Treb. Soc. Cat. Biol., Vol. 41 (1990) 71-78

UTILITAT DE LA DETERMINAC16 DEL DNA DEL VIRUS DEL'HEPATITIS B EN SERUM PER HIBRIDAC16 MOLECULAR

J. COSTA, I. GIBERT , J. BARBS, V. GARCIA BERNABE, J.M. SANCHEZ TAPIAS,

i J. RODES

Unitat d'Ilepatologia. Hospital Clinic i Provincial. Universitat de Barcelona.

Departament de Genetica i Microbiologia. Universitat Autonoma de Barcelona.

RESUMEN

Mediante una tecnica de hibridacidn molecular, utilizando como sonda DNA-VHB purificado

de un plasmido recombinante, se ha examinado la presencia de DNA-VHB en el suero de 82

portadores cronicos de HBsAg (RIA) sin evidencias de infeccion delta y en 80 sujetos HBsAg

negativos (40 donantes de Sangre y 40 con hepatitis cronica o cirrosis no alcohblica). Se detecto

DNA-VHB en cantidades variables en los 62 portadores cronicos (57 HBeAg positivo y 5 antiHBe

positivo) con transaminasas elevadas, lesiones de hepatitis cronica y presencia de HBcAg en el

tejido hepatico (inmunoperoxidasa). En los 8 portadores con transaminasas elevadas, antiHBe

positivo, lesiones de hepatitis cronica y HBcAg ausente del higado, se detect6 DNA-VHB serico en

forma intermitente. El examen fue negativo en los 11 portadores cronicos con antiHBe positivo y

transaminasas normales, asi como en los sujetos HBsAg negativo.

La presencia de DNA-VHB en el suero se asocia a la existencia de actividad inflamatoria y

refleja la actividad replicativa del VHB con mayor fidelidad que la valoracion del sistema

antigenico HBe. Su examen constituye un elemento sumamente util tanto para el estudio de la

historia natural de la infeccion cronica por el VHB como para la valoracion de agentes terapeu-

ticos.

INTRODUCCI6

El virus de ]'hepatitis B (VHB) es una

particula infecciosa de 42 nm de diametre

(Fig. 1). Presenta una coberta lipoproteica

on es localitza ]'antigen de superficie

(HBsAg). Aquesta coberta conte un nucli

proteic on s'expressa ]'antigen del "core"

(HBcAg) i ]'antigen "e" (HBeAg) que es

probablement una forma criptica de 1'ante-

rior. Associat al nucli es troba una doble

cadena de DNA circular (DNA-VHB) i un

enzim amb activitat DNA polimerasa

(DNAp).

La infeccio per aquest virus patogen es

al nostre pals una causa important de mor-

bilitat i de mortalitat i ocasiona, a part de

1'estat de portador sa, una amplia varietat

de processos patologics que inclouen ]'he-

patitis aguda, les diferents formes d'hepa-

72 J. COSTA, I. GIBER!, J. BARBL , I. GAR(L'1 BER:V.1BL , J.SI. SI.VCHEZ I'IPLIS I J. ROOTS

titis cronica, la cirrosi i el cancer primitiude fetge.A la infecci6 cronica pel VHB els feno-

mens d'inflamaci6 i de necrosi hepaticas'associen normalment a la presencia dereplicaci6 virica activa i, al contrari, laseva absentia correspon a una fase poste-rior d'inactivaci6 de la malaltia. De noproduir-se aquest canvi qualitatiu en el de-curs de 1'evoluc16 de ]'hepatitis cronica, esa dir, de persistir la replicacio del virus, laprobabilitat que la malaltia progressi a for-mes irreversibles de lesi6 del tipus de lacirrosi hepatica es molt mes elevada queen el cas contrari (9, 19). D'enca que homdisposa de medicaments antivirics, es rea-litzen estudis terapeutics amb el propositde provocar l'erradicaci6 de l'activitat re-plicativa del virus disminuint aixi el risede la possible progressi6 de la malaltia(17, 26).

Tant per a la selecci6 dels malalts a trac-tar (es obvi que cal triar nomes aquells quipresenten replicacio virica) com per alcontrol de I'acci6 antivirica de la drogautilitzada, es imprescindible disposar detecniques no invasives que permetin d'a-valuar de forma seriada 1'estat replicatiudel VHB en un malalt concret.

D'altra banda, el grau de replicacio delVHB es un indicador del potencial d'unpatient de transmetre la infeccio i per tantel seu coneixement permet de prendre lesmesures necessaries per evitar el contagide les persones del seu entorn mes imme-diat.

En resum, el coneixement de 1'estat re-plicatiu del VHB en un patient concret esde gran interes clinic ja que indica actitudsprofilactiques i terapeutiques diferents.

Per determinar 1'activitat replicativa delVHB hi ha diversos procediments. Calaclarir que la detecci6 d'HBsAg en serumno d6na una informaci6 adequada al res-pecte ja que normalment a la infecci6cronica pel VHB el DNA viric s'integra enel genoma de l'hepatocit expressant-se ]a

sequencia que codifica I'HBsAg. Lana virica es sintetitzada per la cel•lula iposteriorment alliberada a la sang. Pertant, aquest antigen es trobara en serumtant si el virus es replica activament com sino. Aixi doncs, cal explorar la presencia decomponents de la nucleocapsida en serumo en teixit hepatic per avaluar I'existenciade replicacio virica. Fins fa poc temps elsmarcadors de replicaci6 mes utilitzats hanestat l'HBeAg (24), I'HBcAg(18) o laDNAp (1 1) en serum i I'HBc.Ag en teixithepatic (29). Tots aquests metodes presen-ten diverses limitations que han fet palesala necessitat d'emprar procediments mesadequats. Aquests darrers anys, la clonaci6en bacteris del genoma del VHB ha fetpossible l'obtenc16 de DNA viric especi-fie (4), per a ser utilitzat com a sonda enestudis d'hibridaci6 molecular per a la de-tecci6 de DNA-VHB en els teixits i fluidscorporals.

El proposit d'aquest estudi ha estat I'a-valuac16 d'un metode de determinaci6, enserum, del DNA-VHB per hibridaci6 mo-lecular com a index de la replicaci6 delVHB, tot comparant-lo amb altres marca-dors mes coneguts de 1'activitat virica.

MATERIAL I METODES

Pacients i serums

S'ha estudiat el serum de 161 personesdividides en tres grups: el grup I estavaformat per 70 pacients amb hepatitiscronica i HBsAg positiu. En el grup II esvan incloure I1 portadors sans de]'HBsAg, amb valors repetidament nor-mals d'aminotransferases. El grup III eraformat per 80 persones HBsAg sero-negati-ves, 40 de les quals eren donadors de sang 1les 40 restants presentaven lesions d'hepa-titis cronica d'etiologia no alcoholica. Capdels pacients de 1'estudi no presentava evi-dencies de sobreinfecci6 per ]'agent delta(VHD).

U77LIT-iT DE LA DEI ERMINACIO DEL DNA DEL VIRUS DE L JIEPATITIS B

EN SERUM PER IIIBRIDAC IO MOLEC LAR 73

El diagnostic d'hepatitis cronica es va

realitzar segons criteris internacionals.

mitjancant I'analisi histopatologica de

biopsies hepatiques les quals foren practi-

cades a malalts que mostraven elevacio de

transaminases durant mes de sis mesos.

A totes les persones de 1'estudi se'ls va

recollir mostres de serum, les quals foren

guardades a -20 °C fins al moment de la

seva analisi. L'extraccio de les mostres de

serum estudiades, corresponents a malalts

amb hepatitis cronica, es va realitzar el

mateix dia de la practica de la biopsia he-

patica.

Soques bacterianes i plasmidi utilitzats

El plasmidi utilitzat ha estat el pBH2O-

VHB que es portador del DNA del virus

de ('hepatitis B, insertat en la diana Eco RI

del pBH2O, el qual es un derivat del

pBR322. Aquest plasmidi va esser propa-

gat en la soca HB1O1 d'Escherichia coll.

Metodes serologics

En totes les mostres de serum es van

investigar els seguents marcadors del

VHB: DNA-VHB, HBcAg, i HBsAg. A

mes, en els serums HBsAg positius, es va

determinar HBeAg, antiHBe i antidelta.

La determinacio de DNA-VHB s'ha rea-

litzat segons el metode d'hibridacio "blot

dot" descrit per SCOTTO i cols. 1'any

1983 (22) (Fig. 2). Un volum de 5 µl de

serum, control o problema, ha estat incu-

bat amb 25 pl de NaCI 3M i amb 50 µl deNaOH 1 M, durant 10 minuts a temperatu-

ra ambient i adsorbit directament a nitro-

cel•lulosa per filtracio. Immediataments'ha afegit a cada mostra, 100 µl de Tris-

HCI pH 7.4 per a la neutralitzacio. Des-

pres d'assecar els filtres a temperaturesambient, s'han incubat durant 2 hores a80 °C per a la fixacio del DNA.

HBsAg ........,CUB[ERTA

--HBcAg y HBeAgNUCLEOCAPSIDE

---- DNA POLIMERASA

DNAC ACULARGENOMA VHB

Fig. I. Estructura del VHB..Aquest virus presenta un

embolcall de naturalesa lipoproteica amb un antigen

de superficie (HBsAg). La coberta engloba on nucli

on es detecta ('antigen del "core" (HBcAg) i una

forma criptica d'aquest denominada antigen "e"

(HBeAg). Associat al nucli hi ha el genoma viric

format per una doble cadena de DNA circular. Una

de les dues cadenes es troba incompleta. El filament

mes llarg presenta una ruptura ("nick"). A mes a

1'extrem 3' del filament curt hi ha un enzim amb

activitat DNA polimerasa (DNAp).

Fig. 2. Hibridacio molecular "blot dot". Imatge ob-

tinguda despres de I'autoradiografia i del revelat. La

columna numero 2 correspon als controls negatius, i

la resta de posicions als controls positius i a les dife-

rents mostres de serum analitzades. Les taques negres

assenyalen les mostres amb DNA-VHB. La seva in-

tensitat es proporcional al grau de positivitat de les

mostres.

Per a l'extraccio del plasmidi quimeric

s'ha seguit el metode de BIRMBOIN modifi-

cat (1). L'aillament del genoma del VHB

74 J COSTA, I. GIBERT, J. BARBS . I GARCIA BLRV IBS, J.11 . S'.-1 NCHEZ TAPI. IS 1.1. RODES

ha estat segons el metode de 1'electroelu-ci6 (28).

La prehibridacio s'ha realitzat a 65 'Ctota una nit, amb una solucio que contenia5 x SSC, 10 x solucio de Denhart, 10 x sul-fat dextra, 0,02M de fosfat di-basic i0,3 mg/ml de DNA d'esperma de salmo.La hibridacio es va portar a terme a 68 'Cdurant 16 hores amb una solucib identicaa ]'anterior a la qual s'han afegit 200 µA dela sonda, marcada amb P32 per "nick trans-lation" (20), l'activitat especifica de laqual era de 1-4 x 101 cpm/µg de DNA-VHB. Un cop finalitzada la hibridacios'han rentat els filtres durant 5 minuts atemperatura ambient amb 5 x SSC i 0, 1 O/ode SDS i quatre vegades de 30 minuts a55 °C amb 0,1 x SSC i 0,1 % de SDS. Per al'autoradiografia s'ha utilitzat pel-liculaKodak X-Omat S. La impressio de la placafotografica ha estat reforcada amb mam-pares Dupont Cronex HI-Plus.L'HBcAg ha estat determinat segons el

metode de NEURATH i cols. (16). S'hanincubat 400 pl de serum amb nonidet P-40per trencar la coberta del virus i alliberar]'HBcAg el qual formara immunocomple-xos amb l'antiHBc circulant. Els immuno-complexos resultants es precipiten ambpolietilenglicol 6.000 al 2 % i despres detres rentats son incubats amb NaSCN 3Mper dissociar els seus components. A conti-nuacio s'incuba durant tota la nit amb bo-les de poliestire. L'antigen i l'anticos s'ad-sorbeixen per separat damunt la superficiedel plastic. L'activitat HBcAg es detectadaamb IgG antiHBe conjugada a I'll. L'IgGantiHBe s'obte per cromatografia de bes-canvi ionic amb Sepharosa 6B-CL-DEAE(Pharmacia) previa prccipitacio amb sulfatamonic. La font d'anticos es serum d'unpacient que presenta un titol molt elevatd'antiHBc, pero que no demostra activitatantiHBs, antiHBe ni antidelta. El marcat-ge de ]'IgG amb "'I s'ha fet segons el meto-de de la cloramina T (10).L'HBsAg, 1'HBeAg, l'antiHBe 1 I'antidel-

ta s'han determinat per radioimmunoas-saig (RIA) utilitzant reactius comercials(Abbott Labs. USA).

Metodes immunohistologics

L'HBcAg i I'antigen delta han estat ana-litzats en mostres de teixit hepatic, fixadesen formol i incloses en parafina, segonsmetodes d'immunoperoxidasa indirectadescrits per TREVISAN i cols. (27) amb pe-tites modificacions (21).

RESULTATS

Dels 70 pacients amb hepatitis cronicapel VHB del grup 1, 66 (94,3 %),57 (81,4 %) i 51 (72 %) presentaven res-pectivament el DNA-VHB, l'HBeAgi ]'HBcAg positiu en serum. A mes,62(88%) pacients d'aquest grup demos-traven activitat HBcAg en teixit hepatic.No s'ha detectat DNA-VHB ni HBcAg

al serum de cap dels 1 I portadors sans delgrup II (tots ells antiHBe positiu) ni tam-poc al serum de les 80 persones del grupIII.

Correlacio entre DNA-VHB i HBcAghepatic

En el 93,9 % (62/66) dels pacients DNA-VHB positiu tambe es va detectar HBcAgen teixit hepatic. A la inversa, tots els pa-cients amb HBcAg histic presentavenDNA-VHB en serum. Aixo vol dir que noes va detectar HBcAg al fetge, malgrat lapositivitat del DNA-VHB en serum, en4/66 malalts (6,1 %).

Correlacio entre DNA-VHB i HBcAg seric

Els resultats de comparar la presencia deDNA-VHB 1 de HBcAg en el serum dels

UTILI1AT DE LA DETE.RMINACIO DEL DNA DEL VIRUS DE LI EPATITIS B

EN SERUM PER IIIBRIDACIO MOLECULAR 75

TAULA I

Correlacio entre 1'HBcAg seric i la presenciade DNA-VIIB en el grup de malalts amb

hepatitis cronica B

100%,

DNAVHSEl DNA VHS-

D.N'-I-[HB+ DNA-['HB-n=66 n=4

HBcAg+n=51 51 0

HBcAg - n= 19 15 4

50%1

malalts del grup I, estan exposats a la Tau-

la I. Deis 66 malalts DNA-VHB positiu, el

77,3 % (5 1/ 66) eren HBcAg positiu en se-

rum i el 22,7 % (15/ 66) eren HBcAg nega-

tiu.

Correlacio entre DNA-VHB i sistema

HBe/antiHBe

Deis pacients del grup I que van resultar

positius pel DNA-VHB, el 86,36 % (57/66)

tenien I'HBeAg positiu i el 13,63 % (9/66)

tenien positiu ('antiHBe. A la inversa, tots

els pacients HBeAg positiu i el 69 % dels

antiHBe positiu del grup I, tenien DNA-

VHB al serum.D'acord amb els resultats de 1'analisi del

sistema HBeAg/antiHBe i del HBcAg en

teixit hepatic, es van dividir els 70 pa-

cients del grup I en tres subgrups, el primer

dels quals quedava format per 57 malalts

amb HBeAg seric i HBcAg hepatic post-

tius. El segon subgrup estava constituIt per

5 pacients antiHBe i HBcAg positius en

serum i en biopsia respectivament. Final-

ment, el tercer subgrup el formaven 8 pa-

cients antiHBe positiu sense HBcAg al tei-

xit hepatic. Tots els malalts del primer i

del segon subgrup (es a dir, tots els qui

presentaven HBcAg en teixit hepatic) eren

DNA-VHB positiu en serum, aixi com

tambe ho eren la meitat dels del tercer

subgrup. Els quatre restants del tercer sub-

grup eren DNA-VHB i HBcAg negatius en

serum (Fig. 3).

HC HC HC PS HB.Ag-

HBeAg. entl.HBe , entl.HBe, en,I.HBe,

HBCAg. HBcAg , HBcAg -=57 =5 =B n=11 n=80

Fig. 3. Comparacio entre el sistema HBeAg/antiHBe,

!'HBcAg histic i la presencia de DNA-VHB en serum.

Tots els pacients amb hepatitis cronica B que tenien

HBcAg al fetge, presentaven DNA-VHB al serum,

tant si tenien I'HBeAg positiu corn si tenien positiu

('antiHBe. Es va detectar DNA-VHB en la meitat dell

malalts amb hepatitis cronica B que no tenien HBcAg

al teixit hepatic. D'altra banda, no es va detectar

DNA viric en cap dels portadors sans de I'HBsAg ni

en cap dels subjectes HBsAg negatiu.

DISCUSSIO

El percentatge de positivitat dels dife-

rents marcadors de replicacio comparats

en aquest estudi demostra que la determi-

nacio de DNA-VHB es l'indicador mes

sensible de l'activitat replicativa del VHB.

Habitualment, la positivitat del HBeAg

es correlaciona amb 1'existencia de replica-

66 virica, aixi com la seva absentia s'asso-

cia a positivitat de 1'antiHBe. L'analisi del

sistema HBeAg/antiHBe es, donada la fa-

cilitat de la seva determinaci6, el procedi-

ment mes utilitzat a la practica clinica dia-

ria per a la valoraci6 de l'activitat replica-

tiva del VHB. De totes maneres, algunes

discrepancies entre 1'estat replicatiu del vi-

rus i el "status" HBe/antiHBe, fan d'a-

quest sistema un procediment pot recoma-

nable per inexacte.

A 1'estudi present, tots els serums

HBeAg positiu que hem analitzat demos-

tren positivitat del DNA-VHB. Altres tre-

balls, pero, no indiquen una correlacio

76 J. (OS7.1, I. GIBERI, J. BARBE, l. G.IR(i 1 BERNABI , J.,41. SANCIIEZ IAPIAS I J. RODES

tant estricta entre aquests dos marcadors,en el sentit que un percentatge que oscil•laentre el 9,2 % i el 19 % de serums HBeAgpositius, son negatius pel DNA-VHB (12,14, 25). La rao d'aquesta discrepancia esque al contrari que en el nostre, els altresestudis inclouen serums HBeAg positiusde pacients que es troben en una fase pro-pera a la seroconversio espontania a anti-HBe, quant sovint el DNA-VHB ja s'hanegativitzat (6).

D'altra banda, la positivitat de I'anti-HBe a ]'hepatitis cronica, no sempre assen-yala 1'absencia de replicacio virica, ja que9 dels 13 pacients antiHBe del grup I erenDNA-VHB positiu. Aixo pot explicar elpotential de transmissio del VHB d'alguns

pacients antiHBe sero-positius (23, 30).Donat que el nombre de malalts amb he-patitis cronica inclosos en aquest estudi esredu*ft, no podem extreure conclusions de-finitives de la frequencia de replicacio delVHB en aquest col•lectiu. De totes mane-res, com que aquests malalts no han estatseleccionats previament, ]'alt percentatge

de positivitat de DNA-VHB obtingut, ensdona una idea aproximada de la magnitud

d'aquest fet. Aquest percentatge es similaral d'altres estudis realitzats a pa*fsos de]'area mediterrania i notablement superioral dels fets a paYsos anglosaxons (12, 13,28). A mes, no hem detectat DNA-VHB enel serum de cap dels portadors sans deHBsAg (tots antiHBe positiu). Aquests re-sultats suggereixen que dels malalts amb]'antiHBe positiu, son precisament aquestsqui presenten lesions d'hepatitis cronica ihipertransaminasemia els que sovint de-mostren replicacio del VHB, fet que no esdona practicament mai en els portadorssans amb antiHBe positiu.

El 93,9 % dels nostres pacients amb elDNA-VHB seric positiu, presenten activi-tat HBcAg en teixit hepatic, cosa que con-firma que la deteccio d'aquest antigen alfetge es un bon indicador de 1'existenciad'activitat replicativa del virus. El princi-

pal inconvenient d'aquest procediment esque obliga a la realitzacio de biopsia hepa-tica, la qual coca obviament, no es potrepetir a intervals frequents. D'altra Ban-da, 1'HBcAg seric es un marcador de repli-cacio relativament poc sensible ja que re-sulta negatiu en el 22,5 % dels serums ambDNA-VHB.No hem detectat DNA-VHB al serum de

cap dels donadors de sang ni de cap malaltamb hepatopatia cronica i HBsAg negatiu,cosa que concorda amb els resultats de lamajoria d'estudis publicats (7, 12). Aixo esun argument a favor de 1'especificitat delmetode d'hibridacio molecular emprat. Noobstant, alguns estudis demostren un petitpercentatge de positivitat del DNA-VHBal serum de pacients amb HBsAg negatiu ihepatopatia cronica (3, 15).

El fet que el 94,3 % dels pacients ambhepatitis cronica pel VHB presentin repli-cacio virica documentada per la positivitatdel DNA-VHB en serum confirma la claraassociacio entre 1'activitat replicativa delvirus i la presencia de lesio hepatica, enaquest grup de malalts. Aixo ho corroborael fet que cap dels portadors sans de]'HBsAg analitzats en aquest estudi pre-senta replicacio del VHB. De totes mane-res, no hem aconseguit detectar replicaciodel VHB al serum de 4 pacients antiHBepositius i amb hepatitis cronica. Aquestadada coincideix amb les d'altres autors de]'area mediterrania (13, 25). Malgrat quehom pot suposar, en aquest grup de ma-lalts una sobreinfeccio per un virus de ('he-patitis no A no B, o be I'accio de mecanis-mes patogenics de caracter autoimmunita-ri, no disposem actualment de cap hipotesique expliqui de forma consistent la rao dela persistencia d'inflamacio hepatica enaquests malalts.En resum, cl metode d'hibridacio mole-

cular emprat en aquest estudi es un proce-diment senzill, sensible i especific per a lavaloracio de 1'activitat replicativa delVHB. La disponibilitat d'aquest marcador

U77131iI DE LA DE1ER.t1LNAC1O DEL I),4I DFI. 17RU.S 1)L I.'IIEPA777IS B

FN SIiRC'Af I'FR IIIBRID.I ('IO dfOLECULAR 77

permetra aprofondir en aspectes poc cone-

guts de la historia natural de la lnfeccio

cronica pet VHB, aixi corn comprovar l'ac-

cio antivirica dels farmacs utilitzats en es-

tudis terapeutics.

Agraiments

Agraim la col•laboracid del Dr. J. Summers

de l'Institute for Cancer Research de Filadelfia,

(USA), per la cessio desinteressada de la soca

d'Escherichia coli que conte el plasmidi

pBH2O-VHB, a Nuri Artigas per la seva col.la-

boraciO en les determinacions dels marcadors

convencionals del VHB i al Dr. R. Guerrero per

donar-nos el suport material i tecnic del seu de-

partament.

BIBLIOGRAFIA

1. BIRNBOIN, D.C. i DOLY, J. (1979) Rapid alkaline

extraction procedure for screening recombinant

plasmids DNA. Nucleic Acids Res. 7:1513-1523.

2. BONING, F., HOYER, B., i NELSON, J. I cols. (1981)

Hepatitis B virus DNA in the sera of HBsAg

carriers : a marker of active hepatitis B virus re-

plication in the liver. Ilepatology 1:386-391.

3. BRECHOr . C.. DEGOs. F., LuGASS\. C. i cols.

(1985) Hepatitis B virus DNA in patients with

chronic liver disease and negative tests for hepa-

titis B surface antigens . N. Engl. J.:Ifed. 312:270-

276.

4. BURRE1 l., C.J., MACKA}, P., GREENAWAY. P.J. I

cols. (1979 ). Expression in Eschertchia colt of

hepatitis B virus DNA sequences cloned in plas-

mid pBR322 . Nature 279:43-47.

5. CHARN.Y, D., POUR( El, C., Louise, A. i cols.

(1979) Cloning in Escherichia cols and physical

structure of hepatitis B virion DNA. Proc. Nall.

.-lead. Sci. USA, 76:2222-2226.

6. COSTA, J., SANCHEZ TAI'ILS, J.M. i MAs, A. (1986)

Utilidad de la determinacion en el suero del

DNA del virus de la hepatitis B (DNA-VHB) en

la infection cronica por VHB. Gastroenterol He-

patol 9:15.7. FREIMAN, J., ECKSTEIN, R., MCCAUGAN, G. i cols.

(1985) Significance of serum and hepatic markers

of hepatitis B viral infection in HBsAg-positive

and HBsAg-negative chronic active hepatitis. He-

patoloip' 5:50-53.

8. HADZIY.ANNIS, S.J., LIEBERMAN, H.M., KAR-

voUNTZIS, G.G. i cols. (1983) Analysis of liver

disease, nuclear HBcAg, viral replication, and

hepatitis B virus DNA in liver and serum of

HBeAg vs. antiHBe positive carriers of hepatitis

B virus. Hepatology 3:656-662.

9. HOOFNAGLE, J.H., DusHElco, G.M.. SEEF, L.B. i

co/s. (1984) Seroconversion from hepatitis Be an-

tigen to antibody in chronic type B hepatitis.

Ann. Intern. Med. 94:744-748.

10. HUNTER. W.H. i GREENWOOD, F.D. (1984) Prepa-

ration of iodine- 131 labelled human growth hor-

mone of high specific activity. Nature 194:495-

496.11. KAPLAN, P.M., FORD, E.C., PURCELL, R.H. l eo/s.

(1976) Demonstration of subpopulations of Dane

particles. J. Tirol. 17:885-893.

12. KARAYI.ANNIS, P., FOWLER, M.J.F., LOK, A.S.F. l

co/s. (1985) Detection of serum HBV-DNA by

molecular hybridization. Correlation with

HBeAg/antiHBe status, racial origen, liver histo-

logy and hepatocellular carcinoma. J. Hepatol.

1:99-106.

13. MONJARDINO, J., KARAYIANNIS, P., MONTANO, L.

i cols. (1984) Contribution of low level HBV-

replication to continuing inflammatory activity

in patients with anti-HBe positive chronic hepa-

titis B virus infection. Gut 25:1283-1287.

14. MATSUYAMA, Y., OMATA. M., YOKOSURA, O. 1

cols. (1985) Discordance of hepatitis Be antigen/

antibody and hepatitis B virus deoxyribonucleic

acid in serum. Gastroenterology 89:1104-1108.

15. NALPAS, B., BERTHELOT, P., THIERS. V. I cols.

(1985) Hepatitis B virus multiplication in the

absence of usual serological markers. A study of

146 chronic alcoholics. J. Hepatol. 1:87-89.

16. NEURATH, A.R., STRICK, N., BAKER, L. / co/s.

(1982) Radioimmunoassay of hidden viral anti-

gens. Proc. Nat/. Acad. Set. C'SA. 79:4415-4419.

17. OMATA, M., IM.AZ.AKi, F.. YOKOSUKA, O. 1 co/S.

Recombinant leukocyte. An interferon treatment

in patients with chronic hepatitis B virus infec-

tion. Gastroenterology 88:870-880.

18. PURCELL, R.H., GERIN, J.L., ALMEIDA, J. I cols.

(1974) Radioimmunoassay for the detection of

the core of Dane particle and antibody to it.

Interrirology 2:231-243.

19. REALDI, G., ALBERTI, A., Rt1GGE, M. l cols. (1980)

Seroconversion from hepatitis B antigen to an-

tiHBe in chronic hepatitis B virus infection. Gas-

troenlerologv 79:195-199.

20. RIGBI, P.W.J., DIECKMANN, RODES, C. i Co/S.

(1977) Labeling deoxyribonucleic acid to high

specific activity in vitro by nick translation with

DNA polimerase 1. J. Mol. Biol. 113:237-251.

21. SANCHEZ TAPIAS, J.M., VILAR, H., COSTA, J. I cols.

(1985) Natural history of chronic persistent hepa-

78 J. COSTA, I. GIBERT, J. BARBE, V. GARCIA BERNABE, J.M. SANCHEZ TAPIRS I J. ROUES

titis B: relationship between hepatitis B virusreplication and the course of the disease. J. 11epa-tol. 1:15-27.

22. SCOTTO, J., HADCHOUEL, M., HERY, C.H. i cols.

(1983) Detection of hepatitis B virus DNA in

serum by a simple spot hybridization technique:

Comparison with results of other viral markers.

Hepatology, 3:279-284.

23. SINATRA, F.R., SHAH, P., WEISSMAN, J.Y. I ('ol.S.

(1982) Perinatal transmitted acute icteric hepati-

tis B virus surface antigen positive and anti-

hepatitis B e-positive carrier mothers. Pediatric.

70:557-559.

24. TAKAHASHI, K., IMAI, M., TSUDA, F. I cols. (1976)Association of Dane particles with an antigen inthe serum of asymptomatic carriers of hepatitis Bsurface antigen. J. Immunol. 117:102-105.

25. THIERS, V., BOUCHARDEAN, F., COUROU('E, A. i

cols. (1986) L'ADN du virus de l'hepatitis B com-

me marqueur de multiplication virale: compari-

son avec I'antigene HBe et I'anticorps anti-HBe.

La Presse Medicate 15:1219-1222.

26. HOMAS, H.C., i Lo('K, A.S.F. (1984) Approaches

to the treatment of chronic hepatitis B. A: Ad-vances in hepatitis research. EV Chiari. Ed. Mas-son Publishing. Inc. New York 241-250.

27. TREVISAN, A., GUDAT, F., BusACHI, i cols. (1982)

An improved method for HBcAg demonstration

in paraffin embedded liver tissue. Liver 2:331-

339.

28. WELLER, I.V.D., FOWLFR, M.J.F., MONIARDINO,

J. i cols. The detection of HBV-DNA in serum by

molecular hybridization: A more sensitive met-

hod for the detection of complete HBV particles.

J. Med. Virol. 9:273-280.

29. YAMADA, G. I NAKANE, P.K. (1977) Hepatitis B

core and surface antigens in liver tissue. Light

and electron microscopic localization by peroxi-

dase-labeled antibody method. Lab. Invest.

36:649.

30. ZANETTI, A.R., FERRONI, P., MAGLIANO, E.M. I

cols. (1982) Perinatal transmission of the hepati-

tis B virus and of the HBV-associated delta agent

from mothers to offspring in northern Italy. J.

Med. Piro!. 9:139-148.