UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

NATHALIA MAÍRA CABRAL DE MEDEIROS

IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE COMPONENTES

DA VIA DE EXCISÃO DE BASES (BER) EM CANA-DE-

AÇÚCAR (SACCHARUM spp.).

NATAL/RN 2018

NATHALIA MAÍRA CABRAL DE MEDEIROS

IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE COMPONENTES

DA VIA DE EXCISÃO DE BASES (BER) EM CANA-DE-

AÇÚCAR (SACCHARUM spp.).

Tese apresentada ao programa de pós-graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Doutor(a) em Bioquímica.

Orientadora: Profa. Dra. Kátia Castanho Scortecci.

NATAL

2018

i

ii

iii

Dedico essa obra

À Deus, meus pais, meu irmão, meus familiares, meus amigos e professores, pela paciência, incentivo e eterno apoio.

iv

AGRADECIMENTOS

Ao criador e a espiritualidade por me salvaguardar continuamente nessa longa caminhada rumo a evolução moral e intelectual.

Á minha família pelo incentivo a minha jornada acadêmica de estudos e experimentos, além do suporte emocional para persistir nessa referida jornada.

À minha orientadora, professora Profa. Dra. Kátia Castanho Scortecci, por me acompanhar desde a graduação, guiando-me no labirinto da ciência.

Aos meus colegas de laboratório pelo companheirismo e apoio nessa epopeia cientifica.

À CAPES e CNPq e demais órgãos de fomento pelo auxílio financeiro que culminaram no desenvolvimento desse trabalho aqui exposto.

v

Se o conhecimento pode criar problemas,

não é através da ignorância que podemos solucioná-los.

Isaac Asimov

vi

vii

IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE COMPONENTES DA VIA DE

EXCISÃO DE BASES (BER) EM CANA-DE-AÇÚCAR (SACCHARUM spp.).

RESUMO A produtividade de qualquer cultivar está diretamente relacionada com a preservação de seu código genético, pois qualquer alteração na sequência pode acarretar consequências que afetam diretamente o desenvolvimento/crescimento do vegetal. A resposta ao dano ao DNA ocorre por meio de seu reparo que transcorre por intermédio de diferentes vias, sendo uma delas a via de excisão de bases (BER), cujos estudos em plantas ainda são inferiores em comparação a outros organismos eucariotos. Um dos obstáculos no avanço dessas pesquisas é a complexidade do genoma vegetal presente em alguns cultivares de importância agroeconômica, de modo que muitos estudos utilizam organismos modelos diploides. Este trabalho propõe preencher a lacuna existente no conhecimento da via BER em relação a plantas não-modelos e poliploides, tendo como alvo a cana-de-açúcar. A primeira abordagem do trabalho, foi a identificação de componentes da via BER em cana-de-açúcar e comparar os resultados obtidos com as sequências de outros organismos vegetais para o aprofundamento na questão da conservação desta via. A segunda abordagem se utilizou de uma sequência homóloga a AP endonuclease de Arabidosis thaliana (AtARP) em cana-de-açúcar denominada de ScARP1. Esta foi alvo de um ensaio de caracterização enzimática. Para primeira abordagem, considerou-se os resultados de trabalhos anteriores, onde foi verificado uma duplicação em cana-de-açúcar para a sequência AP endonuclease (ScARP1 e ScARP3), além de trabalho recente de revisão da via BER em plantas. Desta forma, foi efetuada uma busca nos bancos de dados de sequências ESTs para cana-de-açúcar (SUCEST-FUN) por sequências pertencentes a via BER. Para verificar a ocorrência de duplicações, os resultados dessa busca foram submetidos a analises filogenéticas e inferências Bayesianas. As sequências encontradas foram caracterizadas quanto a presença de domínios conservados, além de algumas delas foram modeladas, criando modelos 3D hipotéticos. Algumas das presumíveis proteínas identificadas diferiram em sua estrutura com as proteínas de referência de A. thalina. Ademais, múltiplas cópias de sequência foram observadas em certas famílias vegetais em detrimento de outras. Para a segunda abordagem, a proteína ScARP1 foi clonada, expressa e purificada. Com esta foram realizados diferentes ensaios que visaram avaliar a sua eficiência enzimática (considerando temperatura, cofatores enzimáticos e concentração de sais), assim como os substratos que seriam reconhecidos por ScARP1. Observou-se que a proteína ScARP1 possui apenas atividade AP endonuclease. Além disso, observou-se uma complementação parcial de ScARP1 em extratos proteicos do mutante arp-

/- de A. thalina. Com esse trabalho foi possível identificar membros da via BER em cana-de-açúcar, além de caracteriza-los estruturalmente e filogeneticamente a qual possibilitou destacar diferenças entre sequências de monocotiledôneas e dicotiledôneas. Ademais, em relação a ScARP1, determinou-se que esta apresenta atividade Ap endonuclease essencial para a sua atuação em BER. Com isso, amplificou-se o conhecimento desta via em cana-de-açúcar, bem como em organismos vegetais de forma geral.

Palavras-chaves: Reparo de DNA, AP Endonuclease, cana-de-açúcar, caracterização bioquímica, Filogenia, Modelagem.

viii

IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION FROM BASE EXCISION REPAIR PATHWAY COMPONENTS (BER) IN SUGARCANE (SACCHARUM

spp.).

ABSTRACT

The productivity of any cultivar is directly related to the preservation of its genetic

code, since any change in the sequence can have consequences that directly

affect the development/growth of the plant. The response to DNA damage occurs

through its repair through different pathways, one of which is the base excision

pathway (BER), whose studies on plants are still inferior in comparison to other

eukaryotic organisms. One of the obstacles in the advancement of these

researches is the complexity of the plant genome present in some cultivars of

agroeconomic importance, so that many studies use diploid models organisms.

This work proposes to fill the gap in the knowledge of the BER pathway in relation

to non-models and polyploid plants, targeting the sugarcane. The first approach

of the work was to identify components of the BER pathway in sugarcane and

compare the results obtained with the sequences of other plant organisms to

deepen the question of conservation of this pathway. The second approach was

using a sequence homologous to the AP endonuclease of Arabidosis thaliana

(AtARP) in sugarcane denominated ScARP1. This was the subject of an

enzymatic characterization test. For the first approach, we considered the results

of previous studies, where a duplication in sugarcane was verified for the AP

endonuclease sequence (ScARP1 and ScARP3), in addition to recent work on

the BER pathway review in plants. Thus, a search of the ESTs sequences

databases for sugarcane (SUCEST-FUN) was done by sequences belonging to

via BER. To verify the occurrence of duplications, the results of this search were

submitted to phylogenetic analysis and Bayesian inferences. The sequences

found were characterized as the presence of conserved domains, besides some

of them were modeled, creating hypothetical 3D models. Some of the presumed

proteins identified differed in their structure with the reference proteins of A.

thalina. Furthermore, multiple copies sequences were observed in certain plant

families over others. For the second approach, the ScARP1 protein was cloned,

expressed and purified. With this, different assays were carried out to evaluate

its enzymatic efficiency (considering temperature, enzymatic cofactors and salt

concentration), as well as the substrates that would be recognized by ScARP1.

It has been observed that the ScARP1 protein has only AP endonuclease activity.

In addition, partial complementation of ScARP1 in protein extracts of the A.

thalina arp-/- mutant was observed. With this work it was possible to identify

members of the BER pathway in sugarcane, besides characterizing them

structurally and phylogenetically, which made it possible to highlight differences

between sequences of monocotyledons and dicotyledons. Furthermore, in

relation to ScARP1, it was determined that this presents Ap endonuclease activity

essential for his performance in BER. Thus, it amplified the knowledge this

pathway in sugarcane and vegetables on organisms in general.

Keywords: DNA repair, AP Endonuclease, sugarcane, biochemical

characterization, Phylogeny, Modeling.

ix

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Agentes genotóxicos e reparo do DNA, em plantas - 28

Figura 2 – Representação esquemática da via de excisão de bases (BER). - 33

Figura 3 - Metodologia de identificação de sequências putativas de componentes da via de

Excisão de bases (BER) em cana-de-açúcar. - 46

Figura 4 - Análise e avaliação das sequências BER presumíveis de cana-de-açúcar. - 47

Figura 5 - Esquema didático representando as etapas metodológicas para a purificação da

proteína ScARP1. - 53

Figura 6 - Esquema representado as abordagens de avaliação e complementação enzimática empregadas na proteína ScARP1. - 66

Figura 7 – Substratos utilizados paras as respectivas atividades enzimáticas a serem

testas para ScARP1. - 61

Figura 8 – Modelo da presumível PCNA de Cana-de-açúcar. - 97

Figura 9 – Modelo tridimensional e sequências proteínas das PCNAs de plantas e humano.

- 98

Figura 10 – Modelos proposto para a presumível PCNA de cana-de-açúcar associado ao

DNA. - 99

Figura 11 – Modelo proposto para a putativa FEN1 de cana-de-açúcar. -. 101

Figura 12 – Complexo proposto de PCNA e FEN1 de cana-de-açúcar. - 103

Figura 13 - Analise das sequências de AP endonuclease AtARP, AtAPE2 e AtAPE1L (de A.

thaliana), ScARP1 e ScARP3 (cana-de-açúcar) e hAPE1 (Homo sapiens). – 107

Figura 14 – Modelos tridimensionais das Ap endonuclases de Arabidopsis thaliana e

Saccharum spp. - 110

Figura 15 - Mapa do desenvolvimento de expressão da sequência AtARP. - 111

Figura 16 - Mapa do desenvolvimento de expressão da sequência AtAPE1L. - 112

Figura 17 - Mapa do desenvolvimento de expressão da sequência AtAPE2. - 113

Figura 18 - Mapa do desenvolvimento de expressão das sequências homólogas a AtARP

em Oryza sativa (LOC_Os01g58680.1 e LOC_Os01g58690.1). - 114

Figura 19 - Mapa do desenvolvimento de expressão das sequências homólogas a AtAPE1L

em Oryza sativa (LOC_Os12g18200.1). - 116

Figura 20 - Mapa do desenvolvimento de expressão das sequências homólogas a AtAPE2

em Oryza sativa (LOC_Os09g36530.2). – 117

Figura 21– Resultados da eficiência da atividade enzimática de ScARP1 em relação a

variação de concentração e temperatura – 118

Figura 22 - Resultado do efeito dos distintos íons e da concentração de NaCl sob a

atividade de ScARP1. – 126

Figura 23 - Resultado dos ensaios de atividade exonuclease, fostatase e 3´-

phosphodiesterase de ScARP1. – 129

x

Figura 24 - Resultado do ensaio de complementação de atividade Ap endonuclease em

extratos vegetais de A. thaliana. – 131

Figura 25 - Diagrama de comparação das AP endonucleas de Arabidopsis thaliana

(AtARP1) e de cana-de-açúcar (ScARP1). – .133

Figura 26 - Diagrama de comparação das AP endonucleas de Arabidopsis thaliana

(AtARP1) e de cana-de-açúcar (ScARP1). –. 166

xi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Cristal de proteínas do banco de dados PDB (Protein Data Bank) utilizados para

as análises. – 51

Tabela 2 – Sequências utilizadas na confecção dos substratos a serem utilizados nos

ensaios enzimáticos. – .62

Tabela 3 – Formação do substrato em relação ao ensaio enzimático específico. – 63

Tabela 4 – Proteínas envolvidas na via de excisão de bases (BER) selecionadas para o

estudo. – 70

Tabela 5 – Função de AP endonuclease de Arabidopsis thaliana e cana-de-açúcar. – 106

Tabela 6 – Comparação entre as sequências de AP endonuclease analisadas. – 109

Tabela 7 - Expressão mais relevantes dos genes de AP endonuclease de Arabidopsis

thaliana, Oryza sativa e Saccharum spp. – 120

Tabela 8 - Dados do projeto AtGenExpress referente a expressão das sequências

analisadas de Ap endonuclease de A. thaliana (ARP, APE1L e APE2) em relação aos

estresses abióticos. – 122

Tabela 9– Dados de expressão de sequências homólogas a Ap edonculease de A. thaliana

em Oryza sativa em relação ao estresse abiótico: por seca, sal e frio. – 123

xii

LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS EROs - Espécie reativas de oxigênio; BER - Via de reparo por excisão de base; NER - Via de reparo por excisão de nucleotídeo; MMR - Via de rapro de DNA mismatch ou reparo de mal pareamento do DNA; HR - Via de reparo por recombinação homóloga; NHEJ - Via de reapro por recombinação não-homóloga. ESTs - expressed sequence tag -marcador de sequência genética; SSR - Simple Sequence Repeats - sequências simples repetidas; SNPs - Single-Nucleotide Polymorphisms - polimorfismo de nucleotídeo único; QTL - Mapeamento de loci de caracteres quantitativos; BAC - Cromossomo artificial bacteriano; AP - Apurínico/apirimídico; 5'dRP - 5' desoxirribose fosfato; 3´PUA - Aldeído β,α-insaturado; SN-BER - Single Nucleotide Base Excision Repair ou via curta de BER; LP-BER - Long Patch Base excision repair ou via longa de BER; MMS - Metanossulfonato de metila; Polβ - DNA polimerase beta; AtLIG1 - DNA ligase 1 de Arabidopsis thaliana; AtFPG - DNA-Formamidopirimidina Glicosilase de Arabidopsis thaliana; AtOGG1 - 8-oxoguanine DNA glicosilase 1 de Arabidopsis thaliana; 8-oxoG - 8-Oxoguanina; ZDP - DNA-3-fosfatase; AtPol λ - DNA Polimerase lambda de Arabidopsis thaliana; 5-mC - 5-Metilcitosina; AtXRCC1 - X-RAY REPAIR CROSS COMPLEMENTING 1 de Arabidopsis thaliana; PCNA - Antígeno Nuclear da Proliferação Celular; OsFEN1 - FLAP ENDONUCLEASE 1 de Oryza sativa; APE1 - Apurínica/apimínica (AP) endonuclease 1 de mamíferos;

xiii

AtUNG - Uracil-DNA glicosilase; MBP - Maltose-binding protein; BtMe - β-mercaptoetanol. EDTA - Ácido etilenodiamino tetra-acético. TEMED - Tetrametiletilendiamina. APS - Persulfato de amónio. HEPES - Ácido 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonico. DTT - Ditiotreitol. OGG1 - 8-OXOGUANINA GLICOSILASE; NTH1 e NTH2 -ENDONUCLEASE III-LIKE PROTEIN 1 e 2; UNG ou UDG - URACIL-DNA GLICOSILASE; ROS1 - REPRESSOR OF SILENCING 1; DEM - ATIVADOR TRANSCRICIONAL DEMETER; DML3 - DEMETER-LIKE PROTEIN 3; MBD4L - METHYL-CpG-BINDING DOMAIN PROTEIN 4-LIKE PROTEIN; FEN1 ou SAV6 - FLAP ENDONUCLEASE 1; Pol λ ou POLL - DNA POLIMERASE LAMBDA; TDP1 - TYROSYL-DNA PHOSPHODIESTERASE 1; LIG1 - DNA LIGASE I (1); LIG4 - DNA LIGASE IV (4); ZDP - POLINUCLEOTIDEO 3'-FOSFATASE; PCNA1 - ANTIGENO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR 1; PCNA2 - ANTIGENO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR 2; PARP1 - POLI [ADP-RIBOSE] POLIMERASE 1; PARP2 - POLI [ADP-RIBOSE] POLIMERASE 2; XRCC1 - X-RAY REPAIR CROSS-COMPLEMENTING PROTEIN 1; WRN - WERNER SYNDROME ATP-DEPENDENT HELICASE; DNAss - Single strand DNA - DNA fita simples; DNAds - Double strand DNA - DNA fita dupla; WGD - Duplicação total do genoma.

xiv

SUMÁRIO

RESUMO VII

LISTA DE FIGURAS IX

LISTA DE TABELAS XI

LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS XII

SUMÁRIO XIV

1. INTRODUÇÃO 20

1.1. CANA-DE-AÇÚCAR 20

1.1.1. ORIGEM E CARACTERÍSTICA DO CULTIVAR 20

1.1.2. IMPORTÂNCIA ECONÔMICA 20

1.2. ESTRESSE GENOTÓXICO, REPARO DE DNA E PRODUTIVIDADE DO CULTIVO. 23

1.2.1. CONDIÇÕES ADVERSAS SEU EFEITO SOBRE AS PLANTAS. 23

1.2.2. RESPOSTA AO ESTRESSE E SUA RELAÇÃO AS VIAS DE REPARO DE DNA. 26

1.2.2.1. Pesquisas relevantes em cana-de-açúcar no reparo do DNA. 30

1.3. VIA DE EXCISÃO DE BASES (BER) 31

1.3.1. DESCRIÇÃO DA VIA E SUA RELEVÂNCIA PARA AS PLANTAS. 31

1.3.2. AP ENDONUCLEASE – UMA DAS ENZIMAS CHAVES DA VIA BER. 38

1.4. IMPORTÂNCIA DA ANÁLISE IN SILICO. 40

1.4.1. ANÁLISE FILOGENÉTICA. 40

1.4.2. MODELAGEM 41

2. OBJETIVO GERAL. 44

2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS. 44

3. MATERIAL E MÉTODOS 45

3.1. IDENTIFICAÇÃO DE COMPONENTES DE BER EM CANA-DE-AÇÚCAR. 45

3.1.1. BUSCA POR SEQUÊNCIAS E AVALIAÇÃO. 45

3.1.2. ÁRVORES FILOGENÉTICAS GERADAS VIA TAXONTREE. 48

3.1.3. INFERÊNCIA BAYESIANA. 48

3.2. MODELAGEM. 49

3.2.1. REFINAMENTO E AVALIAÇÃO DOS MODELOS. 50

3.2.2. ANÁLISE DOS MODELOS 50

3.3. ANÁLISE IN SILICO DE AP ENDONCUCLEASE DE ARABIDOPSIS THALIANA, HOMO

SAPIENS E DE CANA-DE-AÇÚCAR. 51

xv

3.3.1. ANÁLISE IN SILICO DE SEQUÊNCIAS DE ARABIDOPSIS THALIANA. 51

3.3.2. MODELOS DE AP ENDONUCLASES DE A. THALIANA. 52

3.4. CLONAGEM E PURIFICAÇÃO DA AP ENDONUCELASE DE CANA-DE-AÇÚCAR: SCARP1.

53

3.4.1. MINIPREP (CTAB) E REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR). 54

3.4.2. EXTRAÇÃO DE DNA DE GEL DE AGAROSE. 55

3.4.3. LIGAÇÃO AO VETOR DE EXPRESSÃO PMAL-C5X. 55

3.4.4. COMPETÊNCIA E TRANSFORMAÇÃO RÁPIDA DA LINHAGEM BL21. 56

3.4.5. ENSAIO DE EXPRESSÃO DE PROTEÍNA. 56

3.4.6. PURIFICAÇÃO. 57

3.4.7. GEL SDS-PAGE. 58

3.5. PROTEÍNA SCARP1 – AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE E COMPLEMENTAÇÃO ENZIMÁTICA.

59

3.5.1. REAÇÃO DE ENSAIO ENZIMÁTICO. 60

3.5.1.1. Substratos. 60

3.5.1.2. Protocolos de reação e precipitação. 64

3.5.1.3. Gel de acrilamida para os ensaios enzimáticos. 64

3.5.2. REAÇÃO DE COMPLEMENTAÇÃO ENZIMÁTICA. 65

3.5.2.1. Material vegetal utilizado. 65

3.5.2.2. Plantio de sementes em placas. 66

3.5.2.3. Extração das proteínas de A. thaliana e dialise. 66

3.5.2.4. Reação de complementação. 67

3.6. REVELAÇÃO DE IMAGENS. 67

4. RESULTADO 68

4.1. VIA DE EXCISÃO DE BASES EM CANA-DE-AÇÚCAR: IDENTIFICAÇÃO E

CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS PUTATIVAS. 68

4.1.1. 8-OXOGUANINA GLICOSILASE – OGG1 72

4.1.1.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – OGG1. 72

4.1.2. ENDONUCLEASE III-LIKE PROTEIN 1 E 2 73

4.1.2.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – NTH1 e NTH2. 74

4.1.3. URACIL-DNA GLICOSILASE - UNG OU UDG. 75

4.1.3.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – UNG. 75

4.1.4. ATIVADOR TRANSCRICIONAL DEMETER (DME), REPRESSOR OF

SILENCING 1 (ROS1) E DEMETER-LIKE PROTEIN 3 (DML3). 76

4.1.4.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – ROS1, DME e DML3. 78

4.1.5. METHYL-CPG-BINDING DOMAIN PROTEIN 4-LIKE PROTEIN -MBD4L 78

4.1.5.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – MBD4L. 79

4.1.6. FLAP ENDONUCLEASE 1 - FEN1 OU SAV6. 80

4.1.6.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – FEN1A e FEN1B. 81

4.1.7. DNA POLIMERASE LAMBDA -POL Λ OU POLL. 81

4.1.7.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – DNA polimerase Lambda.

83

4.1.8. TYROSYL-DNA PHOSPHODIESTERASE 1 TDP1. 83

4.1.8.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – TDP1. 84

4.1.9. DNA LIGASE 1 -LIG1. 85

4.1.9.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – DNA ligase I. 86

xvi

4.1.10. DNA LIGASE IV - LIG4. 86

4.1.10.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – DNA ligase IV. 88

4.1.11. POLINUCLEOTIDEO 3'-FOSFATASE – ZDP. 88

4.1.11.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – ZDP. 89

4.1.12. ANTIGENO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR 1 (PCNA1) E ANTIGENO DE

PROLIFERAÇÃO CELULAR 2 (PCNA2). 90

4.1.12.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – PCNA1 e PCNA2. 91

4.1.13. POLI [ADP-RIBOSE] POLIMERASE 1 (PARP1) E POLI [ADP-RIBOSE]

POLIMERASE 2 (PARP2). 91

4.1.13.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – PARP1 e PARP2. 93

4.1.14. X-RAY REPAIR CROSS-COMPLEMENTING PROTEIN 1 - XRCC1. 93

4.1.14.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – XRCC1. 94

4.1.15. WERNER SYNDROME ATP-DEPENDENT HELICASE- WRN. 94

4.1.15.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – WRN. 95

4.2. MODELAGEM. 96

4.2.1. MODELO DE PCNA_CANA. 96

4.2.2. MODELO DE FEN1_CANA. 100

4.2.3. INTERAÇÃO ENTRE OS MODELOS DE PCNA E FEN1. 101

4.3. ANALISE DAS SEQUÊNCIAS AP ENDONUCLEASES DE ARABIDOPOSIS, E CANA-DE-

AÇÚCAR. 104

4.4. COMPARAÇÃO DE MODELOS DE AP ENDONUCLEASE DE ARABIDOPSIS E CANA-DE-

AÇÚCAR. 109

4.5. ANÁLISE DO PADRÃO DE EXPRESSÃO DAS AP ENDONUCLEASES DE ARABIDOPSIS,

ARROZ E MILHO EM COMPARAÇÃO A CANA-DE-AÇÚCAR. 112

4.6. ENSAIOS DE REAÇÃO ENZIMÁTICA. 124

4.6.1. EFICIÊNCIA DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA E EFEITO DA TEMPERATURA EM SCARP1.

124

4.6.2. EFEITO DOS ÍONS E CONCENTRAÇÃO DE NACL NA ATIVIDADE DE SCARP1. 127

4.6.3. ATIVIDADE EXONUCLEASE, FOSTATASE E 3´-PHOSPHODIESTERASE DE SCARP1.

129

4.6.4. ENSAIO DE COMPLEMENTAÇÃO DE ATIVIDADE AP ENDONUCLEASE EM EXTRATOS

DE A. THALIANA. 132

5. DISCUSSÃO 134

5.1. IDENTIFICAÇÃO E ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS DA VIA BER EM CANA-DE-AÇÚCAR. 134

5.1.1. OGG1. 135

5.1.2. NTH1 E NTH2. 136

5.1.3. UNG. 137

5.1.4. DME, DMLE E ROS1. 138

5.1.5. MBD4L. 140

5.1.6. FEN1A E FEN1B. 141

5.1.7. POLLAMBDA. 142

5.1.8. TDP1. 144

5.1.9. DNA LIGASE 1 E DNA LIGASE 4. 144

5.1.10. ZDP. 146

5.1.11. PCNA1 E PCNA2. 147

5.1.12. PARP1 E PARP2. 148

xvii

5.1.13. XRCC1. 150

5.1.14. WRN. 151

5.2. DUPLICAÇÕES DE SEQUÊNCIAS DE COMPONENTES DE BER NOS ORGANISMOS

VEGETAIS. 152

5.3. ANÁLISE DOS MODELOS DE PCNA E FEN1 DE CANA-DE-AÇÚCAR. 155

5.4. CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA DE SCARP1. 157

6. CONCLUSÃO 165

7. REFERÊNCIAS 168

20

1. INTRODUÇÃO

1.1. Cana-de-açúcar

1.1.1. Origem e característica do cultivar

A cana-de-açúcar é uma planta nativa do sudeste da Ásia, com seu cultivo na

Índia datado desde 5000 anos atrás. Possui a fotossíntese do tipo C4, resultando em

uma forte acumulação de biomassa em condições tropicais e crescimento menos

vigoroso em regiões temperadas (BRADSHAW, 2016). Esse vegetal é uma

gramínea pertencente a família Poaceae que, por sua vez, é uma família de plantas

com sementes economicamente importantes que incluem entre os seus

representantes o milho (Zea mays), trigo (Triticum spp.), arroz (Oryza sativa) e o

sorgo (Sorghum bicolor).

A cana-de-açúcar utilizada para cultivo é um híbrido multiespecífico e recebe,

por isso, a designação de Saccharum spp. Os híbridos modernos de Saccharum são

altamente poliplóides e aneuploides com números de cromossomos em células

somáticas que variam de 100 a 130. Este genoma complexo é derivado de alguns

cruzamentos entre Saccharum officinarum L. (2n = 8x = 80), que é caracterizado por

acumular sacarose, e Saccharum spontaneum L. (2n = 5x a 12x = 40-128) que

apresenta resistência a doenças e levada taxa de crescimento em biomassa,

contudo com baixo teor de sacarose (D’HONT et al., 1998; IRVINE, 1999; GRIVET

& ARRUDA 2002; VICENTINI et al., 2012). As cultivares atuais de cana-de-açúcar

estimam ter cerca de 80-90% do genoma de origem da S. officinarum e 10 a 20% de

S. spontaneum (GRIVET et al., 1996; HOARAU et al., 2002; D’HONT, 2005;

PIPERIDIS et al., 2010).

1.1.2. Importância econômica

A cana-de-açúcar é uma cultura importante em todo o mundo, produzindo

80% do açúcar bruto mundial e é cada vez mais requisitada para a produção de

biocombustíveis tendo em vista os dados da European Commission - Agriculture and

development (https://ec.europa.eu/agriculture/sugar_en). De acordo com a

21

FAOSTAT (Food and Agriculture Organization Corporate Statistical Database), em

2016, a estimativa de área destinada à colheita de cana-de-açúcar foi de mais de 26

milhões de hectares (ha), já a produtividade (Yield) foi de, aproximadamente, 700 mil

hg/ha (hectograma por hectare) e a produção mundial foi de cerca de 1 bilhão de

toneladas.

A cana-de-açúcar pode ser considerada uma das principais alternativas para

o setor de biocombustíveis, segundo a própria Companhia Nacional de

Abastecimento (CONAB), isso ocorre em virtude de seu grande potencial na

produção de etanol e aos respectivos subprodutos, deste modo fazendo com que,

no agronegócio, a indústria brasileira da cana-de-açúcar exiba papel de destaque na

economia nacional. O Brasil é líder no complexo sucroenergético e maior produtor

mundial de cana-de-açúcar (CARVALHO & OLIVEIRA, 2006).

Para o crescimento ótimo da cana-de-açúcar a FAO (Food and Agriculture

Organization of the United Nations) informa que a safra floresce sob uma longa e

quente estação de crescimento com alta incidência de radiação e umidade

adequada. A temperatura ideal para germinação das gemas do caule é de 32 a 38

°C. O crescimento ótimo é alcançado com temperaturas médias diárias entre 22 e

30 °C. A temperatura mínima para o crescimento ativo é de aproximadamente 20 °C.

Sabe-se também que a cana-de-açúcar é moderadamente sensível à salinidade e

diminui o rendimento das culturas devido ao aumento da mesma. Outro fato

importante que deve ser ressaltado é a necessidade de uma umidade disponível

adequada ao longo do período de crescimento para obter rendimentos máximos,

pois o crescimento vegetativo é diretamente proporcional à água transpirada.

Estudos mostraram o impacto da redução da disponibilidade de água na produção

de cana-de-açúcar, devido a sua alta produção de biomassa o que requer grandes

quantidades de água para produção máxima (WIEDENFELD, 2008).

Em relação ao Nordeste brasileiro, conforme descrito pela CONAB segundo

o levantamento da safra de cana-de-açúcar feita em maio de 2018 (V. 5 - SAFRA

2018/19 N.1), se for comparado a produtividade de cana-de-açúcar por região,

percebe-se que a região Nordeste se encontra em último lugar em relação as outras

regiões do Brasil, dispondo da produção de 48,85 t/ha (toneladas por hectare), na

safra de 2017/18, e 50,85 t/ha, em 2018/19 (estimativa de maio de 2018). Os

22

primeiros lugares - região Centro-Oeste e Sudeste - exibem uma média de 75 t/ha

de produtividade. A própria CONAB indica como fatores negativos da baixa

produtividade do Nordeste está relacionado a falta de investimentos, renovação das

lavouras e o clima, a depender das chuvas para proporcionar um clima favorável

para a renovação das lavouras o que levaria ao aumento de rendimento. Além disso,

deve-se levar em consideração os custos de produção da região Nordeste que são

mais elevados em comparação aos da região Centro-Sul por causa da baixa

fertilidade dos solos, menor volume de chuvas e topografia inadequada para

mecanização (KOHLHEPP, 2010). Todos esses fatores culminam por resultar em

uma diminuição na produtividade, afetando negativamente a economia regional.

Ainda segundo a Companhia Nacional de Abastecimento, o estado do Rio

Grande do Norte exibiu uma produtividade (em kg/ha -quilograma por hectare) de

aproximadamente 43 mil na safra de 2017/18, ficando em último lugar dentre os

estados da região Nordeste, contudo na safra de 2018/19, até o momento,

apresentou a produtividade foi de 47 mil, ocupando o penúltimo lugar.

Além disso, outro fator a contribuir com a discrepância referente a

produtividade de cana-de-açúcar entre as regiões brasileiras seria os programas de

melhoramento desse organismo vegetal a qual parte dos seus cultivares são

desenvolvidos adaptados a condições edafoclimáticas típicas das regiões sul-

sudeste, logo, quando implantadas na região nordeste sofrem consequências

negativas expressas em sua produtividade (PEREIRA & TAVARES, 2017).

Contribuindo para cenário desfavorável para melhoramento vegetal da cana-de-

açúcar, a produção de um novo cultivar, se utilizando de metodologias do

melhoramento clássico, requer o tempo de 8 a 12 anos (CESNIK, 2007). Abordagens

biotecnológicas podem tornar-se cruciais para enfrentar as limitações do

melhoramento clássico, pois além do tempo de obtenção de um novo material ser

demasiadamente longo, a cana-de-açúcar é um organismo complexo, e a sua

elevada ploidia (aneuploidia e ploidia) e estrutura do genoma criam desafios para o

desenvolvimento de plantas transgênicas que favoreçam o desenvolvimento da

planta ideal o mercado, ou seja, planta essa que seja produtiva, com alto teor de

sacarose (riqueza), tolerância ao déficit hídrico, alta produção de etanol e de

biomassa (MORAIS et al., 2015).

23

1.2. Estresse Genotóxico, Reparo de DNA e Produtividade do Cultivo.

1.2.1. Condições adversas seu efeito sobre as plantas.

As plantas por terem uma natureza séssil, em um ambiente variável, tem que

lidar com uma infinidade de condições adversas (doravante denominado estresse)

onde a maioria destas condições pode atrasar o seu crescimento e desenvolvimento

e, mais importante, impedi-los de atingir o seu potencial genético em termos de

produtividade, tendo vista que essa produtividade é estritamente relacionada à

estabilidade do genoma (BALESTRAZZI et al., 2011).

A segurança alimentar é uma questão importante na agenda política mundial,

tendo em conta que nos próximos 40 anos, a demanda por produção de cereais

deverá aumentar em 60% à medida que a população irá crescer dos atuais 6,6 para

8,7 bilhões até o ano de 2050 (BENGTSSON et al., 2006). O aumento da

temperatura global, associado a chuvas limitadas e condições extremas de seca,

afeta severamente a produtividade das culturas dentro de um cenário em que as

previsões de escala global da futura dinâmica da vegetação se tornaram uma

prioridade para a comunidade científica (AHUJA et al., 2010; MCDOWELL et al.,

2011). São esperadas temperaturas sazonais crescentes e precipitações reduzidas,

acompanhadas de ondas de calor com maior frequência e maior duração

(AINSWORTH & ORT, 2010).

A segurança alimentar não é o único problema ser enfrentado pela a

humanidade em um futuro próximo, não se pode ignorar a crítica questão dos

combustíveis fósseis. É previsto que a produção mundial de petróleo deverá diminuir

de 25 bilhões de barris para 5 bilhões de barris até 2050 (CAMPBELL & LAHERREE,

1998). Todavia, com a nova descoberta do uso de biocombustível, a demanda atual

por esse tipo de combustível aumentou. A cana-de-açúcar é uma das principais

fontes de biocombustível que pode substituir o combustível fóssil nos próximos anos.

Tal fato não apenas contribuiria para a manutenção do equilíbrio ecológico, mas

também fortaleceria a indústria e colaboraria para a diversificação energética

mundial (LAM et al., 2009). Ademais, o uso de biocombustível tem impactos

positivos, uma vez que elimina os compostos de chumbo da gasolina, bem como a

redução da emissão venenosa de gases nocivos (GOLDEMBERG et al., 2008). Há

24

também a redução das emissões de CO2, pois o etanol de cana-de-açúcar requer

apenas uma pequena quantidade de combustíveis fósseis para sua produção.

A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é agora considerada a cultura de energia

de primeira geração (produção de etanol a partir da fermentação de açúcares

vegetais) mais produtiva, além de também ter eficiência na produção de

biocombustível de segunda geração (A produção de etanol a partir de biomassa

lignocelulósica) (BECHARA et al., 2018). Os açúcares extraídos da cana de açúcar

podem ser facilmente fermentados para produzir etanol. Além disso, o bagaço

(biomassa remanescente após o suco ser extraído das hastes) é usado pelas usinas

de açúcar para gerar vapor e eletricidade (SALASSI & BREAUX, 2006; MAHMOOD-

UL-HASSAN et al., 2015). Levando-se em consideração as mudanças climáticas e

seu efeito negativo sobre a agricultura, inclusive na cultura de cana-de-açúcar, isso

também desencadearia consequências adversas na produção de biocombustível e,

logo, prejudicando a economia brasileira.

As plantas expostas a ambientes adversos sofrem estresse oxidativo,

resultando em lesões graves nos níveis celular e molecular. Exemplo desses

ambientes adversos seria a poluição ambiental, causada por atividades

antropogênicas, bem como o estresse hídrico e as condições de alta temperatura

associadas a mudanças climáticas rápidas que contribuem para a deterioração do

solo e, portanto, afetam a produtividade das culturas (AHMAD et al., 2009). Quando

as plantas estão diante do estresse oxidativo, as respostas protetoras, que incluem

uma rede complexa de eventos moleculares e celulares integrados, são ativadas. A

percepção inicial do estresse e a transdução do sinal de estresse são fatores-chave

que levam à modulação da expressão gênica e, finalmente, à resposta da planta que

pode garantir a tolerância e assim garantindo a sobrevivência do organismo

(BALESTRAZZI et al., 2009). Não obstante, a maioria das pesquisas focam nas

respostas das plantas aos estresses individuais, incluindo calor, seca, salinidade,

frio, osmose, nutrientes, bactérias, fungos, vírus e herbívoros (WANG et al., 2003;

NAKASHIMA & YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 2006; FERREIRA et al., 2007;

RODRIGO et al., 2011; FÜRSTENBERG-HÄGG et al., 2013; SHAIK &

RAMAKRISHNA, 2013; SHANKER et al., 2014). Embora esses estudos forneceram

insights importantes sobre as respostas ao estresse das plantas, eles não permitem

prever as respostas das plantas em condições de campo as quais normalmente

25

englobam mais de um estresse simultâneo atuando sobre o cultivar (ATKINSON &

URWIN, 2012; ATKINSON et al., 2013; PRASCH & SONNEWALD, 2013;

RASMUSSEN et al., 2013 KISSOUDIS et al., 2014; SUZUKI et al., 2014; PANDEY

et al., 2015). Atualmente, esforços intensos são dedicados a compreender os

múltiplos aspectos da biologia molecular do estresse das plantas para adquirir novos

conhecimentos e fornece ferramentas/tecnologias avançadas para melhorar a

sobrevivência dos vegetais e garantir um ótimo desempenho agronômico.

A cana-de-açúcar, por sua vez, é considerado uma planta com algumas

peculiaridades, como as múltiplas cópias do genoma, que introduzem obstáculos

para abordagens fisiológicas, genéticas e bioquímicas para sua melhoria. O enorme

impacto do biocombustível na economia, a exploração bem-sucedida da cana-de-

açúcar em biocombustíveis e as mudanças climáticas mudaram o foco global e

identificaram a inevitável necessidade de pesquisas extensivas sobre a cana-de-

açúcar (AZEVEDO et al., 2011). Um exemplo de estresse que afeta a cana-de-

açúcar, principalmente relacionamento regiões de clima árido e semiárido, é o salino.

O estresse salino prejudica gravemente a produtividade e a qualidade do produto,

principalmente resultando na redução da atividade fotossintética (AKHTAR et al.,

2003) que eventualmente provoca a diminuição na concentração de sacarose na

haste de cana (ROZEFF et al., 1995).

Estudos voltados a identificação e caracterização de genes essências para a

tolerância a estresse abióticos e biótico ainda são escassos em cana-de-açúcar se

comparado a outros organismos vegetais, tais como a Arabidopsis thaliana. Pode-

se citar alguns exemplos, como o isolamento do gene de catalase peroximal

(ScCAT1) em uma variedade de cana-de-açúcar resistente ao patógeno Sporisorium

scitamineum, indicou que o gene responde a condições de estresse biótico e abiótico

que estaria envolvendo na proteção da cana-de-açúcar contra o estresse oxidativo

(SU et al., 2014). Augustine et al (2015) investigaram o efeito da super-expressão do

gene HSP70 (heat shock protein 70) de Erianthus arundinaceus (cana-de-açúcar

selvagem) em cana-de-açúcar moderna ocasionando, como consequência, a

formação de interdigitações anisotrópicas em resposta ao referido estresse. O gene

R2R3-MYB em cana-de-açúcar (ScMYB2) apresentou um splicing alternativo de dois

trainscritos (ScMYB2S1 e ScMYB2S2) que estariam envolvidos na via de sinalização

da senescência da folha mediada por ABA (ácido abscísico) e atuariam em um papel

26

positivo na resposta da senescência induzida por seca na cana-de-açúcar (GOU et

al., 2017). Zhang et al (2017) investigaram a subunidade 7 mediadora (MED7), uma

subunidade chave na modulação do complexo da RNA polimerase II, em cana-de-

açúcar (ScMED7), a qual foi observado que a sua transcrição está relacionado com

a presença de metais pesados, temperatura baixa e hormônios. ScMED7

desempenharia um papel importante na modulação das respostas da cana-de-

açúcar aos estresses bióticos e abióticos, e poderia atuar nas respostas

hipersensíveis e na defesa basal contra os patógenos (ZHANG et al., 2017). Liu et

al (2018) estudaram o gene ScAPX6 (L-ascorbate peroxidase 6) em cana-de-açúcar,

a qual exibiu como localização subcelular o cloroplasto, tolerância ao estresse por

cobre (Cu), tendo aumento de expressão em hormônios associados ao estresse

(ácido abscísico e metil jasmonato), sendo proposto que ScAPX6 estaria associado

a resposta a hipersensibilidade e imunidade da cana-de-açúcar. Como pode ser

observado, tais trabalhos citados anteriormente se concentram na analise de

expressão dos genes por eles estudados, tendo poucos estudos voltados para a

caracterização enzimática e modelagem das presumíveis proteínas para a cana-de-

açúcar.

1.2.2. Resposta ao estresse e sua relação as vias de reparo de DNA.

As plantas estão continuamente expostas a estresses ambientais, edáficos e

outros estresses antropogênicos. Estes incluem extremos de temperatura, seca, UV-

B (radiação ultravioleta do tipo B - 320–280 nm), bem como poluentes do ar e do

solo. Além de impactar severamente os componentes estruturais, enzimáticos e não

enzimáticos das plantas, esses estresses potencialmente ameaçam os genomas

vegetais (WASI et al., 2013). Os danos ao DNA que não foram devidamente

corrigidos podem gerar mutações, que podem acarretar instabilidade do genoma da

planta, dessa forma afetando o seu crescimento e produtividade, o que ameaça a

sobrevivência do organismo (SINGH et al., 2010, BIEDERMANN et al., 2011). As

plantas, por serem organismos sésseis, são susceptíveis aos impactos ambientais

desfavoráveis, logo o embate contra os agentes estressores e suas consequências

(lesões ao material genético, por exemplo) é a única alternativa para sua

sobrevivência e crescimento.

27

O estresse genotóxico nas plantas é essencialmente considerado como um

fator crítico que prejudica o fitness e a produtividade ao afetar a estabilidade do

genoma (TUTEJA et al., 2009; ROLDAN-ARJONA & ARIZA, 2009), tendo em vista

os efeitos do estresse oxidativo no compartimento nuclear onde o DNA pode se

tornar o principal alvo das espécies reativas de oxigênio (EROs). Vários estresses

abióticos (por exemplo: déficit de água, alto teor de sal, luz UV, radiação ionizante,

metais pesados e ozônio) podem desencadear o dano ao DNA, atuando diretamente

na estrutura de dupla hélice ou aumentando os níveis intracelulares de EROs

(TUTEJA et al., 2009). O dano oxidativo do DNA requer um reparo rápido para

manter a integridade do genoma e preservar a fidelidade da informação genética. A

resposta das células das plantas ao estresse genotóxico depende da atividade de

múltiplos caminhos de reparo do DNA que compartilham alguns elementos comuns

com células animais, mas também características próprias, únicas para o reino

vegetal (BALESTRAZZI et al., 2013).

Vários agentes genotóxicos podem simultaneamente causar danos ao DNA

dentro do núcleo e estresse oxidativo fora do compartimento nuclear, levando a uma

atividade molecular complexa que pode resultar na morte celular programada

(BALESTRAZZI et al., 2013). Além do estimulo ao reparo do DNA, mecanismos

antioxidantes são ativados dentro e fora do compartimento nuclear. No entanto,

enquanto a maquinaria antioxidante da planta tem sido amplamente investigada

(GILL & TUTEJA, 2010), a pesquisa no campo do reparo do DNA em organismos

vegetais ainda é limitada, apesar da relação relevante entre este aspecto da fisiologia

da planta e os problemas agronômicos atuais (BALESTRAZZI et al., 2011).

Geralmente, é aceito que a escolha de uma via de reparo e sua ação depende

principalmente do tipo de célula, seu status de proliferação, fase do ciclo celular, bem

como o tipo de lesão e seu contexto genômico (BRITT, 1999; MANOVA &

GRUSZKA, 2015). Fora algumas exceções, demonstrou-se que as plantas possuem

todos os mecanismos de reparo da molécula de DNA que foram inicialmente

descritos em maior extensão nos outros sistemas eucarióticos, como leveduras e

mamíferos (BRITT, 2002; MANOVA & GRUSZKA, 2015).

Em relação as vias de reparo (figura 1), temos a via de fotorreativação dos

danos induzidos por UV (radiação ultravioleta) na molécula de DNA, sendo um dos

28

mecanismos de reparação primário imprescindível para as plantas diariamente,

devido a necessidade inerente a exposição à luz solar para que a fotossíntese

ocorra. As duas formas clássicas de reparo de excisão, de base (BER) e de

nucleotídeos (NER), muitas vezes consideradas como "reparação de escuro",

também são encontradas no genoma das plantas (RASTOGI et al., 2010). O reparo

de DNA Mismatch (MMR), ou reparo de mal pareamento do DNA, tem sido implicado

na remoção de nucleotídeos emparelhados de forma incorreta e as fotolesões

induzidas por UV nos genomas de plantas superiores (CULLIGAN & HAYS, 2000;

LARIO et al., 2011.). As principais vias de reparo de quebra de fita dupla de DNA -

Recombinação Homóloga (HR) e Recombinação não-Homóloga (NHEJ)

demonstraram ser essenciais nas plantas para a preservação de sua estabilidade

genética (PUCHTA & HOHN, 1996; WATERWORTH et al., 2011). Alguns dos

mecanismos de reparo, como a fotorreativação, são altamente especializados para

um dano particular, no entanto, outros, como a via de excisão ou recombinação,

podem lidar com uma grande variedade de lesões (RIES et al., 2000; FATIMA et al.,

2017).

Figura 1 - Agentes genotóxicos e reparo do DNA, em plantas. A molécula de DNA nas plantas sofre ação de agentes genotóxicos que provocam danos ao seu material genético. As plantas, por sua vez, possuem várias vias de reparo do DNA como ilustrado acima para se protegerem. EROs – Espécies Reativas de Oxigêncio, UV- Ultravioleta.

A maior parte da pesquisa na área de reparo de DNA foi realizada em enzimas

bacterianas, todavia trabalhos adicionais demonstraram que há um nível alto de

29

conservação dessas proteínas entre os diferentes reinos, o que permite a análise via

homologia de sequências (SCHRÖPFER et al., 2014).

Em relação aos estudos de reparo de DNA em plantas, estes se concentraram

nas plantas superiores principalmente utilizando uma pequena dicotiledônea como

modelo: Arabidopsis thaliana (HAYS, 2002). O isolamento e a caracterização dos

primeiros genes de reparo do DNA nos vegetais estavam envolvidos no

fotorreativação, reparo por excisão, HR e NHEJ, todos esses foram inicialmente

baseados na informação da sequência homóloga disponível em outros organismos

(BATSCHAUER, 1993; BRITT et al., 1996; SANTERRE & BRITT, 1994; AHMAD et

al., 1997; JIANG et al., 1997; DOUTRIAUX et al., 1998; GARCIA et al., 2000;

HARTUNG et al., 2000; LIU et al., 2000; OSAKABE et al., 2002; TAMURA et al.,

2002; WEST et al., 2002.).

Além do modelo genético vegetal de Arabidopsis, outro modelo utilizado é o

arroz (Oryza sativa L.), estas duas espécies têm sido bem estudas, no caso das

plantas, para os mecanismos de reparo e sua relação com a influência de vários

fatores ambientais e de desenvolvimento vegetal, bem como sobre a identificação e

regulação dos genes envolvidos no reparo do DNA e nos diferentes mecanismos de

proteção (UEDA & NAKAMURA, 2011). A pesquisa intensiva realizada em

Arabidopsis e em arroz aumentaram enormemente os conhecimentos atuais sobre

os mecanismos de reparo de DNA nas plantas (HAYS, 2002; KIMURA et al., 2004).

Durante a última década também foram feitos progressos significativos na

caracterização molecular das vias de reparo e genes que medeiam esses processos

em importantes plantas de cultivo, como arroz, espinafre (Spinacia oleracea), pepino

(Cucumis sativus), tomate (Solanum lycopersicum), trigo (Triticum spp.), cevada

(Hordeum vulgare) e outras (MANOVA & GRUSZKA, 2015). O avanço da tecnologia

molecular tem expandido o número de genomas de culturas sequenciados e, assim,

contribuiu para os avanços realizados no campo de reparo do DNA nos vegetais

(SINGH et al., 2010; BALESTRAZZI et al., 2013). No entanto, esses estudos ainda

são poucos e devem ser expandidos para incluir um maior número de espécies se

quisermos ter uma imagem mais clara da capacidade dos genomas de plantas para

superar os impactos biológicos de diferentes agentes genotóxicos e para se adaptar

às mudanças nas diferentes condições de estresse ambiental. Além disso, ainda

30

existe a necessidade de aprofundar ainda mais nesse campo de pesquisa para

plantas poliploides de importância comercial tais como batata (Solanum tuberosum),

algodão (Gossypium L.) e cana-de-açúcar, cuja complexidade do genoma se torna

um obstáculo para um melhor entendimento desses mecanismos.

1.2.2.1. Pesquisas relevantes em cana-de-açúcar no reparo do DNA.

Desde o início dos anos 2000, pesquisadores da UNICAMP (Universidade

Estadual de Campinas, Brasil), ESALQ-USP (Instituto de Agricultura Luiz de Queiroz,

Piracicaba / SP), IAC (Instituto Agronômico de Campinas, Campinas / SP), e a

UFSCar (Universidade Federal de São Carlos, Araras / SP) se concentraram

amplamente em várias áreas relacionadas para assim promover o conhecimento da

estrutura genética e genômica da cana-de-açúcar. A pesquisa desses grupos é

principalmente dedicada a microsatélites ou SSR (Simple Sequence Repeats -

sequências simples repetidas, TAUTZ, 1989) e SNPs (Single-Nucleotide

Polymorphisms - polimorfismo de nucleotídeo único), mapas de ligação e

mapeamento de loci de caracteres quantitativos (QTL), construção e avaliação de

cromossomo artificial bacteriano (BAC) e as análises do transcriptoma de vários

tecidos (DE SETTA et al., 2016).

As primeiras pesquisas públicas consistiam na construção do banco de dados

ESTs (expressed sequence tag -marcador de sequência genética) de cana-de-

açúcar (SUCEST) e posterior análise e anotação funcional dessas sequências

(VETTORE et al., 2001), além da identificação de genes relacionados ao reparo de

DNA por meio de sequências ESTs de cana-de-açúcar (COSTA et al., 2001),

também foi especificada a detecção de genes referentes a via BER (via de Reparo

por Excisão de Bases) (AGNEZ-LIMA et al., 2001). Essas pesquisas levaram em

consideração a utilização de ferramentas de bioinformática para permitir a

identificação de grupos de genes que participam de diferentes vias do reparo do DNA

em homologia com os genes de Arabidopsis, como discutido no tópico anterior.

Contudo, a procura de homólogos envolvidos na replicação e reparo do DNA é

particularmente difícil nas espécies cujas sequências genômicas completas não

estão disponíveis, como é o caso da cana-de-açúcar. Uma das soluções é o uso de

ESTs como base para a identificação de genes. Os ESTs são definidos como os

31

fragmentos de sequências de RNAm obtidas através de reações de sequenciamento

que são realizadas em clones selecionados aleatoriamente de bibliotecas de cDNA.

Os projetos de EST são usados principalmente para complementar os projetos de

genoma existentes ou para servir como alternativas para fins de descoberta de genes

(PARKINSON & BLAXTER, 2009). A tecnologia da sequência de EST oferece uma

alternativa relativamente barata ao sequenciamento do genoma integral e tornou-se

um recurso valioso para a identificação de genes (LINDLÖF, 2003). Logo, dispondo

do banco ESTs (SUCEST-FUN) foi determinado homólogos presumíveis de cana-

de-açúcar dos genes de Arabidopsis que se sabe que estão envolvidos no reparo do

DNA (LIMA et al., 2001; COSTA et al., 2001). Dispondo desses homólogos, trabalhos

complementares envolvendo caracterização de genes específicos da via BER foram

feitos, permitindo uma melhor compressão dessa via de reparo em um organismo

complexo como a cana-de-açúcar (MAIRA et al., 2014; SCORTECCI et al., 2007)

1.3. Via de Excisão de Bases (BER)

1.3.1. Descrição da via e sua relevância para as plantas.

Dentre os mecanismos de reparo, a via de reparo por excisão de base (BER)

seria aquela via responsável por conferir proteção a molécula de DNA contra as

formas mais comuns de danos "non-bulky" nas bases (ou seja, que não causam

alterações na estrutura espacial do DNA de modo que poderiam ser identificados e

corrigidos por outras vias de reparo). Esses danos em geral são causados por

aquilações, oxidações, deaminações e erros que podem ocorrer durante o processo

de replicação (BARNES & LINDAHL, 2004; FORTINI & DOGLIOTTI, 2007;

ZHARKOV, 2008). Grande parte do dano é o resultado de lesões espontâneas que

ocorrem naturalmente a molécula de DNA (LINDAHL, 1993), embora, outros danos

também possam ser causados por produtos químicos advindo do ambiente,

radiações ou tratamentos com drogas citostáticas (substâncias citotóxicas

destinadas a causar disfunção celular).

As etapas da via BER, como apresentada na figura 2, já foram bastante

estudados e se desenvolvem a partir de uma DNA glicosilase que identifica e retira

a base inapropriada. Esta base pode apresentar uma alteração química em sua

estrutura que pode vir a gerar consequências mutagênicas. Estas DNA glicosilases

32

clivam a ligação C1´-N-glicosídica e geram assim um sitio abásico

(apurínico/apirimídico – ou sítio AP) (STIVERS & JIANG, 2003; ZHARKOV &

GROLLMAN, 2005). O passo seguinte desta via de reparo corresponde ao

processamento deste sítio AP, já que este é considerado genotóxico. Não obstante,

deve-se enfatizar que nem todos os sítios AP são oriundos de ações das enzimas

DNA glicosilase, os sítios AP também podem ser resultantes da perda espontânea

de bases nitrogenadas que pode ocorrer naturalmente na molécula de DNA

(LINDAHL, 1993). As enzimas AP endonuclease ou as enzimas AP liases (também

denominadas de DNA glicosilase bifuncional) serão as responsáveis por processar

o sítio AP que, ao final, produzem extremidades 5´- e 3´- bloqueadas (5'dRP - 5'

desoxirribose fosfato, 3´PUA - aldeído β,α-insaturado). A ação de enzimas adicionais

da via atuam sobre essas extremidades não-convencionais, que impediriam

posterior ação das enzimas de reparo, e geram as extremidades corretas: 5´-P e 3´-

OH, respectivamente, pela ação de polimerase com a atividade dRPase, atuando

sob o 5'dRP, ou AP endonuclease com atividade 3´-fosfodiesterase, agindo sobre

3´-PUA (Figura 2) (LEVIN & DEMPLE, 1990; WIEDERHOLD et al., 2004). O

resultado é um gap (lacuna) na fita simples do DNA onde estava localizado o dano

original na base nitrogenada. Este gap vai ser então preenchido ou por um único

nucleotídeo, direcionando para uma sub-via de BER chamada de via curta (SN-BER

- Single Nucleotide Base Excision Repair), ou será preenchido por vários

nucleotídeos, direcionando para outra sub-via de BER, a via longa (LP-BER - Long

Patch Base excision repair) (figura 2) (FORTINI & DOGLIOTTI, 2007).

33

Figura 2 – Representação esquemática da via de excisão de bases (BER). O início da via se dá com o reconhecimento e remoção da base danificada (representado por uma estrela) por uma DNA glicosilase, essa enzima pode ser monofuncional, tendo apenas a capacidade clivar a ligação N-glicosídica, gerando um sítio abásico, ou pode ser bifuncional tendo também de clivar o esqueleto fosfodiestere do DNA (atividade liase), sendo que este último gera extremidades 5´fosfatase e 3 aldeído β,α-insaturado (PUA). A enzima Ap endonuclease identifica o sítio abásico, clivando o esqueleto fosfodiestere gerando extremidades 3´hidroxila e 5' desoxiribose fosfato (dRP). As extremidades PUA e dRP são extremidades não convencionais e necessitam ser processadas para se converterem em 3´hidroxila e 5´fosfato, respectivamente. Existem duas sub-vias de BER, via longa e curta, cuja diferença está na quantidade de nucleotídeos a serem adicionados na lacuna e nas proteínas que compõem tais vias. Proteínas que dão suporte a via BER estão indicando em cinza. Em verde está representado as enzimas que foram propostas atuarem na via BER dos organismos vegetais, contrastando com o que é apresentado em negrito referente as proteínas que atuam na via BER em mamíferos (Adaptado a partir de BAUTE & DEPICKER, 2008).

Até o momento, várias DNA glicosilases específicas para determinadas lesões

foram identificadas em plantas. Em Arabidopsis, 3-metiladenina-DNA glicosilase foi

o primeiro gene de reparo do DNA de planta clonada e mostrou remover as lesões

de DNA alquiladas induzidas pelo tratamento com MMS (Metanossulfonato de

metila) (SANTERRE & BRITT, 1994). Também foi observado em experimentos

utilizando extratos celulares de Arabidopsis que, quando esses extratos foram

expostos a molécula de DNA contendo a base Uracil, esta base foi retirada por

enzimas que se enquadrariam na família das uracil-DNA glicosilases (CÓRDOBA-

CAÑERO et al., 2009).

34

Evidenciou-se que ambas as vias BER podem ocorrer após as etapas de

incisão inicial, apesar da falta de homólogo da DNA polimerase beta (pol β) e DNA

Ligase III em plantas (figura 2), e as reações de reparo são finalizadas pela atividade

da AtLIG1 (DNA ligase 1) (CÓRDOBA-CAÑERO et al., 2009; 2011). Ademais, a via

curta de BER foi considerada como uma via de reparo essencial do DNA nas

mitocôndrias das plantas, pelo menos para a remoção da base Uracil, pois a

atividade da uracil-DNA glicosilase foi encontrada associada, predominantemente, à

membrana da organela tanto na planta modelo como nas espécies de cultivo

analisadas (BOESCH et al., 2009).

Em A. thaliana, as enzimas AtFPG (DNA-Formamidopirimidina Glicosilase) e

AtOGG1 (8-oxoguanine DNA glicosilase 1) apresentam atividades de

glicosilase/liase para iniciar a reparação da lesão oxidativa 8-Oxoguanina (8-oxoG)

e dos sítios apurínico ou apirimidínico (AP) endógenos. Os intermediários gerados

tornaram-se subsequentemente substratos para a DNA-3-fosfatase, ZDP, e a

endonuclease ARP. Haja vista o engajamento dessas enzimas no reparo de bases

oxidadas, a inativação dos genes AtFPG e AtOGG1 provocou um aumentou no nível

de lesões oxidativas na molécula de DNA dos genomas nucleares e mitocondriais,

enquanto a inativação das funções AtARP e AtZDP acelerou o envelhecimento das

sementes (CÓRDOBA-CAÑERO et al., 2014).

A proteína putativa AtPol λ (DNA Polimerase lambda) foi implicada no passo

de síntese da via longa de BER em Arabidopsis, tendo como base a Pol λ

anteriormente identificada em arroz que pertence a família X das polimerases. A

polimerase β, a enzima que atuaria na via BER em mamíferos, também seria

membro desta família, contudo não foi excluído a contribuição de outra DNA

polimerases de plantas ainda não identificada que também agiria na via longa de

BER (CÓRDOBA-CAÑERO et al., 2009, UCHIYAMA et al., 2009). Em relação as

enzimas de DNA ligase, cuja ação se situa na última etapa da via BER, experimentos

tem mostrado que até agora a proteína LIG1 é a única DNA ligase que pode ser

associada tanto com a via curta quanto com a longa da via de BER em plantas

(CÓRDOBA-CAÑERO et al., 2011).

O reparo da excisão base também está implicado no controle epigenético

(modificações da cromatina que não envolvem mudanças nas sequências de bases

35

do DNA, sendo de caráter hereditário), pois está ativamente envolvido na remoção

de 5-mC (5-Metilcitosina) e na sua substituição por uma citosina não-metilada em

eucariontes, incluindo as plantas. A metilação da molécula de DNA é uma

modificação epigenética associada a um estado da cromatina compactada que limita

a acessibilidade dos fatores de transcrição ou da maquinaria de reparo ao DNA

(GRAFI & OHAD, 2013). Sabe-se que os mutantes de Arabidopsis que são de forma

direta ou indiretamente afetados pela metilação exibem um fenótipo sensível ao dano

na molécula de DNA (GONG et al., 2002; ELMAYAN et al., 2005; SHAKED et al.,

2006; YAO et al., 2012). O processo de desmetilação pode resultar em lesões no

DNA, uma vez que requer o reparo por excisão de base para restaurar a sequência

(LEE et al., 2014).

A metilação do DNA é o mecanismo epigenético que está envolvido na

regulação da expressão gênica e na resposta ao estresse em plantas. Essa

modificação epigenética é mantida por uma rede altamente complexa de

mecanismos moleculares que apresentam uma grande sensibilidade a diferentes

sinais ambientais e do desenvolvimento. A metilação da molécula de DNA pode guiar

a deposição de outros marcadores epigenéticos e direcionar a atividade dos

complexos de remodelação da cromatina (ZILBERMAN et al., 2007). Após a

exposição ao estresse, a indução transcricional de genes específicos do estresse

frequentemente correlaciona-se com uma diminuição da metilação do DNA em seus

loci, sugerindo assim que a indução de genes relacionados ao estresse sob

condições de estresse naturais pode exigir a desmetilação de sequências

especificas (BOYKO & KOVALCHUK 2008; 2011). Portanto, o funcionamento

impróprio da via BER pode prevenir a desmetilação da molécula de DNA, já que essa

via estaria envolvida, como apresentado no início do texto, na identificação e retirada

da base metilada 5-mC, deste modo, pode afetar a regulação de genes e a atividade

de outras vias de reparo, alterando a expressão de seus genes. Várias proteínas

foram reconhecidas como essenciais para diferentes estágios do processos de

desmetilação mediada por BER em plantas, tais como o DNA glicosilase/liase

bifuncional ROS1, que removeria a base metilada e cortaria a cadeia de DNA, a

proteína ZDP que estaria envolvida no processamento dos intermediários

resultantes, bem como o homólogo AtXRCC1 (X-RAY REPAIR CROSS

36

COMPLEMENTING 1) de Arabidopsis, que estimula etapas do processamento da

extremidade 3´ e a etapa final de ligação (MARTÍNEZ-MACÍAS et al., 2013).

Outros membros da via BER, como PCNA (Antígeno Nuclear da Proliferação

Celular), um homotrimero que circunda a molécula de DNA, servindo de base para

o recrutamento de proteínas envolvidas nos processos de replicação, reparo,

remodelamento da cromatina e epigenética, teve homólogos identificados em

Arabidopsis e em várias espécies de plantas de cultivo, e alguns deles possuíam

uma segunda cópia funcionalmente ativa do gene (AMOROSO et al., 2001;

ANDERSON et al., 2008). As proteínas PCNA de plantas apresentam muitas

semelhanças estruturais e funcionais com as de outros organismos o que suportam

seu envolvimento no reparo por excisão, bem como nas vias replicativas da síntese

do DNA nos vegetais (STRZALKA & ZIEMIENOWICZ, 2011). De fato, foi mostrado

que as atividades das proteínas OsFEN1 (FLAP ENDONUCLEASE 1) e OsPOLλ no

arroz foram melhoradas pela interação com OsPCNA, considerando que uma das

funções dessa proteína é potencializar a atividade de polimerases e Flap

endonuclease 1, além de outras proteínas que a ela (PCNA) se associam

(SCHRÖPFER et al., 2014). Estudos de expressão gênica envolvendo a atividade

BER em arroz abrangendo a proliferação celular, demostrou níveis elevados de

transcritos OsPCNA, OsFEN1-a e OsPOL λ. Estes foram detectados principalmente

nos tecidos de arroz em desenvolvimento, mas não nas folhas maduras,

especialmente após o tratamento que provocou danos ao DNA (KIMURA et al., 2004;

UCHIYAMA et al., 2004). Esses resultados são condizentes com papel de proteína

PCNA na via BER que é necessário para a ancoragem das DNA polimerases

replicativas sobre o DNA e em aumentar a atividade da DNA polimerase. Além disso,

PCNA pode aumentar a estabilidade de ligação da proteína FEN1 e modular a

atividade da endonuclease por interação proteína-proteína (SCHRÖPFER et al.,

2014).

Em luzerna-cortada (Medicago truncatula), a regulação positiva das DNA

glicosilases MtOGG1 e MtFPG foi encontrada durante a embebição da semente que

coincidiu com a entrada de água e a produção de EROs (espécies reativas de

oxigênio), haja vista, que essas duas DNA glicosilases estão associadas com os

danos oxidativos (MACOVEI et al., 2011).

37

Em relação as plantas, em contraste com o rápido progresso observado em

mamífero, fungos e células microbianas, estudos em BER são ainda poucos.

Pesquisa efetuada na plataforma PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)

resultou em 4.233 artigos referente ao assunto reparo de DNA em organismos

vegetais, sendo que quando focado em Arabidopsis, referente ao mesmo assunto, o

total de artigos foi de 986. Entretanto, quando se pesquisou artigos relacionados a

via BER, sem restrigir a um organismo vivo em especifico, foi contabilizado mais de

111 mil artigos (destes 19 mil seriam relacionados a bactéria, 9 mil a levedura e 64

mil ao humano, aproximadamente).

A discrepância de trabalhos científicos voltadas para organismos vegetais, a

qual existe uma relativa homogeneidade das publicações, concentradas em

determinadas espécies, seria a complexidade do genoma vegetal de algumas

cultivares que se torna um obstáculo no desenvolvimento da pesquisa. Muitos

ensaios e estudos, em plantas, focam em organismos diploides, como já bastante

evidenciado nos exemplos expostos acima, na qual grande maioria dos

experimentos estavam voltados para o organismo modelo A. thaliana, enquanto a

cana-de-açúcar (alvo de estudo deste trabalho), apresenta a genética conhecida

como uma das mais complexas que existem no reino vegetal. O genoma nuclear

poliploide complexo e grandes genomas organelares da cana-de-açúcar

representam desafios para o sequenciamento do seu material genético e contribuem

para o fato da genômica desse organismo vegetal ficar atrás, em comparação com

outras espécies de gramíneas, como arroz, milho e sorgo

(THIRUGNANASAMBANDAM et al., 2018). Devido a isso, estudo voltados para

reparo de DNA, bem como a via BER, na cana-de-açúcar são poucos, muitos dos

mesmos limitados devido a natureza complexa deste organismo já exposto

anteriormente. À vista disso, demonstra-se a necessidade de estudos voltados a

organismos de importância econômica, a exemplo da cana-de-açúcar, cujos

resultados porventura obtidos podem ter aplicações na agroindústria, como a

descobertas de ferramentas no ramo da genética para amplificar o manejo e a

produtividade.

38

1.3.2. Ap Endonuclease – Uma das enzimas chaves da via BER.

A apurínica/apimínica (AP) endonuclease 1 de mamíferos (APE1) é

necessária para a reparação de sítios abásicos e outras lesões de DNA e é uma

enzima essencial do reparo por excisão de bases (BER) e das vias de reparo de

quebra de fita simples do DNA (KANE & LINN, 1981; ROBSON & HICKSON, 1991;

DEMPLE et al., 1991). A APE1 também possui funções importantes na regulação

transcricional e às vezes é referido como Ref-1 (BHAKAT et al., 2009). O substrato

dessa enzima seriam os sítios abásicos que são lesões mutagênicas e citotóxicas

que surgem por ruptura espontânea da ligação N-glicosil ou pela a ação de DNA

glicolisilases, que promovem, por sua vez, a excisão das bases danificadas do DNA

(LOEB, 1985; LINDAHL, 1993).

A APE1 é essencial para o desenvolvimento embrionário e a viabilidade

celular (XANTHOUDAKIS et al., 1996; FUNG & DEMPLE, 2005; IZUMI et al., 2005).

Além de também mediar o reparo de rupturas de fita simples e fita dupla do DNA

pela remoção de grupos de 3´- blocking (- bloqueada), gerando novamente uma

extremidade 3´-OH permitindo a subsequente ação de outros membros da

maquinaria de reparo (IZUMI et al., 2000; PARSONS et al., 2004).

O genoma de A. thaliana, uma planta modelo amplamente utilizada do grupo

das dicotiledôneas, contém três genes que codificam os homólogos da

endonuclease 1 humana (APE1): AtARP, AtAPE1L e AtAPE2. Em outras pesquisas,

foi mostrado que a proteína AtARP é uma AP endonuclease de classe II hidrolítica

que cliva o DNA duplex na posição 5 ' em um sítio abásico e gera uma quebra de fita

simples flanqueada com um 3'-hidroxil (3'-OH) e um 5' desoxirribose fosfato (5'-dRp)

(BABIYCHUK et al., 1994; CÓRDOBA-CAÑERO et al., 2011). A AtARP também

contém uma função redox análoga à do APE1 humano, que pode estimular a ligação

ao DNA pelo fator de transcrição humano AP-1 (BABIYCHUK et al., 1994). Na

presença de Mg+2, AtARP exibe maior atividade de clivagem do sítio abásico em

extratos celulares de A. thaliana (CÓRDOBA-CAÑERO et al., 2011; CÓRDOBA-

CAÑERO et al., 2009). Curiosamente, os mutantes arp-/- crescem normalmente e

não exibem defeitos fenotípicos em condições laboratoriais, no entanto, são

hipersensíveis à presença de 5-Fluorouracil (5-fU) no meio de crescimento,

sugerindo que a AtARP é essencial quando um aumentado no número de sítios

39

abásicos é gerado pela ação da enzima monofuncional uracil-DNA glicosilase

(AtUNG) (CÓRDOBA-CAÑERO et al., 2011).

Um estudo genético mostrou que as plantas de A. thaliana que são deficientes

em AP endonuclease (individualmente, em relação a cada um dos três homólogos a

APE1 nesse organismo vegetal) não apresentam fenótipos evidentes que

diferenciem do fenótipo do tipo selvagem (MURPHY et al., 2009). Todavia, foi

observado que duplos mutantes nos genes AtAPE1L e AtAPE2 seriam letais,

resultando em um fenótipo de aborto de sementes, enquanto que a inativação de

AtARP em combinação com AtAPE1L ou AtAPE2 não é prejudicial (MURPHY et al.,

2009). Essas observações sugerem que AtAPE1L e AtAPE2 são necessários para

reparar o dano no DNA endógeno que ocorre durante o desenvolvimento da semente

e para o processamento da extremidade 3´ durante a desmetilação iniciada pela

5mC-DNA glicosilases (CÓRDOBA-CAÑERO et al., 2011).

Os dados do genoma da cana-de-açúcar mostraram a presença de duas

sequências homólogas ao AtARP: ScARP1 e ScARP3 (AGNEZ-LIMA et al., 2001).

A identidade de sequência entre ScARP1 e AtARP foi de 59% e entre ScARP3 e

AtARP foi de 72%. Além disso, a análise filogenética mostrou que essas duas

sequências foram colocadas em clados parafiléticos (MAIRA et al., 2014). Os

resultados obtidos permitem propor que a proteína ScARP3 poderia reter uma maior

semelhança para com a sequência dos clados das dicotiledôneas. Por outro lado, o

ScARP1 poderia ser resultado de um novo evento de duplicação de genes, devido a

sua proximidade ao clado das monocotiledôneas. Esta sequência (ScARP1) pode

ter sofrido modificações nas regiões codificantes e de regulação o que seria um

resultado evidente de um processo de sub-funcionalização (MAIRA et al., 2014). Os

dados de qPCR mostraram que ScARP1 e ScARP3 foram detectados em todos os

tecidos de cana-de-açúcar analisados (raízes, folhas, flores e meristema apical) e

apresentaram um padrão de expressão ligeiramente semelhante (MAIRA et al.,

2014). No entanto, o padrão de expressão sugere que a sequência ScARP1 pode

responder ao estresse oxidativo de forma diferente da ScARP3, esse resultado

reforça a hipótese de que ScARP1 pode ser um resultado de sub-funcionalização

(MAIRA et al., 2014). Com base nesses dados, no presente trabalho, fizemos análise

in silico da AP endonuclease em Arabidopsis e cana-de-açúcar, bem como a

caracterização bioquímica in vitro da proteína ScARP1, que devido as suas

40

características próprias (regulação, estrutura e filogenia) que diferem da ScARP3,

proporcionará um melhor entendimento bioquímico da caracterização enzimática de

uma AP endonuclease oriunda da cana-de-açúcar.

1.4. Importância da análise in silico.

1.4.1. Análise filogenética.

A filogenia é a história da descendência de um grupo de taxa, como espécies e

de seus antepassados comuns, incluindo a ordem de ramificação e às vezes os

tempos de divergência. O termo "filogenia" é derivado de uma combinação de

palavras gregas. “Phylon” é "tribo" ou "clã" ou "raça" e "genia" significa "origem" ou

"fonte". Sendo um método de reconstrução filogenética que pode também ser

utilizado para ampliar a compreensão das relações evolutivas entre genes derivados

de um ancestral comum (BOGUSZ & WHELAN, 2017).

Na filogenia molecular, as relações entre os organismos ou os genes são

estudados comparando homólogos de DNA ou sequências de proteínas.

Dissimilaridades entre as sequências indicam divergência genética como resultado

da evolução molecular ao longo do tempo (AMIT, 2014).

De forma geral, enquanto a abordagem filogenética clássica depende de

características morfológicas de um organismo, as abordagens moleculares

dependem de sequências de nucleotídeos de RNA e DNA e sequências de

aminoácidos de uma proteína que são determinadas usando técnicas modernas. Ao

comparar moléculas homólogas de diferentes organismos, é possível estabelecer

seu grau de parentesco estabelecendo ou revelando uma hierarquia de

relacionamento em uma árvore filogenética. Tanto os métodos baseados em

morfologia clássica como os métodos baseados em análises moleculares são

evidências relevantes, uma vez que a estrutura biomolecular básica de todos os

organismos é semelhante e a morfologia de um organismo é, na verdade, as

manifestações dos seus perfis de genoma, proteoma e transcriptoma (AMIT, 2014).

Uma combinação dos métodos baseados na morfologia e dos métodos baseados

em análise molecular fortalece assim o exercício da determinação das relações

filogenéticas dos organismos em grande medida.

41

Inferir árvores filogenéticas a partir de dados de sequência molecular é um

método fundamental usado em estudos evolutivos e sistemáticos. A árvore

resultante pode fornecer informações diretas sobre as relações evolutivas entre

espécies individuais ou pode refletir aspectos importantes da história das

sequências, como a duplicação de genes (BOWERS et al., 2003) e a classificação

da linhagem (MADDISON & KNOWLES 2006). A árvore também é um componente

crítico de outros estudos, e pode servir para a melhor compreensão da evolução

adaptativa (YANG, 2006), estudando a aquisição de novas funções (CONANT &

WOLFE 2008) e datando os eventos de especiação (DOS REIS et al., 2016). A

estimativa da filogenia é uma tarefa difícil, uma vez que exige distinguir entre muitas

histórias evolutivas potenciais usando apenas dados moleculares do número

relativamente pequeno de sequências existentes à nossa disposição (BOGUSZ &

WHELAN, 2017). Muitos métodos de inferência de árvores foram propostos e a

abordagem atual da técnica é realizar inferência através de um processo em duas

etapas de alinhamento de sequência múltipla (MAS - multiple sequence alignment)

seguido de inferência estatística da árvore (FELSENSTEIN, 1988).

Cada organismo, bem como as moléculas proteicas que o compõem,

possuem uma história evolutiva a ser desvendada para, assim, aprofundar o

conhecimento da evolução da vida como um todo, além de possibilitarem aplicações

biológicas desse conhecimento.

1.4.2. Modelagem

Com o sucesso de uma série de expansões de projetos de sequenciamento de

genomas, o número de sequências de proteínas conhecidas foi aumentado

exponencialmente. Diante desse cenário, muitos genomas foram depositados no

GenBank (http://www.ncbi.nlm.nihgov/genbank/). Os dados do GenBank para o mês

de maio de 2018 indicou que a plataforma possui armazenada cerca de 208 milhões

de sequências (estatísticas do site: https://www.ncbi.nlm.nihgov/genbank/statistics/)

já sequências advindas dos projetos de Whole Genome Shotgun (WGS), que se

tratam de genomas ou cromossomos incompletos de procariontes ou eucariontes

que geralmente estão sendo sequenciados por estratégia whole genoma shotgun,

se encontra em torno 621 milhões de sequências. No entanto, as sequências por

42

conta própria não podem dizer o que cada proteína faz na célula. Embora a

informação da estrutura proteica seja essencial para a compreensão da função, a

velocidade da determinação da estrutura proteica fica muito atrás do aumento das

sequências nucleotídicas descobertas, devido às dificuldades técnicas e à natureza

laboriosa das experiências da biologia estrutural. Até maio de 2018, cerca de 114

milhões de sequências de proteínas anotadas automaticamente e não revisadas e

557 mil sequências anotadas e revisadas foram depositadas no banco de dados

UniProtKB (BAIROCH et al., 2005) (http://www.uniprot.org/). Contudo, o número

correspondente de estruturas de proteínas em 3D no banco de dados da Protein

Data Bank (PDB) (BERMAN et al., 2000) (http://www.rcsb.org) é de apenas cerca de

140 mil.

O experimento para determinar estruturas proteicas por meio de difração de

raio-X se baseia na purificação e cristalização da proteína, no entanto, como já

mencionado anteriormente, essas técnicas requerem uma intensa mão de obra e

demora para se obter resultados. Alternativamente, a estrutura de uma proteína pode

ser determinada por meios não experimentais, como é o caso da modelagem

molecular. Assim, o desenvolvimento de algoritmos computacionais eficientes que

podem gerar previsões de estrutura 3D de alta resolução torna-se provavelmente o

único caminho para preencher as lacunas geradas pelo acumulo de dados advindo

dos projetos de sequenciamento.

Dependendo se as proteínas semelhantes foram resolvidas

experimentalmente, os métodos de predição da estrutura proteica podem ser

agrupados em duas categorias. Primeiro, se as proteínas a serem estudadas exibem

uma estrutura similar a outra proteína cuja estrutura tridimensional esteja disponível

dentro do banco de dados PDB, o modelo da sequência da proteína alvo pode ser

construído tendo como base a estrutura do template (cristal oriundo do PDB). O

procedimento é chamado de "modelagem baseada em um template" (SALI &

BLUNDELL,1993; KARPLUS et al., 1998; JONES 1999; SKOLNICK et al., 2004;

SODING 2005; WU & ZHANG 2008; YANG et al., 2011b). Se os modelos de proteína

não estiverem disponíveis, deve-se criar os modelos 3D a partir do zero. Este

procedimento recebeu nomes diferentes, modelagem ab initio (KLEPEIS et al. 2005;

LIWO et al., 2005; WU et al., 2007; TAYLOR et al., 2008; XU & ZHANG, 2012);

Modelagem de novo (BRADLEY et al., 2005a, b), modelagem baseada em física

43

(OLDZIEJ et al., 2005), ou modelagem livre (JAUCH et al., 2007, KINCH et al., 2016),

logo esse método se baseia na natureza físico-química dos resíduos, tentando

prever a disposição tridimensional dos mesmos e assim moldar a estrutura terciária

da proteína.

Com relação as plantas, efetuando uma busca dentro do banco de dados do

PDB pode-se observar que o mesmo possui 1.157 cristais pertencentes ao

organismo A. thaliana sendo que para humano existem 39.235 cristais disponíveis

para estudo (consulta efetuada em maio de 2018). Tendo em vista a necessidade de

aprofundar os estudos em organismos vegetais visando não só preencher lacunas

de conhecimento como também buscando aplicações das descobertas em

ferramentas biotecnológicas para melhoramento vegetal, previsões de estruturas

proteicas por meio de modelagem in silico se torna uma alternativa atraente para

suprir as necessidades da literatura e da agroindústria.

44

2. OBJETIVO GERAL.

Identificar e caracterizar (enzimaticamente e/ou in silico) genes de reparo associados

com a via de excisão de bases (BER) em cana-de-açúcar (Saccharum spp.).

2.1. Objetivos específicos.

• Buscar e avaliar as sequências de reparo da via BER em banco de dados de

ESTs (SUCEST) de cana-de-açúcar;

• Analisar filogeneticamente as sequências obtidas buscando verificar presença

de múltiplas cópias das referidas sequências nas famílias de organismos

vegetais;

• Analisar estruturalmente algumas das sequências de reparo por meio de

modelos tridimensionais;

• Clonar e purificar a presumível AP Endonuclease ScARP1 de cana-de-açúcar.

Além de verificar a presença de atividades enzimáticas (endonuclease,

fosfatase, exonuclease e 3´diesterase);

• Avaliar a capacidade de complementação de atividade enzimática de ScARP1

em extratos da planta mutante de A. thaliana;

45

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Identificação de componentes de BER em cana-de-açúcar.

3.1.1. Busca por sequências e avaliação.

A identificação das sequências em Saccharum spp. envolvidas na via de

Excisão de Bases (BER) se baseou no trabalho de Spampinato (2017) a qual se

tratou de uma revisão referente a via BER, fornecendo sequências de Arabidopsis

thaliana de cada um dos membros de BER. As referidas sequências foram

identificadas no servidor Uniprot (http://www.Uniprot.org). A partir destas sequências,

que foram as querys para efetuar a busca, foi então feito um BLAST (Basic Local

Alignment Search Tool), mais especificamente o Blastp (query é uma proteína em

busca de sequências proteicas), em relação ao próprio bancos de dados do servidor,

especificamente no grupo das plantas. Dos resultados obtidos, foram então

selecionadas as sequências pertencentes a família das Poaceae, a qual cana-de-

açúcar faz parte. Do grupo de sequências encontradas anteriormente, se escolheu

a sequência oriunda de Sorghum bicolor ou Setaria itálica para efetuar uma nova

etapa de busca via BLAST (Tblastn) agora no banco de dados de ESTs (expressed

sequence tag -marcador de sequência genética) de cana-de-açúcar: o SUCEST-

FUN (www.sucest-fun.org/), mais precisamente os bancos de dados Sugarcane

Transcripts Assembly - Trinity (All) e Sugarcane Transcripts Assembly - Trinity (only

Full-Length), desta forma buscando encontrar sequências homólogas em cana-de-

açúcar correspondente aos componentes de BER investigados. Tal metodologia de

identificação de sequências putativas para a cana-de-açúcar está apresentada na

figura abaixo.

46

Figura 3 - Metodologia de identificação de sequências putativas de componentes da via de

Excisão de bases (BER) em cana-de-açúcar. Sequência dos componentes da via de excisão de

bases (BER) segundo o artigo de Spampinato (2017) de Arabidopsis thaliana onde foram identificados

no banco de dados Uniprot e foram utilizadas como query para o Blast efetuado contra o mesmo

banco de dados, para assim identificar sequências pertencentes a família Poaceae, dessas

sequências foi selecionada aquelas oriundas do organismo Sorghum bicolor ou Setaria italica para se

tornarem querys de um novo Blast agora contra o banco de dados ESTs (SUCEST-FUN) e com isso

foi identificado sequências presumíveis de BER em cana-de-açúcar.

As sequências eventualmente encontradas foram avaliadas quanto a

possibilidade de serem empregados em estudos in silico posteriormente (figura 4),

logo foram analisadas quanto a presença domínios conservados se utilizando

primeiramente da ferramenta CD-search

(https://www.ncbi.nlm.nihgov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) do NCBI (National Center for

Biotechnology Information - https://www.ncbi.nlm.nihgov/) (MARCHLER-BAUER et

al., 2016; MARCHLER-BAUER et al., 2014; MARCHLER-BAUER et al., 2010;

MARCHLER-BAUER & BRYANT, 2004), depois a ferramenta ScanProsite

(http://prosite.expasy.org/scanprosite/) do Prosite

47

(http://prosite.expasy.org/prosite.html) (DE CASTRO et al., 2006), e também foi

considerado o tamanho de sequência tendo como base informações da literatura

científica e das anotações nos bancos de dados. Essas comparações foram feitas

por meio de alinhamentos múltiplos das sequências de referência extraídas do

servidor Uniprot (Arabidopsis thaliana, Setaria itálica, Sorghum bicolor, Oryza sativa

subsp. Japonica, Zea mays, Brachypodium distachyon) se utilizando do programa

Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Caso a sequência não se

enquadre nos parâmetros de tamanho e presença de domínios conservados esta

seria descartada. Por outro lado, as sequências que compartilham características

semelhantes com as outras sequências do banco de dados/literatura, contudo não

apresentam tamanho adequado para análises in silico posteriores, foram apenas

computadas como resultados positivos, sendo um indicativo do pressuposto da

existência daquele determinado componente de BER em cana-de-açúcar.

Figura 4 - Análise e avaliação das sequências BER presumíveis de cana-de-açúcar. As sequências presumíveis identificadas em cana-de-açúcar foram alinhadas via Clustal Omega com sequências de referência de plantas. A partir desse alinhamento foi observado correspondência quanto ao tamanho, presença de domínios conservados (CD-search e ScanProsite Tool) e anotações advindo das servidors Uniprot e NCBI, além de informações advindo de artigos científicos. Com essas análises e avaliações foi possível verificar e selecionar as sequências de cana-de-açúcar que de fato seriam pertencentes a via de excisão de bases (BER).

48

3.1.2. Árvores filogenéticas geradas via TaxOnTree.

As árvores filogenéticas foram geradas via a servidor TaxOnTree

(http://bioinfo.icb.ufmg.br/taxontree/) (SAKAMOTO & ORTEGA, 2016), tais árvores

são necessárias para presumir as relações evolutivas entre as sequências aqui

analisadas e a verificação de presença de múltiplas cópias das mesmas. Os dados

de entrada foram a sequência de proteína em formato FASTA para o caso das

sequências de cana-de-açúcar previstas para serem as proteínas da via BER. Além

disso, também foram utilizados identificadores de proteína, no caso do Uniprot

(UniprotKB), para as sequências oriundas de Arabidopsis thaliana e Zea mays. Após

efetuar esse passo inicial, a servidor executa uma busca via BLAST nos bancos de

dados disponíveis (RefSeq, RefSeq without fragmented proteins e Uniprot Reference

Proteome) esse resultado é então filtrado tendo em vista os seguintes parâmetros: o

E-value (1e-10), o limite de identidade (50%), excluindo as isoformas possíveis e

limitando a análise de sequência por analise (200 hits). Obtendo a lista de proteínas

selecionadas, essas foram alinhadas via MUSCLE (EDGAR, 2004) e depois aparada

(trimming), a partir desse resultado é gerado a árvore filogenética. A referida árvore

é produzida utilizando o método FastTree que é baseado no princípio de “evolução

mínima” (minimum-evolution) - tentando encontrar uma topologia que minimize a

quantidade de evolução ou a soma dos comprimentos das ramificações. O FastTree

utiliza uma variante heurística de neighbor joining (SAITOU & NEI, 1987; STUDIER

& KEPPLER, 1988) para encontrar rapidamente uma árvore inicial e usa os

intercâmbios de vizinhos mais próximos (nearest-neighbor interchanges - NNIs) para

refinar a topologia. Ademais, com esse servidor também é obtido o atributo

taxonômico. As árvores foram visualizadas e editadas via o programa FigTree v1.4.3.

3.1.3. Inferência Bayesiana.

Corroborando com as árvores resultantes da análise filogenética, foi, então,

gerado árvores oriundas de inferências bayesianas. Para isso, o alinhamento das

sequências dos componentes da via BER, mais precisamente o alinhamento o qual

não está incluída a sequência de cana-de-açúcar, dos organismos vivos, resultante

do TaxOnTree, foi utilizado para efetuar uma inferência bayesiana. Primeiramente

49

foi analisado o modelo de substituição adequado a ser aplicado a cada alinhamento,

isso foi executado com o programa ProtTest v3.4.2. (DARRIBA et al., 2011).

Dispondo dessa informação, através do programa BEAUti 2, foi possível criar o

arquivo com a extensão .XML com as instruções necessárias para dar início à

inferência e a criação das árvores que se efetuou no programa BEAST v2.4.8

(BOUCKAERT et al., 2014). Apesar das diferenças quanto o modelo de substituição

utilizado bem como proporção invariante, existe uma constante em todas as análises

feitas: o prior utilizado foi "coalescent constant population" e o comprimento da

corrente (chain length) foi de 1000000 (1 milhão). As árvores foram visualizadas pelo

programa DensiTtree - Tree Set Visualizer v2.2.6. Foi utilizado o TreeAnnotator

v2.4.8 para eliminar as árvores iniciais, no caso, na porcentagem de 15%, sendo que

o objetivo é excluir árvores que podem prejudicar a análise final dos dados, sendo

que estas árvores constituem parte inicial da cadeia do MCMC (Markov chain Monte

Carlos - cadeia de Markov de Monte Carlo), onde se aproxima da distribuição de

amostragem a partir do seu ponto de partida, sendo necessário serem descartada.

A árvore consenso final foi editada e visualizada via o programa FigTree v1.4.3.

3.2. Modelagem.

Analisando a conservação da sequência e estrutura terciária, e logo avaliando

a conservação funcional, de algumas das sequências presumíveis da via BER

identificadas em cana-de-açúcar foi construído modelos hipotéticos 3D.Os modelos

para as proteínas de cana-de-açúcar PCNA (Proliferating cell nuclear antigen -

Antígeno Nuclear da Proliferação Celular) e FEN1 (Flap endonuclease 1)

pertencentes a via BER foram preditos utilizando a servidor I-TASSER (Iterative

Threading ASSEmbly Refinement) (https://zhanglab.ccmb.med.umichedu/I-

TASSER/) (YANG & ZHANG, 2015) que se utiliza de uma abordagem hierárquica

para a estrutura da proteína e a predição da função (YANG et al., 2015). Primeiro,

ele identifica os modelos estruturais do PDB (Protein Data Bank - um arquivo que

contém informações sobre a estrutura de proteínas, ácidos nucleicos e montagens

complexas experimentalmente determinadas) por meio da abordagem de

encadeamento múltiplo LOMETS (Local Meta-Threading-Server- um serviço web

on-line para a predição da estrutura proteica) que gera modelos 3D utilizando-se de

50

9 programas de encadeamento instalados localmente (-FFAS-3D, HHsearch,

MUSTER, pGENTHREADER, PPAS, PRC, PROSPECT2, SP3 e SPARKS-X) com

os modelos atômicos completos construídos por simulações de montagem de

fragmento de modelo iterativo (ZHANG, 2008; ROY, et al., 2010;YANG, et al., 2015).

O programa I-TASSER além da predição do modelo tridimensional também faz

predições acerca da função da estrutura analisada e isso é feito através do

encadeamento dos modelos 3D por meio do banco de dados da função de proteína

BioLiP (É um banco de dados curado semi-manualmente para interações de alta

qualidade e biologicamente relevantes de ligantes-proteínas).

3.2.1. Refinamento e avaliação dos modelos.

Os modelos hipotéticos necessitam ter a estrutura otimizada para, desta

forma, gerar uma estrutura 3D mais próxima da suposta proteína nativa, para isso

os modelos devem ser refinados e avaliados estruturalmente. O refinamento dos

modelos foi feito por meio do servidor ModRefiner

(https://zhanglab.ccmb.med.umichedu/ModRefiner/) que se trata de um algoritmo de

refinamento de estrutura de proteína de nível atômico e de alta resolução (XU &

ZHANG 2011). Os átomos da cadeia lateral e do esqueleto são completamente

flexíveis durante as simulações de refinamento da estrutura, onde a análise

conformacional foi guiada pelo conhecimento físico estrutural. Um objetivo do

ModRefiner é desenhar os modelos de partida iniciais mais próximos do seu estado

nativo, em termos de ligações de hidrogênio, topologia do esqueleto e

posicionamento de cadeia lateral (XU & ZHANG, 2011).

A avaliação dos modelos gerados pelo I-TASSER e refinados via ModRefiner

se fez pelo servidor Molprobity (http://molprobity.biochem.duke.edu/) (CHEN et al.,

2010).

3.2.2. Análise dos modelos

Dispondo dos modelos 3D de cana-de-açúcar estes foram comparados com

cristais das referidas proteínas depositadas no banco de dados PDB.

51

(http://www.pdb.org/pdb/home/home.do). O cálculo do RMSD (Root Mean Square

deviation), sendo este uma medida frequentemente usada para indicar a diferenças

entre valores previstos por um modelo (cristal PDB) e os valores observados

(modelos 3D hipotéticos de cana-de-açúcar), foi efetuado pelo programa UCSF

Chimera (PETTERSEN et al., 2004). Tal programa também foi utilizado para

visualização tridimensional dos modelos. Os cristais utilizados estão expostos na

tabela abaixo:

Tabela 1 – Cristal de proteínas do banco de dados PDB (Protein Data Bank) utilizados para as análises.

PDB entry Macromoléculas Referência

6GIS PCNA de humano

associada a molécula de

DNA

DE MARCH et al., 2017

2ZVV PCNA1 de A. thalina

associada com o

peptídeo P21 humano.

STRZALKA et al., 2009

2ZVW PCNA2 de A. thalina

associada com o

peptídeo P21 humano.

STRZALKA et al., 2009

IUL1 Complexo constituído de

PCNA em associação

com FEN1, ambas

proteínas humanas.

SAKURAI et al., 2005

3.3. Análise in silico de AP endoncuclease de Arabidopsis thaliana,

Homo sapiens e de cana-de-açúcar.

3.3.1. Análise in silico de sequências de Arabidopsis thaliana.

A comparação entre as sequências de AP endonuclease de A. thalina, cana-

de-açúcar e humano seria necessária para verificar a preservação de sítios,

domínios conservados e perfis de expressão dessas proteínas. Para isso, as

sequências de AP endonuclease de plantas e de humano foram retiradas do servidor

Uniprot (http://www.Uniprot.org/) (UNIPROT CONSORTIUM, 2018): P45951

(ARP_ARATH), Q5XF07 (APE1L_ARATH), F4JNY0 (APE2_ARATH) e P27695

52

(APEX1_HUMAN), enquanto as sequências de cana-de-açúcar (ScARP1 e ScARP3)

foram oriundas de trabalho anterior do grupo de pesquisa (MAIRA et al., 2014).

Essas sequências foram alinhadas via Clustal Omega

(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) e deste alinhamento foi verificado a

correspondência de sítio ativos, resíduos de ligação a metais, entre outros sítios

importantes compartilhada entre as sequências analisadas. Ademais, com essas

sequências foi efetuado uma análise evolutiva utilizando o MEGA7 (KUMAR et al.,

2016). Foi utilizado o método de máxima verossimilhança no modelo de matriz de

Dayhoff (SCHWARZ & DAYHOFF, 1979). A árvore de consenso foi obtida a partir de

1000 réplicas de bootstrap (FELSENSTEIN, 1985). As árvores iniciais para a busca

heurística foram obtidas pela aplicação dos algoritmos Neighbor-Joining e BioNJ a

uma matriz de distâncias pairwise estimada usando um modelo JTT e, em seguida,

selecionando a topologia com uma maior probabilidade de log de valor. A topologia

da árvore foi observada no programa Figtree v 1.4.2.

Com as sequências de AP endonuclease de A. thalina foi possível efetuar

analises de perfil de expressão no servidor Bio-Analytici Resource for Planta Biology

- BAR) (WINTER et al., 2007) se utilizando das ferramentas Arabidopsis eFP Browser

(tendo como data source utilizados: Developmental Map, Abiotic stress AT-Tax,

Abiotic stress II) e Rice eFP Brower se utilizando do homólogos de arroz para as

sequências de Arabidopis citadas acima (tendo como data source utilizados: Rice

mas, Rice maize comparison, ricestress mas).

3.3.2. Modelos de AP endonuclases de A. thaliana.

Os modelos hipotéticos 3D de AP endonucleas de plantas (A. thalina e cana-

de-açúcar) foram alinhados para que assim fosse aferido a conservação estrutural e

funcional das proteínas analisadas. Para tanto, o modelo tridimensional de ScARP1

foi gerado a partir de um trabalho anterior publicado pelo grupo de pesquisa (MAIRA

et al., 2014). Já os modelos para as sequências de AP endonucleases oriundas de

Arabidopsis thaliana (AtARP, AtAPE1L e AtAPE2) foram gerados via I-TASSER

(https://zhanglab.ccmb.med.umichedu/I-TASSER/) (YANG & ZHANG, 2015).

Refinadas via servidor ModRefiner

53

(https://zhanglab.ccmb.med.umichedu/ModRefiner/) e avaliadas via Molprobity

(http://molprobity.biochem.duke.edu/) (CHEN et al., 2010).

3.4. Clonagem e purificação da AP endonucelase de cana-de-

açúcar: ScARP1.

O resumo da metodologia empregada para a obtenção da proteína purificada

da presumível AP endonuclease de cana-de-açúcar (ScARP1) está exposta na figura

5. A descrição das referidas metodologias está exposta nos tópicos abaixo.

Figura 5 - Esquema didático representando as etapas metodológicas para a purificação da proteína ScARP1. (1) Primeiramente, as culturas de bactérias contendo o plasmídeo pBC com o inserto de interesse (ScARP1) foi obtido por meio da MiniPrep (CTAB). (2) Com o plasmídeo, foi efetuado a reação em cadeia da polimerase (PCR) a qual foi amplificado a sequência de ScARP1. (3) Foi verificado o resultado da PCR em gel de agarose e dele foi efetuado a extração do DNA. (4) A sequência ScARP1 foi ligada ao vetor de expressão pMal-c5x. (5) Com este vetor foi efetuado transformação de células competentes da linhagem BL21+dcm-. (6) Dispondo das células transformadas foi feito o ensaio de expressão de proteínas. (7) Após o ensaio foi obtido a proteína ScARP1 purificada.

54

3.4.1. Miniprep (CTAB) e Reação em cadeia da polimerase (PCR).

A obtenção da sequência de AP endonuclease de cana-de-açúcar, ScARP1,

para ser utilizada em procedimentos posteriores, foi feita por meio de Miniprep e

amplificação via PCR. Desta forma, primeiramente as culturas bactérias contendo o

plasmídeo (pBC) a qual apresenta o inserto de interesse (ScARP1) clonado a ele,

foram crescidas em meio LB (Luria-Bertani) acrescido de antibiótico clorofenicol em

agitação a 37 °C por um dia. Após esse período, o meio (LB + bactérias) foi

transferido a um tubo cônico de 1,5 mL e centrifugado a 13.400 rpm (12.044,8 g) por

1 minuto (MiniSpin Tubo eppendorf), sendo essa velocidade empregada em todas

etapas de centrifugação desse procedimento. Em seguida, o precipitado contendo

as células bacterianas foi ressuspendido em solução STET (8% Sucrose, 5% Triton

X-100, 50 mM EDTA e 50 mM Tris pH 8,0), acrescido de lisozima (10 mg/mL) e

RNAse (10 mg/mL). Após essa adição e a ressuspenção, as amostras foram

submetidas a um choque térmico a 100 °C por um minuto. Em seguida, o tubo foi

centrifugado por 10 minutos e depois se descartou o precipitado. Foi adicionado

CTAB 5% a solução (8% Sucrose, 0,1% Triton X-100, 50 mM EDTA pH 8 e 50 mM

TrisCl pH 8) e foi deixado a temperatura ambiente por 10 minutos. Posteriormente,

este foi centrifugado por 10 minutos e se descartou o sobrenadante. O precipitado

existente foi ressuspendido em NaCl (1,2 M) e etanol 100% frio. Logo em seguida a

solução foi misturada utilizando o vortex (ms2 minishaker IKA) por 10 minutos a

temperatura ambiente. Depois, foi feita uma centrifugação por 10 minutos e foi

descartado o sobrenadante. Nesse momento, ao tubo cônico de 1,5 mL contendo o

precipitado foi adicionado 200 µL etanol 70% e este foi centrifugando (13.400

rpm/12.044,8 g) por 5 minutos. O etanol foi descartado e a amostra foi secada em

speed vacum (Heraeus pico 17 speedvac concentrader – Thermo Scientific). Com o

fim de todo esse procedimento, o precipitado final foi ressuspendido em 20 µL de

água ultrapura. Com este DNA plasmidial contendo a sequência ScARP1 foi

realizada uma reação de PCR para amplificação desta sequência utilizando a

VELOCITY DNA polimerase (BIOLINE), a qual apresenta uma capacidade de

revisão rápida do DNA devido apresentar a atividade de proofreading. Os primers

utilizados foram ScARP1_F1 (foward): GAA TTC ATG AGC TCC ACG TCT TCT CA;

ScARP1_R1 (reverse): GTC GAC CTA CAG CTT CAG CAC AAG GC

55

3.4.2. Extração de DNA de gel de agarose.

O produto da PCR foi separado em gel de agarose 0,7%. Utilizando-se o

QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) foi possível extrair o DNA contido no gel de

agarose cujo procedimento será descrito a seguir. Após o corte, o fragmento do gel

de agarose contendo o DNA foi colocado em um tubo cônico de 1,5 mL e

posteriormente este tubo com gel foi pesado para determinar quanto de tampão seria

adicionado. Foi adicionado 3 volumes do Buffer QC do kit para cada volume do gel.

Em seguida, incubou-se este tubo com tampão a 50 °C por 10 minutos. Em seguida,

acrescentou 1 volume de isopropanol e misturou o conteúdo. Este conteúdo foi

transferido para uma coluna QI Aquick spin column num tubo cônico de 2 mL. Esta

foi centrifugado por 1 minuto a 13.000 rpm/ 11.336,5 g (máquina MiniSpin eppendorf),

ao fim, descartou-se o liquido do tubo. Em seguida foi acrescentado o Buffer QC na

coluna QI Aquick spin column e centrifugou novamente por 1 minuto nas mesmas

condições anteriores. Depois, foi adicionado o Buffer PE e do mesmo modo anterior

se centrifugou e se descartou o líquido. Por fim, centrifugou-se a coluna sem nenhum

líquido acrescentado, para que se retirasse qualquer álcool residual. Terminado esse

processo, a QI Aquick spin column foi transferida a outro tubo cônico de 1,5 mL e foi

acrescentando água quente (50 °C) a coluna e depois a mesma foi centrifugada, o

liquido foi coletado e foi medido a concentração de DNA via NanoDrop (Thermo

Fisher Scientific).

3.4.3. Ligação ao vetor de expressão pMAL-c5X.

O vetor pMAL-c5X permite gerar fusões da proteína de interesse com a

proteína de ligação a maltose (MBP - maltose-binding protein), pois o gene a ser

transcrito será inserido no sítio de restrição do vetor na mesma janela leitura

transducional que o gene malE (que codifica a MBP). Esse vetor foi previamente

digerido com as enzimas EcoRI e SalI. Este foi desfosforilado com a Rapid alkaline

fosfatase (1 U/μL- Sigma-Aldrich). Após a desfosforilação foi realizada a ligação do

inserto (resultante do processo de amplificação via PCR) com o vetor de expressão

pMAL-c5X (New England BioLabs – NEB) na proporção de 1:1, a temperatura a 4

°C por 12 horas.

56

3.4.4. Competência e Transformação rápida da linhagem BL21.

O vetor de expressão contendo o inserto de interesse deve ser transformado

em bactérias Escherichia coli de linhagem que detenha a capacidade de conferir

eficiência na expressão proteica. Para isso, foi cultivado em meio LB líquido (em tubo

cônico de 15 mL) adicionado o antibiótico clorofenicol (34 μg/mL) as bactérias da

estirpe BL21 + dcm -, por 3 a 4 horas. Após transcorrido esse tempo, foi centrifugado

a 13400 rpm/ 12.044,8 g (MiniSpin eppendorf) a qual se evidenciou o precipitado

sendo retirado o excesso do meio líquido. Em seguida, o precipitado foi

ressuspendido em 0,1 M de CaCl2. Após esse processo, os tubos foram deixados

por 5 minutos no gelo, depois, centrifugou-se a 13.400 rpm/12.044,8 g e descartou-

se o sobrenadante. Novamente, foi ressuspendido o precipitado resultante em 0,1 M

de CaCl2, logo depois, foi colocado por mais 5 minutos no gelo. Ao fim desse

procedimento, as bactérias já estavam competentes, dessa forma, o processo de

transformação por choque térmico ocorreu. Para a ocorrência da transformação as

bactérias competentes foram colocadas em contato com o material proveniente da

ligação do vetor de expressão pMAL-5cX contendo o inserto na proporção de 1 μL

do inserto para 10 μL de bactéria. Após a adição, o tubo cônico de 1,5 mL contendo

as células e os plasmídeos foi deixado por 30 minutos no gelo. Posteriormente, o

mesmo foi colocado a 42 °C por 2 minutos, ocasionando o choque térmico, o que

possibilitou a incorporação do vetor + inserto no interior da célula, ao fim deste

processo, o tubo cônico novamente foi colocado no gelo.

3.4.5. Ensaio de expressão de proteína.

A expressão da proteína de interesse seria necessária previamente para

posteriormente se efetuar purificação. Desta forma, para o ensaio de expressão, se

utilizou de um erlemmeyer de 1 L, a qual foi acrescentado 250 mL de meio LB com

a adição de glicose (2 g/L) e a essa solução foi adicionada cloranfenicol (34 μg/mL)

(BL21 apresenta resistência a esse antibiótico, como indicado no tópico 3.4.4.), além

disso foi acrescentada carbenicilina (50 μg/mL) (resistência do vetor pMAL-c5X).

Depois, foi adicionada a bactérias da estirpe BL21 contendo o plasmídeo com o

inserto de interesse no meio. Em seguida, o erlemmeyer foi colocado em um Shaker

57

(infors ht multitron standard) a 225 rpm com a temperatura de 37 °C. Depois de ter

passado uma hora e meia, foi medida a absorbância a 600 nm (SmartSpec Plus

Spectrophotometer – Bio-Rad). Quando for atingindo o valor desejado de 0,1 e 0,2

A, foi reduzido a temperatura do Shaker para 23 °C e o erlemmeyer foi mantido em

seu interior sob agitação por mais 1 hora e meia. Transcorrido o tempo, foi medida a

absorbância que deveria estar entre 0,5 a 0,7 A. Verificando que a taxa de

crescimento se encontrou na faixa requerida, foi acrescentado 1 mM IPTG (Isopropil

β-D-1-tiogalactopiranosídeo) para induzir a expressão proteica e assim, esperou-se

4 horas. Depois de transcorrido o tempo, o conteúdo do erlemmeyer foi transferido

para potes e tubos cônicos de 50 mL. Em seguida estes foram centrifugados a 1.000

rpm/ 153,166 g por 20 minutos (Beckman J2-Hs) e parte do sobrenadante foi

descartado. O precipitado foi ressuspendido com o resto do líquido, após esse

processo foi centrifugado por 15 minutos a 7.800 rpm / 6.500 g. O sobrenadante foi

retirado e o tubo contendo o precipitado foi guardado a -80 °C.

3.4.6. Purificação.

Dispondo do precipitado congelado a -80 °C do item anterior (tópico 3.4.5.), o

passo seguinte foi a obtenção da proteína de interesse da amostra. Para isso, o

referido precipitado foi descongelado e ressuspendido em tampão Cb (20 mM Tris

HCl pH 7,4, 200 mM NaCl, 10 mM BtMe, 1 mM EDTA e 50% glicerol) em gelo.

Depois, foi adicionado um inibidor de protease (1 μL/mL - Sigma-Aldrich) na

proporção 1:1. Em seguida, a amostra foi colocada para sonicar (Q55 Sonicator –

Qsonica) por 1 minuto, amplitude entre 50-60. Posteriormente, o tubo foi centrifugado

(centrifuge 5810r) por 40 minutos a 9.250 rpm/17.218,5 g a 10 °C. Após esse

procedimento, a amostra foi filtrada com acrodisc 25mm syringe filter 0,2 μm HT

Tuffryn® Membrane. As amostras resultantes foram colocadas na máquina AKta

prime, que se trata de um sistema de cromatografia líquida compacta e

automatizada, a qual a coluna de cromatografia fica conectada para assim permitir a

separação da proteína expressa (ScARP1) do montante celular. Tendo em vista que

o vetor pMAL-c5X, quando expresso, gerou a ScARP1 fundido ao MBP (maltose-

binding protein), foi possível que essa proteína fosse purificada por uma coluna

contendo resina a base de amilose. Para iniciar o processo de purificação, tal

58

máquina foi acoplada a um computador de modo que se verificou os picos no gráfico

projetado simultaneamente referentes a quantidade de amostra coletada nos tubos,

desta maneira, pode-se saber em quais tubos estariam a proteína de interesse. Foi

comprovado a eficiência da purificação e indução ao se colocar as amostras

(alíquotas) coletadas durante o ensaio de expressão (tópico 3.4.5.) em um gel de

SDS-page, a qual foi gerado um gráfico e o resultado da quantificação, tendo como

base a curva padrão BSA (bovine serum albumin ou albumina do soro bovino), foi

utilizado como base para o passo seguinte. Foi efetuado a dialise das amostras

segundo o gráfico, levando-se em consideração as amostras que apresentaram

maior eficiência na purificação e indução, como mencionando anteriormente,

utilizando dialysis tubing cellulose membrane (Sigma-ALDRICH), 25 mm. Esses

tubos contendo as amostras a serem dialisadas foram colocadas em um erlemmeyer

que continha tampão de diálise CB e foi deixado over-night (12 horas,

aproximadamente) com baixa agitação. Depois, o resultado da dialise foi distribuída

em tubos cônicos de 1,5 mL e armazenados em -80 °C.

3.4.7. Gel SDS-page.

Para a visualização de amostras dos ensaios de expressão e resultado da

purificação, tais amostras foram aplicadas em Gel de SDS-page, a qual o método de

preparo será descrito a seguir. Foi utilizado o sistema vertical da Bio-Rad. Primeiro

foi feito a solução low a 10% (LGB - Lower gel buffer - pH 8,8, Acrilamida 40% 19: 1,

TEMED e APS a 10%): Após feito a solução, essa foi colocada no espaço entre os

géis, esperou-se 15 minutos para que polimerizasse. Posteriormente, foi feito a

solução up (UGB - Up gel buffer - pH 6,81, Acrilamida 40% 19: 1, TEMED e APS a

10%). Logo, feito a solução, foi adicionado a mesma entre os vidros e colocado o

pente, a qual se moldou os poços onde foi aplicado as amostras, também foi

esperado polimerização (por volta de 15 minutos). Ao fim deste tempo, se retirou o

pente e se transferiu o gel para outro suporte aonde foi submetido a uma voltagem

e que, desta forma, as proteínas foram separadas por tamanho e peso. O suporte foi

preenchido com um tampão de proteína (250 mM Tris base, 1,92 M Glicina e 1%

SDS). Com o fim da preparação do gel, suporte e tampão, pode-se adicionar as

amostras nos poços e depois submeter o sistema a uma voltagem (80 V para

59

passagem no gel up e 100 a 150 V para passagem no gel low) por aproximadamente

3 horas, cada uma das amostras foram antes ressuspendidas em 30 μL da solução

loading buffer 1x (62,5 mM Tris HCl pH 6,8, 2,5% SDS, 0,002 % bromophenol blue,

0,7135 M (5%) β-mercaptoethanol e 10% glicerol).

3.5. Proteína ScARP1 – Avaliação da atividade e complementação

enzimática.

Dispondo da proteína purificada (ScARP1), foram efetuadas avaliações

quanto a determinação da atividade enzimática e os fatores que a influenciam,

ademais a complementação enzimática em extratos celulares de plantas mutantes

de Arabidopsis thaliana (figura 6). As metodologias para tais abordagens estão

descritas nos tópicos a seguir.

Figura 6 - Esquema representado as abordagens de avaliação e complementação enzimática empregadas na proteína ScARP1. Possuindo a proteína purificada de cana-de-açúcar, esta foi utilizada para efetuar a avaliação quanto a presença ou não de atividades enzimáticas, além de verificar as condições ótimas de atuação da presumível enzima de cana-de-açúcar, observando os fatores que influenciam a referida atividade. Além disso, a proteína ScARP1 foi utilizada na abordagem de complementação enzimática de extratos celulares de plantas mutantes de Arabidopsis thaliana.

60

3.5.1. Reação de ensaio enzimático.

As reações relacionadas aos vários ensaios enzimáticos deste estudo

seguiriam, basicamente, salvo algumas alterações especificais dependendo do

ensaio, os mesmos componentes dispostos a seguir:

• DNA (substrato);

• Tampão;

• Íon (cofator enzimático);

• Enzima;

• H2O (água Ultrapura)

Os tópicos posteriores serão centrados em cada um destes ensaios e os

substratos de DNA utilizados.

3.5.1.1. Substratos.

Cada ensaio enzimático para a caracterização bioquímica da proteína

ScARP1 apresentou seu substrato específico como indicado na figura 7. As

sequências, com a construção, estão apresentadas na tabela 2.

61

Figura 7 – Substratos utilizados paras as respectivas atividades enzimáticas a serem testas para ScARP1. O substrato utilizado nos ensaios de atividade endonuclease, trata-se de um DNA duplex (fita dupla de DNA) que apresenta tetrahydrofuran (THF) que simula um sítio abásico. No ensaio da atividade exonuclease foi utilizado um DNA duplex, contendo a extremidade hidroxila livre (-OH). Já no ensaio da atividade fosfatase foi utilizado DNA duplex e triplex que exibiam fosfatases livres. No ensaio de 3´-phosphodiesterase foi utilizado como substrato um DNA duplex com a extremidade PUA (Aldeído β,α-insaturado) livre.

62

Tabela 2 – Sequências utilizadas na confecção dos substratos a serem utilizados nos ensaios enzimáticos.

Nome Sequência de DNA* Fita Marcador**

Fl-UGF TCACGGGATCAATGTGTTCTTTCAGCTCUGGT

CACGCTGACCAGGAATACC Superior

Fl na

extremidade

5 ´

Fl-

APGF

TCACGGGATCAATGTGTTCTTTCAGCTCFGGTC

ACGCTGACCAGGAATACC Superior

Fl na

extremidade

5´

UGF TCACGGGATCAATGTGTTCTTTCAGCTCUGGTC

ACGCTGACCAGGAATACC Superior -

CGR AGTGCCCTAGTTACACAAGAAAGTCGAGGCCAG

TGCGACTGGTCCTTATGG Inferior -

Al-

CGR

AGTGCCCTAGTTACACAAGAAAGTCGAGGCCAG

TGCGACTGGTCCTTATGG Inferior

Al na

extremidade

5 ´

Al-28P TCACGGGATCAATGTGTTCTTTCAGCTC Superior

Al na

extremidade

5´

Al-

28OH TCACGGGATCAATGTGTTCTTTCAGCTC Superior

Al na

extremidade

5´

P30_51 GGTCACGCTGACCAGGAATACC Inferior -

*F = Análogo ao sítio AP (tetrahydrofuran).

**Fl = Fluoresceína; Al = Alexa fluor 647.

A preparação do substrato, como apresentado na tabela 2, se utilizou de

nucleotídeos sintetizados, alguns com fluoróforo (Fluoresceína e Alexa fluor 647)

para que possibilite a visualização quando exposto a um determinado tipo de

comprimento de onda. O cálculo básico para a construção do substrato para os

respectivos ensaios enzimáticos está exposto abaixo:

63

Tabela 3 – Formação do substrato em relação ao ensaio enzimático específico.

Identificação

do substrato /

Concentração

Ap

endonuclease

X1

Exonuclease

X1

Fosfatase

Duplex

X1

Fosfatase

Triplex

X1

Fl-APGF

(5 pmol/pL) 1 - - -

CGR

(10 pmol/pL) 1 1 1 1

Al 28-P

(5 pmol/pL) - - 1 1

Al 28-OH

(5 pmol/pL) - 1 - -

P30-51

(5 pmol/pL) - - - 1

TN 3 3 3 2

Volume final 5

Com relação ao substrato PUA (aldeído β,α-insaturado), o processo de

preparação se deu de forma diferente, pois consistiu em uma reação envolvendo

uma Uracil DNA glicosilase (UDG) e uma endonuclease III, desta forma gerando o

substrato adequado. A reação ocorreu por uma hora a 37 °C, depois disso, a solução

sofreu um processo de precipitação do DNA eliminando o sobrenadante residual

(mais detalhes no tópico 3.5.1.2) e foi ressuspendendido o precipitado em água

ultrapura, logo estando pronto para ser utilizado em uma reação.

Os outros substratos também passaram por uma reação que consistiu,

unicamente, de expor a solução contendo as duas fitas de nucleotídeos, sendo uma

contendo o marcador fluorescente e o outro apenas uma fita simples (sem

marcador), acrescido da solução TN (10 mM Tris HCl pH 8 e 20 mM NaCl) a uma

temperatura de 95 °C por 5 minutos e posteriormente foi deixado esfriar (lentamente)

em água morna, sendo assim, permitindo que essas duas fitas se anelassem,

formando o substrato desejado para os ensaios subsequentes.

64

3.5.1.2. Protocolos de reação e precipitação.

As reações dos ensaios, após seu preparo, foram colocadas em temperaturas

fixas, na máquina Thermo Statplus, por um determinado tempo (dependendo do

ensaio) para que a reação enzimática possa ocorrer. Após o termino deste tempo foi

adicionado proteinase K (20 mg/mL - Sigma-Aldrich) para cada reação. Com a adição

da proteinase K, a reação foi mantida em 37 °C por 30 minutos, posteriormente

adicionou-se a solução TE (10 mM Tris HCl pH 8 e 1 mM EDTA pH 8), etanol 100%

gelado e glicogênio (2 mg/mL). Com o acrescimento dos componentes descritos

anteriormente, esperou-se 30 minutos a –20 °C. Em seguida, os tubos foram

centrifugados por 13.300 rpm/ 17.000 g (heraeus pico 17 centrifuga) por 15 minutos

a 4 °C, depois foi retirado o sobrenadante e adicionou-se etanol 80% gelado.

Novamente, este tubo foi centrifugado a 13.300 rpm/17.000 g na mesma temperatura

já citada, por 5 minutos. Logo depois, foi retirado o sobrenadante e secou-se o tubo

cônico de 1,5 mL em speed vacum (Heraeus pico 17 speedvac concentrader –

Thermo Scientific) por 15 minutos. Ao secar totalmente o etanol, o precipitado foi

ressuspendido em formamida a 90%, sendo este o preparo da solução a ser aplicada

nos géis de acrilamida (item 3.5.1.3.). Posteriormente, a solução foi ressuspendida

e mantida a temperatura de 95 °C por 5 minutos para depois ser aplicada no gel.

3.5.1.3. Gel de acrilamida para os ensaios enzimáticos.

Após os ensaios enzimáticos os produtos foram separados em gel de

acrilamida, para isto foi preparado um gel utilizando 7 M de Ureia, 40% acrilamida/Bis

19:1, TBE 10%, APS a 10 % e TEMED. Este gel foi polimerizado over-night. No

momento da separação dos produtos dos diferentes ensaios enzimáticos estes

foram separados a 400 V e por aproximadamente 1 hora. Depois este material foi

visualizado via FLA5100 Fluor Imager (Fuji film).

65

3.5.2. Reação de complementação enzimática.

3.5.2.1. Material vegetal utilizado.

As sementes de plantas selvagens de Arabidopsis (WT- Wild type) e das

plantas do mutante arp-/-, plantas essas da linhagem mutante de Arabidopsis

SALK_021478 (ALONSO et al., 2003) que apresenta uma inserção de T-DNA no

gene da ARP, foram obtidas do Arabidopsis Biological Resource Center

(http://www.arabidopsis.org). Essas sementes foram plantadas em vasos

previamente esterilizados, estes foram preenchidos por terra autoclavada na

proporção 2 (terra úmida que foi pressionada manualmente se tornando mais

compacta): 1 (terra não-compactada), além disso, a água utilizada apresentou a

proporção 1:1 de fungicida (Duaxo- fungincida polivalente concentrado). As

sementes foram colocadas sobre a superfície da terra e depois o vaso foi coberto

com papel filme. Os vasos foram mantidos por 2 dias a 4 °C. Terminado este período,

foram feitos furos diminutos no papel filme e foi transferido os vasos para a câmara

de germinação nas condições de dia longo (16 horas de luz e 8 horas de escuro) e

temperatura de 23 °C. Após transcorrido dois meses, com regas regulares efetuadas

durante esse período, as plantas resultantes foram coletadas, cortadas logo acima

da raiz, colocadas em um envelope de papel e deixado secar a temperatura

ambiente. Após a verificação do ressecamento das plantas, estas foram retiradas

dos envelopes e foram separadas as sementes dos outros componentes vegetais

(restos de folhas e caules) com auxílio de uma peneira. As sementes foram colhidas

em tubos cônicos de 1,5 mL precisamente rotulados e datados. As sementes, depois,

foram desinfestadas, com a adição de etanol 100% e misturadas manualmente, em

seguida retirou-se o sobrenadante. Posteriormente, foi acrescentado hipoclorito de

sódio a 50% ao tubo, colocado no vortex (ms2 minishaker IKA) e deixado agitando

por 10 minutos, primeiro 5 minutos em alta intensidade (1800) e depois diminuir para

a agitação mínima (200). Depois o material foi levado ao fluxo laminar – AV-100

burdinola – para a retirada do hipoclorito de sódio –e depois foi adicionado água

deionizada ao tubo cônico de 1,5 mL e foi deixado por dois dias a 4 °C, após esse

período as sementes já estavam aptas para serem utilizadas em outros

experimentos.

66

3.5.2.2. Plantio de sementes em placas.

As sementes desinfestadas foram semeadas em placas de petri contendo

meio MS a 1% (Murashige e Skoog) com 3% de sacarose. Depois de semeadas por

sobre o meio, as placas foram lacradas com papel parafilme e então colocadas na

câmara de germinação em condições de dia longo (16 horas de luz e 8 horas de

escuro), deixando-as ali por 15 dias.

3.5.2.3. Extração das proteínas de A. thaliana e dialise.

As plantas de A. thaliana crescidas in vitro descritas no item anterior (3.5.2.2.)

foram retiradas das placas com ajuda de pinças, essas plantas foram colocadas

sobre papel laminado, pesadas e depois envolvidas com o mesmo papel como um

pacote, em seguida, foram colocadas em nitrogênio líquido. Esses pacotes

congelados foram abertos, seu conteúdo foi despejado em almofariz para ser

macerado com auxílio de um pistilo junto com nitrogênio líquido até que as plantas

congeladas tivessem virado pó. O resultado foi transferido à um tubo cônico de 2 mL,

foi, então, adicionado o tampão de extração (25 mM HEPES-KOH pH7,8, 100 mM

KCl, 5 mM MgCl2, 250 mM Sacarose, 10% glicerol, 1 mM DTT e Inibidor de protease

1 μL/mL), sendo que a quantidade a ser adicionado, em μL, foi igual a massa oriunda

da pesagem mencionado no início deste protocolo. Também foi adicionado o inibidor

de protease (1 μL/mL - Sigma-Aldrich) na proporção V: m. Em seguida, o tubo foi

mantido 45 minutos em gelo. Após transcorrido o tempo, este foi centrifugado por 45

minutos a 13.300 rpm/17.000 g (heraeus pico 17 centrifuga) em 4 °C. Com cuidado,

foi transferido o sobrenadante para outro tubo cônico de 2 mL e foi filtrado o líquido

por meio de malhas de nylon (monodur®-nylon - Clear Edge), posteriormente foi

realizado a dialise do material

Para o procedimento de diálise foi utilizado a membrana de 10 mm dialysis

tubing cellulose membrane (Sigma-ALDRICH), na razão de cada 1 cm de

comprimento da membrana para a 0,3 mL do volume da amostra a ser dialisada. A

amostra foi colocada na membrana de dialise cujas extremidades foram vedadas

com pinças de diálise. Todo este processo ocorreu no gelo. Após a aplicação, as

membranas com a amostras foram colocadas no tampão de diálise (DB) (25 mM

67

HEPES-KOH pH 7,8, 100 mM KCl, 10% glicerol e 1 mM DTT) e foi deixado over-

night com baixa agitação a 4 °C. Depois, o material da diálise foi distribuído em tubos

cônicos de 1,5 mL e guardados em -80 °C.

3.5.2.4. Reação de complementação.

A reação utilizou do extrato enzimático proveniente da planta selvagem (WT)

e da mutante (arp -/-), sendo o controle positivo a reação a qual apresenta a enzima

ARP funcional (extrato da planta selvagem) e logo sendo capaz de processar o

substrato com sítio abásico artificial, com o extrato arp -/- foi feito o controle negativo.

A reação de complementação foi efetuada com o extrato enzimático da planta

mutante com a adição das concentrações de 2 µM e 4 µM da proteína ScARP1. Com

esse extrato também foi adicionado AP endonuclease 1 humana – hAPE1- em uma

diluição 1:100 (0,1 U/μL) como controle. As reações ocorreram por 3 horas a 37 °C,

utilizando o tampão DB (25 mM HEPES-KOH pH7,8, 100 mM KCl, 10% glicerol e 1

mM DTT). Ao termino das três horas, as amostras foram precipitadas (descrito no

item 3.11) e depois foram aplicados no gel de acrilamida para visualização do

resultado.

3.6. Revelação de imagens.

Os géis de acrilamida foram fotografados utilizando a máquina Fijifilm Fla-

5100, a qual foi possível revelar a imagem de acordo com o comprimento de onda

adequado aos marcadores florescentes utilizados, permitindo a visualização do

substrato. O resultado em imagem foi quantificado pelo programa Multi Gauge 3.0V,

pois por meio dele foi possível avaliar a intensidade das bandas e gerar um resultado

numérico.

68

4. RESULTADO

4.1. Via de excisão de bases em cana-de-açúcar: identificação e

caracterização de proteínas putativas.

A cana-de-açúcar, como outros organismos poliploides (que apresentam mais

de dois conjuntos de cromossomos homólogos), geralmente, não possuem o

genoma totalmente sequenciado. A dificuldade concernente ao tamanho do genoma

referente a poliploidia resulta, em relação ao sequenciamento, em um processo

muitas vezes complexo e laborioso. A maior parte das informações de cana-de-

açúcar, desta forma, se encontra em bancos de ESTs e alguns BACs. Assim, nesta

etapa deste trabalho foi realizado uma busca no banco de dados ESTs disponíveis

para cana-de-açúcar (SUCEST-FUN) por componentes da via BER com o propósito

de investigar a existência de duplicação desses mesmos membros, haja visto que o

homólogo de AtARP em cana-de-açúcar exibe uma duplicação: ScARP1 (alvo de

estudo desse trabalho) e ScARP3 (MAIRA et al., 2014).

Em relação aos bancos de dados ESTs de plantas é importante enfatizar que

muitos dessas sequências não estão depositadas no NCBI (National Center for

Biotechnology Information), além disso, tais bancos são resultados de grupos de

pesquisas distintos o que significa que alguns dos dados armazenados podem

diferenciar entre si. Para a pesquisa relacionadas com cana-de-açúcar foi utilizado o

banco de dados o SUCEST-FUN que reúne diferentes bancos de dados de cana-de-

açúcar: como: o Projeto genoma Sugarcane Expressed Sequence Tags (SUCEST)

(http://sucest.lad.ic.unicamp.br/en/) (VETTORE et al., 2003), a Sugarcane Gene

Index (SGI), os catálogos SUCAST e SUCAMET, que incluem dados de expressão

(http://sucest-fun.org), o banco de dados GRASSIUS (YILMAZ et al., 2009) e

registros das características agronômicas, fisiológicas e bioquímicas de cultivares de

cana-de-açúcar.

A escolha dos representantes da via de BER se baseou no trabalho de

Spampinato (2017) como já descrito na metodologia (item 3.1). Os componentes de

BER identificados em cana-de-açúcar nesse estudo estão resumidos na tabela 4. A

tabela sintetiza as informações das proteínas: seu nome, função, sua funcionalidade

69

em BER, código do locus AGI (Arabidopsis genome initiative) fornecidos pelo artigo

de Spampinato e sua correspondente código no banco de dados Uniprot.

Os tópicos a seguir serão voltados para a caracterização de cada uma dessas

proteínas, além de avaliar se as mesmas estão presentes ou não no genoma de

cana-de-açúcar com as informações existentes no banco de dados SUCEST-FUN.

70

Tabela 4 – Proteínas envolvidas na via de excisão de bases (BER) selecionadas para o estudo.

PROTEÍNA SIGLA FUNÇÃO EM BER Código do locus AGI/ UniprotKB

8-OXOGUANINA GLICOSILASE

OGG1 É a enzima primária responsável pela excisão da 8-oxoguanina (8-

oxoG), um subproduto da base mutagênica que ocorre como resultado da exposição a espécies reativas de oxigênio (EROs).

Envolvidos na etapa inicial de BER, reconhecendo a

base danificada.

At1g21710 Q9FNY7

ENDONUCLEASE III-LIKE PROTEIN 1 e 2

NTH1 e NTH2 Geralmente está envolvida na remoção de lesões de pirimidina oxidada

através de reparo de excisão base.

At2g31450 e At1g05900 Q9SIC4 e B9DFZ0

URACIL-DNA GLICOSILASE UNG ou UDG Preveni a mutagênese eliminando a base uracil da molécula de DNA

por clivagem da ligação N-glicosídica. At3g18630

Q9LIH6

REPRESSOR OF SILENCING 1 ROS1 Envolvido no processo epigenético, catalisa a liberação da 5-

metilcitosina (5-meC) do DNA através do mecanismo glicosilase/liase.

At2g36490 Q9SJQ6

ATIVADOR TRANSCRICIONAL DEMETER

DEM At5g04560

Q8LK56

DEMETER-LIKE PROTEIN 3 DML3 Potencial ativador transcricional que pode agir cortando o promotor

alvo. Catalisaria a liberação do 5-metilcitosina (5-Mec) do DNA por meio de um mecanismo glicosilase/liase.

At4g34060 O49498

METHYL-CpG-BINDING DOMAIN PROTEIN 4-LIKE

PROTEIN MBD4L

DNA Glicosilase monofuncional que tem como alvo o mal pareamento dos nucleotídeos U: G e T: G. Catalisa a excisão dos derivados da

uracila e exibe uma preferência por um contexto de sequência CpG, independentemente do estado de metilação da cadeia complementar.

Aciona a via de reparo de excisão bases (BER).

At3g07930 Q0IGK1

FLAP ENDONUCLEASE 1 FEN1 ou SAV6 Remove 5' 'flaps' no reparo de DNA e processa as extremidades 5' dos

fragmentos de Okazaki no processo de replicação de DNA. Envolvido com a via longa

de BER. At5g26680

O65251

DNA POLIMERASE LAMBDA Pol λ ou POLL

É um membro da família X da DNA polimerases. Estaria envolvido na adição de nucleotídeos no reparo de recombinação não-Homóloga

(NHEJ - non-homologous end joining ) e também na via de reparo de quebra de fita dupla do DNA (DSB- double-strand break).

Substitui a Polimerase beta (que não apresenta homólogos em plantas), atuando na via curta de

BER.

At1g10520 Q9FNY4

71

PROTEÍNA (continuação da tabela 7)

SIGLA FUNÇÃO EM BER Código do locus AGI/ UniprotKB

TYROSYL-DNA PHOSPHODIESTERASE 1

TDP1 Enzima de reparo do DNA que pode remover uma variedade de adutos covalentes do DNA através da hidrólise de uma ligação 3'-fosfodiéster,

gerando uma extremidade 3' com fosfato livre.

Processamento de produtos intermediários

de BER

At5g15170 Q8H1D9

DNA LIGASE I (1) LIG1 Responsável por catalisar o processo de ligar ou religar nucleotídeos ou

fragmentos de nucleotídeos ao esqueleto do DNA. Está envolvido em mecanismos de recombinação e reparo de DNA (Homóloga e não-

homóloga).

Envolvido na via longa e curta de BER.

At1g08130 e At1g49250 Q42572 e

F4I1P7

DNA LIGASE IV (4) LIG4 Proposto estar envolvido

na via curta de BER. At5g57160

Q9LL84

POLINUCLEOTIDEO 3'-FOSFATASE

ZDP Atuaria sobre os produtos gerados pela ação de OGG1 ou FPG Processamento de

produtos intermediários de BER

At3g14890 Q84JE8

ANTIGENO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR 1

PCNA1

PCNA é um homotrímero e atinge a sua processabilidade, circundando o DNA, onde atua como um suporte para recrutar as proteínas

envolvidas na replicação de DNA, reparação do DNA, a remodelação da cromatina e epigenética.

Envolvido na via longa de BER.

At1g07370 Q9M7Q7

ANTIGENO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR 2

PCNA2 Mesma descrição acima. Pode estar envolvido na resistência a radiação

ultravioleta. Envolvido na via longa de

BER. At2g29570 Q9ZW35

POLI [ADP-RIBOSE] POLIMERASE 1

PARP1 Catalisando a poli(ADP-ribosil)ação de um número limitado de proteínas aceptoras envolvidas na arquitetura da cromatina e no metabolismo do

DNA. Esta modificação seguida de danos ao DNA é um passo obrigatório em uma via de detecção/sinalização que leva à reparação

de quebras de cadeia de DNA

Protege o substrato de BER, presente na via

longa de BER.

At2g31320 Q9ZP54

POLI [ADP-RIBOSE] POLIMERASE 2

PARP2 Não é essencial para o reparo de DNA na via

BER

At4g02390 Q11207

X-RAY REPAIR CROSS-COMPLEMENTING PROTEIN 1

XRCC1 Está envolvido no reparo de quebra de fita simples do DNA, reparo de

excisão de base (BER) e reparo de excisão de nucleotídeos (NER). Envolvido na via curta de

BER. At1g80420

Q24JK4

WERNER SYNDROME ATP-DEPENDENT HELICASE

WRN Uma helicase envolvida na manutenção da integridade do genoma. Interage com diversas

proteínas de BER: FEN1, PolB e PARP1

At4g13870 Q84LH3

72

4.1.1. 8-OXOGUANINA GLICOSILASE – OGG1

A DNA glicosilase OGG1 foi identificada no grupo das gramíneas, mais

precisamente na espécie Setaria itálica (OGG1_SETIT - K3YSU8), Sorghum

bicolor (OGG1_SORBI - C5XU78), Oryza sativa subsp. Japonica

(OGG1_ORYSJ - Q6ZI28), Zea mays (OGG1_MAIZE - B4FY38), Brachypodium

distachyon (OGG1_BRADI - I1IAG9) e Saccharum spp (OGG1_CANA).

Observou-se que existe uma diferença no tamanho das sequências de

monocotiledônea (média de 399 a 419 aminoácidos) em comparação com a

sequência de eudicotiledônea, sendo a OGG1 de Arabidopsis thaliana a que tem

de menor tamanho (365 aminoácidos). Todas as sequências apresentaram o

domínio da superfamília OGG1 (8-oxoguanina DNA glicosilase) . Com exceção

da sequência pertencente a Brachypodium distachyon (OGG1_BRADI) que

exibe também o domínio pertencente à família AccB (Biotin Carboxy carrier

protein), sendo este um domínio caracterizado por estar envolvido no transporte

e metabolismo de coenzima e lipídios. Todas as proteínas, compartilham os

mesmos resíduos nos sítios de ligação ao DNA e substrato (8-oxoguanina). A

conservação desses resíduos indicaria uma provável preservação da função

dessa enzima entre as sequências analisadas, inclusive com a de cana-de-

açúcar. Deve-se enfatizar que as sequências de gramíneas advindas do banco

do Uniprot aqui utilizadas para análise não foram revisadas pela a plataforma e

a maioria delas não apresentam anotação que as identifiquem como 8-

oxoguanina DNA glicosilase, categorizadas como proteínas preditas.

4.1.1.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – OGG1.

A árvore filogenética gerada pelo servidor TaxOnTree para OGG1 foi

possível notar que dentro do grupo da Poaceae o organismo Triticum aestivum

(trigo) apresenta três proteínas, A0A1D5VTA8, A0A1D5VKE2 e A0A1D5WWG0,

que exibem o tamanho, em aminoácidos, de: 437, 402 e 424, respectivamente.

Essas proteínas são sequências não caracterizada cuja proteína foi somente

predita, além disso, a posição no genoma dessas sequências é desconhecida,

sendo que a identidade compartilhada entre eles é acima de 90% e isso também

73

vale para o resultado referente a cobertura das sequências (Query cover), o que

poderia indicar que essas sequências provavelmente são isoformas. A

metodologia da plataforma TaxOnTree não excluiu as sequências de trigo do

alinhamento múltiplo que gerou a árvore filogenética, por não ser capaz de

avaliar tais sequências devido à ausência de informações contidas na plataforma

Uniprot (como o locus e a indicação que tais sequências seriam isoformas uma

das outras). Ademais, essas sequências, muitas vezes, são oriundas de

anotações automáticas e por não terem passado ainda por um processo de

revisão, podem conter informações redundantes. Fora esse caso, não se

observa dentro do grupo das gramíneas nenhuma duplicação de sequências,

isso também se repete em relação a todos os organismos representados na

árvore.

A inferência bayesiana suporta essas observações onde se observou que

ocorreu uma preservação na topologia, dando suporte as descrições feitas em

relação a árvore filogenética.

4.1.2. ENDONUCLEASE III-LIKE PROTEIN 1 E 2

Em A. thalina existem duas proteínas NTH (homólogas a endonuclease

III), como assinalado pelo o artigo de Spampinato (2017), sendo denominados

de 1 e outra de 2 (NTH1 e NTH2). Ambas sequências são DNA N-glicosilases

bifuncionais que estariam envolvidos na identificação de danos oxidativos as

bases pirimidinas. Essas proteínas, conforme anotação fornecida pela

plataforma Uniprot, possuem como localização subcelular o cloroplasto, mais

precisamente o seu núcleo. As sequências NTH1 e NTH2 se encontram em locus

distintos e em cromossomos também diferentes, cromossomo 2 e 1

respectivamente. Entretanto, quando efetuada a busca por homólogos dessas

duas proteínas em gramíneas só foi encontrado o equivalente para a sequência

de NTH1.

As sequências, tanto pertencentes ao grupo das gramíneas –

NTH1_SETIT (K3ZJ06) de Setaria itálica, NTH1_SORBI (C5YRT7) de Sorghum

bicolor, NTH11_ORYSJ (Q2R7H4) de Oryza sativa subsp. Japonica,

74

NTH1_MAIZE (A0A1D6ITB2) de Zea mays, NTH1_BRADI (I1IM16) de

Brachypodium distachyon e NTH1_CANA de Saccharum spp – quanto a

sequência Arabidopsis, exibem, aproximadamente, o mesmo tamanho, na faixa

de 362 a 379 aminoácidos). Além disso, as sequências conservam os resíduos

importantes para a função de DNA glicosilase. Estas também apresentam o sítio

ativo e sítio de ligação a metais (especificando ao ferro e ao enxofre). Este último

seria composto por cisteínas. As sequências de NTH analisadas também

apresentaram o domínio da superfamília HHH cujo nome advém do motivo

Hélice-Grampo-Hélice (helix-hairpin-helix) observado nas proteínas que fazem

parte dessa superfamília, a qual estaria incluso a Endonuclease III (NTH), tendo

esse motivo a função de se ligar ao DNA.

4.1.2.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – NTH1 e NTH2.

A árvore filogenética para a proteína NTH apresentou duplicações dentro

da família Brassicaceae, mais precisamente nas espécies Arabidopsis thaliana,

Arabidopsis lyrata, Brassica napus, Brassica oleracea, Eutrema salsugineum e

Arabis alpina Percebe-se que tais duplicações se encontram em ramos

separados, ou seja, dentro do grupo da família Brassicaceae, existem dois

subgrupos, sendo um deles composto por sequências semelhantes a NTH1 de

Arabidopsis e outro subgrupo por sequências similares a NTH2. Duplicações

dessas sequências também foram encontradas em outras famílias pertencente

ao grupo das eudicotiledôneas, já a família Poaceae não foi exibiu evidências de

sequências em múltiplas cópias.

Comparando a árvore filogenética com a oriunda da inferência bayesiana

nota-se a perpetuação, de forma geral, na topologia gerada pela a árvore da

plataforma TaxOnTree, apesar de algumas diferenças no posicionamento de

alguns grupos. Entretanto, estes não prejudicaram a intepretação evolutiva que

foi semelhante a já mencionada com a árvore filogenética, logo, tal preservação

conferiu maior veracidade aos resultados aqui obtidos.

75

4.1.3. URACIL-DNA GLICOSILASE - UNG ou UDG.

A proteína Uracil DNA glicosilase (UDG) tem a função de identificar e

catalisar o processo de excisão do Uracila que porventura foi incorporada, de

forma errada, ao DNA por uma DNA polimerase ou mesmo sendo derivado da

deaminação de uma citosina. Comparando a UDG advindo de Arabidopis

percebe-se que as sequências de gramíneas (UDG_SETIT (K3Z887) de Setaria

itálica, UDG_SORBI (A0A1B6PP12) de Sorghum bicolor, UDG_ORYSJ

(Q7XQA5) de Oryza sativa subsp. Japonica, UDG_MAIZE (B4FW30) de Zea

mays, UDG_BRADI (I1J398) de Brachypodium distachyon e UDG_CANA de

Saccharum spp.) exibiram um tamanho menor, aproximadamente 30

nucleotídeos a menos. Porém todos apresentaram o domínio da superfamília

UDG (em cor verde). Existem pelo menos cinco famílias UDG que foram

caracterizadas até agora. Essas famílias compartilham estruturas secundárias

semelhantes, motivos comuns e sitio ativo. Eles demonstram diferentes

especificidades de substrato, mas muitas vezes a função de uma enzima pode

ser complementada pela outra. As proteínas UDGs aqui analisadas pertencem

a Família 1 das UDGs que tem como alvo a uracila tanto no DNAss (single strand

DNA - DNA fita simples) quanto no DNAds (double strand DNA - DNA fita dupla)

e reconhecem o referido nucleotídeo explicitamente em uma conformação extra-

helical por meio de uma combinação de interações proteicas e com a molécula

d´água. As enzimas da Família 1 estão presentes em Eubacteria, Eukarya e em

alguns vírus eucarióticos.

As UDG de plantas também apresentaram a conservação do resíduo do

sítio ativo, um aminoácido ácido aspártico, o que serviria de indicativo para a

provável funcionalidade enzimática dessas proteínas no grupo das Poaceae.

4.1.3.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – UNG.

As relações filogenéticas das sequências UNG estão expressas na árvore

gerada pelo servidor TaxOnTree. Nesta referida árvore, podemos observar a

ocorrência de algumas duplicações das UNG-DNA glicosilases nos organismos

76

estudados, na família que compõem a dicotiledôneas, mas não na família

Poaceae.

Ao se comparar com a árvore principal da inferência bayesiana, observa-

se algumas diferenças, como o fato do grupo das monocotiledôneas apresentar

como grupo-irmão um grupo constituído por organismos advindo da família

Solanaceae, Phrymaceae e Apiaceae. Existem, desta forma, diferenças quanto

a topologia, principalmente no grupo das dicotiledôneas, por outro lado, na

família da Poaceae as relações previstas se preservam.

4.1.4. ATIVADOR TRANSCRICIONAL DEMETER (DME),

REPRESSOR OF SILENCING 1 (ROS1) E DEMETER-LIKE

PROTEIN 3 (DML3).

As sequências de ROS1, DML3 e DME em A. thaliana correspondem a

proteínas diferentes que atuam no processo de desmetilação do DNA. Essas

sequências, em Arabidopsis, estão localizadas em locus e cromossomos

distintos, nos cromossomos 2, 4 e 5 respetivamente, como também exibirem

tamanhos diferentes (DME - 1987 aa; ROS1 – 1393 aa e DML3 – 1044 aa).

Apenas ROS1 e DME compartilham 65% de identidade em suas sequências,

sendo que essas duas em comparação com DML3 exibem identidades inferiores

a 50%. DME, além de ser a maior das três sequências de Arabidopsis, exibe

domínios de superfamílias, mesmo que truncados, que não estão presentes nas

outras: Glutanin_hmw e TonB_N. A subunidade de glutenina de alto peso

molecular (High molecular weight glutenin subunit - Glutanin_hmw) é o grupo

composto por proteínas do glúten que seriam em grande parte responsáveis

pelas propriedades elásticas do glúten e, portanto, das massas. TonB região N-

terminal (TonB N-terminal region - TonB_N) é um domínio pequeno encontrado

apenas a downstream (a jusante) na extremidade N-terminal das proteínas TonB

ancorada na membrana citoplasmática, a função exata desse domínio não é

conhecida.

Em relação as sequências encontradas nas gramíneas, apesar de se

utilizar como query para a busca as distintas proteínas mencionadas

anteriormente, os resultados se repetiram entre si, de modo que não foi possível

77

a distinção de uma sequência específica para DME, ROS1 ou DML3. A maioria

das sequências de Poaceae presentes no banco de dados do Uniprot ainda não

foram revisadas, sendo então classificadas como proteínas não-caracterizadas,

a exceção a essa observação foi a sequência de milho que apresentou a

anotação de ser homóloga a ROS1 de A. thaliana.

As sequências do grupo das gramíneas (SETIT (K3ZPW2) de Setaria

itálica, SORBI(A0A1Z5R5E2) de Sorghum bicolor, ORYSI(B8AAK8) de Oryza

sativa subsp. Indica, ROS1_MAIZE(K7U9K6) de Zea mays, BRADI(I1I9S5) de

Brachypodium distachyon) tais como ROS1 e DML3, exibiram os mesmos

domínios das superfamílias: HHH, Perm-CXXC, RRM_DME. Hélice-Grampo-

Hélice (helix-hairpin-helix -HHH), domínio esse também foi encontrado na

proteína NTH1 e NTH2 (tópico 4.5.2), e teria a função de se ligar ao DNA. Nas

proteínas aqui analisadas tal domínio se mostrou truncado. Unidade Permutada

única Zf-CXXC (Permuted single zf-CXXC unit - Perm-CXXX) é um domínio

detectado em proteínas semelhantes a DEMETER normalmente encontrado em

plantas terrestres. RRM em DEMETER (RRM in Demeter - RRM_DME) é um

domínio presente na porção C-terminal de proteínas semelhantes a DEMETER,

RRM é predito que facilitaria a interação do domínio catalítico com o DNA ou

RNA.

A sequência de cana-de-açúcar identificada, não apresentou nenhum

domínio como também não apresentou o sítio de ligação ao metal Ferro-enxofre

(4Fe-4S). Embora exiba essas ausências, a sequência oriunda de cana-de-

açúcar apresenta alta identidade com as sequências de milho e Sorghum, além

de exibir uma identidade acima de 50% com as sequências de Arabidopsis. Vale

salientar que o alinhamento da sequência de cana-de-açúcar com as sequências

citadas se deu na porção N-terminal, justamente na região que nessas

sequências não apresenta os domínios ou sítios a serem destacados. Devido ao

tamanho da sequência de cana-de-açúcar ser menor que das outras proteínas

estudadas, pode-se cogitar que a busca efetuada no banco ESTs do SUCEST-

FUN tenha fornecido apenas o fragmento de uma sequência maior que

constituiria em uma provável sequência DME, ROS1 ou DML3 de cana-de-

açúcar.

78

4.1.4.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – ROS1, DME e

DML3.

Como mencionado anteriormente, ROS1, DME e DML3, por serem

semelhantes em relação as suas sequências (compartilharem entre si

identidades superiores a 50%), acabaram por gerar um alinhamento englobando

sequências que fossem semelhantes a essas DNA glicosilases, de modo que o

servidor TaxOnTree gerou uma árvore com 553 sequências, sendo que todas

elas pertencem ao reino Viridiplantae.

A árvore filogenética ( exibe diversas duplicações e até mais do que isso,

pois, conforme assinalado no parágrafo anterior, por se tratar de uma árvore que

envolve mais de uma DNA glicosilase, significa que existirá sequências

diferentes de uma mesma espécie alusivos a cada uma dessas DNA glicosilases

indicadas. A inferência bayesiana, suporta as observações feitas anteriormente,

de modo que se pode notar que ocorreu uma preservação na topologia em

relação a árvore principal da inferência bayesiana e a filogenética.

4.1.5. METHYL-CpG-BINDING DOMAIN PROTEIN 4-LIKE PROTEIN -

MBD4L

A sequência MBD4L (Methyl-CpG-binding domain protein 4-like protein)

trata-se de uma DNA glicosilase monofuncional que tem como alvo para

correção do DNA o mal pareamento U:G e T:G (já mencionado na tabela 4). A

sequência de MBD4L advindo de Arabidopsis thaliana difere, principalmente em

relação ao domínio conservado, das sequências pertencentes ao grupo das

gramíneas (MBD4L_SETIT(K3Y6Z6) de Setaria itálica,

MBD4L_SORBI(A0A1Z5S7M7) de Sorghum bicolor, MBD4L_ORYSJ (B9G222)

de Oryza sativa subsp. japonica, MBD4L_MAIZE (A0A1D6LF32) de Zea mays,

MBD4L_BRADI(I1IVD5) de Brachypodium distachyon e MBD4L_CANA de

Saccharum spp.), já que MBD4L_ARATH exibi um domínio da superfamília HHH

(destacado em verde) – já descrito no tópico 4.1.2 – enquanto as outras

sequências, incluindo a de cana-de-açúcar, exibem o domínio Endo3c. A

superfamília da endonuclease III (Endo3c) é formada pela a própria

79

endonuclease III, Alquilabase DNA glicosilases (família Alka) e outras DNA

glicosilases. Entretanto, dentre as sequências de Poaceae, verificou-se que a

sequência de Brachypodium distachyon exibe, além do domínio Endo3c, o

domínio truncado da superfamília EBV-NA3 (Epstein-Barr virus nuclear antigen

3 - Antigénio 3 nuclear do vírus Epstein-Barr - EBV-NA3), essa família inclui

proteínas nucleares importantes para a infecção do vírus Epstein-Barr.

A diferença de tamanho das proteínas é bastante evidente nas

sequências de gramíneas, compreendendo a faixa de 479 até 858 aminoácidos.

Deve-se enfatizar, todavia, que tais sequências, em sua maioria, não foram

anotadas e nem revisadas pela plataforma Uniprot, logo podendo ter sido

inferidas a partir do transcrito primário do RNA mensageiro que ainda não sofreu

edição.

O sítio ativo das sequências e os resíduos que contribuiriam pela

especificidade de enzima para com a guanina, apesar das diferenças

enfatizadas anteriormente, se preservam entre as sequências de

monocotiledônea e a de eudicotiledônea. A sequência de cana-de-açúcar,

entretanto, exibiu um tamanho diminuto em comparação a sequências aqui

analisadas, mas por preservar o domínio conservado Endo3c e o sítio ativo,

haveria possibilidade de ser um fragmento derivado de uma provável proteína

funcional.

4.1.5.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – MBD4L.

A sequência MBD4L gerou duas árvores filogenéticas pelo servidor

TaxOnTree, pois seguindo a sua metodologia, só seriam incluídos no

alinhamento as sequências que tivessem identidade de 50% ou acima. De modo

que as sequências do grupo das gramíneas não foram abrangidas dentro das

sequências que envolvia as dicotiledôneas, e o mesmo ocorreu de modo inverso,

gerando assim duas árvores exclusivas, sendo uma específica para mono e a

outra para dicotiledôneas. Ambas árvores apresentaram múltiplas cópias de

sequência, que devido a alta identidade compartilhada entre elas, cogitasse a

possibilidade de se tratar de isoformas.

80

As duas árvores principais oriundas da inferência bayesiana da proteína

MBD4L, tendo em vista as árvores filogenéticas já discorridas anteriormente,

demonstrou uma preservação na topologia, conferindo veracidade nas

descrições e resultados aqui analisados.

4.1.6. FLAP ENDONUCLEASE 1 - FEN1 ou SAV6.

Flap endonuclease 1 é uma enzima essencial para a replicação e reparo

do DNA. Essa proteína é caracterizada por possuir dois domínios principais: N-

terminal (N_Domain) e o interno ou I (I_Domain), sendo domínios importantes

para atividade catalítica da enzima e sua ligação ao DNA. A importância desses

domínios pode ser evidenciada pelos sítios que se encontram precisamente

nesses referidos domínios, sítios esses de ligação ao DNA e também de ligação

ao íon metálico, que no caso seria o Magnésio. Além disso, existe uma

sequência disposta na posição C-terminal que é o local de interação com a

proteína de ancoragem PCNA.

Em gramíneas – Setaria itálica, FEN1A_SORBI (C5YUK3) e

FEN1B_SORBI (C5WU23) de Sorghum bicolor, FEN1A_ORYSJ (Q9SXQ6) e

FEN1B_ORYSJ (Q75LI2) de Oryza sativa subsp. japonica, FEN1A_ORYSI

(B8AW67) e FEN1B_ORYSI (B8AMS4) de Oryza sativa subsp. Indica,

FEN1A_MAIZE (B4FHY0) e FEN1B_MAZE (A0A1D6GDY1) de Zea mays e

FEN1A_CANA e FEN1B_CANA de Saccharum spp. – ao contrário do que foi

observando em Arabidopsis, existem algumas sequências que apresentam uma

segunda proteína flap endonuclease assim denominado de "FEN1B", que difere

em tamanho (por serem maiores que a Flap endonuclase 1 convencional que

recebe o sufixo "A") e a ausência da sequência de interação com PCNA. Nem

todas as espécies que pertencem a Poaceae exibem essa duplicação, como

observado pela sequência de Setaria Italica. Deve-se enfatizar que as

sequências FEN1A e FEN1B se encontram em locus e cromossomos diferentes

em seus respectivos organismos. Outra observação importante a ser feita é que

entre as sequências analisadas, sejam elas FEN1A ou FEN1B, existe uma

conservação não só nos resíduos que compõem os sítios de ligação, mas

81

também a posição desses mesmos resíduos se preservou, exceções seriam a

sequência de Setaria italica e FEN1B de Sorghum bicolor (C5WU23).

4.1.6.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – FEN1A e FEN1B.

As árvores filogenéticas da enzima FLAP ENDONUCLEASE (FEN1)

foram duas, uma destas referente a FEN1A e outra a FEN1B. Nestas árvores

pode-se observar que essas apresentam convergências quanto as duplicações

(ou mais repetições) tanto no grupo pertencente as dicotiledôneas quanto no

grupo das Poaceae.

Na inferência bayesiana, foi possível observar que existe algumas

diferenças quanto a arquitetura da árvore principal gerada, principalmente tendo

como o foco o grupo das monocotiledôneas, na árvore filogenética para FEN1B.

A árvore para FEN1A evidencia-se que embora a família Poaceae estivesse

subdividida em dois grandes ramos, esses permaneceram separados das

dicotiledôneas, algo que se repetiu para análise bayesiana. Já para a árvore

filogenética para FEN1B, nota-se que um grupo constituído por sequências

pertencentes a família Solanaceae seria grupo irmão de um conjunto maior

formado por um dos grupos da Poaceae que englobaria sequências classificadas

como FEN1A, além de sequências pertencentes a organismo mais basais das

angiospermas, monocotiledôneas e dicotiledôneas como membros da família

Bromeliaceae, Musaceae, Amborellaceae e Zosteraceae. Isso poderia indicar

que as sequências FEN1A das gramíneas seriam mais próximas as sequências

de FLAP ENDONUCLEASE I das dicotiledôneas, em detrimento das sequências

FEN1B que seriam mais basais.

4.1.7. DNA POLIMERASE LAMBDA -Pol λ ou POLL.

Em relação a via de Excisão de bases (BER), a polimerase lambda seria a

DNA polimerase que deveria substituir a polimerase beta, tendo em vista que em

plantas não foi encontrado um homólogo correspondente a essa enzima em

específico. As DNAs polimerase lambdas aqui analisadas (POLlambda_ARATH

82

(Q9FNY4) de Arabidopsis thaliana, POLlambda_SETIT (K3XW78) de Setaria

itálica, POLlambda_SORBI (A0A194YIA1) de Sorghum bicolor,

POLlambda_ORYSJ (Q67VC8) de Oryza sativa subsp. japonica,

POLlambda_MAIZE (A0A1D6NRF0) de Zea mays, POLlambda_BRADI

(I1GZF6) de Brachypodium distachyon e PoLlambda_CANA de Saccharum spp.)

exibem um tamanho similar tendo aproximadamente de 520 aa a 555 aa, e a

presença do domínio da superfamília Pol_Beta. O domínio da superfamília da

Polimerase Beta (Pol_Beta) é caracterizado por conter o domínio

nucleotidiltransferase (NT) que constitui, por sua vez, de dois aminoácidos, que

podem ser dois ácidos aspárticos (D ou Asp) ou um ácido aspártico e um ácido

glutâmico (E ou Glu), associados a um terceiro aminoácido distal, esses três

coordenarão a ligação com íons metálicos divalentes que são essenciais para a

catalise. Como observado nas sequências estudas, existem três ácidos

aspárticos (D) presente em todas as sequências analisadas que devem compor

o domínio NT e que são responsáveis pela ligação com o íon manganês (Mn +2).

A diferença notada entre as sequências foi a presença do domínio

pertencente a superfamília BRCT observado em algumas das sequências de

gramíneas como a Setaria italica (K3XW78), Zea mays (A0A1D6NRF0), Oryza

sativa (Q67VC8) e Brachypodium distachyon (I1GZF6). O domínio da proteína

supressora de câncer de Mama carboxi-terminal (Breast Cancer Suppressor

Protein carboxy-terminal -BRCT) é encontrado em muitas proteínas envolvidas

no reparo do DNA e nos pontos de checagem (chekpoint) do ciclo celular. A

sequência de Sorghum bem como a de cana-de-açúcar não exibiram esse

domínio BRCT.

Apesar da sequência cana-de-açúcar encontrada ter um menor tamanho

em comparação as outras sequências, esta exibe o domínio da superfamília da

DNA Polimerase Beta como também o sítio ativo, sítios de ligação a

desoxicitidina trifosfato (dCTP) e ao íon metálico (Manganês). O dCTP é um

trifosfato de nucleósido que contém a pirimidina base de citosina, a qual contém

fosfoanidrido de alta energia que liberam energia quando hidrolisado, as DNAs

polimerases usam essa energia para incorporar desoxicitidina em uma cadeia

sintetizada de DNA. Com base nisso, pode-se propor que a sequência de cana-

de-açúcar possa ser um fragmento de uma DNA polimerase lambda funcional.

83

4.1.7.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – DNA polimerase

Lambda.

A árvore filogenética para a proteína DNA polimerase lambda gerada via

servidor TaxOnTree. Nela pode-se observar a presença de algumas duplicações

no grupo das dicotiledôneas, porém tal fato não é observado para o grupo das

gramíneas.

A árvore principal oriunda da inferência bayesiana, comparando com a

árvore filogenética resultante da metodologia efetuada pela plataforma

TaxOnTree, apresentam topologias similares, logo as observações destacadas

nos parágrafos anteriores foram suportadas pela análise bayesiana.

4.1.8. TYROSYL-DNA PHOSPHODIESTERASE 1 TDP1.

TYROSYL-DNA PHOSPHODIESTERASE 1 (TDP1) remove uma

variedade de adutos covalentes do DNA através da hidrólise da ligação 3'-

fosfodiéster, dando origem, no DNA, um fosfato na sua porção 3´. Esta proteína

também está associada ao reparo do DNA mediado por DNA topoisomerase

durante o metabolismo cromossômico. As sequências de TDP1 analisadas

exibiram, com a exceção da sequência de Setaria italica e cana-de-açúcar, um

tamanho de 600 a 671 aa (aminoácidos). Essas sequências foram:

TDPI_ARATH (Q8H1D9) de Arabidopsis thaliana, TDPI_SETIT (K3Y685) de

Setaria itálica, TDPI_SORBI(A0A1B6QEP1) de Sorghum bicolor, TDPI_ORYSJ

(Q7XHY3) de Oryza sativa subsp. japonica, TDPI_MAIZE (C0PDG6) de Zea

mays, TDPI_BRADI (I1GTU1) de Brachypodium distachyon e TDPI_CANA de

Saccharum spp. Quanto aos domínios conservados, todas as sequências

(exceto a sequência de cana-de-açúcar) exibiram o domínio da superfamília

Tyr_DNA_Prospho que envolve as Tirosil-DNA fosfodiesterases. Algumas

sequências apresentaram também o domínio da superfamília FHA. Domínio

associado a Forkhead (Forkhead associated domain - FHA) que é o domínio

presumível de sinalização nuclear e que poderia se ligar com a fosfoteronina,

fosfoserina e a fosfotirosina, muitas das proteínas que contêm domínio FHA

84

estão localizadas no núcleo, onde participam no estabelecimento ou

manutenção de pontos de controle do ciclo celular, no reparo do DNA ou

regulação transcricional. O domínio FHA não está presente na sequência de

Setaria italica e Oryza sativa.

A sequência de cana-de-açúcar além de ser bem menor que as outras

sequências de plantas usadas para comparação, exibe um domínio distinto

pertencente a superfamília PLFc_Sf, ou seja, um domínio catalítico da

fosfolipase D (Catalytic domain of phospholipase D - PLFc_Sf). A superfamília

do PLD (phospholipase D - Fosfolipase D) é composta por um grupo grande e

diversificado de proteínas, incluindo PLDs de plantas, mamíferos e bactérias

como por exemplo a cardiolipina sintase bacteriana (bacterial cardiolipin - CL),

fosfatidilserina sintase bacteriana (bacterial phosphatidylserine synthases- PSS),

fosfatidilglicerofosfato sintase de eucarioto (eukaryotic

phosphatidylglycerophosphate synthase - PGP), tirosil-DNA fosfodiesterase 1

sintase (Tdp1), e algumas endonucleases bacterianas (Nuc e BfiI), entre outras.

Deve-se levar em consideração que a sequência da cana-de-açúcar está

incompleta em tamanho, de modo que, caso tivesse completa, esse domínio

discrepante poderia não se apresentar, ademais, não se pode deixar de frisar

que o domínio PLFc_Sf também engloba as TDP1s. Além disso, a presumível

TDP1_CANA compartilhou alguns sítios importantes com as outras TDP1s aqui

analisadas, como o sítio ativo e o sítio de ligação ao substrato. Deve ser

enfatizado que, como mencionando antes, por ter um tamanho pequeno, dois

resíduos que compõem esses sítios importantes para TDP1 não puderem ter

correspondentes na sequência de cana-de-açúcar.

4.1.8.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – TDP1.

A árvore filogenética gerada para a proteína TDP1 apresenta alguns

eventos de duplicação, todos eles se encontram dentro do grupo das

dicotiledôneas.

85

Dispondo da árvore consenso resultante da inferência bayesiana,

percebe-se poucas diferenças quanto a topologia em comparação com a árvore

filogenética, de modo que tal resultado confere maior veracidade as observações

efetuadas anteriormente quando foi analisado na árvore filogenética de TDP1.

4.1.9. DNA LIGASE 1 -LIG1.

DNA ligase 1 (LIG1) é uma proteína essencial que sela os cortes da fita

dupla de DNA durante a replicação, recombinação e reparo do DNA. Em relação

ao reparo, a DNA ligase 1 estaria envolvida na quebra da fita simples (SSB -

single strand breaks) e dupla (DSB - double strand breaks). Existem duas formas

de DNA ligase, uma que requer ATP e outro NAD. As sequências de plantas

avaliadas apresentaram o domínio DNA_LIGASE_A3 (destacado em verde), ou

melhor, o domínio pertencente a família de DNA ligase depedente de ATP. As

sequências analisadas foram: DNLI1_ARATH (Q42572) e F4I1P7_ARATH de

Arabidopsis thaliana, DNLI1_SETIT (K4A636) de Setaria itálica, DNLI1_SORBI

(A0A1B6QK46) de Sorghum bicolor, DNLI1_ORYSJ (Q7XD67) de Oryza sativa

subsp. japonica, DNLI1_MAIZE (A0A1D6KSD8) de Zea mays, DNLI1_BRADI

(I1I4Y2) de Brachypodium distachyon e DNLI1_CANA de Saccharum spp. Essas

sequências retrataram diferenças quanto ao tamanho, possuindo sequências

menores com 657 aminoácidos enquanto existem outras com 931 aminoácidos.

A despeito dessa diferença, as sequências exibem a conservação de resíduos

importantes para atividade catalítica da enzima tais como o sítio ativo, sítio de

ligação ao ATP e ao íon metálico (Magnésio).

O trabalho de Spampinato (2017) propôs a existência de duas DNA ligase

1 que atuariam na via de excisão de bases: as sequências DNLI1_ARATH

(Q42572) (AtLIG1) e F4I1P7_ARATH (AtLIG1a). Essas sequências diferem

quanto o tamanho e estão ambas localizadas no cromossomo 1 da Arabidopsis,

mas se encontram em locus diferentes e distantes um do outro. A busca por

homólogos dessas duas sequências de Arabidopsis no grupo das gramíneas não

gerou como resultados duas sequências distintas, ou seja, usando como query

para a busca tanto DNLI1_ARATH (Q42572) quanto F4I1P7_ARATH o resultado

obtido foi o mesmo.

86

4.1.9.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – DNA ligase I.

O diagrama que representa as relações evolutivas entre os organismos

tendo como alvo a sequência de DNA LIGASE I e buscando destacar os

organismos vegetais se encontra apresentado na árvore filogenética gerada via

servidor TaxOnTree. Pode-se distinguir nele, duplicações e mais repetições

presentes dentro do grupo das dicotiledôneas, contudo o mesmo não foi visto

nas monocotiledônea.

A comparação da árvore filogenética e a árvore consenso originada da

inferência bayesiana, constata-se uma alteração da topologia e dessa forma

modificando as relações entre os grupos de organismos. Podemos observar, por

exemplo, na árvore principal, uma sequência da família Malvaceae, pertencente

a espécie Corchorus olitorius, que seria mais basal em relação as angiospermas,

algo não evidenciado na árvore filogenética. Ademais, a família Brassicaceae

passa ser grupo-irmão de um conjunto constituído por espécies que são

compostas tanto por monocotiledôneas quanto dicotiledôneas, tal fato também

não foi observado na árvore filogenética. Apesar dessas diferenças, o grupo das

monocotiledôneas parece preservado nas duas árvores analisadas.

4.1.10. DNA LIGASE IV - LIG4.

A proteína DNA LIGASE IV é responsável por juntar eficientemente as duas

pontas de quebra de fita simples do DNA, sendo uma reação dependente de

ATP. Essa DNA ligase, especificamente, estaria envolvida no reparo por união

de extremidades não-homólogas (NHEJ - Non-homologous end joining). As

proteínas DNA LIGASE IV analisadas (DNLI4_ARATH (Q9LL84) de Arabidopsis

thaliana, DNLI4_SETIT (K3Y4S0) de Setaria itálica, DNLI4_SORBI

(A0A1Z5REU4) de Sorghum bicolor, DNLI4_ORYSA(B9FCD0) de Oryza sativa

subsp. japonica, DNLI4_MAIZE (A0A1D6E090) de Zea mays DNLI4_BRADI

(A0A0Q3KWA2) de Brachypodium distachyon e DNLI4_CANA de Saccharum

spp.) exibiram tamanhos acima de 1000 aminoácidos. Somente a sequência de

87

cana-de-açúcar apresentou um tamanho pequeno. O domínio da superfamília

CDC9 está presente na maioria das sequências, sendo esse um domínio

referente as DNA LIGASE dependentes de ATP. O domínio da superfamília

BRCT também está presente nas sequências, exceto na sequência de cana-de-

açúcar, sendo este um domínio encontrado em muitas proteínas envolvidas no

reparo do DNA e nos pontos de checagem (chekpoint) do ciclo celular, já

mencionado em itens anteriores.

As sequências pertencentes as gramíneas apresentaram o domínio

DNAL4 referente a família composta pela DNA LIGASE IV, as sequências de

Arabidopsis e de cana-de-açúcar diferem nesse quesito por não exibirem tal

domínio. Ademais, as sequências de Setaria italica, Zea mays, Brachypodium

distachyon e cana-de-açúcar apresentaram o domino conservado

DNA_ligase_A_N. DNA ligase N Terminus (DNA_ligase_A_N) é uma região

encontrado em muitas sequências das proteínas DNA LIGASE dependentes de

ATP, teorizasse que esse domínio estaria evolvido na ligação ao DNA auxiliando

a catalise da enzima.

A proteína DNLI4_ARATH apresentou um domínio truncado denominado

Neuromodulin_N, sendo uma região N-terminal de proteínas que promovem a

junção de lacunas (gaps) no DNA. A sequência putativa de DNA LIGASE IV de

cana-de-açúcar e a sequência de B. distachyon exibiram o domínio da

superfamília Adenylation_DNA_ligase_like. O domínio de adenilação de

proteínas semelhantes às ligases de polinucleótidos dependentes de ATP

(Adenylation domain of proteins similar to ATP-dependent polynucleotide ligases

- Adenylation_DNA_ligase_like) está presente em DNA e RNA ligases

dependentes de ATP e estaria envolvido na ligação do referente ATP. É proposto

que nesse domínio estaria localizado os resíduos importantes para o sítio ativo.

Isto pode ser comprovado ao evidenciar que os resíduos que compõem o sítio

ativo e sítios de ligação ao ATP e íons metálicos se encontram dispostos no

domínio Adenylation_DNA_ligase_like. A sequência de cana-de-açúcar, também

apresenta um domínio exclusivo (não encontrado nas outras sequências aqui

estudadas): OBF_DNA_ligase_family, que está associado ao domínio de ligação

a oligonucleótido/oligossacarídeo (OB). Sendo um módulo de ligação ao DNA

que é parte da unidade central catalítica da DNA ligase dependente de ATP.

88

DNALI4_CANA por ter o menor tamanho, possivelmente se tratar de um

fragmento de uma proteína maior, por isso, não exibe os domínios como BRCT

e DNAL4 presentes nas outras sequências na posição C-terminal. Entretanto, a

presumível sequência de cana-de-açúcar conservou os resíduos importantes

para a função catalítica da DNA LIGASE IV, podendo-se inferir que seria

provável a existência de uma DNA LIGASE IV funcional no organismo cana-de-

açúcar.

4.1.10.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – DNA ligase IV.

A árvore filogenética para DNA ligase IV, indicou a presença de

duplicações para algumas espécies dentro no grupo das dicotiledôneas, sendo

que esse mesmo fato não foi observado em monocotiledôneas. No caso do trigo

foram observadas duplicações, mas conforme foi discutido anteriormente existe

uma grande possibilidade dessas sequências se tratarem de isoformas.

Dispondo da árvore principal resultante da inferência bayesiana se

evidência, quanto a topologia, uma correspondência com a árvore filogenética.

Não obstante, vale salientar que a árvore bayesiana, cujo query foi a DNA ligase

4 de Arabidopsis, só exibiu sequências do reino Viridiplantae, não tendo, desta

forma, sequências do reino Metazoa e Fungi.

4.1.11. POLINUCLEOTIDEO 3'-FOSFATASE – ZDP.

POLINUCLEOTIDEO 3´-FOSFATASE (ZDP) é uma enzima envolvida na

via BER requerida para a ativação da desmetilação do DNA. As sequências de

ZDP de Arabidopsis e de alguns organismos pertencente ao grupo das Poaceae

– ZDP_ARATH (Q84JE8) de Arabidopsis thaliana, ZDP_SETIT (K3XGW7) de

Setaria itálica, ZDP_SORBI (A0A1W0VZC1) de Sorghum bicolor, ZDP_ORYSJ

(Q5JND9) de Oryza sativa subsp. japonica, ZDP_MAIZE (C0PDZ5) de Zea mays

ZDP_BRADI (A0A0Q3MZG3) de Brachypodium distachyon e ZDP_CANA de

Saccharum spp.– exibirem tamanhos que variavam de 460 a 694 aminoácidos.

Além do mais, pode ser observado um domínio conservado presente de forma

89

constante nas sequências analisadas: PARP_reg. Sendo este um domínio

regulador da poli(ADP-ribose) polimerase (PARP). Outro domínio observado,

salvo em Arabidopsis, foi o domínio PNK3P. Este domínio trata-se de uma

superfamília a qual engloba as polinucleotideos kinases 3 fosfatases que são

proteínas que tem como papel principal atuarem na quebra de fita simples do

DNA induzindo por agentes genotóxicos como a radiação gamma. O domínio

PNK3P é caracterizado por catalisar a desfosforilação dos 3´-fosfatos do DNA.

A sequência de Arabidopsis e a de Sorghum exibem um domínio em

comum: o ZF_PARP, sendo a região Zn-finger das Poli(ADP-ribose) polimerases

e DNA ligases que funcionariam como um sensor para quebras no DNA (figura

31). A sequência de Arabidopsis apresenta ainda um domínio exclusivo que não

foi observado nas outras sequências de gramíneas estudadas: HAD_like, isto é,

hidrolase parecidas como haloácidos dehalogenase (Haloacid Dehalogenase-

like Hydrolases), uma superfamília que incluem proteínas que catalisam as

reações de substituição nucleofilicas nos centros de fosforo e carbono do

aminoácido, usando um ácido aspártico conservado em uma catalise covalente.

A sequência de uma possível ZDP em cana-de-açúcar apresenta

tamanho e domínios condizentes com outras sequências de ZDP usadas para

comparação, principalmente aquelas pertencentes ao grupo das gramíneas. É

importante observar os valores encontrados de identidade entre a ZDP_CANA e

as outras sequências de Poaceae contrastando com Arabidopis cuja

porcentagem é inferior a 50%. Este dado reforça ainda mais a hipótese de que

tal sequência encontrada na plataforma SUCEST-FUN poderia indicar uma

proteína ZDP funcional.

4.1.11.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – ZDP.

As inferências evolucionárias em forma de árvore das relações entre as

sequências de ZDP entre os seres vivos foi gerada via servidor TaxOnTree.

Nesta árvore foram ressaltados os organismos vegetais. Pode-se observar

duplicações de sequências em espécies que compõem o grupo das

90

dicotiledôneas, enquanto para o grupo das monocotiledôneas, precisamente das

gramíneas, não foram observadas essas duplicações.

A árvore principal oriunda da inferência bayesiana, ao se comparar com a

árvore filogenética resultante da metodologia efetuada pela plataforma

TaxOnTree, foi possível notar diferenças em suas topologias. Uma dessas

diferenças seria o fato de a família Solanaceae não ser o grupo mais basal em

relação as gramíneas e outros organismos pertencentes as dicotiledôneas, como

foi mostrado na árvore filogenética. Na árvore da inferência bayesiana a referida

família se encontra junto as outras dicotiledôneas. Seguindo a mesma lógica, as

sequências pertencentes a espécie Genlisea aurea (família Lentibulariaceae) e

Erythranthe guttata (família Phrymaceae) também abandonaram suas condições

mais basais na árvore da inferência bayesiana, acompanhando o grupo

composto pela família Solanaceae.

4.1.12. ANTIGENO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR 1 (PCNA1) e

ANTIGENO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR 2 (PCNA2).

O ANTÍGENO NUCLEAR DE PROLIFERAÇÃO CELULAR (PCNA) trata-se

de uma proteína que atua como um grampo, envolvendo o DNA, e assim

servindo como plataforma de ancoragem para outras proteínas que atuariam na

replicação e reparo de DNA, também na remodelagem da cromatina e na

regulação epigenética. A revisão feita por Spampinato (2017) propôs a existência

de dois tipos de PCNA em Arabidopsis: PCNA1 e PCNA2. Essas proteínas se

encontram em cromossomos diferentes do organismo A. thaliana (cromossomo

1 e 2, respectivamente) e apresentam uma identidade de 96% entre si. Contudo,

efetuando a busca por homólogos dessas PCNAs dentro do grupo das

gramíneas não resultou na obtenção de duas sequências de PCNAs pertinente

a cada organismo analisado. As sequências de gramíneas para essa analise

inicial foram: PCNA_SETIT (K3YV19) de Setaria itálica, PCNA_SORBI

(C5XV51) de Sorghum bicolor, PCNA_ ORYSJ (P17070) de Oryza sativa subsp.

japonica, PCNA_MAIZE (Q43266) de Zea mays PCNA_ BRADI (I1IDN4

(A0A0Q3MZG3) de Brachypodium distachyon e PCNA_CANA de Saccharum

spp.

91

As sequências demonstraram uma alta conservação na disposição dos

domínios como também tamanho das proteínas, exibindo o comprimento de 263

aminoácidos. A sequência PCNA2 de Arabidopsis exibiu um aminoácido a mais

– 264 aa. Os domínios PCNA_1 e PCNA_2, correspondem a regiões

conservadas entre as proteínas caracterizadas como PCNAs, situadas na

porção N-terminal das sequências, sendo que PCNA_2 é o domínio que foi

proposto ser responsável pela ligação com o DNA.

A sequência de cana-de-açúcar exibiu os dois domínios descritos

anteriormente e a porcentagem de identidade compartilhada entre as outras

PCNAs de plantas foi superior a 80%, sugerindo que tal sequência deve ser

funcional dentro desse organismo vegetal.

4.1.12.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – PCNA1 e PCNA2.

A árvore filogenética da proteína PCNA exibiu duplicações e triplicação de

sequências no grupo das dicotiledôneas e monocotiledôneas. Tais sequências

exibiram tamanhos de proteínas próximos entre si, além de alta identidade, tendo

diferenças, de uma em comparação, de apenas poucos aminoácidos.

A inferência bayesiana indicou na árvore consenso, a conservação das

relações evolutivas já assinalado na árvore filogenética, conferindo, desta forma,

maior veracidade as observações e descrições anteriormente.

4.1.13. POLI [ADP-RIBOSE] POLIMERASE 1 (PARP1) e POLI [ADP-

RIBOSE] POLIMERASE 2 (PARP2).

POLI(ADP-RIBOSE) POLIMERASE (PARP) está envolvida na via de

reparo de excisão base (BER), catalisando assim o poli(ADP-ribosil)lação. Em

Arabidopsis thalina existem duas PARPs denominadas de PARP1 e PARP2.

Estas sequências apresentam tamanhos e presença de domínios conservados

diferentes. É importante ressaltar que estas sequências se encontram em

cromossomos diferentes (2 e 4, respectivamente).

92

A proteína PARP1 apresentou dois motivos zinc-finger na porção N-

terminal de sua sequência que estariam envolvidos na ligação com fitas simples

de DNA. Esta também possui o domínio BRCT que já foi encontrado em outras

proteínas identificadas da via BER.

O domínio PARPalpha, se refere ao domínio alfa-helicoidal da PARP, a

qual é responsável por retransmitir o sinal de ativação emitido ao se ligar ao DNA

danificado. Além disso, existe o domínio PARPcatalytic que corresponde ao

domínio catalítico de PARP responsável por transferir a fração ADP-ribose do

seu substrato NAD (Dinucleótido de nicotinamida e adenina) para os

aminoácidos ácido aspártico e glutâmico. Esses dois domínios estão presentes

tanto em PARP1 quanto em PARP2. Os domínios SAP1 e 2, exibidos em PARP2

na sua região N-terminal, não apresentam uma função conhecida, sendo

também presente em outras sequências de PARPs das gramíneas.

A busca efetuada no Uniprot e no banco de dados ESTs (SUCEST)

retornou sequências homólogas a PARP1 e outras a PARP2. As sequências

identificadas e analisadas das gramíneas foram: PARP1_ ORYSJ (Q7EYV7),

PARP2A_ ORYSJ (Q5Z8Q9) e PARP2B_ ORYSJ (Q0JMY1) de Oryza sativa

subsp. japonica, PARP1_ MAIZE (Q9ZSV1) e PARP2_ MAIZE (O50017) de Zea

mays e PARP1_CANA e PARP2_CANA de Saccharum spp. É possível

evidenciar, para essas sequências, domínios característicos as respectivas

PARPs como também existem diferenças que parecem ser exclusivas das

sequências encontradas nas Poaceae. Verificou-se a presença de um domínio

SAP nas proteínas PARP1 de O. sativa, Z. mays e cana-de-açúcar. Em relação

a PARP2, foi encontrado dois subtipos de PARP2 em arroz: PARP2A e PARP2B

a qual diferem quanto a presença dos domínios SAPs, sendo que a o subtipo 2B

não os possuem.

A sequência de PARP1 de cana-de-açúcar parece estar completa, por

apresentar tamanho, disposição de domínios e motivos similar com as outras

sequências de PARP1 analisadas. Ademais, pode-se observar a alta identidade

com as proteínas de outras espécies. Entretanto, para PARP2_CANA nota-se

que se trata de uma sequência parcial, considerando seu tamanho como também

por não possuir o domínio catalítico.

93

4.1.13.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – PARP1 e PARP2.

As árvores filogenéticas para as proteínas PARP1 e PARP2 foramg

eradas via servidor TaxOnTree. Foram obtidas duas árvores com conjuntos de

proteínas distintos provavelmente pelas diferenças de tamanho e domínios

observados entre as PARPs. As duplicações exibidas em essas árvores também

diferiram, principalmente para PARP2, provavelmente devido a existência dos

subtitipos PARP2A e PARP2B.

As árvores consensos de PARP1 e PARP2, da inferência bayesiana,

repetiram as relações já observadas nas árvores filogenéticas das referidas

proteínas, sendo assim mantendo a topologia e garantindo confiabilidades nas

observações tecidas sobre as relações evolutivas entre as sequências

estudadas.

4.1.14. X-RAY REPAIR CROSS-COMPLEMENTING PROTEIN 1 -

XRCC1.

O papel de corrigir defeitos no reparo de DNA de fita simples e na troca de

cromátides irmãs promovidas por tratamento com agentes genotóxicos (radiação

ionizante e agente alquilantes) é associado a proteína XRCC1 (HOCH et al.,

2017). Além disso, também é proposto que essa proteína estaria envolvida na

epigenética por atuar na via de desmetilação do DNA (MARTÍNEZ-MACÍAS et

al., 2013). As sequências identificadas e analisadas foram: XRCC1_ARATH

(Q24JK4) de Arabidopsis thaliana, XRCC1_SETIT (K3XY04) de Setaria italica,

XRCC1_SORBI (C5Z3V7) de Sorghum bicolor, XRCC1_ORYSJ (Q5VQ75) de

Oryza sativa subsp. japonica, XRCC1_MAIZE (B4G1L6) de Zea mays,

XRCC1_BRADI (I1H1P9) de Brachypodium distachyon e XRCC1_CANA de

Saccharum spp. A partir destas sequências, pode-se evidenciar que existe uma

conservação quanto ao tamanho da sequência de XRCC1 que varia entre 344 a

355 aminoácidos, assim como da presença do domínio BRCT. Embora a

sequência de Arabidopsis thaliana exiba dois domínios BRCT, um disposto na

94

porção N-terminal e outra na C-terminal, nas gramíneas é encontrado apenas

um domínio BRCT.

A sequência de cana-de-açúcar dispõe do tamanho semelhante as outras

sequências de XRCC1 aqui analisadas e compartilha com elas altos valores de

identidade, principalmente entre as sequências do grupo das Poaceae. Além do

mais possui o referido domínio BRCT, o que reforça a hipótese que

XRCC1_CANA seja uma sequência funcional.

4.1.14.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – XRCC1.

A árvore filogenética para a proteína XRCC1 exibiu poucas duplicações,

sendo que essas se concentram em organismos pertencentes ao grupo das

dicotiledôneas.

Confrontando a árvore filogenética com a árvore consenso oriundo da

inferência bayesinana percebeu-se, de forma geral, que ocorreu uma

preservação da topologia e, desta forma, das relações previstas para os

organismos/sequências analisadas. Entretanto, a família Solanaceae,

apresentou uma duplicação na árvore bayesiana.

4.1.15. WERNER SYNDROME ATP-DEPENDENT HELICASE- WRN.

Helicase ATP dependente da síndrome Werner (WRN) é uma proteína

nuclear que atua na manutenção da estabilidade do genoma e desempenha um

papel importante no reparo do DNA, na replicação, na transcrição e na

manutenção dos telômeros. As sequências analisadas e identificadas foram: :

WRN_ARATH (Q84LH3) de Arabidopsis thaliana, WRN_SETIT (K3Y906) de

Setaria italica, WRN_SORBI (C5YBT8) de Sorghum bicolor, WRN_ORYSJ

(Q7XP25) de Oryza sativa subsp. japonica, WRN_MAIZE (B6TDG3) de Zea

mays, WRN_BRADI (Q7XP25) de Brachypodium distachyon e WRN_CANA de

Saccharum spp. Com estas sequências foi possível observar a existência de

uma evidente conservação da WRN entre os organismos vegetais estudados,

afinal, todos exibem o tamanho por volta de 292 a 311 aminoácidos, e

95

apresentam o domínio conservado da superfamília DNAQ_like_exo. A

superfamília do domínio DNAQ-like (ou DEDD) da 3´-5´ exonuclease

(DNAQ_like_exo) trata-se de um grupo com uma conservação estrutural que

engloba proteínas que catalisam a excisão de nucleosideos monofosfatos do

DNA ou RNA no sentindo 3´-5´, também é denominado de superfamília DEDD

devido a quatro aminoácidos invariantes presentes no sítio catalítico nos seus

membros. Dentro dessa superfamília temos a WRN, que se trata de uma DNA

helicase RecQ que exibe atividade exonuclease e logo possui o domínio DNAQ-

like ou DEDD.

A sequência de cana-de-açúcar além de apresentar o domínio referente

a superfamília DNAQ-Like, exibe alta identidade entre os organismos

pertencentes ao grupo das gramíneas (acima de 70% de identidade) , sugerindo,

assim, a probabilidade de funcionalidade da sequência prevista.

4.1.15.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – WRN.

A árvore que expressa as relações filogenéticas de WRN foi gerada via

servidor TaxOnTree. Nesta árvore pode-se observar duplicações de sequências

que ocorreram somente no grupo das dicotiledôneas.

A árvore consenso oriunda da inferência bayesiana (exibiu uma diferença

quanto a topologia, quando comparada a árvore filogenética originada da

plataforma TaxOnTree. Pode-se observar que o grupo constituído pelas

sequências pertencentes aos organismos da família Poaceae se encontra em

um grupo maior a qual apresentariam relação com os organismos mais basais

das angiospermas (como a família Bromeliaceae, Musaceae, Zosteraceae,

Amborellaceae e Nelumbonaceae) e estaria associado com famílias de

dicotiledôneas como a Solanaceae e Curcubitaceae. Esse grande grupo seria

grupo-irmão de um conjunto formado, por sua vez, por famílias pertencentes a

dicotiledôneas, tais como Fabaceae, Malvaceae e Brassicaceae. Esse tipo de

relação não ficou explícita na árvore filogenética.

96

4.2. Modelagem.

Os resultados a seguir são referentes as sequências das proteínas PCNA

e FEN1 de cana-de-açúcar que são proteínas que são previstas interagirem

entre si, sendo que PCNA serve de ancoragem para várias proteínas, inclusive

a FEN1 que aliás, como já descrito no item 4.1.6., possui uma sequência de

interação com PCNA na sua porção N-terminal. Ademais, tais modelos obtiveram

os melhores modelos via I-tasser, ou seja, tendo o melhor C-score previsto, além

de melhores avaliações via Molproby.

A previsão de modelos é importante para elucidar a estrutura das

proteínas presumíveis da via BER e, desta forma, permitiria a inferência quanto

a preservação da atividade enzimática, reconhecimento do substrato, presença

de sítios de ligação ao DNA, outras subunidades e interação com outras

proteínas necessárias para o desempenho de sua função. O trabalho anterior do

nosso grupo de pesquisa desenvolveu modelos tridimensionais das enzimas AP

endonucleases ScARP1 e ScARP3 de cana-de-açúcar (MAIRA et al., 2014).

Estes modelos serviram de base para a caracterização estrutural dessas

proteínas e predição de sua funcionalidade in vivo. Além disso, devido o escasso

número de cristais relacionados a proteínas de origem vegetal, o

desenvolvimento de modelos tridimensionais utilizando as diferentes

ferramentas de modelagem auxiliaria a compreensão dessas proteínas que

atuam não somente no reparo de DNA, mas em outras vias essenciais do

metabolismo do DNA.

4.2.1. Modelo de PCNA_CANA.

O modelo tridimensional da putativa PCNA de cana-de-açúcar se organiza

em arquiteturas homotriméricas em forma de anel, como destacado na figura 8,

nas cores azul, verde e rosa a qual, cada uma, representam três cadeias

idênticas de PCNA organizadas para formar o referido anel. Ademais, esse

modelo exibe alta similaridade de sequência e estrutural com outras PCNAs

avaliadas, conforme observado na figura 9, onde se evidencia os modelos de

97

PCNAs oriundos de cristais de A. thaliana e H. sapiens e constata-se uma

semelhança com o anel homotrimérico previsto para a PCNA de cana-de-açúcar.

Essa organização estrutural se apresenta conservada em todas as PCNAs até o

momento identificadas em diversos organismos pertencentes a diferentes reinos

(BAUER & BURGERS, 1990; WASEEM et al., 1992; ALMENDRAL et al.,1987;

MATSUMOTO et al., 1987; YAMAGUCHI et al., 1991; YAMAGUCHI et al., 1990;

HATA et al., 1992; LOPEZ et al., 1995; LÓPEZ et al., 1997; SUZUKA et al., 1991;

STRZALKA & ZIEMIENOWICZ, 2007; CANN et al., 1999).

Figura 8 – Modelo da presumível PCNA de Cana-de-açúcar. As estruturas destacadas em azul, verde e rosa tratam-se de cadeias individuas de PCNA que em conjuntam formam o anel homotriméricas.

98

Figura 9 – Modelo tridimensional e sequências proteínas das PCNAs de plantas e humano. Os modelos 3D exibem a conservação da estrutura arquiteturas homotriméricas em forma de anel.

PCNA geralmente é chamada de grampo deslizante (sliding clamp), pois

foi previsto que a dupla fita de DNA passaria pela abertura do anel do PCNA e

este serviria como plataforma de ancoragem para muitas proteínas envolvidas

no metabolismo do DNA. Foi verificado a possível preservação dessa função no

modelo de Saccharum spp., utilizando como base o cristal 6GIS, que se trata de

um modelo de PCNA humano que está associado com o DNA. Ao alinhar o cristal

com a PCNA oriundo de cana-de-açúcar (RMSD - Root Mean Square deviation-

entre os modelos foi na média de 0,653 Å), foi possível constatar a provável

conservação da interação com DNA (figura 44). Deve-se observar na figura 10,

destacado em rosa a região de ligação ao DNA que no modelo se encontra

voltado para o interior do orifício do anel, local em que a dupla fita de DNA

deveria passar. Tanto na figura 10a e 10b (que indicam ângulos diferentes de

visão do modelo), pode-se observar o DNA, representando por uma dupla fita

que constitui uma hélice de coloração azulada, passar pelo o referido orifício do

anel da PCNA de cana-de-açúcar.

99

Figura 10 – Modelos proposto para a presumível PCNA de cana-de-açúcar associado ao DNA. Destaca-se em rosa a região do PCNA que interage com o DNA a qual se encontra voltada para o interior do anel da estrutura homotrimérica. A dupla fita que constitui uma hélice de cor predominante azul é a representação tridimensional do DNA. (A) visão do modelo de PCNA de cana-de-açúcar interagindo com o DNA visto lateralmente. (B) visão frontal do já mencionado modelo.

100

4.2.2. Modelo de FEN1_CANA.

FEN1 é uma nuclease específica de estrutura (TSUTAKAWA et al.,2011)

que pode remover DNA flaps, que são estruturas de ácido nucleico normalmente

criadas pela DNA polimerase durante o processo de amadurecimento do

fragmento Okazaki (BALAKRISHNAN & BAMBARA, 2013). Os membros da

família FEN1 possuem um núcleo de nuclease conservado composto por regiões

N-terminal (região N) e interna (região I) (LIEBER, 1997). Essas referidas regiões

estão destacadas na figura 11, em verde (região N-terminal) e roxo (região

interna) no modelo proposto para a sequência de FEN1_CANA. Vale salientar

também, a região de interação com o PCNA, destacado em cinza (figura 11) que

se encontra em uma alça mais exposta que as outras regiões demarcadas.

As estruturas de cristal das proteínas da família FEN1 de diferentes

espécies revelaram que as regiões N e I formam um domínio globular

conservado contendo o site ativo (CESKA et al.,1996; MUESER et al., 1996;

HOSFIELD et al., 1998; HWANG et al., 1998; STORICI et al., 2002). Na maioria

dos membros da família FEN1, as regiões N e I são separadas por,

aproximadamente, 70 aminoácidos. Esta região formam um arco helicoidal que

está localizado acima do sítio ativo e desempenha um papel na ligação e catálise

do DNA (STORICI et al., 2002).

101

Figura 11 – Modelo proposto para a putativa FEN1 de cana-de-açúcar. Modelo de FEN1 de cana-de-açúcar. Destacado tanto no alinhamento quanto no modelo as regiões N-terminal

(verde), interna (I) (roxo) e região de interação com PCNA (cinza).

4.2.3. Interação entre os modelos de PCNA e FEN1.

PCNA, como já mencionado anteriormente, serviria como plataforma de

ancoragem de proteínas que exerceriam funções que variam de metilação de

DNA, reparo por excisão de base, reparo por excisão de nucleotídeos, reparo de

incompatibilidade, replicação de DNA e síntese de DNA de translesão (MAGA &

HUBSCHER, 2003). Desta forma, utilizando o cristal IUL1 que consiste da PCNA

humana associada com FEN1 (também humana) (SAKURAI et al., 2005), foi

verificado a possibilidade dos modelos previstos para cana-de-açúcar dessas

referidas proteínas também pudesse interagir entre si. O resultado, como exibido

na figura 12, demonstra que as FEN1 de cana-de-açúcar (modelo colorido em

azul) se apresentam associadas ao anel homotrimérica de PCNA (modelo de

coloração verde), em destaque em laranja está a sequência de interação ao

102

PCNA das FEN1s, sendo essa sequência, como demonstrado na figura, a

interface da interação PCNA e FEN1. O RMSD (Root Mean Square deviation)

entre os modelos de FEN1 (pertencentes ao cristal IUL1 e o modelo previsto

para cana-de-açúcar) foi em média 0,914 Å, enquanto entre os modelos de

PCNA, do cristal e o de cana-de-açúcar foi em média 0, 737 Å, foi feito uma

média pois o cristal apresenta três cadeias de FEN1 e de PCNA (que constituem

a estrutura em forma de anel).

103

Figura 12 – Complexo proposto de PCNA e FEN1 de cana-de-açúcar. (a) visão lateral do complexo. (b) visão frontal do complexo. Os modelos de FEN1 estão na coloração azul, os de PCNA em verde e íons Mg+2 estão destacados em amarelo. A sequência de FEN1 que interage com PCNA está destacada em laranja.

104

4.3. Analise das sequências AP endonucleases de Arabidoposis,

e cana-de-açúcar.

AP endonucleae é uma enzima essencial para a via de excisão de bases

(BER) por catalisar a etapa inicial da via, identificando e processando o sítio

abásico reminiscente da ação das DNA glicosilases ou mesmo gerado

espontaneamente. Sítios abásicos não reparados podem levar a mutação

durante a replicação semiconservativa, o que indica o quão importante é a ação

da AP endonuclease para a conservação do código genético.

Em Arabidopsis, existem três AP endonucleases homólogas a APE1 (AP

endonuclease 1 humana), denominadas de AtAPE1L, AtAPE2 e AtARP

(MURPHY et al., 2009). Primeiramente, na tabela 5 são apresentadas as

diferenças existentes entre as três sequências de AP endonuclease de

Arabidopsis thaliana para depois fazer a comparação com a sequência de cana-

de-açúcar. Como apresentado na tabela abaixo, podemos observar que AtARP

seria aquela que teria a capacidade de reparar danos oxidativos ao DNA e

poderia agir como um fator redox. Além disso, esta proteína exibi as atividades

de AP endonuclease e teria a capacidade de processar a extremidade 3´-PUA.

Tendo em vista a sua atividade 3´-fosfatase, existe uma divergência, pois em um

artigo é enfatizado que apresentaria uma significativa atividade in vitro (LEE et

al., 2014), enquanto em outro artigo indica que não existira essa atividade (LI et

al., 2015a). Esta proteína também apresenta uma forte afinidade não-específica

ao DNA. Para a proteína AtARP foi previsto como localização subcelular o

cloroplasto, mais precisamente o nucléolo dessa organela, logo essa AP

endonuclease estaria envolvida, possivelmente, no reparo por via excisão de

bases (BER) nos cloroplastos (GUTMAN & NIYOGI, 2009).

A proteína AtAPE1L, por sua vez, apresentaria atividade AP

endonuclease, contudo, diferente da AtARP, essa proteína estaria envolvida no

processo de desmetilação e gene imprinting (LI et al., 2015a). A proteína

AtAPE1L exibiria atividade 3´-fosfotase e converteria a extremidade 3´-PUA

gerada por ROS1 para 3´-OH. Como a proteína AtARP, ATAPE1L exibiria uma

forte afinidade não especifica ao DNA. Sendo essa enzima necessária, junto com

AtAPE2, para a viabilidade das sementes (MURPHY et al., 2009). Quanto a

105

localização subcelular, foi previsto que tal proteína iria para o núcleo e nucléolo,

sendo co-localizada com as proteínas ROS1 e ZDP (LI et al., 2015a).

No caso da proteína AtAPE2, esta possuiria a atividade 3´-fosfatase in

vitro (LI et al., 2015a; LEE et al., 2014; LI et al., 2018b), apesar que um artigo

sugira que na verdade AtAPE2 não apresentaria esta atividade enzimática (LEE

et al., 2014). Essa enzima não seria capaz de catalisar a conversão de 3´-PUA

em 3´-OH, como também não apresenta atividade 3´-fosfatase in vitro. Todavia,

apresentaria atividade 3´-5´exonuclease in vitro (LI et al., 2018b). Apresentaria,

ademais, uma forte afinidade não-específica ao DNA e teria como localização

subcelular o núcleo.

106

Tabela 5 – Função de AP endonuclease de Arabidopsis thaliana e cana-de-açúcar.

Nome/UniprotKB Atividade e função Localização Subcelular

AtARP1 (P45951 –

ARP_ARATH)

• Repara danos oxidativos ao DNA, também atua como fator Redox (BABIYCHUK et al., 1994);

• É uma enzima multifuncional e pode estar envolvida no reparo do DNA e na regulação da transcrição (BABIYCHUK et al., 1994);

• Apresenta atividade apurínica/apirimídica (AP) endonuclease (LI et al., 2015a; CÓRDOBA-CAÑERO et al., 2011; LEE et al., 2014);

• Catalisa a conversão do 3´aldeído β,α-insaturado (3´-PUA) para 3´-OH (LEE et al., 2014);

• Pode estar envolvido no reparo de excisão de bases nos cloroplastos (GUTMAN & NIYOGI, 2009);

• Apresenta significativa atividade 3´-fosfatase in vitro (LEE et al., 2014);

• Não apresentaria atividade 3´-fosfatase in vitro (LI et al., 2015a);

• Tem uma forte afinidade não especifica para com o DNA (LEE et al., 2014).

Nucléolo do cloroplasto (GUTMAN & NIYOGI,

2009).

AtAPE1L (Q5XF07 –

APE1L_ARATH)

• Atividade Apurínica/apirimídia (AP) endonuclease envolvida na desmetilação do DNA e no imprinting de genes (LI et al., 2015a);

• Possui atividade 3´-fosfatase in vitro (LI et al., 2015a);

• Não possui atividade 3´-fosfatase in vitro (LEE et al., 2014);

• Cataliza a conversão do grupo 3´aldeído β,α-insaturado (3´-PUA) a 3´-OH gerado por ROS1 (LI et al., 2015a; LEE et al., 2014);

• Tem uma forte afinidade não especifica com o DNA (LEE et al., 2014);

• Junto com AtAPE2 é necessário para a viabilidade de sementes (MURPHY et al., 2009).

Núcleo (LI et al., 2015). Nucléolo (LI et al.,

2015a). Co-localiza e com ROS1

e ZDP, dois componentes da maquinaria de

desmetilação do DNA (LI et al., 2015a).

AtAPE2 (F4JNYO –

APE2_ARATH)

• Não possui atividade bioquímica (LEE et al., 2014);

• Possui atividade 3´-fosfatase in vitro (LI et al., 2015a; LEE et al., 2014; LI et al., 2018b);

• Possui atividade 3´-5´exonuclease in vitro (LI et al., 2018b);

• Não possui atividade 3´-fosfatase in vitro (LEE et al., 2014);

• Não é possivel catalisar a conversão do grupo 3´aldeído β,α-insaturado (3´-PUA) a 3´-OH(LI et al., 2015a; LEE et al., 2014);

• Tem uma forte afinidade não especifica com o DNA (LEE et al., 2014);

• Junto com AtAPE1L é necessário para a viabilidade de sementes (MURPHY et al., 2009).

Núcleo

Anotação PROSITE-ProRule

ScARP1 Dados aqui apresentados neste trabalho no item 4.4 Núcleo e cloroplasto (MAÍRA et al., 2014).

107

A proteína ScARP1 de cana-de-açúcar é homóloga a AtARP de A. thaliana.

Observa-se que tal como a AP endonuclease da planta de eudicotiledônea, a de

cana-de-açúcar também apresenta um direcionamento subcelular para o cloroplasto,

mas também exibe, divergindo da proteína AtARP, um direcionamento para o núcleo.

Além disso, as duas sequências diferem também no tamanho, sendo ScARP1 menor

que a AtARP figura 13 e tabela 6.

Figura 13 - Analise das sequências de AP endonuclease AtARP, AtAPE2 e AtAPE1L (de A. thaliana), ScARP1 e ScARP3 (cana-de-açúcar) e hAPE1 (Homo sapiens). (a) alinhamento múltiplo de sequências feito pelo método Clustal Omega, a qual o destaque em negro corresponde ao domínio da superfamília Exonuclease-Endonuclease-Fosphatase (EEP), as caixas em vermelho, bem como o destaque em cinza indica o sítio ativo das sequências. (b) Representação esquemática dos domínios conservados das sequências, a figura em azul se destaca o domínio da superfamília Exonuclease-Endonuclease-Fosphatase (EEP) e em verde o domínio SAP, também é possível observar os sítios de ligação a metais (losango em cinza) e o sítio ativo (losango em vermelho). (c) Analise filogenética das sequências de Ap endonucleases, se utilizando do método de Maximum Likelihood. A análise evolucionária foi conduzida via MEGA7 (KUMAR et al., 2015).

108

A figura 13a e 13b apresenta o alinhamento entre as já mencionadas

sequências de AP endonuclease a qual se destaca o domínio conservado

pertencente a superfamília Exonuclease-Endonuclease-Fosphatase (EEP), também

foi evidenciado o sítio ativo que é compartilhado pelas sequências. A diferença

exibida na sequência ScARP1 é que esta apresentou o domínio SAP algo não

observado nas outras AP endonucleases estudadas.

Verificando as sequências de AP endonuclease de cana-de-açúcar e de

Arabidopsis observa-se a conservação de sítios essenciais para a catalise e ligação

de metais (cofatores enzimáticos) o que indica, devido a essa conservação, a

atividade efetivamente funcional da enzima, tal resultado é evidenciado na tabela 6.

Nesta tabela constata-se a preservação destes sítios, exceto por algumas diferenças

como o sítio ativo da AtARP e ScARP1 serem constituído por Tirosina (Y) e Histidina

(H), enquanto a AtAPE1L e hAPE1 exibem como sítio ativo uma Tirosina e um ácido

Aspártico (D), por fim, AtAPE2, de acordo com os dados fornecidos pelo servidor

Uniprot, tem como sítio ativo uma Histidina. Na tabela 6 também foi apresentado a

porcentagem de identidade compartilhada entre as sequências em relação a

ScARP1, de modo que se conclui que a enzima de cana-de-açúcar apresenta maior

similaridade com AtARP (60%), enquanto com as outras proteínas exibe uma

correspondência abaixo de 50%, algo também observado na árvore filogenética

exibida na figura 13c, a qual nota-se que ScARP1 se encontra em um grupo formado

pela AtARP e ScARP3. Estes valores podem ser um indicativo de uma discrepância

na estrutura, composição de aminoácidos e talvez na função.

Em relação a ScARP3, sequência homóloga a AtARP de A. thaliana também

encontrada em cana-de-açúcar e alvo de análise de um trabalho anterior do grupo

de pesquisa (MAIRA et al., 2014), esta exibe uma diferença em relação a ScARP1,

como mostrado na figura 13b e 13c. A ScARP3 está mais próxima da sequência de

AP endonuclease da Arabidopsis (AtARP), apresentando até uma maior

porcentagem de identidade (75%). Maíra et al. (2014) também evidenciou que a

sequência ScARP3 seria mais próxima do grupo das plantas eudicotilédôneas

enquanto a ScARP1 estaria incluindo dentro das monocotiledôneas, mais

precisamente junto com os representantes da família das Poaceae.

Deve-se ressaltar os sítios de ligação a metais compartilhado ou não com as

sequências aqui analisadas, todas AP endonucleases compartilham quatro (4) sítios

109

em comum. As sequências AtAPE2, ScARP1 e AtARP apresentam apenas dois

sítios partilhados entre eles. Existem também sítios exclusivos, ou seja, que não

apresentam correspondência (quando alinhados) com nenhuma outra proteína, de

cada enzima, sendo encontrado um em hAPE1.

Tabela 6 – Comparação entre as sequências de AP endonuclease analisadas. Seus respectivos tamanhos, porcentagem de identidade quando comparada a ScARP1, sítios ativos e sítios de ligação a metais.

Proteína Tamanho

da sequência

Identidade vs

ScARP1 (%)

Sítio ativo

Sítio de ligação a

metais

Sítio estabilizador de estado de

transição

Sítio Importante

para a atividade catalítica

ScARP1 306 - Y161 H297

E86 D201

N203 D296 N56 H297

N203 D271

AtARP ** 536 60% Y389 H527

E313 D429 N431 D526 N282 H527

N431 D501

AtAPE1L* 364 28% Y182 D222

D222 N224

D342 E80 N224 D311

AtAPE2 **

610 27% H324 N196 N7

D323 E37

H324 D194

- -

APEX1h* 318 45% Y171 D210

D70 E96 D210 N212

D308 N212 D283

* Apresenta sítios de ligação a metais (Magnésio). **Apresenta sítios de ligação a metais (Magnésio e Manganês).

4.4. Comparação de modelos de AP endonuclease de Arabidopsis e

cana-de-açúcar.

Os modelos tridimensionais das enzimas AP endonuclease de A. thaliana e

cana-de-açúcar (figura 14) demonstram que os resíduos que se ligariam a metais

(sejam eles Magnésio ou Manganês) se encontram na região mais interna da

proteína, justamente no sítio ativo da mesma, pois alguns dos resíduos também

fazem parte dos sítio ativos previstos para as enzimas como já demonstrado na

tabela 6.

110

Figura 14 – Modelos tridimensionais das Ap endonuclases de Arabidopsis thaliana e Saccharum spp. (a) Modelo referente a proteína AtARP de A. thaliana. (b) Modelo referente a proteína AtAPE1L de A. thaliana. (c) Modelo referente a proteína AtAPE2 de A. thaliana. (d) Modelo referente a ScARP1 de Saccharum sp. Em todos os modelos estão destacados os sítios de ligação aos metais, enfatizados nas caixas negras ao lado dos respectivos modelos.

Alinhando as proteínas, como pode ser observado na figura 15, nota-se que

o modelo referente a ScARP1 se alinha com a região correspondente ao sítio ativo

das proteínas analisadas de A. thalina (AtARP, AtAPE1L e AtAPE2), o que seria um

indicativo da conservação do mesmo e da provável atividade enzimática da

presumível enzima de cana-de-açúcar – ScARP1.

111

Figura 15– Sobreposição dos modelos de Ap endonucleases de Arabidopsis thaliana e Saccharum sp. (a) Sobreposição dos modelos de AtARP (A. thaliana) e ScARP1 (cana-de-açúcar). (b) Sobreposição do modelo de AtAPE1L (A. thaliana) e ScARP1. (c) Sobreposição do modelo de AtAPE2 (A. thaliana) e ScARP1.

112

4.5. Análise do padrão de expressão das AP endonucleases de

Arabidopsis, arroz e milho em comparação a cana-de-açúcar.

Analisando o desenvolvimento de A. thaliana por meio do transcriptoma e

utilizando os dados do projeto AtGenExpress tendo como alvo a sequência AtARP

(efetuado via Arabidopsis eFP Browser na plataforma Bio-Analytici Resource for

Planta Biology - BAR) (WINTER et al., 2007) (figura 16), foi possível observar que

AtARP apresenta um aumento de expressão em estágios finais do desenvolvimento

da semente. Além disso, este aumento foi observado na semente seca como

também na semente embebida com água, por 24 horas. Outros estágios em que

AtARP se encontra upregulated (coloração alaranjada) seria no meristema apical na

fase vegetativa e essa expressão continua aumentada até a fase de inflorescência e

mesmo no botão floral. Verifica-se nesses dados um aumento de expressão na

planta nas folhas em senescência.

Figura 16 - Mapa do desenvolvimento de expressão da sequência AtARP. O mapa foi gerado via Arabidopsis eFP Browser, cujas as cores são um indicativo da expressão do determinado gene analisado (cor vermelha seria o maior aumento na expressão e azul o menor). O mapa exibe as principais fases de desenvolvimento e estruturas do organismo A. thaliana. Figura adaptada do resultado do Arabidopsis eFP Browser.

113

Em relação a AtAPE1L (figura 16), semelhante ao que foi observado em

AtARP (figura 17), também exibiu um aumento de expressão no meristema apical,

sendo que esse aumento se intensificou conforme passava do estágio vegetativo

para o estágio de transição e, por fim, o estágio de inflorescência. As sementes, por

outro lado, exibiram diferenças na expressão em comparação a enzima

anteriormente analisada. As sementes demonstraram um aumento de expressão nos

estágios iniciais, sendo que nos estágios finais ocorre uma diminuição, isso também

é notado no caso da folha em senescência e outros estágios no desenvolvimento

das folhas. Outra semelhança com AtARP foi o aumento na expressão de AtAPE1L

nos estágios iniciais das flores, ainda em botão, sendo que um aumento adicional de

expressão foi observado no carpelo, contudo, uma diminuição na expressão ocorreu

nas sépalas e pétalas. AtAPE1L também exibiu o aumento da expressão nas

sementes embebidas por água, mas já nas sementes secas ocorre uma diminuição

de expressão. Logo, observa-se diferenças na expressão entre AtAPE1L e AtARP.

Figura 17 - Mapa do desenvolvimento de expressão da sequência AtAPE1L. O mapa foi gerado via Arabidopsis eFP Browser, cujas as cores são um indicativo da expressão do determinado gene analisado (cor vermelha seria o maior aumento na expressão e azul o menor). O mapa exibe as principais fases de desenvolvimento e estruturas do organismo A. thaliana. Figura adaptada do resultado do Arabidopsis eFP Browser.

114

Para a sequência AtAPE2 foi observado um aumento na expressão no

meristema apical (figura 18). Esta expressão foi aumentava como ocorria a transição

do ápice meristemático vegetativo para floral. Além disso, foi observado um aumento

na expressão de AtAPE2 nas flores (na fase de botão), sendo que esse aumento

também foi encontrado no carpelo e pétalas. Entretanto, diferindo de AtARP, a

sequência AtAPE2 exibiu uma diminuição de expressão nas sementes e nas folhas.

Ao contrário do que foi observado em AtAPE1L (figura 17), em estágio senescente,

as folhas exibiram aumenta de expressão de AtAPE2. Outra semelhança com AtARP

seria o aumento de expressão observado em AtAPE2 nas sementes embebidas.

Figura 18 - Mapa do desenvolvimento de expressão da sequência AtAPE2. O mapa foi gerado via Arabidopsis eFP Browser, cujas as cores são um indicativo da expressão do determinado gene analisado (cor vermelha seria o maior aumento na expressão e azul o menor). O mapa exibe as principais fases de desenvolvimento e estruturas do organismo A. thaliana. Figura adaptada do resultado do Arabidopsis eFP Browser.

Afim de fazer comparação quanto os dados de expressão do desenvolvimento

vegetal descritos acima com o grupo da Poaceae, haja vista que a cana-de-açúcar

faz parte do referido grupo, foi efetuado uma busca por sequências homólogas das

115

AP endonuclease de A. thaliana em Oryza sativa e estas foram analisadas utilizando

a ferramenta Rice eFP Brower, no servidor BAR, a qual se baseou no perfil de

expressão via array (expression profiling by array) do desenvolvimento dos tecidos

e órgãos do arroz, tendo em vista a expressão espacial e temporal dos genes (JAIN

et al., 2007; SHARMA et al., 2009).

LOC_Os01g58680.1 seria a sequência homóloga a AtARP em arroz e foi

observado (figura 19) que tal sequência apresentou um aumento de expressão nos

estágios iniciais da inflorescência, quando essa ainda estava se desenvolvendo e

diferenciado. Além disso, LOC_Os01g58680.1 exibiu um aumento de expressão no

meristema apical, contudo uma diminuição foi evidenciada nas sementes e na folha

jovem e madura.

Tendo em conta o trabalho de Maira et al. (2014) a qual foi evidenciado

duplicações da AP endonucleases homólogas a AtARP dentro do grupo das

gramíneas (Poaceae), foi encontrado outra sequência homóloga a AtARP em arroz

que seria LOC_Os01g58690.1. Os dois genes (LOC_Os01g58680.1 e

LOC_Os01g58690.1) se encontram no mesmo cromossomo (cromossomo 1),

próximo um do outro, diferindo no número de exons, LOC_Os01g58680.1 possui 12

enquanto LOC_Os01g58690.1 apresenta 8. LOC_Os01g58690.1 exibiu aumento de

expressão nos estágios finais da inflorescência e diminuição de expressão nos

iniciais, comportando-se de forma inversa a outra sequência de arroz

(LOC_Os01g58680.1). Outra diferença constatada foi o aumento de expressão nas

sementes e nas folhas maduras e jovens por parte da LOC_Os01g58690.1. A

congruência entre essas duas sequências de arroz seria que ambas exibem o

aumento na expressão no meristema apical.

116

Figura 19 - Mapa do desenvolvimento de expressão das sequências homólogas a AtARP em Oryza sativa (LOC_Os01g58680.1 e LOC_Os01g58690.1). O mapa foi gerado via Rice eFP Brower, cujas as cores são um indicativo da expressão do determinado gene analisado (cor vermelha seria o maior aumento na expressão e azul o menor). O mapa exibe as principais fases de desenvolvimento e estruturas do organismo O. sativa. Figura adaptada do resultado do Rice eFP Brower.

LOC_Os12g18200.1 seria o homólogo de AtAPE1L em arroz. Na figura 20

podemos observar que essa sequência exibiu um aumento de expressão nos

117

estágios inicias da inflorescência. Entretanto, nos estágios finais

LOC_Os12g18200.1 exibiu uma diminuição na expressão. Essa diminuição também

foi verificada nas sementes, sendo que nos estágios S1 e S2 ocorreu um aumento

de expressão enquanto nos estágios S3 e S4 houve uma diminuição. Também foi

evidenciado diminuição na expressão nas folhas jovens e maduras, em contrapartida

foi observado um aumento na expressão no meristema apical.

Figura 20 - Mapa do desenvolvimento de expressão das sequências homólogas a AtAPE1L em Oryza sativa (LOC_Os12g18200.1). O mapa foi gerado via Rice eFP Brower, cujas as cores são um indicativo da expressão do determinado gene analisado (cor vermelha seria o maior aumento na expressão e azul o menor). O mapa exibe as principais fases de desenvolvimento e estruturas do organismo O. sativa. Figura adaptada do resultado do Rice eFP Brower.

Já para a sequência LOC_Os09g36530.2 (figura 21), homóloga a sequência

AtAPE2, esta exibiu um aumento de expressão nos estágios iniciais da inflorescência

e diminuição nos estágios finais. Entretanto, diferente do que foi notado nas

sementes de LOC_Os12g18200.1 (figura 20), o homólogo AtAPE2 em arroz exibiu

uma diminuição na expressão nas sementes, mostrando um aumento na expressão

no estágio S5. Ademais, o aumento de expressão foi observado nas folhas jovens e

maduras e no meristema apical.

118

Figura 21 - Mapa do desenvolvimento de expressão das sequências homólogas a AtAPE2 em Oryza sativa (LOC_Os09g36530.2). O mapa foi gerado via Rice eFP Brower, cujas as cores são um indicativo da expressão do determinado gene analisado (cor vermelha seria o maior aumento na expressão e azul o menor). O mapa exibe as principais fases de desenvolvimento e estruturas do organismo O. sativa. Figura adaptada do resultado do Rice eFP Brower.

O trabalho de Maíra et al. (2014) mostrou que a sequência ScARP1 seria

expressa nas raízes, folhas e meristema apical. Este padrão de expressão foi

evidenciado também nas análises do padrão de expressão de A. thaliana e O. sativa,

principalmente referente a expressão em folhas e meristema apical. Tal fato pode

ser melhor observado na tabela abaixo a qual resume os dados de expressão mais

relevantes das plantas estudas (A. thaliana, O. sativa e Saccharum spp.)

119

Tabela 7 - Expressão mais relevantes dos genes de AP endonuclease de Arabidopsis thaliana, Oryza sativa e Saccharum spp.

Nome

Expressão mais relevante no

desenvolvimento vegetal de Arabidopsis

thaliana

Nome Expressão mais relevante no

desenvolvimento vegetal de Oryza sativa Nome

Expressão mais

relevante no

desenvolvimento

vegetal de

Saccharum spp.

AtARP

Aumento de expressão: Meristema apical

(vegetativo, transição e inflorescência);

Semente (estágios finais de

desenvolvimento); Folha senescente; Fases

iniciais de botão floral; Carpelo, Sementes

secas e embebidas.

Diminuição de expressão: Folha (em

desenvolvimento e maduras); Pétala e

sépalas (flor madura).

LOC_Os01g58680.1

(homólogo a

AtARP)

Aumento de expressão: Inflorescência (estágio

P1 a P5); Meristema apical.

Diminuição de expressão: Folha jovem; Folha

madura e sementes (estágio S2 a S5).

ScARP1

(homólogo a

AtARP)

Aumento de

expressão: folhas e

meristema apical.

LOC_Os01g58690.1

(homólogo a

AtARP)

Aumento de expressão: Inflorescência (estágio

P5); Meristema apical; sementes (estágio S1, S4

e S5); Folha jovem e Folha madura.

Diminuição de expressão: Inflorescência

(estágio P2 e P3).

AtAPE1L

Aumento de expressão: Meristema apical

(vegetativo, transição e inflorescência);

Semente (estágios inicias de

desenvolvimento); Folha início do

desenvolvimento; Fases iniciais de botão

floral; Carpelo e Sementes secas.

Diminuição de expressão: Folha

senescência; Pétala e sépalas (flor madura),

Pedículo e estágios finais do

desenvolvimento das sementes.

LOC_Os12g18200.1

(Homólogo a

AtAPE1L)

Aumento de expressão: Inflorescência (estágio

P1 e P2); Meristema apical; sementes (estágio

S1 e S2); Raiz de muda.

Diminuição de expressão: Inflorescência

(estágio P4 a P6); Sementes (estágio S3 e S4);

Folha jovem e Folha madura.

120

Nome

(continuaç

ão da

tabela -)

Expressão mais relevante no

desenvolvimento vegetal de Arabidopsis

thaliana

Nome Expressão mais relevante no

desenvolvimento vegetal de Oryza sativa

AtAPE2

Aumento de expressão: Meristema apical

(transição e inflorescência); Folha

senescente; Fases iniciais de botão floral;

fases de bulbo floral Carpelo; Pétalas;

Pedículo e Sementes embebidas.

Diminuição de expressão: Folha maduras e

Estágios intermediários de desenvolvimento

da semente.

LOC_Os09g36530.2

(Homólogo a

AtAPE2)

Aumento de expressão: Inflorescência (estágio

P1 e P2); Meristema apical; sementes (estágio

S5); Folha jovem e Folha madura.

Diminuição de expressão: Inflorescência

(estágio P6); Raiz da muda e Sementes (estágio

S1 a S4).

121

Em relação aos estresses abióticos, foi utilizado como base os dados obtidos

em AtGenExpress (KILIAN et al., 2007) apresentados na tabela 8 donde se

preocupou enfatizar os resultados dos diversos experimentos envolvendo estresses

abióticos que exibiram variação na expressão (Up ou Down, aumento ou diminuição,

respectivamente) das sequências AP endonucleases de A. thaliana, tendo em vista

o tempo em que a planta (Arabidopsis thaliana) foi exposta ao agente estressor.

Na tabela 8 pode-se observar que existe uma clara distinção no perfil de

expressão das AP endonuclease de Arabidopsis. O estresse por frio e osmótico

gerou uma diminuição na expressão de AtARP e AtAPE1L (downregulated),

entretanto, AtAPE2 exibiu um aumento na expressão (upregulated). Em

contrapartida, nos estresses genotóxicos e por radiação UV-B, ocorreu o inverso,

AtAPE2 mostrou uma diminuição na expressão enquanto AtARP e AtAPE1L

aumentaram. AtAPE1L demonstrou ter um aumento de expressão no estresse por

seca e por lesão, a qual as outras AP endonucleases apresentaram uma diminuição.

Já no estresse oxidativo, AtARP e AtAPE2 evidenciaram aumentos e diminuições de

expressão com o decorrer do tempo de exposição ao agente indutor do estresse

(metil viologênio). Embora exista divergências no perfil de expressão entre as

enzimas de Arabidopsis, as três exibiram diminuição na expressão no estresse

salino, ao passo que aumentaram a expressão no estresse por calor.

122

Tabela 8 - Dados do projeto AtGenExpress referente a expressão das sequências analisadas de Ap endonuclease de A. thaliana (ARP, APE1L e APE2) em relação aos estresses abióticos.

Estresse abiótico (KILIAN et al., 2007)

Tipo de estresse

Frio 4 °C contínuos

(câmara fria e sob gelo picado).

Osmótico 300 mM de Manitol.

Salino 150 mM de

NaCl.

Seca Exposto ao fluxo de ar por 15 min com perda

de 10% de peso fresco.

Genotóxico 1,5 μg/mL de

Bleomicina com 22 μg/mL mitomicina

C.

Oxidativo 10 μM metil viologênio (paraquat).

UV-B 15 minutos de luz

UV-B.

Lesão Perfurações na

folha.

Calor 3 horas a 38 °C

seguido pela recuperação a 25

°C

AtARP Dowregulated .Downregulated Downregulated Downregulated Upregulated Upregulated

Downregulated* Upregulated Downregulated Upregulated

AtAPE1L Downregulated Downregulated

Downregulated Upregulated Upregulated Downregulated Upregulated Upregulated

Upregulated

AtAPE2 Upregulated

Upregulated

Downregulated

Downregulated

Downregulated

Upregulated

Downregulated * Downregulated Downregulated

Upregulated

*Aumento e diminuição de expressão em determinadas fases do experimento

123

O trabalho de Jain et al (2007) tange aos resultados array em relação ao

perfil de expressão na Oryza sativa durante o estresse salino, por seca e frio

(indicado na tabela abaixo). Com base nesse trabalho, foi efetuado uma busca

por resultados referentes as sequências de arroz, homólogas as AP

endonuclease de A. thaliana (AtARP, AtAPE1L e AtAPE2), a qual foi verifica que

todas as sequências apresentaram uma diminuição na expressão durantes os

estresses abióticos testados.

Tabela 9– Dados de expressão de sequências homólogas a Ap edonculease de A. thaliana em Oryza sativa em relação ao estresse abiótico: por seca, sal e frio.

Homólogos em arroz Estresse abiótico

Seca Salino Frio

AtARP LOC_Os01g58680.1 Downregulated Downregulated -

LOC_Os01g58690.1 Downregulated - Downregulated

AtAPE1L LOC_Os12g18200.1 Downregulated Downregulated -

AtAPE2 LOC_Os09g36530.1 Downregulated Downregulated Downregulated

Maíra et al. (2014) constatou que ScARP1 aumentou sua expressão no

estresse oxidativo. Esse fato foi evidenciado ao analisar a expressão de ScARP1

em plantas de cana-de-açúcar que foram submetidas a uma concentração de 0

e 30 mM de H2O2 por oito horas. Em AtARP (tabela 8), quando exposta 1, 3 e 6

horas ao experimento de indução ao estresse oxidativo, apresentou aumento de

expressão. Por outro lado, AtARP também exibiu diminuição de expressão em

outros momentos do mesmo experimento (tabela 8). Estas diferenças podem

estar associadas as diferenças nas metodologias utilizadas pelos dois grupos de

pesquisa. No caso do perfil de expressão da sequência de Arabidopsis do projeto

AtGenExpress para a análise de estresse oxidativo, foi utilizado a aplicação de

10 μM de Paraquat (1,1'-dimetil-4,4'-bipiridina-dicloreto). Esta substância

apresenta uma atividade redox, consequentemente produz ânions superóxidos

gerando assim os danos oxidativos. Infelizmente a falta de mais dados de perfil

de expressão em gramíneas sobre os estresses abióticos impediu de comparar

os resultados de ScARP1 com outros na literatura.

124

4.6. Ensaios de reação enzimática.

Tendo o pressuposto que a proteína AP endonuclease de cana-de-açúcar

(ScARP1) poderia apresentar atividade enzimática funcional com base nos

resultados obtidos anteriormente. Então, a proteína ScARP1 foi purificada e, a

partir dela, foram realizados alguns ensaios bioquímicos para caracterizar essa

atividade enzimática, buscando por exemplo as condições ótimas de pH,

temperatura, concentração de enzima necessária para desempenhar a atividade

de reparo de DNA e qual poderia ser o substrato preferido. Os resultados obtidos

estão apresentados abaixo.

4.6.1. Eficiência da atividade enzimática e efeito da

temperatura em ScARP1.

A proteína purificada (ScARP1) foi exposta a um substrato de DNA

contendo um sítio abásico artificial que apresenta em sua constituição o

tetrahydrofuran (THF) (figura 22a). Considerando que o sítio abásico natural é

instável e normalmente gera quebras de dupla fita no DNA, não seria o substrato

ideal a ser escolhido para os ensaios, logo, foi preferível a escolha de um sítio

abásico artificial e mais estável o que permitiria ser reconhecido pela a enzima

e, desse modo, comprovar a atividade endonuclease da mesma

(SCHERMERHORN & DELANEY, 2013). Caso a proteína ScARP1 apresente

atividade AP endonuclease, esta seria capaz de clivar o substrato contendo a

lesão e assim formar um produto a ser visualizado no gel de acrilamida com 28

nucleotídeos de tamanho. Este fragmento teria também uma hidroxila livre em

sua extremidade 3´como apresentado no esquema da figura 56a. Em vista disso,

com o intuito de verificar se a proteína ScARP1 possuía atividade AP

endonuclease foram utilizadas diferentes concentrações em nM (nanomolar)

desta proteína em presença do já referido substrato. Como observado na figura

22b, em comparação ao controle positivo – a enzima AP endonuclease humana

(hAPE) (comercial na concentração de 0,1 U) – a proteína ScARP1 apresentou

a função de AP endonuclease, clivando o substrato resultando assim no acúmulo

de um produto com 28 nucleotídeos (figura 22b). Na figura 22c foi apresentado

um gráfico com a quantificação das bandas do gel de acrilamida observadas.

125

Com isso, pode-se evidenciar que na máxima concentração testada (40 nM) de

ScARP1 a porcentagem de atividade AP endonuclease foi, aproximadamente,

de 30 %.

Sabe-se que outro fator que poderia influenciar a conformação proteica,

bem como, a atividade enzimática seria a temperatura. Logo, com o intuito de

avaliar qual seria a temperatura ótima para a proteína ScARP1 foi realizado o

próximo experimento. O ensaio cujo resultado foi apresentado na figura 22d

mostrou como a AP endonuclease de cana-de-açúcar reagiu quando exposta a

diferentes temperaturas (20 a 37 °C). Nesta figura pode-se verificar que a

temperatura de 37 °C seria aonde a enzima ScARP1 exibiu maior atividade

enzimática. Estes dados podem ser observados também na forma de

representação gráfica como mostrado na figura 22e.

126

Figura 22– Resultados da eficiência da atividade enzimática de ScARP1 em relação a variação de concentração e temperatura. (a) representação esquemática do substrato utilizado nos ensaios de atividade endonuclease, trata-se de um DNA duplex em que apresenta tetrahydrofuran (THF) que simula um sítio abásico. Quando este e clivado pela a enzima AP endonuclease dá origem a um DNA fita simples contendo 28 nucleotídeos, com a extremidade com uma hidroxila livre (-OH). (b) Gel de acrilamida do ensaio envolvendo a atividade da enzima ScARP1 com concentrações diferentes da enzima (2, 5, 10, 20 e 40 nM), ocorrendo a 37 °C por 1 hora. O controle positivo foi a AP endonuclease I humana (na concentração de 0,1 U). O marcador M1 é o substrato com o tamanho de 58 nucleotideos, DNA de fita dupla, já o marcador M2 trata-se de um DNA simples fita contendo 28 nucleotídeos, com a extremidade com uma hidroxila livre (-OH). Gel revelado a 473 nm, 750V, canal LPB. (c) Média da atividade enzimática de ScARP1 com diferentes concentrações da mesma (2, 5, 10, 20 e 40 nM). (d) Gel de acrilamida (19:1, 12 % com 7M de Ureia) de ensaio envolvendo a atividade da enzima ScARP1 com diferentes temperaturas (°C) por 1 hora. O controle positivo foi a hAPE1 na concentração de 0,1 U. O marcador (M) trata-se de uma fita simples de DNA contendo 28 nucleotídeos, com a extremidade com uma hidroxila livre (-OH). Gel revelado a 473 nm, 750V, canal LPB. (e) Gráfico com as médias da atividade enzimática de ScARP1 em relação a temperatura avaliada. Os cálculos foram feitos com base em quantificação no programa Multi Gauge v3.0.

127

4.6.2. Efeito dos íons e concentração de NaCl na atividade de

ScARP1.

Tendo como base que íons podem servir como cofatores enzimáticos

atuando no sítio ativo e assim permitindo que uma proteína tenha uma boa

atividade, nesta etapa do trabalho foi avaliada quais íons que se associam a

proteína ScARP1 e quais deles seriam de grande importância para a sua

atividade enzimática. Para isto foi avaliado os íons bivalentes MgCl2, MnCl2 e o

CoCl2. Esta escolha de íons teve como base o fato da proteína AtARP de A.

thaliana possuir atividade na presença do íon MgCl2. O resultado do ensaio

demonstrou que a preferência da proteína em estudo (ScARP1) foi por MgCl2 e

MnCl2, sendo este último o que apresentou maior atividade enzimática,

principalmente na concentração de 2 mM (figura 23a). Essas observações

podem ser confirmadas ao analisar as bandas exibidas neste gel que foram

quantificadas e expressas em gráfico como apresentadas na figura 23b. Este

gráfico confirma que a porcentagem de maior atividade da enzima ScARP1 foi

em MnCl2, quando esse íon bivalente está entre 1 a 2 mM de concentração,

decaindo nas concentrações de 5 a 10 mM. Contudo, mesmo assim, os

resultados pertinentes ao MnCl2 foram melhores se comparados com os

resultados obtidos para o íon MgCl2.

128

Figura 23 - Resultado do efeito dos distintos íons e da concentração de NaCl sob a atividade de ScARP1. (a) Gel de acrilamida de ensaio envolvendo a atividade da enzima ScARP1 com diferentes íons (MgCl2, MnCl2, CoCl2) ocorrendo a 37 °C por 1 hora. O controle positivo (linha 1) foi a hAPE1 (0,1 U), o gel apresenta dois controles: C1 – Tampão CB (20 mM Tris HCl pH 7,4, 200 mM NaCl, 10 mM BtMe, 1 mM EDTA e 50 % glicerol) + substrato +íons, C2 – substrato + enzima (ScARP1) sem a presença de íons. (b) Média da atividade enzimática de ScARP1 em relação a diferentes íons (MgCl2, MnCl2, CoCl2), o gráfico apresenta dois controles: C1 – Tampão + substrato +íons, C2 – Tampão + substrato + enzima (ScARP1) sem a presença de íons. (c) Gel de acrilamida de ensaio envolvendo a atividade da enzima ScARP1 com concentrações de NaCl em mM (25, 50, 100, 150, 200, 250) ocorrendo a 37°C por 1 hora. O controle positivo foi a hAPE1 (0,1 U) (linha 8). ), o gráfico apresenta um controles: C1 – Tampão + substrato +íons.(d) Média da atividade enzimática de ScARP1 em relação a diferentes concentrações de NaCl em mM (25, 50, 100, 150, 200, 250).O marcador (M), para todos os géis, trata-se de um DNA fita simples contendo 28 nucleotídeos, com a extremidade com uma hidroxila livre (-OH). Gel revelado a 473 nm, 750V, canal LPB. Os cálculos foram feitos com base em quantificação no programa Multi Gauge v3.0.

A concentração de sal pode também influenciar na estrutura e solubilidade

da proteína em condição aquosa. Portanto, foi então avaliado como a

129

concentração de sal (NaCl) pode interferir na atividade enzimática da proteína

ScARP1 (figura 23). Na figura 23c foi apresentado o resultado obtido. Nesta

figura podemos verificar que com o aumento deste sal houve uma diminuição na

capacidade catalítica da proteína ScARP1. Os resultados podem ser

confirmados quando estes foram plotados na forma de gráfico (figura 23e).

Percebe-se que existe uma correlação entre as duas variáveis, porcentagem de

atividade e a concentração de NaCl, ocorrendo uma diminuição da primeira com

o aumento da segunda, sendo uma relação inversamente proporcional.

4.6.3. Atividade exonuclease, fostatase e 3´-phosphodiesterase de

ScARP1.

A atividade exonuclease caracteriza-se pela clivagem de nucleotídeos,

um de cada vez, a partir da extremidade (exo) de um polinucleotídeo de cadeia.

Nos ensaios anteriores (item 4.6.1 e 4.6.2) foi observado um grau de degradação

de DNA do substrato processado pela a enzima ScARP1 evidenciado por bandas

menores a 28 nucleotídeos. Devido a isso, pode-se levantar uma hipótese que

esta enzima apresenta um certo grau de atividade exonuclease além da

capacidade de endonuclease, deste modo, o ensaio subsequente foi avaliar o

grau desta atividade com a concentração crescente de NaCl (mM). Tendo em

conta que o sal pode influenciar a estrutura e eficiência da ação da proteína (visto

no item 4.6.2). Na figura 24a, não se pode observar os fragmentos que seriam

relacionados com a atividade exonuclease. Este ensaio se utilizou de um

substrato de DNA de fita dupla, sendo uma fita menor (com 28 nucleotídeos) que

apresenta uma extremidade com hidroxila livre (figura 24a). Quando a proteína

de cana-de-açúcar foi adicionada a reação nota-se, comparado com o marcador

a qual seria uma fita simples de 28 nucleotídeos com a hidroxila livre (o que

indicaria um DNA não degradado, tal como a fita menor que compõe o próprio

substrato), que não houve processamento e logo não ocorrendo a atividade

exonuclease, de modo que o resultado esperado seria bandas abaixo as

observadas do marcador, indicando fragmentos menores e, assim, degradação

do substrato.

130

As enzimas podem apresentar mais de uma atividade enzimática como já

exposto na tabela 5 referente as AP endonuclease de Arabidopsis, em especial

a própria AtARP a qual ScARP1 é homóloga. Dessa maneira, também foi

avaliado a potencialidade da proteína ScARP1 de exibir a capacidade de agir

como uma fosfatase. Para esse fim, a enzima alvo do estudo foi apresentada

substratos que possuem fosfato em suas extremidades, sendo estes divididos

em duplex (com duas fitas de DNA dispostas para formar uma fita dupla - -P) e

tríplex (com três fitas de DNA dispostas para formar uma fita dupla com um gap

(lacuna) – P-P) como apresentado nas figuras 24b e 24c. O resultado do ensaio

foi observado nas figuras citadas anteriormente, na qual evidencia-se, sempre

comparando com o marcador (constituído de DNA de fita simples de 28

nucleotídeos com a extremidade dispondo de fosfato livre) e com as reações que

não foram adicionadas enzimas (linha 6 e linha 12 da figura 24b), que a enzima

ScARP1 não possui atividade fosfatase pois o esperado era ter bandas abaixo

do marcador “M” indicando assim o processamento do substrato.

Outro ensaio foi realizado com o objetivo de também verificar a atividade

fosfatase, só que testando com outras variáveis, como os cofatores enzimáticos,

principalmente o MgCl2, tendo em vista que esse íon, em outros trabalhos como

de Joldybayeva et al (2014), estava relacionado em estimular a atividade

fosfatase. Ademais, se utilizou de uma fosfatase como controle positivo, além

dos marcadores constituídos de DNA de fita simples de 28 nucleotídeos com a

extremidade dispondo de fosfato livre e outra fita com a mesma quantidade de

nucleotídeos com uma hidroxila livre, analisando, assim, se houve ou não

atividade catalítica que converteria o fosfato em hidroxila. Desta forma, foi

possível comprovar com maior precisão os resultados obtidos. Na figura 24c,

verifica-se que ScARP1 não apresenta realmente a atividade fosfatase, pois não

reproduz o produto com a hidroxila, previsto na linha 7 quando se utilizou uma

fosfatase para processar o substrato (controle positivo) em que é perceptível a

existência de duas bandas, uma correspondendo a fragmento nucleotídeo com

hidroxila e outro com o fosfato.

131

Figura 24 - Resultado dos ensaios de atividade exonuclease, fostatase e 3´-phosphodiesterase de ScARP1. (a) Gel de acrilamida do ensaio envolvendo a atividade exonuclease da enzima ScARP1 com concentrações de NaCl em mM (25, 50, 100, 150, 200, 250) ocorrendo a 37 °C por 1 hora. O marcador (M) trata-se de um DNA fita simples contendo 28 nucleotídeos, com a extremidade com uma hidroxila livre (-OH). (b) Gel de acrilamida do ensaio envolvendo a atividade fosfatase da enzima ScARP1 com diferentes substratos Triplex (P-P) e Duplex (-P), ambos contendo fosfatos livres, sendo o ensaio ocorrendo a 37 °C por 1 hora. O marcador (M) é um DNA fita simples contendo 28 nucleotídeos, com a extremidade com um fosfato livre (-F). (c) Gel de acrilamida de ensaio envolvendo a atividade fosfatase da enzima ScARP1 com diferentes íons MnCL2 (concentração de 0,02 mM) e MgCl2 (na concentração de 0,001 mM –linha1-, 0,0025mM –linha 2-, 0,005mM –linha 3-, 0,01 mM –linha 4-, 0,02 mM –linha 5-) ocorrendo a 37 °C por 1 hora. Vale salientar a linha 8 em que representa o tampão, ou seja, reação sem a adição da ScARP1. Os marcadores são: M1 = DNA fita simples contendo 28 nucleotídeos, com a extremidade com uma hidroxila livre (-OH), M2 = DNA fita simples contendo 28 nucleotídeos, com a extremidade com um fosfato livre (-F). (d) gel de acrilamida de ensaio envolvendo a capacidade de processamento do substrato PUA (phosphor-α,β-unsaturated aldehyde - aldeído β,α-insaturado) pela a enzima ScARP1 com diferentes íons MnCL2 (concentração de 0,02 mM) e MgCl2 (na concentração de 0,02 mM), sendo o ensaio ocorrendo a 37 °C por 1 hora. Também foi avaliado diferentes pH, a linha 7 apresenta pH 5, enquanto o restante se enquadra no pH 8. Outra variável que faz parte do experimento foi a concentração de sal (NaCl) em concentração, na linha 2: 100 mM, linha 3: 50mM e na linha 5: 100 mM. Os marcadores são: PUA – substrato utilizado no ensaio, M1 = DNA fita simples contendo 28 nucleotídeos, M2 =DNA fita simples contendo 29 nucleotídeos, M3 - DNA fita simples contendo 51 nucleotídeos. Gel revelado a 473 nm, 750V, canal LPB. Os substratos utilizados nos ensaios apresentam marcação da fluorescência Alexa Fluor 635 (FL*). Todos os géis foram revelados a 635 nm, 550V, canal Cy5, exceto o ensaio 3´-phosphodiesterase cujo gel foi revelado a 473 nm, 750V, canal LPB.

132

A via de excisão de bases (BER) origina, ao longo de suas diversas

etapas, extremidades não-convencionais na fita de DNA a qual bloqueiam a

atividade da polimerase, de modo que não se pode preencher a lacuna com

nucleotídeos, por conseguinte, se essas extremidades não-convencionais não

forem processadas e retiradas, perpetua-se um sitio altamente mutagênico no

material genético, além disso, o reparo não poderá ser efetivado. “PUA”

(phosphor-α,β-unsaturated aldehyde - aldeído β,α-insaturado) trata-se de uma

destas extremidades não-convencionais geradas durante o reparo. Assim sendo,

com o intuito de avaliar se ScARP1 tem a capacidade de processar tal substrato

foi realizado um ensaio utilizando um substrato composto de um DNA de fita

dupla (duplex), cuja uma das fitas exibe em sua extremidade 3´ - PUA (figura

24d). O resultado do ensaio, como mostrado na figura 24d, teve como foco tanto

avaliar se os íons (MgCl2 e MnCl2) como a concentração de sal, poderiam

influenciar nesta suposta atividade. O controle positivo utilizado foi a

endonuclease IV que apresenta essa capacidade de processar a PUA, em vista

disso, pelo que se comprova no resultado, observa-se que ScARP1 não possui

esse tipo de atividade (figura 24d).

4.6.4. Ensaio de complementação de atividade AP endonuclease

em extratos de A. thaliana.

Com os ensaios anteriores foi comprovado que a enzima ScARP1 tem

atividade endonuclease, sabendo que esta proteína é homóloga a AtARP de A.

thaliana, foi levantado a questão se ScARP1 seria capaz de complementar a

atividade endonuclease de um extrato proteico oriundo de plantas mutantes que

não expressam a proteína AtARP (plantas arp -/-). Portanto, foi feito o ensaio em

que se adicionou concentração de 40 e 80 nM de ScARP1 nesses extratos. O

resultado obtido está apresentado na figura 25a, a qual observa-se que na

concentração de 40 nM (linha 4) e 80 nM (linha 5) existe evidência da ação da

enzima, porém se comparado ao extrato selvagem (WT) na linha 2 constata-se

que todo o substrato foi processado, enquanto que ScARP1 não conseguiu

realizar este processamento por completo. Consequentemente se deduziu que

a complementação foi parcial. Essas observações também estão de acordo com

os dados na quantificação feita via Multi Gauge V3, exibidos no gráfico (figura

133

25b), a qual ratifica-se a porcentagem de atividade endonuclease nos extratos,

enfatizando que ScARP1 não processa todo o substrato e sua atividade é

contabilizada em, no máximo, 40%.

Figura 25 - Resultado do ensaio de complementação de atividade Ap endonuclease em extratos vegetais de A. thaliana. (a) Gel de acrilamida do ensaio de complementação enzimática de ScARP1, ocorrido a 37 °C por 3 horas. O arp-/- extract – extrato proteico de A. thalina mutante sem a enzima ARP, WT extract – extrato proteico de A. thaliana selvagem. O marcador (M) trata-se de uma DNA fita simples contendo 28 nucleotídeos, com a extremidade com uma hidroxila livre (-OH). Gel revelado a 473 nm, 750V, canal LPB. (b) Gráfico com a média da atividade enzimática da ARP (no caso do extrato selvagem –WT–) e ScARP1 adicionado nos extratos das plantas mutantes arp. Os cálculos foram feitos com base em quantificação no programa Multi Gauge v3.0.

134

5. DISCUSSÃO

5.1. Identificação e análise das sequências da via BER em cana-

de-açúcar.

A recente introdução de tecnologias de sequenciamento de nova-geração

desencadeou uma explosão de projetos de genoma de sequenciamento. No

caso das plantas, tendo como base os dados expostos pelo instituto Joint

Genoma (JGI - Joint Genome Institute), do seu programa com plantas:

Phytozome, existe, até o momento, 64 genomas vegetais liberados para estudo

(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!releaseNotes). Já em relação a

cana-de-açúcar, foco desse trabalho, sabe-se que o seu genoma haploide exibe

um tamanho relativamente pequeno (~ 1 Gpb). No entanto, os cultivares

modernas de cana-de-açúcar são poliploides derivados de hibridização

interespecífica entre S. officinarum L. e S. spontaneum L. (ROACH, 1969) o que

acarretou a constituição de 130 cromossomos distribuídos entre 12 grupos

homólogos, aproximadamente, (D'HONT 2005; GRIVET & ARRUDA 2002)

gerando como resultado um genoma de 10 Gpb (LE CUNFF et al., 2008). A

poliploidia, todavia, trata-se de um mecanismo importante para a evolução e

diversificação tanto para plantas como para animais, sendo associado ao

surgimento de novidades evolutivas, conferindo vantagens adaptativas e até

mesmo a formação de novas espécies (DUFRESNE et al., 2014; SATTLER et

al., 2016). Contudo a sua existência dificulta o sequenciamento, montagem e

anotação do genoma devido aos altos níveis de polimorfismo nos cromossomos

e a grande proporção de sequências repetitivas (SOUZA et al., 2011; YANG et

al., 2011a). Ademais, a cana-de-açúcar não apresenta progenitores diploides

para permitir uma montagem de genoma mais rápida e fácil (GARCIA et al.,

2013) da mesma forma que a batata (POTATO GENOME SEQUENCING

CONSORTIUM, 2011), algodão (LI et al., 2014) e banana (D'HONT et al., 2012).

Existe um consórcio mundial, envolvendo vários centros de pesquisa para

o sequenciamento e estudo do genoma da cana-de-açúcar, no Brasil, o principal

projeto seria o BIOEN-FAPESP, que se utiliza de duas abordagens principais:

uma usando uma coleção de BACs enriquecida com regiões gênicas e outra

135

seria sequenciamento Shotgun. Recentemente, uma coleção de 317 sequências

de BAC foi disponibilizada ao público (DE SETTA et al., 2014). Além disso, uma

tentativa adicional de sequenciar as regiões enriquecidas com genes que

exploram a filtração por metil (regiões metiladas) também disponibilizou dados

do genoma, embora com um alto nível de fragmentação que limita sua

aplicabilidade em estudos genômicos funcionais (GRATIVOL et al., 2014). Com

esse cenário, não há uma data prevista para a liberação de uma sequência

completa ou quase completa de genoma de cana-de-açúcar, forçando aos

pesquisadores a se utilizar de outras abordagens, como o uso de sequências

ESTs (expressed sequence tag -marcador de sequência genética) em suas

pesquisas.

As vias de reparo de DNA, incluindo a via de excisão de bases (BER),

apresenta uma alta conservação de suas proteínas entre os organismos, já

discutido por Aravind et al. (1999), a qual fez uma análise detalhada dos

domínios proteicos envolvidos no reparo de DNA, comparando as sequências

das proteínas de reparo de dois organismos modelo bem estudados, a bactéria

(Escherichia coli) e levedura (Saccharomyces cerevisiae), a todos os conjuntos

de sequências de proteínas codificadas em genomas completamente

sequenciados de bactérias, Archaea e eucariontes. Já Yoshiyama et al. (2013),

demonstraram que muitos fatores envolvidos na resposta ao dano do DNA (DDR

- DNA damage response) de animais estariam presentes no genoma de plantas,

chegando a essa conclusão se baseando na homologia das sequências. Do

mesmo modo, a busca empregada nesse trabalho por sequências homólogas a

componentes de BER em cana-de-açúcar se utilizando do banco de dados ESTs

levando-se em consideração a conservação dos domínios e sequências de

proteínas de reparo entre os organismos vivos.

A seguir será discorrido sobre as proteínas da via BER identificadas nesse

trabalho:

5.1.1. OGG1.

Uma das principais lesões mutagênicas no DNA causada pela exposição

das espécies reativas de oxigênio é a 7,8-dihidro-8-oxoguanina (8-oxoG)

tratando-se da oxidação de uma guanina, sendo uma das lesões mais

136

abundantes (KASAI & NISHIMURA, 1993) e tendo comprovação de ser

altamente mutagênico in vitro e in vivo (MICHAELS et al., 1992; GROLLMAN &

MORIYA, 1993). O fato de ser mutagênico se deve a habilidade de 8-oxoG de

parear não só com a citosina como também com a adenina, possibilitando a

ocorrência de transversão de GC para TA (WOOD et al., 1990; SHIBUTANI et

al., 1991). Essa lesão (8-oxoG) é reparada via BER (via de excisão de bases),

sendo iniciada por uma DNA glicosilase capaz de identificar a lesão e a excisar

do DNA. A DNA glicosilase que age sobre 8-oxoG pode ser de duas diferentes

famílias estruturais, cujos o arquetípico dos membros seria a FPG (também

denominada de MUTM) da Escherichia coli e a OGG1 de levedura (BROOKS et

al., 2013).

Foi identificado, neste trabalho, uma OGG1 em cana-de-açúcar,

denominada de OGG1_CANA. Pode-se observar (item 4.1.1), que

OGG1_CANA, como também outras sequências pertencentes a família das

Poaceae e a representante dicotiledônea (Arabidopsis thaliana), exibem o

domínio conservado da superfamília OGG1, sendo que uma diferença

vislumbrada entre A. thaliana e as sequências das gramíneas é que essas teriam

um comprimento maior. Também foi observado a conservação em OGG1_CANA

dos resíduos de glutamina e fenilalanina que seriam responsáveis pelo

reconhecimento da base lesionada (GARCÍA-ORTIZ et al, 2001). Além disso,

com ensaios de mutagênese sítio dirigida em OGG1 humana foi verificado que

os resíduos lisina e ácido aspártico teriam papel essencial para a catalise

adequada da DNA glicosilase (NASH et al., 1997; BJØRÅS et al., 2002). A

conservação do domínios e resíduos importantes seria um indicativo do provável

papel funcional da OGG1_CANA.

5.1.2. NTH1 e NTH2.

As espécies reativas de oxigênio também oxidavam as pirimidinas do

DNA, sendo que esse dano é reparado pela Endonuclase III, cujo protótipo seria

a Endonuclease III de E. coli. Em A. thalina foi identificado um homologo para

essa proteína, denominado de AtNTH1 (Arabidopsis thaliana endonuclease

three homologue 1), a qual foi caracterizado e comprovado sua atividade

enzimática diante diversos substratos, pirimidinas danificadas por estresse

137

oxidativos, levando-se a conclusão que teria papel essencial na defesa da planta

contra esse estresse (ROLDÁN-ARJONA et al., 2000). Existe um segundo

homólogo de Endonuclease III em Arabidopsis, denominado de AtNTH2

(Arabidopsis thaliana endonuclease three homologue 2) a qual foi encontrado

junto com AtNTH1 e AtARP no núcleo do cloroplasto de Arabidopsis,

demonstrando a ocorrência da via BER nessa organela (GUTMAN & NIYOGI,

2009).

Em relação as gramíneas, não foi identificado uma sequência que seria

referente a NTH2. Conforme observando na árvore filogenética e a árvore

consenso da inferência bayesiana, tais diagramas de relações evolutivas

exibiram duplicações de sequências para organismos pertencentes ao grupo das

dicotiledôneas, porém não para as monocotiledôneas.

A NTH1_CANA, conforme exposto no item 4.1.2, pertence a superfamília

HHH (Helix-hairpin-Helix) sendo esse domínio conservado estando presente em

proteínas que fazem parte da via de excisão de bases (BER) (CHOI, 2002).

Ademais, vale ressaltar que a Endonuclease III de E. coli já foi super-expressa e

purificada (ASAHARA et al., 1989), além de cristalizada e sua estrutura analisada

(KUO et al., 1992a, b; THAYER et al., 1995), o que levou a conclusão que essa

endonuclease III possui o domínio Helix-Hairpin-Helix (HHH) além dos sítios de

ligação ferro-enxofre [4Fe-4S]. Esses referidos sítios seriam quatro cisteínas

conservadas que atuariam na química redox e na ligação com o DNA (THAYER

et al., 1995), ambos, motivo e sítios, estão conservados na presumível sequência

de cana-de-açúcar. Também vale frisar a conservação do ácido aspártic no sítio

ativo, sendo esse um resíduo preservado em outras DNA glicosilases além de

NTH1, como UNG e MBD4L (CHOI, 2002). A conservação observada indicaria

que NTH1_CANA poderia exercer um papel funcional na cana-de-Açúcar no

reparo de pirimidinas danificadas.

5.1.3. UNG.

A presença de Uracila no DNA pode ser pelo erro de incorporação de dUMP

(desoxiuridina monofosfato) ou pela deaminação hidrolítica da citosina. Essa

lesão relativamente comum no genoma é ativamente removida por BER, sendo

iniciada por uma uracila DNA glicosilase (UDG ou UNG).

138

Os UDGs são distribuídos em uma superfamília de proteínas composta por

cinco famílias (FRIEDBERG et al., 2006, CHUNG et al., 2003). A primeira UDG

identificada foi a enzima Ung de Escherichia coli (LINDAHL, 1974), que tipifica a

Família-1 das UDGs. Essa família altamente conservada engloba a maioria das

UNG das espécies até o momento analisadas, com algumas exceções como

Drosophila melanogaster e Archaea (ARAVIND & KOONIN, 2000). Enzimas da

família-1, reconhecem a uracila em uma conformação extra-helicoidal e atuam

tanto contra fitas duplas de DNA (dsDNA) quanto para fitas simples (ssDNA). A

sequência de UDG_CANA exibiu, tal como as outras sequências analisadas e

utilizadas para a comparação, o domínio conservado pertencente a superfamília

UDG, mais precisamente concernente a família-1, conforme já descrito

anterirmente. Além disso, apresenta a conservação do ácido aspártico como sítio

ativo.

Sabe-se que o gene UNG de humano codifica duas formas da proteína,

uma que é direcionada para a mitocôndria (UNG1) e outra para o núcleo (UNG2),

a UNG de Arabidopsis (AtUNG) parece ser homóloga a esses dois tipos de UNG,

sendo comprovado que AtUNG atua no DNA mitocondrial (BOESCH et al.,

2009). As sequências analisadas que compõe as árvores, em sua maioria,

apresentam anotações de previsão computacional que direcionada as UNGs

tanto para o núcleo quanto para a mitocôndria, levantando a questão se de fato

haveria apenas uma UNG para ambas organelas em plantas. Isso indica a

necessidade de mais pesquisas tendo com esse foco o direcionamento

subcelular.

5.1.4. DME, DMLE e ROS1.

A metilação do carbono 5 da citosina (5-meC) trata-se de uma modificação

epigenética que guia a formação de uma cromatina transcricionalmente

silenciada, além de permitir a transmissão de padrões específicos de atividade

de genes nas divisões celulares (BENDER, 2004, BIRD, 2002). Em eucariontes,

a metilação de DNA foi detectada nos protistas, fungos, plantas e animais

(COLOT & ROSSIGNOL, 1999) e exerce um papel importante no

desenvolvimento (HOLLIDAY & PUGH, 1975; RIGGS, 1975; ELHAMAMSY,

2016) e na defesa do genoma contra elementos genéticos moveis (YODER et

139

al., 1997). O nível de resíduos de 5-meC no genoma depende dos processos de

metilação e desmetilação do DNA (ELHAMAMSY, 2016). Evidências genéticas

e bioquímicas indicam que as plantas contêm várias DNA glicosilases/AP-liases

bifuncionais que provocam a excisão de 5-meC quando presentes no DNA

duplex e iniciam sua substituição por uma citosina regular se utilizando da via

BER (HE et al., 2011). Em Arabidopsis thaliana, uma família DNA glicosilases

que tem como alvo 5-meC é formado por ROS1 (REPRESSOR OF SILENCING

1), DME (DEMETER), DML2 (DEMETER-LIKE 2) e DML3 (DEMETER- LIKE 3),

todas essas proteínas estão envolvidas na regulação do imprinting e do

silenciamento gênico (HE et al., 2011).

ROS1 e DME são preditos codificarem proteínas grandes contendo

domínios pertencentes a DNA glicosilase com similaridade de sequência

significante com proteínas envolvidas em BER da superfamília HHH-GPD

(nomeadas por sua característica helix-hairpin-helix e loop rico em prolina e

glicina seguida por um aspartato conservado) (NASH et al., 1996). A superfamília

HHH-GPD de DNA glicosilases é disseminada nos três domínios da vida

(Bactéria, Archeae e Eucariontes) e seus membros, tipicamente, são compostos

por proteínas de 200 a 400 aminoácidos de comprimento (DENVER et al., 2003).

Contudo, claramente, ROS1 e DME são proteínas longas (1100-2000

aminoácidos) se comparada com DNA glicosilases usuais. Além disso, tais

proteínas são únicas para plantas, como pode ser evidenciado nas árvores

filogenéticas e a árvore resultante da inferência bayesiana, a qual percebe-se

que não têm representantes do reino Metazoa e Fungi. Ademais, existem

sequências presumíveis de DME e ROS1, presente nas briófitas e algas verdes

unicelulares, isso sugere que a desmetilação por meio da excisão de 5-meC

deve ter aparecido cedo durante a evolução das plantas (GROSJEAN, 2009).

DML2 e DML3 também são DNA glicosilases com alvo 5-meC (ORTEGA-

GALISTEO et al., 2008; PENTERMAN et al., 2007). Entretanto, DML2 apresenta

uma atividade fraca, pelo menos nas análises in vitro, enquanto DML3 possuem

atividade e substratos específicos em comum a DME e ROS1 (ORTEGA-

GALISTEO et al., 2008; PENTERMAN et al., 2007).

As sequências encontradas nas gramíneas, com a exceção de K7U9K6,

proteína de milho, não apresentam anotações que os especificaria como DME,

140

ROS1 tão pouco DML3, mas compartilham os principais domínios que

caracterizam esses tipos DNA glicosilases, tais como: o domínio HHH (já

discutido acima, pertencente a superfamília HHH-GPD), além do cluster (4Fe-

4S)+2 formado pelas quatro cisteínas conservadas. Os clusters Fe-S são muito

versáteis; suas funções podem ser amplamente agrupadas em portadores de

elétrons, catalisadores enzimáticos e reguladores gênicos, além desse cluster

ser requerido para ativar a desmetilação de DNA (BUZAS, 2016). Contudo, a

sequência identificada no banco de dados ESTs de cana-de-açúcar (SUCEST-

FUN), não exibiu nenhum domínio ou sítios que o caracterize como uma DNA

glicosilase e logo não se pode concluir que a cana-de-açúcar possua tais

proteínas. Devido à importância dessas DNA glicosilases para o processo

epigenético, além que, conforme mostrado nas árvores, existe a presença

dessas enzimas em organismos próximos evolutivamente da cana-de-açúcar,

como o S. bicolor e S. italica, não se pode descartar a possibilidade da existência

das mesmas no genoma de Saccharum spp.

5.1.5. MBD4L.

A proteína MBD4 de mamíferos é uma glicosilase monofuncional que

excisa T (timina) e U (uracila) pareados com G (guanina), mas tendo preferência

por derivados U halogenados, como 5-hidroximetiluracil (5-hmU), essa

característica também é relatada para TDG (Timina DNA glicosilase da

superfamília UDG) (SJOLUND et al., 2013). Essa enzima (MBD4), devido a sua

função como DNA glicosilase, afeta o reparo do DNA, a progressão do tumor, a

apoptose e a expressão gênica. Além disso, o MBD4 liga-se e reprime os

promotores de genes hipermetilados, influenciado a sua transcrição (KONDO et

al., 2005). Por outro lado, MBD4 e TDG de mamíferos, bem como a DME

(glicosilases exclusivas de plantas) estão envolvidos na desmetilação ativa do

DNA associada à via BER. Enquanto DME, DML2, DML3 e ROS1 removem 5-

metilcitosina (5-meC), permitindo a sua substituição por citosina (C) (AGIUS et

al., 2006; ORTEGA-GALISTEO et al., 2008), MBD4 e TDG não eliminam

eficientemente 5-meC, requerendo um processo de múltiplos passos.

Ramiro-Merina et al. (2013) demostraram que Arabidopsis codifica uma

DNA glicosilase monofuncional homóloga a MBD4 de mamífero que foi assim

141

denominada de MBD4-like ou AtMBD4L (At = Arabidopsis thaliana). Nota et al.

(2015) indicaram que a ativação de AtMBD4L induziria a expressão de um gene

tardio da via BER AtLIG1 e como isso aumentaria a tolerância da planta ao

estresse oxidativo.

Comparando as sequências de gramíneas percebe-se que, diferindo da

sequência de Arabidopsis, exibem o domínio conservado referente a

superfamília Endonuclease III. As sequências da família Poaceae também

mostraram, em sua maioria, serem maiores em comprimento em relação a

AtMBD4L, exceção disso a sequência presumível de cana-de-açúcar. Essa

sequência, embora apresente conservados os domínios, sítios importantes,

como o sítio ativo e os resíduos envolvidos na especificidade com a guanina,

exibe tamanho abaixo do previsto o que leva a conclusão de não representar

uma proteína completa.

A diferença entre as sequências de MBD4L vegetais, principalmente

referente as sequências de dicotiledôneas e monocotiledôneas, foi tão grande

que foi gerado duas árvores filogenéticas com dois grupos distintos: um tendo

como foco dicotiledôneas e outra o grupo composto pelas gramíneas. Tais

resultados levantam questão sobre como essas diferenças afetariam a

funcionalidade da MBD4L nesses diferentes organismos vegetias e expõe a

necessidade de mais estudos em relação a essa enzima, especificamente.

5.1.6. FEN1A e FEN1B.

FEN1 é uma nuclease específica da estrutura (TSUTAKAWA et al., 2011)

que podem remover abas (flap) que são estruturas de ácido nucléico criadas pela

primase e DNA polimerase durante o processo de maturação do fragmento de

Okazaki (fita atrasada) (BALAKRISHNAN & BAMBARA, 2013). A FEN1 interage

com mais de 30 proteínas envolvidas em diferentes vias metabólicas do DNA,

incluindo a replicação do DNA, reparo do DNA, degradação do DNA apoptótico

e a manutenção da estabilidade dos telômeros (ZHENG et al., 2010).

Em relação as plantas, sabe-se que dois homólogos de FEN1 foram

identificados em arroz (Oryza sativa, OsFEN1a, OsFEN1b). Testes de

complementação funcional revelaram que apenas OsFEN1a seria capaz

142

complementar o mutante fen1/rad27 em levedura, sugerindo que os dois genes

podem ser funcionalmente distintos (KIMURA et al., 2003). Além disso,

OsFEN1a, expresso em Escherichia coli, possui atividade de nuclease flap

endonuclase e 5´- exonuclease (KIMURA et al., 2000). Em Arabidopsis thaliana,

um homólogo de FEN1 foi identificado por meio de uma pesquisa de homologia

(KIMURA et al., 2000). A caracterização bioquímica da proteína SAV6 (também

denominado de FEN1) revelou que, ao contrário do FEN1 animal, a proteína

SAV6 apresenta atividade Flap-endonuclease e gap (lacuna) endonuclease, mas

não possui atividade 5´-exonuclease. No entanto, como a FEN1 humana

(hFEN1), a SAV6 também é necessária para a manutenção da integridade do

genoma e resposta a danos no DNA de plantas (ZHANG et al., 2016a).

Tendo em vista a estrutura da Flap endonuclease, sabe que a FEN1

humana é composta pelo domínio N-terminal e o intermediário (Domínio I) além

de uma região C-terminal a qual é importante para interação de FEN1 com outras

proteínas, tais como PCNA e WRN (ZHENG et al., 2005; BROSH et al., 2001;

BROSH et al., 2002; KARANJA & LIVINGSTON, 2009). A sequência presumível

de FEN1 preserva os domínios descritos, porém, as FEN1B, tanto de cana-de-

açúcar como de outras sequências de gramíneas analisadas, não apresentam o

motivo de ligação ao PCNA na sua porção C-terminal, o que deve afetar o seu

mecanismo de ação na célula vegetal.

A existência desses dois subtipos de FEN1 está além do que se tem

anotado nos bancos de dados, como pode ser observado nas árvores

filogenéticas a qual duplicações de FEN1 com evidentes diferenças estruturais

(tamanho e presença/ausência do motivo de interação com PCNA) estão

distribuídas entre os representantes de dicotiledôneas e monocotiledôneas. Isso

monstra como é imprescindível maiores pesquisas concernente a FEN1A e

FEN1B, para melhor entender as funções e mecanismos a qual esses dois tipos

de Flap Endonucleases 1 exercem no metabolismo do DNA dos organismos

vegetais.

5.1.7. POLLambda.

As DNA polimerases da Família X estão envolvidas principalmente nas

vias de reparo e recombinação de DNA (RAMADAN et al., 2004; ROY et al.,

143

2011). A DNA polimerase λ de mamífero (Pol λ), um membro da família X

recentemente identificado, estaria difundida entre eucariontes superiores, tanto

em animais como em plantas. O DNA Pol λ humana é uma DNA polimerase que

compartilha um alto grau de homologia de sequência com o DNA Pol β de

mamífero (34% de identidade de aminoácido com Pol β humano). DNA Pol β tem

sido o membro mais extensivamente estudado desta família e foi demonstrado

que desempenha um papel essencial na etapa de síntese de DNA, no

preenchimento das lacunas (gaps) na via BER, mais precisamente na via curta

de BER (SINGHAL et al. 1995). Estudos com extratos de fibroblastos

embrionários de camundongos indicaram que a DNA Pol λ de mamíferos possui

a atividade da dRP liase (5´-desoxirribose fosfato liase) in vitro, sugerindo que

tal polimerase poderia ter função na via BER tal como a Pol β (GARCÍA-DÍAZ et

al., 2001).

Estudos demonstraram a existência de um homólogo de DNA Pol λ de

mamífero em arroz (UCHIYAMA et al., 2004) e Arabidopsis (GARCÍA-DÍAZ et

al., 2000). Aliás, análises genômicas em arroz e Arabidopsis sugeriram que o

DNA Pol λ poderia ser o único membro da família X em plantas superiores, já

que nenhuma sequência Pol-β foi identificada em genomas de plantas até o

momento. Portanto, em vegetais, o DNA Pol λ parece substituir a função de Pol

β para desempenhar um papel fundamental no reparo e recombinação de danos

no DNA nuclear.

Em relação a DNA polimerase λ, pode-se observar que as sequências

de plantas referentes a essa enzima possuem o domínio conservado da

superfamília da Polimerase Beta (β), contudo as sequências de gramíneas

exibiram uma diferença relacionada a presença de um domínio BRCT que não

foi previsto para a polimerases de Arabidopsis. Essas diferenças podem culminar

em discrepâncias nos mecanismos catalíticos dessas polimerases, contudo,

mais estudos voltados para caracterização bioquímica seriam necessários para

tecer inferências com maior certeza sobre a implicações dessas diferenças

estruturais.

144

5.1.8. TDP1.

A TDP1 (tirosil-DNA fosfodiesterase 1) é uma enzima especializada em

hidrolisar a ligação fosfodiéster entre um resíduo de tirosina e o 3´-fosfato do

DNA no complexo DNA-TOP1 (topoisomerase I) (YANG et al., 1996). O TDP1

foi identificado pela primeira vez em Saccharomyces cerevisiae (POULIOT et al.,

1999).

A proteína TDP1 pertence à superfamília de PLD (fosfolipase D), que

compreende proteínas que são onipresentes em bactérias, leveduras, plantas e

mamíferos (PONTING & KERR, 1996). Uma estrutura universal na superfamília

PLD é um motivo HKD catalítico repetido [HXK (X) 4D (X) 6 GSXN], que surgiu

como resultado de um evento de duplicação gênica (POULIOT et al., 1999;

INTERTHAL et al., 2001). Esses motivos de HKD têm resíduos altamente

conservados de histidina (H) e lisina (K) (INTERTHAL et al., 2001; DAVIES et

al., 2003; DAVIES et al., 2002; INTERTHAL et al., 2005; DAVIES et al., 2002b),

algo que é observado nas sequências presumíveis de TDP1 analisadas.

AtTDP é um ortólogo de TDP1 humano em Arabidopsis (LEE et al., 2010)

e ao contrário das proteínas TDP1 de levedura e humanas, essa enzima consiste

em dois domínios: um domínio SMAD / FHA (associado a forkhead) na região N-

terminal e um domínio TDP na região C-terminal. Percebe-se que sequência de

Setaria italica, Oryza sativa e a presumível sequência de TDP1 de cana-de-

açúcar exibiram o domínio FHA (Forkhead associated domain) na sua região N-

terminal. Tal fato indica a preservação da estrutura das sequências e possível

atividade catalítica funcional das mesmas.

5.1.9. DNA ligase 1 e DNA ligase 4.

As DNA ligases desempenham papéis essenciais em todos os

organismos, mantendo a estrutura física do DNA. Essas enzimas selam as

lacunas no esqueleto de açúcar-fosfato do DNA (uma reação dependente de

ATP) que surgem durante a replicação, danos e reparo do mesmo (WU et al.,

2001). Exemplo da importância dessas enzimas seria a DNA ligase 1 (LIG1) que

é um gene essencial com fenótipos knockout letais em leveduras, células de

145

mamíferos e Arabidopsis (JOHNSTON, 1979; PETRINI et al., 1995;

WATERWORTH et al., 2009).

O genoma de Arabidopsis codifica quatro DNA ligases: AtLIG1, AtLIG1a,

AtLIG4 e AtLIG6 (SUNDERLAND et al., 2006). A AtLIG1 realiza a reação de

ligação na replicação e no reparo por excisão de bases do DNA, enquanto o

AtLIG4 é responsável pela ligação do DNA na via de união de extremidade não-

homóloga (Non-homologous end joining - NHEJ) na resposta ao dano ao DNA

(TAYLOR et al., 1998; WATERWORTH et al., 2009; CÓRDOBA-CAÑERO et al.,

2011; WEST et al., 2000; VAN ATTIKUM et al., 2003). Não há papéis relatados

para AtLIG1a e AtLIG6 (LI et al., 2015b). AtLIG6 foi clonado a partir de arroz e

Arabidopsis (IKEDA et al., 2011; KINOSHITA et al., 2004), embora a função em

planta desta DNA ligase continua a ser indeterminada. Análises de transcriptoma

revelaram que o AtLIG1a provavelmente não é expresso, indicando que o AtLIG1

pode ser a única fonte de atividade da DNA ligase I em Arabidopsis (CÓRDOBA-

CAÑERO et al., 2011).

Além do que, A DNA LIGASE I de Arabidopsis (AtLIG1) é co-localizada

com ROS1, ZDP e APE1L in vivo (LI et al., 2015b). Ademais, LI et al. (2015b)

discutem que o AtLIG1 é essencial para a desmetilação e ativação dos genes

maternamente impressos FWA e MEA no endosperma, sendo que seus dados

sugerem que AtLIG1 é a principal DNA ligase que funciona na última etapa da

desmetilação ativa do DNA em Arabidopsis.

A DNA ligase 1 de Arabidopsis e das gramíneas estudadas demonstraram

preservação do domínio das DNA ligases dependentes de ATP

(DNA_LIGASE_A3, destacado em verde na figura) e dos sítios essenciais para

a funcionalidade adequada da enzima. A árvore filogenética para essa DNA

ligase exibiu duplicações dentro do grupo constituído pelas dicotiledôneas sendo

um reflexo da existência dos dois tipos previstos de DNA ligase 1 já

documentado em Arabidopsis: AtLIG1, AtLIG1a.

Em relação DNA ligase 4, percebe-se diferenças entre as sequências das

gramíneas com relação a Arabidopsis, pela presença de domínios como:

DNAL4, DNA_ligase_A_N e Adenylation_DNA_ligase_like. Aliás, nota-se que a

maioria das sequências apresentam o domínio BRCT, que como já foi discutido,

146

seria um domínio que envolveria a interação proteína-proteína, estando presente

em numerosas proteínas envolvida das no reparo do DNA e no controle do ciclo

celular (CALLEBAUT & MORNON, 1997). Os domínios BRCT das DNA ligase IV

humana e S. cerevisiae seriam aonde estariam presentes os sítios de ligação

das proteínas XRCC4 e LIF1 (CRITCHLOW et al., 1997; HERRMANN et al.,

1998), logo a preservação desses domínios nas sequências analisadas,

principalmente na presumível sequência de DNA ligase IV de cana-de-açúcar,

indica a manutenção de interações essenciais para o desempenho adequado da

função da enzima no contexto celular.

5.1.10. ZDP.

Em eucariotos, a classe da enzima polinucleotídeo quinase 3' -fosfatase

(PNKP) humana trata-se de uma proteína bifuncional que atua como uma

fosfatase na remoção de lesões bloqueadoras de 3'-fosfato, bem como uma

quinase na restauração dos terminais 5 '-fosfato. (KARIMI-BUSHERI et al., 1999,

JILANI et al., 1999). Embora totalmente competente na restauração de

terminações propensas a reparo, a PNKP humana é, por si só, incapaz de

localizar locais danificados de DNA (PETRUCCO et al., 2002).

A primeira enzima vegetal que catalisa o reparo de lesões de DNA 3´-

bloqueadas foi identificada no milho (BETTI et al., 2001). Além disso, tendo em

vista que FPG e OGG1 são necessários para a manutenção de níveis ótimos de

8-oxoG via BER em extratos de células de Arabidopsis, e que plantas mutantes

deficientes em ambas enzimas apresentam aumento do dano oxidativo ao DNA

(CÕRDOBA-CAÑERO et al., 2014). Somado a isso, Cõrdoba-Cañero et al.

(2014) mostraram que o DNA 3´-fosfatase ZDP (zinc finger DNA 3´-

phosphoesterase) e a ARP (AP endonuclease apurinic endonuclease redox

protein) estão envolvidas no processamento das extremidades 3´-bloqueados

gerados durante a reparação 8-oxoG e que ambos são necessários para manter

a capacidade de germinação após condições de deterioração da semente. Além

disso, outro trabalho demonstrou que ZDP é necessário para a desmetilação do

DNA mediada por ROS1 em Arabidopsis (MARTÍNEZ-MACÍAS et al., 2012).

No trabalho de Petrucco et al. (2002) foi caracterizada a enzima

denominada AtZDP para a DNA polinucleotideo 3´-fosfoesterase de Arabidopsis

147

thaliana, sendo uma proteína modular multifuncional com um domínio 3'-

fosfoesterase C-terminal e um domínio de ligação ao DNA da porção N-terminal

contendo PARP-like zinc finger, conhecido por estar envolvido no

reconhecimento da quebra de fita dupla em células eucarióticas (GRADWOHL

et al., 1990; IKEJIMA et al., 1990; PETRUCCO, 2003). O domínio Zf-PARP

(PARP zinc finger), foi somente encontrado na sequência de A. thalina e de

Sorghum, item 4.1.11. Ademais, nas sequências dos organismos advindo da

família Poaceae, foi encontrado na sua porção C-terminal o domínio da

superfamília PNK3P, que envolve as polinucleotideos kinases 3 fosfatases,

incluindo a ZDP, contudo na sequência de Arabidopsis nessa referida porção

exibe o domínio HAD_like. Essas mudanças levantam dúvidas referente ao

modo de ação da ZDP nas plantas, evidenciando a necessidade de mais estudos

nessa área.

5.1.11. PCNA1 e PCNA2.

O antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) é uma das proteínas

mais importantes em células eucarióticas. Estudos sobre o PCNA demonstraram

que ele desempenha um papel crucial não apenas na replicação do DNA, mas

também no reparo do DNA, regulação do ciclo celular e apoptose (MOLDOVAN

et al., 2007) Análises detalhadas dos PCNAs de levedura e animal levaram à

identificação e caracterização de mais de 50 proteínas de interação com PCNA

(KELMAN, 1997).

Em Arabidopsis, existem duas PCNAs, assim chamadas de AtPCNA1 e

AtPCNA2, a qual diferem uma da outra em 8 aminoácidos, além de que

AtPCNA2 possuir um resíduo a mais, no comprimento da proteína (ANDERSON

et al., 2008). Desses 8 aminoácidos distintos, em AtPCNA1 em relação a

AtPCNA2, foi avaliado que quatro destes são idênticos aos resíduos encontrados

em PCNAs de Brassica napus e em humano, sendo que nestes PCNAs, esses

aminoácidos, exibiram função em leveduras mutantes que não dispunham de

PCNAs funcionais (MARKLEY et al., 1997; WASEEM et al., 1992).

Anderson et al. (2008) demonstraram que é necessário a co-expressão

de POLH (DNA polymerase eta - Pol η) e AtPCNA2 (e não AtPCNA1) para

restaurar a resistência normal a radiação UV no mutante RAD30 em levedura. A

148

diferença se deu na lisina 201 presente na AtPCNA1 que inibiria a ubiquinação

da lisina 164, afetando assim a ligação desta com a Pol η e assim não sendo

capaz de atuar na TLS (translesion synthesis - síntese por translesão) e restaurar

a progressão da forquilha de replicação. A lisina (lys) na posição 201 da

AtPCNA1 pertenceria ao grupo composto por aminoácidos com cadeias laterais

eletricamente carregados, no caso da lys essa seria dotada de carga positiva, já

o correspondente na AtPCNA2 seria uma asparagina (Asn) que pertenceria ao

grupo de aminoácidos com cadeias laterais polares sem serem dotados de

carga. Em PCNA_CANA, o resíduo em questão correspondente seria uma

glutamina que concerne ao mesmo grupo que a Asn, o que leva a concluir que

a PCNA de cana-de-açúcar seria mais próxima AtPCNA2 do que a AtPCNA1 e

poderia, como tal, atuar no TLS.

Nas árvores filogenéticas e na árvore consenso da inferência bayesiana

observa-se a ocorrência de várias duplicações de sequências, tanto em

dicotiledôneas quanto em monocotiledôneas. Essas duplicações em PCNA

indicam que embora seja uma proteína conservada entre os seres vivos,

variações em apenas alguns resíduos podem gerar funções diferentes na célula,

como já mencionado em relação a AtPCNA1 e AtPCNA2.

5.1.12. PARP1 e PARP2.

As proteínas da família PARP estão presentes em todos os eucariotos,

exceto levedura. Eles são caracterizados por possuírem um domínio PARP

(KARLBERG et al., 2013). O membro mais estudado desta família de proteínas

é o seu membro fundador PARP1 humano (HsPARP1). Ativada por quebras da

cadeia do DNA, o HsPARP1 forma cadeias de poli (ADP-ribose) ligadas as

moléculas de ADP-ribose de proteínas nucleares, incluindo ele próprio, usando

NAD+ como substrato. Esta modificação rápida e transitória da proteína ativaria

a maquinaria de reparo de DNA (PINES et al., 2013). Em humanos, a família

PARP compreende 17 membros dos quais nem todos têm atividade PARP

(KARLBERG et al., 2013; PINES et al., 2013).

Na planta modelo Arabidopsis thaliana foram identificadas três proteínas

PARP canônicas, PARP1, PARP2 e PARP3 (LEPINIEC et al., 1995;

149

BABIYCHUK et al., 1998; DOUCET-CHABEAUD et al., 2001; HUNT et al., 2004).

Sabe-se que esses membros da família PARP possuem propriedades que estão

atreladas a melhoraria das respostas ao estresse vegetal (DE BLOCK et al.,

2005; JANSEN et al., 2009; GEISSLER & WESSJOHANN, 2011; SCHULZ et al.,

2012). Os PARPs estão envolvidos no reparo de DNA, crescimento de plantas,

germinação de sementes, tolerância a estresse abiótico e biótico (DE BLOCK et

al., 2005; VANDERAUWERA et al., 2007; ISHIKAWA et al., 2009; SCHULZ et al.

2012; JIA et al., 2013; LIU et al. 2014, RISSEL et al., 2014, SCHULZ et al., 2014,

FENG et al., 2015, PHAM et al., 2015, SONG et al., 2015, ZHANG et al., 2015).

Semelhante às suas contrapartes humanas, as proteínas PARP da Arabidopsis

desempenham um papel nas respostas de danos ao DNA e na manutenção da

integridade do mesmo em várias circunstâncias. Assim, eles medeiam o reparo

do DNA, mas também desencadeiam a morte celular programada, em resposta

ao estresse oxidativo do genoma (AMOR et al., 1998), e a expressão de PARP1

e PARP2 é induzida por radiação ionizante (DOUCET-CHABEAUD et al., 2001).

Consequentemente, mutantes knockout para ambos os genes são

hipersensíveis a agentes que danificam o DNA (JIA et al., 2013; BOLTZ et al.,

2014; SONG et al., 2015; ZHANG et al., 2015). Ambas as proteínas

demonstraram estar associadas à cromatina (BABIYCHUK et al., 2001) e

estarem envolvidas em uma via alternativa de junção de DNA não homóloga (JIA

et al., 2013). A atividade enzimática poli (ADP-ribosil) de PARP1 e PARP2 de

Arabidopsis já foi demonstrada e confirmada (BABIYCHUK et al., 1998; FENG

et al., 2015).

A AtPAPR1 apresenta três módulos funcionais: o domínio de ligação N-

terminal, que agiria como um sensor de "nick" (fresta/sulco) sendo responsável

pela localização nuclear. O domínio central de auto-modificação que contém o

domínio BRCT, sendo nesse modulo onde ocorre o recrutamento de enzimas

associadas a via BER. O terceiro domínio seria o domínio catalítico C-terminal,

sendo o mais conservado entre as PARPs (DOUCET-CHABEAUD et al., 2001).

O primeiro domínio (N-terminal) é caracterizado pela presença do Zinc-finger e

o domínio SAP, relacionados com a ligação ao DNA, sendo observado isso nas

sequências analisadas de PARP1 e 2 das gramíneas e de Arabidopsis, também

foi possível evidenciar o domínio central, com o BRCT, presente no PARP1 mas

150

não no PARP2, e o domínio funcional C-terminal catalítico, composto por

domínio alfa-helicoidal da PARP e PARPcatalytic.

Com relação as árvores filogenéticas geradas, nota-se que PARP2

apresenta anotações no Uniprot da existência de subtipos, precisamente nas

gramíneas, apesar de não se ter respaldo em trabalhos publicados. A diferença

estrutural desses subtipos se dá pela presença ou ausência de domínios e

diferenças de tamanhos, sendo chamados de :PARP2-A e PARP2-B. Devido a

isso, foi observado duplicações de sequências nas árvores que tem como foco

a proteína PARP2 (figura 45), sendo que essas duplicações estavam além das

gramíneas, se abrangendo para espécies do grupo da dicotiledônea, tais como

as famílias Brassicaceae e Malvaceae.

5.1.13. XRCC1.

Em células de mamíferos, a proteína XRCC1 desempenhe um papel

central na via curta de BER (TEBBS et al., 1999; DOGLIOTTI et al., 2001;

CALDECOTT, 2003).

Os homólogos de plantas XRCC1 foram identificados em Arabidopsis

(TAYLOR et al., 2002) e arroz (UCHIYAMA et al., 2008). Embora as proteínas

XRCC1 de mamíferos e outros vertebrados possuam um domínio N-terminal e

dois domínios BRCT (BRCT1 e BRCT2), a XRCC1 de Arabidopsis contém

apenas os domínios BRCTs, que exibe um alto grau de conservação de

sequência em todos os homólogos de XRCC1 (TAYLOR et al., 2002; UCHIYAMA

et al., 2008). Pode-se observar que as sequências de gramíneas estudadas, item

4.1.14, também apresentaram o domínio BRCT, contudo, apenas um, ao invés

de dois como exibido na sequência de Arabidopsis. Ademais, Martínez-Macías

et al (2013) relataram que XRCC1 de Arabidopsis interage com ROS1 e ZDP e

estimularia suas atividades enzimáticas in vitro, logo sugerem que a XRCC1

funcionaria durante a desmetilação ativa do DNA em Arabidopsis, esse fato

demonstra o quão é importante aprofundar os estudos das proteínas

pertencentes a BER, atreladas ao sistema epigenético, para ampliar o

151

conhecimento a cerca desses mecanismos de ação para outros organismos

vegetais além da planta modelo Arabidopsis thaliana.

5.1.14. WRN.

As helicases RecQ desempenham um papel importante na manutenção

da estabilidade do genoma (KAROW, et al., 2000; COBB et al., 2002; CHU et al.,

2009). Em humanos, várias doenças hereditárias foram correlacionadas com

mutações em helicases RecQ-like (ELLIS et al., 1995; YU et al., 1996; KITAO et

al., 1999). A doença mais proeminente é a síndrome de Werner (WS), uma

desordem genética autossômica recessiva caracterizada pelo início precoce do

envelhecimento (YU et al., 1996; OSHIMA et al., 2017) e anormalidades

genômicas, como rupturas cromossômicas, translocações cromossômicas

recíprocas (SALK et al., 1981) e deleções genômicas. (FUKUCHI et al., 1989). A

proteína Werner (hWRN-p), responsável pela WS, possui atividades de 3'-5´

exonuclease e 3´-5´ helicase (SHEN et al., 1998; KAMATH-LOEB et al., 1998),

sendo, então, pertencente à família das helicases RecQ.

Proteínas do tipo WRN também foram detectadas em camundongos (WU

et al., 1998) e Xenopus laevis (YAN et al., 1998). Foi identificamos sete

homólogos da família RecQ em Arabidopsis thaliana (HARTUNG et al., 2000).

No entanto, nenhum gene que codifica o homólogo completo da proteína WRN

foi encontrado no genoma desse organismo. Em vez disso, foi detectado um

pequeno ORF (AtWRNexo) codificando 285 aminoácidos, que mostrava uma

notável semelhança com o domínio de exonuclease da proteína da síndrome de

WS (HARTUNG et al., 2000).

As sequências de plantas, item 4.1.15, mostraram que exibem o domínio

da superfamília DNAQ_like_exo, a qual envolve a DNA helicase RecQ e a

própria WRN. Entretanto, existem poucos trabalhos na literatura voltada para

essa proteína, principalmente em plantas.

152

5.2. Duplicações de sequências de componentes de BER nos

organismos vegetais.

No trabalho de Singh et al (2010), por meio da comparação de genomas

vegetais disponíveis na época, tendo como objetivo comparar os genes que

estariam envolvidos no reparo e recombinação do DNA, foi encontrado que

FEN1 (flap endonuclease 1), no genoma de monocotiledôneas analisadas

(milho, arroz, Sorghum e Brachypodium) apresentaram duas copias dessa

endonuclease e que tais copias não seriam produtos de duplicações

intragenômicas. De fato, essas copias seriam os subtipos de FEN1: FEN1A e

FEN1B identificados nesse trabalho. Singh et al. (2010) também identificaram

apenas uma cópia FEN1 em dicotiledôneas, a saber Arabidopsis, Medicago

truncatula, Vitis venifera e Papaver somniferum, contudo Glycine max

apresentou duas copias de FEN1, sendo que nesse caso, tais copias seriam

produtos de duplicação intragenômica, ou seja, uma das cópias de um gene

duplicado (FEN1) está livre de restrições seletivas (uma vez que a outra cópia

fornece a função), permitindo assim que nessa cópia substituições ocorram e

novas funções sejam geradas. De forma geral, as árvores filogenéticas

demonstraram diferenças quanto presença ou não de duplicação de sequências

de componentes da via BER, existem casos que a duplicação foi observada nas

dicotiledôneas e não nas monocotiledôneas, exemplo do caso da NTH, PCNA e

DNA ligase 1, essa diferença observada, somada com diferenças estruturais

(tamanho, presença ou ausência de determinados domínios conservados)

indicaria uma diferença nos mecanismos de reparo de DNA entre as plantas.

Em trabalho anterior, foi discutido que um evento de duplicação do

genoma como um todo (WGD) estaria relacionado com a duplicação observada

para a sequência de AP endonuclease no grupo das gramíneas (MAIRA et al.,

2014), no trabalho aqui apresentado observa-se que duplicações estão

presentes em outros grupos vegetais além da Poaceae.

Sabe-se que o destino da grande maioria dos genes duplicados

decorrentes da duplicação segmentar é a não-funcionalização de um membro

do par (LYNCH & CONERY 2000, 2003a, 2003b) e isso deveria ocorrer dentro

de alguns milhões de anos na ausência de qualquer vantagem intrínseca da

153

cópia duplicada (WATTERSON 1983; LYNCH et al., 2001). Além disso, levando-

se em conta a grande variedade de tamanho dos genomas vegetais (como A.

thaliana e cana-de-açúcar, por exemplo) e a existência de eventos de WGD que

ocorreram diversas vezes na história das plantas, pressupõem-se que a

diminuição do tamanho desses genomas estaria atrelada ao fenômeno de

diploidização. Este fenômeno trata-se de processos que retornam um genoma

poliploide a um genoma de tipo diploide. A diploidização pode incluir perda de

genes duplicados e cromossomos, perda de DNA repetitivo e silenciamento

gênico (SOLTIS et al., 2015). Apesar disso, a maioria dos genomas que foram

estudados contém muitos genes duplicados, alguns dos quais são claramente

bastante antigos (LYNCH & CONERY, 2000).

Com base nessa observação, vários mecanismos foram propostos para

tentar explicar a preservação de genes duplicados (HUGHES, 1994; FORCE et

al., 1999; LYNCH et al., 2001; TAYLOR & RAES, 2004; LYNCH, 2007; INNAN &

KONDRASHOV, 2010): Alguns desses mecanismos seria: (1)

neofuncionalização, pelo qual uma cópia adquire uma nova função benéfica em

relação a função ancestral essencial; (2) subfuncionalidade, partição da função

ancestral; (3) seleção para aumento do produto genético; e (4) o mascaramento

de alelos não funcionais. Uma outra explicação simples para o grande número

de duplicações preservadas nos poliploides seria que, ao contrário das

duplicações de um único gene, as duplicações oriundas do WGD exibem uma

conservação completa das sequências reguladoras circundantes, ambientes

cromossômicos, etc. Embora isso possa contribuir um pouco para o padrão de

retenção em poliploides, não explica a observação de que diferentes tipos de

genes parecem estar preservados após WGD em comparação com duplicações

em menor escala. Este fato pode ser melhor explicado pela seleção do equilíbrio

da dosagem entre as proteínas. Devido às relações estequiométricas com outros

genes que interagem entre si (por exemplo, complexos multi-subunidades e

inúmeras vias envolvidas no metabolismo e regulação transcricional), as funções

de um subconjunto de loci codificadores de proteína podem ser altamente

influenciadas por desequilíbrios de dosagem (VEITIA, 2002; PAPP et al., 2003,

BIRCHLER et al., 2005; VEITIA et al., 2008).

154

Tendo em vista os genomas das plantas, especificamente, existem, em

média, 65% dos seus genes anotados que apresentam uma duplicação

(PANCHY et al., 2016). A maioria dessas cópias são derivadas de WGDs

consistente com a prevalência de eventos de paleopoliploidização na linhagem

de planta terrestre (PANCHY et al., 2016). Li et al. (2016) investigaram o destino

de genes duplicados de 40 diferentes espécies de plantas com flores, a qual

todas experimentaram pelo menos um ou mais eventos WGD ao longo de sua

história evolutiva. Foi observado a perda de genes logo após a duplicação do

genoma como um todo, de forma que os genes, rapidamente, retornaram ao

estado de única cópia (LI et al., 2016). Entretanto, alguns desses genes

preservaram o seu estado de multiplicas copias. Tais genes pertencem a famílias

de genes envolvidas na resposta a estresse biótico e abiótico, logo, sendo

importantes para a adaptação do vegetal ao ambiente. Desta forma, pode-se

correlacionar a duplicação e retenção dessas cópias com uma vantagem

adaptativa que tais genes podem conferir a planta, permitindo que esta possa

atuar de forma mais eficiente em reposta as variações ambientais. Os genes de

reparo estariam atrelados a essa hipótese, já que são necessários para

manutenção da estabilidade do genoma e preservação da informação genética,

além de que, muitos dos seus membros, já descritos nesse trabalho, atuam em

outros processos de importância adaptativa como a epigenética.

A preservação das duplicações observadas nesse trabalho poderiam ser

decorrentes de diversos fatores, no caso da ScARP1 foi postulado, em relação

a sua duplicação ScARP3, que haveria uma subfuncionalização, pois elas

apresentam padrões de expressão diferenciado e foi previsto que também

estariam direcionadas para organelas citoplasmáticas distintas (MAIRA et al.,

2014), o mesmo pode ocorrer com as sequências aqui estudas que exibiram

duplicações encontradas nas árvores filogenéticas, contudo um estudo mais

detalhado sobre as mesmas se faz necessário para tecer uma melhor hipótese

sobre o fato.

Em cana-de-açúcar, bem como em outros organismos vegetais, que não

as plantas modelos, exibem poucos trabalhos focados na caracterização e

analise estrutural de componentes individuais de vias metabólicas. Trabalhos

como de Manners e Casu (2011), a qual fizeram uma análise de genômica

155

funcional do transcriptoma de cana-de-açúcar, além de discutir as técnicas

empregadas para proporcionar um estudo genômico nesse organismo vegetal,

são escassos e corroboram para uma visão geral dos processos, deixando

lacunas na discussão mais restritas a determinados genes. Ademais, deve-se

levar em consideração que a estratégia tradicional de melhoramento está ficando

para trás da demanda da necessidade comercial devido à falta de conhecimento

sobre características relacionadas à tolerância ao estresse, falta de técnicas de

seleção eficientes e baixa variação genética e fertilidade (RODRÍGUEZ et al.,

2005). A evidente carência biotecnológica será suplementada com estudos

voltados para caracterização bioquímica e funcional de vias importantes e de

seus componentes, como a via de reparo de DNA, a exemplo desse trabalho da

via BER. Isso demonstra a importância dos resultados aqui demonstrados e sua

potencial aplicabilidade no melhoramento vegetal. Além disso, deve-se frisar a

importância desse trabalho para além da cana-de-açúcar, suplementando

informações e levantando questões sobre os componentes da via BER e sua

relação filogenética para os organismos vegetais, de forma geral.

5.3. Análise dos modelos de PCNA e FEN1 de cana-de-açúcar.

A proteína Antígeno Nuclear da Proliferação Celular (PCNA - Proliferating

cell nuclear antigen) comumente chamado de "grampo deslizante" (sliding

clamp) serve como plataforma de ancoragem para muitas proteínas envolvidas

no metabolismo de DNA. Outros estudos em PCNA demonstraram que essa

proteína desempenha um papel crucial não só na replicação do DNA, mas

também no reparo do mesmo, na regulação do ciclo celular e na apoptose

(MOLDOVAN et al., 2007). Tendo em vista que os reinos os quais são divididos

os seres vivos se distanciaram um do outro desde os tempos antigos, o

mecanismo mais básico responsável pela a replicação do DNA parece estar

altamente conservada entre todos os organismos. O melhor exemplo disso foi a

identificação de genes de PCNA e a conservação de sua sequência entre

diferentes espécies tais como leveduras: fermento de broto (Saccharomyces

cerevisiae) (BAUER & BURGERS, 1990) e levedura de fissão

(Schizosaccharomyces pombe) (WASEEM et al., 1992); animais: humano

156

(ALMENDRAL et al.,1987), rato (MATSUMOTO et al., 1987), camundongo

(YAMAGUCHI et al., 1991) e Drosophila (YAMAGUCHI et al., 1990); plantas:

cenoura (HATA et al., 1992), milho (LOPEZ et al., 1995; LÓPEZ et al., 1997)

arroz (SUZUKA et al., 1991) e feijão comum (STRZALKA & ZIEMIENOWICZ,

2007); bem como archaeon: Pyrococcus furiosus (CANN et al., 1999). O modelo

presumível de cana-de-açúcar também exibe uma alta similaridade com as

sequências de PCNAs de Arabidopsis thaliana e humana, tendo em vista que

tais sequências apresentam cristais depositados no banco de dados do PDB

(Protein Data Bank) (STRZALKA et al., 2009; SAKURAI et al., 2005; GULPIS et

al., 1996; PUNCHIHEWA et al., 2012; KONTOPIDIS et al., 2005).

A conservação da sequência e de estrutura tridimensional indicaria que a

proteína PCNA de cana-de-açúcar poderia substituir uma proteína PCNA em

outro organismo. Experimentos foram feitos anteriormente tendo essa

perspectiva, foi utilizado PCNAs de Drosophila e de levedura que mostraram

serem capazes de funcionalmente substituir o PCNA de mamífero em ensaios

de replicação de DNA (BAUER et al., 1988). Em relação a plantas, também foi

demonstra que um PCNA recombinante de arroz estimulou a atividade

enzimática da DNA polimerase δ de células humanas (MATSUMOTO et al.,

1994). Outro estudo demonstrou que PCNA oriundas de mamíferos foram

capazes de estimular a atividade e processividade de duas polimerases δ de

trigo (LAQUEL et al., 1993).

A proteína FLAP ENDONUCLEASE 1 (FEN1) é altamente conservado

entre as espécies. A importância da FEN1 pode ser observada no caso de ratos

com deleção da referida enzima o que resultou em serem embrionariamente

letais e hipersensíveis à radiação gama (LARSEN et al., 2003). Por outro lado,

os mutantes homozigotos fen1 nas células DT40 de frango eram viáveis, mas

eram sensíveis ao metil metanossulfonato (MMS - methyl methanesulfonate) e

aos agentes oxidativos que danificavam o DNA (MATSUZAKI et al., 2002). No

entanto, a nossa compreensão da FEN1 no reino das plantas é limitada.

A conservação da sequência, principalmente dos sítios de ligação ao

DNA, a metais e motivos de interação com proteínas, como também a

preservação da conformação tridimensional da proteína, oferece respaldo para

157

corroborar com a possibilidade de a atividade enzimática das sequências de

cana-de-açúcar aqui discutidas (PCNA e FEN1) terem funcionalidade real. Aliás,

Maíra et al. (2014) geraram modelos 3D de ScARP1 sendo que este serviu de

base para a formulação do trabalho aqui apresentado, o que demonstra a

importância dessas análises in silico para a formulação de futuros estudos in vitro

e in vivo.

A interação observada entre os modelos PCNA e FEN1 de cana-de-

açúcar demonstra a possível conservação do mecanismo de ação de ambas as

proteínas para a promoção de processos como reparo e replicação do DNA. Tal

proposta, confere uma maior compreensão desses referidos processos em

plantas, levantando a possibilidade de conservação dos mesmos no reino

Plantae.

5.4. Caracterização enzimática de ScARP1.

Atualmente, deve-se ampliar a visão acerca da via de reparo BER, já que

esta não estaria unicamente relacionada com a manutenção da integridade do

genoma (FENG et al., 2010; BELLACOSA & DROHAT, 2015). O mecanismo de

reparo pode estar associado também a outras vias necessárias para a planta

desencadear uma resposta adequada ao estresse presente no ambiente.

Estresses ambientais podem ocasionar um aumento na concentração de

espécies reativas de oxigênio (EROs) em células vegetais, esses acréscimos

ocorrem, por exemplo, em condições como alta concentração de sal, seca,

estresses combinados (seca seguida de inundação), contaminação do solo por

metais pesados, baixas temperaturas que poderem acarretar congelamento no

solo (BURDON et al., 1996; DEMIDCHIK, 2015; DAS & ROYCHOUDHURY,

2016; FOYER et al., 2017) e em combinação com alta incidência de luz e frio

(MICHAELI et al., 2001; HASANUZZAMAN, 2013; DAS & ROYCHOUDHURY,

2014). Os EROs seriam originados da cadeia transportadora de elétrons na

mitocôndria, além disso, em vegetais (especificamente), existe a adição da

reação de fotossíntese, no cloroplasto, que resulta na produção de superóxido e

oxigênio singlet, principalmente quando a taxa de fixação de carbono é baixa e

limitada pelo suprimento de CO2 e a temperatura (DEL RÍO, 2015).

158

Os EROs podem atuar também como um sinal de vida ou morte,

dependendo do contexto molecular e celular em que as espécies reativas de

oxigênio se acumulam. Os resultados dessa sinalização dependem de muitos

parâmetros, principalmente a natureza química da forma EROs produzida (ou

seja, superóxido, peróxido de hidrogênio ou oxigênio singlet) e a natureza do

parceiro interativo (proteína tiol, metabólito, lipídios ou molécula de DNA), bem

como a identidade celular, mas todos os tipos de modificação oxidativa

(reversível ou irreversível) podem ser vistos como parte da matriz de sinalização

redox porque induzem respostas regulatórias, de reparo ou de morte.

Juntamente com a tensão do oxigênio celular, EROs controlam muitos aspectos

cruciais da biologia animal e vegetal, como também a proliferação celular, a

homeostase das células-tronco e o comprometimento da linhagem de

diferenciação (MOHYELDIN et al., 2010; BIGARELLA et al., 2014; DEL POZO,

2016; CONSIDINE et al., 2016).

No caso da molécula de DNA, estas espécies reativas de oxigênio podem

reagir, por exemplo, com a guanina gerando assim um produto denominado de

7,8-dihydro-8-oxoguanina (8-oxoguanina) que é altamente mutagênico

(SHIBUTANI et al., 1991). Para remoção dessa lesão na molécula de DNA, a

célula se utiliza de enzimas presentes na via BER (WILSON et al., 2003). Estas

enzimas seriam as DNA glicosilases que seriam responsáveis pela identificação

e catalise do processo de retirada da base danificada ou lesada, este processo

gera um sítio abásico que é corrigido por outras enzimas downstream da via

BER, incluindo a AP endonuclease. Além disso, essa mesma enzima (AP

endonclease) pode desempenhar também papeis de controle do processo da

epigenética, como já foi analisado em relação a proteína AtAPEL1 de

Arabidopsis que funciona a downstream das proteinas ROS1 e DME, enzimas

estas que estão envolvidas no processo de desmetilação do grupamento metil-

citosina da molécula do DNA (LI et al., 2015a).

Tendo em vista os perfis de expressão dos genes AP endonucleases

,AtARP, AtAPE1L e AtAPE2, diante do desenvolvimento do organismo vegetal

de Arabidopsis thaliana (figuras 16, 17, e 18) e dos homólogos dos mesmos

genes em Oryza sativa (figuras 19, 20 e 21), além dos dados referente a

expressão de ScARP1 (AP endonucleasde de cana-de-açúcar) advindo de Maíra

159

et al. (2014), foi possível observar o aumento de expressão, como indicado na

tabela 7, em diversas fases do desenvolvimento. Nota-se que os estágios

desenvolvimento com expressão mais proeminente nos diferentes organismos

analisados foi o meristema apical, etapas do desenvolvimento das folhas e do

órgão floral, desenvolvimento do embrião e a semente. Sabe-se que a via de

excisão de bases (BER), como já mencionado no parágrafo anterior, está

envolvido no processo de desmetilação, sendo que AP endonucleases atuariam

como intermediários nesse processo. AtAPE1L, juntamente com ZDP, mediaria

reações a jusante (downstream) das vias de desmetiação de DNA de ROS1 e

DME (LI et al., 2018a). AtAPE2, por sua vez, teriam funções que seriam

sobrepostas a função da proteína ZDP e, deste modo, teria ação na manutenção

do epigenoma e a estabilidade genética nas plantas (LI et al., 2018b). Ademais,

esses processos de desmetilações estão associados ao desenvolvimento das

plantas, como, por exemplo no desenvolvimento: do estômato (YAMAMURO et

al., 2014), controlado por auxina (ARIEL et al., 2014), do embrião (CHOI et al.,

2002; GEHRING et al., 2006), da germinação do pólen (SCHOFT et al., 2011),

do endosperma (ONO et al., 2012), diferenciação de nódulos (SATGE et al.,

2016) e amadurecimento de frutos (LIU et al., 2015; LANG et al., 2017). Logo, à

vista disso, pode-se associar o aumento de expressão observado nos perfis de

expressão com processos de desmetilação acoplados ao desenvolvimento

vegetal.

A sequência utilizada nesse estudo, AP endonuclease homóloga a AtARP

de A. thaliana em cana-de-açúcar, sendo denominada ScARP1, foi originada de

análises anteriores (MAIRA et al., 2014) a qual foi proposto a estrutura

tridimensional da enzima e se verificou in silico que essa provavelmente poderia

ter atividade AP endonuclease. Agora, os estudos in vitro apresentados aqui,

além de reafirmar resultados anteriores, complementam o entendimento de

como a AP endonuclease de cana-de-açúcar atua na célula vegetal, reforçando

a sua importância na maquinaria de reparo.

Em outros trabalhos foi demonstrado que a família ExoIII das AP

endonucleases presente em humanos (hAPE1), E. coli (Xth) e plantas (AtARP

de A. thaliana) são absolutamente dependentes de cátions divalentes,

tipicamente Mg+2, para desempenhar, de forma adequada, suas atividades

160

catalíticas (BABIYCHUK et al., 1994; ROGER & WEISS, 1980; KANE & LINN,

1981). Logo, dispondo de um substrato marcado com 5´-fluoresceina e THF

(Tetrahydrofuran) que mimetizava o sítio abásico natural, foi possível observar,

sob a presença de diferentes íons divalentes (MgCl2, MnCl2 e CoCL2) que a

enzima ScARP1 apresentou atividade AP endonuclease tanto na presença dos

íons divalentes Mg+2 quanto Mn+2, sendo que o íon manganês resultou em maior

atividade da enzima. Sabe-se que os cristais disponíveis para a AP

endonuclease humana reportam a presença de ligação com metais Mg+2, Pb+2

ou Sm+3 (BEERNINK et al., 2001; MANVILLA et al., 2013; GORMAN et al., 1997),

sendo que o pressuposto seria que estes são necessários para a cristalização

adequada da enzima wildtype (tipo selvagem) ou a versão que apresenta a

extremidade N-terminal truncada. He et al. (2014), a partir de análises de cristais

de AP endonucleases humana, notaram uma plasticidade do sitio de ligação a

metais. Ademais, foi demonstrado em outro estudo que Mn+2 poderia substituir,

efetivamente, Mg+2 para promover assim a catálise de APE1 (SHERMERHORN

& DELANEY; 2013). Além disso, He et al (2014) propuseram que existem três

resíduos (D70, E96 e D308) da enzima humana que são essências para

estabiliza-la, estes podem utilizar tanto Mg+2 quanto Mn+2, como pode ser

observado na tabela 3, nas sequências de plantas analisadas, apenas os

resíduos E96 e D308 exibem correspondências nas AP endonucleases vegetais.

Além do que, existem resíduos relacionados com ligação a metais nas

sequências de AtARP, AtAPE2 e ScARP1 que não exibem equivalência em

hAPE1 humana, tais como N282, H527 (AtARP), N7, H324 (AtAP2) e N56, H297

(ScARP1), desta forma, deve existir diferença quanto a dinâmica do sítio de

ligação a metais entre as enzimas de origem vegetal e humana.

Córdoba-Cañero et al. (2011), propuseram que AtARP seria a principal

AP endonuclease ativa nos extratos celulares de Arabidopsis, sendo requerida

para a via BER nos sítios de Uracil e AP (sítio abásico) sintético em análises in

vitro. Ainda no mesmo estudo, ao utilizar as enzimas AP liases de trabalhos

prévios (CORDOBA-CAÑERO et al., 2009) notou-se que essa fora incapaz de

substituir a função de AtARP nos extratos mutantes arp -/-, o que levou a

conclusão que a enzima AtARP apresentaria atividade 3´-fosfodiesterase que

removeria grupos 3´-blocking (ou 3´-PUA). Ademais, completando o resultado

161

anterior de Cordoba-Cañero, foi reportado que AtARP e AtAPE1L foram capazes

de processar lesões 3´blocking gerados por DME (DEMETER) (LEE et al., 2014).

Sabe-se que o genoma de A. thaliana codifica três proteínas AP

endonculeases-like: AtAPE1L, AtAPE2 e AtARP (MURPHY et al., 2009).

Analisando individualmente cada uma destas enzimas, conclui-se que todas

apresentam atividade AP endonuclease in vitro, contudo AtAPE1L também

dispõe uma atividade 3´-fosfatase e é capaz de processar a extremidade 3´- PUA

gerando assim como produto 3´-OH (LI et al., 2014). Aliás, essas três enzimas

quando alinhadas apresentam diferenças, como por exemplo, embora todas

possuíssem o domínio EEP, AtAPE2 e AtARP apresentam um domínio adicional

zinc-finger (ZF) e o domínio SAP DNA binding domain (domínio de ligação ao

DNA), respectivamente. Essas diferenças podem estar indicando que essas

enzimas poderiam ter funções tecido especificas em A. thaliana (LEE et al.,

2014).

A enzima ScARP1 foi colocada em contato com substratos com

extremidades 3´dispondo de: OH (hidroxila), P (fosfato) e PUA (Aldeído β,α-

insaturado) em ensaios in vitro. Os resultados obtidos mostraram que a proteína

de cana-de-açúcar foi incapaz de processar estes substratos, a não ser aquele

já relacionado com o sítio abásico (atividade AP endonuclease). Deve-se levar

em consideração que trabalhos anteriores se utilizaram do banco de dados

SUCEST-FUN (AGNEZ-LIMA et al., 2001) para a identificação de homólogos de

genes da via BER em cana-de-açúcar, obteve não só ScARP1 como homologo

a AtARP, como também ScARP3. A análise filogenética feita em um trabalho

prévio (MAIRA et al., 2014) propôs que essas duas ScARPs foram originadas de

um evento de duplicação total do genoma (WGD), o que poderia resultar também

em uma um processo de sub-funcionalização. Foi observado em Maira et al.

(2014) que estas duas sequências poderiam ter uma sinalização para

compartimentos celulares diferentes, porém essa sub-funcionalização também

poderia estar atrelada a uma divisão de funções, logo se ScARP1 não apresenta

todas as atividades enzimáticas descritas para AtARP, isto poderia sugerir que

ScARP3 teria tais características, ou ainda uma outra proteína de cana-de-

açúcar não-homóloga a AtARP.

162

Joldybayeva et al. (2014) clonaram e caracterizaram um homólogo em

trigo da hAPE1 humana e da AtAPE1L de A. thalina que eles denominaram de

TaApe1L. Como resultados eles observaram que a enzima de trigo exibia

atividades: AP endonuclease, 3´-fosfodiesterase, 3´-fosfatase e 3´->

5´exonuclease, sendo que a metodologia empregada foi diferente do que a

utilizada para ScARP1, pois Joldybayeva e colaboradores propuseram como

hipótese que se deve utilizar detergente não-iônico para estabilizar a proteína e

assim mantê-la ativa. Ademais, as diferenças dos resultados poderiam estar

relacionadas ao fato que ScARP1 é homólogo a AtARP e não da proteína

AtAPE1L de Arabidopsis.

A proteína hAPE1 humana é uma enzima multifuncional que possui

atividades 3´-> 5´exonuclease (CHOU, 2002; CHOU & CHENG, 2003),

fosfodiesterase (SUH et al., 1997) e RNase H (BARZILAY et al., 1995), além

disso, a proteína possui um domínio N-terminal, domínio REF1, envolvido na

regulação transcricional redox-dependente, sendo esse domínio dispensável

para a função em BER (TIMOFEYEVA et al., 2009). Porém, quando se compara

a sequência de aminoácidos entre AtARP e APE1 humana em um alinhamento

nota-se que existem diferenças entre eles, não sendo observado uma homologia

conclusiva na porção N-terminal (BRITT, 2002). Logo, essa diferença poderia

estar relacionada as discrepâncias encontradas nas funções, do mesmo modo

se comparado com a sequência de cana-de-açúcar, pois, a proteína ScARP1

também exibe diferenças em seu alinhamento com o seu homólogo AtARP

(MAIRA et al., 2014).

Embora tenha sido avaliado a atividade exonuclease de ScARP1 e

obteve-se um resultado negativo quanto a sua presença (item 4.6.3, figura 24a),

foi ponderado a sua existência se baseado na visualização de bandas menores

assinalando fragmentos menores de DNA nos geis de acrilamida de outros

ensaios (figura 22 e 23), o que seria um indicativo de uma atividade exonuclease.

Foi proposto uma hipótese para tentar explicar esse fenômeno observado: a

enzima (ScARP1), ao se associar ao DNA devido o reconhecimento do sítio

abásico artificial, permaneceria ali acoplado o que resultaria na promoção da

atividade exonuclease, de modo que, para que essa dita atividade ocorresse se

faz necessário, primeiramente, o acoplamento da proteína e sua permanência

163

no substrato, o que não ocorreria nos experimentos propostos para a avaliação

da presença da atividade exonuclease se utilizando de outro substrato distinto

do sítio abásico, logo, seria imprescindível mais experimentos e estudos para a

comprovação dessa hipótese.

A complementação da atividade AP endonuclease do extrato celular

mutante arp-/- demonstrou que ScARP1 não substituiu em sua totalidade a

atividade de AtARP. Isso pode ter ocorrido devido ao extrato utilizado conter

todas as proteínas presentes na célula vegetal de Arabidopsis, portanto, também

estando incluído inibidores da via BER, como por exemplo, PARP que já foi

reportado ter efeito negativo nas taxas de reparo de BER em extratos celulares

(ALLINSON et al., 2003; 2004). Além do que, vale salientar que a enzima

estudada não pertence a A. thalina, sendo também distante filogeneticamente

da mesma, como pode ser evidenciado quando alinhado as sequências de

ambas as enzimas constatando que as mesmas não exibem uma alta homologia

(figura 13 e tabela 6), de modo que essa diferença estrutural e um ambiente

celular não-adequado podem culminar em um decréscimo na eficiência da

atividade enzimática, logo resultando em uma complementação parcial.

Sabe-se que o conhecimento sobre o reparo de DNA em plantas,

particularmente no genoma de plantas para colheitas (com valor comercial) é

insuficiente. O uso de Arabidopsis thaliana da mesma maneira que o arroz como

modelos vegetais, pois ambos compartilham características atrativas para

estudos genéticos e condições de manutenção em laboratório como: rápido ciclo

de vida, tamanho diminuto e simplicidade de seu genoma, possibilitou melhor

analise de mutações. Percebe-se, infelizmente, uma carência de trabalhos

focado mais em plantas de cultivo. Assim sendo, com a aplicação dos

conhecimentos advindo das plantas modelo de cultivares comerciais, seria

possível ter uma clara visão da capacidade dos genomas vegetais de superar os

impactos biológicos de vários e distintos agentes genotóxicos e se adaptar as

mudanças ambientais e condições de estresses (MANOVA & GRUSZKA, 2015).

A proteína ScARP1 é o primeiro trabalho envolvendo a caracterização

enzimática de uma enzima de reparo em cana-de-açúcar, planta

monocotiledônea e com metabolismo C4, sendo diferente fisiologicamente dos

modelos vegetais citados anteriormente (Arroz e Arabidopsis). Além de

164

suplementar a literatura cientifica, abre portas para possiblidades de estudos

mais aprofundados na via BER e o uso destas descobertas como instrumentos

biotecnológicos que poderão aumentar o rendimento desta planta de grande

importância para a agroindústria mundial.

165

6. CONCLUSÃO

O escopo principal desse trabalho foi elucidar mais sobre a via BER em

cana-de-açúcar, utilizando-se, para isso, a caracterização enzimática da AP

endonuclease ScARP1, além da identificação e análise de outros componentes

da via de Excisão de Bases (BER).

Para a enzima ScARP1, foi observada que a mesma apresentou atividade

endonuclease, além de se constatar as condições ótimas para a sua atuação:

temperatura (37°C), íons metálicos bivalentes (Mg+2 ou Mn+2), concentração de

sal (atividade da enzima é inversamente proporcional a concentração do sal).

Além disso, ScARP1 não exibiu nenhuma atividade exonuclease, fosfatase e

fosfodiesterase, mas foi capaz de complementar, parcialmente, os extratos

celulares advindos da planta mutante (arp -/-). Os dados in vitro reforçaram a ideia

que ScARP1 de cana-de-açúcar se trata de uma subfuncionalização e conservou

a atividade de Ap endonuclease, essencial para a sua atuação na via BER. Na

figura 26, pode-se comparar o resumo das características até o momento

apuradas de ScARP1, resultado deste e de outros trabalhos feitos por nosso

grupo de pesquisa, com relação o seu homólogo em Arabidopsis (AtARP1),

ressaltando as características em comum, como também discrepantes entre as

duas enzimas de BER.

166

Figura 26 - Diagrama de comparação das AP endonucleas de Arabidopsis thaliana (AtARP1) e de cana-de-açúcar (ScARP1). Destaca-se no diagrama as principais características descobertas para ScARP1 em comparação do que se sabe para AtARP1, tendo que vista que a AP endonuclease de cana-de-açúcar é homóloga a AP endonuclease de Arabidopsis. As referidas características seriam as atividades enzimáticas previstas, localização subcelular, íons metálicos bivalentes utilizados como cofatores enzimáticos e perfis de expressão - em relação ao desenvolvimento vegetal e diante ao estresse oxidativo-, tendo em vista, o aumento da expressão das referidas sequências analisadas.

Quanto aos componentes de BER que foram identificados, foi possível

observar evidentes diferenças entre as sequências das monocotiledôneas e

dicotiledôneas, além de duplicações apresentadas nas árvores filogenéticas que

vão além do grupo das gramíneas. Tais resultados geraram o levantamento de

diversas questões quanto a preservação e modificações nos mecanismos de

167

reparo de DNA entre os diferentes tipos vegetais, tendo em vista, a conservação

ou não de domínios conservados previstos, tendo como base a planta modelo

Arabidopsis, nas outras sequências vegetais. Isso enfatiza, a necessidade de

mais estudos que abranjam outros organismos que não as plantas modelos.

Os modelos tridimensionais de PCNA e FEN1 para a cana-de-açúcar

permitiram dar maior suporte aos dados referentes da identificação dos

componentes de BER, permitindo cogitar a preservação das interações entre tais

proteínas e, logo, a manutenção da funcionalidade das mesmas em cana-de-

açúcar.

Deve-se enfatizar que a importância desse trabalho, tendo em vista que

até o presente momento existem poucos estudos publicados de caracterização

enzimática de gene de reparo de cana-de-açúcar, como também existem

escassos trabalhados voltados a caracterização dos componentes da via BER

como foi aqui apresentado, o que traz algo novo e de impacto para o reparo de

DNA em plantas, principalmente para cana-de-açúcar.

168

7. REFERÊNCIAS

AGIUS, F.; KAPOOR, A.; ZHU, J.-K. Role of the Arabidopsis DNA

glycosylase/lyase ROS1 in active DNA demethylation. Proceedings of the

National Academy of Sciences, v. 103, n. 31, p. 11796–11801, 2006.

AGNEZ-LIMA, L. F.; DE MEDEIROS, S. R. B.; MAGGI, B. S.; QUARESMA, G.

A. S. Base excision repair in sugarcane. Genetics and Molecular Biology, v.

24, n. 1–4, p. 123–129, 2001.

AHMAD, A.; DIWAN, H.; ABROL, Y. P. Global climate change, stress and plant

productivity. In: Abiotic Stress Adaptation in Plants. Springer Netherlands, p.

503-521, 2009.

AHMAD, M.; JARILLO, J. A.; KLIMCZAK, L. J.; LANDRY, L. G.; PENG, T.; LAST,

R. L.; CASHMORE, A. R. An enzyme similar to animal type II photolyases

mediates photoreactivation in Arabidopsis. The Plant cell, v. 9, n. 2, p. 199–207,

1997.

AHUJA, I.; DE VOS, R. C. H.; BONES, A. M.; HALL, R. D. Plant molecular stress

responses face climate change. Trends in Plant Science, v. 15, n. 12, p. 664–

674, 2010. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1016/j.tplants.2010.08.002>.

AINSWORTH, E. A.; ORT, D. R. How Do We Improve Crop Production in a

Warming World? PLANT PHYSIOLOGY, v. 154, n. 2, p. 526–530, 2010.

Disponível em: <http://www.plantphysiol.org/cgi/doi/10.1104/pp.110.161349>.

AKHTAR, S.; WAHID, A.; RASUL, E. Emergence, growth and nutrient

composition of sugarcane sprouts under NaCl salinity. Biologia Plantarum, v.

46, n. 1, p. 113–116, 2003.

ALLINSON, S. L.; DIANOVA, I. I.; & DIANOV, G. L. Poly (ADP-ribose)

polymerase in base excision repair: always engaged, but not essential for DNA

damage processing. ACTA BIOCHIMICA POLONICA-ENGLISH EDITION-, v.

50, n. 1, p. 169-180, 2003.

169

ALLINSON, S. L.; SLEETH, K. M.; MATTHEWMAN, G. E.; & DIANOV, G. L.

Orchestration of base excision repair by controlling the rates of enzymatic

activities. DNA repair, v. 3, n. 1, p. 23-31, 2004.

ALMENDRAL, J. M.; HUEBSCH, D.; BLUNDELL, P. a.; MACDONALD-BRAVO,

H.; BRAVO, R. Cloning and sequence of the human nuclear protein cyclin:

homology with DNA-binding proteins. Proceedings of the National Academy

of Sciences of the United States of America, v. 84, n. 6, p. 1575–1579, 1987.

ALONSO, J. M.; STEPANOVA, A. N.; LEISSE, T. J.; KIM, C. J.; CHEN, H.;

SHINN, P.; STEVENSON, D. K.; ZIMMERMAN, J.; BARAJAS, P.; CHEUK, R.;

GADRINAB, C.; HELLER, C.; JESKE, A.; KOESEMA, E.; MEYERS, C. C.;

PARKER, H.; PREDNIS, L.; ANSARI, Y.; CHOY, N.; DEEN, H.; GERALT, M.;

HAZARI, N.; HOM, E.; KARNES, M.; MULHOLLAND, C.; NDUBAKU, R.;

SCHMIDT, I.; GUZMAN, P.; AGUILAR-HENONIN, L.; SCHMID, M.; WEIGEL, D.;

CARTER, D. E.; MARCHAND, T.; RISSEEUW, E.; BROGDEN, D.; ZEKO, A.;

CROSBY, W. L.; BERRY, C. C.; ECKER, J. R. Genome-wide insertional

mutagenesis of Arabidopsis thaliana. Science, v. 301, n. 5633, p. 653–657, 2003.

AMIT ROY, S. R. Molecular Markers in Phylogenetic Studies-A Review. Journal

of Phylogenetics & Evolutionary Biology, v. 2, n. 2, 2014.

AMOR, Y.; BABIYCHUK, E.; INZÉ, D.; LEVINE, A. The involvement of poly(ADP-

ribose) polymerase in the oxidative stress responses in plants. FEBS Letters, v.

440, n. 1–2, p. 1–7, 1998.

AMOROSO, A.; CONCIA, L.; MAGGIO, C.; RAYNAUD, C.; BERGOUNIOUX, C.;

CRESPAN, E.; CELLA, R.; MAGA, G. Oxidative DNA damage bypass in

Arabidopsis thaliana requires DNA polymerase λ and proliferating cell nuclear

antigen 2. The Plant cell, v. 23, n. 2, p. 806–22, fev. 2011.

ANDERSON, H. J.; VONARX, E. J.; PASTUSHOK, L.; NAKAGAWA, M.;

KATAFUCHI, A.; GRUZ, P.; DI RUBBO, A.; GRICE, D. M.; OSMOND, M. J.;

SAKAMOTO, A. N.; NOHMI, T.; XIAO, W.; KUNZ, B. A. Arabidopsis thaliana Y-

family DNA polymerase η catalyses translesion synthesis and interacts

functionally with PCNA2. Plant Journal, v. 55, n. 6, p. 895–908, 2008.

170

ANJUM, N. A., GILL, S. S., & GILL, R. Plant adaptation to environmental change:

significance of amino acids and their derivatives. CABI, 2014.

ARAVIND, L.; KOONIN, E. V. The alpha/beta fold uracil DNA glycosylases: a

common origin with diverse fates. Genome biology, v. 1, n. 4, p.

RESEARCH0007, 2000.

ARAVIND, L.; WALKER, D. R.; & KOONIN, E. V. Conserved domains in DNA

repair proteins and evolution of repair systems. Nucleic acids research, v. 27,

n. 5, p. 1223-1242, 1999.

ARIEL, F.; JEGU, T.; LATRASSE, D.; ROMERO-BARRIOS, N.; CHRIST, A.;

BENHAMED, M.; CRESPI, M. Noncoding transcription by alternative rna

polymerases dynamically regulates an auxin-driven chromatin loop. Molecular

Cell, v. 55, n. 3, p. 383–396, 2014.

ASAHARA, H.; WISTORT, P. M.; BANK, J. F.; BAKERIAN, R. H.;

CUNNINGHAM, R. P. Purification and Characterization of Escherichia coli

Endonuclease III from the Cloned nth Gene. Biochemistry, v. 28, n. 10, p. 4444–

4449, 1989.

ATKINSON, N. J.; LILLEY, C. J.; URWIN, P. E. Identification of genes involved

in the response of Arabidopsis to simultaneous biotic and abiotic stresses. Plant

physiology, v. 162, n. 4, p. 2028–41, 2013.

ATKINSON, N.; URWIN, P. The interaction of plant biotic and abiotic stresses:

from In Posidonia oceanica cadmium induces changes in DNA genes to the field.

Journal of Experimental Botany, v. 63, n. 10, p. 695-703523–3544, 2012.

AUGUSTINE, S. M.; CHERIAN, A. V.; SYAMALADEVI, D. P.; SUBRAMONIAN,

N. Erianthus arundinaceus HSP70 (EaHSP70) Acts as a Key Regulator in the

Formation of Anisotropic Interdigitation in Sugarcane (Saccharum spp. hybrid) in

Response to Drought Stress. Plant and Cell Physiology, v. 56, n. 12, p. 2368–

2380, 2015.

AZEVEDO, R. A.; CARVALHO, R. F.; CIA, M. C.; GRATÃO, P. L. Sugarcane

Under Pressure: An Overview of Biochemical and Physiological Studies of Abiotic

Stress. Tropical Plant Biology, v. 4, n. 1, p. 42–51, 2011.

171

BABIYCHUK, E.; COTTRILL, P. B.; STOROZHENKO, S.; FUANGTHONG, M.;

CHEN, Y.; O’FARRELL, M. K.; VAN MONTAGU, M.; INZÉ, D.; KUSHNIR, S.

Higher plants possess two structurally different poly(ADP-ribose) polymerases.

Plant Journal, v. 15, n. 5, p. 635–645, 1998.

BABIYCHUK, E.; KUSHNIR, S.; VAN MONTAGU, M.; & INZE, D. The

Arabidopsis thaliana apurinic endonuclease Arp reduces human transcription

factors Fos and Jun. Proceedings of the National Academy of Sciences, v.

91, n. 8, p. 3299-3303, 1994.

BABIYCHUK, E.; VAN MONTAGU, M.; KUSHNIR, S. N-terminal domains of plant

poly(ADP-ribose) polymerases define their association with mitotic

chromosomes. Plant Journal, v. 28, n. 3, p. 245–255, 2001.

BAIROCH, A.; APWEILER, R.; WU, C. H.; BARKER, W. C.; BOECKMANN, B.;

FERRO, S.; GASTEIGER, E.; HUANG, H.; LOPEZ, R.; MAGRANE, M.; MARTIN,

M. J.; NATALE, D. A.; O’DONOVAN, C.; REDASCHI, N.; YEH, L. S. L. The

Universal Protein Resource (UniProt). Nucleic Acids Research, v. 33, n.

DATABASE ISS., 2005.

BALAKRISHNAN, L.; BAMBARA, R. A. Flap Endonuclease 1. Annual Review

of Biochemistry, v. 82, n. 1, p. 119–138, 2013.

BALESTRAZZI, A.; BOTTI, S.; ZELASCO, S.; BIONDI, S.; FRANCHIN, C.;

CALLIGARI, P.; RACCHI, M.; TURCHI, A.; LINGUA, G.; BERTA, G.;

CARBONERA, D. Expression of the PsMT A1 gene in white poplar engineered

with the MAT system is associated with heavy metal tolerance and protection

against 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine mediated-DNA damage.. Plant Cell

Reports, v. 28, n. 8, p. 1179–1192, 2009.

BALESTRAZZI, A.; CONFALONIERI, M.; MACOVEI, A.; DONÀ, M.;

CARBONERA, D. Genotoxic stress and DNA repair in plants: emerging functions

and tools for improving crop productivity. Plant cell reports, v. 30, n. 3, p. 287-

295, 2011.

BALESTRAZZI, A.; MACOVEI, A.; DONÀ, M.; CARBONERA, D.;

CONFALONIERI, M. Genotoxic stress, DNA repair, and crop productivity. In:

172

Crop improvement under adverse conditions. Springer, New York, NY, p.

153-169. 2013.

BARNES, D. E.; LINDAHL, T. Repair and Genetic Consequences of Endogenous

DNA Base Damage in Mammalian Cells. Annual Review of Genetics, v. 38, n.

1, p. 445–476, 2004.

BARZILAY, G.; WALKER, L. J.; ROBSON, C. N.; HICKSON, I. D. Site-directed

mutagenesis of the human DNA repair enzyme HAP1: Identification of residues

important for AP endonuclease and RNase H activity. Nucleic Acids Research,

v. 23, n. 9, p. 1544–1550, 1995.

BATSCHAUER, A. A plant gene for photolyase: an enzyme catalyzing the repair

of UV‐light‐induced DNA damage. The Plant Journal, v. 4, n. 4, p. 705-709,

1993.

BAUER, G. A.; BURGERS, P. M. Molecular cloning, structure and expression of

the yeast proliferating cell nuclear antigen gene. Nucleic Acids Res, v. 18, n. 2,

p. 261–265, 1990.

BAUER, G. A.; BURGERS, P. M. The yeast analog of mammalian

cyclin/proliferating-cell nuclear antigen interacts with mammalian DNA

polymerase delta. Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America, v. 85, n. 20, p. 7506–10, 1988.

BECHARA, R.; GOMEZ, A.; SAINT-ANTONIN, V.; SCHWEITZER, J. M.;

MARÉCHAL, F.; ENSINAS, A. Review of design works for the conversion of

sugarcane to first and second-generation ethanol and electricity. Renewable and

Sustainable Energy Reviews, v. 91, p. 152-164, 2018.

BEERNINK, P. T.; SEGELKE, B. W.; HADI, M. Z.; ERZBERGER, J. P.; WILSON,

D. M.; & RUPP, B. Two divalent metal ions in the active site of a new crystal form

of human apurinic/apyrimidinic endonuclease, Ape1: implications for the catalytic

mechanism. Journal of molecular biology, v. 307, n. 4, p. 1023-1034, 2001.

BELLACOSA, A., & DROHAT, A. C. Role of base excision repair in maintaining

the genetic and epigenetic integrity of CpG sites. DNA repair, v. 32, p. 33-42,

2015.

173

BENDER, J. DNA METHYLATION AND EPIGENETICS. Annual Review of

Plant Biology, v. 55, n. 1, p. 41–68, 2004.

BENGTSSON, M.; SHEN, Y.; OKI, T. A SRES-based gridded global population

dataset for 1990-2100. Population and Environment, v. 28, n. 2, p. 113–131,

2006.

BERMAN, H. M.; WESTBROOK, J.; FENG, Z.; GILLILAND, G.; BHAT, T. N.;

WEISSIG, H.; SHINDYALOV, I. N.; BOURNE, P. E. The protein data bank.

Nucleic acids research, v. 28, n. 1, p. 235–242, 2000.

BETTI, M.; PETRUCCO, S.; BOLCHI, A.; DIECI, G.; OTTONELLO, S. A Plant 3′-

Phosphoesterase Involved in the Repair of DNA Strand Breaks Generated by

Oxidative Damage. Journal of Biological Chemistry, v. 276, n. 21, p. 18038–

18045, 2001.

BHAKAT, K. K.; MANTHA, A. K.; MITRA, S. Transcriptional Regulatory Functions

of Mammalian AP-Endonuclease (APE1/Ref-1), an Essential Multifunctional

Protein. Antioxidants & Redox Signaling, v. 11, n. 3, p. 621–637, 2009.

BIEDERMANN, S.; MOONEY, S.; HELLMANN, H. Recognition and repair

pathways of damaged DNA in higher plants. Selected Topics in DNA Repair, p.

201–236, 2011. Disponível em: <http://cdn.intechopen.com/pdfs/22716/InTech-

Recognition_and_repair_pathways_of_damaged_dna_in_higher_plants.pdf>.

BIGARELLA, C. L.; LIANG, R.; & GHAFFARI, S. Stem cells and the impact of

ROS signaling. Development, v. 141, n. 22, p. 4206-4218, 2014.

BIRCHLER, J. A.; RIDDLE, N. C.; AUGER, D. L.; & VEITIA, R. A. Dosage balance

in gene regulation: biological implications. Trends in Genetics, v. 21, n. 4, p.

219-226, 2005.

BIRD, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes &

Development, v. 16, n. 1, p. 6–21, 2002.

BJØRÅS, M.; SEEBERG, E.; LUNA, L.; PEARL, L. H.; BARRETT, T. E.

Reciprocal “flipping” underlies substrate recognition and catalytic activation by

the human 8-oxo-guanine DNA glycosylase. Journal of Molecular Biology, v.

317, n. 2, p. 171–177, 2002.

174

BOESCH, P.; IBRAHIM, N.; PAULUS, F.; COSSET, A.; TARASENKO, V.;

DIETRICH, A. Plant mitochondria possess a short-patch base excision DNA

repair pathway. Nucleic Acids Research, v. 37, n. 17, p. 5690–5700, 2009.

BOGUSZ, M.; WHELAN, S. Phylogenetic tree estimation with and without

alignment: New distance methods and benchmarking. Systematic Biology, v.

66, n. 2, p. 218–231, 2017.

BOLTZ, K. A.; JASTI, M.; TOWNLEY, J. M.; SHIPPEN, D. E. Analysis of

poly(ADP-ribose) polymerases in Arabidopsis telomere biology. PLoS ONE, v. 9,

n. 2, 2014.

BOLTZ, K. A.; JASTI, M.; TOWNLEY, J. M.; SHIPPEN, D. E. Analysis of

poly(ADP-ribose) polymerases in Arabidopsis telomere biology. PLoS ONE, v. 9,

n. 2, 2014.

BOUCKAERT, R.; HELED, J.; KÜHNERT, D.; VAUGHAN, T.; WU, C. H.; XIE, D.;

SUCHARD, M. A.; RAMBAUT, A.; DRUMMOND, A. J. BEAST 2: A Software

Platform for Bayesian Evolutionary Analysis. PLoS Computational Biology, v.

10, n. 4, 2014.

BOWERS, J. E.; CHAPMAN, B. A.; RONG, J.; PATERSON, A. H. Unravelling

angiosperm genome evolution by phylogenetic analysis of chromosomal

duplication events. Nature, v. 422, n. 6930, p. 433–438, 2003.

BOYKO, A.; KOVALCHUCK, I. Epigenetic Control of Plant Stress Response.

Environmental and molecular mutagenesis, v. 49, p. 61–72, 2008.

BOYKO, A.; KOVALCHUK, I. Genome instability and epigenetic modification—

heritable responses to environmental stress?. Current opinion in plant biology,

v. 14, n. 3, p. 260-266, 2011.

BRADLEY, P.; MALMSTRÖM, L.; QIAN, B.; SCHONBRUN, J.; CHIVIAN, D.;

KIM, D. E.; MEILER, J.; MISURA, K. M. S.; BAKER, D. Free modeling with

Rosetta in CASP6. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, v. 61,

n. S7, p. 128-134, 2005a.

175

BRADLEY, P.; MISURA, K. M. S.; BAKER, D. Biochemistry: Toward high-

resolution de novo structure prediction for small proteins. Science, v. 309, n.

5742, p. 1868–1871, 2005b.

BRADSHAW, J. E. Clonal Cultivars from Multistage Multitrait Selection. In: Plant

Breeding: Past, Present and Future. Springer, Cham. p. 343-386, 2016.

BRITT, a B. DNA damage and repair in plants. Annu Rev Plant Physiol Plant

Mol Biol, v. 47, p. 75–100, 1996.

BRITT, A. B. Molecular genetics of DNA repair in higher plants. Trends in plant

science, v. 4, n. 1, p. 20-25, 1999.

BRITT, A. Repair of damaged bases. The Arabidopsis Book, p. e0005, 2002.

BROOKS, S. C.; ADHIKARY, S.; RUBINSON, E. H.; EICHMAN, B. F. Recent

advances in the structural mechanisms of DNA glycosylases. Biochimica et

Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics, v. 1834, n. 1, p. 247-271,

2013.

BROSH, R. M.; DRISCOLL, H. C.; DIANOV, G. L.; SOMMERS, J. A. Biochemical

characterization of the WRN-FEN-1 functional interaction. Biochemistry, v. 41,

n. 40, p. 12204–12216, 2002.

BROSH, R. M.; VON KOBBE, C.; SOMMERS, J. A.; KARMAKAR, P.;

OPRESKO, P. L.; PIOTROWSKI, J.; DIANOVA, I.; DIANOV, G. L.; BOHR, V. A.

Werner syndrome protein interacts with human flap endonuclease 1 and

stimulates its cleavage activity. EMBO Journal, v. 20, n. 20, p. 5791–5801, 2001.

BURDON, R. H.; O'KANE, D.; FADZILLAH, N.; GILL, V.; BOYD, P. A.; & FINCH,

R. R. Oxidative stress and responses in Arabidopsis thaliana and Oryza sativa

subjected to chilling and salinity stress.Bio- chem Soc Trans 24: 469–472. 1996.

BUZAS, D. M. Emerging links between iron-sulfur clusters and 5-methylcytosine

base excision repair in plants. Genes & Genetic Systems, v. 91, n. 2, p. 51–62,

2016.

CALDECOTT, K. W. XRCC1 and DNA strand break repair. DNA repair, v. 2, n.

9, p. 955-969, 2003.

176

CALLEBAUT, I.; MORNON, J. P. From BRCA1 to RAP1: A widespread BRCT

module closely associated with DNA repair. FEBS Letters, v. 400, n. 1, p. 25–

30, 1997.

CAMPBELL, C. J.; LAHERRÈRE, J. H. The end of cheap oil. Scientific

American, v. 278, n. 3, p. 78-83, 1998.

CANN, I. K.; ISHINO, S.; HAYASHI, I.; KOMORI, K.; TOH, H.; MORIKAWA, K.;

ISHINO, Y. Functional interactions of a homolog of proliferating cell nuclear

antigen with DNA polymerases in Archaea. Journal of bacteriology, v. 181, n.

21, p. 6591–6599, 1999.

CARVALHO, G. R.; OLIVEIRA, C. D. O setor sucroalcooleiro em perspectiva.

Embrapa Monitoramento por Satélite-Circular Técnica (INFOTECA-E), 2006.

Disponível em: <

http://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/infoteca/handle/doc/1008450> Acesso

em: 28 de janeiro de 2018.

CESKA, T. A.; SAYERS, J. R.; STIER, G.; SUCK, D. A helical arch allowing

single-stranded DNA to thread through T5 5’- exonuclease. Nature, v. 382, n.

6586, p. 90–93, 1996.

CESNIK, R. Melhoramento da cana-de-açúcar: marco sucro-alcooleiro no Brasil.

Com Ciência: Revista Eletrônica de Jornalismo Científico, p. 1–4, 2007.

CHEN, V. B.; ARENDALL, W. B.; HEADD, J. J.; KEEDY, D. A.; IMMORMINO, R.

M.; KAPRAL, G. J.; MURRAY, L. W.; RICHARDSON, J. S.; RICHARDSON, D.

C. MolProbity: All-atom structure validation for macromolecular crystallography.

Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography, v. 66, n. 1, p.

12–21, 2010.

CHOI, Y. Demeter, a DNA glycosylase domain protein, is required for endosperm

genn imprinting and seed viability in Arabidopsis. Cell, v. 110, p. 33–42, 2002.

CHOI, Y.; GEHRING, M.; JOHNSON, L.; HANNON, M.; HARADA, J. J.;

GOLDBERG, R. B.; JACOBSEN, S. E.; FISCHER, R. L. DEMETER, a DNA

glycosylase domain protein, is required for endosperm gene imprinting and seed

viability in Arabidopsis. Cell, v. 110, n. 1, p. 33–42, 2002.

177

CHOU, K. M.; & CHENG, Y. C. The exonuclease activity of human

apurinic/apyrimidinic endonuclease (APE1) Biochemical properties and inhibition

by the natural dinucleotide Gp4G. Journal of Biological Chemistry, v. 278, n.

20, p. 18289-18296, 2003.

CHU, W. K.; HICKSON, I. D. RecQ helicases: multifunctional genome caretakers.

Nature Reviews Cancer, v. 9, n. 9, p. 644, 2009.

CHUNG, J. H.; IM, E. K.; PARK, H. Y.; KWON, J. H.; LEE, S.; OH, J.; H. WANG,

K. C.; LEE, J. H.; JANG, Y. A novel uracil-DNA glycosylase family related to the

helix-hairpin-helix DNA glycosylase superfamily. Nucleic Acids Research, v. 31,

n. 8, p. 2045–2055, 2003.

COBB, J. A.; BJERGBAEK, L.; GASSER, S. M. RecQ helicases: at the heart of

genetic stability. FEBS letters, v. 529, n. 1, p. 43-48, 2002.

COLOT, V.; ROSSIGNOL, J. L. Eukaryotic DNA methylation as an evolutionary

device. Bioessays, v. 21, n. 5, p. 402-411, 1999.

CONANT, G. C.; WOLFE, K. H. Turning a hobby into a job: how duplicated genes

find new functions. Nature Reviews Genetics, v. 9, n. 12, p. 938, 2008.

CONSIDINE, M. J.; DIAZ-VIVANCOS, P.; KERCHEV, P.; SIGNORELLI, S.;

AGUDELO-ROMERO, P.; GIBBS, D. J.; & FOYER, C. H. Learning to breathe:

developmental phase transitions in oxygen status. Trends in plant science,

2016.

CÓRDOBA-CAÑERO, D.; DUBOIS, E.; ARIZA, R. R.; DOUTRIAUX, M. P.;

ROLDÁN-ARJONA, T. Arabidopsis uracil DNA glycosylase (UNG) is required for

base excision repair of uracil and increases plant sensitivity to 5-fluorouracil.

Journal of Biological Chemistry, v. 285, n. 10, p. 7475-7483, 2010.

CÓRDOBA-CAÑERO, D.; MORALES-RUIZ, T.; ROLDÁN-ARJONA, T.; ARIZA,

R. R. Single-nucleotide and long-patch base excision repair of DNA damage in

plants. The Plant journal : for cell and molecular biology, v. 60, n. 4, p. 716–

28, 2009.

178

CÓRDOBA-CAÑERO, D.; ROLDÁN-ARJONA, T.; ARIZA, R. R. Arabidopsis ARP

endonuclease functions in a branched base excision DNA repair pathway

completed by LIG1. Plant Journal, v. 68, n. 4, p. 693–702, 2011.

CÓRDOBA-CAÑERO, D.; ROLDÁN-ARJONA, T.; ARIZA, R. R. Arabidopsis ZDP

DNA 3’-phosphatase and ARP endonuclease function in 8-oxoG repair initiated

by FPG and OGG1 DNA glycosylases. Plant Journal, v. 79, n. 5, p. 824–834,

2014.

COSTA, R. M. A.; LIMA, W. C.; VOGEL, C. I. G.; BERRA, C. M.; LUCHE, D. D.;

MEDINA-SILVA, R.; GALHARDO, R. S.; MENCK, C. F. M.; OLIVEIRA, V. R. DNA

repair-related genes in sugarcane expressed sequence tags (ESTs). Genetics

and Molecular Biology, v. 24, n. 1–4, p. 131–140, 2001.

CRITCHLOW, S. E.; BOWATER, R. P.; JACKSON, S. P. Mammalian DNA

double-strand break repair protein XRCC4 interacts with DNA ligase IV. Current

biology : CB, v. 7, n. 8, p. 588–598, 1997.

CULLIGAN, K. M.; HAYS, J. B. Arabidopsis MutS homologs-AtMSH2, AtMSH3,

AtMSH6, and a novel AtMSH7-form three distinct protein heterodimers with

different specificities for mismatched DNA. The Plant cell, v. 12, n. 6, p. 991–

1002, 2000.

D’HONT, A. Unraveling the genome structure of polyploids using FISH and GISH;

examples of sugarcane and banana. Cytogenetic and genome research, v.

109, n. 1-3, p. 27-33, 2005.

D’HONT, A.; ISON, D.; ALIX, K.; ROUX, C.; GLASZMANN, J. C. Determination

of basic chromosome numbers in the genus Saccharum by physical mapping of

ribosomal RNA genes. Genome, v. 41, n. 2, p. 221–225, 1998.

DARRIBA, D.; TABOADA, G. L.; DOALLO, R.; POSADA, D. ProtTest 3: fast

selection of best-fit models of protein evolution. Bioinformatics, 27(8), 1164-1165.

2011.

DAS, K.; & ROYCHOUDHURY, A. Reactive oxygen species (ROS) and response

of antioxidants as ROS-scavengers during environmental stress in plants. Redox

Homeostasis Managers in Plants under Environmental Stresses, p. 53, 2016.

179

DAS, K.; ROYCHOUDHURY, A. Reactive oxygen species (ROS) and response

of antioxidants as ROS-scavengers during environmental stress in plants.

Frontiers in Environmental Science, v. 2, 2014.

DAVIES, D. R.; INTERTHAL, H.; CHAMPOUX, J. J.; HOL, W. G. J. Crystal

structure of a transition state mimic for Tdp1 assembled from vanadate, DNA,

and a topoisomerase I-derived peptide. Chemistry and Biology, v. 10, n. 2, p.

139–147, 2003.

DAVIES, D. R.; INTERTHAL, H.; CHAMPOUX, J. J.; HOL, W. G. J. Insights into

substrate binding and catalytic mechanism of human tyrosyl-DNA

phosphodiesterase (Tdp1) from vanadate and tungstate-inhibited structures.

Journal of Molecular Biology, v. 324, n. 5, p. 917–932, 2002.

DAVIES, D. R.; INTERTHAL, H.; CHAMPOUX, J. J.; HOL, W. G. J. The crystal

structure of human tyrosyl-DNA phosphodiesterase, Tdp1. Structure, v. 10, n. 2,

p. 237–248, 2002b.

DAVIS, I.; W.; LEAVER-FAY, A.; CHEN, V. B.; BLOCK, J. N.; KAPRAL, G. J.;

WANG, X.; MURRAY, L. W.; ARENDALL, W. B.; SNOEYINK, J.; RICHARDSON,

J. S.; RICHARDSON, D. C. MolProbity: All-atom contacts and structure validation

for proteins and nucleic acids. Nucleic Acids Research, v. 35, n. SUPPL.2,

2007.

DE BLOCK, M.; VERDUYN, C.; DE BROUWER, D.; CORNELISSEN, M.

Poly(ADP-ribose) polymerase in plants affects energy homeostasis, cell death

and stress tolerance. The Plant Journal, v. 41, n. 1, p. 95–106, 2005.

DE CASTRO, E.; SIGRIST, C. J.; GATTIKER, A.; BULLIARD, V.; LANGENDIJK-

GENEVAUX, P. S.; GASTEIGER, E.; BAIROCH, A.; HULO, N. ScanProsite:

detection of PROSITE signature matches and ProRule-associated functional and

structural residues in proteins. Nucleic acids research, v. 34, n. suppl_2, p.

W362-W365, 2006.

DE MARCH, M.; MERINO, N.; BARRERA-VILARMAU, S.; CREHUET, R.;

ONESTI, S.; BLANCO, F. J.; DE BIASIO, A. Structural basis of human PCNA

sliding on DNA. Nature Communications, v. 8, 2017.

180

DE MORAIS, L. K.; DE AGUIAR, M. S.; DE ALBUQUERQUE E SILVA, P.;

MARINHO CAˆMARA, T. M.; CURSI, D. E.; FERNANDES JUNIOR, A. R.;

CHAPOLA, R. G.; CARNEIRO, M. S.; BESPALHOK FILHO, J. C. Breeding of

sugarcane. In: Industrial Crops: Breeding for Bioenergy and Bioproducts.

[s.l: s.n.]p. 29–42.

DE SETTA, N.; MONTEIRO-VITORELLO, C. B.; METCALFE, C. J.; CRUZ, G.

M. Q.; DEL BEM, L. E.; VICENTINI, R.; ... & VIEIRA, A. P. Building the sugarcane

genome for biotechnology and identifying evolutionary trends. BMC genomics,

v. 15, n. 1, p. 540, 2014.

DEL POZO, J. C. Reactive oxygen species: from harmful molecules to fine-tuning

regulators of stem cell niche maintenance. PLoS genetics, v. 12, n. 9, p.

e1006251, 2016.

DEL RÍO, L. A. ROS and RNS in plant physiology: An overview. Journal of

Experimental Botany, v. 66, n. 10, p. 2827–2837, 2015.

DEMIDCHIK, V. Mechanisms of oxidative stress in plants: from classical

chemistry to cell biology. Environmental and Experimental Botany, v. 109, p.

212-228, 2015.

DEMPLE, B.; HERMAN, T.; CHEN, D. S. Cloning and expression of APE, the

cDNA encoding the major human apurinic endonuclease: definition of a family of

DNA repair enzymes. Proceedings of the National Academy of Sciences, v.

88, n. 24, p. 11450–11454, 1991.

DENVER, D. R.; SWENSON, S. L.; LYNCH, M. An evolutionary analysis of the

helix-hairpin-helix superfamily of DNA repair glycosylases. Molecular Biology

and Evolution, v. 20, n. 10, p. 1603–1611, 2003.

D'HONT, A.; DENOEUD, F.; AURY, J. M.; BAURENS, F. C.; CARREEL, F.;

GARSMEUR, O.; ... & DA SILVA, C. The banana (Musa acuminata) genome and

the evolution of monocotyledonous plants. Nature, v. 488, n. 7410, p. 213, 2012.

DOGLIOTTI, E.; FORTINI, P.; PASCUCCI, B.; PARLANTI, E. The mechanism of

switching among multiple BER pathways. Progress in Nucleic Acid Research

and Molecular Biology, v. 68, p. 3–27, 2001.

181

DOS REIS, M.; DONOGHUE, P. C. J.; YANG, Z. Bayesian molecular clock dating

of species divergences in the genomics era. Nature Reviews Genetics, v. 17, n.

2, p. 71, 2016.

DOUCET-CHABEAUD, G.; GODON, C.; BRUTESCO, C.; DE MURCIA, G.;

KAZMAIER, M. Ionising radiation induces the expression of PARP-1 and PARP-

2 genes in Arabidopsis. Mol Genet Genomics, v. 265, n. 6, p. 954–963, 2001.

DOUTRIAUX, M. P.; COUTEAU, F.; BERGOUNIOUX, C.; WHITE, C. Isolation

and characterisation of the RAD51 and DMC1 homologs from Arabidopsis

thaliana. Molecular and General Genetics, v. 257, n. 3, p. 283–291, 1998.

DUFRESNE, F.; STIFT, M.; VERGILINO, R.; MABLE, B. K. Recent progress and

challenges in population genetics of polyploid organisms: an overview of current

state‐of‐the‐art molecular and statistical tools. Molecular ecology, v. 23, n. 1, p.

40-69, 2014.

EDGAR, R. C. MUSCLE: Multiple sequence alignment with high accuracy and

high throughput. Nucleic Acids Research, v. 32, n. 5, p. 1792–1797, 2004.

ELHAMAMSY, A. R. DNA methylation dynamics in plants and mammals:

overview of regulation and dysregulation. Cell biochemistry and function, v.

34, n. 5, p. 289-298, 2016.

ELLIS, N. A.; GRODEN, J.; YE, T. Z.; STRAUGHEN, J.; LENNON, D. J.; CIOCCI,

S.; PROYTCHEVA, M.; GERMAN, J. The Bloom’s syndrome gene product is

homologous to RecQ helicases. Cell, v. 83, n. 4, p. 655–666, 1995.

ELMAYAN, T.; PROUX, F.; VAUCHERET, H. Arabidopsis RPA2: A genetic link

among transcriptional gene silencing, DNA repair, and DNA replication. Current

Biology, v. 15, n. 21, p. 1919–1925, 2005.

FATIMA, U.; KHAN, M. F.; E FATIMA, J.; SHAHAB, U.; AHMAD, S.; YUSUF, M.

A. DNA damage, response, and repair in plants under genotoxic stress. In: Stress

Signaling in Plants: Genomics and Proteomics Perspective, Volume 2. [s.l: s.n.]p.

151–171, 2017.

FELSENSTEIN, J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the

bootstrap. Evolution, 39, 783–791. 1985.

182

FELSENSTEIN, J. Phylogenies From Molecular Sequences: Inference And

Reliability. Annual Review of Genetics, v. 22, n. 1, p. 521–565, 1988.

FENG, B.; LIU, C.; DE OLIVEIRA, M. V. V.; INTORNE, A. C.; LI, B.; BABILONIA,

K.; DE SOUZA FILHO, G. A.; SHAN, L.; HE, P. Protein Poly(ADP-ribosyl)ation

Regulates Arabidopsis Immune Gene Expression and Defense Responses.

PLoS Genetics, v. 11, n. 1, 2015.

FENG, S., JACOBSEN, S. E., & REIK, W. Epigenetic reprogramming in plant and

animal development. Science, v. 330, n. 6004, p. 622-627, 2010.

FERREIRA, R. B.; MONTEIRO, S.; FREITAS, R.; SANTOS, C. N.; CHEN, Z.;

BATISTA, L. M.; DUARTE, J.; BORGES, A.; TEIXEIRA, A. R. The role of plant

defence proteins in fungal pathogenesis. Molecular Plant Pathology, v. 8, n. 5,

p. 677-700, 2007.

FORCE, A.; LYNCH, M.; PICKETT, F. B.; AMORES, A.; YAN, Y. L.; &

POSTLETHWAIT, J. Preservation of duplicate genes by complementary,

degenerative mutations. Genetics, v. 151, n. 4, p. 1531-1545, 1999.

FORTINI, P.; DOGLIOTTI, E. Base damage and single-strand break repair:

Mechanisms and functional significance of short- and long-patch repair

subpathways. DNA Repair, v. 6, n. 4, p. 398–409, 2007.

FOYER, C.H.; RUBAN, A. V.; NOCTOR, G. Viewing oxidative stress through the

lens of oxidative signalling rather than damage. Biochemical Journal 474, 877–

883, 2017.

FRIEDBERG, E. C.; WALKER, G. C.; SIEDE, W.; WOOD, R. D.; SCHULTZ, R.

a.; ELLENBURGER, T. DNA repair and mutagenesis. American Society for

Microbiology, Washington, DC. p. 865-894,2006.

FUKUCHI, K.; MARTIN, G. M.; MONNAT, R. J. Mutator phenotype of Werner

syndrome is characterized by extensive deletions. Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America, v. 86, n. 15, p. 5893–

7, 1989.

183

FUNG, H.; DEMPLE, B. A vital role for Ape1/Ref1 protein in repairing

spontaneous DNA damage in human cells. Molecular Cell, v. 17, n. 3, p. 463–

470, 2005.

FÜRSTENBERG-HÄGG, J.; ZAGROBELNY, M.; BAK, S. Plant defense against

insect herbivores. International journal of molecular sciences, v. 14, n. 5, p.

10242-10297, 2013.

GARCIA, A. A.; MOLLINARI, M.; MARCONI, T. G.; SERANG, O. R.; SILVA, R.

R.; VIEIRA, M. L.;VICENTINI, R.; COSTA, E.A.; MANCINI, M.C.; GARCIA, M.O.;

PASTINA, M.M.; GAZAFFI, R.; MARTINS, E.R.; DAHMER, N.; SFORÇA, D.A.;

SILVA, C.B.; BUNDOCK, P.; HENRY, R.J.; SOUZA, G.M.; VAN SLUYS, M.A.;

LANDELL, M.G.; CARNEIRO, M.S.; VINCENTZ, M.A.; PINTO, L.R.;

VENCOVSKY, R.; SOUZA, A.P. SNP genotyping allows an in-depth

characterisation of the genome of sugarcane and other complex autopolyploids.

Scientific reports, v. 3, 2013.

GARCIA, V.; SALANOUBAT, M.; CHOISNE, N.; TISSIER, a. An ATM homologue

from Arabidopsis thaliana: complete genomic organisation and expression

analysis. Nucleic acids research, v. 28, n. 8, p. 1692–1699, 2000.

GARCÍA-DÍAZ, M.; BEBENEK, K.; KUNKEL, T. A.; BLANCO, L. Identification of

an intrinsic 5’-deoxyribose-5-phosphate lyase activity in human DNA polymerase

lambda: a possible role in base excision repair. The Journal of biological

chemistry, v. 276, n. 37, p. 34659–63, 2001.

GARCÍA-DÍAZ, M.; DOMÍNGUEZ, O.; LÓPEZ-FERNÁNDEZ, L. A.; DE LERA, L.

T.; SANÍGER, M. L.; RUIZ, J. F.; PÁRRAGA, M.; GARCÍA-ORTIZ, M. J.;

KIRCHHOFF, T.; DEL MAZO, J.; BERNAD, A.; BLANCO, L. DNA polymerase

lambda (Pol λ), a novel eukaryotic DNA polymerase with a potential role in

meiosis. Journal of Molecular Biology, v. 301, n. 4, p. 851–867, 2000.

GARCÍA-ORTIZ, M. V.; ARIZA, R. R.; ROLDÁN-ARJONA, T. An OGG1

orthologue encoding a functional 8-oxoguanine DNA glycosylase/lyase in

Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology, v. 47, n. 6, p. 795–804, 2001.

GEHRING, M.; HUH, J. H.; HSIEH, T. F.; PENTERMAN, J.; CHOI, Y.; HARADA,

J. J.; GOLDBERG, R. B.; FISCHER, R. L. DEMETER DNA glycosylase

184

establishes MEDEA polycomb gene self-imprinting by allele-specific

demethylation. Cell, v. 124, n. 3, p. 495–506, 2006.

GEISSLER, T.; WESSJOHANN, L. A. A Whole-Plant Microtiter Plate Assay for

Drought Stress Tolerance-Inducing Effects. Journal of Plant Growth

Regulation, v. 30, n. 4, p. 504–511, 2011.

GILL, S. S.; TUTEJA, N. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in

abiotic stress tolerance in crop plants. Plant physiology and biochemistry :

PPB / Société française de physiologie végétale, v. 48, n. 12, p. 909–30, dez.

2010.

GOLDEMBERG, J.; COELHO, S. T.; GUARDABASSI, P. The sustainability of

ethanol production from sugarcane. Energy Policy, v. 36, n. 6, p. 2086–2097,

2008.

GONG, Z.; MORALES-RUIZ, T.; ARIZA, R. R.; ROLDÁN-ARJONA, T.; DAVID,

L.; ZHU, J. K. ROS1, a repressor of transcriptional gene silencing in Arabidopsis,

encodes a DNA glycosylase/lyase. cell, v. 111, n. 6, p. 803-814, 2002.

GORMAN, M. A.; MORERA, S.; ROTHWELL, D. G.; LA FORTELLE, E.; MOL, C.

D.; TAINER, J. A.; HICKSON, I. D.; & FREEMONT, P. S. The crystal structure of

the human DNA repair endonuclease HAP1 suggests the recognition of extra‐

helical deoxyribose at DNA abasic sites. The EMBO journal, v. 16, n. 21, p.

6548-6558, 1997.

GRADWOHL, G.; MÉNISSIER DE MURCIA, J. M.; MOLINETE, M.; SIMONIN,

F.; KOKEN, M.; HOEIJMAKERS, J. H.; DE MURCIA, G. The second zinc-finger

domain of poly(ADP-ribose) polymerase determines specificity for single-

stranded breaks in DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences

of the United States of America, v. 87, n. 8, p. 2990–4, 1990.

GRAFI, G.; OHAD, N. Plant epigenetics: a historical perspective. In: Epigenetic

Memory and Control in Plants. Springer, Berlin, Heidelberg. p. 1-19. 2013.

GRATIVOL, C.; REGULSKI, M.; BERTALAN, M.; MCCOMBIE, W. R.; SILVA, F.

R.; ZERLOTINI NETO, A.; ... & FERREIRA, P. C. G. Sugarcane genome

sequencing by methylation filtration provides tools for genomic research in the

genus Saccharum. The Plant Journal, v. 79, n. 1, p. 162-172, 2014.

185

GRIVET, L.; ARRUDA, P. Sugarcane genomics: depicting the complex genome

of an important tropical crop. Current opinion in plant biology, v. 5, n. 2, p.

122–7, abr. 2002.

GRIVET, L.; D’HONT, A.; ROQUES, D.; FELDMANN, P.; LANAUD, C.;

GLASZMANN, J. C. RFLP mapping in cultivated sugarcane (Saccharum spp.):

Genome organization in a highly polyploid and aneuploid interspecific hybrid.

Genetics, v. 142, n. 3, p. 987–1000, 1996.

GROLLMAN, A. P.; MORIYA, M. Mutagenesis by 8-oxoguanine: an enemy

within. Trends in genetics, v. 9, n. 7, p. 246-249, 1993.

GROSJEAN, H. DNA and RNA Modification Enzymes : Structure, Mechanism,

Function and Evolution. Landes bioscience, 2009.

GULBIS, J. M.; KELMAN, Z.; HURWITZ, J.; O’DONNELL, M.; KURIYAN, J.

Structure of the C-terminal region of p21(WAF1/CIP1) complexed with human

PCNA. Cell, v. 87, n. 2, p. 297–306, 1996.

GULBIS, J. M.; KELMAN, Z.; HURWITZ, J.; O’DONNELL, M.; KURIYAN, J.

Structure of the C-terminal region of p21(WAF1/CIP1) complexed with human

PCNA. Cell, v. 87, n. 2, p. 297–306, 1996.

GUTMAN, B. L.; NIYOGI, K. K. Evidence for base excision repair of oxidative

DNA damage in chloroplasts of Arabidopsis thaliana. Journal of Biological

Chemistry, v. 284, n. 25, p. 17006–17012, 2009.

HARTUNG, F.; PLCHOVÁ, H.; PUCHTA, H. Molecular characterisation of RecQ

homologues in Arabidopsis thaliana. Nucleic acids research, v. 28, n. 21, p.

4275–4282, 2000.

HASANUZZAMAN, M.; NAHAR, K.; & FUJITA, M. Extreme temperature

responses, oxidative stress and antioxidant defense in plants. In: Abiotic stress-

Plant responses and applications in agriculture. InTech, 2013.

HATA, S.; KOUCHI, H.; TANAKA, Y.; MINAMI, E.; MATSUMOTO, T.; SUZUKA,

I.; HASHIMOTO, J. Identification of carrot cDNA clones encoding a second

putative proliferating cell‐nuclear antigen, DNA polymerase δ auxiliary protein.

European Journal of Biochemistry, v. 203, n. 3, p. 367–371, 1992.

186

HAYS, J. B. Arabidopsis thaliana, a versatile model system for study of eukaryotic

genome-maintenance functions. DNA repair, v. 1, n. 8, p. 579-600, 2002.

HE, H.; CHEN, Q.; GEORGIADIS, M. M. High-resolution crystal structures reveal

plasticity in the metal binding site of apurinic/apyrimidinic endonuclease i.

Biochemistry, v. 53, n. 41, p. 6520–6529, 2014.

HE, X.-J.; CHEN, T.; ZHU, J.-K. Regulation and function of DNA methylation in

plants and animals. Cell Research, v. 21, n. 3, p. 442–465, 2011.

HERRMANN, G.; LINDAHL, T.; SCHÄR, P. Saccharomyces cerevisiae LIF1: A

function involved in DNA double-strand break repair related to mammalian

XRCC4. EMBO Journal, v. 17, n. 14, p. 4188–4198, 1998.

HOARAU, J. Y.; GRIVET, L.; OFFMANN, B.; RABOIN, L. M.; DIORFLAR, J. P.;

PAYET, J.; HELLMANN, M.; D’HONT, A.; GLASZMANN, J. C. Genetic dissection

of a modern sugarcane cultivar (Saccharum spp.). II. Detection of QTLs for yield

components. Theoretical and Applied Genetics, v. 105, n. 6–7, p. 1027–1037,

2002.

HOCH, N. C.; HANZLIKOVA, H.; RULTEN, S. L.; TÉTREAULT, M.;

KOMULAINEN, E.; JU, L.; HORNYAK, P.; ZENG, Z.; GITTENS, W.; REY, S. A.;

STARAS, K.; MANCINI, G. M. S.; MCKINNON, P. J.; WANG, Z. Q.; WAGNER,

J. D.; YOON, G.; CALDECOTT, K. W. XRCC1 mutation is associated with PARP1

hyperactivation and cerebellar ataxia. Nature, v. 541, n. 7635, p. 87–91, 2017.

HOLLIDAY, R.; PUGH, J. E. DNA modification mechanisms and gene activity

during development. Science (New York, N.Y.), v. 187, n. 4173, p. 226–232,

1975.

HOSFIELD, D. J.; MOL, C. D.; SHEN, B.; TAINER, J. A. Structure of the DNA

repair and replication endonuclease and exonuclease FEN-1: Coupling DNA and

PCNA binding to FEN-1 activity. Cell, v. 95, n. 1, p. 135–146, 1998.

HUGHES, A. L. The evolution of functionally novel proteins after gene duplication.

Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences, v. 256,

n. 1346, p. 119-124, 1994.

187

HUNT, L.; LERNER, F.; ZIEGLER, M. NAD–new roles in signalling and gene

regulation in plants. New Phytologist, v. 163, n. 1, p. 31-44, 2004.

HWANG, K. Y.; BAEK, K.; KIM, H. Y.; CHO, Y. The crystal structure of flap

endonuclease-1 from Methanococcus jannaschii. Nature Structural and

Molecular Biology, v. 5, n. 8, p. 707–713, 1998.

IKEDA, Y.; KINOSHITA, Y.; SUSAKI, D.; IKEDA, Y.; IWANO, M.; TAKAYAMA,

S.; HIGASHIYAMA, T.; KAKUTANI, T.; KINOSHITA, T. HMG Domain containing

SSRP1 is required for DNA demethylation and genomic imprinting in arabidopsis.

Developmental Cell, v. 21, n. 3, p. 589–596, 2011.

IKEJIMA, M.; NOGUCHI, S.; YAMASHITA, R.; OGURA, T.; SUGIMURA, T.;

GILL, D. M.; MIWA, M. The zinc fingers of human poly(ADP-ribose) polymerase

are differentially required for the recognition of DNA breaks and nicks and the

consequent enzyme activation. Other structures recognize intact DNA. Journal

of Biological Chemistry, v. 265, n. 35, p. 21907–21913, 1990.

INNAN, H.; & KONDRASHOV, F. The evolution of gene duplications: classifying

and distinguishing between models. Nature reviews. Nature reviews. Genetics,

v. 11, n. 2, p. 97, 2010.

INTERTHAL, H.; CHEN, H. J.; CHAMPOUX, J. J. Human Tdp1 cleaves a broad

spectrum of substrates, including phosphoamide linkages. Journal of Biological

Chemistry, v. 280, n. 43, p. 36518–36528, 2005.

INTERTHAL, H.; POULIOT, J. J.; CHAMPOUX, J. J. The tyrosyl-DNA

phosphodiesterase Tdp1 is a member of the phospholipase D superfamily.

Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 98, n. 21, p. 12009–

12014, 2001.

IRVINE, J. E. Saccharum species as horticultural classes. Theoretical and

Applied Genetics, v. 98, n. 2, p. 186–194, 1999.

ISHIKAWA, K.; OGAWA, T.; HIROSUE, E.; NAKAYAMA, Y.; HARADA, K.;

FUKUSAKI, E.; YOSHIMURA, K.; SHIGEOKA, S. Modulation of the Poly(ADP-

ribosyl)ation Reaction via the Arabidopsis ADP-Ribose/NADH

Pyrophosphohydrolase, AtNUDX7, Is Involved in the Response to Oxidative

Stress. PLANT PHYSIOLOGY, v. 151, n. 2, p. 741–754, 2009.

188

IZUMI, T.; BROWN, D. B.; NAIDU, C. V.; BHAKAT, K. K.; MACINNES, M. A.;

SAITO, H.; CHEN, D. J.; MITRA, S. Two essential but distinct functions of the

mammalian abasic endonuclease. Proceedings of the National Academy of

Sciences, v. 102, n. 16, p. 5739–5743, 2005.

IZUMI, T.; HAZRA, T. K.; BOLDOGH, I.; TOMKINSON, A. E.; PARK, M. S.;

IKEDA, S.; MITRA, S. Requirement for human AP endonuclease 1 for repair of

3’-blocking damage at DNA single-strand breaks induced by reactive oxygen

species. Carcinogenesis, v. 21, n. 7, p. 1329–1334, 2000.

JAIN, M.; NIJHAWAN, A.; ARORA, R.; AGARWAL, P.; RAY, S.; SHARMA, P.;

KAPOOR, S.; TYAGI, A. K.; KHURANA, J. P. F-Box Proteins in Rice. Genome-

Wide Analysis, Classification, Temporal and Spatial Gene Expression during

Panicle and Seed Development, and Regulation by Light and Abiotic Stress.

PLANT PHYSIOLOGY, v. 143, n. 4, p. 1467–1483, 2007.

JANSEN, M.; GILMER, F.; BISKUP, B.; NAGEL, K. A.; RASCHER, U.;

FISCHBACH, A.; BRIEM, S.; DREISSEN, G.; TITTMANN, S.; BRAUN, S.; DE

JAEGER, I.; METZLAFF, M.; SCHURR, U.; SCHARR, H.; WALTER, A.

Simultaneous phenotyping of leaf growth and chlorophyll fluorescence via

Growscreen Fluoro allows detection of stress tolerance in Arabidopsis thaliana

and other rosette plants. Functional Plant Biology, v. 36, n. 11, p. 902–914,

2009.

JAUCH, R.; YEO, H. C.; KOLATKAR, P. R.; CLARKE, N. D. Assessment of

CASP7 structure predictions for template free targets. Proteins: Structure,

Function, and Bioinformatics, v. 69, n. S8, p. 57-67, 2007.

JIA, Q.; DULK-RAS, A. Den; SHEN, H.; HOOYKAAS, P. J. J.; DE PATER, S.

Poly(ADP-ribose)polymerases are involved in microhomology mediated back-up

non-homologous end joining in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology,

v. 82, n. 4–5, p. 339–351, 2013.

JIANG, C.-Z.; YEE, J.; MITCHELL, D. L.; BRITT, A. B. Photorepair mutants of

Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 94, n. 14,

p. 7441–7445, 1997.

189

JILANI, A.; RAMOTAR, D.; SLACK, C.; ONG, C.; YANG, X. M.; SCHERER, S.

W.; LASKO, D. D. Molecular cloning of the human gene, PNKP, encoding a

polynucleotide kinase 3’-phosphatase and evidence for its role in repair of DNA

strand breaks caused by oxidative damage. Journal of Biological Chemistry,

v. 274, n. 34, p. 24176–24186, 1999.

JOHNSTON, L. H. The DNA repair capability of cdc9, the Saccharomyces

cerevisiae mutant defective in DNA ligase. Molecular & general genetics :

MGG, v. 170, n. 1, p. 89–92, 1979.

JOLDYBAYEVA, B.; PROROK, P.; GRIN, I. R.; ZHARKOV, D. O.; ISHENKO, A.

A.; TUDEK, B.; BISSENBAEV, A.K.; SAPARBAEV, M. Cloning and

characterization of a wheat homologue of apurinic/apyrimidinic endonuclease

Ape1L. PloS one, v. 9, n. 3, p. e92963, 2014.

JONES, D. T. GenTHREADER: an efficient and reliable protein fold recognition

method for genomic sequences. Journal of molecular biology, v. 287, n. 4, p.

797–815, 1999.

KAMATH-LOEB, A. S.; SHEN, J.-C.; LOEB, L. A.; FRY, M. Werner Syndrome

Protein: II. CHARACTERIZATION OF THE INTEGRAL 3′ → 5′ DNA

EXONUCLEASE . Journal of Biological Chemistry , v. 273, n. 51, p. 34145–

34150, 1998.

KANE, C. M.; & LINN, S. Purification and characterization of an

apurinic/apyrimidinic endonuclease from HeLa cells. Journal of Biological

Chemistry, v. 256, n. 7, p. 3405-3414, 1981.

KARANJA, K. K.; LIVINGSTON, D. M. C-terminal flap endonuclease (rad27 )

mutations: Lethal interactions with a DNA ligase I mutation (cdc9-p) and

suppression by proliferating cell nuclear antigen (POL30) in Saccharomyces

cerevisiae. Genetics, v. 183, n. 1, p. 63–78, 2009.

KARIMI-BUSHERI, F.; DALY, G.; ROBINS, P.; CANAS, B.; PAPPIN, D. J.;

SGOUROS, J.; MILLER, G. G.; FAKHRAI, H.; DAVIS, E. M.; LE BEAU, M. M.;

WEINFELD, M. Molecular characterization of a human DNA kinase. The Journal

of Biological Chemistry, v. 274, n. 34, p. 24187–24194, 1999.

190

KARLBERG, T.; LANGELIER, M. F.; PASCAL, J. M.; SCHÜLER, H. Structural

biology of the writers, readers, and erasers in mono-and poly (ADP-ribose)

mediated signaling. Molecular aspects of medicine, v. 34, n. 6, p. 1088-1108,

2013.

KAROW, J. K.; WU, L.; HICKSON, I. D. RecQ family helicases: roles in cancer

and aging. Current opinion in genetics & development, v. 10, n. 1, p. 32-38,

2000.

KARPLUS, K., BARRETT, C., & HUGHEY, R. Hidden Markov models for

detecting remote protein homologies. Bioinformatics (Oxford, England), v. 14,

n. 10, p. 846-856, 1998.

KASAI, H.; NISHIMURA, S. Formation of 8-hydroxyguanine by oxidative DNA

damage, its repair and its mutagenic effects. In: Advances in mutagenesis

Research. Springer, Berlin, Heidelberg,p. 31-45. 1993.

KELMAN, Z. PCNA: structure, functions and interactions. Oncogene, v. 14, n. 6,

p. 629–640, 1997.

KILIAN, J.; WHITEHEAD, D.; HORAK, J.; WANKE, D.; WEINL, S.; BATISTIC, O.;

D&APOS;ANGELO, C.; BORNBERG-BAUER, E.; KUDLA, J.; HARTER, K. The

AtGenExpress global stress expression data set: Protocols, evaluation and

model data analysis of UV-B light, drought and cold stress responses. Plant

Journal, v. 50, n. 2, p. 347–363, 2007.

KIMURA, S.; FURUKAWA, T.; KASAI, N.; MORI, Y.; KITAMOTO, H. K.;

SUGAWARA, F.; HASHIMOTO, J.; SAKAGUCHI, K. Functional characterization

of two flap endonuclease-1 homologues in rice. Gene, v. 314, n. 1–2, p. 63–71,

2003.

KIMURA, S.; TAHIRA, Y.; ISHIBASHI, T.; MORI, Y.; MORI, T.; HASHIMOTO, J.;

SAKAGUCHI, K. DNA repair in higher plants; photoreactivation is the major DNA

repair pathway in non-proliferating cells while excision repair (nucleotide excision

repair and base excision repair) is active in proliferating cells. Nucleic Acids

Research, v. 32, n. 9, p. 2760–2767, 2004.

KIMURA, S.; UEDA, T.; HATANAKA, M.; TAKENOUCHI, M.; HASHIMOTO, J.;

SAKAGUCHI, K. Plant homologue of flap endonuclease-1: Molecular cloning,

191

characterization, and evidence of expression in meristematic tissues. Plant

Molecular Biology, v. 42, n. 3, p. 415–427, 2000.

KINCH, L. N.; LI, W.; MONASTYRSKYY, B.; KRYSHTAFOVYCH, A.; GRISHIN,

N. V. Evaluation of free modeling targets in CASP11 and ROLL. Proteins:

Structure, Function and Bioinformatics, 2016.

KINOSHITA, T.; MIURA, A.; CHOI, Y.; KINOSHITA, Y.; CAO, X.; JACOBSEN, S.

E.; FISCHER, R. L.; KAKUTANI, T. One-Way Control of FWA Imprinting in

Arabidopsis Endosperm by DNA Methylation. Science, v. 303, n. 5657, p. 521–

523, 2004.

KISSOUDIS, C.; VAN DE WIEL, C.; VISSER, R. G.; VAN DER LINDEN, G.

Enhancing crop resilience to combined abiotic and biotic stress through the

dissection of physiological and molecular crosstalk. Frontiers in Plant Science, v.

5, p. 207, 2014.

KITAO, S.; SHIMAMOTO, A.; GOTO, M.; MILLER, R. W.; SMITHSON, W. A.;

LINDOR, N. M.; FURUICHI, Y. Mutations in RECQL4 cause a subset of cases of

Rothmund-Thomson syndrome. Nature Genetics, v. 22, n. 1, p. 82–84, 1999.

KLEPEIS, J. L.; WEI, Y.; HECHT, M. H.; FLOUDAS, C. A. Ab initio prediction of

the three-dimensional structure of a de novo designed protein: A double-blind

case study. Proteins: Structure, Function and Genetics, v. 58, n. 3, p. 560–

570, 2005.

KOHLHEPP, G. Análise da situação da produção de etanol e biodiesel no Brasil.

Estudos Avançados, v. 24, n. 68, p. 223–253, 2010.

KONDO, E.; GU, Z.; HORII, A.; FUKUSHIGE, S. The thymine DNA glycosylase

MBD4 represses transcription and is associated with methylated p16(INK4a) and

hMLH1 genes. Molecular and cellular biology, v. 25, n. 11, p. 4388–96, 2005.

KONTOPIDIS, G.; WU, S.-Y.; ZHELEVA, D. I.; TAYLOR, P.; MCINNES, C.;

LANE, D. P.; FISCHER, P. M.; WALKINSHAW, M. D. Structural and biochemical

studies of human proliferating cell nuclear antigen complexes provide a rationale

for cyclin association and inhibitor design. Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America, v. 102, n. 6, p. 1871–

6, 2005.

192

KOPP, J.; BORDOLI, L.; BATTEY, J. N. D.; KIEFER, F.; SCHWEDE, T.

Assessment of CASP7 predictions for template‐based modeling targets.

Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, v. 69, n. S8, p. 38-56, 2007.

KUMAR, S.; STECHER, G.; TAMURA, K. MEGA7: Molecular Evolutionary

Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets. Molecular biology and

evolution, v. 33, n. 7, p. 1870–1874, 2016.

KUO, C. F.; MCREE, D. E.; CUNNINGHAM, R. P.; TAINER, J. A. Crystallization

and crystallographic characterization of the iron-sulfur-containing DNA-repair

enzyme endonuclease III from Escherichia coli. Journal of Molecular Biology,

v. 227, n. 1, p. 347–351, 1992a.

KUO, C.; MCREE, D.; FISHER, C.; O’HANDLEY, S.; CUNNINGHAM, R.;

TAINER, J. Atomic structure of the DNA repair [4Fe-4S] enzyme endonuclease

III. Science, v. 258, n. 5081, p. 434–440, 1992b.

LAM, E.; SHINE, J.; DA SILVA, J.; LAWTON, M.; BONOS, S.; CALVINO, M.;

CARRER, H.; SILVA-FILHO, M. C.; GLYNN, N.; HELSEL, Z.; MA, J.; RICHARD,

E.; SOUZA, G. M.; MING, R. Improving sugarcane for biofuel: engineering for an

even better feedstock. GCB Bioenergy, v. 1, n. 3, p. 251–255, 2009.

LANG, Z.; WANG, Y.; TANG, K.; TANG, D.; DATSENKA, T.; CHENG, J.;

ZHANG, Y.; HANDA, A. K.; ZHU, J.-K. Critical roles of DNA demethylation in the

activation of ripening-induced genes and inhibition of ripening-repressed genes

in tomato fruit. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 114, n.

22, p. E4511–E4519, 2017.

LAQUEL, P.; LITVAK, S.; CASTROVIEJO, M. Mammalian proliferating cell

nuclear antigen stimulates the processivity of two wheat embryo DNA

polymerases. Plant physiology, v. 102, n. 1, p. 107–114, 1993.

LARIO, L. D.; RAMIREZ-PARRA, E.; GUTIERREZ, C.; CASATI, P.;

SPAMPINATO, C. P. Regulation of plant MSH2 and MSH6 genes in the UV-B-

induced DNA damage response. Journal of experimental botany, v. 62, n. 8,

p. 2925-2937, 2011.

193

LARSEN, E.; GRAN, C.; SAETHER, B. E.; SEEBERG, E.; KLUNGLAND, A.

Proliferation failure and gamma radiation sensitivity of Fen1 null mutant mice at

the blastocyst stage. Mol Cell Biol, v. 23, n. 15, p. 5346–53, 2003.

LE CUNFF, L.; GARSMEUR, O.; RABOIN, L. M.; PAUQUET, J.; TELISMART,

H.; SELVI, A.; GRIVET, L.; PHILIPPE, R.; BEGUM, D.; DEU, M.; COSTET, L.;

WING, R.; GLASZMANN, J.C.; D'HONT, A. Diploid/polyploid syntenic shuttle

mapping and haplotype-specific chromosome walking toward a rust resistance

gene (Bru1) in highly polyploid sugarcane (2n∼ 12x∼ 115). Genetics, v. 180, n.

1, p. 649-660, 2008.

LEE, J.; JANG, H.; SHIN, H.; CHOI, W. L.; MOK, Y. G.; & HUH, J. H.AP

endonucleases process 5-methylcytosine excision intermediates during active

DNA demethylation in Arabidopsis. Nucleic acids research, v. 42, n. 18, p.

11408-11418, 2014.

LEE, S.-Y.; KIM, H.; HWANG, H.-J.; JEONG, Y.-M.; NA, S. H.; WOO, J.-C.; KIM,

S.-G. Identification of Tyrosyl-DNA Phosphodiesterase as a Novel DNA Damage

Repair Enzyme in Arabidopsis. PLANT PHYSIOLOGY, v. 154, n. 3, p. 1460–

1469, 2010.

LEPINIEC, L.; BABIYCHUK, E.; KUSHNIR, S.; VAN MONTAGU, M.; INZÉ, D.

Characterization of an Arabidopsis thaliana cDNA homologue to animal poly(ADP

ribose) polymerase. FEBS Letters, v. 364, n. 2, p. 103–108, 1995.

LEVIN, J. D.; DEMPLE, B. Analysis of class II (hydrolytic) and class I (β-lyase)

apurinic/apyrimidinic endonucleases with a synthetic DNA substrate. Nucleic

Acids Research, v. 18, n. 17, p. 5069–5075, 1990.

LI, F.; FAN, G.; WANG, K.; SUN, F.; YUAN, Y.; SONG, G.; LI, Q.; MA, Z.; LU, C.;

ZOU, C.; CHEN, W.; LIANG, X.; SHANG, H.; LIU, W.; SHI, C.; XIAO, G.; GOU,

C.; YE, W.; XU, X.; ZHANG, X.; WEI, H.; LI, Z.; ZHANG, G.; WANG, J.; LIU, K.;

KOHEL, R. J.; PERCY, R. G.; YU, J. Z.; ZHU, Y. X.; WANG, J.; YU, S. Genome

sequence of the cultivated cotton gossypium arboreum. Nature Genetics, v. 46,

n. 6, p. 567–572, 2014.

LI, J.; LIANG, W.; LI, Y.; QIAN, W. APURINIC/APYRIMIDINIC

ENDONUCLEASE2 and ZINC FINGER DNA 3’-PHOSPHOESTERASE Play

194

Overlapping Roles in the Maintenance of Epigenome and Genome Stability. The

Plant cell, v. 2, p. tpc.00287.2018, 2018b.

LI, Y.; CÓRDOBA-CAÑERO, D.; QIAN, W.; ZHU, X.; TANG, K.; ZHANG, H.;

ARIZA, R.R.; ROLDÁN-ARJONA, T. & ZHU, J. K. An AP endonuclease functions

in active DNA demethylation and gene imprinting in Arabidopsis. PLoS genetics,

v. 11, n. 1, p. e1004905, 2015a.

LI, Y.; DUAN, C. G.; ZHU, X.; QIAN, W.; ZHU, J. K. A DNA ligase required for

active DNA demethylation and genomic imprinting in Arabidopsis. Cell

Research, v. 25, n. 6, p. 757–760, 2015b.

LI, Y.; KUMAR, S.; QIAN, W. Active DNA demethylation: mechanism and role in

plant development. Plant Cell Reports, v. 37, n. 1, p. 77–85, 2018a.

LI, Z.; DEFOORT, J.; TASDIGHIAN, S.; MAERE, S.; VAN DE PEER, Y.; DE

SMET, R. Gene Duplicability of Core Genes Is Highly Consistent across All

Angiosperms. The Plant Cell, v. 28, n. 2, p. 326–344, 2016.

LIEBER, M. R. The FEN‐1 family of structure‐specific nucleases in eukaryotic

DNA replication, recombination and repair. Bioessays, v. 19, n. 3, p. 233-240,

1997.

LIMA, W. C.; MEDINA-SILVA, R.; GALHARDO, R. S.; MENCK, C. F. M.

Distribution of DNA repair-related ESTs in sugarcane. Genetics and Molecular

Biology, v. 24, n. 1–4, p. 141–146, 2001.

LINDAHL, T. An N-Glycosidase from Escherichia coli That Releases Free Uracil

from DNA Containing Deaminated Cytosine Residues. Proceedings of the

National Academy of Sciences, v. 71, n. 9, p. 3649–3653, 1974.

LINDAHL, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature, v.

362, n. 6422, p. 709–715, 1993.

LINDLÖF, A. Gene identification through large-scale EST sequence processing.

Applied bioinformatics, v. 2, n. 3, p. 123–9, 2003.

LIU, F.; HUANG, N.; WANG, L.; LING, H.; SUN, T.; AHMAD, W.; MUHAMMAD,

K.; GUO, J.; XU, L.; GAO, S.; QUE, Y.; SU, Y. A novel l-ascorbate peroxidase 6

gene, ScAPX6, plays an important role in the regulation of response to biotic and

195

abiotic stresses in sugarcane. Frontiers in Plant Science, v. 8, n. January, p. 1–

13, 2018.

LIU, R.; HOW-KIT, A.; STAMMITTI, L.; TEYSSIER, E.; ROLIN, D.; MORTAIN-

BERTRAND, A.; HALLE, S.; LIU, M.; KONG, J.; WU, C.; DEGRAEVE-

GUIBAULT, C.; CHAPMAN, N. H.; MAUCOURT, M.; HODGMAN, T. C.; TOST,

J.; BOUZAYEN, M.; HONG, Y.; SEYMOUR, G. B.; GIOVANNONI, J. J.;

GALLUSCI, P. A DEMETER-like DNA demethylase governs tomato fruit ripening.

Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 112, n. 34, p. 10804–

10809, 2015.

LIU, S.; LIU, S.; WANG, M.; WEI, T.; MENG, C.; WANG, M.; XIA, G. A Wheat

SIMILAR TO RCD-ONE Gene Enhances Seedling Growth and Abiotic Stress

Resistance by Modulating Redox Homeostasis and Maintaining Genomic

Integrity. The Plant Cell, v. 26, n. 1, p. 164–180, 2014.

LIU, Z.; HOSSAIN, G. S.; ISLAS-OSUNA, M. A.; MITCHELL, D. L.; MOUNT, D.

W. Repair of UV damage in plants by nucleotide excision repair: Arabidopsis

UVH1 DNA repair gene is a homolog of Saccharomyces cerevisiae Rad1. Plant

Journal, v. 21, n. 6, p. 519–528, 2000.

LIWO, A.; KHALILI, M.; SCHERAGA, H. A. Ab initio simulations of protein-folding

pathways by molecular dynamics with the united-residue model of polypeptide

chains. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 102, n. 7, p.

2362–2367, 2005.

LOEB; L.A. Apurinic sites as mutagenic intermediates. Cell, v. 40, n. 3, p. 483-

484, 1985.

LÓPEZ, I.; KHAN, S.; VÁZQUEZ, J.; HUSSEY, P. J. The proliferating cell nuclear

antigen (PCNA) gene family in Zea mays is composed of two members that have

similar expression programmes. Biochimica et Biophysica Acta - Gene

Structure and Expression, v. 1353, n. 1, p. 1–6, 1997.

LOPEZ, I.; KHAN, S.; VAZQUEZ-RAMOS, J.; HUSSEY, P. J. Molecular cloning

of a maize cDNA clone encoding a putative proliferating cell nuclear antigen.

Biochim Biophys Acta, v. 1260, n. 1, p. 119–121, 1995.

196

LYNCH, M. The evolution of genetic networks by non-adaptive processes.

Nature Reviews Genetics, v. 8, n. 10, p. 803–813, 2007.

LYNCH, M.; & CONERY, J. S. The evolutionary demography of duplicate genes.

In: Genome Evolution. Springer Netherlands. p. 35-44. 2003a.

LYNCH, M.; & CONERY, J. S. The evolutionary fate and consequences of

duplicate genes. Science, v. 290, n. 5494, p. 1151-1155, 2000.

LYNCH, M.; & CONERY, J. S. The origins of genome complexity. science, v.

302, n. 5649, p. 1401-1404, 2003b.

LYNCH, M.; O'HELY, M.; WALSH, B.; & FORCE, A. The probability of

preservation of a newly arisen gene duplicate. Genetics, v. 159, n. 4, p. 1789-

1804, 2001.

MACOVEI, A.; BALESTRAZZI, A.; CONFALONIERI, M.; FAÉ, M.; CARBONERA,

D. New insights on the barrel medic MtOGG1 and MtFPG functions in relation to

oxidative stress response in planta and during seed imbibition. Plant Physiology

and Biochemistry, v. 49, n. 9, p. 1040–1050, 2011.

MADDISON, W.; KNOWLES, L. Inferring phylogeny despite incomplete lineage

sorting. Systematic Biology, v. 55, n. 1, p. 21–30, 2006.

MAGA, G.; HÜBSCHER, U. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA): a dancer

with many partners. Journal of Cell Science, v. 116, p. 3051–3060, 2003.

MAHMOOD-UL-HASSAN, M.; SUTHAR, V.; RAFIQUE, E.; AHMAD, R.; YASIN,

M. Kinetics of cadmium, chromium, and lead sorption onto chemically modified

sugarcane bagasse and wheat straw. Environmental Monitoring and

Assessment, v. 187, n. 7, 2015.

MAIRA, N.; TORRES, T. M.; DE OLIVEIRA, A. L.; DE MEDEIROS, S. R. B.;

AGNEZ-LIMA, L. F.; LIMA, J. P. M. S.; SCORTECCI, K. C. Identification,

characterisation and molecular modelling of two AP endonucleases from base

excision repair pathway in sugarcane provide insights on the early evolution of

green plants. Plant Biology, v. 16, n. 3, p. 622–631, 2014.

MANNERS, J. M.; & CASU, R. E. Transcriptome analysis and functional

genomics of sugarcane. Tropical Plant Biology, v. 4, n. 1, p. 9-21, 2011.

197

MANOVA, V.; GRUSZKA, D. DNA damage and repair in plants–from models to

crops. Frontiers in plant science, v. 6, 2015.

MANVILLA, B. A.; POZHARSKI, E.; TOTH, E. A.; & DROHAT, A. C. Structure of

human apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 with the essential Mg2+ cofactor.

Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography, v. 69, n. 12,

p. 2555-2562, 2013.

MARCHLER-BAUER, A.; BO, Y.; HAN, L.; HE, J.; LANCZYCKI, C. J.; LU,

S.;CHITSAZ, F.; DERBYSHIRE, M.K.; GEER, R.C.; GONZALES, N.R.; GWADZ,

M.; HURWITZ, D.I.; LU, F.; MARCHLER, G.H.; SONG, J.S.; THANKI, N.; WANG,

Z.; YAMASHITA, R.A.; ZHANG, D.; ZHENG, C.; GEER, L.Y.; BRYANT, S.H.

CDD/SPARCLE: functional classification of proteins via subfamily domain

architectures. Nucleic acids research, v. 45, n. D1, p. D200-D203, 2016.

MARCHLER-BAUER, A.; BRYANT, S. H. CD-search: protein domain annotations

on the fly. Nucleic acids research, v. 32, n. suppl_2, p. W327-W331, 2004.

MARCHLER-BAUER, A.; DERBYSHIRE, M. K.; GONZALES, N. R.; LU, S.;

CHITSAZ, F.; GEER, L. Y.;GEER, R.C.; HE, J.; GWADZ, M.; HURWITZ, D.I.;

LANCZYCKI, C.J.; LU, F.; MARCHLER, G.H.; SONG, J.S.; THANKI, N.; WANG,

Z.; YAMASHITA, R.A.; ZHANG, D.; ZHENG, C.; BRYANT, S.H. CDD: NCBI's

conserved domain database. Nucleic acids research, v. 43, n. D1, p. D222-

D226, 2014.

MARCHLER-BAUER, A.; LU, S.; ANDERSON, J. B.; CHITSAZ, F.;

DERBYSHIRE, M. K.; DEWEESE-SCOTT, C.; FONG, J.H.; GEER, L.Y.; GEER,

R.C.; GONZALES, N.R.; GWADZ, M.; HURWITZ, D.I.; JACKSON, J.D.; KE, Z.;

LANCZYCKI, C.J.; LU, F.; MARCHLER, G.H.; MULLOKANDOV, M.;

OMELCHENKO, M.V.; ROBERTSON, C.L.; SONG, J.S.; THANKI, N.;

YAMASHITA, R.A.; ZHANG, D.; ZHANG, N.; ZHENG, C.; BRYANT, S.H. CDD:

a Conserved Domain Database for the functional annotation of proteins. Nucleic

acids research, v. 39, n. suppl_1, p. D225-D229, 2010.

MARKLEY, N.-A.; YOUNG, D.; LAQUEL, P.; CASTROVIEJO, M.; MOLONEY, M.

M. Molecular genetic and biochemical analysis of Brassica napus proliferating

198

cell nuclear antigen function. Plant molecular biology, v. 34, n. 4, p. 693-700,

1997.

MARTÍNEZ-MACÍAS, M. I.; CO, D.; ARIZA, R. R.; ROLDA, T. The DNA repair

protein XRCC1 functions in the plant DNA demethylation pathway by stimulating

cytosine methylation (5-meC) excision, gap tailoring, and DNA ligation. Journal

of Biological Chemistry, v. 288, n. 8, p. 5496-5505, 2013.

MARTÍNEZ-MACÍAS, M. I.; QIAN, W.; MIKI, D.; PONTES, O.; LIU, Y.; TANG, K.;

LIU, R.; MORALES-RUIZ, T.; ARIZA, R. R.; ROLDÁN-ARJONA, T.; ZHU, J. K. A

DNA 3’ Phosphatase Functions in Active DNA Demethylation in Arabidopsis.

Molecular Cell, v. 45, n. 3, p. 357–370, 2012.

MATSUMOTO, K.; MORIUCHI, T.; KOJI, T.; NAKANE, P. K. Molecular cloning

of cDNA coding for rat proliferating cell nuclear antigen (PCNA)/cyclin. The

EMBO journal, v. 6, n. 3, p. 637–42, 1987.

MATSUMOTO, T.; HATA, S.; SUZUKA, I.; HASHIMOTO, J. Expression of

functional proliferating-cell nuclear antigen from rice (Oryza sativa) in Escherichia

coli. Activity in association with human DNA polymerase delta. Eur J Biochem,

v. 223, n. 1, p. 179–187, 1994.

MATSUZAKI, Y.; ADACHI, N.; KOYAMA, H. Vertebrate cells lacking FEN-1

endonuclease are viable but hypersensitive to methylating agents and H2O2.

Nucleic acids research, v. 30, n. 14, p. 3273–3277, 2002.

MCDOWELL, N. G.; BEERLING, D. J.; BRESHEARS, D. D.; FISHER, R. A.;

RAFFA, K. F.; STITT, M. The interdependence of mechanisms underlying

climate-driven vegetation mortality. Trends in ecology & evolution, v. 26, n. 10,

p. 523-532, 2011.

MICHAELI, R.; PHILOSOPH‐HADAS, S.; RIOV, J.; SHAHAK, Y.; RATNER, K.;

& MEIR, S. Chilling‐induced leaf abscission of Ixora coccinea plants. III.

Enhancement by high light via increased oxidative processes. Physiologia

plantarum, v. 113, n. 3, p. 338-345, 2001.

MICHAELS, M. L.; CRUZ, C.; GROLLMAN, A. P.; MILLER, J. H. Evidence that

MutY and MutM combine to prevent mutations by an oxidatively damaged form

199

of guanine in DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America, v. 89, n. 15, p. 7022–7025, 1992.

MOHYELDIN, A.; GARZÓN-MUVDI, T.; & QUIÑONES-HINOJOSA, A. Oxygen

in stem cell biology: a critical component of the stem cell niche. Cell stem cell,

v. 7, n. 2, p. 150-161, 2010.

MOLDOVAN, G. L., PFANDER, B., & JENTSCH, S. PCNA, the maestro of the

replication fork. Cell, 129(4), 665-679. 2007.

MUESER, T. C.; NOSSAL, N. G.; HYDE, C. C. Structure of bacteriophage T4

RNase H, a 5′ to 3′ RNA–DNA and DNA–DNA exonuclease with sequence

similarity to the RAD2 family of eukaryotic proteins. Cell, v. 85, n. 7, p. 1101-

1112, 1996.

MURPHY, T. M., BELMONTE, M., SHU, S., BRITT, A. B., & HATTEROTH, J.

Requirement for abasic endonuclease gene homologues in Arabidopsis seed

development. PLoS One, v. 4, n. 1, p. e4297, 2009.

NAKASHIMA, K.; YAMAGUCHI-SHINOZAKI, K. Regulons involved in osmotic

stress‐responsive and cold stress‐responsive gene expression in plants.

Physiologia plantarum, v. 126, n. 1, p. 62-71, 2006.

NASH, H. M.; BRUNER, S. D.; SCHÄRER, O. D.; KAWATE, T.; ADDONA, T. A.;

SPOONER, E.; LANE, W. S.; VERDINE, G. L. Cloning of a yeast 8-oxoguanine

DNA glycosylase reveals the existence of a base-excision DNA-repair protein

superfamily. Current Biology, v. 6, n. 8, p. 968–980, 1996.

NASH, H. M.; LU, R.; LANE, W. S.; VERDINE, G. L. The critical active-site amine

of the human 8-oxoguanine DNA glycosylase, hOgg1: Direct identification,

ablation and chemical reconstitution. Chemistry and Biology, v. 4, n. 9, p. 693–

702, 1997.

NOTA, F.; CAMBIAGNO, D. A.; RIBONE, P.; ALVAREZ, M. E. Expression and

function of AtMBD4L, the single gene encoding the nuclear DNA glycosylase

MBD4L in Arabidopsis. Plant Science, v. 235, p. 122–129, 2015.

OLDZIEJ, S.; CZAPLEWSKI, C.; LIWO, A.; CHINCHIO, M.; NANIAS, M.; VILA,

J. A.; KHALILI, M.; ARNAUTOVA, Y. A.; JAGIELSKA, A.; MAKOWSKI, M.;

200

SCHAFROTH, H. D.; KAZMIERKIEWICZ, R.; RIPOLL, D. R.; PILLARDY, J.;

SAUNDERS, J. A.; KANG, Y. K.; GIBSON, K. D.; SCHERAGA, H. A. Physics-

based protein-structure prediction using a hierarchical protocol based on the

UNRES force field: Assessment in two blind tests. Proceedings of the National

Academy of Sciences, v. 102, n. 21, p. 7547–7552, 2005.

ONO, A.; YAMAGUCHI, K.; FUKADA-TANAKA, S.; TERADA, R.; MITSUI, T.;

IIDA, S. A null mutation of ROS1a for DNA demethylation in rice is not

transmittable to progeny. Plant Journal, v. 71, n. 4, p. 564–574, 2012.

ORTEGA-GALISTEO, A. P.; MORALES-RUIZ, T.; ARIZA, R. R.; ROLDÁN-

ARJONA, T. Arabidopsis DEMETER-LIKE proteins DML2 and DML3 are required

for appropriate distribution of DNA methylation marks. Plant Molecular Biology,

v. 67, n. 6, p. 671–681, 2008.

OSAKABE, K.; YOSHIOKA, T.; ICHIKAWA, H.; TOKI, S. Molecular cloning and

characterization of RAD51-like genes from Arabidopsis thaliana. Plant

molecular biology, v. 50, n. 1, p. 71–81, 2002.

OSHIMA, J.; SIDOROVA, J. M.; MONNAT, R. J. Werner syndrome: clinical

features, pathogenesis and potential therapeutic interventions. Ageing research

reviews, v. 33, p. 105-114, 2017.

PANCHY, N.; LEHTI-SHIU, M. D.; SHIU, S.-H. Evolution of gene duplication in

plants. Plant Physiology, v. 171, n. August, p. pp.00523.2016, 2016.

PANDEY, P.; RAMEGOWDA, V.; SENTHIL-KUMAR, M. Shared and unique

responses of plants to multiple individual stresses and stress combinations:

physiological and molecular mechanisms. Frontiers in plant science, v. 6, p. 723,

2015.

PAPP, B.; PAL, C.; & HURST, L. D. Dosage sensitivity and the evolution of gene

families in yeast. Nature, v. 424, n. 6945, p. 194, 2003.

PARKINSON, J.; BLAXTER, M. Expressed Sequence Tags: an overview. In:

Expressed sequence tags (ESTs). Humana Press, p. 1-12. 2009.

201

PARSONS, J. L.; DIANOVA, I. I.; DIANOV, G. L. APE1 is the major 3′-

phosphoglycolate activity in human cell extracts. Nucleic Acids Research, v. 32,

n. 12, p. 3531–3536, 2004.

PENTERMAN, J.; ZILBERMAN, D.; HUH, J. H.; BALLINGER, T.; HENIKOFF, S.;

FISCHER, R. L. DNA demethylation in the Arabidopsis genome. Proceedings of

the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 104,

n. 16, p. 6752–7, 2007.

PEREIRA, N. A.; TAVARES, M. Efficiency of major producing regions of sugar

cane through Data Envelopment Analysis (DEA). Custos e Agronegocio, v. 13,

n. Special edition, p. 37–70, 2017.

PETRINI, J. H.; XIAO, Y.; WEAVER, D. T. DNA ligase I mediates essential

functions in mammalian cells. Molecular and cellular biology, v. 15, n. 8, p.

4303–4308, 1995.

PETRUCCO, S. Sensing DNA damage by PARP-like fingers. Nucleic Acids

Research, v. 31, n. 23, p. 6689–6699, 2003.

PETRUCCO, S.; VOLPI, G.; BOLCHI, A.; RIVETTI, C.; OTTONELLO, S. A nick-

sensing DNA 3′-repair enzyme from Arabidopsis. Journal of Biological

Chemistry, v. 277, n. 26, p. 23675–23683, 2002.

PETTERSEN, E. F.; GODDARD, T. D.; HUANG, C. C.; COUCH, G. S.;

GREENBLATT, D. M.; MENG, E. C.; FERRIN, T. E. UCSF Chimera—A

Visualization System for Exploratory Research and Analysis. J Comput Chem,

v. 25, p. 1605–1612, 2004.

PHAM, P. A.; WAHL, V.; TOHGE, T.; DE SOUZA, L. R.; ZHANG, Y.; DO, P. T.;

OLAS, J. J.; STITT, M.; ARAÚJO, W. L.; FERNIE, A. R. Analysis of knockout

mutants reveals non-redundant functions of poly(ADP-ribose)polymerase

isoforms in Arabidopsis. Plant Molecular Biology, v. 89, n. 4–5, p. 319–338,

2015.

PINES, A.; MULLENDERS, L. H.; VAN ATTIKUM, H.; LUIJSTERBURG, M. S.

Touching base with PARPs: moonlighting in the repair of UV lesions and double-

strand breaks. Trends in biochemical sciences, v. 38, n. 6, p. 321-330, 2013.

202

PIPERIDIS, G.; PIPERIDIS, N.; D’HONT, A. Molecular cytogenetic investigation

of chromosome composition and transmission in sugarcane. Molecular

Genetics and Genomics, v. 284, n. 1, p. 65–73, 2010.

PONTING, C. P.; KERR, I. D. A novel family of phospholipase D homologues that

includes phospholipid synthases and putative endonucleases: Identification of

duplicated repeats and potential active site residues. Protein Science, v. 5, n. 5,

p. 914-922, 1996.

POULIOT, J. J.; YAO, K. C.; ROBERTSON, C. A.; NASH, H. A. Yeast gene for a

Tyr-DNA phosphodiesterase that repairs topoisomerase I complexes. Science,

v. 286, n. 5439, p. 552–555, 1999.

PRASCH, C. M.; SONNEWALD, U. Simultaneous application of heat, drought

and virus to Arabidopsis thaliana plants reveals significant shifts in signaling

networks. Plant Physiology, p. pp. 113.221044, 2013.

PUNCHIHEWA, C.; INOUE, A.; HISHIKI, A.; FUJIKAWA, Y.; CONNELLY, M.;

EVISON, B.; SHAO, Y.; HEATH, R.; KURAOKA, I.; RODRIGUES, P.;

HASHIMOTO, H.; KAWANISHI, M.; SATO, M.; YAGI, T.; FUJII, N. Identification

of small molecule proliferating cell nuclear antigen (PCNA) inhibitor that disrupts

interactions with PIP-box proteins and inhibits DNA replication. Journal of

Biological Chemistry, v. 287, n. 17, p. 14289–14300, 2012.

RAMADAN, K.; SHEVELEV, I.; HÜBSCHER, U. The DNA-polymerase-X family:

controllers of DNA quality?. Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 5, n.

12, p. 1038, 2004.

RAMIRO-MERINA, Á.; ARIZA, R. R.; ROLDÁN-ARJONA, T. Molecular

characterization of a putative plant homolog of MBD4 DNA glycosylase. DNA

Repair, v. 12, n. 11, p. 890–898, 2013.

RASMUSSEN, S.; BARAH, P.; SUAREZ-RODRIGUEZ, M. C.;

BRESSENDORFF, S.; FRIIS, P.; COSTANTINO, P.; BONES, A. M.; NIELSEN,

H. B.; MUNDY, J. Transcriptome Responses to Combinations of Stresses in

Arabidopsis. PLANT PHYSIOLOGY, v. 161, n. 4, p. 1783–1794, 2013.

203

RASTOGI, R. P.; RICHA; KUMAR, A.; TYAGI, M. B.; SINHA, R. P. Molecular

Mechanisms of Ultraviolet Radiation-Induced DNA Damage and Repair. Journal

of Nucleic Acids, v. 2010, p. 1–32, 2010.

RIGGS, A. D. X inactivation, differentiation, and DNA methylation. Cytogenetic

and Genome Research, v. 14, n. 1, p. 9–25, 1975.

RISSEL, D.; LOSCH, J.; PEITER, E. The nuclear protein Poly(ADP-ribose)

polymerase 3 (AtPARP3) is required for seed storability in Arabidopsis thaliana.

Plant Biology, v. 16, n. 6, p. 1058–1064, 2014.

ROACH, B. T. Cytological studies in Saccharum. chromosome transmission

interspecific and intergeneric crosses. Int Soc Sugar Cane Technol Proc

Congr, 1969.

ROBSON, C. N.; HICKSON, I. D. Isolation of cDNA clones encoding a human

apurinic/apyrimidinic endonuclease that corrects DNA repair and mutagenesis

defects in E. coli xth (exonuclease III) mutants. Nucleic acids research, v. 19,

n. 20, p. 5519–23, 1991.

RODRIGO, G.; CARRERA, J.; RUIZ-FERRER, V.; DEL TORO, F. J.; LLAVE, C.;

VOINNET, O.; ELENA, S. F. Characterization of the Arabidopsis thaliana

interactome targeted by viruses. Santa Fe Institute Working Paper, 2011.

RODRÍGUEZ, M.; CANALES, E.; & BORRÁS-HIDALGO, O. Molecular aspects

of abiotic stress in plants. Biotecnología Aplicada, v. 22, n. 1, p. 1-10, 2005.

ROGERS, S. G.; & WEISS, B. Exonuclease III of Escherichia coli K-12, an AP

endonuclease. Methods in enzymology, v. 65, p. 201-211, 1980.

ROLDÁN-ARJONA, T.; ARIZA, R. R. Repair and tolerance of oxidative DNA

damage in plants. Mutation Research/Reviews in Mutation Research, v. 681,

n. 2, p. 169-179, 2009.

ROLDÁN-ARJONA, T.; GARCÍA-ORTIZ, M. V; RUIZ-RUBIO, M.; ARIZA, R. R.

cDNA cloning, expression and functional characterization of an Arabidopsis

thaliana homologue of the Escherichia coli DNA repair enzyme endonuclease III.

Plant molecular biology, v. 44, n. 1, p. 43–52, 2000.

204

ROY, A.; KUCUKURAL, A.; ZHANG, Y. I-TASSER: A unified platform for

automated protein structure and function prediction. Nature Protocols, v. 5, n.

4, p. 725–738, 2010.

ROY, S.; CHOUDHURY, S. R.; SINGH, S. K.; DAS, K. P. AtPollambda, a

homolog of mammalian DNA polymerase lambda in Arabidopsis thaliana, is

involved in the repair of UV-B induced DNA damage through the dark repair

pathway. Plant and Cell Physiology, v. 52, n. 2, p. 448–467, 2011.

ROY, S.; CHOUDHURY, S. R.; SINGH, S. K.; DAS, K. P. AtPolλ, a homolog of

mammalian DNA polymerase λ in Arabidopsis thaliana, is involved in the repair

of UV-B induced DNA damage through the dark repair pathway. Plant and cell

physiology, v. 52, n. 2, p. 448-467, 2011.

ROZEFF, N. Sugarcane and salinity—a review paper. Sugar Cane (United

Kingdom), 1995.

SAITOU, N.; NEI, M. The neighbor-joining method: a new method for

reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution, v. 4, n. 4,

p. 406–425, 1987.

SAKAMOTO, T.; ORTEGA, J. M. Ferramentas para análise filogenética e de

distribuição taxonômica de genes ortólogos. Belo Horizonte - MG, Brasil:

Universidade Federal de Minas Gerais, 2016. Disponível em:

<http://www.pgbioinfo.icb.ufmg.br/ defesas/106D.PDF>.

SAKURAI, S.; KITANO, K.; YAMAGUCHI, H.; HAMADA, K.; OKADA, K.;

FUKUDA, K.; UCHIDA, M.; OHTSUKA, E.; MORIOKA, H.; HAKOSHIMA, T.

Structural basis for recruitment of human flap endonuclease 1 to PCNA. EMBO

Journal, v. 24, n. 4, p. 683–693, 2005.

SALASSI, M. E., & BREAUX, J. B. Allocation of sugarcane planting costs in 2006.

Staff Report No, 2005.

ŠALI, A.; BLUNDELL, T. L. Comparative protein modelling by satisfaction of

spatial restraints. Journal of Molecular Biology, v. 234, n. 3, p. 779–815, 1993.

205

SALK, D.; AU, K.; HOEHN, H.; MARTIN, G. M. Cytogenetics of Werner’s

syndrome cultured skin fibroblasts: Variegated translocation mosaicism.

Cytogenetic and Genome Research, v. 30, n. 2, p. 92–107, 1981.

SANTERRE, A.; BRITT, A. B. Cloning of a 3-methyladenine-DNA glycosylase

from Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 91, n. 6, p. 2240–2244,

1994.

SATTLER, M. C.; CARVALHO, C. R.; CLARINDO, W. R. The polyploidy and its

key role in plant breeding. Planta, v. 243, n. 2, p. 281-296, 2016.

SCHERMERHORN, K. M.; DELANEY, S. Transient-state kinetics of

apurinic/apyrimidinic (AP) endonuclease 1 acting on an authentic AP site and

commonly used substrate analogs: The effect of diverse metal ions and base

mismatches. Biochemistry, v. 52, n. 43, p. 7669–7677, 2013.

SCHOFT, V. K.; CHUMAK, N.; CHOI, Y.; HANNON, M.; GARCIA-AGUILAR, M.;

MACHLICOVA, A.; SLUSARZ, L.; MOSIOLEK, M.; PARK, J.-S.; PARK, G. T.;

FISCHER, R. L.; TAMARU, H. Function of the DEMETER DNA glycosylase in the

Arabidopsis thaliana male gametophyte. Proceedings of the National

Academy of Sciences, v. 108, n. 19, p. 8042–8047, 2011.

SCHRÖPFER, S.; KOBBE, D.; HARTUNG, F.; KNOLL, A.; PUCHTA, H. Defining

the roles of the N-terminal region and the helicase activity of RECQ4A in DNA

repair and homologous recombination in Arabidopsis. Nucleic Acids Research,

v. 42, n. 3, p. 1684–1697, 2014.

SCHULZ, P.; JANSSEUNE, K.; DEGENKOLBE, T.; MERET, M.; CLAEYS, H.;

SKIRYCZ, A.; TEIGE, M.; WILLMITZER, L.; HANNAH, M. A. Poly(ADP-

Ribose)polymerase activity controls plant growth by promoting leaf cell number.

PLoS ONE, v. 9, n. 2, 2014.

SCHULZ, P.; NEUKERMANS, J.; VAN DER KELEN, K.; MÜHLENBOCK, P.;

VAN BREUSEGEM, F.; NOCTOR, G.; TEIGE, M.; METZLAFF, M.; HANNAH, M.

A. Chemical PARP inhibition enhances growth of arabidopsis and reduces

anthocyanin accumulation and the activation of stress protective mechanisms.

PLoS ONE, v. 7, n. 5, 2012.

206

SCHWARZ, R.; DAYHOFF, M. Matrices for Detecting Distant Relationships. In:

Dayhoff, M., Ed., Atlas of Protein Sequences, National Biomedical Research

Foundation, p.353-358.1979.

SCORTECCI, K. C.; LIMA, A. F. O.; CARVALHO, F. M.; SILVA, U. B.; AGNEZ-

LIMA, L. F.; DE MEDEIROS, S. R. B. A characterization of a MutM/Fpg ortholog

in sugarcane-A monocot plant. Biochemical and Biophysical Research

Communications, v. 361, n. 4, p. 1054–1060, 2007.

SHAIK, R.; RAMAKRISHNA, W. Genes and Co-Expression Modules Common to

Drought and Bacterial Stress Responses in Arabidopsis and Rice. PLoS ONE, v.

8, n. 10, 2013.

SHAKED, H.; AVIVI-RAGOLSKY, N.; LEVY, A. A. Involvement of the arabidopsis

SWI2/SNF2 chromatin remodeling gene family in DNA damage response and

recombination. Genetics, v. 173, n. 2, p. 985–994, 2006.

SHANKER, A. K.; MAHESWARI, M.; YADAV, S. K.; DESAI, S.; BHANU, D.;

ATTAL, N. B.; VENKATESWARLU, B. Drought stress responses in crops.

Functional & Integrative Genomics, v. 14, n. 1, p. 11–22, 2014.

SHARMA, R.; MOHAN SINGH, R. K.; MALIK, G.; DEVESHWAR, P.; TYAGI, A.

K.; KAPOOR, S.; KAPOOR, M. Rice cytosine DNA methyltransferases - Gene

expression profiling during reproductive development and abiotic stress. FEBS

Journal, v. 276, n. 21, p. 6301–6311, 2009.

SHEN, J. C.; GRAY, M. D.; OSHIMA, J.; KAMATH-LOEB, A. S.; FRY, M.; LOEB,

L. A. Werner syndrome protein: I. DNA helicase and DNA exonuclease reside on

the same polypeptide. Journal of Biological Chemistry, v. 273, n. 51, p. 34139–

34144, 1998.

SHIBUTANI, S.; TAKESHITA, M.; GROLLMAN, A. P. Insertion of specific bases

during DNA synthesis past the oxidation-damaged base 8-oxodG. Nature, v. 349,

n. 6308, p. 431–434, 1991.

SINGH, S. K.; CHOUDHURY, S. R.; ROY, S.; SENGUPTA, D. N. Understanding

DNA repair and recombination in higher plant genome: Information from genome-

wide screens in Arabidopsis and rice. Plant Signaling & Behavior, v. 6, n. 1, p.

120–122, 1 jan. 2011.

207

SINGH, S. K.; ROY, S.; CHOUDHURY, S. R.; SENGUPTA, D. N. DNA repair and

recombination in higher plants: insights from comparative genomics of

Arabidopsis and rice. BMC genomics, v. 11, p. 443, 2010.

SINGHAL, R. K.; PRASAD, R.; WILSON, S. H. DNA polymerase  β conducts the

gap-filling step in uracil-initiated base excision repair in a bovine testis nuclear

extract. Journal of Biological Chemistry, v. 270, n. 2, p. 949–957, 1995.

SJOLUND, A. B.; SENEJANI, A. G.; SWEASY, J. B. MBD4 and TDG:

multifaceted DNA glycosylases with ever expanding biological roles. Mutation

Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, v. 743,

p. 12-25, 2013.

SKOLNICK, J.; KIHARA, D.; ZHANG, Y. Development and large scale

benchmark testing of the PROSPECTOR_3 threading algorithm. Proteins:

Structure, Function and Genetics, v. 56, n. 3, p. 502–518, 2004.

SÖDING, J. Protein homology detection by HMM-HMM comparison.

Bioinformatics, v. 21, n. 7, p. 951–960, 2005.

SOLTIS, P. S.; MARCHANT, D. B.; VAN DE PEER, Y.; & SOLTIS, D. E.

Polyploidy and genome evolution in plants. Current opinion in genetics &

development, v. 35, p. 119-125, 2015.

SONG, J.; KEPPLER, B. D.; WISE, R. R.; BENT, A. F. PARP2 Is the Predominant

Poly(ADP-Ribose) Polymerase in Arabidopsis DNA Damage and Immune

Responses. PLoS Genetics, v. 11, n. 5, 2015.

SOUZA, G. M.; BERGES, H.; BOCS, S.; CASU, R.; D’HONT, A.; FERREIRA, J.

E.; HENRY, R.; MING, R.; POTIER, B.; SLUYS, M. V.; VINCENTZ M.;

PATERSON, A. H. The sugarcane genome challenge: strategies for sequencing

a highly complex genome. Tropical plant biology, v. 4, n. 3-4, p. 145-156, 2011.

SPAMPINATO, C. P. Protecting DNA from errors and damage: an overview of

DNA repair mechanisms in plants compared to mammals. Cellular and

Molecular Life Sciences, v. 74, n. 9, p. 1693–1709, 2017.

STIVERS, J. T.; JIANG, Y. L. A mechanistic perspective on the chemistry of DNA

repair glycosylases. Chemical Reviews, v. 103, n. 7, p. 2729–2759, 2003.

208

STORICI, F.; HENNEKE, G.; FERRARI, E.; GORDENIN, D. A.; HÜBSCHER, U.;

RESNICK, M. A. The flexible loop of human FEN1 endonuclease is required for

flap cleavage during DNA replication and repair. EMBO Journal, v. 21, n. 21, p.

5930–5942, 2002.

STRZALKA, W.; OYAMA, T.; TORI, K.; MORIKAWA, K. Crystal structures of the

Arabidopsis thaliana proliferating cell nuclear antigen 1 and 2 proteins complexed

with the human p21 C-terminal segment. Protein science : a publication of the

Protein Society, v. 18, n. 5, p. 1072–1080, 2009.

STRZALKA, W.; ZIEMIENOWICZ, A. Molecular cloning of Phaseolus vulgaris

cDNA encoding proliferating cell nuclear antigen. Journal of Plant Physiology,

v. 164, n. 2, p. 209–213, 2007.

STRZALKA, W.; ZIEMIENOWICZ, A. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA): a

key factor in DNA replication and cell cycle regulation. Annals of botany, v. 107,

n. 7, p. 1127-1140, 2011.

STUDIER, J. A.; KEPPLER, K. J. A note on the neighbor-joining algorithm of

Saitou and Nei. Molecular biology and evolution, v. 5, n. 6, p. 729–31, 1988.

SU, Y.; GUO, J.; LING, H.; CHEN, S.; WANG, S.; XU, L.; ALLAN, A. C.; QUE, Y.

Isolation of a novel peroxisomal catalase gene from sugarcane, which is

responsive to biotic and abiotic stresses. PLoS ONE, v. 9, n. 1, 2014.

SUH, D.; WILSON III, D. M.; & POVIRK, L. F. 3′-phosphodiesterase activity of

human apurinic/apyrimidinic endonuclease at DNA double-strand break ends.

Nucleic acids research, v. 25, n. 12, p. 2495-2500, 1997.

SUNDERLAND, P. A.; WEST, C. E.; WATERWORTH, W. M.; BRAY, C. M. An

evolutionarily conserved translation initiation mechanism regulates nuclear or

mitochondrial targeting of DNA ligase 1 in Arabidopsis thaliana. Plant Journal,

v. 47, n. 3, p. 356–367, 2006.

SUZUKA, I.; HATA, S.; MATSUOKA, M.; KOSUGI, S.; HASHIMOTO, J. Highly

conserved structure of proliferating cell nuclear antigen (DNA polymerase delta

auxiliary protein) gene in plants. European journal of biochemistry / FEBS, v.

195, n. 2, p. 571–575, 1991.

209

SUZUKI, N.; RIVERO, R. M.; SHULAEV, V.; BLUMWALD, E.; MITTLER, R.

Abiotic and biotic stress combinations. New Phytologist, v. 203, n. 1, p. 32–43,

2014.

TAMURA, K.; ADACHI, Y.; CHIBA, K.; OGUCHI, K.; TAKAHASHI, H.

Identification of Ku70 and Ku80 homologues in Arabidopsis thaliana: Evidence

for a role in the repair of DNA double-strand breaks. Plant Journal, v. 29, n. 6,

p. 771–781, 2002.

TAUTZ, D. Hypervariabflity of simple sequences as a general source for

polymorphic DNA markers. Nucleic Acids Research, v. 17, n. 16, p. 6463–6471,

1989.

TAYLOR, J. S.; & RAES, J. Duplication and divergence: the evolution of new

genes and old ideas. Annu. Rev. Genet.; v. 38, p. 615-643, 2004.

TAYLOR, R. M.; HAMER, M. J.; ROSAMOND, J.; BRAY, C. M. Molecular cloning

and functional analysis of the Arabidopsis thaliana DNA ligase I homologue.

Plant J, v. 14, n. 1, p. 75–81, 1998.

TAYLOR, R. M.; THISTLETHWAITE, A.; CALDECOTT, K. W. Central Role for

the XRCC1 BRCT I Domain in Mammalian DNA Single-Strand Break Repair.

Molecular and Cellular Biology, v. 22, n. 8, p. 2556–2563, 2002.

TAYLOR, W. R.; BARTLETT, G. J.; CHELLIAH, V.; KLOSE, D.; LIN, K.;

SHELDON, T.; JONASSEN, I. Prediction of protein structure from ideal forms.

Proteins: Structure, Function and Genetics, v. 70, n. 4, p. 1610–1619, 2008.

TEBBS, R. S.; FLANNERY, M. L.; MENESES, J. J.; HARTMANN, A.; TUCKER,

J. D.; THOMPSON, L. H.; CLEAVER, J. E.; PEDERSEN, R. A. Requirement for

the Xrcc1 DNA base excision repair gene during early mouse development.

Developmental biology, v. 208, n. 2, p. 513–29, 1999.

THAYER, M. M.; AHERN, H.; XING, D.; CUNNINGHAM, R. P.; TAINER, J. a.

Novel DNA binding motifs in the DNA repair enzyme endonuclease III crystal

structure. The EMBO journal, v. 14, n. 16, p. 4108–20, 1995.

THE POTATO GENOME SEQUENCING. Genome sequence and analysis of the

tuber crop potato. Nature, v. 475, p. 189–195, 2011.

210

THIRUGNANASAMBANDAM, P. P.; HOANG, N. V.; HENRY, R. J. The

Challenge of Analyzing the Sugarcane Genome. Frontiers in Plant Science, v.

9, n. May, 2018.

TIMOFEYEVA, N. A.; KOVAL, V. V.; KNORRE, D. G.; ZHARKOV, D. O.;

SAPARBAEV, M. K.; ISHCHENKO, A. A.; & FEDOROVA, O. S. Conformational

dynamics of human AP endonuclease in base excision and nucleotide incision

repair pathways. Journal of Biomolecular Structure and Dynamics, 26(5),

637-652. 2009.

TSUTAKAWA, S. E.; CLASSEN, S.; CHAPADOS, B. R.; ARVAI, A. S.; FINGER,

L. D.; GUENTHER, G.; TOMLINSON, C. G.; THOMPSON, P.; SARKER, A. H.;

SHEN, B.; COOPER, P. K.; GRASBY, J. A.; TAINER, J. A. Human flap

endonuclease structures, DNA double-base flipping, and a unified understanding

of the FEN1 superfamily. Cell, v. 145, n. 2, p. 198–211, 2011.

TUTEJA, N.; AHMAD, P.; PANDA, B. B.; TUTEJA, R. Genotoxic stress in plants:

shedding light on DNA damage, repair and DNA repair helicases. Mutation

research, v. 681, n. 2–3, p. 134–49, 2009.

UCHIYAMA, Y.; KIMURA, S.; YAMAMOTO, T.; ISHIBASHI, T.; SAKAGUCHI, K.

Plant DNA polymerase  λ, a DNA repair enzyme that functions in plant

meristematic and meiotic tissues. European Journal of Biochemistry, v. 271,

n. 13, p. 2799–2807, 2004.

UCHIYAMA, Y.; SUZUKI, Y.; SAKAGUCHI, K. Characterization of plant XRCC1

and its interaction with proliferating cell nuclear antigen. Planta, v. 227, n. 6, p.

1233–1241, 2008.

UCHIYAMA, Y.; TAKEUCHI, R.; KODERA, H.; SAKAGUCHI, K. Distribution and

roles of X-family DNA polymerases in eukaryotes. Biochimie, v. 91, n. 2, p. 165-

170, 2009.

UEDA, T.; NAKAMURA, C. Ultraviolet-defense mechanisms in higher plants.

Biotechnology & Biotechnological Equipment, v. 25, n. 1, p. 2177-2182,

2011.

UNIPROT CONSORTIUM, T. UniProt: the universal protein knowledgebase.

Nucleic Acids Research, v. 46, n. 5, p. 2699–2699, 2018.

211

VAN ATTIKUM, H.; BUNDOCK, P.; OVERMEER, R. M.; LEE, L. Y.; GELVIN, S.

B.; HOOYKAAS, P. J. J. The Arabidopsis AtLIG4 gene is required for the repair

of DNA damage, but not for the integration of Agrobacterium T-DNA. Nucleic

Acids Research, v. 31, n. 14, p. 4247–4255, 2003.

VANDERAUWERA, S.; DE BLOCK, M.; VAN DE STEENE, N.; VAN DE COTTE,

B.; METZLAFF, M.; VAN BREUSEGEM, F. Silencing of poly(ADP-ribose)

polymerase in plants alters abiotic stress signal transduction. Proceedings of

the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 104,

n. 38, p. 15150–15155, 2007.

VEITIA, R. A. Exploring the etiology of haploinsufficiency. Bioessays, v. 24, n. 2,

p. 175-184, 2002.

VEITIA, R. A.; BOTTANI, S.; & BIRCHLER, J. A. Cellular reactions to gene

dosage imbalance: genomic, transcriptomic and proteomic effects. Trends in

Genetics, v. 24, n. 8, p. 390-397, 2008.

VETTORE, A. L.; DA SILVA, F. R.; KEMPER, E. L.; ARRUDA, P. The libraries

that made SUCEST. Genetics and Molecular Biology, v. 24, n. 1–4, p. 1–7,

2001.

VETTORE, A. L.; DA SILVA, F. R.; KEMPER, E. L.; SOUZA, G. M.; DA SILVA,

A. M.; FERRO, M. I. T.; HENRIQUE-SILVA, F.; GIGLIOTI, ??der A.; LEMOS, M.

V. F.; COUTINHO, L. L.; NOBREGA, M. P.; CARRER, H.; FRAN??A, S. C.;

BACCI, M.; GOLDMAN, M. H. S.; GOMES, S. L.; NUNES, L. R.; CAMARGO, L.

E. A.; SIQUEIRA, W. J.; VAN SLUYS, M. A.; THIEMANN, O. H.; KURAMAE, E.

E.; SANTELLI, R. V.; MARINO, C. L.; TARGON, M. L. P. N.; FERRO, J. A.;

SILVEIRA, H. C. S.; MARINI, D. C.; LEMOS, E. G. M.; MONTEIRO-VITORELLO,

C. B.; TAMBOR, J. H. M.; CARRARO, D. M.; ROBERTO, P. G.; MARTINS, V.

G.; GOLDMAN, G. H.; DE OLIVEIRA, R. C.; TRUFFI, D.; COLOMBO, C. A.;

ROSSI, M.; DE ARAUJO, P. G.; SCULACCIO, S. A.; ANGELLA, A.; LIMA, M. M.

A.; DE ROSA, V. E.; SIVIERO, F.; COSCRATO, V. E.; MACHADO, M. A.;

GRIVET, L.; DI MAURO, S. M. Z.; NOBREGA, F. G.; MENCK, C. F. M.; BRAGA,

M. D. V; TELLES, G. P.; CARA, F. A. A.; PEDROSA, G.; MEIDANIS, J.;

ARRUDA, P. Analysis and functional annotation of an expressed sequence tag

212

collection for tropical crop sugarcane. Genome Research, v. 13, n. 12, p. 2725–

2735, 2003.

VICENTINI, R.; DEL BEM, L. E. V; VAN SLUYS, M. A.; NOGUEIRA, F. T. S.;

VINCENTZ, M. Gene Content Analysis of Sugarcane Public ESTs Reveals

Thousands of Missing Coding-Genes and an Unexpected Pool of Grasses

Conserved ncRNAs. Tropical Plant Biology, v. 5, n. 2, p. 199–205, 2012.

WANG, W.; VINOCUR, B.; ALTMAN, A. Plant responses to drought, salinity and

extreme temperatures: towards genetic engineering for stress tolerance. Planta,

v. 218, n. 1, p. 1-14, 2003.

WASEEM, N. H.; LABIB, K.; NURSE, P.; LANE, D. P. Isolation and analysis of

the fission yeast gene encoding polymerase delta accessory protein PCNA. The

EMBO journal, v. 11, n. 13, p. 5111–20, 1992.

WASI, S.; TABREZ, S.; AHMAD, M. Toxicological effects of major environmental

pollutants: an overview. Environmental monitoring and assessment, v. 185,

n. 3, p. 2585-2593, 2013.

WATERWORTH, W. M.; KOZAK, J.; PROVOST, C. M.; BRAY, C. M.; ANGELIS,

K. J.; WEST, C. E. DNA ligase 1 deficient plants display severe growth defects

and delayed repair of both DNA single and double strand breaks. BMC Plant

Biology, v. 9, 2009.

WATTERSON, G. A. On the time for gene silencing at duplicate loci. Genetics,

v. 105, n. 3, p. 745-766, 1983.

WEST, C. E.; WATERWORTH, W. M.; JIANG, Q.; BRAY, C. M. Arabidopsis DNA

ligase IV is induced by γ-irradiation and interacts with an Arabidopsis homologue

of the double strand break repair protein XRCC4. Plant Journal, v. 24, n. 1, p.

67–78, 2000.

WEST, C. E.; WATERWORTH, W. M.; STORY, G. W.; SUNDERLAND, P. A.;

JIANG, Q.; BRAY, C. M. Disruption of the Arabidopsis AtKu80 gene

demonstrates an essential role for AtKu80 protein in efficient repair of DNA

double-strand breaks in vivo. Plant Journal, v. 31, n. 4, p. 517–528, 2002.

213

WIEDENFELD, B. Effects of irrigation water salinity and electrostatic water

treatment for sugarcane production. Agricultural water management, v. 95, n.

1, p. 85-88, 2008.

WIEDERHOLD, L.; LEPPARD, J. B.; KEDAR, P.; KARIMI-BUSHERI, F.;

RASOULI-NIA, A.; WEINFELD, M.; TOMKINSON, A. E.; IZUMI, T.; PRASAD, R.;

WILSON, S. H.; MITRA, S.; HAZRA, T. K.; ANTONIO, S.; CAROLINA, N.; TG, A.

AP endonuclease-independent DNA base excision repair in human cells.

Molecular cell, v. 15, n. 2, p. 209-220, 2004.

WILSON 3RD, D. M.; SOFINOWSKI, T. M.; & MCNEILL, D. R. Repair

mechanisms for oxidative DNA damage.Frontiers in bioscience: a journal and

virtual library, v. 8, p. d963-81, 2003.

WINTER, D.; VINEGAR, B.; NAHAL, H.; AMMAR, R.; WILSON, G. V.;

PROVART, N. J. An “electronic fluorescent pictograph” Browser for exploring and

analyzing large-scale biological data sets. PLoS ONE, v. 2, n. 8, 2007.

WOOD, M. L.; ESSIGMANN, J. M.; DIZDAROGLU, M.; GAJEWSKI, E.

Mechanistic Studies of Ionizing Radiation and Oxidative Mutagenesis: Genetic

Effects of a Single 8-Hydroxyguanine (7-Hydro-8-oxoguanine) Residue Inserted

at a Unique Site in a Viral Genome. Biochemistry, v. 29, n. 30, p. 7024–7032,

1990.

WU, J.; HE, J.; MOUNTZ, J. D. Effect of age and apoptosis on the mouse

homologue of the huWRN gene. Mechanisms of Ageing and Development, v.

103, n. 1, p. 27–44, 1998.

WU, S.; SKOLNICK, J.; ZHANG, Y. Ab initio modeling of small proteins by

iterative TASSER simulations. BMC Biology, v. 5, 2007.

WU, S.; ZHANG, Y. A comprehensive assessment of sequence-based and

template-based methods for protein contact prediction. Bioinformatics, v. 24, n.

7, p. 924–931, 2008.

WU, Y. Q.; HOHN, B.; ZIEMIENOWICZ, A. Characterization of an ATP-

dependent type I DNA ligase from Arabidopsis thaliana. Plant Molecular

Biology, v. 46, n. 2, p. 161–170, 2001.

214

XANTHOUDAKIS, S.; SMEYNE, R. J.; WALLACE, J. D.; CURRAN, T. The

redox/DNA repair protein, Ref-1, is essential for early embryonic development in

mice. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 93, n. 17, p. 8919–8923, 1996.

XU, D.; ZHANG, Y. Ab initio protein structure assembly using continuous

structure fragments and optimized knowledge-based force field. Proteins:

Structure, Function and Bioinformatics, v. 80, n. 7, p. 1715–1735, 2012.

XU, D.; ZHANG, Y. Improving the physical realism and structural accuracy of

protein models by a two-step atomic-level energy minimization. Biophysical

Journal, v. 101, n. 10, p. 2525–2534, 2011.

YAMAGUCHI, M.; HAYASHI, Y.; HIROSE, F.; MATSUOKA, S.; MORIUCHI, T.;

SHIROISHI, T.; MORIWAKI, K.; MATSUKAGE, a. Molecular cloning and

structural analysis of mouse gene and pseudogenes for proliferating cell nuclear

antigen. Nucleic acids research, v. 19, n. 9, p. 2403–10, 1991.

YAMAGUCHI, M.; NISHIDA, Y.; MORIUCHI, T.; HIROSE, F.; HUI, C. C.;

SUZUKI, Y.; MATSUKAGE, A. Drosophila proliferating cell nuclear antigen

(cyclin) gene: structure, expression during development, and specific binding of

homeodomain proteins to its 5’-flanking region. Molecular and cellular biology,

v. 10, n. 3, p. 872–879, 1990.

YAMAMURO, C.; MIKI, D.; ZHENG, Z.; MA, J.; WANG, J.; YANG, Z.; DONG, J.;

ZHU, J. K. Overproduction of stomatal lineage cells in Arabidopsis mutants

defective in active DNA demethylation. Nature Communications, v. 5, 2014.

YAN, H.; CHEN, C. Y.; KOBAYASHI, R.; NEWPORT, J. Replication focus-

forming activity 1 and the Werner syndrome gene product. Nature genetics, v.

19, n. 4, p. 375–8, 1998.

YANG, J.; YAN, R.; ROY, A.; XU, D.; POISSON, J.; ZHANG, Y. The I-TASSER

Suite: Protein structure and function prediction. Nature Methods, v. 12, p. 7–8,

2015.

YANG, J.; ZHANG, Y. I-TASSER server: New development for protein structure

and function predictions. Nucleic Acids Research, v. 43, n. W1, p. W174–W181,

2015.

215

YANG, S. W.; BURGIN, A. B.; HUIZENGA, B. N.; ROBERTSON, C. A.; YAO, K.

C.; NASH, H. A. A eukaryotic enzyme that can disjoin dead-end covalent

complexes between DNA and type I topoisomerases. Proceedings of the

National Academy of Sciences, v. 93, n. 21, p. 11534–11539, 1996.

YANG, X.; YE, C. Y.; CHENG, Z. M.; TSCHAPLINSKI, T. J.; WULLSCHLEGER,

S. D.; YIN, W.; XIA, X. & TUSKAN, G. A. Genomic aspects of research involving

polyploid plants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), v. 104, n. 3,

p. 387-397, 2011a.

YANG, Y.; FARAGGI, E.; ZHAO, H.; ZHOU, Y. Improving protein fold recognition

and template-based modeling by employing probabilistic-based matching

between predicted one-dimensional structural properties of query and

corresponding native properties of templates. Bioinformatics, v. 27, n. 15, p.

2076–2082, 2011b.

YANG, Z. Computational molecular evolution. Oxford series in ecology and

evolution, p. xvi, 357, 2006.

YAO, Q.; SONG, C. X.; HE, C.; KUMARAN, D.; DUNN, J. J. Heterologous

expression and purification of Arabidopsis thaliana VIM1 protein: In vitro evidence

for its inability to recognize hydroxymethylcytosine, a rare base in Arabidopsis

DNA. Protein Expression and Purification, v. 83, n. 1, p. 104–111, 2012.

YILMAZ, A.; NISHIYAMA, M. Y.; FUENTES, B. G.; SOUZA, G. M.; JANIES, D.;

GRAY, J.; GROTEWOLD, E. GRASSIUS: A Platform for Comparative Regulatory

Genomics across the Grasses. PLANT PHYSIOLOGY, v. 149, n. 1, p. 171–180,

2009.

YODER, J. A.; WALSH, C. P.; BESTOR, T. Cytosine methylation and the ecology

of intragenomic parasites. Trends in genetics, v. 13, n. 8, p. 335-340, 1997.

YOSHIYAMA, K. O.; SAKAGUCHI, K.; & KIMURA, S. DNA damage response in

plants: conserved and variable response compared to animals. Biology, v. 2, n.

4, p. 1338-1356, 2013.

YU, C.-E.; OSHIMA, J.; FU, Y.-H.; WIJSMAN, E. M.; HISAMA, F.; ALISCH, R.;

MATTHEWS, S.; NAKURA, J.; MIKI, T.; OUAIS, S.; MARTIN, G. M.; MULLIGAN,

216

J.; SCHELLENBERG, G. D. Positional Cloning of the Werner’s Syndrome Gene.

Science, v. 272, n. 5259, p. 258–262, 1996.

ZHANG, H.; GU, Z.; WU, Q.; YANG, L.; LIU, C.; MA, H.; XIA, Y.; GE, X.

Arabidopsis PARG1 is the key factor promoting cell survival among the enzymes

regulating post-translational poly(ADP-ribosyl)ation. Scientific Reports, v. 5,

2015.

ZHANG, J.; XIE, S.; ZHU, J. K.; GONG, Z. Requirement for flap endonuclease 1

(FEN1) to maintain genomic stability and transcriptional gene silencing in

Arabidopsis. The Plant journal : for cell and molecular biology, v. 87, n. 6, p. 629–

640, 2016b.

ZHANG, X.; YANG, Y.; ZOU, J.; CHEN, Y.; WU, Q.; GUO, J.; QUE, Y.; XU, L.

ScMED7, a sugarcane mediator subunit gene, acts as a regulator of plant

immunity and is responsive to diverse stress and hormone treatments. Molecular

Genetics and Genomics, v. 292, n. 6, p. 1363–1375, 2017.

ZHANG, Y. I-TASSER server for protein 3D structure prediction. BMC

Bioinformatics, v. 9, 2008.

ZHANG, Y.; WEN, C.; LIU, S.; ZHENG, L.; SHEN, B.; TAO, Y. Shade avoidance

6 encodes an arabidopsis flap endonuclease required for maintenance of

genome integrity and development. Nucleic Acids Research, v. 44, n. 3, p.

1271–1284, 2016a.

ZHARKOV, D. O. Review Base excision DNA repair. Cellular and Molecular

Life Sciences, v. 65, p. 1544–1565, 2008.

ZHARKOV, D. O.; GROLLMAN, A. P. The DNA trackwalkers: principles of lesion

search and recognition by DNA glycosylases. Mutation Research/Fundamental

and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, v. 577, n. 1, p. 24-54, 2005.

ZHENG, L.; JIA, J.; FINGER, L. D.; GUO, Z.; ZER, C.; SHEN, B. Functional

regulation of FEN1 nuclease and its link to cancer. Nucleic acids research, v.

39, n. 3, p. 781-794, 2010.

ZHENG, L.; ZHOU, M.; CHAI, Q.; PARRISH, J.; XUE, D.; PATRICK, S. M.;

TURCHI, J. J.; YANNONE, S. M.; CHEN, D.; SHEN, B. Novel function of the flap

217

endonuclease 1 complex in processing stalled DNA replication forks. EMBO

Reports, v. 6, n. 1, p. 83–89, 2005.

ZILBERMAN, D.; GEHRING, M.; TRAN, R. K.; BALLINGER, T.; HENIKOFF, S.

Genome-wide analysis of Arabidopsis thaliana DNA methylation uncovers an

interdependence between methylation and transcription. Nature Genetics, v. 39,

n. 1, p. 61–69, 2007.