UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE STÉPHANIE … (RIUFF).pdf · M527a Mello, Stéphanie Christine Sinder Avaliação bioquímica do perfil lipídico e marcadores de lesão hepática

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

INSTITUTO DE SAÚDE DE NOVA FRIBURGO

CURSO DE GRADUÇÃO EM BIOMEDICINA

STÉPHANIE CHRISTINE SINDER MELLO

AVALIAÇÃO BIOQUÍMICA DO PERFIL LIPÍDICO E MARCADORES

DE LESÃO HEPÁTICA EM RESPOSTA A UMA DIETA

ATEROGÊNICA

NOVA FRIBURGO

2016

i


AVALIAÇÃO BIOQUÍMICA DO PERFIL LIPÍDICO E

MARCADORES DE LESÃO HEPÁTICA EM RESPOSTA A UMA

DIETA ATEROGÊNICA

ORIENTADORA:

PROFa. DRª. CAROLINE FERNANDES DOS SANTOS BOTTINO

NOVA FRIBURGO

2016

Monografia apresentada à Universidade

Federal Fluminense/ Instituto de Saúde de

Nova Friburgo, como Trabalho de

Conclusão do Curso de graduação em

Biomedicina.

M527a Mello, Stéphanie Christine Sinder

Avaliação bioquímica do perfil lipídico e marcadores de lesão hepática em

resposta a uma dieta aterogênica. / Stéphanie Christine Sinder Mello ; Profᵃ.

Drᵃ. Caroline Fernandes dos Santos Bottino, orientadora. -- Nova Friburgo, RJ:

[s.n.], 2016.

79f.

Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Biomedicina) –

Universidade Federal Fluminense, Instituto de Saúde de Nova Friburgo,

2016.

1. Bioquímica. 2. Lipoproteínas. 3. Enzimas hepáticas. 4. Aterosclerose. I.

Bottino, Caroline Fernandes dos Santos, Orientadora. II. Título.

CDD M574.192

ii


AVALIAÇÃO BIOQUÍMICA DO PERFIL LIPÍDICO E

MARCADORES DE LESÃO HEPÁTICA EM RESPOSTA A UMA

DIETA ATEROGÊNICA

Apresentado em: 29 de Novembro de 2016.

Banca Examinadora

_____________________________________ Profa. Dra. Fernanda Amorim de Morais Nascimento Braga (Titular)

Universidade Federal do Rio de Janeiro – Campus Macaé

_____________________________________

Prof. Dr. Leonardo de Souza Mendonça (Titular) Universidade Federal Fluminense – Instituto de Saúde de Nova Friburgo

_____________________________________ Profa. Dra. Caroline Fernandes dos Santos Bottino (Titular/Orientador)

Universidade Federal Fluminense – Instituto de Saúde de Nova Friburgo

_____________________________________ Profa. Dra. Fabiana Nunes Germano (Suplente)

Universidade Federal Fluminense – Instituto de Saúde de Nova Friburgo

NOVA FRIBURGO

2016

Monografia apresentada à Universidade

Federal Fluminense/ Instituto de Saúde de

Nova Friburgo, como Trabalho de

Conclusão do Curso de graduação em

Biomedicina.

iii

Todo aquele que se dedica ao estudo da ciência chega a convencer-se de que

nas leis do Universo se manifesta um Espírito sumamente superior ao do

homem, e perante o qual nós, com os nossos poderes limitados, devemos

humilhar-nos.

Albert Einstein

iv

AGRADECIMENTOS

Primeiramente agradeço a Deus, por me acompanhar, me

proteger e me dar forças durante toda a minha trajetória.

A minha família, por estar sempre comigo, acreditar em mim e me

ajudar em tudo que eu necessito. Principalmente aos meus pais que não

mediram esforços para meu crescimento moral e acadêmico.

A meus amigos por terem me dado todo o apoio necessário e por

fazerem com que esta caminhada tenha sido mais fácil de percorrer.

A meus professores, por, apesar das dificuldades, terem feito o

seu melhor em ensinar tudo que sabem. Principalmente a minha

orientadora, Caroline Fernandes, por fazer este trabalho ser possível e

por me acolher no mundo acadêmico em mais da metade da graduação.

v

RESUMO

A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica que acomete os

vasos sanguíneos e possui origem multifatorial. A obesidade e o perfil lipídico

alterado são fatores de risco conhecidos para o desenvolvimento da

aterosclerose. O objetivo do presente estudo é caracterizar o perfil bioquímico

lipídico e hepático de camundongos C57Bl/6 alimentados com uma dieta

aterogênica. Para esse fim, camundongos C57BL/6 machos com três meses

de idade foram submetidos à dieta controle ou dieta aterogênica contendo

excesso de lipídios saturados, colesterol e ácido cólico durante 2, 4 ou 8

semanas (n=12/grupo). A massa corporal foi aferida semanalmente e a

ingestão de ração diariamente. No momento da eutanásia, sangue foi coletado

para análise bioquímica. A análise estatística foi realizada no software

GraphPad Prisma 6.0 sendo considerado significativo um P<0,05. Não houve

ganho de MC pela ingestão da dieta aterogênica. A ingestão de ração foi

menor nos grupos que ingeriram a dieta aterogênica (-19%). A ingestão de

energia foi maior no grupo submetido à dieta aterogênica por 2 semanas (A2)

em +11,6% e no grupo submetido à dieta aterogênica por 4 semanas (A4) em

+12,2%, porém menor no grupo que recebeu dieta aterogênica por 8 semanas

(A8) em -5,1%, quando comparados aos seus respectivos controles. Não

houve diferença significativa de triglicerídeo sérico entre os grupos. A ingestão

da dieta aterogênica aumentou o colesterol total (A2: +62,6%; A4: +35,4% e;

A8: +40%, P<0,05). Foi observado um aumento do colesterol de alta densidade

(HDL) nos grupos com dieta aterogênica (A2: +99%; A4: +369,1%; A8:

+111,2%, P<0,05). Os valores de colesterol de baixa densidade (LDL), por sua

vez, também se mostraram aumentados nos grupos submetidos à dieta

aterogênica (A2: +162,8%; A4: +128,8% e; A8: +108,9%, P<0,05). Em relação

ao perfil de marcadores séricos hepático, não houve diferença estatística nos

níveis de fosfatase alcalina entre os grupos. Porém, em relação ao grupo

controle, os níveis da enzima transaminase glutâmico-pirúvica (TGP) foram

aumentados (A2: +806,4%; A4: +194,4% e; A8: +107,6%, P<0,05). E, por fim,

os níveis de transaminase glutâmico-oxalacética (TGO) estavam aumentados

somente nos grupos A2 e A4 (+89,8% e +39,7%, respectivamente, P<0,05).

Dessa forma, concluímos que uma dieta hiperlipídica rica em colesterol e ácido

cólico é capaz de alterar o metabolismo lipídico e hepático, mesmo sem o

ganho de massa corporal e sem ser necessário um tempo prolongado de

exposição à dieta, em camundongos C57Bl/6.

Palavras chave: lipoproteínas, enzimas hepáticas, aterosclerose

vi

ABSTRACT

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease that affects blood

vessels and has multifactorial origin. Obesity and altered lipid profile are known

risk factors for the development of atherosclerosis. The present study aimed to

characterize the lipid and hepatic biochemical profile of male C57Bl/6 mice fed

with an atherogenic diet. Therefore, three-months old C57Bl/6 mice were fed

with a control diet or an atherogenic diet rich in saturated fat, cholesterol and

colic acid for 2, 4 or 8 weeks (n=12/group). Body mass (BM) was measured

weekly and food intake daily. At euthanasia, blood was collected for

biochemical assays. Statistical analysis was performed using GraphPad Prisma

software 6.0 and a P< 0.05 was considered statistically significant. There was

no BM gain by the ingestion of the atherogenic diet. Food intake was decreased

in mice fed with the atherogenic diet (-19%). Energy intake of A2 and A4 groups

increased (+11.6% and +12.2%, respectively), but decreased in A8 group (-

5.1%), when they were compared to their respective controls. There was no

significant change in serum triglyceride, but the atherogenic diet increased total

cholesterol levels (A2: +62.6%; A4: +35.4% and; A8: +40%, P<0.05). An

increase in high-density lipoprotein (HDL) fraction was observed in the

atherogenic groups (A2: +99%; A4: +369.1% and; A8: +111.2%, P<0.05). The

low-density lipoprotein (LDL) fraction was also increased mice fed with the

atherogenic diet (A2: +162.8%; A4: +128.8% and; A8: +108.9%, P<0.05).

Regarding hepatic markers, there was no difference in alkaline phosphatase

among groups. However, in the control group, the level of the glutamic pyruvic

transaminase enzyme (SGPT) was increased (A2: + 806.4%; A4: + 194.4%

and; A8: +107.6%, P<0,05). Finally, the glutamic-oxaloacetic transaminase

(SGOT) was increased only in A2 and A4 groups (+89.8% and +39.7%,

respectively, P<0.05). Thus, we conclude that a high-fat diet rich in cholesterol

and colic acid can modulate lipid and hepatic metabolism, even if body weight

gain did not take place, without the need of a long-term induction time, in

C57Bl/6 mice.

Keywords: lipoproteins, liver enzymes, atherosclerosis

vii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Desenvolvimento da placa aterogênica..............................................6

Figura 2 – Sumário do metabolismo lipoproteico.................................................9

Figura 3 – Esteatose hepática...........................................................................14

Figura 4 – Esteatohepatite e estresse oxidativo................................................15

Figura 5 – Evolução da Massa Corporal (MC)...................................................41

Figura 6 – Massa corporal final..........................................................................42

Figura 7 – Ingestão de ração.............................................................................43

Figura 8 – Consumo de energia........................................................................43

Figura 9 – Triglicerídeos séricos........................................................................45

Figura 10 – Níveis séricos de Colesterol total...................................................45

Figura 11 – Níveis séricos de Colesterol de alta densidade (HDL)...................46

Figura 12 – Níveis séricos de Colesterol de baixa densidade (LDL).................46

Figura 13 – Níveis séricos de Fosfatase Alcalina..............................................48

Figura 14 – Níveis séricos de transaminase glutâmico-pirúvica (TGP).............48

Figura 15 – Níveis séricos de transaminase glutâmico-oxalacética (TGO) ......49

viii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Composição nutricional das dietas experimentais...........................21

Tabela 2 – Ensaio para dosagem do colesterol total sérico..............................24

Tabela 3 – Ensaio para dosagem do HDL colesterol sérico..............................26

Tabela 4 – Ensaio para dosagem do LDL colesterol sérico..............................28

Tabela 5 – Ensaio para dosagem do triglicerídeo sérico...................................30

Tabela 6 – Curva padrão do ensaio para a dosagem de transaminase

glutâmico-oxalacética (TGO/AST) sérica...........................................................32

Tabela 7 – Ensaio para a dosagem de transaminase glutâmico-oxalacética

(TGO/AST) sérica..............................................................................................33

Tabela 8 – Curva padrão do ensaio para a dosagem de transaminase

glutâmico-pirúvica (TGP/ALT) sérica.................................................................35

Tabela 9 – Ensaio para a dosagem de transaminase glutâmico-pirúvica

(TGP/ALT) sérica...............................................................................................36

Tabela 10 – Ensaio para a dosagem de fosfatase alcalina sérica.....................38

Tabela 11 – Concentração esperada dos diferentes analitos presentes no

controle normal e controle patológico utilizados nos ensaios bioquímicos........39

Tabela 12 – Valor do r da correlação entre a absorbância e a concentração de

cada analito........................................................................................................50

Tabela 13 – Concentração observada dos diferentes analitos presentes no

controle normal e controle patológico utilizados nos ensaios bioquímicos........51

ix

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ALT Alanina aminotransferase

ApoE-/- Modelo animal knockout para a apolipoproteína E

AST Aspartato aminotransferase

CETP Proteína de transferência do éster de colesterol

CT Colesterol total

eNOS Enzina óxido nítrico sintase endotelial

EPM Média ± erro padrão da média

FA Fosfatase Alcalina

HDL Lipoproteína de alta densidade

ICAM1 Molécula de adesão intracelular

IDL Lipoproteína de densidade intermediária

IL-1 Interleucina 1

IL-8 Interleucina 8

LDL Lipoproteína de baixa densidade

LDL-ox LDL oxidado

LDLR-/- Modelo animal knockout para o receptor LDL

MC Massa corporal

PAD Padrão do ensaio

PAI-1 Inibidor do ativador do plasminogênio 1

PLTP Proteínas de transferência de fosfolípides

Qm Quilomícrons

RNS Espécies reativas de nitrogênio

x

ROS Espécies reativas de oxigênio

RT Reagente de trabalho

TG Triglicerídeo

TGO Enzima transaminase glutâmico oxalacética

TGP Enzima transaminase glutâmico pirúvica

VCAM1 Molécula de adesão vascular

VLDL Lipoproteínas de muito baixa densidade

xi

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO...............................................................................1

2 REVISÂO DE LITERATURA..........................................................3

2.1 ATEROSCLEROSE.....................................................................3

2.2 FISIOPATOLOGIA DA ATEROSCLEROSE................................4

2.3 METABOLISMO LIPÍDICO..........................................................7

2.4 PERFIL LIPÍDICO E RISCO DE ATEROSCLEROSE...............10

2.4.1 Papel do HDL na aterosclerose..............................................10

2.4.2 Papel do LDL na aterosclerose..............................................11

2.2.3 Papel do triglicerídeo na aterosclerose..................................12

2.5 PROCESSO INFLAMATÓRIO HEPÁTICO...............................13

2.6 MARCADORES HEPÁTICOS NA ATEROSCLEROSE............16

2.7 MODELOS ANIMAIS DE ATEROSCLEROSE..........................17

3 OBJETIVOS.................................................................................19

3.1 OBJETIVOS GERAIS................................................................19

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.....................................................19

4 MATERIAIS E MÉTODOS...........................................................20

4.1 ANIMAIS E GRUPOS EXPERIMENTAIS..................................20

4.2 EUTANÁSIA E COLETA DE AMOSTRAS................................22

4.3 BIOQUÍMICA SANGUÍNEA.......................................................22

4.3.1 Colesterol Total.......................................................................23

4.3.2 HDL Colesterol.......................................................................25

xii

4.3.3 LDL Colesterol........................................................................27

4.3.4 Triglicerídeos..........................................................................29

4.3.5 Transaminase Glutâmico-Oxalacética....................................31

4.3.6 Transaminase Glutâmico Pirúvica..........................................34

4.3.7 Fosfatase Alcalina..................................................................37

4.4 CONTROLE DE QUALIDADE NORMAL E PATOLÓGICO......39

4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA...........................................................40

5 RESULTADOS.............................................................................41

5.1 MASSA CORPORAL.................................................................41

5.2 INGESTÃO ALIMENTAR E ENERGÉTICA...............................42

5.3 LIPIDOGRAMA..........................................................................44

5.4 MARCADORES DE FUNÇÃO HEPÁTICA................................47

5.5 CONTROLE DE QUALIDADE DOS ENSAIOS

BIOQUÍMICOS................................................................................50

5.5.1 Curva Padrão..........................................................................50

5.5.2 Controles de Qualidade..........................................................51

6 DISCUSSÃO................................................................................52

7 CONCLUSÕES............................................................................56

8 REFERÊNCIAS............................................................................57

ANEXO 1 – Aprovação pelo Comitê de Ética no Uso de

Animais

1

1. INTRODUÇÃO

A aterosclerose é uma doença inflamatória multifatorial que acomete a

camada intima das artérias (Sposito et al., 2007). Juntamente com as demais

doenças cardiovasculares, esta é uma importante causa de óbitos ao redor do

mundo (Re et al., 1994; Laurenti et al., 2000; Reis et al., 2006). Além de fatores

genéticos predisponentes, os fatores de risco para tal doença estão

relacionados com os hábitos de vida e hábitos alimentares do indivíduo. Dessa

forma, diversos fatores como a hiperglicemia, a lipoproteína de baixa

densidade (LDL) aumentada, a lipoproteína de alta densidade (HDL) diminuída,

a resistência a insulina, a intolerância a glicose e a hipertensão arterial, que

são componentes da chamada Síndrome Metabólica, podem aumentar

consideravelmente o risco para o desenvolvimento da doença (Sinaiko, 2007;

Bonomini et al., 2015).

O aparecimento de placas (ateroma) resultantes do acúmulo de lipídeos,

macrófagos, restos celulares e diversas outras substâncias envoltos por uma

capa fibrótica rica em colágeno é a principal característica da doença (Sposito

et al., 2007). Tal formação se dá a partir da lesão endotelial que leva a uma

maior permeabilidade a lipoproteínas, principalmente ao LDL que se acumulam

na camada íntima arterial e se tornam imunogênicas (Weber e Noels, 2011;

Tavafi, 2013). A partir daí, a resposta imune se torna predominante na

patogênese e macrófagos fagocitam cristais de colesterol, se tornando células

esponjosas que estão presentes já nas lesões ateroscleróticas iniciais (Olivares

et al., 2016). Essas lesões progridem com o recrutamento de mais células

inflamatórias, proliferação das células inflamatória na lesão, apoptose celular e

aparecimento de um tecido necrótico (Lhotak et al., 2016). Com o avanço da

lesão pode haver a ruptura dessa placa resultando numa complicação

denominada aterotrombose que pode acarretar diversas consequências ao

paciente (Libby, 2002; Xavier et al., 2013).

O estudo do metabolismo lipídico é muito importante para se

compreender a aterosclerose. Os lipídeos são carreados pelo corpo humano

2

por partículas denominadas lipoproteínas (Wilkins, 2002) e, principalmente as

partículas do tipo LDL e as do tipo HDL são muito relacionadas a doença

aterosclerótica de modo que a partícula LDL apresenta um efeito pró

aterosclerótico enquanto partículas HDL apresentam um efeito protetor a

doença (Forti e Diament, 2006). Além disso, o monitoramento do processo

inflamatório hepático a partir de marcadores de lesão hepática como as

enzimas transaminase glutâmico oxalacética (TGO), transaminase glutâmico

pirúvica (TGP) e fosfatase alcalina (FA) é importante na aterosclerose à medida

que a doença hepática gordurosa não alcoólica é considerada uma

manifestação hepática da síndrome metabólica (Soler et al., 2008; Chaves et

al., 2012; Schild et al., 2013; Efe et al., 2014).

A utilização de animais de laboratório para o estudo de patologias

humanas é muito comum e com a aterosclerose não é diferente. Porem, nesse

caso, esse é um grande desafio visto que nenhum animal representa com

precisão todas as etapas da aterosclerose humana (Xiangdong et al., 2011).

Apesar de o camundongo ser naturalmente resistente a aterosclerose, esse

modelo é amplamente utilizado já que algumas espécies são capazes de

desenvolver lesões inicias a partir da utilização de uma dieta específica rica em

colesterol e gordura suplementada com ácido cólico (Nishina et al., 1990), além

de existirem modelos de camundongos geneticamente modificados para esse

fim (Plump et al., 1992; Zhang et al., 1992; Breslow, 1996; Leong et al., 2015).

3

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 ATEROSCLEROSE

As doenças cardiovasculares são uma importante causa de morte em

todo o mundo, tanto em países desenvolvidos quanto em países ainda em

desenvolvimento (Laurenti et al., 2000). Alguns estudos mostram que eventos

cardiovasculares, dentre eles a aterosclerose, são responsáveis por grande

parte das ocorrências de morte súbita (Re et al., 1994; Reis et al., 2006). Nos

últimos anos houve um declínio da mortalidade por tais doenças em países

desenvolvidos, enquanto em países em desenvolvimento essa ocorrência vem

aumentando, o que ocorre no Brasil (Sposito et al., 2007). Diante disso, é

considerado muito importante estudar os fatores de risco para o

desenvolvimento da aterosclerose, suas características iniciais,

desenvolvimento e patogênese.

A Síndrome Metabólica é um transtorno caracterizado por diversos

fatores que levam a uma maior predisposição para as doenças

cardiovasculares e para o diabetes (Sinaiko e University of Minnesota, 2007).

Dentre esses fatores, pode-se destacar a hiperglicemia, LDL aumentado, HDL

diminuído, a resistência à insulina, a intolerância à glicose e a hipertensão

arterial. Quando esses fatores estão combinados com a predisposição genética

e com a obesidade, eles se tornam os principais fatores de risco para diversas

doenças, incluindo a aterosclerose (Bonomini et al., 2015). Além disso, o

consumo de alimentos ricos em gordura saturada aumenta o potencial de

monócitos se tornarem células esponjosas, ou seja, macrófagos repletos de

cristais de colesterol que estão presentes já nas fases iniciais da lesão

aterosclerótica (Henning et al., 2016).

Dessa forma, nota-se que os hábitos de vida e principalmente os hábitos

alimentares do indivíduo tem um importante papel no desenvolvimento e

estabelecimento da doença.

4

2.2 FISIOPATOLOGIA DA ATEROSCLEROSE

A aterosclerose é uma doença inflamatória que acomete a camada

intima das artérias e é caracterizada pelo aparecimento de placas de gordura

(ateroma). Tais placas são resultado de um acúmulo de lipídeos, macrófagos,

restos celulares, cálcio e outras substâncias, além de uma capa fibrosa rica em

colágeno (Sposito et al., 2007). Apesar do diagnóstico clínico dessa doença e

suas consequências normalmente ocorrerem após a meia-idade, seus sinais e

o início de seu desenvolvimento podem ocorrer ainda na infância e

adolescência (Santos et al., 2008).

A formação da placa característica da aterosclerose se dá a partir da

lesão endotelial causada por fatores de risco para a doença, como a

hipertensão arterial e o diabetes. A partir dessa lesão, ocorre o remodelamento

endotelial que leva a uma maior permeabilidade a lipoproteína, principalmente

as de baixa densidade (por sua capacidade de penetrar na célula endotelial por

endocitose). Há então o acumulo de lipoproteínas aterogênicas, como o LDL na

camada íntima arterial, mais especificamente no local da lesão (Weber e Noels,

2011; Tavafi, 2013).

Ao serem retidas no espaço subendotelial, as partículas de LDL sofrem

oxidação e se tornam imunogênicas, ou seja, há exposição de neoantígenos, o

que faz com que células do sistema imune sejam atraídas para o local onde

estes se encontram (Sposito et al., 2007; Rafieian-Kopaei et al., 2014). Além

disso, a presença de LDL oxidada (LDL-ox) estimula a expressão de moléculas

de adesão leucocitárias na superfície endotelial, promovendo a adesão de

leucócitos no local de acúmulo dessas moléculas (Kume et al., 1992; Boisvert

et al., 1998).

A partir de seu recrutamento, os macrófagos fagocitam esses cristais de

colesterol formando as chamadas células esponjosas, que são o principal

componente das lesões iniciais da aterosclerose, chamadas de estrias

gordurosas (Olivares et al., 2016). O crescimento da lesão aterosclerótica se

5

dá, então, a partir da proliferação de macrófagos. Quando a proliferação de

macrófagos diminui, mais monócitos são recrutados juntamente com linfócitos,

fazendo com que a resposta imune seja um importante fator para que a lesão

se mantenha. Com o avanço da lesão, macrófagos entram em apoptose e no

ultimo estágio da lesão pode-se notar um estágio necrótico em que se

observam restos celulares e cristais de colesterol a nível celular, como pode

ser observado na Figura 1 (Lhotak et al., 2016).

Além disso, mediadores de inflamação estimulam a migração e

proliferação de células musculares lisas da camada média próxima a intima e

estas, por sua vez, produzem mais citocinas, fatores de crescimento e a matriz

extracelular que vai ser fundamental para a constituição da camada fibrosa

externa da lesão (Sposito et al., 2007).

A ruptura da capa fibrótica da placa aterosclerótica expõe material

lipídico altamente trombogênico, causando a chamada aterotrombose (Xavier

et al., 2013). Nesse caso, essa é uma das complicações da aterosclerose que

pode levar ao infarto agudo do miocárdio, além de acidente vascular encefálico,

que pode levar o paciente a graves complicações ou até mesmo a morte

(Libby, 2002).

6

Figura 1 – Desenvolvimento da placa aterogênica. Na fase inicial da aterosclerose

(1), há infiltração de monócitos na camada endotelial, a diferenciação destes em

macrófagos e a proliferação celular induzindo o crescimento da lesão. Em 2, a

proliferação de macrófagos aumenta e, além disso, mais monócitos são recrutados. A

infiltração de células inflamatórias (3), compostas pela proliferação de linfócitos ocorre

simultaneamente com a apoptose de macrófagos, sendo esta a transição entre as

lesões iniciais e intermediárias. No estágio intermediário (4), além de células

inflamatórias, já se pode observar a formação de um tecido necrótico. Em lesões

avançadas (5), a proliferação celular se torna mais lenta e a lesão avança a um estado

necrótico com a presença de restos celulares e cristais de colesterol. Adaptado de

(Lhotak et al., 2016).

7

2.3 METABOLISMO LIPÍDICO

Os lipídeos de maior relevância clínica são os fosfolipídios, o colesterol,

os triglicerídeos e os ácidos graxos (Grundy, 1998; Sposito et al., 2007). Esses

lipídeos viajam pelo sangue em diferentes partículas chamadas lipoproteínas

(Wilkins, 2002). As lipoproteínas, como sugere o nome, são compostas de

lipídeos e proteínas, sendo classificadas em quilomícrons (Qm), lipoproteínas

de muito baixa densidade (VLDL), lipoproteínas de densidade intermediária

(IDL), LDL e HDL.

O colesterol é precursor de hormônios esteroidais, ácidos biliares e da

vitamina D. Por outro lado, os triglicerídeos têm em sua conformação três

ácidos graxos ligados a uma molécula de glicerol e possuem um papel

importante no armazenamento energético (Wilkins, 2002; Sposito et al., 2007).

O metabolismo lipídico pode ser dividido em duas vias, a via exógena

que se inicia com a absorção e se estende até o transporte dos lipídeos

ingeridos ao fígado e aos tecidos e a via endógena que compreende o

transporte e metabolismo das lipoproteínas produzidas no fígado (Silva, 2015).

Os triglicerídeos (TGs) representam a maior parte das gorduras que os

indivíduos ingerem. Ao serem ingeridos, os TGs são quebrados em ácidos

graxos livres no intestino pelas lipases pancreáticas presentes no suco

pancreático. Os demais lipídeos ingeridos são emulsificados por componentes

da bile e transformados em micelas, o que facilita a sua absorção. Após

absorvidos pelas células intestinais, tais partículas lipídicas, em especial os

ácidos graxos, são utilizados para a produção de Qms (Xavier et al., 2013).

Os Qms, por sua vez, entram na circulação linfática e alcançam assim a

circulação sanguínea. Nesta, a enzima lipase lipoproteica faz a hidrólise dessa

lipoproteína, o que permite a entrega de ácidos graxos para células musculares

e adipócitos. São então formadas partículas de Qm remanescentes, que são

captadas pelo fígado (Cooper, 1997).

8

No fígado, a partir dos TGs e outras moléculas como as apolipoproteínas

B-100, E e C, são formadas as partículas de VLDL. Estas são liberadas para a

circulação onde, assim como ocorre com o Qm, são hidrolisadas pela lipase

lipoproteica e, com isso, são formadas partículas remanescentes de VLDL e

IDL. Essas partículas, ao chegarem no fígado, podem ser degradadas ou sofrer

a ação da lipase hepática, o que resulta na formação de partículas de LDL. A

LDL é a principal lipoproteína carreadora de colesterol para tecidos periféricos

(Santos et al., 1999).

O HDL, por sua vez, é uma lipoproteína heterogênea que pode ser

secretada pelo fígado, sintetizada diretamente pelo intestino e, ainda, resultar

de restos do catabolismo de lipoproteínas ricas em triglicerídeos. Estas são

importantes por fazerem o transporte do colesterol proveniente de tecidos

periféricos para o fígado para que este seja, então, removido do organismo

(Silva, 2015).

Por fim, vale salientar que durante a hidrólise de lipoproteínas ricas em

TGs, essas lipoproteínas estão sujeitas a trocas lipídicas com HDL e LDL

através da ação da proteína de transferência do éster de colesterol (CETP)

(Tall, 1993; Santos et al., 1999; Forti e Diament, 2006). Na Figura 2 é ilustrado

resumidamente o metabolismo esse metabolismo lipídico.

9

Figura 2 – Sumário do metabolismo lipoproteico. O esquema ilustra o metabolismo

lipoproteico a partir da absorção intestinal e o movimento das partículas lipídicas a

partir das diversas lipoproteínas, incluindo seu metabolismo hepático. Dessa forma, se

pode observar tanto o metabolismo lipídico exógeno (partindo do intestino) como

endógeno (partindo do fígado) e as diversas moléculas que formam as lipoproteínas.

Adaptado de (Silva, 2015).

10

2.4 PERFIL LIPÍDICO E RISCO DE ATEROSCLEROSE

Em relação a aterosclerose, as principais lipoproteínas a serem

estudadas são o HDL e o LDL, já que se sabe que concentrações sanguíneas

elevadas de LDL e concentrações baixas de HDL são importantes fatores de

risco para as doenças cardiovasculares e para a formação da placa

aterosclerótica (Forti e Diament, 2006).

Valores desejáveis de colesterol total (CT) devem se limitar a 200 mg/dL.

Os valores de HDL devem estar acima de 45 mg/dL para mulheres e acima de

35 mg/dL para homens e os valores de LDL devem ser até 100 mg/dL para ser

considerado desejável. O valor de TG desejável deve se limitar a 200 mg/dL

(Wilkins, 2002).

2.4.1 Papel do HDL na aterosclerose

O colesterol HDL tem um efeito protetor contra a aterosclerose por

diversos fatores (Acton et al., 1996; Assmann e Gotto, 2004; Linsel-Nitschke e

Tall, 2005). Em primeiro lugar, tal lipoproteína faz o transporte reverso do

colesterol, ou seja, transporta o colesterol até o fígado para que o mesmo seja

eliminado. Esse transporte pode ser feito diretamente já que as CETPs e as

proteínas de transferência de fosfolípides (PLTP) transferem triglicerídeos e

fosfolípides de outras lipoproteínas para o HDL e esse HDL rico em TGs é mais

sensível a ação das lipases hepáticas. Além disso, ocorre o transporte reverso

indireto de colesterol à medida que partículas de LDL e VLDL são enriquecidas

com colesterol esterificado proveniente do HDL por intermédio da CETP, o que

as torna mais sensíveis às lipases hepática e a captação destes por receptores

presentes no fígado (Forti e Diament, 2006; Leança et al., 2010; Ferreira e

Sposito, 2014).

11

O HDL também exerce um efeito protetor em relação à aterosclerose de

outras formas. Ele apresenta efeito antitrombótico ao inibir a agregação

plaquetária, diminuir a viscosidade sanguínea, diminuir a atividade do fator

tecidual e inibidor do ativador do plasminogênio 1 (PAI-1) e diminuir os níveis

de antígenos (Rosenson et al., 1998). Além disso, o HDL é capaz de promover

a proteção do endotélio ao inibir as moléculas de adesão leucocitária na

superfície endotelial, como a molécula de adesão vascular (VCAM1), molécula

de adesão intracelular (ICAM1) e a E-selectina (Cybulsky e Gimbrone, 1991;

Cockerill et al., 1995). O HDL interfere no diâmetro do vaso ao aumentar a

concentração da proteína óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) (Rämet et al.,

2003) e modula a produção do peptídeo natriurético C (Sugiyama et al., 1995)

causando vasodilatação, e ao provocar o relaxamento vascular ao estimular a

síntese de prostaciclina (Fleisher et al., 1982).

Por fim, o HDL apresenta uma função anti-inflamatória ao inibir

moléculas fundamentais no processo inflamatório como a interleucina 1(IL-1) e

a interleucina 8 (IL-8) (Cockerill et al., 1995). Além disso, o HDL inibe alguns

produtos da oxidação do LDL, revertendo os efeitos do LDL-ox (Matsuda et al.,

1993) e diminuindo a peroxidação lipídica do LDL (Mackness et al., 2016).

2.4.2 Papel do LDL na aterosclerose

Sabe-se que existe uma estreita relação entre o colesterol LDL e a

aterosclerose, sendo essa lipoproteína considerada elemento importante na

formação da placa aterosclerótica (Boisvert et al., 1998; Ramos, 1998; Wilkins,

2002).

O LDL apresenta maior capacidade de penetração no endotélio

lesionado onde sofre oxidação, tornando-se LDL-ox (Weber e Noels, 2011). A

presença de LDL-ox foi observada em placas ateroscleróticas tanto em

humanos quanto em animais (Ylä-Herttuala et al., 1989). Tal modificação de

LDL para LDL-ox pode ser induzida tanto por células musculares lisas, quanto

por células endoteliais ou até mesmo por macrófagos e monócitos (Henriksen

12

et al., 1981; Henriksen et al., 1983; Parthasarathy et al., 1986). Esse processo

é decorrente da ação de espécies reativas de oxigênio (ROS) e espécies

reativas de nitrogênio (RNS) liberadas pelas células, desencadeando a

peroxidação lipídica (Steinberg et al., 1989).

O LDL-ox apresenta citotoxidade aumentada em relação ao LDL não

oxidado, atividade quimiotática para monócitos circulantes e inibitória para

migração de macrófagos da parede arterial para os tecidos, fatores que

contribuem para a resposta inflamatória que culmina na aterosclerose. Além

disso, apresenta menor taxa de captação pelos receptores de LDL presente

nas células hepáticas e periféricas e maior afinidade pelos receptores

scavenger dos macrófagos contribuindo, assim, para a formação das células

esponjosas (Siqueira et al., 2006).

2.4.3 Papel do triglicerídeo na aterosclerose

O metabolismo lipídico está intimamente relacionado a

hipertrigliceridemia e costuma ocorrer juntamente com outros fatores de risco

para a aterosclerose como o aumento do LDL, diminuição do HDL, resistência

a insulina, hipertensão arterial, obesidade, entre outros fatores (Grundy, 1998;

Wilkins, 2002). Além disso, estudos mostram que a elevação dos níveis de TGs

é, também, um fator independente para o desenvolvimento da placa (Nakaya,

2002) já que lipoproteínas ricas em TGs, principalmente o VLDL, apresentam

efeito aterogênico (Schiavo et al., 2003).

Estudos mostram, também, que a hipertrigliceridemia acelera a

aterosclerose ao estar associado com a diminuição do HDL, aumento de

lipoproteínas remanescentes, pequena elevação do LDL e aumento de

condições trombogênicas (Nakaya, 2002).

13

2.5 PROCESSO INFLAMATÓRIO HEPÁTICO

A doença hepática gordurosa não alcoólica abrange um aspecto de

alterações que vão desde a esteatose hepática assintomática, com a dosagem

de aminotransferases (TGO e TGP) de normais a um pouco elevadas, até a

esteatohepatite, que consiste em esteatose com inflamação, fibrose e cirrose

(Neuschwander-Tetri e Caldwell, 2003; Damiani et al., 2011). Estudos mostram

que uma dieta com alto teor de lipídeos pode levar a inflamação hepática

independe da presença ou não de esteatose. Além disso, camundongos

modificados geneticamente para apresentam hiperlipidemia se mostram

susceptíveis ao desenvolvimento da esteatohepatite não alcoólica (Wouters et

al., 2008). Daí a importância da dieta nos processos inflamatórios hepáticos e

na consequente lesão hepática.

Day e colaboradores propuseram um modelo para explicar a patogênese

da esteatohepatite, o qual consiste em dois eventos: 1) esteatohepatite

relacionada a resistência à insulina e a obesidade e; 2) esteatohepatite

relacionada ao estresse oxidativo (Day e James, 1998).

No primeiro evento, depósitos lipídicos e a lipólise estão comprometidos

em tecidos mais sensíveis à insulina, o que aumenta a concentração de ácidos

graxos no plasma e, consequentemente, aumenta o fluxo de ácidos graxos

livres para o fígado, gerando um acúmulo de triglicerídeos no hepatócito (Day e

James, 1998; Browning e Horton, 2004; Damiani et al., 2011), como pode ser

observado na Figura 3.

14

Figura 3 – Esteatose hepática. Alterações metabólicas que resultam no acúmulo

de triglicerídeos no fígado em casos de resistência à insulina. Adaptado de (Browning

e Horton, 2004).

15

O segundo evento, caracterizado pelo estresse oxidativo (Figura 4), é

resultante do desequilíbrio entre espécies químicas pró-oxidantes e

antioxidantes (Robertson et al., 2001). A oxidação de ácidos graxos é uma

importante fonte de espécies químicas pró-oxidantes como, por exemplo,

radicais hidroxil e ânions superóxido que, juntamente com outras espécies

químicas, são chamadas de ROS. O aumento de ROS causa depleção de ATP

e do dinucleotídeo nicotinamida, altera a estabilidade proteica, destrói

membranas via peroxidação lipídica e aumenta citocinas pró-inflamatórias. Tais

eventos levam a lesão celular (Bergamini et al., 2004; Browning e Horton, 2004;

Damiani et al., 2011).

Figura 4 – Esteatohepatite e estresse oxidativo. Mecanismo de lesão celular

induzido por lipídios na doença hepática não alcoólica (Browning e Horton, 2004).

16

2.6 MARCADORES HEPÁTICOS NA ATEROSCLEROSE

A avaliação da função hepática se torna importante quando se trata da

aterosclerose, à medida que os estudos mostram uma estreita correlação entre

a doença hepática gordurosa não alcoólica e a síndrome metabólica, podendo

a primeira ser considerada uma manifestação hepática da segunda. A

síndrome metabólica, por sua vez, é um fator de risco conhecido para doenças

cardiovasculares (Soler et al., 2008; Chaves et al., 2012; Schild et al., 2013; Efe

et al., 2014). Além disso, a avaliação hepática deve ser feita rotineiramente em

pacientes de todas as idades que apresentem fatores de risco para doença

hepática, como a obesidade, o diabetes e a hiperlipidemia (Minuk, 1998).

A enzima TGP é encontrada no citosol do hepatócito em maior

quantidade do que em outros tecidos, o que a torna a enzima mais específica

para a caracterização de doença hepática. A enzima TGO, por sua vez, é

localiza-se tanto no citosol quanto na mitocôndria e está distribuída por

diversos tecidos como o fígado, o coração, o musculo esquelético, os rins, o

cérebro, o pâncreas, os pulmões, os leucócitos e os eritrócitos sendo, dessa

forma, menos específica para lesões hepáticas. A relação entre os valores

séricos de ambas é importante na avaliação da gravidade da lesão hepática

(Minuk, 1998; Ozer et al., 2008; Al-Busafi et al., 2013). Além disso, a doença

hepática não gordurosa é um importante fator para o aumento discreto dessas

transaminases (Al-Busafi et al., 2013).

A FA é uma enzima localizada na membrana celular e está presente

principalmente no fígado e nos ossos (Ozer et al., 2008). Dessa forma, o

aumento sérico dessa enzima se relaciona principalmente a distúrbios nesses

dois órgãos. Quando há indícios de que tal aumento possui origem hepática,

deve-se pesquisar tanto por colestase (obstrução parcial dos dutos biliares,

cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária ou colestase por drogas)

ou por doença hepática infiltrativa (Mincis e Micis, 2016).

17

2.7 MODELOS ANIMAIS DE ATEROSCLEROSE

Muitos animais já foram utilizados como modelo para o estudo da

aterosclerose, dentre eles coelhos, ratos, camundongos, hamster, suínos, aves

e primatas. Todavia, não há nenhum modelo animal que demonstre com

precisão todos os estágios da aterosclerose humana (Xiangdong et al., 2011).

Os camundongos costumam ser utilizados em experimentos que

investigam a aterosclerose por apresentarem pequeno porte, tempo de vida

relativamente curto, serem de fácil manutenção e domesticação e

desenvolverem diversas patologias humanas (Animais de laboratório: o

camundongo, 2016). Entretanto, os camundongos costumam ser resistentes ao

desenvolvimento da placa aterosclerótica induzida por dieta, visto que

aproximadamente 70% do seu colesterol total sérico é representado por

partículas de HDL (Xiangdong et al., 2011).

Mesmo em face a essa limitação do modelo, estudos mostram que

camundongos C57Bl/6J alimentados com uma dieta rica em colesterol e

gordura suplementada com ácido cólico, apresentam células esponjosas no

espaço subendotelial após alguns meses de ingestão da dieta, o que indica

que tais animais são capazes de desenvolver a placa aterosclerótica (Nishina

et al., 1990; Breslow, 1996).

Além da linhagem C57Bl/6J, as linhagens AKR/J, DBA/2J e C57L/J

também são capazes de desenvolver aterogênese induzida por dieta, apesar

de serem menos susceptíveis (Paigen et al., 1985). A principal desvantagem

destes modelos é que a lesão observada a partir da utilização de tal dieta é

pequena, chegando apenas aos estágios iniciais da aterosclerose humana

(estrias gordurosas), após um tempo de ingestão de dieta entre 12 semanas a

9 meses, apesar deste tempo ser variável (Paigen et al., 1985; Jawien et al.,

2004).

Além dos modelos de aterogênese em camundongos induzidos por

dieta, existem os modelos modificados geneticamente (Xiangdong et al., 2011).

Entre estes, pode-se destacar o modelo knockout para a apolipoproteína E

18

(ApoE-/-) e o modelo (LDLR-/-), que são bem estudados, caracterizados e

desenvolvem placas ateroscleróticas expressivas.

A apolipoproteína é responsável pelo empacotamento do colesterol e

outras gorduras. No modelo ApoE-/- os camundongos apresentam a

apolipoproteína E inativada pela técnica de targeting e, por esse motivo, os

animais apresentam concentrações plasmáticas de colesterol

aproximadamente cinco vezes maiores e desenvolvem depósitos de células

esponjosas na aorta a partir dos três meses de idade (Plump et al., 1992;

Zhang et al., 1992).

Já o modelo LDLR-/- apresenta inativação do receptor de LDL. Esse

receptor está presente nos hepatócitos e faz a mediação da endocitose de

ApoE para captar as partículas de LDL da circulação sanguínea. Por esse

motivo, os níveis de colesterol aumentam duas vezes nos camundongos LDLR-

/- em relação ao animal que não apresenta tal modificação genética (Breslow,

1996; Leong et al., 2015).

19

3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVOS GERAIS

Avaliar bioquimicamente o perfil lipídico e marcadores de lesão hepática

no soro de camundongos submetidos a uma dieta aterogênica.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Avaliar curto período de administração de dieta rica em lipídios

saturados, colesterol e ácido cólico desencadeia alterações

bioquímicas anteriores a formação das lesões ateroscleróticas

propriamente ditas;

• Avaliar a progressão do perfil lipídico em resposta a uma dieta

aterogênica ao dosar o TG, CT, HDL colesterol e LDL colesterol

séricos;

• Avaliar a progressão de marcadores de lesão hepática em resposta a

uma dieta aterogênica através da dosagem de FA, TGP e TGO.

20

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 ANIMAIS E GRUPOS EXPERIMENTAIS

Os protocolos para a experimentação animal foram aprovados pelo

Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal Fluminense

(CEUA/UFF n°647/2015). Foram utilizados camundongos C57Bl/6 machos

obtidos do Biotério Central da UFF localizado no Campus Valonguinhos e

mantidos, durante todo o experimento, no Biotério do Instituto de Saúde de

Nova Friburgo da UFF. Os animais foram mantidos em gaiolas com no máximo

cinco animais e, aos três meses de idade começaram a ser alimentados com

dieta controle ou dieta aterogênica por um tempo de dois, quatro ou oito

semanas. Os grupos experimentais foram classificados de acordo com o

número de semanas de alimentação com a respectiva dieta conforme descrito

a seguir com um número de 12 animais por grupo experimental:

o Grupo C2: Dieta controle por 2 semanas



o Grupo A2: Dieta aterogênica por 2 semanas



As dietas utilizadas no experimento foram elaboradas pela empresa

PragSoluções (Jaú-SP, www.pragsolucoes.com.br), com base nas

recomendações do Instituto Americano de Nutrição (AIN-93M) (Reeves et al.,

1993). A composição das dietas controle e aterogênicas está descrita na tabela

a seguir (Tabela1).

http://www.pragsolucoes.com.br/

21

Tabela 1 – Composição nutricional das dietas experimentais

DIETA

CONTROLE

DIETA

ATEROGÊNICA

INGREDIENTES (g/kg)

Amido de Milho 466,0 193,0

Amido de Milho dextrinizado 155,0 155,0

Sacarose 100,0 100,0

Caseína 140,0 175,0

Óleo de soja 40,0 40,0

Banha (colesterol total) --- 238,0*

Fibras (celulose) 50,0 50,0

L-cistina 1,8 1,8

Colina 2,5 2,5

BHT 0,008 0,04

Mix de Minerais 35,0 35,0

Mix de Vitaminas 10,0 10,0

Ácido cólico --- 5,0

TOTAL 1.000,0 1.005,3

ENERGIA DA DIETA

Kcal/g 3.804 5.000

Proteína (%) 14,0 14,0

Carboidratos (%) 76,0 36,0

Lipídios (%) 10,0 50,0

*A banha consiste em gordura saturada. Cada 100g contém 243,0 mg de colesterol

A principal diferença entre as dietas utilizadas está na adição de gordura

saturada (banha) e ácido cólico na composição da dieta aterogênica. A banha

adicionada apresenta altos níveis de colesterol em sua composição e o ácido

cólico tem a função de potencializar o efeito desse colesterol. Além disso, tais

adições fizeram com que a dieta aterogênica apresentasse uma maior

quantidade de energia (5.000 Kcal/g).

Durante o experimento, a massa corporal foi aferida semanalmente a fim

de avaliar o ganho de peso dos animais. Para se avaliar a quantidade de

alimento e de energia ingerida pelos camundongos, a ingestão alimentar foi

aferida diariamente durante todo o experimento.

22

4.2 EUTANÁSIA E COLETA DE AMOSTRAS

Para a eutanásia, os animais foram colocados em jejum (sem privação

de água) por seis horas a fim de se medir a glicemia de jejum. A glicemia foi

aferida a partir de uma gota de sangue coletada a partir de uma pequena

incisão na cauda de cada animal com a utilização de um glicômetro (Glicômetro

One Touch Ultra) porém não foi observada diferença significativa em relação a

glicemia entre os grupos estudados.

Logo após a aferição da glicemia os camundongos foram anestesiados

com ketamina (100,0 mg/kg) e xilasina (10,0 mg/kg) intraperitoneal e a

eutanásia só foi realizada após esses animais não responderem mais a

estímulos. O sangue foi então coletado diretamente do átrio direito por punção

com a utilização de uma seringa de 1 mL.

O sangue coletado foi acondicionado em microtubos de 1,5 mL (um

microtubo por animal) e centrifugado por dez minutos a 3.200 rpm a 4°C, após

a retração sanguínea. Por fim, o soro foi separado após a centrifugação,

acondicionado em um segundo microtubo e congelado em congelador

convencional -20°C para a posterior bioquímica sanguínea. O restante do

sangue foi descartado.

4.3 BIOQUÍMICA SANGUÍNEA

Entre as 12 amostras coletadas por grupo, foram utilizadas

aleatoriamente seis amostras para a realização das dosagens bioquímicas. As

dosagens bioquímicas foram feitas através de ensaios colorimétricos (Bioclin,

Belo Horizonte, MG, Brasil) adaptados para serem realizados em microplaca de

96 poços. Foram dosados o CT, HDL colesterol, LDL colesterol, TG e enzimas

hepáticas (TGO, TGP e FA). Todas as dosagens foram realizadas com as

amostras em duplicata e os controles e padrões em triplicata.

23

Anterior à realização dos ensaios, o soro foi retirado do congelador

(descongelado) e acondicionado em gelo até o momento de ser utilizado. Antes

da pipetagem das amostras, as mesmas foram homogeneizadas em vortex.

Todos os ensaios bioquímicos colorimétricos foram lidos com a utilização do

espectrofotômetro de microplacas Epoch (LifeTechnologies), na configuração

area scan 5x5 a fim de, ao captar a absorbância de diversos pontos de cada

poço da microplaca, apresentar resultados mais fidedignos, ao evitar efeito do

menisco do líquido e presença de bolhas no líquido.

4.3.1 Colesterol Total

A dosagem do CT foi feita com a utilização do kit colorimétrico

COLESTEROL MONOREAGENTE K083 da empresa Bioclin. O ensaio foi

adaptado para a realização em microplaca de 96 poços, sendo a capacidade

total de cada poço de 300µL. Para tal adaptação, foi adicionado 200µL do

reagente de trabalho (RT) nº1 em todos os poços, incluindo padrões, controles

e amostras. Os padrões 1, 2 e 3 foram pipetados de acordo com o volume

indicado na tabela abaixo (Tabela 2) utilizando o RT nº 2, em triplicata. As

amostras e os controles foram adicionados em seus respectivos poços em

quantidade de 2 µL.

Após a adição de reagentes, padrões e amostras, a microplaca foi

agitada para homogeneização e colocada em banho-maria a 37°C para o

desenvolvimento da cor. Após, foi feita a leitura da absorbância de cada poço

da microplaca em espectrofotômetro de microplacas (Epoch, LifeTechnologies)

no modo area scan 5x5, no λ 500 nm (490-550 nm), acertando o zero com o

branco.

24

Tabela 2 – Ensaio para dosagem do colesterol total sérico

Quantidade de reagentes, controles e amostras que foram adicionados aos poços da microplaca correspondentes aos padrões, controles e

amostras para a obtenção do colesterol total sérico. Na coluna “explicação” se observa o valor do colesterol total em mg/dL contido em cada

padrão (PAD1, PAD2 e PAD3). *Concentração desconhecida.

RT (N° 1) RT (N° 2)

CN, CP ou

Amostra Explicação

BRC 200 µL --- --- Branco

PAD 1 200 µL 1,0 µL --- Padrão 1 (100 mg/dL)



CN 200 µL --- 2,0 µL Controle Normal

CP 200 µL --- 2,0 µL Controle Patológico

AMOSTRAS 200 µL --- 2,0 µL Amostras*

25

4.3.2 HDL Colesterol

A dosagem do colesterol HDL foi obtida a partir da utilização do kit

colorimétrico HDL DIRETO K071 da empresa Bioclin adaptado para ser feito

em microplaca de 96 poços.

Primeiramente foram adicionados 150 µL de reagente RT nº 1 em todos

os poços da microplaca, seguido dos padrões em quantidade determinada na

tabela a seguir (Tabela 3) e 1,5 µL dos controles e das amostras em suas

respectivas posições na microplaca. Feito isso, a microplaca foi

homogeneizada à mão e colocada em banho-maria a 37°C por 10 min e foi

feita a leitura da absorbância a 550 nm (Epoch, LifeTechnologies, area scan

5x5).

Após a leitura da primeira etapa do ensaio, iniciou-se a segunda etapa,

na qual foi adicionado 50 µL do RT nº 2 em todos os poços. Feito isso, a

microplaca foi novamente homogeneizada e colocada em banho-maria a 37ºC

por 10 min. Após a incubação foi feita uma nova leitura da absorbância a 550

nm (Epoch, LifeTechnologies, area scan 5x5).

Para o cálculo do valor do colesterol HDL das amostras, primeiramente

foi subtraído a absorbância do branco da absorbância de todos os poços. Após,

o valor da primeira leitura foi subtraído da segunda leitura. O valor resultante foi

utilizado para o cálculo da equação de regressão linear e correlação de

Pearson da curva padrão. A partir desta curva foi determinado o valor em

mg/dL do colesterol HDL de todas as amostras.

26

Tabela 3 – Ensaio para dosagem do HDL colesterol sérico

Quantidades de reagentes, padrão e amostras que devem ser pipetados nos poços da microplaca correspondentes aos padrões, controles e

amostras para a obtenção do colesterol HDL pelo método direto. Na coluna “explicação” se observa o valor em mg/dL do colesterol HDL

contido em cada padrão (PAD1, PAD2 e PAD3). * Concentração desconhecida.

ETAPA 1

Leitura 1

HOMOGENEIZAR

+

BANHO-MARIA

37ºC por 10 min

+

LER

ABSORBÂNCIA

550 nm

ETAPA 2

Leitura 2

HOMOGENEIZAR

+

BANHO-MARIA

37ºC por 10 min

+

LER

ABSORBÂNCIA

550 nm

Explicação

RT

(N° 1)

CN, CP ou

Amostra Calibrador

RT

(N° 2)

BRC 150 µL --- --- 50 µL Branco

PAD 1 150 µL --- 0,75 µL 50 µL Padrão 1 (27 mg/dL)



CN 150 µL 1,5 µL --- 50 µL Controle Normal

CP 150 µL 1,5 µL --- 50 µL Controle Patológico

AMOSTRAS 150 µL 1,5 µL --- 50 µL Amostras*

27

4.3.3 LDL Colesterol

Para a dosagem do colesterol LDL nas amostras de soro dos animais foi

utilizado o kit colorimétrico COLESTEROL LDL TOTAL K088 da empresa

Bioclin adaptado para ser feito em microplaca de 96 poços.

Foi adicionado 150 µL de RT em todos os poços, incluindo os poços

correspondentes a branco, controles, padrões e amostras. Foi adicionado água

destilada, calibrador, controles e amostras nas quantidades indicadas na tabela

a baixo (Tabela 4) em seus respectivos poços na microplaca. Após essa

adição, a microplaca foi homogeneizada a partir de agitação manual e colocada

em banho-maria a 37°C por 5 minutos. Após essa etapa, a absorbância foi lida

em 600 nm (Epoch, LifeTechnologies, area scan 5x5, 546 - 600 nm).

Após a primeira leitura, foi adicionado 50 µL de RT n°2 em todos os

poços, a microplaca foi novamente homogeneizada e colocada em incubação

por 5 minutos em banho-maria a 37°C. Uma nova leitura foi feita em 600 nm

(Epoch, LifeTechnologies, area scan 5x5, 546 - 600 nm).

Para a obtenção dos valores de colesterol LDL em mg/dL foi subtraída a

leitura da absorbância do poço branco da leitura de todos os demais poços em

ambas as leituras. Foi subtraída a primeira leitura da segunda leitura e, após

esse procedimento, foi feita uma curva padrão para a determinação dos valores

de colesterol LDL a partir dos valores dos padrões já conhecidos previamente.

28

Tabela 4 – Ensaio para dosagem do LDL colesterol sérico

ETAPA 1

Leitura 1

AGITAR

+

BANHO-MARIA

37ºC por 5 min

+

LER

ABSORBÂNCIA

600 nm

ETAPA 2

Leitura 2

AGITAR

+

BANHO-MARIA

37ºC por 5 min

+

LER

ABSORBÂNCIA

600 nm

Explicação RT

(N° 1)

Água

Destilada Calibrador

CN, CP ou

Amostra

RT

(Nº2)

BRC 150 µL 1,5 µL --- --- 50 µL Branco

PAD 1 150 µL --- 0,75 µL --- 50 µL Padrão 1 (32,5 mg/dL)



CN 150 µL --- --- 1,5 µL 50 µL Controle Normal

CP 150 µL --- --- 1,5 µL 50 µL Controle Patológico

AMOSTRAS 150 µL --- --- 1,5 µL 50 µL Amostras*

Quantidades de reagentes e amostra que devem ser pipetados nos poços da microplaca correspondentes aos padrões, controles e amostras

para a obtenção do colesterol LDL. Na coluna “explicação” se observa o valor em md/dL de colesterol LDL contido em cada padrão (PAD 1,

PAD 2 e PAD 3).*Concentração desconhecida.

29

4.3.4 Triglicerídeos

A dosagem de TGs séricos foi feita a partir do kit colorimétrico

TRIGLICERIDEOS K117 da empresa Bioclin adaptado para ser feito em

microplaca de 96 poços. Os padrões, controles e o branco foram aferidos em

triplicata e as amostras em duplicata.

Para o ensaio, foi adicionado 200 µL do RT nº 1 em todos os poções da

microplaca. Os padrões 1, 2 e 3 (RT nº 2) foram adicionados em triplicata de

acordo com a tabela abaixo (Tabela 5). Foi pipetado 2 µL dos controles normal

e patológico, assim como das amostras em seus respectivos poços.

Após serem adicionados todos os reagentes e amostras, a microplaca

foi incubada a 37°C por 10 minutos em banho-maria. Após a incubação, a

absorbância dos poços da microplaca foi lida com a utilização de um

espectrofotômetro para a leitura de microplacas (Epoch, LifeTechnologies, area

scan 5x5) com a utilização de um comprimento de onda de 500 nm.

Para o cálculo do TG sérico das amostras, a absorbância do branco foi

subtraída da absorbância de todos os demais poços (padrões, controles e

amostras). Após, foi criada uma curva padrão de calibração utilizando

absorbância e concentrações de TG dos padrões 1, 2 e 3. A absorbância das

amostras foi colocada nessa curva padrão para a obtenção da dosagem de TG

em mg/dL.

30

Tabela 5 – Ensaio para dosagem do triglicerídeo sérico

RT* (N° 1) RT** (N° 2)

CN, CP ou

Amostra Explicação

BRC 200 µL --- --- Branco




CN 200 µL --- 2,0 µL Controle Normal

CP 200 µL --- 2,0 µL Controle Patológico

AMOSTRAS 200 µL --- 2,0 µL Amostras*

Quantidades de reagentes e amostras que foram pipetados nos poços da microplaca de 96 poços correspondentes a padrões (PAD 1,

PAD 2 e PAD 3), controle normal (CN) e patológico (CP) e amostras para a dosagem de triglicerídeos séricos. *Concentração

desconhecida.

31

4.3.5 Transaminase Glutâmico-Oxalacética

A dosagem da enzima TGO ou aspartato aminotransferase (AST) foi

feita através do kit TGO K034 da empresa Bioclin adaptado para a realização

em microplaca de 96 poços.

Para criação da curva de calibração do ensaio, foi realizada a mistura do

padrão e água destilada em diferentes quantidades com o substrato da TGO

nos poços, conforme indicado na Tabela 6, utilizando-se microtubos de 2 mL.

Logo após, foi adicionado 125 µL de RT n° 2 (reagente de cor) e 1.250 mL de

hidróxido de sódio 0,4 N em cada microtubo e a solução final obtida foi

homogeneizada em vortex.

Duzentos microlitros da mistura de cada microtubo foi então transferida

para os poços da microplaca, em triplicata, a fim de se obter a curva de

calibração dos padrões. A microplaca foi homogeneizada, deixada em repouso

por cinco minutos e então sua absorbância foi lida a 505 nm (Epoch,

LifeTechnologies, area scan 5x5, 490 - 540 nm), acertando o zero com água

destilada. A curva de calibração foi plotada colocando na ordenada os valores

de absorbância e na abcissa os valores de TGO em Unidades/mL.

Uma segunda placa foi preparada para o ensaio com as amostras de

valor desconhecido. Os reagentes e controles foram adicionados de acordo

com a Tabela 7 em seus respectivos poços, em duplicata. A microplaca foi

então homogeneizada deixada em repouso por cinco minutos a temperatura

ambiente. A absorbância de cada poço foi lida a 505 nm (Epoch,

LifeTechnologies, area scan 5x5), acertando o zero com água destilada. Os

valores de TGO foram obtidos a partir da curva de calibração confeccionada no

início deste ensaio (Tabela 6) e os resultados obtidos foram expressos em UI.

32

Tabela 6 – Curva padrão do ensaio para a dosagem de transaminase glutâmico-oxalacética (TGO/AST) sérica

Microtubos Padrão* Substrato de TGO Água destilada TGO

1 --- 125,0 µL 25,0 µL 0 U/mL

2 12,5 µL 112,5 µL 25,0 µL 24 U/mL

3 25,0 µL 100,0 µL 25,0 µL 61 U/mL

4 37,5 µL 87,5 µL 25,0 µL 114 U/mL

5 50,0 µL 75,0 µL 25,0 µL 190 U/mL

Quantidades de reagentes a serem adicionados para a confecção dos padrões de 1 a 5 e o valor de enzima TGO em U/ml correspondente a

cada padrão.

33

Tabela 7 – Ensaio para a dosagem de transaminase glutâmico-oxalacética (TGO/AST) sérica

RT

(N° 1)

INCUBAR

37ºC

por 3 min

CP, CN,

Amostra

HOMOGENEIZAR

+

BANHO-MARIA

37ºC por 30 min

RT

(N° 2) HOMOGENEIZAR

+

REPOUSO 20 min

(Temperatura

ambiente)

NaOH 0,4 N Explicação

AMOSTRAS 20 µL 8,0 µL 20 µL 200 µL Amostras*

CN 20 µL 8,0 µL 20 µL 200 µL Controle

Normal

CP 20 µL 8,0 µL 20 µL 200 µL Controle

Patológico

Quantidade de reagentes, amostras e controles que foram pipetados nos poços da microplaca de 96 poços correspondentes aos controles

normal (CN) e patológico (CP) e amostras em todas as etapas do ensaio para a quantificação de enzima TGO sérica. * Concentração

desconhecida.

34

4.3.6 Transaminase Glutâmico Pirúvica

A dosagem da enzima TGP ou alanina aminotransferase (ALT) foi

realizada com a utilização do Kit TGP K035 da empresa Bioclin adaptado para

ser feito em microplaca de 96 poços.

Para a obtenção da curva de calibração deste ensaio, seguiu-se o

mesmo protocolo utilizado para a obtenção da curva de calibração do TGO,

porém utilizando-se o substrato específico para TGP. A mistura de reagentes

com os padrões também foi realizada em microtubos de 2,0 mL. A esta mistura

cujas quantidades de reagentes são indicadas na Tabela 8, foi adicionado

posteriormente 125 µL do RT nº 2 (reagente de cor) e 1.250 mL de hidróxido de

sódio 0,4 N. Duzentos microlitros da mistura final foram transferidos para uma

microplaca, em triplicata. Foi utilizado o mesmo procedimento para a obtenção

dos valores da curva de calibração utilizado no protocolo anterior de dosagem

do TGO sérico.

Em uma segunda microplaca, as amostras, controles e reagentes foram

adicionados conforme é mostrado na Tabela 9 em seus respectivos poços, em

duplicata. A placa foi então homogeneizada e incubada por 3 minutos a

temperatura ambiente e lida a 505 nm (Epoch, LifeTechnologies, area scan

5x5), acertando o zero com água destilada. A dosagem de TGP foi obtida a

partir da curva de calibração e expressa então em UI.

35

Tabela 8 – Curva padrão do ensaio para a dosagem de transaminase glutâmico-pirúvica (TGP/ALT) sérica

Microtubos Padrão* Substrato de TGP Água destilada TGP

1 --- 125,0 µL 25 µL 0 U/mL

2 12,5 µL 112,5 µL 25 µL 28 U/mL

3 25,0 µL 100,0 µL 25 µL 57 U/mL

4 37,5 µL 87,5 µL 25 µL 97 U/mL

5 50,0 µL 75,0 µL 25 µL 150 U/mL

Quantidade de reagentes a serem adicionados para a confecção dos padrões 1, 2, 3, 4 e 5 e o valor de enzima TGP em U/ml correspondente

a cada padrão.

36

Tabela 9 – Ensaio para a dosagem de transaminase glutâmico-pirúvica (TGP/ALT) sérica

RT

(N° 1)

INCUBAR

37ºC

por 3 min

CP, CN,

Amostra

HOMOGENEIZAR

+

BANHO-MARIA

37ºC por 30 min

RT

(N° 2) HOMOGENEIZAR

+

REPOUSO 20 min

(Temperatura

ambiente)

NaOH 0,4 N Explicação

AMOSTRAS 20 µL 4,0 µL 20 µL 200 µL Amostras*

CN 20 µL 4,0 µL 20 µL 200 µL Controle

Normal

CP 20 µL 4,0 µL 20 µL 200 µL Controle

Patológico

Quantidade de reagentes e amostras que devem ser pipetados nos poços da microplaca de 96 poços correspondentes ao controle normal

(CN), controle patológico (CP) e amostras em todas as etapas do ensaio para a quantificação de enzima TGO sérica. * Concentração

desconhecida.

37

4.3.7 Fosfatase Alcalina

A dosagem da enzima FA alcalina foi feita com a utilização do kit

FOSFATASE ALCALINA K019 da empresa Bioclin adaptado para realização do

ensaio em microplaca de 96 poços.

O ensaio para a quantificação da enzima fosfatase alcalina foi feito em

três etapas. Na primeira etapa, foi adicionado 5 µL do RT n°1 em todos os

poços, seguido de 50 µL do RT nº2, também em todos os poços. Feito isso, foi

adicionado os padrões nas quantidades indicadas na Tabela 10 em seus

respectivos poços, em triplicata. A microplaca foi coberta, homogeneizada à

mão e colocada em banho-maria por dois minutos.

Na segunda etapa, foram adicionados os controles e as amostras em

seus respectivos poços, em duplicata. A placa foi então coberta,

homogeneizada novamente e incubada a 37°C em banho-maria por 10

minutos. Na terceira etapa, foi adicionado 200 µL de RT n°3 em todos os poços

e a microplaca foi novamente homogeneizada. Após essa adição, foi medida a

absorbância de cada poço da microplaca no λ 578 nm (Epoch,

LifeTechnologies, area scan 5x5).

Para a obtenção do resultado em UI, foi subtraída a absorbância do

poço correspondente ao branco de todas as absorbâncias dos controles e das

amostras. Foi criada uma curva padrão a partir dos padrões e a partir dessa,

fosse obtida a concentração de FA sérica ao se plotar as absorbâncias das

amostras nessa curva.

38

Tabela 10 – Ensaio para a dosagem de fosfatase alcalina sérica

ETAPA 1

HOMOGENEIZAR

+

BANHO-MARIA

37ºC por 2 min

ETAPA 2

HOMOGENEIZAR

+

BANHO-MARIA

37ºC por

EXATAMENTE

10 min

ETAPA 3

RT

(N°1)

RT

(N°2)

RT

(Nº4) SALINA

CN, CP e

Amostra

RT

(Nº3)

BRANCO 5,0 µL 50 µL --- --- --- 200 µL

PADRÃO 1 (40 UI) 5,0 µL 50 µL 5,00 µL --- --- 200 µL

PADRÃO 2 (20 UI) 5,0 µL 50 µL 2,50 µL 2,50 µL --- 200 µL

PADRÃO 3 (10 UI) 5,0 µL 50 µL 1,25 µL 3,75 µL --- 200 µL

CN 5,0 µL 50 µL --- --- 5,0 µL 200 µL

CP 5,0 µL 50 µL --- --- 5,0 µL 200 µL

AMOSTRAS* 5,0 µL 50 µL --- --- 5,0 µL 200 µL

Quantidade de reagentes e amostras que devem ser pipetados nos poços da microplaca de 96 poços correspondentes a padrões (P1, P2 e

P3), controle normal (CN) e patológico (CP) e amostras em todas as etapas do ensaio para a quantificação de enzima TGO sérica. *

Concentração desconhecida.

39

4.4 CONTROLE DE QUALIDADE NORMAL E PATOLÓGICO

Para avaliar os ensaios realizados, foram utilizados controle de

qualidade normal (BIOCONTROL N K073, Lote 0050, Bioclin) e patológico

(BIOCONTROL P K074, Lote 0038, Bioclin), onde a concentração dos diversos

analitos era conhecida. Após realizado o ensaio de interesse, verificou-se se a

absorbância obtida, após aplicada à curva padrão, retornaria o valor esperado

dos controles normal e patológico.

Tabela 11 – Concentração esperada dos diferentes analitos presentes no

controle normal e controle patológico utilizados nos ensaios bioquímicos

Analito Controle Normal Controle Patológico

Colesterol Total 107 – 131 mg/dL 263 – 323 mg/dL

HDL Colesterol 48 – 74 mg/dL 86 – 130 mg/dL

LDL Colesterol 20 – 30 mg/dL 57 – 87 mg/dL

Triglicerídeo 58 – 72 mg/dL 281 – 345 mg/dL

TGO 26 – 38 U/mL 93 – 139 U/mL

TGP 17 – 27 U/mL 88 – 132 U/mL

Fosfatase alcalina 24 – 36 U/L 53 – 79 U/L

40

4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados foram tabelados e organizados no software Excel for

Windows. Para o cálculo do valor sérico dos analitos estudados, a curva

padrão foi calculada através da curva de regressão linear, onde na ordenada

foi plotada a absorbância e na abscissa a concentração do analito em questão.

Para avaliar a eficiência da curva padrão, foi calculado o r da correlação de

Pearson entre a absorbância e a concentração do analito dos padrões.

O valor sérico dos analitos estudados é apresentado na forma de média

± erro padrão da média (EPM). Os grupos dieta controle e dieta aterogênica,

que receberam a dieta pelo mesmo tempo, foram comparados através de teste

t de Student (dados paramétricos) ou teste de Mann-Whitney (dados não

paramétricos). Para comparar o efeito do tempo de dieta entre os anmais que

receberam o mesmo tipo de dieta, foi utilizando teste ANOVA One way com

pós-teste de Tukey e pós-teste para tendência linear (dados paramétricos) ou

teste ANOVA de Kruskal Wallis com pós-teste de Dunn (dados não

paramétricos). Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o

sotware GraphPad Prism versão 6.0.

41

5 RESULTADOS

5.1 MASSA CORPORAL

A massa corporal (MC) final dos camundongos alimentads com dieta

controle por 2, 4 e 8 semanas foi respectivamente de 27±0,4g, 30±0,6g e

30±0,8g. Já a MC final dos camundongos alimentados com dieta aterogenica

também por 2, 4 e 8 semanas foi de 28,2±0, 30,3±1g e 28,4±0,8g,

respectivamente. Dessa forma, não houve ganho de MC pela ingestão de dieta

aterogênica quando comparados os animais que receberam dieta controle

como é ilustrado nos gráficos abaixo (Figuras 5 e 6).

S e m a n a s

Ma

ss

a C

orp

ora

l (g

)

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0

2 2

2 4

2 6

2 8

3 0

3 2

3 4D ie ta C o n tro le

D ie ta A te ro g e n ic a

Figura 5 - Evolução da Massa Corporal (MC). Camundongos C57BL/6 alimentados

com dieta controle e aterogênica por 2, 4 e 8 semanas.

42

Ma

ss

a C

orp

ora

l F

ina

l (g

)

2 4 8 2 4 8

0

1 0

2 0

3 0

4 0

D ie ta C o n tro le D ie ta A te ro g ê n ic a

Figura 6 – Massa corporal final. Camundongos C57BL/6 alimentados com dieta

controle e aterogênica por 2, 4 e 8 semanas.

5.2 INGESTÃO ALIMENTAR E ENERGÉTICA

Houve diferença estatística significativa na ingestão de ração quando

comparados os grupos experimentais alimentados com dieta controle e os

grupos alimentados com dieta aterogênica. A ingestão alimentar foi menor no

grupo que recebeu dieta aterogênica quando comparado ao grupo de seu

respectivo número de semanas alimentado com dieta controle (A2: -16%; A4: -

15% e A8: -28%; p<0,05).

43

Ra

çã

o g

/an

ima

l

2 4 8 2 4 8

0

1

2

3

4

5


[* ] v s . C o n t ro le (m e s m o te m p o )

* *

*

Figura 7 – Ingestão de ração. Camundongos C57BL/6 alimentados com dieta

controle e aterogênica por 2, 4 e 8 semanas. Quando indicado, p<0,05 [*] vs.

respectivo grupo controle.

Contudo, apesar da menor ingestão de ração dos grupos alimentados

com dieta aterogenica quando comparados aos grupos controle, hove um

aumento de ingestão energética nos grupos A2 (+11,6%) e A4 (+12,2%) e

diminuição da ingestão energética no grupo A8 (-5,1%) quando comparados

aos seus respectivos controles.

En

erg

ia m

éd

ia (

Kc

al/

dia

/an

ima

l)

2 4 8 2 4 8

0

5

1 0

1 5

2 0


* **


Figura 8 – Consumo de energia. Camundongos C57BL/6 alimentados com dieta

controle e aterogênica por 2, 4 e 8 semanas. Quando indicado, p<0,05 [*] vs.

respectivo grupo controle.

44

5.3 LIPIDOGRAMA

Na bioquímica sanguínia que avaliou o metabolismo lipídico, o TG foi de

C2: 51,3±8,5 mg/dL, C4: 36±6,2 mg/dL e C8: 52,7±10,5 mg/dL, A2: 35,5±6,0

mg/dL A4: 59,9±17,0 mg/dL A8: 46,7±5,8 mg/dL. Dessa forma, não houve

diferença estatística em relação ao TG dos animais alimentados com dieta

aterogênica em relação aos animais alimentados com dieta controle.

Já em relação ao CT foi observado um aumento estatístico significativo

de tais níveis nos animais alimentados com dieta aterogênica quando

comparados aos seus respectivos controles com o mesmo tempo de dieta. Nos

controles, os valores de CT foram de C2: 58,3±3,6 mg/dL C4: 68,9±5,6 mg/dL

C8: 57,6±5,0 mg/dL e houve um aumento percentual de CT em A2 de +62,6%,

em A4 de +35,4% e em A8 de A8: +40%.

Ao se analisar as frações de colesterol presentes no soro dos animais,

houve diferenças estatísticas em ambas (HDL e LDL). Os níveis de HDL foram

de C2: 63,5±2,5 mg/dL, C4: 72,7±3,7 mg/dL C8: 99,1±17,8 mg/dL, sendo

observado aumento nos grupos com dieta aterogênica (A2: +99%; A4:

+369,1%; A8: +111,2%, P<0,05). Os valores de LDL, por sua vez, foram de C2:

36,5±2,5 mg/dL, C4: 19,5±4,9 md/dL C8: 9,7±1,9 md/dL também aumentados

no grupos submetidos a dieta aterogênica (A2: +162,8%; A4: +128,8%; A8:

+108,9%, P<0.05).

45

Tri

gli

ce

rid

eo

s (

mg

/dL

)

2 4 8 2 4 8

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0


Figura 9 – Triglicerídeos séricos. Camundongos C57BL/6 alimentados com dieta

controle e aterogênica por 2, 4 e 8 semanas.

Co

les

tero

l to

tal

(mg

/dL

)

2 4 8 2 4 8

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0


*

*

*


Figura 10 – Níveis séricos de Colesterol total. Camundongos C57BL/6 alimentados

com dieta controle e aterogênica por 2, 4 e 8 semanas. Quando indicados, p<0,05 [*]

vs. respectivo grupo controle.

46

HD

L (

mg

/dL

)

2 4 8 2 4 8

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

5 0 0


*

*

*


[a ] v s . 2 s e m a n a s (m e s m a d ie ta )

a

a

Figura 11 – Níveis séricos de Colesterol de alta densidade (HDL). Camundongos

C57BL/6 alimentados com dieta controle e aterogênica por 2, 4 e 8 semanas. Quando

indicados, p<0,05 [*] vs. respectivo grupo controle, [a] vs. grupo 2 semanas (mesma

dieta).

LD

L (

mg

/dL

)

2 4 8 2 4 8

0

5 0

1 0 0

1 5 0


*

*

*[* ] v s . C o n t ro le (m e s m o te m p o )


a

a

Figura 12 – Níveis séricos de Colesterol de baixa densidade (LDL). Camundongos

C57BL/6 alimentados com dieta controle e aterogênica por 2, 4 e 8 semanas. Quando

indicados, p<0,05 [*] vs. respectivo grupo controle, [a] vs. grupo 2 semanas (mesma

dieta).

47

5.4 MARCADORES DE FUNÇÃO HEPÁTICA

Na análise dos marcadores de lesão hepática, a dosagem sérica da

enzima FA não foi alterada com a ingestão de dieta aterogênica. Os valores da

dosagem de FA foram C2: 42,8±1 UI C4: 41,2±2,2 C8: 42,1±0,7 UI para os

camundongos alimentados com dieta controle e A2: 39,1±3 UI, A4: 37,6±2,3 UI

e A8: 40,9±0,8 para os animais alimentados com dieta aterogênica.

Os níveis de TGP se mostraram aumentados substancialmente com a

utilização da dieta aterogênica. A dosagem de tal enzima foi de C2: 15,3±2

U/mL C4: 36,9±7,5 U/mL C8: 42,1±12,3 U/mL no grupo controle e de A2:

138,5±20,5 U/mL, A4: 108,7±16,6 U/mL e A8: 87,4±22,6 U/mL no grupo

alimentado com dieta aterogênica. Dessa forma, foi observado um aumento

percentual de +806,4% em A2 em relação a C2, de +194,4% em A4 em relação

a C4 e de A8: +107,6% em A8 em relação a C8.

Por fim, os níveis de TGO mostraram-se aumentados estatisticamente

apenas em A2 e A4 em relação aos seus respectivos controles. Tal dosagem

foi de C2: 72,3±4,1 U/mL C4: 92±9,1 U/mL e C8: 115,4±14,4 U/mL nos grupos

controle e A2: 137,2±13 U/mL, A4: 128,5±12,1 U/mL e A8: 109,4±8,9 U/mL nos

grupos alimentados com dieta aterogênica. O aumento estatístico foi de

+89,8% em A2 em relação a C2 e de +39,7% em A4 em relação a C4.

48

Fo

sfa

tas

e A

lca

lin

a (

UI)

2 4 8 2 4 8

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0


Figura 13 – Níveis séricos de Fosfatase Alcalina. Camundongos C57BL/6

alimentados com dieta controle e aterogênica por 2, 4 e 8 semanas.

TG

P (

U/m

L)

2 4 8 2 4 8

0

4 0

8 0

1 2 0

1 6 0

2 0 0


*

*

*


Figura 14 – Níveis séricos de transaminase glutâmico-pirúvica (TGP).

Camundongos C57BL/6 alimentados com dieta controle e aterogênica por 2, 4 e 8

semanas. Quando indicados, p<0,05 [*] vs. respectivo grupo controle.

49

TG

O (

U/m

L)

2 4 8 2 4 8

0

4 0

8 0

1 2 0

1 6 0

2 0 0


**



a

Figura 15 –– Níveis séricos de transaminase glutâmico-oxalacética (TGO).

Camundongos C57BL/6 alimentados com dieta controle e aterogênica por 2, 4 e 8

semanas. Quando indicados, p<0,05 [*] vs. respectivo grupo controle, [a] vs. grupo 2

semanas (mesma dieta).

50

5.5 CONTROLE DE QUALIDADE DOS ENSAIOS BIOQUÍMICOS

5.5.1 Curva Padrão

Para o cálculo da concentração dos analitos foi plotada uma curva de

regressão linear entre as concentrações conhecidas do analito em questão

(eixo X) e sua absorvancia após a realização do ensaio bioquímico (eixo Y). A

Tabela 12 mostra a curva de regressão linear obtida para cada analito. A curva

padrão de todos os analitos apresentou uma boa correlação (r), variando entre

0,94 e 0,99.

Tabela 12 – Valor do r da correlação entre a absorbância e a concentração de

cada analito

Analito r (P) Equação de regressão

Colesterol Total 0,999 (NS) ABS = 0,000785*[CT] + 0,0515

HDL Colesterol 0,972 (NS) ABS = 0,001098*[HDL] + 0,1570

LDL Colesterol 0,984 (NS) ABS = 0,002508*[LDL] - 0,1195

Triglicerídeo 0,997 (NS) ABS = 0,0004057*[TG] + 0,0160

TGO 0,943 (NS) ABS = 0,001135*[TGO] + 0,2065

TGP 0,970 (NS) ABS = 0,001489*[TGP] + 0,2083

Fosfatase alcalina 0,948 (NS) ABS = 0,05274*[FA] - 0,6340

Abreviaturas: NS, não significativo; ABS, absorbância da amostra; CT, colesterol total;

HDL, lipoproteína de alta densidade; LDL, lipoproteína de baixa densidade; TG,

triglicerídeos; TGO, transaminase glutâmico oxalacética; TGP, transaminase glutâmico

pirúvica; FA, fosfatase alcalina.

51

5.5.2 Controles de Qualidade

Na Tabela 13 são apresentados os valores observados dos diferentes

analitos sanguíneos, após a realização dos diferentes ensaios bioquímicos. Os

valores observados de CT, FA e TGO, tanto para o controle normal quanto

para o patológico se encontram foram do esperado segundo a bula dos

controles de qualidade. Os valores do controle normal de LDL e TG também se

encontram fora do esperado, assim como o valor do controle patológico de TG.

Porém, apesar de fora do esperado, os valores do controle normal de TGP e

FA são observados bem próximo ao esperado. Foram observados valores

dentro do que se espera segundo a bula para os controles normais de HDL e

TG e para os controles patológios de HDL, LDL, TG e TGP.

Tabela 13 – Concentração observada dos diferentes analitos presentes no

controle normal e controle patológico utilizados nos ensaios bioquímicos

Analito Controle Normal Controle Patológico

Colesterol Total 73,91 mg/dL 248,67 mg/dL

HDL Colesterol 49,8 mg/dL 91,1 mg/dL

LDL Colesterol 8,6 mg/dL 73,9 mg/dL

Triglicerídeo 49,4 mg/dL 377,6 mg/dL

TGO 79,6 U/mL 186,0 U/mL

TGP 15,7 U/mL 118,4 U/mL

Fosfatase alcalina 37,14 U/L 47,31 U/L

Abreviaturas: HDL, lipoproteína de alta densidade; LDL, lipoproteína de baixa

densidade; TGO, transaminase glutâmico oxalacética; TGP, transaminase glutâmico

pirúvica.

52

6 DISCUSSÃO

Dietas ricas em gordura saturada são um importante fator para o

desenvolvimento da aterosclerose, por causar distúrbios lipídicos,

principalmente o aumento do LDL (Steinberg et al., 1989; Sposito et al., 2007;

Henning et al., 2016). Apesar dessa informação ser amplamente difundida, o

consumo desse tipo de dieta, que juntamente com o consumo de sódio e

carboidratos simples é chamada de dieta ocidental, se faz muito presente na

sociedade moderna.

No presente estudo, para avaliar as consequências iniciais da ingestão

desse tipo de dieta, foi utilizada uma dieta rica em gordura (15%), colesterol

(1,25%) e ácido cólico (0,5%). Estudos mostram que esse tipo de dieta é capaz

de induzir, após em torno de 12 semanas de ingestão, estágios iniciais de

aterosclerose em algumas linhagens de camundongos como o C57BL/6,

apesar de camundongos serem relativamente resistentes ao desenvolvimento

da aterosclerose (Paigen et al., 1985; Nishina et al., 1990; Breslow, 1996). Tal

dieta se mostra eficiente para esse fim porque a ingestão de ácido cólico

aumenta a absorção intestinal de gordura e colesterol, assim como inibe a

conversão de colesterol em ácido biliar, diminuindo ao final a eliminação do

colesterol absorvido (Ando et al., 2005). Além disso, o tipo de gordura saturada

presente na dieta é oriunda da banha de porco, sendo o tipo de gordura mais

recomendada para induzir a obesidade e roedores (Buettner et al., 2006).

Diante disso, a dieta utilizada no presente estudo se mostrou eficaz em

modificar parâmetros lipídicos e marcadores de função hepática.

Observou-se, em nosso estudo, que os animais do grupo experimental

que receberam dieta aterogênica apresentaram uma ingestão alimentar menor

do que os animais alimentados com dieta controle. Apesar disso, o consumo de

energia do grupo alimentado com dieta aterogênica foi estatisticamente maior

nos grupos de 2 e 4 semanas. Este fato justifica-se pela densidade energética

da dieta aterogênica ser consideravelmente maior do que a da dieta controle

(5,000 kcal/g vs 3,804 kcal/g respectivamente). Tal dado é importante, já que o

aumento do consumo energético é indispensável para o aumento da

adiposidade (Townsend et al., 2008).

53

Apesar da maior ingesta calórica, não foi observado o aumento da MC

dos animais, quando comparados os grupos alimentados com dieta controle e

dieta aterogênica. Isso mostra que a ingestão da dieta aterogênica não foi

capaz de aumentar a MC de camundongos C57Bl/6 alimentados por oito

semanas. Esse dado pode ser considerado consistente com a literatura, à

medida que Nishina e colaboradores, em seu estudo, também não observaram

aumento de MC com a utilização de dieta semelhante (Nishina et al., 1990).

Sabe-se que as deslipidemias estão intimamente relacionadas com o

processo de aterogênese. A partir da utilização de uma dieta aterogênica, se

pode observar o aumento nos níveis de CT, o que mostra que a dieta em

questão foi eficaz em induzir uma deslipidemia nos camundongos. No estudo

de Srivastava e colaboradores, tal alteração também foi observada (Srivastava

et al., 2000). Diversos estudos mostram que uma dieta rica em gordura

saturada e rica em ácido cólico aumenta os níveis séricos de LDL e diminui os

níveis séricos de HDL (Nishina et al., 1990; Ishida et al., 1991; Srivastava et al.,

2000). Tal dado não foi consistente com o presente estudo já que foi observado

um aumento tanto de LDL, quanto do HDL, de forma bastante significativa.

Em relação aos triglicerídeos, não foram observadas alterações entre os

animais alimentados com dieta controle e aterogênica. Corroborando com esse

estudo, Ishida e colaboradores também não encontraram diferença na

concentração de tal analito em camundongos alimentados com dieta

aterogênica (Ishida et al., 1991). Já Srivastava e colaboradores observaram um

aumento significativo no triglicerídeo de camundongos alimentados com dieta

rica em lipídeos e ácido cólico quando comparado a uma dieta convencional

(controle), porém não encontraram tal diferença quando comparada a

alimentação com dieta aterogênica e alimentação com dieta rica em lipídeos

sem a adição de ácido cólico (Srivastava et al., 2000).

O monitoramento de enzimas hepáticas é fundamental com a utilização

desse tipo de dieta, já que a lesão hepática é uma das manifestações da

Sindrome Metabólica na qual esse tipo de dieta é um fator de risco conhecido

(Soler et al., 2008; Schild et al., 2013). Em nosso estudo, foi observado um

aumento significativo nos níveis da enzima TGP, considerada a enzima mais

54

específica para a caracterização de doença hepática, uma vez que ela está

presente em maior quantidade no citosol do hepatócito do que em outros

tecidos. Esse nível aumentado está de acordo com a literatura já que Nishida e

colaboradores também observaram em seu estudo um aumento considerável

dos níveis séricos desse marcador em camundongos C57BL/6 alimentados

com dieta aterogênica até a 14ª semana (Nishina et al., 1990).

Geralmente, os níveis das enzimas TGO e TGP aumentam em conjunto

e a relaçao entre ambos é importante na avaliação da gravidade da lesão

hepática (Ozer et al., 2008; Al-Busafi et al., 2013). No presente estudo, houve

aumento dos níveis séricos da enzima TGO na 2ª e na 4ª semana de estudo,

porém esse aumento não foi observado na 8ª semana. Todavia, numa análise

mais ampla, esse tipo de dieta foi capaz de alterar os níveis séricos dessas

enzimas, indicando que houve lesão hepática a nível de hepatócitos.

Além da lesão à nível celular, estudos mostram que a presença de ácido

cólico na dieta experimental é capaz de induzir a formação de cálculos biliares

até a 14ª semana (Nishina et al., 1990; Khanuja et al., 1995). Como a enzima

fosfatase alcalina está presente nas células de ductos biliares, seu aumento

normalmente se faz presente na presença de cálculos biliares já que, nesse

caso, há obstrução desses ductos. No presente estudo, não foi observado

aumento dos níveis séricos de fosfatase alcalina, mostrando que o tempo de

administração de dieta não foi suficiente para alterar tal parâmetro.

Por fim, a partir desse estudo, pode-se observar que a avaliação do

perfil lipídico e de marcadores de função hepática por método bioquímico

colorimétrico adaptado para a realização em microplaca de 96 poços foi

eficiente. Os ensaios forneceram uma boa curva padrão dos analitos com a

utilização de pequenas quantidades de reagentes e amostras, o que é

importante, visto a dificuldade na obtenção de grandes quantidades de soro em

estudos feitos em camundongos. Em média, consegue-se obter após punção

cardíaca e centrifugação do sangue, cerca de 300 a 400 µL de soro ou plasma,

dependendo da linhagem, gênero e idade do camundongo. Esse volume é

considerado pequeno, quando se quer realizar a dosagem de diversos analitos

55

em um soro ou plasma proveniente de um mesmo animal para estudos

metabólicos.

A curva de regressão linear plotada para o cálculo da concentração dos

analitos apresentou uma boa correlação, onde o r variou entre 0,94 e 0,99.

Entretanto, os controles normal e patológico utilizados nos diversos ensaios

não atingiram os valores esperados para diversos analitos. Acreditamos que os

controles utilizados no presente ensaio não são confiáveis para todos os

analitos, necessitando-se buscar dessa forma controles de novos fornecedores

que sejam de qualidade e confiabilidade para a realização de ensaios futuros.

56

7 CONCLUSÃO

Uma dieta hiperlipídica rica em colesterol e ácido cólico é capaz de

alterar o metabolismo lipídico e hepático, mesmo sem o ganho de massa

corporal e sem ser necessário um tempo prolongado de exposição à dieta, em

camundongos C57Bl/6. Entretanto, esta mesma dieta não é capaz de alterar os

níveis de fosfatase alcalina, indicando que até a oitava semana de exposição

não haveria o risco de colestase e doença hepática obstrutiva neste modelo

animal.

57

8 REFERÊNCIAS

ACTON, S. et al. Identification of Scavenger Receptor SR-BI as a High Density

Lipoprotein Receptor. 1996-01-26 1996. Disponível em: <

http://science.sciencemag.org/content/271/5248/518.long >.

AL-BUSAFI, S. A. et al. Mild Hypertransaminasemia in Primary Care.

International Scholarly Research Notices, v. 20132013, 2013/04/10 2013.

Disponível em: < https://www.hindawi.com/journals/isrn/2013/256426/ >.

ANDO, H. et al. Regulation of cholesterol 7alpha-hydroxylase mRNA

expression in C57BL/6 mice fed an atherogenic diet. Atherosclerosis, v. 178,

n. 2, p. 265-9, Feb 2005. ISSN 0021-9150 (Print)0021-9150. Disponível em: <

http://dx.doi.org/10.1016/j.atherosclerosis.2004.09.016 >.

Animais de laboratório: o camundongo. 2016. Disponível em: <

https://www.researchgate.net/publication/49599408_Animais_de_laboratorio_o

_camundongo >.

ASSMANN, G.; GOTTO, A. M. HDL Cholesterol and Protective Factors in

Atherosclerosis. 2004-06-15 2004. Disponível em: <

http://circ.ahajournals.org/content/109/23_suppl_1/III-8 >.

BERGAMINI, C. M. et al. Oxygen, reactive oxygen species and tissue damage.

Curr Pharm Des, v. 10, n. 14, p. 1611-26, 2004. ISSN 1381-6128 (Print)1381-

6128. Disponível em: < http://dx.doi.org/ >.

BOISVERT, W. A. et al. A leukocyte homologue of the IL-8 receptor CXCR-2

mediates the accumulation of macrophages in atherosclerotic lesions of LDL

receptor-deficient mice. J. Clin. Invest., v. 101, p. 353-363, // 1998.

BONOMINI, F.; RODELLA, L. F.; REZZANI, R. Metabolic Syndrome, Aging and

Involvement of Oxidative Stress. 2015-03-25 2015. Disponível em: <

http://www.aginganddisease.org/EN/10.14336/AD.2014.0305 >.

BRESLOW, J. L. Mouse Models of Atherosclerosis. 1996-05-03 1996.

Disponível em: < http://science.sciencemag.org/content/272/5262/685 >.

BROWNING, J. D.; HORTON, J. D. Molecular mediators of hepatic steatosis

and liver injury. J Clin Invest, v. 114, n. 2, p. 147-52, 2004. ISSN 0021-9738

(Print). Disponível em: < http://dx.doi.org/10.1172/jci200422422 >.

BUETTNER, R. et al. Defining high-fat-diet rat models: metabolic and

molecular effects of different fat types. J Mol Endocrinol, v. 36, n. 3, p. 485-

http://dx.doi.org/10.1172/jci200422422

http://dx.doi.org/

http://science.sciencemag.org/content/271/5248/518.long

https://www.researchgate.net/publication/49599408_Animais_de_laboratorio_o_camundongo

http://circ.ahajournals.org/content/109/23_suppl_1/III-8

https://www.hindawi.com/journals/isrn/2013/256426/

https://www.researchgate.net/publication/49599408_Animais_de_laboratorio_o_camundongo

http://www.aginganddisease.org/EN/10.14336/AD.2014.0305

http://dx.doi.org/10.1016/j.atherosclerosis.2004.09.016

http://science.sciencemag.org/content/272/5262/685

58

501, Jun 2006. ISSN 0952-5041 (Print)0952-5041. Disponível em: <

http://dx.doi.org/10.1677/jme.1.01909 >.

CHAVES, G. V. et al. Association between non-alcoholic fatty liver disease and

liver function/injury markers with metabolic syndrome components in class III

obese individuals. Rev. Assoc. Med. Bras., v. 58, n. 3, p. 288-293, 06/2012

2012. ISSN 0104-4230. Disponível em: <

http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_abstract&pid=S0104-

42302012000300007&lng=en&nrm=iso&tlng=pt >.Disponível em: <

http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0104-


http://www.scielo.br/pdf/ramb/v58n3/en_v58n3a07.pdf >.Disponível em: <

http://www.scielo.br/pdf/ramb/v58n3/v58n3a07.pdf >.

COCKERILL, G. W. et al. High-Density Lipoproteins Inhibit Cytokine-Induced

Expression of Endothelial Cell Adhesion Molecules. 1995-11-01 1995.

Disponível em: < http://atvb.ahajournals.org/content/15/11/1987.long >.

COOPER, A. D. Hepatic uptake of chylomicron remnants. J Lipid Res, v. 38, n.

11, p. 2173-92, Nov 1997. ISSN 0022-2275 (Print)0022-2275. Disponível em: <

http://dx.doi.org/ >.

CYBULSKY, M. I.; GIMBRONE, M. A. Endothelial expression of a mononuclear

leukocyte adhesion molecule during atherogenesis. Science, v. 251, p. 788-

791, // 1991.

DAMIANI, D. et al. Metabolic syndrome in children and adolescents: doubts

about terminology but not about cardiometabolic risks. Arq Bras Endocrinol

Metab, v. 55, n. 8, p. 576-582, 11/2011 2011. ISSN 0004-2730. Disponível em:

< http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_abstract&pid=S0004-




http://www.scielo.br/pdf/abem/v55n8/11.pdf >.

DAY, C. P.; JAMES, O. F. W. Steatohepatitis: A tale of two “hits”?

Gastroenterology, v. 114, n. 4, p. 842-845, 1998/04/01 1998. ISSN 1528-

0012. Disponível em: <

http://www.gastrojournal.org/article/S0016508598705992/abstract >.Disponível

em: < http://www.gastrojournal.org/article/S0016508598705992/fulltext

>.Disponível em: <

http://www.gastrojournal.org/article/S0016508598705992/pdf >.

http://www.gastrojournal.org/article/S0016508598705992/pdf

http://dx.doi.org/10.1677/jme.1.01909

http://www.scielo.br/pdf/ramb/v58n3/en_v58n3a07.pdf

http://www.scielo.br/pdf/ramb/v58n3/v58n3a07.pdf

http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_abstract&pid=S0104-42302012000300007&lng=en&nrm=iso&tlng=pt

http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0004-27302011000800011&lng=en&nrm=iso&tlng=pt

http://atvb.ahajournals.org/content/15/11/1987.long


http://www.gastrojournal.org/article/S0016508598705992/fulltext



http://www.scielo.br/pdf/abem/v55n8/11.pdf


http://www.gastrojournal.org/article/S0016508598705992/abstract



http://dx.doi.org/

59

EFE, D. et al. Assessment of the Relationship between Non-Alcoholic Fatty

Liver Disease and CAD using MSCT. Arq. Bras. Cardiol., v. 102, n. 1, p. 10-

18, 01/2014 2014. ISSN 0066-782X. Disponível em: <


782X2014000100003&lng=en&nrm=iso&tlng=pt >.Disponível em: <



http://www.scielo.br/pdf/abc/v102n1/en_0066-782X-abc-102-01-0010.pdf

>.Disponível em: < http://www.scielo.br/pdf/abc/v102n1/0066-782X-abc-102-01-

0010.pdf >.

FERREIRA, E. S. P.; SPOSITO, A. C. Comparison between cholesteryl ester

transfer protein and HDL size in association with carotid atherosclerosis. 18-06-

2014 2014. Disponível em: <

http://www.bibliotecadigital.unicamp.br/document/?code=000931572 >.

FLEISHER, L. N. et al. Stimulation of arterial endothelial cell prostacyclin

synthesis by high density lipoproteins., 1982-06-25 1982. Disponível em: <

http://www.jbc.org/content/257/12/6653.short >.

FORTI, N.; DIAMENT, J. High-density lipoproteins: metabolic, clinical,

epidemiological and therapeutic intervention aspects. An update for clinicians.

2006 2006. Disponível em: <

http://saudepublica.bvs.br/pesquisa/resource/pt/lil-439711 >.

GRUNDY, S. M. Hypertriglyceridemia, atherogenic dyslipidemia, and the

metabolic syndrome. Am J Cardiol, v. 81, n. 4a, p. 18b-25b, Feb 26 1998.

ISSN 0002-9149 (Print)0002-9149. Disponível em: < http://dx.doi.org/ >.

HENNING, A. L. et al. Consumption of a High-fat Meal was associated with an

Increase in Monocyte Adhesion Molecules, Scavenger Receptors, and

Propensity to Form Foam Cells. Cytometry B Clin Cytom, Aug 29 2016. ISSN

1552-4949. Disponível em: < http://dx.doi.org/10.1002/cyto.b.21478 >.

HENRIKSEN, T.; MAHONEY, E. M.; STEINBERG, D. Enhanced macrophage

degradation of low density lipoprotein previously incubated with cultured

endothelial cells: recognition by receptors for acetylated low density

lipoproteins. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 78, n. 10, p. 6499-503, Oct 1981.

ISSN 0027-8424 (Print)1091-6490 (Electronic). Disponível em: <


______. Enhanced macrophage degradation of biologically modified low density

lipoprotein., 1983-03-01 1983. Disponível em: <

http://atvb.ahajournals.org/content/3/2/149.long >.

http://www.bibliotecadigital.unicamp.br/document/?code=000931572

http://www.scielo.br/pdf/abc/v102n1/en_0066-782X-abc-102-01-0010.pdf

http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_abstract&pid=S0066-782X2014000100003&lng=en&nrm=iso&tlng=pt

http://dx.doi.org/10.1002/cyto.b.21478

http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0066-782X2014000100003&lng=en&nrm=iso&tlng=pt

http://www.scielo.br/pdf/abc/v102n1/0066-782X-abc-102-01-0010.pdf



http://www.jbc.org/content/257/12/6653.short

http://saudepublica.bvs.br/pesquisa/resource/pt/lil-439711


http://dx.doi.org/

http://dx.doi.org/

http://www.scielo.br/pdf/abc/v102n1/0066-782X-abc-102-01-0010.pdf

60

ISHIDA, B. Y. et al. Effects of atherogenic diet consumption on lipoproteins in

mouse strains C57BL/6 and C3H. J Lipid Res, v. 32, n. 4, p. 559-68, Apr 1991.


JAWIEN, J.; NASTALEK, P.; KORBUT, R. Mouse models of experimental

atherosclerosis. J Physiol Pharmacol, v. 55, n. 3, p. 503-17, Sep 2004. ISSN

0867-5910 (Print)0867-5910. Disponível em: < http://dx.doi.org/ >.

KHANUJA, B. et al. Lith1, a major gene affecting cholesterol gallstone

formation among inbred strains of mice. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 92, n.

17, p. 7729-33, Aug 15 1995. ISSN 0027-8424 (Print)0027-8424. Disponível

em: < http://dx.doi.org/ >.

KUME, N.; CYBULSKY, M. I.; JR, M. A. G. Lysophosphatidylcholine, a

component of atherogenic lipoproteins, induces mononuclear leukocyte

adhesion molecules in cultured human and rabbit arterial endothelial cells.,

1992-09-01 1992. Disponível em: < http://www.jci.org/articles/view/115932 >.

LAURENTI, R.; BUCHALLA, C. M.; DE SOUSA CARATIN, C. V. Doença

Isquêmica do Coração. Internações, Tempo de Permanência e Gastos.

Brasil, 1993 a 1997. Arq Bras Cardiol. Arq Bras Cardiol. 74: 483-487 p. 2000.

LEANÇA, C. C. et al. HDL: the yin-yang of cardiovascular disease. Arq Bras

Endocrinol Metab, v. 54, n. 9, p. 777-784, 12/2010 2010. ISSN 0004-2730.

Disponível em: <





http://www.scielo.br/pdf/abem/v54n9/a02v54n9.pdf >.

LEONG, X.-F. et al. Animal Models in Cardiovascular Research: Hypertension

and Atherosclerosis. BioMed Research International, v. 20152015,

2015/05/03 2015. ISSN 2314-61332314-6133. Disponível em: <

https://www.hindawi.com/journals/bmri/2015/528757/ >.

LHOTAK, S. et al. Characterization of Proliferating Lesion-Resident Cells

During All Stages of Atherosclerotic Growth. J Am Heart Assoc, v. 5, n. 8,

2016. ISSN 2047-9980. Disponível em: <

http://dx.doi.org/10.1161/jaha.116.003945 >.

http://dx.doi.org/

https://www.hindawi.com/journals/bmri/2015/528757/


http://dx.doi.org/


http://www.jci.org/articles/view/115932


http://dx.doi.org/


http://www.scielo.br/pdf/abem/v54n9/a02v54n9.pdf

http://dx.doi.org/10.1161/jaha.116.003945

61

LIBBY, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature, v. 420, n. 6917, p. 868-874,

12/19/print 2002. ISSN 0028-0836. Disponível em: <

http://dx.doi.org/10.1038/nature01323 >.

LINSEL-NITSCHKE, P.; TALL, A. R. HDL as a target in the treatment of

atherosclerotic cardiovascular disease. Nat Rev Drug Discov, v. 4, n. 3, p.

193-205, 03//print 2005. ISSN 1474-1776. Disponível em: <

http://dx.doi.org/10.1038/nrd1658 >.

MACKNESS, M. I.; DURRINGTON, P. N.; MACKNESS, B. How high-density

lipoprotein protects against the effects of... : Current Opinion in Lipidology.

2016. Disponível em: < http://journals.lww.com/co-

lipidology/Abstract/2000/08000/How_high_density_lipoprotein_protects_against

_the.7.aspx >.

MATSUDA, Y. et al. High density lipoprotein reverses inhibitory effect of

oxidized low density lipoprotein on endothelium-dependent arterial relaxation.,

1993-05-01 1993. Disponível em: <

http://circres.ahajournals.org/content/72/5/1103.short >.

MINCIS, M.; MICIS, R. Liver-enzymes: aspects of pratical interest. RBM

Revista Brasileira de Medicina: 56-60 p. 2016.

MINUK, G. Y. Canadian Association of Gastroenterology Practice Guidelines:

evaluation of abnormal liver enzyme tests. Can J Gastroenterol, v. 12, n. 6, p.

417-21, Sep 1998. ISSN 0835-7900 (Print)0835-7900. Disponível em: <


NAKAYA, N. [Hypertriglyceridemia as a cause of atherosclerosis]. Nihon

Rinsho, v. 60, n. 5, p. 860-7, May 2002. ISSN 0047-1852 (Print)0047-1852.

Disponível em: < http://dx.doi.org/ >.

NEUSCHWANDER-TETRI, B. A.; CALDWELL, S. H. Nonalcoholic

steatohepatitis: summary of an AASLD Single Topic Conference. Hepatology,

v. 37, n. 5, p. 1202-19, May 2003. ISSN 0270-9139 (Print)0270-9139.

Disponível em: < http://dx.doi.org/10.1053/jhep.2003.50193 >.

NISHINA, P. M.; VERSTUYFT, J.; PAIGEN, B. Synthetic low and high fat diets

for the study of atherosclerosis in the mouse. J Lipid Res, v. 31, n. 5, p. 859-

69, May 1990. ISSN 0022-2275 (Print)0022-2275. Disponível em: <


http://dx.doi.org/

http://dx.doi.org/10.1038/nature01323

http://dx.doi.org/

http://dx.doi.org/

http://journals.lww.com/co-lipidology/Abstract/2000/08000/How_high_density_lipoprotein_protects_against_the.7.aspx


http://dx.doi.org/10.1053/jhep.2003.50193

http://dx.doi.org/10.1038/nrd1658


http://circres.ahajournals.org/content/72/5/1103.short

62

OLIVARES, A. L.; GONZALEZ BALLESTER, M. A.; NOAILLY, J. Virtual

exploration of early stage atherosclerosis. Bioinformatics, Aug 29 2016. ISSN

1367-4803. Disponível em: < http://dx.doi.org/10.1093/bioinformatics/btw551 >.

OZER, J. et al. The current state of serum biomarkers of hepatotoxicity.

Toxicology, v. 245, n. 3, p. 194-205, Mar 20 2008. ISSN 0300-483X

(Print)0300-483x. Disponível em: < http://dx.doi.org/10.1016/j.tox.2007.11.021

>.

PAIGEN, B. et al. Variation in susceptibility to atherosclerosis among inbred

strains of mice. Atherosclerosis, v. 57, n. 1, p. 65-73, 1985/10/01 1985. ISSN

1879-1484. Disponível em: < http://www.atherosclerosis-

journal.com/article/0021915085901388/abstract >.Disponível em: <

http://www.atherosclerosis-journal.com/article/0021915085901388/fulltext

>.Disponível em: < http://www.atherosclerosis-

journal.com/article/0021915085901388/pdf >.

PARTHASARATHY, S. et al. Macrophage oxidation of low density lipoprotein

generates a modified form recognized by the scavenger receptor., 1986-09-01

1986. Disponível em: < http://atvb.ahajournals.org/content/6/5/505.long >.

PLUMP, A. S. et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in

apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES

cells. Cell, v. 71, n. 2, p. 343-53, Oct 16 1992. ISSN 0092-8674 (Print)0092-

8674. Disponível em: < http://dx.doi.org/ >.

RAFIEIAN-KOPAEI, M. et al. Atherosclerosis: process, indicators, risk factors

and new hopes. Int J Prev Med, v. 5, n. 8, p. 927-46, Aug 2014. ISSN 2008-

7802 (Print)2008-7802. Disponível em: < http://dx.doi.org/ >.

RAMOS, M. A. Induction of macrophage VEGF in response to oxidized LDL and

VEGF accumulation in human atherosclerotic lesions. Arterioscler. Thromb.

Vasc. Biol., v. 18, p. 1188-1196, // 1998.

RE, A. et al. A population-based autopsy study of sudden, unexpected

deaths from natural causes among persons 5 to 39 years old during a 12-

year period. Hum Pathol. 25: 1332-40 p. 1994.

REEVES, P. G.; NIELSEN, F. H.; FAHEY, G. C., JR. AIN-93 purified diets for

laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc

writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. J Nutr, v.

123, n. 11, p. 1939-51, Nov 1993. ISSN 0022-3166 (Print)0022-3166.

Disponível em: < http://dx.doi.org/ >.

http://dx.doi.org/10.1093/bioinformatics/btw551

http://dx.doi.org/

http://www.atherosclerosis-journal.com/article/0021915085901388/abstract

http://www.atherosclerosis-journal.com/article/0021915085901388/abstract


http://www.atherosclerosis-journal.com/article/0021915085901388/pdf

http://www.atherosclerosis-journal.com/article/0021915085901388/pdf

http://dx.doi.org/

http://dx.doi.org/10.1016/j.tox.2007.11.021

http://dx.doi.org/

http://www.atherosclerosis-journal.com/article/0021915085901388/fulltext

63

REIS, L. M. D. et al. Sudden death prevalence analysis and associated risk

factors: study with 2056 patients submitted to necropsy. J. Bras. Patol. Med.

Lab., v. 42, n. 4, p. 299-303, 08/2006 2006. ISSN 1676-2444. Disponível em: <





http://www.scielo.br/pdf/jbpml/v42n4/a12v42n4.pdf >.

ROBERTSON, G.; LECLERCQ, I.; FARRELL, G. C. Nonalcoholic steatosis and

steatohepatitis. II. Cytochrome P-450 enzymes and oxidative stress. Am J

Physiol Gastrointest Liver Physiol, v. 281, n. 5, p. G1135-9, Nov 2001. ISSN

0193-1857 (Print)0193-1857. Disponível em: < http://dx.doi.org/ >.

ROSENSON, R. S. et al. Effects of lipids and lipoproteins on thrombosis and

rheology. Atherosclerosis, v. 140, n. 2, p. 271-280, 1998/10/01 1998. ISSN

1879-1484. Disponível em: < http://www.atherosclerosis-

journal.com/article/S0021915098001440/abstract >.Disponível em: <

http://www.atherosclerosis-journal.com/article/S0021915098001440/fulltext

>.Disponível em: < http://www.atherosclerosis-

journal.com/article/S0021915098001440/pdf >.

RÄMET, M. E. et al. High-density lipoprotein increases the abundance of eNOS

protein in human vascular endothelial cells by increasing its half-life ☆. v. 41, n.

12, p. 2288–2297, 18 June 2003 2003. Disponível em: <

http://dx.doi.org/10.1016/S0735-1097(03)00481-9 >.

SANTOS, J. E. D. et al. Consenso Brasileiro Sobre Dislipidemias Detecção,

Avaliação e Tratamento. Arq Bras Endocrinol Metab, v. 43, n. 4, p. 287-305,

08/1999 1999. ISSN 0004-2730. Disponível em: <





http://www.scielo.br/pdf/abem/v43n4/11753.pdf >.

SANTOS, M. G. D. et al. Risk factors for the development of atherosclerosis in

childhood and adolescence. Arq. Bras. Cardiol., v. 90, n. 4, p. 301-308,

04/2008 2008. ISSN 0066-782X. Disponível em: <








http://www.atherosclerosis-journal.com/article/S0021915098001440/fulltext

http://www.scielo.br/pdf/jbpml/v42n4/a12v42n4.pdf

http://dx.doi.org/





http://www.scielo.br/pdf/abem/v43n4/11753.pdf


http://www.atherosclerosis-journal.com/article/S0021915098001440/abstract


http://www.atherosclerosis-journal.com/article/S0021915098001440/pdf

http://www.atherosclerosis-journal.com/article/S0021915098001440/pdf

http://dx.doi.org/10.1016/S0735-1097(03)00481-9



http://www.atherosclerosis-journal.com/article/S0021915098001440/abstract


64

http://www.scielo.br/pdf/abc/v90n4/en_v90n4a12.pdf >.Disponível em: <

http://www.scielo.br/pdf/abc/v90n4/v90n4a12.pdf >.

SCHIAVO, M. et al. The influence of diet on the triglycerides serum

concentration. J. Bras. Patol. Med. Lab., v. 39, n. 4, p. 283-288, 00/2003 2003.

ISSN 1676-2444. Disponível em: <





http://www.scielo.br/pdf/jbpml/v39n4/18540.pdf >.

SCHILD, B. Z. et al. Nonalcoholic fatty liver disease and its association with

metabolic syndrome in the preoperative period in patients undergoing bariatric

surgery. Rev. Assoc. Med. Bras., v. 59, n. 2, p. 155-160, 04/2013 2013. ISSN

0104-4230. Disponível em: <





http://www.scielo.br/pdf/ramb/v59n2/en_v59n2a15.pdf >.Disponível em: <

http://www.scielo.br/pdf/ramb/v59n2/v59n2a15.pdf >.

SILVA, P. M. D. Metabolismo lipídico e diagnóstico das dislipidemias

primárias. Factores de risco. Sociedade Portuguesa de Cardiologia: 10-25 p.

2015.

SINAIKO, A., USA. Obesity, insulin resistance and the metabolic syndrome. J.

Pediatr. (Rio J.), v. 83, n. 1, p. 3-5, 02/2007 2007. ISSN 0021-7557. Disponível

em: < http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_abstract&pid=S0021-




http://www.scielo.br/pdf/jped/v83n1/en_v83n1a02.pdf >.Disponível em: <

http://www.scielo.br/pdf/jped/v83n1/v83n1a02.pdf >.

SIQUEIRA, A. F. A. U. et al. LDL: da síndrome metabólica � instabilização da

placa aterosclerótica. 2006-04-01 2006. Disponível em: <

http://www.repositorio.unifesp.br/handle/11600/3038 >.

SOLER, G. L. N. et al. Nonalcoholic Fatty Liver Disease: association with

metabolic syndrome and cardiovascular risk factors. Rev SOCERJ, v. 21(2), p.

94-100, 2008. Disponível em: <



http://www.scielo.br/pdf/jped/v83n1/v83n1a02.pdf

http://www.scielo.br/pdf/abc/v90n4/v90n4a12.pdf

http://www.scielo.br/pdf/ramb/v59n2/en_v59n2a15.pdf

http://www.repositorio.unifesp.br/handle/11600/3038


http://www.scielo.br/pdf/abc/v90n4/en_v90n4a12.pdf



http://www.scielo.br/pdf/jbpml/v39n4/18540.pdf

http://www.scielo.br/pdf/jped/v83n1/en_v83n1a02.pdf





http://www.scielo.br/pdf/ramb/v59n2/v59n2a15.pdf




65

http://sociedades.cardiol.br/socerj/revista/2008_02/a2008_v21_n02_a04Gisele.

pdf >.

SPOSITO, A. C. et al. IV Diretriz Brasileira sobre Dislipidemias e Prevenção da

Aterosclerose: Departamento de Aterosclerose da Sociedade Brasileira de

Cardiologia. Arq. Bras. Cardiol., v. 88, p. 2-19, 04/2007 2007. ISSN 0066-

782X. Disponível em: <





http://www.scielo.br/pdf/abc/v88s1/01.pdf >.

SRIVASTAVA, R. A.; SRIVASTAVA, N.; AVERNA, M. Dietary cholic acid lowers

plasma levels of mouse and human apolipoprotein A-I primarily via a

transcriptional mechanism. Eur J Biochem, v. 267, n. 13, p. 4272-80, Jul 2000.


STEINBERG, D. et al. Beyond cholesterol. Modifications of low-density

lipoprotein that increase its atherogenicity. N Engl J Med, v. 320, n. 14, p. 915-

24, Apr 6 1989. ISSN 0028-4793 (Print)0028-4793. Disponível em: <

http://dx.doi.org/10.1056/nejm198904063201407 >.

SUGIYAMA, S. et al. Lipoproteins Regulate C-Type Natriuretic Peptide

Secretion From Cultured Vascular Endothelial Cells. 1995-11-01 1995.

Disponível em: < http://atvb.ahajournals.org/content/15/11/1968.full >.

TALL, A. R. Plasma cholesteryl ester transfer protein. J Lipid Res, v. 34, n. 8,

p. 1255-74, Aug 1993. ISSN 0022-2275 (Print)0022-2275. Disponível em: <


TAVAFI, M. Complexity of diabetic nephropathy pathogenesis and design of

investigations. J Renal Inj Prev, v. 2, n. 2, p. 59-62, 2013. ISSN 2345-2781

(Electronic). Disponível em: < http://dx.doi.org/10.12861/jrip.2013.20 >.

TOWNSEND, K. L.; LORENZI, M. M.; WIDMAIER, E. P. High-fat diet-induced

changes in body mass and hypothalamic gene expression in wild-type and

leptin-deficient mice. Endocrine, v. 33, n. 2, p. 176-88, Apr 2008. ISSN 1355-

008X (Print)1355-008x. Disponível em: < http://dx.doi.org/10.1007/s12020-008-

9070-1 >.

WEBER, C.; NOELS, H. Atherosclerosis: current pathogenesis and therapeutic

options. Nat Med, v. 17, n. 11, p. 1410-22, 2011. ISSN 1078-8956. Disponível

em: < http://dx.doi.org/10.1038/nm.2538 >.



http://dx.doi.org/10.12861/jrip.2013.20

http://www.scielo.br/pdf/abc/v88s1/01.pdf

http://atvb.ahajournals.org/content/15/11/1968.full

http://sociedades.cardiol.br/socerj/revista/2008_02/a2008_v21_n02_a04Gisele.pdf

http://dx.doi.org/10.1038/nm.2538

http://dx.doi.org/


http://dx.doi.org/

http://sociedades.cardiol.br/socerj/revista/2008_02/a2008_v21_n02_a04Gisele.pdf

http://dx.doi.org/10.1007/s12020-008-9070-1

http://dx.doi.org/10.1007/s12020-008-9070-1


http://dx.doi.org/10.1056/nejm198904063201407

66

WILKINS, L. W. Third Report of the National Cholesterol Education Program

(NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood

Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III) Final Report. 2002-12-17 2002.

Disponível em: < http://circ.ahajournals.org/content/106/25/3143.long >.

WOUTERS, K. et al. Dietary cholesterol, rather than liver steatosis, leads to

hepatic inflammation in hyperlipidemic mouse models of nonalcoholic

steatohepatitis. Hepatology, v. 48, n. 2, p. 474-86, Aug 2008. ISSN 0270-9139.

Disponível em: < http://dx.doi.org/10.1002/hep.22363 >.

XAVIER, H. T. et al. V Diretriz Brasileira de Dislipidemias e Prevenção da

Aterosclerose. Arq. Bras. Cardiol., v. 101, n. 4, p. 1-20, 10/2013 2013. ISSN

0066-782X. Disponível em: <





http://www.scielo.br/pdf/abc/v101n4s1/v101n4s1.pdf >.

XIANGDONG, L. et al. Animal models for the atherosclerosis research: a

review. Protein Cell, v. 2, n. 3, p. 189-201, Mar 2011. ISSN 1674-800x.

Disponível em: < http://dx.doi.org/10.1007/s13238-011-1016-3 >.

YLÄ-HERTTUALA, S. et al. Evidence for the presence of oxidatively modified

low density lipoprotein in atherosclerotic lesions of rabbit and man. J Clin

Invest, v. 84, n. 4, p. 1086-95, Oct 1989. ISSN 0021-9738 (Print). Disponível

em: < http://dx.doi.org/ >.

ZHANG, S. H. et al. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in

mice lacking apolipoprotein E. Science, v. 258, n. 5081, p. 468-71, Oct 16

1992. ISSN 0036-8075 (Print)0036-8075. Disponível em: < http://dx.doi.org/ >.



http://dx.doi.org/10.1002/hep.22363


http://circ.ahajournals.org/content/106/25/3143.long


http://www.scielo.br/pdf/abc/v101n4s1/v101n4s1.pdf

http://dx.doi.org/10.1007/s13238-011-1016-3

http://dx.doi.org/

http://dx.doi.org/

Serviço Público Federal Universidade Federal Fluminense

Pró-Reitoria de Pesquisa, Pós-Graduação e Inovação Comissão de Ética no Uso de Animais

Certificamos que o projeto n° 647, intitulado “Efeito de dietas hiperenergéticas com

potencial obesogênico e/ou aterogênico sobre o sistema cardiovascular e renal de

camundongos”, sob a orientação da Profª. Caroline Fernandes dos Santos do Polo

Universitário de Nova Friburgo, está de acordo com os Princípios Éticos na

Experimentação Animal da SBCAL e obteve a aprovação da Comissão de Ética no

Uso de Animais em 26 de fevereiro de 2015. A quantidade total de animais

aprovada pela CEUA para este projeto foi de 240 (duzentos e quarenta)

camundongos, e este certificado é válido por três anos após sua aprovação.

Niterói, 26 de fevereiro de 2015.

_________________________________________

Prof. Dr. Fabio Otero Ascoli

Coordenador da CEUA

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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE STÉPHANIE … (RIUFF).pdf · M527a Mello, Stéphanie Christine Sinder Avaliação bioquímica do perfil lipídico e marcadores de lesão hepática