UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO

DOUTORADO EM BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS

AVALIAÇÃO DO PERFIL IMUNOLÓGICO COM ÊNFASE NA RESPOSTA T

REGULATÓRIA ANTE A INFECÇÃO DO HELICOBACTER PYLORI EM

PACIENTES COM GASTRITE

JAIR FRANCISCO DE SANTANA GRAIM

Belém-Pará

2014

JAIR FRANCISCO DE SANTANA GRAIM

AVALIAÇÃO DO PERFIL IMUNOLÓGICOCOM ÊNFASE NA RESPOSTA T

REGULATÓRIA ANTE A INFECÇÃO DO HELICOBACTER PYLORI EM

PACIENTES COM GASTRITE

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biologia de Agentes

Infecciosos e Parasitários do Instituto de

Ciências Biológicas da Universidade Federal

do Pará como requisito parcial para a obtenção

do grau de Doutor em Biologia dos Agentes

Infecciosos e Parasitários.

Orientador: Prof. Dr. Juarez Antonio Simões

Quaresma

Belém – Pará

2014

Graim, Jair Francisco de Santana

Avaliação do perfil imunológico com ênfase na resposta T regulatória

ante a infecção do H. Pylori em pacientes com gastrite, Belém-Pará,

2013, 129p, Tese de Doutorado em Biologia dos Agentes Infecciosos e

Parasitários.

1. Helicobacter pylori 2. Resposta T regulatória 3. Gastrites

1

JAIR FRANCISCO DE SANTANA GRAIM

AVALIAÇÃO DO PERFIL IMUNOLÓGICO COM ÊNFASE NA RESPOSTA T

REGULATÓRIA ANTE A INFECÇÃO DO HELICOBACTER PYLORI EM

PACIENTES COM GASTRITE

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e

Parasitários do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como

requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Biologia dos Agentes

Infecciosos e Parasitários.

Orientador: Prof. Dr. Juarez Antonio Simões Quaresma

Instituto de Ciências Biológicas - UFPA.

Banca Examinadora: Profa. Dra. Ana Cecília Ribeiro Cruz

Instituto Evandro Chagas - IEC/PA

Prof. Dr. Ismaelino Mauro Nunes Magno

Centro de Estudos Superiores do Pará - CESUPA

Profa. Dra. Helen Thais Fuzii

Universidade Federal do Pará - UFPA

Profa. Dra. Fabiola Elizabeth Villanova

Universidade Federal do Pará - UFPA

Profa. Dra. Luisa Carício Martins

Núcleo de Medicina Tropical - NMT/UFPA

Belém, 24 de junho de 2014

2

“A mente que se abre a uma nova idéia

jamais voltará ao seu tamanho original.”

Albert Einstein

3

À memória de meu pai, por todos os aprendizados e,

em particular por me ensinar “o que é certo e o que é errado”.

de minha avó, Hilda, exemplo de mulher, minha maior incentivadora.

do meu tio, Cecílio, por sempre ter acreditado em mim e por ter sido meu esteio na

hora que mais precisava.

4

AGRADECIMENTOS

A meu Deus por ter me dado o bem mais valioso que um ser humano pode ter, a vida.

À Universidade do Estado do Pará, por ter proporcionado o Programa de Pós-

Graduação Interinstitucional com a Universidade Federal do Pará, contribuindo para

melhor qualificação de seus docentes;

Ao Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, em especial ao

Programa de Pós-Graduação em Biologia dos Agentes Infecciosos e Parasitários

(BAIP), pelo esmero em contribuir para a formação de profissionais que contribuirão

para o engrandecimento de nosso Estado e de toda a Amazônia;

Ao meu orientador, Prof. Dr. Juarez Antônio Simões Quaresma, por ter aceitado o

desafio de orientação deste trabalho, assim como pela sua atenção, paciência,

compreensão, incentivo e apoio que nos foi tão valiosos até mesmo nos momentos mais

difíceis;

Ao Núcleo de Medicina Tropical (NMT/UFPA) por ter permitido a realização deste

trabalho em seus domínios.

Ao Laboratório Sabin que, gentilmente, cedeu o material para a realização desse estudo.

Aos Professores do curso de Pós-graduação a nível de Doutorado em Biologia dos

Agentes Infecciosos e Parasitários do Centro de Ciências Biológicas da Universidade

Federal do Pará.

5

Ao Prof. Dr. Ricardo Ishak que muito acreditou e me incentivou para que eu pudesse

estar realizando e concluindo mais uma das etapas importantes da minha carreira

acadêmica.

A Profa. Dra. Rosana Libonati, pela grande contribuição nas orientações em Estatística.

Ao Hospital Ophir Loyola, meu local de trabalho, pela compreensão permitindo que eu

pudesse me ausentar para realização deste curso de doutorado.

Ao Prof. Doutor Jorge Rodrigues de Souza, pesquisador do Laboratório de

imunopatologia do Núcleo de Medicina Tropical (NMT) da UFPA, pela grande

contribuição nas orientações para melhor desenvolvimento deste trabalho.

A Profa. Dra. Tinara Leila de Souza Aarão, pesquisadora do Laboratório de

imunopatologia do Núcleo de Medicina Tropical (NMT) da UFPA, professora de

imunologia da UEPA, grande colaboradora e incentivadora deste trabalho.

Aos professores da Banca de Qualificação, Profa. Dra. Ana Cecília Ribeiro Cruz, Prof.

Dr. Ismaelino Mauro Nunes Magno, Profa. Dra. Luisa Carício Martins, Profa. Dra.

Hellen Thais Fuzii, a Profa. Dra. Fabiola Elizabeth Villanova.

A Sra. Luciene Dias Cavalcante, Bibliotecária - Coordenadora da Divisão de

Documentação e Biblioteca do Hospital Ophir Loyola, pela sua prestimosa colaboração

na revisão deste documento.

Aos pacientes que participaram desta pesquisa pela importante contribuição para o

desenvolvimento deste estudo.

Aos meus queridos irmãos Rosi e Beto, pelo incentivo e pelo amor que nos mantêm

sempre unidos.

A minha esposa, Nildinha, que com paciência e sabedoria soube contornar e

compreender os momentos mais tensos;

6

Aos meus filhos, Antonio Neto e Priscila, presentes de Deus;

Aos meus pais, Antonio (in memorian) e Rosa, meus maiores incentivadores, meus

espelhos, meus amigos, meus amores, por tudo que me proporcionaram para que eu

pudesse chegar aonde cheguei.

7

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS 10

LISTA DE FIGURAS 11

LISTA DE ABREVIATURAS 13

RESUMO 15

ABSTRACT 16

1 INTRODUÇÃO 17

1.1 O GÊNERO HELICOBACTER 18

1.1.1 A bactéria Helicobacter pylori 19

1.1.1.1 Histórico 19

1.1.1.2 Morfologia da bactéria Helicobacter pylori 21

1.1.1.3 Genoma da bactéria Helicobacter pylori 22

1.1.1.4 Modos de transmissão do H. pylori 25

1.2 EPIDEMIOLOGIA DO H. pylori 26

1.2.1 Prevalência 26

1.3 PATOGÊNESE E FATORES DE VIRULÊNCIA 26

1.3.1 Fatores de colonização 28

1.3.1.1 Motilidade 28

1.3.1.2 Microaerofilismo 30

1.3.1.3 Urease 30

1.3.1.4 HspA e HspB 31

1.3.1.5 Adesinas 31

1.3.2 Fatores de persistência 33

1.3.2.1 Lipopolissacarídeos 33

1.3.2.2 Mimetismo molecular 33

1.3.2.3 Forma cocóide 34

1.3.2.4 Catalase e superóxido dismutase 34

1.3.3 Fatores que induzem a doença 34

1.3.3.1 Proteases e lipases 35

8

1.3.3.2 Citotoxina vacuolizante 35

1.3.3.3 Citotoxina associada ao grupo A (CagA) 38

1.4 ASSOCIAÇÃO ENTRE DOENÇAS GASTROINTESTINAIS E H.

pylori

42

1.5 RESPOSTA IMUNOLÓGICA AO H. pylori 45

1.6 PRINCIPAIS CÉLULAS ENVOLVIDAS NA RESPOSTA IMUNE

PARA H. pylori

47

1.6.1 Macrófagos 47

1.6.2 Células Epiteliais 49

1.6.3 Células Dendríticas 49

1.6.4 Linfócitos 50

1.6.4.1 Células B 50

1.6.4.2 Células T 51

1.7 LINFÓCITO T REGULADOR 52

1.7.1 Fator de Transcrição FOXP3 54

1.7.2 Mecanismos de ação das Tregs 55

1.7.3 Papel das células T reguladoras nas doenças infecciosas 56

1.8 DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO PELO H. PYLORI 57

1.9 OBJETIVOS 61

1.9.1 Objetivo Geral 61

1.9.2 Objetivos Específicos 61

2 MATERIAL E MÉTODOS 62

2.1 POPULAÇÃO DE ESTUDO 62

2.2 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO NO ESTUDO 62

2.2.1 Critérios de inclusão 62

2.2.2 Critérios de exclusão 62

2.3 COLETA E PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS 63

2.3.1

2.3.2

Biópsias

Análise Histopatológica

63

63

2.4 DESCRIÇÃO DAS TÉCNICAS LABORATORIAIS 63

2.4.1 Detecção Histopatológica do H. pylori 63

2.4.2 Detecção das células CD4, CD8, CD20, Neutrófilos e Linfócitos T

regulatórios na biópsia gástrica

63

9

2.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA 66

3 RESULTADOS 67

4 DISCUSSÃO 80

5 CONCLUSÃO 89

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 90

ANEXOS

10

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Resultado das amostras estudadas quanto a presença e ausência de

H. pylori.............................................................................................

67

Tabela 2 - Estatística descritiva da variável CD20.............................................

68

Tabela 3 - Estatística descritiva da variável CD4...............................................

70

Tabela 4 - Estatística descritiva da variável CD8..............................................

71

Tabela 5 - Estatística descritiva da variável Neutrófilos...................................

72

Tabela 6 - Estatística descritiva da variável FoxP3...........................................

73

Tabela 7 - Frequência de H. pylori quanto ao número de cruzes, onde 0 =

ausência; 1 = uma cruz; 2 = duas cruzes; 3 = três cruzes .................

74

11

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Microfotografia Eletrônica do H. pylori, demonstrando sua

morfologia curvada e seus flagelos

21

Figura 2 Representação gráfica do primeiro genoma sequenciado do H.

pylori 26695

23

Figura 3 Mosaico do gene vacA adaptado de Atherton et al.

24

Figura 4 Fatores de virulência da bactéria H. pylori

28

Figura 5 Fator de colonização: motilidade e adesão do H. pylori

29

Figura 6 Atividade ureásica do H. pylori

30

Figura 7 Adesão do H. pylori à mucosa gástrica por meio de adesinas

32

Figura 8 Mosaico do gene vacA

36

Figura 9 Representação esquemática dos dois modelos de mecanismo de

ação da citotoxina VacA

38

Figura 10 Ilha de patogenicidade Cag (citotoxin antigen associated)

39

Figura 11 Representação esquemática da ação da citotoxina CagA

41

Figura 12 Representação esquemática da resposta imunológica à infecção

pelo H. pylori

45

Figura 13 Estrutura da proteína FOXP3, com domínio repressor, central

composto por dedos de zinco (ZnF) e zíper de leucina (Zip), e o

domínio forkhead

55

Figura 14 Modelos de mecanismos de ação das Tregs

56

Figura 15 Quantidade de células CD20 encontradas em lâminas H. pylori

positivo e H. pylori negativo

69

Figura 16 Quantidade de células CD4 encontradas nas amostras contendo H.

pylori positivo e H. pylori negativo

70

Figura 17 Quantidade de células CD8 encontradas nas amostras contendo H.

pylori positivo e H. pylori negativo

71

Figura 18 Quantidade de Neutrófilos encontrados na presença de H. pylori

positivo e H. pylori negativo

72

12

Figura 19 Quantidade de células Treg (FoxP3) encontradas nas amostras de

H. pylori positivo e H. pylori negativo

73

Figura 20 Correlação negativa entre a quantidade de células CD4 e H. pylori

75

Figura 21 Correlação negativa entre a quantidade de células CD8 e H. pylori

76

Figura 22 Correlação negativa entre a quantidade de células CD20 e H.

pylori

77

Figura 23 Correlação positiva entre a quantidade de células Treg FoxP3 e H.

pylori

78

Figura 24 Correlação negativa entre a quantidade de neutrófilos e H. pylori

79

13

LISTA DE ABREVIATURAS

AA Aminoácidos

Ag Antígeno

AGS Human gastric adenocarcinoma cells

AlpA Lipoproteina associada à aderência A

AlpB Lipoproteina associada à aderência B

APC Antigen presenting cell

ATPase Enzima de ativação da bomba de prótons

BabA Blood group antigen binding adesin A

BSA Soro Albumina bovina

cagPAI Ilha de patogenicidade cag

cagA Cytotoxin associated gene A

CCR Receptores de quimiocina

CD4 Cluster of diferentation 4

CD8 Cluster of diferentation 8

CTLA Linfócito T citotóxico

DNA Deoxyribonucleic acid

ELISA Enzime-linked immunosorbent assay

h hora

FISH Hibridização in situ com fluorescência

HE Hematoxilina-Eosina

H. pylori Helicobacter pylori

IARC International Agency for Research on Câncer

IFN-γ Interferon gama

IgA Imunoglobulina A

IgG Imunoglobulina G

IgM Imunoglobulina M

IL Interleucina

INCA Instituto Nacional do Câncer

IPEX Immunodeficiency, poliendocrinopathy and enteropathy X-linked syndrome

IS Sequência de inserção

Kb Kilobites

KDa Kilodaltons

KP Lisina-prolina

LPS Lipopolissacarídeos

Mb Megabites

MALT Mucosa associated lymphoid tissue

MAP Mitogen activated protein

min minuto

NAP Proteína ativadora de neutrófilos

NF-kB Factor nuclear kB

NOD Nucleotid binding oligomerization domain containing protein

OiPA Outer inflamatory protein A

OMPs Outer membrane proteins

PCR Polimerase chain reaction

pH Produto hidrogeniônico

RNA Ribonucleic acid

s segundo

14

SabA Sialicacid binding adhesin

SOD Superóxido dimutase

T.A. Temperatura ambiente

TCD4+ Linfócito T auxiliar 4

TCD8+ Linfócito T auxiliar 8

TCR Receptor de células T

Th1 Type 1 helper T cells

Th2 Type 2 helper T cells

TLRs Toll-like receptors

TNF-α Fator de necrose tumoral alfa

Treg Célula T reguladora

vacA Vacuolating cytotoxin gene A

µm Micronmicra

15

RESUMO

A infecção do estômago pelo Helicobacter pylori é a principal causa de gastrite

crônica ativa na metade da população do mundo, muitas vezes evoluindo para formas

mais graves de doenças gastroduodenais. Nos casos em que a resposta imune do

hospedeiro encontra-se ineficiente a bactéria persiste e a inflamação pode continuar por

décadas. A ativação bacteriana das células epiteliais, células dendríticas, monócitos,

macrófagos e neutrófilos é guiada pelas células Thelp tipo 1 de resposta adaptativa,

porém se fazendo de maneira inadequada. A literatura demonstra que muitos tem sido

os caminhos postulados na tentativa de se explicar a falha da resposta imune pelo

hospedeiro, dentre eles destacam-se a apoptose das células epiteliais e macrófagos, a

inadequada função das células efetoras dos macrófagos e células dendríticas, inibição

das células T pelo Vac A e efeito supressor das células Treg. Em muitas doenças,

inclusive as formas crônicas de infecção, a desregulação do sistema imune é o ponto de

partida. No caso do H. pylori, a condição sine qua non da infecção é a presença da

gastrite crônica ativa, caracterizada pelas duas formas de infecção, a forma aguda

(neutrófilos) e a crônica (linfócitos). Foram selecionadas 50 amostras de lâminas de

pacientes que haviam se submetido ao exame de endoscopia digestiva alta e biópsia da

mucosa gástrica, oriundas do Laboratório SABIN, obedecendo os critérios de inclusão e

após ter concordado e assinado o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. A

análise histopatológica e a detecção histopatológica do H. pylori das amostras foram

realizadas no Núcleo de Medicina Tropical da Universidade Federal do Pará. Para

quantificação das interleucinas na mucosa gástrica foram utilizado kits de

imunohistoquímica. Todos os dados foram tabulados e analisados estatisticamente,

aplicando-se o teste t de MANN-WHITNEY e, também, foi aplicado o teste de

correlação de Pearson. Das 50 amostras estudadas, 36 (72%) apresentaram-se infectadas

pelo H. pylori e, 14 (28%) não apresentaram contaminação por essa bactéria. As células

CD20 apresentaram-se em maior quantidade nas amostras que não continham a bactéria,

com média de 8,71, enquanto que as amostras contaminadas pelo H. pylori

apresentaram uma média de 7,27. A média de células CD4 encontradas na amostra em

pacientes contaminados foi de 15,44, enquanto que nas amostras negativas para o H.

pylori a média foi 20,14. A quantidade de células CD8 presentes nas amostras

contaminadas determinou uma média de 12,31, naquelas em que a bactéria não estava

presente foi de 14,43. Avaliando-se a variável neutrófilo, encontrou-se uma média de

11,14 nos casos em que a bactéria estava presente e, 21,79 naqueles onde não foi

encontrada a bactéria. Com relação as células T reguladoras FoxP3, a média encontrada

nas amostras infectadas pelo H. pylori foi de 7,4, já nas amostras negativas para esse

microrganismo a média foi 2,92.

Palavras-chaves: Helicobacter pylori, Resposta T regulatória, Gastrites

16

ABSTRACT

The infection of the stomach by Helicobacter pylori is the major cause of chronic active

gastritis in half the world's population, often progressing to more severe forms of

gastroduodenal diseases. In cases where the host immune response is inefficient by the

bacteria and inflammation may persists for decades. The bacterial activation of

epithelial cells, dendritic cells, monocytes, macrophages and neutrophils is guided by

the type 1 cells Thelp adaptive response, but doing in inapropriate way. The literature

shows that many ways has been postulated in an attempt to explain the failure of the

immune response by the host, among them stand out apoptosis of epithelial cells and

macrophages, the inadequate effector cell function of macrophages and dendritic cells,

inhibition of T cells by Vac A and suppressive effect of Treg cells. In many diseases,

including chronic forms of infection, the deregulation of the immune system is the

starting point. In the case of H. pylori, the sine qua non condition of infection is the

presence of chronic active gastritis, characterized by two forms of infection, the acute

form ( neutrophils ) and chronic ( lymphocytes ) . 50 samples were selected slides from

patients who were submitted to the examination of high digestive endoscopy and biopsy

of the gastric mucosa, resulting from the SABIN Laboratory, following the inclusion

criteria and having agreed and signed the Instrument of Consent . Histopathological

analysis and histopathological detection of H. pylori samples were performed at the

Department of Tropical Medicine of the Federal University of Pará for quantification of

interleukins in the gastric mucosa were used immunohistochemistry kits . All data were

statistically tabulated and analyzed by applying the t MANN-WHITNEY test and also

was applied Pearson correlation test . Of the 50 samples studied , 36 ( 72 % ) were

infected by H. pylori, and 14 ( 28 % ) showed no contamination by this bacteria . The

CD20 cells showed up in greater quantities in the samples that did not contain the

bacteria , with an average of 8.71, while the samples contaminated by H. pylori had an

average of 7.27 . The average CD4 found in patients infected sample was 15.44 , while

the negative samples for H. pylori average was 20.14. The quantity of CD8 cells present

in contaminated samples determined an average of 12.31 , those in which bacteria was

not present was 14.43 . Evaluating the variable neutrophils, was found a mean of 11.14

in cases where the bacteria was present and 21.79 those where the bacteria was not

found. About FoxP3 regulatory T cells, the average found in the samples infected by H.

pylori was 7.4, while in the negative samples for this microorganism, the average was

2.92 .

Keywords : Helicobacter pylori,T Regulatory Response, Gastritis

17

1. INTRODUÇÃO

O Helicobacter pylori (H. pylori) é uma bactéria espiralada gram-negativo, que

coloniza a mucosa gastroduodenal dos seres humanos (Blaser, 1990). A fase inicial da

infecção pelo H. pylori é caracterizada pelo desenvolvimento de uma gastrite aguda,

com aumento transitório de secreção ácida e da resposta inflamatória, sendo precursora

para o desenvolvimento de gastrite crônica ativa com denso infiltrado celular na

mucosa, que com o passar dos anos tende a decrescer (Gisbert et al., 2000). Contudo, o

quadro inflamatório persiste por vários anos e causa sérios danos à mucosa gástrica,

podendo evoluir para doenças gastroduodenais mais graves (Dunn et al., 1997; Gisbert

et al., 2000; Ladeira et al., 2003).

A infecção pelo H. pylori é considerada um dos maiores fatores na patogênese

de várias doenças gastrointestinais, tais como: gastrite crônica, gastrite atrófica, úlceras

pépticas, carcinoma e linfoma gástrico (Longuimire, 1977, Machi et al., 1996, César et

al., 2005; Álvares et al., 2006). Contudo, a maioria dos pacientes infectados permanece

portadores assintomáticos por toda a vida e somente 20% podem evoluir para uma

patologia gastroduodenal mais grave no decorrer da vida (Ladeira et al., 2004;

Thomazini et al., 2006). A grande variabilidade nas manifestações clínicas da infecção

pelo H. pylori está associada a vários fatores, tais como, fatores de virulência

bacteriana, fatores ambientais e fatores genéticos dos hospedeiros, ou a combinação

destes (Coelho et al., 2000, Roder, 2002; Ladeira et al., 2003).

Muitos estudos vêm demonstrando que o H. pylori apresenta uma grande

diversidade genômica, linhagens geneticamente distintas vem sendo descritas em

diferentes regiões, sendo associadas com o desenvolvimento de diferentes doenças

(Peek et al., 1999; Blaser & Berg, 2001; Salama et al., 2001).

Nos últimos anos vem se intensificando a pesquisa de marcadores de

patogenicidade, por técnicas moleculares, na tentativa de detectar cepas bacterianas

associadas ao desenvolvimento de doenças gastroduodenais graves, como úlceras

pépticas e câncer gástrico. Entre estes marcadores, o CagA e os alelos do VacA têm

sido amplamente estudados (González-Valencia et al., 2000; Censini et al., 2001),

estando associados à patogênese das doenças gastroduodenais, fato relevante para sua

identificação (Atherton et al., 1995; Higashi et al., 2004)

Altas taxas de prevalência de doenças gastrointestinais são encontradas no

Brasil, em particular, a região Norte é que apresenta maiores valores, principalmente no

18

que diz respeito ao número de casos de câncer gástrico (Brasil, Ministério da Saúde,

2008)

As estimativas do Instituto Nacional do Câncer (INCA) para 2010 demonstram

uma incidência de 14 casos novos para cada 100 mil homens e de 8 para cada 100 mil

mulheres, variando de acordo com as diversas regiões (Brasil, Ministério da Saúde,

2010).

Apesar de o câncer gástrico vir apresentando uma diminuição da incidência e da

taxa de mortalidade em vários países, até mesmo no Brasil, este tipo de câncer ainda se

constitui em importante problema de saúde pública, especialmente no Estado do Pará

(Araujo et al., 1993; Resende et al., 2006)

A estimativa para incidência de casos novos de câncer de estômago em 2010 no

Estado do Pará, segundo o Instituto Nacional do Câncer, é de 420 casos em homens

(10,82 do total de neoplasias) e 230 casos em mulheres (6,15 do total de neoplasias),

sendo que na capital do Estado, Belém, estima-se destes casos 190 homens e 120

mulheres (Brasil, Ministério da Saúde, 2010).

1.1 O GÊNERO HELICOBACTER

O gênero Helicobacter foi definido por estudos de composição do RNA

ribossômico (Romaniuk, 1987), de seqüenciamento e hibridação do DNA da bactéria

(Goodwin et al, 1989). Juntamente com outros gêneros (Campylobacter, Arcobacter e

Wolinella), constitui a superfamília VI de bactérias gram-negativos (Vandamme et al,

1991).

A morfologia do H. pylori é homogênea, quando observada à microscopia ótica

e eletrônica, apresentando-se com estrutura encurvada ou espiralada, de superfície lisa e

extremidades arredondadas, móvel, não esporulada e microaerófila. Tem a largura

aproximada entre 0,5μm a 0,1μm e 3μm de comprimento, constituindo-se de quatro a

seis flagelos unipolares embainhados e bulbos terminais nas extremidades lisas (Warren

& Marshall, 1984).

Atualmente, o gênero Helicobacter é composto de, no mínimo, 27 espécies com

propriedades comuns, particularmente aquelas relacionadas com a vida no estômago,

podendo-se localizar no fundo e no corpo gástrico, contudo essas bactérias são

encontradas, principalmente, na região antral do estômago (Blaser & Berg, 2001). O H.

pylori pode distribuir-se de maneira focal, segmentar ou difusa ao longo da mucosa

19

gástrica (Warren & Marshall, 1984), localizando-se no interior ou sob a camada de

muco que recobre o epitélio da superfície ou das foveólas, em íntimo contato com a

membrana luminal das células epiteliais que revestem a mucosa gástrica (Ladeira et al,

2003).

Esta bactéria apresenta uma capacidade excepcional de aderência (Thomsen et

al., 1990). Estando adaptada para colonizar somente a mucosa gástrica, sendo que

raramente é observada em áreas de metaplasia intestinal. Fator de grande importância

para o seu papel na patogênese da úlcera péptica duodenal é que no duodeno o H. pylori

coloniza áreas de metaplasia gástrica (Marshall et al., 1985; Queiroz & Mendes, 1993).

O H. pylori apresenta afinidade pelas células mucíparas gástricas, fato este ligado a

composição neutra do muco gástrico, que é diferente dos mucopolissacarídeos ácidos

produzidos pelas células caliciformes da metaplasia intestinal (Queiroz & Mendes,

1993).

1.1.1 A bactéria Helicobacter pylori

1.1.1.1 Histórico

Ao longo de séculos, a presença de um microorganismo na mucosa gástrica foi

tida como improvável, por se acreditar que nesta região não haveria condições

habitáveis, em razão da presença de ácido clorídrico produzido a partir das células

parietais do estômago (Dunn et al., 1997).

Pesquisadores alemães, em 1875, detectaram na mucosa gástrica bactérias

espirais, que não cresceram em culturas, sendo, por este motivo, desprezadas (Blaser,

2005).

O cientista italiano Giulio Bizzozero, em 1892, demonstrou bactérias espiraladas

colonizando o ambiente ácido de estômago de cães. Passados três anos, Salomon

também encontrou espiroquetas no estômago de cães e gatos (Marshall & Warren,

1984).

Krienitz, em 1906, descreveu a presença de bactérias espiraladas em estômago

humano em pacientes portadores de câncer gástrico (Krienitz, 1906). Neste mesmo ano,

Balfour, encontrou microorganismos espiralados em úlceras gástricas de cães e

macacos.

20

Em 1939, Doenges (apud Marshall & Warren, 1999) descreveu também a

presença de microorganismos espiralados, similares ao descrito por Balfour, quando de

autópsias de estômagos de macacos Rhesus e seres humanos.

Palmer, em 1954, ao corar espécimes gástricas com Hematoxilina-eosina (HE),

não identificou tais microorganismos, fato este que desestimulou as pesquisas nesta

área, pois acreditava-se que a presença de bactérias guardava relação com a

contaminação da mucosa do estômago (Palmer, 1954).

Steer e Steer & Colin Jones, em 1975, utilizando microscopia ótica e eletrônica

para estudo de espécimes gástricos de pacientes sem lesão da mucosa gástrica e outros

com úlcera gástrica, demonstraram a presença de bactérias (Steer, 1975; Steer & Colin

Jones, 1975).

Robin Warren, em 1979, redescobriu a bactéria, que, posteriormente, juntamente

com Barry Marshall, utilizando-se de biópsias gástricas de pacientes portadores de

gastrite crônica, retornou com a pesquisa na tentativa de novamente isolar este

microorganismo, sendo que para isso aplicou o método de isolamento a semelhança do

gênero Campilobacter (Marshall & Warren, 1984).

Em 1982, de maneira acidental, Marshall e Warren, aumentando o período de

incubação, conseguiram, pela primeira vez, isolar a bactéria Helicobacter pylori

(Marshall & Warren, 1984; Marshall, 1986; Marshall, 1994). Inicialmente recebeu o

nome de Campilobacter pyloridis, em função de sua localização e similaridade com as

bactérias do gênero Campilobacter, observada na coloração pelo Gram e cultura em

condições microaerófilas (Dunn et al., 1997; Parsonnet et al., 1997). Passado algum

tempo o nome da bactéria passou a se chamar de Campilobacter pylori (Marshall &

Goldwin, 1987).

No ano de 1984, voluntariamente, Marshall e Warren, ingeriram caldo de cultura

da bactéria, correlacionando-a, desta feita, como agente causal da inflamação gástrica

(Marshall, 1986).

Por volta do ano de 1989, após vários estudos taxonômicos envolvendo esta

bactéria, observou-se diferenças em relação ao gênero Campilobacter, reconhecendo-se

um novo gênero, o Helicobacter. Inicialmente, envolvendo duas espécies: H. pylori,

microorganismo da mucosa gástrica humana e Helicobacter mustalae, encontrada na

mucosa gástrica de mustelídeos, popularmente conhecidos como furões (De Groote et

al., 1999)

21

Em 2005, Marshall e Warren, em razão dos estudos realizados com o

Helicobacter pylori, receberam o Prêmio Nobel de Medicina (Mandeville et al, 2009).

1.1.1.2 Morfologia da bactéria Helicobacter pylori

O Helicobacter pylori é uma bactéria gram-negativo, pertencente à Família

Helicobacteriaceae, que apresenta duas formas diferentes: a espiralada e a cocóide. A

forma espiralada (Figura 1) tem as extremidades arredondadas, estrutura curva, que

muitas vezes lembra a letra “S”, aproximadamente tem de 2,5 a 5,0μm de comprimento

e, 0,5 a 1,0μm de espessura. Em geral, possui de 4 a 6 flagelos unipolares e

embainhados e em formato de hélices. Cada flagelo possui, aproximadamente, 30μ de

comprimento e 2,5μm de espessura (Goldwin & Amstrong, 1990).

Figura 1: Microfotografia eletrônica da bactéria H. pylori

Fonte: http://www.bio.davidson.edu/people/sosarafova/Assets/Bio307/vinardone

A forma cocóide apresenta membrana circular, superfície espessa e irregular,

apresentando poucas estruturas intracitoplasmáticas e grânulos, onde se observa em seu

interior um bacilo em forma de “U” circundado pelos flagelos (Saito et al., 2003).

Em condições adversas, tais como aerobiose, pH alcalino, alta temperatura,

incubação prolongada, tratamento com antibióticos, tratamento com inibidores da

bomba de prótons, tratamento com óxido nítrico, ocorre mudança da forma espiralada

para a cocóide. O que faz pensar que a forma cocóide é uma morfologia de resistência,

capaz de suportar as condições adversas do meio, associada à transmissão da bactéria,

sendo capaz de infectar água e alimentos, retornando à forma espiralada quando as

condições do meio ambiente forem propícias (Cole et al., 1997).

22

Estudos demonstram que existem três modos de colonização da bactéria na

mucosa gástrica: aderidas à superfície das células do epitélio gástrico, livres na secreção

mucosa (sem contato com as células gástricas) e intercelular quando se encontram entre

as células epiteliais (Goldwin & Amstrong, 1990).

1.1.1.3 Genoma da bactéria Helicobacter pylori

Para se chegar ao completo seqüenciamento do genoma do H. pylori, foram

realizadas diversas análises a fim de se demonstrar a estrutura genômica e a diversidade

desta bactéria. O H. pylori foi a primeira espécie bacteriana a ter seu genoma

seqüenciado e comparado de duas cepas isoladas independentemente (Tomb et al.,

1997).

O tamanho do genoma do H. pylori é variável, entre 1.6 a 1.73 Mb. Estudos

demonstram que em aproximadamente 40% dos H. pylori isolados contém plasmídeos

que variam de tamanho, entre 1.5 a 23.2, entretanto não foram encontrados neles genes

que codificam fatores de virulência (Tomb et al., 1997).

A primeira cepa seqüenciada foi a 26695, isolada de um paciente que

apresentava gastrite, no Reino Unido (Tomb et al.,1997). No ano de 1998, o genoma da

linhagem J99 foi isolado nos Estados Unidos a partir de um paciente com úlcera

duodenal (Hancock et al., 1998).

Observa-se diferenças na organização, quando se alinha os dois genomas, onde

regiões estão invertidas ou translocadas para outra região e, nessas situações, também, é

possível observar a presença de elementos de inserção ou repetitivos (Tomb et al., 1997;

Alm et al., 1999).

O genoma de cepa “26695” consiste em aproximadamente 1,7 milhão de pares

de bases, com aproximadamente 1620 genes , enquanto que o genoma de cepa “J99”

consiste também de aproximadamente 1,7 milhão de pares de bases, com 1490 genes

(Figura 2). Quando comparadas as duas linhagens seqüenciadas, observa-se que a

organização do genoma e do proteoma de ambas as cepas são similares, onde somente

7% da J99 e 26965 são únicos para cada uma das cepas (gene 89 e 117,

respectivamente). Estudos demonstram que a maioria desses genes cepa específicos

estão localizados em uma região única e variável do genoma denominada zona de

plasticidade (Marshall et al., 1998; Alm et al., 1999). Observa-se também grandes

23

diferenças genéticas nas duas cepas seqüenciadas, chegando até a 6% de diferença nos

nucleotídeos (Pylori Gene Web Server).

Figura 2: Representação gráfica do genoma seqüenciado do H. pylori J99.

Fonte: http://www.helicobacterspain.com/imagenes/rggJ99.htm

Estudos a respeito do genoma do H. pylori demonstram que vários mecanismos

podem contribuir para a diversidade genética desta bactéria. Dentre eles destacam-se os

rearranjos intragênicos que podem ocorrer na bactéria, tais como deleções, duplicações,

inversões e translocações de partes do genoma. Observa-se que muitos desses rearranjos

podem ocorrer como resultado da presença de DNA repetitivo. O DNA do H. pylori

possui um grande número de sequências de DNA repetitivo, bem como sequências de

inserção (IS605) (Alm et al., 1999; Björkholm & Salama, 2003).

Garcia-Vallvé afirma que o H. pylori é competente para transformação natural e,

aparentemente, recombina com eficiência o DNA ganho por transformação ao genoma,

levando a uma diversidade considerável (Garcia-Vallvé et al., 2002).

Estudos apontam que as variações genômicas das cepas podem ser responsáveis

pela codificação de diferentes fatores de virulência, sendo capazes de determinar

diversos tipos de lesão no hospedeiro. Por isso, o estudo do genoma está direcionado

para a compreensão da patogênese e o conhecimento da habilidade deste organismo

para causar doença (Ladeira et al., 2003).

No banco de dados do genoma, há 62 genes da categoria “patogênese”. As cepas

sequenciadas têm Cag (ilha de patogenicidade) longas de aproximadamente 40 Kb

(sucessão de genes responsáveis pela patogênese), com mais de 40 genes. O gene cagA

(citotoxin antigen associated) é considerado marcador de ilha de patogenicidade cag

24

(cag-PAI), e está fortemente associado ao risco para desenvolvimento do câncer gástrico

(Ladeira et al., 2003). Tal ilha de patogenicidade está normalmente ausente em cepas de

H. pylori isoladas de humanos que são portadores assintomáticos (Telford et al., 1994).

O gene vacA encontra-se presente em todas as cepas do H. pylori e compreende

duas partes variáveis, “s” e “m” (Figura 3). A região s (codifica sinal peptídico)

encontra-se localizada no final da cadeia 5’ e tem dois alelos, s1 ou s2, sendo que para o

alelo s1 ainda existem três subtipos: s1a, s1b e s1c. Já a região média (m) tem os alelos

m1 ou m2. A combinação em mosaico dos alelos da região s com os alelos da região m

determina a produção de citotoxinas, responsáveis pelo grau de virulência do H. pylori

(Ladeira et al., 2003). Assim, as cepas portadoras do genótipo vacA s1/m1 produzem

grande quantidade de toxina, enquanto as cepas s1/m2, pouca ou nenhuma toxina. As

cepas vacA do tipo s1a parecem ser mais patogênicas que as s1b e s1c ou s2, estando

mais relacionadas com úlcera péptica. As cepas do tipo m1 estão associadas a um maior

risco de danos para as células epiteliais do que as do tipo m2 (Ladeira et al., 2003).

Figura 3: Mosaico do gene vacA adaptado de Atherton et al.

Fonte: Ladeira et al., 2003, p. 339.

Estudos têm demonstrado que o H. pylori possui uma grande diversidade

genômica, assim como linhagens geneticamente distintas vem sendo descritas em

diferentes regiões, estando relacionadas com o desenvolvimento de diversas doenças

(Van Doorn et al., 1999; Martins et al., 2005; Wen et al., 2007).

Membros de uma determinada população são infectados por cepas de H. pylori

que, caracteristicamente, infectam aquela população, assim como em toda a população

25

humana. Com isso pesquisadores se permitem estudar padrões de migração humana

utilizando-se de cepas do H. pylori. A exemplo disto poderia ser estabelecido que o H.

pylori em índios amazônicos tem sua origem no leste asiático em vez de européia, o que

faz crer que os primeiros imigrantes chegaram aqui há pelo menos 11.000 anos (Wen et

al., 2007).

1.1.1.4 Modos de Transmissão do H. pylori

Apesar de cerca de 50% da população mundial estar contaminada pelo

Helicobacter pylori, os mecanismos de transmissão constituem-se, ainda, em motivos

de muita controvérsia. Têm sido atribuídas as vias oral-oral e fecal-oral como sendo as

principais formas de transmissão, muito embora as taxas reais não tenham sido

estabelecidas até o momento (Marschall, 2000).

O homem é o principal hospedeiro do Helicobacter pylori, enquanto que o

estômago é considerado o seu reservatório (Dunn et al., 1997).

A água contaminada por matéria fecal constitui importante fonte de infecção

(Klein et al, 1991). Já se conseguiu isolar a bactéria das fezes de indivíduos colonizados

(Kelly et al., 1994). Mais recentemente foi relatado que a bactéria Helicobacter pylori

pode ser transmitida sexualmente por via oral-anal (Eslick, 2001).

Outro fator importante diz respeito à aglomeração familial como causa da

transmissão da bactéria Helicobacter pylori, que pode ser observado nos estudos em que

se obteve sorologia positiva em mais de 80% de irmãos colonizados com esta bactéria

(Drumm et al, 1990; Rodrigues et al., 2005). Corroborando este fato, foi constatada

uma maior incidência de H. pylori em crianças com pais infectados, em relação às

crianças cujos pais não eram portadores deste microorganismo (Malaty et al, 1991;

Gold et al., 2001).

Esta bactéria já foi isolada em culturas realizadas com material proveniente de

vômitos, fezes diarréicas e salivas (Perry et al., 2006).

Além das causas ambientais que contribuem para a transmissão do Helicobacter

pylori, há estudos que indicam que fatores do hospedeiro exercem importante papel nas

taxas de infecção e nas conseqüências patológicas induzidas pelo microorganismo

(Atherton, 1997; Ladeira et al, 2003).

26

1.2 EPIDEMIOLOGIA DO H. PYLORI

1.2.1 Prevalência

O Helicobacter pylori apresenta distribuição cosmopolita, sendo encontrada em

habitantes dos cinco continentes (Go, 2002). Cerca da metade da população do globo

terrestre apresenta gastrite induzida pelo H. pylori (Blaser & Berg, 2001). A prevalência

da infecção do H. pylori varia em conformidade com alguns fatores, tais como idade,

nível sócio-econômico e a raça. Estudos sorológicos demonstram que a prevalência de

infecção por Helicobacter pylori aumenta com a idade e é maior nos países em

desenvolvimento (Logan & Walker, 2001). Na França, a soropositividade em indivíduos

menores de 18 anos é de 70%, enquanto na Argélia e na Costa do Marfim, está em torno

de 62% e 64%, respectivamente (Ladeira et al, 2003).

Estudos demonstram que a infecção pelo Helicobacter pylori, em países

desenvolvidos, ocorre após os três ou cinco anos de idade; já em países em

desenvolvimento, observa-se que em crianças com menos de um ano de idade já podem

estar contaminadas (Mégraud et al., 1989; Carvalho et al, 1991). No Brasil, na cidade

de Belo Horizonte, foi desenvolvido um estudo com indivíduos entre sete meses e 16

anos de idade, onde pode ser observado que o indivíduo mais jovem infectado tinha 3

anos e que a positividade de infecção pela bactéria aumentava com a idade, atingindo

82% dos indivíduos maiores de 12 anos e com baixo nível sócio-econômico (Carvalho

et al, 1991).

1.3 PATOGÊNESE E FATORES DE VIRULÊNCIA

A infecção pelo Helicobacter pylori é considerada um dos mais importantes

fatores na patogênese de um amplo espectro de patologias gástricas, tais como gastrite

crônica, gastrite atrófica, úlceras pépticas, carcinoma e linfoma gástrico (César et al,

2005; Álvares et al, 2006). Entretanto, a maioria dos pacientes infectados pela bactéria

permanecem portadores assintomáticos por toda a vida, sendo que somente 20% desses

pacientes podem evoluir para uma patologia gastroduodenal mais grave no decorrer da

vida (Ladeira et al, 2004; Thomazini et al, 2006). O resultado clínico da infecção pelo

H. pylori é determinado pela complexa interação entre fatores do hospedeiro e da

27

bactéria. Enquanto que os fatores do hospedeiro permanecem desconhecidos, a

identificação dos da bactéria avança continuamente (Roder, 2002; Ladeira et al, 2003).

Sabe-se que a resistência ao ácido clorídrico é de vital importância na

patogênese do Helicobacter pylori, uma vez que, sem este atributo biológico, a bactéria

não teria condições de colonizar a mucosa do estômago (Ladeira et al, 2003).

Na fase precoce de colonização, o Helicobacter pylori necessita atravessar a

camada de muco que protege o epitélio gástrico. Esta camada é formada por um gel

viscoelástico que confere proteção química e mecânica ao revestimento epitelial,

inclusive contra bactérias (Jenks & Kusters, 2000). Contudo, lipases e proteases

sintetizadas pelo Helicobacter pylori degradam a camada de muco, o que facilita a

progressão da bactéria (Wallace et al., 1991; Hwang et al., 2002). Além disso, o

Helicobacter pylori move-se facilmente devido à morfologia em espiral e aos flagelos e,

com isso, atravessa a camada de muco, fazendo com que estabeleça íntimo contato com

as células epiteliais de revestimento (Jenks & Kusters, 2000). Outras enzimas,

sintetizadas pela bactéria, tais como superóxido dismutase, catalase e arginase,

conferem proteção contra a atividade lítica de macrófagos e neutrófilos, impedindo uma

resposta eficaz do hospedeiro (Hazell et al., 1991).

Muito embora a mucosa gástrica esteja bem protegida contra infecções

bacterianas, o H. pylori encontra-se altamente adaptado a este meio, através do

desenvolvimento de mecanismos próprios que garantem a sua sobrevivência. Vários são

os fatores envolvidos nesse processo, podendo ser divididos em três classes (Figura 4):

fatores de colonização; fatores de persistência e fatores que induzem doença (Moran,

1996).

28

Figura 4 – Fatores de virulência da bactéria H. pylori (Moran, 1996)

1.3.1 Fatores de colonização

Tais fatores permitem ao patógeno se estabelecer no hospedeiro.

Aproximadamente, 20% da bactéria H. pylori encontram-se aderidas ao nível da

superfície do muco das células epiteliais gástricas. Espécimes gástricas quando

observadas a luz da microscopia eletrônicas encontram-se aderidas ao nível das junções

intercelulares, algumas vezes no fundo dos espaços celulares, com mudança do

citoesqueleto no local de adesão e, também, internalizadas nas células epiteliais,

sugerindo que a adesão envolve interações moleculares especializadas com a mucosa

gástrica (Chen et al., 2001, Necchi et al., 2007).

Para que o H. pylori possa sobreviver no ambiente gástrico esta capacidade de

colonizar a superfície do epitélio gástrico é de fundamental importância, sendo que

vários fatores de colonização encontram-se envolvidos, dentre eles destacam-se como

principais:

1.3.1.1 Motilidade

A forma espiralada da bactéria, associada à presença de quatro ou seis flagelos

unipolares faz com que a bactéria H. pylori rapidamente se movimente na luz do

29

estômago (onde o pH é muito baixo), atravessando o lago mucoso, que é um dos

mecanismos de defesa da mucosa gástrica (Figura 5), para uma área onde o pH

encontre-se próximo do neutro, favorecendo seu crescimento. Tal motilidade constitui-

se em um mecanismo imprescindível para que a bactéria continue colonizando o

estômago, ainda que mecanismos de defesa do hospedeiro, como a acidez e

peristaltismo gástrico, possam atuar, permitindo a aproximação da bactéria às células

epiteliais gástricas (Aguilar et al., 2001). Os flagelos do H. pylori são compostos por

sub unidades de flagelina e cobertos com uma dupla camada de fosfolipídeos, que tem

como finalidade protegê-los contra a acidez gástrica (Fox & Wang, 2002).

Figura 5 - Fator de colonização: motilidade e adesão do H. pylor.

Fonte: h.pylori.info/.

30

1.3.1.2 Microaerofilismo

A bactéria H. pylori é microaerofílica, ou seja, necessita de pequenas

quantidades de oxigênio para sobreviver (Olson & Maier, 2002).

1.3.1.3 Urease

Dada a sua potente atividade ureásica o H. pylori é capaz de sobreviver no meio

ácido do estômago (Figura 6). A enzima urease, que é uma proteína de alto peso

molecular (500 a 600KDa), atua promovendo a hidrólise da uréia [CO(NH2)2], que está

presente em condições fisiológicas no suco gástrico, convertendo a uréia em dióxido de

carbono (CO2) e amônia (NH3). As moléculas de amônia reagem com a água formando

íons de amônio (NH4+) e bicarbonato (HCO3

-), que são capazes de neutralizar o meio ao

redor da bactéria, atingindo um pH em torno de 6 (Aguilar et al.,2001). A amônia atua

como receptor de íons H+

, gerando pH neutro no interior da bactéria, o que confere ao

Helicobacter pylori resistência à acidez gástrica (Weeks & Sachs, 2001). Assim, a

bactéria fica protegida dos efeitos deletérios do pH ácido do estômago. A urease

compreende 6% do total de proteínas sintetizadas pela bactéria, o que representa grande

investimento energético motivado pela sua ação essencial como fator de colonização

(Jenks & Kusters, 2000).

Figura 6 - Atividade ureásica do H. pylori. Fonte: h.pylori.info/.

31

A maior parte da urease sintetizada pela bactéria situa-se em seu citoplasma. A

produção de amônia depende da entrada de uréia na bactéria, que é controlada por uma

proteína de membrana sensível ao pH. Esta proteína é codificada por um gene da

família urease, conhecido como urel (Walsh, 2000; Weeks, 2000; Weeks & Saches,

2001). Cepas de Helicobacter pylori com deleção de urel não sobrevivem em pH ácido

(Ladeira et al, 2003). A entrada de uréia na bactéria é acelerada em pH 5 e diminuída

em pH 7 (Weeks, 2000). A entrada de uréia é altamente específica, não sendo

facilmente saturada, e independe de temperatura e energia (Weeks & Sachs, 2001).

Portanto o Helicobacter pylori possui um mecanismo que permite a liberação do

substrato uréia sobre a urease em condições que é necessária a alcalinização local do

meio ambiente (Ladeira et al, 2003). A proteína urel atua como portão de um canal, que

também permite o refluxo de urease, aumentando o pH periplasmático e do

microambiente próximo, prevenindo acúmulo tóxico de uréia dentro da bactéria (Walsh,

2000; Weeks & Sachs, 2001).

A proteção do H. pylori pela urease ainda confere uma apoptose das células

gástricas in vitro e a inibição da somatostatina gástrica liberada em animais, o que traria

como conseqüências alterações na fisiologia da digestão como um todo (Aguilar et al.,

2001).

Desta forma, o H. pylori fica protegido dos efeitos adversos do pH ácido do

estômago, o que lhe confere acesso à camada protetora de muco. Somado a este fato, a

amônia ainda tem atividade citotóxica, aumentando a permeabilidade da célula epitelial

para prótons e, possivelmente, participe como mediador da resposta imunológica local,

uma vez que é potente ativador de monócito in vitro (Gobert et al., 2002).

1.3.1.4 HspA e HspB

O H. pylori possui as proteínas de choque térmico (Hsp) homólogas as de

humanos, HspA e HspB, cuja a expressão destas proteínas acredita-se aumentar a

atividade da urease e influenciem na habilidade da bactéria tolerar as condições

extremas do estômago (Dunn & Blaser, 1997).

1.3.1.5 Adesinas

Para garantir a sua colonização, o H. pylori necessita aderir-se firmemente as

células gástricas, para tanto lança mão de um conjunto de substâncias que facilitarão

32

essa adesão, as adesinas (Figura 7). Presentes na superfície da bactéria, as adesinas são

estruturas as quais reconhecem especificamente determinados receptores da mucosa

gástrica, que são estruturas glicoconjugadas, ligando-se e iniciando a colonização

bacteriana (Blaser, 1992; Dunn et al., 1997; Covacci et al., 1999).

Figura 7 - Adesão do H. pylori à mucosa gástrica por meio de adesinas.

Fonte: h.pylori.info/.

Estudos demonstram que o mecanismo de adesão da bactéria ao epitélio

gástrico ainda não está totalmente elucidado, estes estudos fazem referência que a

adesina BabA (blood-group antigen-binding adhesin A) do H. pylori utiliza como

receptores os antígenos fucolizados de grupo sanguíneos Lewis b (Leb) e H tipo 1 (H-1),

expressos na superfície epitelial da mucosa gástrica (Covacci et al., 1999; Yamaoka et

al., 2008). Parece que a aderência promovida pela BabA tem um papel crítico no que

diz respeito a transferência de fatores de virulência bacterianos, que são responsáveis

em promover lesão na mucosa do estômago, quer seja de maneira direta ou em

decorrência da resposta inflamatória e/ou auto-imunidade (Ilver et al., 1998). Além do

que, bactérias que se mantêm aderidas firmemente estão menos vulneráveis à acidez

gástrica e, também, não são eliminadas através dos movimentos peristálticos (Silveira et

al., 2005).

O estudo realizado por Ilver et al. (1998) demonstraram que a maior freqüência

de úlcera péptica encontra-se naqueles indivíduos que apresentam grupo sanguíneo O,

33

que equivale ao antígeno de Lewis b, em razão da carga bacteriana ser maior nesses

indivíduos (Ilver et al., 1998).

Em estudos mais recentes observa-se que a análise da sequência genômica das

cepas 26695, J99 e HPAG1 H. pylori, mostra a presença de cinco famílias maiores de

proteínas da membrana externa, que corresponde a 4% do genoma bacteriano. Dentre

estas, temos as adesinas, que se ligam a carboidratos modificados nas glicoproteínas das

células dos hospedeiros, como a adesina ligada ao antígeno do grupo sanguíneo (BabA),

adesina ligada ao ácido siálico (SabA), lipoproteínas associada à aderência (AlpA e

AlpB), proteína inflamatória da membrana externa (OipA) (Yamaoka, 2008; Matteo et

al., 2010).

1.3.2 Fatores de persistência

A literatura demonstra que a bactéria H. pylori permanece no estômago por um

período longo de tempo, muitas vezes permanecendo por toda a vida do indivíduo

infectado. Uma vez que a infecção pelo H. pylori é crônica, é capaz de ativar a resposta

imunológica no hospedeiro, determinando um processo inflamatório crônico. Dentre os

mecanismos de persistência, destacam-se:

1.3.2.1 Lipopolissacarídeos (LPS)

Também denominados endotoxinas, os LPS são glicolipídios tóxicos

fosforilados, presentes na superfície das bactérias gram-negativos, atuando como

principal antígeno de superfície (Berstad et al., 2001).

1.3.2.2 Mimetismo molecular

O mimetismo de antígenos é considerado um dos mais importantes mecanismos

de evasão do sistema imunológico do hospedeiro (Aguilar et al., 2001; Aguiar et al.,

2002). A estrutura da cadeia O-específica do LPS em diferentes tipos de H. pylori pode

mimetizar antígenos da estrutura do grupo sanguíneo Lewis (Lea, Le

b, Le

x, Le

y) que

estão presentes na mucosa do estômago normal de seres humanos e a expressão desses

antígenos Lewis na superfície da bactéria pode camuflar a bactéria e contribuir para a

sobrevivência da mesma no estômago (Aguilar et al., 2001; Berstad et al., 2001; Aguiar

34

et al., 2002). O papel do mimetismo, portanto, é permitir o escape da bactéria aos

mecanismos de reconhecimento do sistema imune, o que contribui para a cronicidade da

infecção (Dunn et al., 1997; GO & Crowe, 2000). Segundo Wirth et al.(1997), a

bactéria H. pylori não expressaria antígenos Lewis apenas, mas também a expressão

fenotípica Le do hospedeiro, o que sugere uma adaptação da bactéria ao hospedeiro.

1.3.2.3 Forma cocóide

Em determinadas condições, que envolva estresse ambiental, a bactéria H. pylori

modifica-se, convertendo a sua forma espiral para a forma cocóide, considerada uma

forma de resistência, originada da forma bacilar, que se adapta transitoriamente às

condições impróprias do ambiente, garantindo ao microorganismo sua sobrevivência ao

meio até que esta possa chegar ao estômago do hospedeiro onde irá replicar-se (Costa et

al., 1999).

1.3.2.4 Catalase e superóxido dismutase

As enzimas catalase e superóxido dismutase (SOD) extracelular são produzidas

em quantidades satisfatórias e são considerados fatores de resistência da bactéria aos

mecanismos líticos oxidativos dos fagócitos polimorfonucleares, o que causa a morte

desses últimos e determina lesão epitelial aguda, sendo importantes fatores de

sobrevivência da bactéria frente à mucosa gástrica inflamada (Ladeira et al., 2003).

1.3.3 Fatores que induzem a doença

Além dos fatores de colonização e persistência, a bactéria H. pylori possui

fatores de virulência que são responsáveis pela produção de substâncias tóxicas que

atuam agredindo as células epiteliais gástricas para obtenção de nutrientes e de melhor

fixação na mucosa gástrica, entretanto tais fatores determinam, normalmente, sérios

danos ao hospedeiro (Yakoob et al., 2009). Dentre esses fatores, destacam-se:

35

1.3.3.1 Proteases e lipases

Enzimas sintetizadas pela bactéria H. pylori, atuam diminuindo o efeito protetor

da camada de muco do epitélio gástrico, facilitando a progressão da bactéria, levando à

penetração do ácido na superfície das células epiteliais, causando sérios danos à mucosa

gástrica (Vinall et al., 2002).

1.3.3.2 Citotoxina vacuolizante (VacA)

Considerada a maior toxina secretada pelo H. pylori sua ação citotóxica

encontra-se produzida em mais de 50% dos casos isolados de H. pylori, estando

relacionada epidemiologicamente com a destruição dos tecidos e úlceras pépticas

(Aguilar et al., 2001; Muller et al., 2002).

Na literatura encontram-se vários estudos demonstrando diversos mecanismos

da atividade tóxica da VacA contra as células do hospedeiro (Aguilar et al., 2001;

Ashour et al., 2002, Muller et al., 2002; Ando et al., 2006). Acredita-se que esta toxina

induz alterações no trânsito intracelular vesicular em células eucarióticas, o que leva a

formação de grandes vacúolos contendo sinais de recentes lisossomos e endossomos.

Tal mecanismo interfere na apresentação de antígeno ao sistema imunológico por

prejudicar o processo e apresentação do antígeno pela célula apresentadora de antígeno

(Aguilar et al., 2001; Muller et al., 2002; Gebert et al., 2003, Ando et al., 2006).

Cerca de 50% a 60% dos diferentes tipos da bactéria H. pylori produzem a

citotoxina vacuolizante VacA, muito embora o gene da VacA esteja sempre presente

em todas as cepas bacterianas isoladas (Ando et al., 2006).

Apesar do gene da citotoxina vacuolizante (VacA) estar presente em todos os

tipos de H. pylori, o mesmo apresenta variações estruturais entre os alelos vacA,

particularmente em duas regiões. Essas variações alélicas se concentram na região N-

terminal (s1a, s1b, s1c e s2) e próximo à região do meio (m1 e m2), que descreve as

diferenças na produção da citotoxina ou na atividade vacuolizante (Figura 8). Assim,

alelos VacA estão relacionados com incremento de úlceras pépticas. As regiões s e m

têm sido associadas a diferentes manifestações clínicas; assim, o alelo s1a/m1 é

associado com maior destruição do epitélio gástrico e úlcera duodenal (Ladeira et al.,

2003; Ando et al., 2006).

36

Figura 8 – Mosaico do gene vacA. Fonte: Adaptado de Athernon et al., 1997

Estudos mostram ainda que s1a/m1 tem maior virulência, enquanto vacAs2 são

raramente associados com doença ulcerosa péptica, assim como são raras em

determinadas populações. Com base nessas informações, os genótipos vacA não podem

ser usados de maneira segura no sentido de discernir o risco de desenvolvimento de

doença gastroduodenal no hospedeiro. Esses estudos ainda demonstram que o alelo s1c

é fenotipicamente diferente de s1a e s1b (Aguilar et al. 2001; Yamaoka et al., 2002;

Ladeira et al., 2003; Ando et al., 2006).

O gene vacA codifica uma protoxina de aproximadamente 140 kDa de massa.

Tal prototoxina é processada antes de ser secretada, sendo retirada da região

aminoterminal a porção do peptídeo sinal e, posteriormente, da região carboxiterminal,

o fragmento transmembrânico, que é separado da toxina no momento da secreção,

resultando em uma toxina com peso de aproximadamente 88 kDa. A proteína

processada pode ser secretada ou permanecer na superfície da bactéria (Cover et al.,

1994; Telford et al., 1994).

A proteína secretada forma uma estrutura monomérica que é composta na região

aminoterminal pelo domínio P37 (34kDa) e na porção carboxiterminal pelo domínio

P58 (54kDa), esses dois domínios estão interligados por uma região de loop, sensível a

ação de proteases (Telford et al., 1994; Cover et al., 1994).

As estruturas monoméricas quando expostas a um pH ácido (<5,5) ou básico

(>8,0) unem-se formando uma estrutura oligomérica, que pode ser composta por 6 a 7

estruturas monoméricas e possui baixa atividade citotóxica. Mas em condições

37

favoráveis a estrutura oligomérica se dissocia e os monômeros exercem alto poder

citotóxico (Mcclain et al., 2000).

A ligação da VacA com a superfície da célula gástrica é o primeiro passo para a

intoxicação celular. Estudos de Padilla et al. (2000) demonstraram que a VacA possui a

capacidade de ligar-se a diferentes tipos de células e tem múltiplos sítios de ligação na

superfície das células.

A porção P37 da proteína VacA é considerada importante na internalização da

toxina e no desenvolvimento do processo de intoxicação celular e a porção P58 é

responsável pela ligação do monômero ao receptor celular (Mcclain et al., 2000).

Alguns estudos demonstram que a citotoxina VacA é capaz de alterar a junção

célula-célula e modificar a resistência elétrica trans-epitelial celular, criando uma rota

paracelular (célula → bactéria) de permeabilidade de pequenas moléculas orgânicas e

íons, tal como, Fe3+ e Ni2

+, que são essenciais para o crescimento da bactéria.

Entretanto, o mecanismo que causa esse processo ainda não foi identificado (Papini et

al., 1998; Montecucco et al., 2001).

Experimentos de Tombola et al.(1999) têm demonstrado que a inserção da

toxina VacA na membrana plasmática leva a formação de poros ânions seletivos,

importantes a sobrevida da bactéria na célula.

Reyrat et al. (2000) propõem dois diferentes modelos de mecanismos de ação da

VacA. O primeiro modelo propõe que o domínio P58 media a ligação à célula alvo, e a

porção P37 seria injetada no citosol da célula alvo, onde enzimaticamente alteraria alvos

citoplasmáticos específicos levando a formação de vacúolos e a apoptose. Entretanto,

ainda não se conseguiu demonstrar alguma atividade enzimática da porção P37, nem tão

pouco foram descritos possíveis alvos citoplasmáticos (Galmiche et al., 2000; Reyrat et

al., 2000; Papini et al., 2001).

O segundo modelo descreve que tanto a porção P37, quanto a porção P58 estão

envolvidos na capacidade de inserir-se na membrana plasmática da célula alvo e na

formação de canais condutores de íons. Sendo que a porção P58 seria responsável pela

interação com a membrana plasmática e, também, pela inserção do P37 na porção

transmembrana. O domínio P37 é capaz de suportar a ação dos lisossomos, importante

na manutenção dos canais, uma vez que este é endocitado e transportado para o

citoplasma dentro de um endossoma (Tombola et al., 1999). No endossoma, a toxina

VacA aumenta a permeabilidade dos ânions deste compartimento, determinando a

ativação da bomba de prótons ATPase, levando à introdução do Hidrogênio no

38

endossoma, que na presença de amônia, em particular a gerada pela urease do H. pylori,

leva ao acúmulo de íons acidotróficos (NH4+), estimulando o afluxo de água para dentro

da célula, essencial na formação dos vacúolos (Figura 9) (Papini et al., 1993; Tombola

et al., 1999).

Figura 9 – Representação esquemática dos dois modelos de mecanismo de ação da

citotoxina VacA . Fonte: Adapatado de Papini et al., 2001.

1.3.3.3 Citotoxina associada ao grupo A (CagA)

O citotoxin antigen associated (cagA) foi o primeiro gene cepa-específico

identificado no Helicobacter pylori, estando fortemente associado ao risco para

desenvolvimento do câncer gástrico (Peek & Blaser, 1997; Lu et al., 2005). As cepas

cag A+ tendem a ser mais virulentas e induzem níveis mais altos de expressão das

citocinas, tais como IL-1b e IL-8 (Chollet-Martin et al., 1993, Blaser & Berg, 2001;

39

Hull et al., 2001). Pacientes infectados por cepas que expressam cagA têm

probabilidade três vezes maior de desenvolver câncer gástrico do que aqueles infectados

por cepas cagA- (Parsonnet et al, 1997). O gene cagA é considerado marcador da ilha de

patogenicidade cag (cag-PAI), que possui de 35 a 40 Kb, comporta 31 genes (Blaser &

Berg, 2001) e é encontrada em cerca de 60% das cepas ocidentais. A ilha cag-PAI é um

componente do genoma do Helicobacter pylori que contém genes homólogos aos de

outras bactérias que codificam componentes do sistema de secreção do tipo IV, que atua

como agulha e serve para injetar moléculas efetoras da bactéria na célula hospedeira,

permitindo que a bactéria module vias do metabolismo celular da célula hospedeira

(Figura 10), incluindo a expressão de proto-oncogenes (Covacci et al, 1999; Ladeira et

al, 2003).

Figura 10 - Ilha de patogenicidade Cag (citotoxin antigen associated).

Fonte: Suerbaum & Michetti, 2002, p. 1117.

Componentes do Helicobacter pylori induzem alterações na fosforilação de

tirosinas, nas vias de sinalização e de transdução da célula hospedeira, resultando em

rearranjos do citoesqueleto e alterações morfológicas que estimulam a célula a se

espalhar e se alongar de maneira idêntica à produzida pelo fator de crescimento de

40

hepatócitos (Segal et al, 1996; Asahi et al, 2000; Ondebreit et al, 2000; Stein et al,

2000). Além disso, fatores da bactéria podem induzir a desfosforilação de proteínas

normalmente fosforiladas (Atherton, 2000).

A proteína cagA do Helicobacter pylori atua como um antígeno altamente

imunogênico. A estrutura do gene revela uma região 5’ altamente conservada, mas com

uma região 3’ com número variável de seqüências repetitivas, o que leva à variação do

comprimento da proteína. Como a proteína CagA é fortemente imunogênica, qualquer

variação em seu comprimento pode levar a diferentes respostas do hospedeiro, incluindo

diferentes graus de resposta inflamatória (Ladeira et al, 2003).

Estudos da variabilidade da região 3’ do gene cagA para investigar as diferenças

nesta região estariam relacionadas a diferentes processos patológicos, demonstraram

que 86% de uma das variantes eram provenientes de pacientes com câncer gástrico e

concluíram que outras diferenças na região 3’ do gene cagA podem estar relacionadas a

diferentes processos patológicos (Yamaoka et al, 1998).

A função da citotoxina CagA ainda não está totalmente elucidada, entretanto,

alguns experimentos têm demonstrado que cepas cagA positivas quando inoculadas em

cultura de células gástricas, como por exemplo, AGS (células do câncer gástrico),

induzem alterações na morfologia destas células, com acentuado alongamento e

aumento celular, determinando rearranjo no citoesqueleto e aumento da motilidade,

alterações essas denominadas de “fenótipo Beija-flor” (Hatakeyama, 2003; Blaser &

Atherton, 2004; Higashi et al., 2004).

Assim, o CagA é um marcador de cepas virulentas do H. pylori, associadas mais

comumente, com úlcera péptica e câncer gástrico, e sua detecção tem se mostrado

clinicamente relevante, ao menos na maioria dos países do Ocidente (Kuipers et al,

1995; Higashi et al, 2002; Higashi et al, 2004).

Experimentos demonstram que a proteína CagA é translocada para dentro das

células do estômago através de um sistema de secreção do tipo IV (TFSS), onde ocorre

a formação de uma estrutura similar a uma seringa que introduz a proteína CagA no

citoplasma da célula gástrica. Embora pouco se conheça a respeito, sabe-se que os genes

que codificam esse sistema de secreção também estão localizados na ilha de

patogenicidade. Esses experimentos revelam que cepas do H. pylori mutantes com

deficiência na funcionalidade do sistema de injeção tipo IV são incapazes de induzir o

fenótipo Beija-flor, o que faz crer que a translocação da CagA é um pré requisito para

41

alteração morfológica da célula (Hatakeyama, 2003; Blaser & Atherton, 2004;

Figueiredo et al., 2005).

A molécula CagA apresenta sítios de fosforilação de tirosina, reconhecidos pelos

domínios SHP2, presentes nas moléculas sinalizadoras, o que faz com que essas

moléculas se liguem aos receptores tirosinoquinases. Tais receptores podem ativar as

proteínas Ras assim como a cascata de Map-quinase (proteinoquinases ativadas por

mitógenos), determinando sinalização ao núcleo da célula e alterando o citoesqueleto da

mesma, estimulando a proliferação e diferenciação celular (Hatakeyama, 2003; Blaser

& Atherton, 2004; Higashi et al., 2004). Contudo, experimentos de Higashi et al.

(2004), demonstraram que a citotoxina CagA pode, através das proteínas sinalizadoras,

enviar sinalização diretamente ao núcleo da célula, independentemente da ativação de

proteínas Ras, conforme se observa na Figura 11.

O prolongado estímulo das proteínas sinalizadoras pela toxina CagA, determina

uma sinalização inadequada estimulando a apoptose celular. Somado a este fato, uma

replicação celular aumentada determina uma ocorrência maior de mutações, e o

acúmulo dessas mutações pode condicionar a uma expressão de oncogenes, alterando o

controle celular e, conseqüentemente, o desenvolvimento de neoplasias (Higashi et al.,

2002; Hatakeyama, 2003; Blaser & Atherton, 2004).

Figura 11 - Representação esquemática da ação da citotoxina CagA.

Fonte: Adaptado de Higashi et al., 2004.

42

1.4 ASSOCIAÇÃO ENTRE DOENÇAS GASTROINTESTINAS E H. PYLORI

A fase inicial da infecção pelo H. pylori é caracterizada pelo desenvolvimento de

uma gastrite aguda, com aumento transitório de secreção ácida e da resposta

inflamatória, sendo precursora para o desenvolvimento da gastrite crônica ativa com

denso infiltrado celular na mucosa, que com o passar dos anos tende a decrescer

(Gisbert et al., 2000). Entretanto, o quadro inflamatório perdura por vários anos

causando sérios danos à mucosa gástrica, podendo evoluir para patologias mais graves

(Blaser, 1990; Dunn et al., 1997; Suerbaun & Michetti, 2002; Ladeira et al., 2003).

Estudos de auto-inoculação, relatados por Marshall, são a maior evidência de que a

infecção pelo H. pylori está associada ao desenvolvimento de gastrite crônica (Warren

&Marshall, 1984).

Predominantemente, a infecção pelo H. pylori acomete a região do antro

gástrico, o que estimula as células G a produzirem gastrina e, conseqüentemente, eleva a

produção de ácido clorídrico. Essa elevação da quantidade de ácido no estômago faz

com que haja um maior afluxo de ácido para o duodeno, determinando uma agressão ao

tecido intestinal, que num mecanismo de auto-defesa sofre metaplasia para tecido

gástrico, contribuindo para colonização do duodeno pelo H. pylori. O grande fluxo de

ácido para o duodeno e a presença da colonização deste tecido pelo H. pylori. Levam ao

desenvolvimento da úlcera duodenal (Suerbaun & Michetti, 2002; Calam & Baron,

2001).

Ocorrendo a gastrite na região do corpo gástrico, observa-se uma diminuição na

produção de ácido clorídrico, em razão da inibição das células enterocromomatóficas,

produtoras de histaminas e células parietais. É comum nestes casos a observação de

destruição das glândulas gástricas (gastrite atrófica) assim como da diminuição da

camada de muco, ambiente este favorável ao desenvolvimento de úlcera gástrica e/ou

câncer gástrico (Suerbaun & Michetti, 2002).

Marshall e Warren observaram que a infecção pelo H. pylori estava associada

com o desenvolvimento de úlcera duodenal, e esta observação também foi rapidamente

confirmada e aplicada para os casos de úlcera gástrica (Warren & Marshall, 1984). Em

1994, a conferência do National Institutes of Health concluiu que o H. pylori era a

maior causa de doença ulcerosa péptica, recomendando que a associação entre úlcera

péptica e aquela bactéria deveria ser tratada através da erradicação dessa bactéria

(Marshall, 1994; Dunn et al., 1997, Sokol & Hoffenberg, 1997, Silva et al., 2004).

43

Estudos têm demonstrado que a infecção pelo H. pylori pode causar uma

elevação na produção de gastrina, determinando um quadro de hipergastrenemia, e que

com a erradicação da bactéria com antibióticos, a secreção da gastrina retornaria a

níveis normais (Silva et al., 2004). Entretanto, os mecanismos pelos quais o H. pylori

mantém as células G em estados hiperfuncionantes ainda não são conhecidos (Blaser,

1990; Chehter, 1999). Pacientes infectados pelo H. pylori possuem uma diminuição no

número de células G da mucosa gástrica, sofrendo sensível aumento após a erradicação

da bactéria. A maioria dos portadores de úlcera duodenal possuem esvaziamento

gástrico mais acelerado que o normal, fazendo com que haja um contato mais intenso da

mucosa do duodeno com a secreção ácida (Moran, 1996). Este contato prolongado da

mucosa do duodeno com a excessiva quantidade de secreção ácida do estômago pode

determinar o aparecimento de metaplasia gástrica no tecido duodenal. Nos pacientes

infectados pelo H. pylori ocorre comumente duodenite, pois as áreas de metaplasia

gástrica do duodeno encontram-se constantemente colonizadas pela bactéria. A presença

do H. pylori no duodeno, somada à ação contínua da secreção cloridropéptica do

estômago, podem ser os determinantes pela perpetuação da úlcera (Figueiredo et al,

2005; Suerbaun & Michetti, 2002).

Geralmente, a úlcera gástrica é única, localizando-se normalmente ao nível da

pequena curvatura no antro gástrico, próximo a incisura angularis, em região adjacente a

mucosa secretora de ácido (Martins et al., 2002). A úlcera gástrica encontra-se

relacionada à deficiência dos fatores de defesa da mucosa do estômago, que não são

capazes de proteger o epitélio contra os efeitos corrosivos do ácido e da pepsina

(Martins et al., 2006). Entretanto, ao que parece, o maior responsável pela diminuição

da resistência da mucosa ao ataque do ácido é a inflamação crônica (Censini et al.,

2001). A responsabilidade pela diminuição da defesa da mucosa gástrica está

relacionada com a associação entre o H. pylori e gastrite (Censini et al., 2001; Martins

et al., 2002). A infecção pelo H. pylori leva a um processo inflamatório agudo ou

crônico da mucosa gástrica (Blaser, 1990; Warren & Marshall, 1984; Martins et al.,

2002). Desta maneira as úlceras gástricas ocorrem tanto na presença de gastrite crônica

superficial como atrófica, desenvolvendo-se no limite do processo inflamatório (Blaser,

1990; Martins et al., 2002).

Estudos demonstram que o H. pylori produz várias proteínas que parecem

mediar ou facilitar seus efeitos deletérios sobre a mucosa gástrica (Martins et al., 2002).

A associação da citotoxina CagA com aumento da inflamação gástrica e

44

conseqüentemente o aparecimento de quadros clínicos mais graves, tem sido bastante

ressaltada atualmente (Martins et al., 2002). As cepas virulentas (CagA+) induzem forte

processo inflamatório, com denso infiltrado de neutrófilos, que causam graves danos à

mucosa gástrica (Lin et al., 2000; Queiroz et al., 2000, Martins et al., 2002).

Estudos sugerem que a soroprevalência para o antígeno CagA do H. pylori em

adultos com úlcera gástrica está aumentada, existindo uma associação entre a presença

do CagA e o risco aumentado de desenvolver úlcera péptica e câncer gástrico (Williams

& Pounder, 1999, Lin et al., 2000; Martins et al., 2002).

Estudos sorológicos demonstram que pacientes com úlcera péptica e tumor

gástrico são mais freqüentemente infectados por cepas virulentas, em torno de 60% a

100%, o que leva a crer que o gene CagA pode ser considerado um marcador genotípico

e fenotípico para linhagens virulentas (Lin et al., 2000; Queiroz et al., 2000; Censini et

al., 2001; Covacci et al., 1999; Williams & Pounder, 1999).

Inúmeros estudos, mais recentemente, apontam evidências de que exista uma

relação entre H. pylori e câncer gástrico (Palli, 1997; Butov et al., 1998; Wang et al.,

1998; Kim et al., 1997; Rangel et al., 2003; Perez-Perez et al., 2005).

A International Agency for Research on Câncer, World Health Organization

(IARC), no ano de 1994, baseando-se no resultado de nove estudos retrospectivos de

casos-controle e quatro estudos coorte, demonstrou uma associação causal entre

infecção por H. pylori e o câncer gástrico (Tanida et al., 1997; Rangel et al., 2003).

Em alguns estudos, há relato de que a gastrite atrófica decorrente de vários anos

de infecção pelo H. pylori funcionaria como lesão precursora da metaplasia intestinal,

para o desenvolvimento da neoplasia gástrica maligna (Huang et al., 1998; Debongnie

et al., 1997; Shibata et al., 1997, Rangel et al., 2003).

Estudos de sorologia para o H. pylori em portadores de neoplasia maligna do

estômago indicam que um maior risco de desenvolvimento da neoplasia estaria

relacionada à infecção pelas cepas CagA desta bactéria (Torres & Pérez, 1998, Rangel

et al., 2003)

O reconhecimento do papel do H. pylori na associação com o câncer gástrico

proporcionou um grande avanço do conhecimento científico, ajudando a elucidar

inúmeros aspectos fisiopatológicos (El-Omar et al., 2000; Uemura et al., 2001).

Contudo, é sabido que alguns aspectos dessa associação ainda permanecem bastante

obscuros, sendo necessário que se prossiga com investigações no que diz respeito a real

45

virulência do H. pylori, a genética do hospedeiro, assim como fatores ambientais e

epidemiológicos.

1.5. RESPOSTA IMUNOLÓGICA AO H. pylori

Estudos de Suerbaum & Michetti (2002) demonstram que o epitélio gástrico

representa a primeira linha de defesa contra a infecção pelo H. pylori, atuando como

uma barreira contra a bactéria, na qual as células epiteliais secretam mediadores

inflamatórios que são responsáveis por desencadear a resposta imunológica à invasão

deste microorganismo (Figura 12).

Figura 12: Representação esquemática da resposta imunológica à infecção pelo

H. pylori. Fonte: Suerbaum & Michetti, 2002, p. 1179.

46

Depois que há o contato com os antígenos bacterianos, as células epiteliais

gástricas secretam citocinas pró-inflamatórias, como a IL-8, que é um potente mediador

inflamatório, que por mecanismos quimiotáxicos recrutam e ativam neutrófilos que

migram para o sítio da infecção (Baggiolini et al., 1994, D'elios et al, 1997; Suerbaum

& Michetti, 2002; Sarvestani et al., 2006; D’elios & Andersen, 2007).

Quando cronicamente ativados, os neutrófilos apresentam propriedades que

contribuem para aumentar a lesão tecidual, uma vez que além de atuarem na fagocitose

e digestão das bactérias liberam enzimas intracelulares e produtos reativos, sendo este

evento um importante mecanismo patogênico, entretanto incapaz de debelar a infecção

em razão da produção bacteriana de catalase e superóxido de desmutase, que protegem a

bactéria (Rautemaa et al., 2001).

A contínua exposição ao microorganismo resulta na ativação da resposta

imunológica específica. Esta resposta se dá pela estimulação dos linfócitos T auxiliares

(TCD4+), direcionando a resposta imunológica tanto para o perfil Th1, quanto Th2.

Entretanto, a resposta celular Th1 é predominante, onde se pode observar que a maioria

dos clones das células CD4+

, específicas contra o H. pylori, secretam interferon γ (IFN-

γ) como resposta à estimulação antigênica, indicando uma resposta com fenótipo Th1

(Suerbaum & Michetti, 2002).

A resposta Th1 leva não somente a produção de IFN-γ, como também de IL-12

(interleucina 12), IL-18 (interleucina 18), IL-17 (interleucina 17) e o fator de necrose

tumoral (TNF-α), que ocorre ao nível da região do antro gástrico (Shibata et al., 1999).

Tudo isso pode ser explicado pela estimulação de neutrófilos, monócitos e células

dendríticas pelo gene da proteína ativadora de neutrófilos (HP-NAP). Em pacientes

infectados há uma proliferação importante de diferentes antígenos H. pylori, incluindo

HP-NAP, que determina a produção de níveis elevados de IFN-γ e TNF-α, para

antígenos gástricos específicos das células Th, resultando numa potente atividade

citotóxica com polarização da resposta Th1. Outros fatores também podem contribuir

para a resposta Th1, além do HP-NAP (Amedei et al., 2006).

A resposta humoral também pode ser observada na infecção pelo H. pylori.

Observam-se anticorpos, predominantemente, do tipo IgG, atuando contra vários

antígenos do H. pylori, entretanto estes não conferem proteção, nem evitam uma nova

infecção (Suerbaum & Michetti, 2002).

De um modo geral, a resposta imunológica que não consegue eliminar a bactéria

resulta do predomínio de células Th1, uma vez que as Th2 estão praticamente ausentes

47

durante a infecção pelo H. pylori. Além do que, clones de células T, específicos para H.

pylori, isolados de pacientes com úlcera péptica, são mais freqüentemente do tipo Th1

do que clones isolados de pacientes apresentando somente gastrite crônica (D’elios et

al., 1997).

Com base nesses estudos, Israel & Peek (2001) levantam a hipótese de que uma

resposta aberrante do hospedeiro (Th1) para um organismo que deveria induzir

respostas imunológicas secretórias (Th2) pode influenciar e perpetuar a inflamação

gástrica.

Estudos de Wang et al. (2007) demonstram que os pacientes infectados pelo H.

pylori CagA+, que apresentam imunidade celular mediada por células Th1, estão

associados com estágios precoces da carcinogênese gástrica, enquanto que, a imunidade

humoral mediada por células Th2, estão relacionados com os estágios avançados da

doença. Nos casos em que pacientes apresentam cepas H. pylori CagA negativo e

naqueles com ausência de bactéria, não há tendência de polarização Th1/Th2. Há um

predomínio da imunidade local sobre a sistêmica. A polarização da resposta

imunológica mediada pelas células Th está associada com a cronicidade e evolução das

patologias gástricas, especialmente o câncer gástrico (Wang et al., 2007).

1.6 PRINCIPAIS CÉLULAS ENVOLVIDAS NA RESPOSTA IMUNOLÓGICA PARA

HELICOBACTER PYLORI

1.6.1 Macrófagos

São fagócitos mononucleares resultantes da maturação de monócitos. Apresenta

diferentes denominações especiais dependendo do tecido onde esteja localizado.

Responsáveis por realizar várias funções importantes nas imunidades inata e adquirida,

tais como ingestão e morte de microorganismo, ingestão de células mortas do

hospedeiro, secretam citocinas, ativam linfócitos T e promovem a angiogênese e síntese

do colágeno (Mai et al., 1991, Abbas et al, 2011).

Dependendo do tipo de estímulo para a ativação celular, os macrófagos podem

adquirir distintas propriedades funcionais. Subpopulações de células T se constituem no

exemplo mais evidente de resposta de macrófagos a diferentes citocinas, em que algumas

destas citocinas, num processo chamado de ativação clássica, ativam macrófagos para se

tornarem eficientes na eliminação de microorganismos. Outras, num processo chamado

48

de ativação alternativa, ativam macrófagos que promovem o remodelamento e o reparo

teciduais. Os macrófagos ainda, por ativação de estímulos externos, como os

microorganismos, podem assumir diferentes formas. Em razão de sua semelhança com

células epiteliais da pele, alguns macrófagos são chamados de células epitelióides.

Quando ativados, podem sofrer fusão para formar células gigantes multinucleadas (Mai

et al., 1991, Abbas et al., 2011).

De um modo geral, os macrófagos respondem aos microrganismos tão

rapidamente quanto os neutrófilos, entretanto sobrevivem por mais tempo nos sítios de

inflamação. Sua diferença em relação aos neutrófilos é que os macrófagos são células em

fase terminal de diferenciação. Portanto, macrófagos são células efetoras dominantes que

atuam nos estágios mais tardios da resposta imunológica inata, ou seja, alguns dias após

a infecção ter se instalada (Mai et al., 1991, Abbas et al., 2011).

Os macrófagos são considerados como peças essenciais ante a resposta inata ao

H. pylori , através das células epiteliais, no momento em que esta bactéria entra em

contato direto com a superfície da mucosa gástrica. Os monócitos e macrófagos são

importantes coordenadores de resposta imune frente a agentes patogênicos e, no caso do

H. pylori, são prováveis ativadores, juntamente com as DCs, de produção de fatores de

imunidade adaptativa, tais como a IL-12, que estimulam as células Th1 resultando numa

produção de citocinas como o intérferon gama (IFN-γ). Estudos recentes demonstraram

que a proteína de ativação de neutrófilos (NAP) do H. pylori contribui para a polarização

do Th1 através da estimulação da secreção de IL-12 e IL-23 de neutrófilos e manócitos.

A produção de IL-12 na mucosa gástrica está associada ao desenvolvimento de úlcera

péptica quando associada a infecção por cepas de H.pylori cagA-positiva, muito

provavelmente em razão da estimulação da resposta Th1(Grimm & Doc, 1996).

Os macrófagos também estão envolvidos na amplificação da resposta

inflamatória produzidas pelas citocinas, tais como as IL-1, TNF-α e IL-6. A ativação da

IL-6 tem sido associada a ativação de TLR4, MAP quinase e eventos de sinalização de

NF-kB.

Os macrófagos também são células efetoras. Algo que tem sido bastante

explorado é a geração de NO derivado da indução da enzima NO sintaxe (iNOS, NOS2),

na qual tem sido demonstrado ser regulada pelo H. pylori em macrófagos tanto in vitro,

quanto in vivo. Estudos demonstram que o H. pylori pode ser morto por macrófagos,

mesmo quando essas bactérias são fisicamente separadas a partir destas células efetoras

49

por um suporte de filtro e que esta defesa antimicrobiana é NO dependente (Bussiere et

al., 2005).

1.6.2 Células Epiteliais

A interação entre H. pylori e células epiteliais tem sido intensamente avaliada

(Peek & Blaser, 2002; Panchal et al., 2003; Naumann & Crabtree, 2004; Peek &

Crabtree, 2006; Crabtree & Naumann, 2006). Entretanto, apesar do contexto de toda essa

revisão, torna-se importante enfatizar o envolvimento das células epiteliais gástricas na

falha da resposta imune. Provavelmente, o H. pylori tira proveito do elevado nível de

tolerância oral no intestino para sobreviver no estômago. Exemplo disso é a falta de

indução da TLR5 pelo H. pylori comparadas com outros agentes patogênicos gástricos

(Gewirtz et al., 2004).

1.6.3 Células Dendríticas

"As células dendríticas são as APC mais importantes para a ativação de células T

virgens, e desempenham grande papel na resposta imune inata às infecções e na ligação

entre imunidade inata e adquirida" (Nish et al., 2003, Abbas et al., 2011).

As células dendríticas (DCs) são de grande interesse no estudo da imunologia da

infecção causada pela bactéria Helicobacter pylori, em razão de representar o elo

fundamental entre a resposta imune inata e a adaptativa. Identificadas como

respondedores primários aos estímulos causados pela bactéria e como células

apresentadoras de antígenos (Pulendran et al., 2001).

Alguns experimentos in vitro têm demonstrado que as células dendríticas

penetram a camada epitelial da mucosa gástrica e, a barreira epitelial do intestino in vivo,

englobando a bactéria diretamente (Rescigno, et al., 2001, Niess et al, 2005, Chieppa et

al., 2006). Entretanto, isto ainda não está bem comprovado no que diz respeito a

infecção por H. pylori, mas a interrupção do complexo apical juncional do epitélio pelo

H. pylori poderia facilitar a interação tanto luminal, quanto subepitelial das células

dendríticas com o H. pylori e os antígenos produzidos pela bactéria (Amieva et al.,

2003). Trabalhos demonstraram que células dendríticas derivadas de células

mononucleares de sangue periférico de seres humanos, produziram IL-12 e IL-10

50

quando estas eram contaminadas por H. pylori (Guiney et al., 2003, Kranzer et al.,

2004).

Determinante importante na orquestração da resposta imune, talvez possa ser o

potencial antigênico do H. pylori de proteína de membrana externa (Voland et al,, 2003).

Recentemente, tem-se demonstrado que as DCs interagem com H. pylori pela

ligação de estruturas de hidrato de carbono de glicoconjugados para Dc-específico

(Appelmelk et al., 2003).

Experimentos demonstraram que em ratos infectados por H. pylori, as DCs são

rapidamente recrutadas para o estômago, levando, em média, em torno de seis horas após

a inoculação, porém desaparecem em torno do quinto dia, não se sabendo se este

desaparecimento está ligado a migração das células CD11-positivas para os nódulos

linfáticos, ou se ocorre apoptose dessas células, ou ainda, uma falha de sustentação dessa

resposta, por vez necessitando de melhores investigações (Kao et al, 2006).

Trabalhos mais recentes demonstram que as DCs quando estimuladas pelo H.

pylori durante 48 horas, exibem uma capacidade nitidamente atenuada para induzir a

produção de IF-γ mediante cultura com células T naive comparadas com as DCs

pulsadas com H. pylori em apenas 8 horas, havendo perda semelhante de resposta para

ligação com CD40, sugerindo que a exposição crônica de DCs ao H. pylori resulta na

perda de capacidade de induzir uma resposta Th1 que poderia estar contribuindo para a

persistência da infecção ( Mitchell et al, 2007).

1.6.4 Linfócitos

1.6.4.1Células B

Apesar de terem sido bem menos estudadas que as células T, há uma grande

evidência de que as células B contribuam para a imunopatogênese da bactéria H. pylori

(Akhiani et al., 2004).

Akhiani e colaboradores realizando estudo experimental com ratos deficientes em

células B (µMT), infectados com H. pylori, comparando estes com ratos de linhagem

selvagem, observaram que não havia diferença na colonização após 2 semanas de

infecção, porém em dois casos houve uma redução por volta da oitava e décima sexta

semana respectivamente, tendo sido associados com o aumento da inflamação gástrica e

infiltração de células CD4+ T (Akhiani et al., 2004). Embora já se tenha descrito

51

resposta IgG e IgA tanto no soro, quanto na mucosa gástrica podendo estar envolvida na

proteção imunológica, estudos aposteriores dão conta de que há uma resposta negativa

de anticorpos IgA, sugerindo que a resposta mediada por anticorpos de células B pode

ser contraproducente. O maior foco de investigação que tem sido relatado, está voltado

para o estudo da associação do desenvolvimento de tumores de células linfóides da

mucosa gástrica. Um grupo de cientistas demonstraram que as células esplênicas de ratos

expostas ao H. pylori estavam protegidas contra apoptose espontâneas e sofreram

proliferação em resposta baixa, e não alta, da multiplicação da infecção, e estas células

respondedoras eram derivadas da população de células B (Bussiere et al., 2006).

Experimentos demonstraram que a infecção crônica da mucosa gástrica pelo H.

pylori encontrava-se protegida por células B esplênicas derivadas de apoptose, indicando

que há uma ativação/sobrevivência fenotípica de célula B, podendo estar relacionado

com o tumor de células linfóides da mucosa gástrica (Bussiere et al., 2006).

Sabe-se que além de produzir anticorpos específicos para antígenos, as células B

também demonstraram produzir anticorpos autorreativos que podem ser patogênicos

(Crabtree et al., 1991, Yamanishi et al., 2006).

1.6.4.2 Células T

A partir do momento em que houve a descoberta do H. pylori como um patógeno

humano, muito se tem investigado a respeito do papel das células T. Os primeiros

estudos dão conta de que os linfócitos gástricos de pacientes infectados pelo H. pylori

tem um incremento de células T produtoras de IFN-γ, com base na resposta da citocina

Th1 e que clones de células T H. pylori-específicos derivados da mucosa gástrica

também possuem um perfil de resposta Th1 em pacientes com doença ulcerosa péptica

(Karttunen et al.,1995, D'Elios et al.,1997, Bamford et al., 1998). As células T da

mucosa gástrica infectada por H. pylori produzem níveis abundantes de citocinas Th1,

IFN-γ e IL-2 e, níveis baixos de citocinas Th2, IL-4 e IL-5 (Karttunen et al., 1995,

Bamford et al., 1998). Trabalhos adicionais demonstraram a importância da ativação da

produção de IL-12 a partir de monócitos, macrófagos ou DCs na indução da resposta

imune por linfócitos Th1 (Haeberle et al., 1997, Meyer et al, 2003, Guiney et al., 2003,

Hafsi et al., 2004), assim como o papel das células epiteliais gástricas como células

apresentadoras de antígenos na ativação de células CD4+ Th (Ye et al., 1997). Estudos

com ratos tem demonstrado que a resposta Th1 está associada com o aumento da

52

gastrite, isto porque IFN-γ/- de ratos demonstra diminuição da gastrite (Akhiani et al.,

2002) e a combinação severa de ratos portadores de doença que determinam

imunodeficiência com deficiência de células T e B com infecção por H. pylori

necessitam da transferência adaptativa de células CD4+ T por gastrites (Eaton et al.,

2001).

Trabalhos tem demonstrado a implicação das células Treg na patogênese da

infecção pelo H, pylori (Lundgren et al., 2003, Lundgren et al., 2005).

1.7 - LINFÓCITO T REGULADOR

Durante a década de 1980 foram realizadas vários tipos de experimentos com

diversos tipos de hibridomas, onde foi identificada um subtipo de células T que tem a

capacidade de suprimir as respostas imunes frente a antígenos específicos. Essa

capacidade supressora foi observada tanto in vitro como in vivo, acometendo qualquer

indivíduo simplesmente transferindo estas células, que passaram a ser denominadas de

células supressoras (Hernández, 2009).

Contudo, as tentativas iniciais para definir populações de células supressoras e

seus mecanismos de ação não foram bem sucedidas, tendo sido os trabalhos

abandonados por mais de duas décadas (Abbas, 2011).

Passados mais de 20 anos, com a utilização de melhores abordagens com intuito

de definir, purificar e analisar populações de linfócitos T que inibem respostas

imunológicas, fizeram com que o interesse e as pesquisas ressurgissem de maneira

impressionante (Abbas, 2011).

As células T reguladoras foram descritas pela primeira vez em 1995 por

Sakaguchi e colaboradores, como uma célula reguladora da resposta imune e da

ativação celular (Belkaid & Rouse, 2005).

Os linfócitos T reguladores representam uma subpopulação de linfócitos T de

células TCD4+, caracterizados pela expressão da molécula CD25+ e do fator nuclear

FOXP3, cuja a função é suprimir as respostas imunológicas e manter a autotolerância

(Abbas, 2011; Melo & Carvalho, 2009).

Os linfócitos T reguladores são componentes da tolerância imunológica, e são

moduladores essenciais na resposta imune à patógenos, alérgenos, células cancerígenas

e antígenos próprios (Melo & Carvalho, 2009).

53

A sinalização para o desenvolvimento das Tregs naturais que ocorre durante a

timopoiese normal ainda é desconhecida, segundo Piccirilo (2008), entretanto Abbas

(2005) acredita que essas células possam ser geradas mediante reconhecimento de

antígenos próprios no timo, através de receptores de alta afinidade (TCR).

Em experimentos realizados com ratos observou-se que a IL-2 tem papel

importante no desenvolvimento das células T reguladoras. Tais experimentos

demonstraram que a deficiência tanto da citocina quanto do receptor, determinaram

graves defeitos de Tregs. Fato este também observado em pacientes com deficiência

congênita da molécula CD25 (Abbas, 2005; Piccirillo, 2008).

São descritos, atualmente, dois tipos principais de Tregs: naturais e adaptativas.

As chamadas Tregs naturais expressam continuamente o receptor de nos corpúsculos de

Hassal no timo como uma subpopulação de células T principalmente distintas e

maduras, representando 5 a 10% das células TCD4+ do sangue periférico (Yagi et al.,

2004; Sakaguchi, 2005; Melo & Carvalho, 2009). Ainda pode-se citar, como

marcadores dessas células, além da expressão constitutiva do fator de transição FOXP3,

o receptor da família TNF induzida por glucocorticóide (GITR), o antígeno 4 associado

ao linfócito T citotóxico (CTLA-4) e elevado nível da cadeia alfa do receptor de IL-2

(CD25) (Cruvinel et al., 2008; Borges et al., 2010).

Outros receptores de superfície descritos nas Tregs são CD27, Fas, CD62L; e os

receptores de quimiocina CCR6, CCR7, CCR8 e CD103, o que permite a migração das

Tregs até o local da inflamação (Melo & Carvalho, 2009).

As células T reguladoras adaptativas são produzidas na periferia após uma

variedade de estímulos antigênicos ou em condições tolerogênicas (Bacchetta et al.,

2007; Taams et al., 2006). Exercem sua função com a liberação de citocinas inibitórias

como IL-10 e TGF-β (Jonuleit & Schimitt, 2003; Sakaguchi, 2006). Vários tipos de

Tregs adaptativas têm sido descritos, como TR1, que produzem IL-10, cuja a função

supressora pode ser bem observada nos trabalhos relativos as doenças alérgicas,

autoimunes e transplante alogênico (Bocchetta et al., 2007; Melo & Carvalho, 2009).

Ainda são citadas na literatura outras Tregs adaptativas tais como TR3 (produtoras de

TGF-β), células T CD4-CD8-, natural killer, CD8+ supressora e gama-delta (Tang &

Bluestone, 2008; Melo & Carvalho, 2009).

54

1.7.1 Fator de Transcrição FOXP3

A partir do trabalho de Brunkow et al. é que a importância do FOXP3 nas

células T reguladoras ficaram bem definidas, quando identificaram a mutação do tipo

frameship do gene FOXP3 (Torgerson & Ochs, 2007). Esta mutação é responsável pelo

fenótipo de camundongos scurfy, uma linhagem mutante recessiva, ligada ao X que

apresenta distúrbios auto-imunes graves com depleção completa de Tregs e óbito

precoce (Melo & Carvalho, 2009).

A deleção funcional do FOXP3 em seres humanos tem sido descrita em

pacientes com a síndrome IPEX (Immunodeficiency, Poliendocrinopathy and

enteropathy X-linked syndrome), caracterizada clinicamente por múltiplas doenças

autoimunes, incluindo diarréia, eczema, diabetes com destruição das glândulas

endócrinas, insulinite e tireoidite, com predileção para meninos em torno dos dois anos

de idade, culminando com o óbito precoce (Gambineri et al., 2003; Campbell & Ziegler,

2007; Torgerson & Ochs, 2007; Melo & Carvalho, 2009).

Localizado no braço curto do cromossomo X, o FOXP3 está constituído de 11

exons e codifica uma proteína de 431 aminoácidos, denominada também de FOXP3.

Predominantemente, encontra-se expresso nas células do timo, baço e linfonodos e,

particularmente, nas células T CD4+CD25+ (Yagi et al., 2004; Torgerson & Oches,

2007).

A proteína FOXP3 é um fator de transcrição, cuja função é exercida sobre

regiões reguladoras específicas dentro do DNA através de um fator ligante altamente

preservado denominado forkhead/winged-helix, aumentando ou suprimindo a

transcrição de genes específicos (Abbas, 2005; Torgerson & Ochs, 2007; Melo &

Carvalho, 2009). Exerce função efetora e facilitadora sobre genes de proteínas chaves

na ativação celular, incluindo a IL-2 e o GM-CSF (Torgerson & Ochs, 2007; Melo &

Carvalho, 2009).

Membro da subfamília P das proteínas FOX (forkhead box), o fator FOXP3 é

composto por três domínios (repressor, central e ligante de DNA ou forkhead (Coffer &

Burgering, 2004; Campbell & Ziegler, 2007; Melo & Carvalho, 2009). (Figura 13). A

maioria das mutações que afetam o gene que levam a substituição de um aminoácido

pelo outro); entretanto, é sabido que ocorrem vários outros tipos de mutações (deleções

ou substituições) e que podem afetar outros domínios (Torgerson & Ochs, 2007; Melo

& Carvalho, 2009).

55

Figura 13 - Estrutura da proteína FOXP3, com o domínio repressor, central composto

por dedos de zinco (ZnF) e zíper de leucina (Zip), e o domínio forkhead. A régua

representa o número de aminoácidos (AA) de 1 a 431. (Adaptado de Torgerson & Ochs,

2007).

Ainda não está bem definida a sinalização nuclear através do FOXP3 nas Tregs.

Alguns trabalhos experimentais demonstram que após a ligação do Ag com o TCR,

observa-se uma atenuação na sinalização celular devido a interação física dos fatores

nucleares NF-kB e NFAT com o fator FOXP3 reprimindo os genes de transcrição das

citocinas IL-2, IL-4 e IFN-y. Ainda observa-se uma outra consequência da ligação de

NFAT e FOXP3, o aumento da expressão de CD25 e CTLA-4. Por último, uma

terceira hipótese de atuação do FOXP3 está ligada a ativação de um cofator com a

função de liberar sinais inibitórios após a ligação do TCR com o Ag (Campbell &

Ziegler, 2007).

1.7.2 Mecanismos de ação das Tregs

Ainda não estão bem esclarecidos os mecanismos de atuação das Tregs para

exercerem a função supressora. Acredita-se que existam pelo menos três mecanismos de

atuação dessas células: contato célula-célula, liberação de citocinas inibitórias e

competição por fatores de crescimento (Sojka et al., 2008; Melo & Carvalho, 2009).

(Figura 14).

56

Figura 14 - Modelos de mecanismos de ação das Tregs. (a) Contato célula-célula -

Supressão da célula-alvo com liberação de fatores de supressão incluindo o monofosfato

de adenosina cíclica (AMPc), citocinas supressivas como o TGF-β, citólise direta ou

sinalização negativa através da molécula CTLA-4; (b) Fatores de supressão solúveis

como citocinas IL-10, TGF-β e IL-35 ou secreção de fatores supressivos pelas APC

como adenosina; (c) Competição - Competição por citocinas que sinalizam através de

receptores da cadeia γ comum (IL-2, IL-4 e IL-7). APC: célula apresentadora de

antígeno (Adaptado de Sojka et al., 2008).

1.7.3 Papel das células T reguladoras nas doenças infecciosas

Diversos mecanismos são acionados para o controle das respostas imunológicas

a infecção e as Tregs participam ativamente no controle dessas respostas. Alguns

trabalhados sobre a infecção causado pela bactéria Helicobacter pylori em seres

humanos tem sido demonstrado o aumento da frequência de células T reguladoras tanto

no estômago quanto no duodeno desses indivíduos infectados por essa bactéria. Outros

experimentos demonstram que em pacientes com hepatite pelo vírus B (HBC) e C

(HCV), também há um aumento de Tregs em sangue periférico (Taams et al., 2006)

Diferente do que ocorre tanto na infecção pelo Helicobacter pylori quanto na

produzida pelos vírus B e C da hepatite, nos pacientes contaminados pelo vírus HIV, a

progressão da doença está diretamente proporcional a um estado de hiperativação

imune, levando a uma redução no número e na função das Tregs (Eggema et al.2005;

Ndhlovu et al., 2008).

57

1.8 DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO PELO H. PYLORI

Atualmente encontram-se disponíveis vários métodos de diagnóstico para a

infecção pelo H. pylori, estando divididos em métodos endoscópicos e não-

endoscópicos. O método endoscópico utiliza-se da esofagogastroduodenoscopia para

realização da biópsia gástrica e assim proceder a coleta do material através de biópsia

gástrica, onde, a partir do qual será realizada a pesquisa através ou do estudo

histopatológico, ou do teste da urease, ou da cultura, ou PCR (Hammar et al., 1992;

Logan & Walker, 2001; Bittencourt et al., 2006).

Para a realização do método histopatológico procede-se a realização do exame

endoscópico, retira-se de um, dois ou mais fragmentos da mucosa gástrica,

preferencialmente do antro gástrico, posteriormente encaminhando este material a

patologia que procederá a identificação do microorganismo através dos diversos

métodos de coloração histológica, sendo que os mais utilizados são o Giemsa, Warthin-

Starry, Steiner e carbolfucsina. Este método, além da identificação da bactéria, permite

também avaliar o tipo e a intensidade da inflamação da mucosa gástrica. Contudo, não é

um método isento de falhas, pois uma amostra inadequada pode comprometer o

resultado do exame (Bittencourt et al., 2006).

A cultura da bactéria é considerada como o método mais específico para o

diagnóstico da infecção por este microorganismo, pois permite não só a identificação do

H. pylori, como, também, proporciona o estudo da amostra quanto à presença de fatores

de virulência, podendo ser usado para determinar a suscetibilidade aos antimicrobianos,

visando uma terapêutica mais adequada (Scholte et al., 2002; César et al., 2005).

Dado seu crescimento lento é muito difícil cultivar in vitro a bactéria H. pylori.

Entretanto, vários meios de cultura podem ser empregados no sentido de identificar a

bactéria. Vários fatores podem influenciar o crescimento da bactéria H. pylori em meio

de cultura como o número de biópsias, o próprio meio empregado, a duração e a

temperatura de transporte e, até mesmo, o método de cultivo (Tonelli & Freire, 2000;

Bittencourt et al., 2006). Alguns medicamentos também podem influenciar a detecção

do H. pylori, como por exemplo, o omeprazol, antimicrobianos, sais de bismuto e

benzocainas. Outro dado importante reside no fato de que alguns autores afirmem que

resíduos de glutaraldeído, utilizado no processo de desinfecção das pinças de biópsias,

possam estar presentes nestas por ocasião da realização da biópsia e, com isso, afetar a

viabilidade do microorganismo (Tonelli & Freire, 2000).

58

Outro método diagnóstico bastante empregado atualmente para identificação da

bactéria H. pylori é o teste da urease, baseado na potente atividade ureásica do

microorganismo. O teste da urease é altamente específico e sensível e, também, o mais

empregado no diagnóstico endoscópico. Como regra, biopsia um fragmento do antro ou

um fragmento do antro e outro do corpo gástrico que, após a coleta, são introduzidos de

imediato em um pequeno tubo contendo uréia e um indicador de pH (vermelho fenol).

Observa-se que a urease hidrolisa a uréia em amônia e dióxido de carbono,

determinando, conseqüentemente, um aumento do pH e mudança de coloração do meio,

passando da cor amarela para a rosa. O teste será considerado positivo quando esta

mudança de coloração possa ocorrer num espaço de tempo menor que 24 horas

(Ornellas et al., 2000).

Embora largamente utilizado na prática clínica, o teste da urease tamponado não

fornece informações a respeito da intensidade da inflamação (Chu et al., 1997).

A genotipagem dos marcadores de virulência do H. pylori e determinação de

suscetibilidade da bactéria aos microorganismos, tanto em amostras isoladas quanto em

fragmentos de biópsia, são as técnicas de Biologia Molecular empregadas para o

diagnóstico da infecção (Bittencourt et al., 2006).

A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) apresenta altíssima sensibilidade e

especificidade, podendo ser feita diretamente da biópsia gástrica ou duodenal, do suco

gástrico, da placa dentária, da saliva, da cultura e até mesmo das fezes (Siqueira et al.,

2007). Em função da sua alta sensibilidade, a PCR é bastante utilizada em estudos

epidemiológicos ligados à identificação de reservatórios ambientais, assim como em

trabalhos de determinação do modo de transmissão desta bactéria (Lehours et al., 2003).

Com sensibilidade semelhante a da PCR, a reação de hibridização in situ com

fluorescência (FISH) é outro método de pesquisa do DNA da bactéria em tecido

(Lehours et al., 2003).

Para a identificação de fatores de virulência do H. pylori, como cagA e vacA,

diversos métodos de biologia molecular podem ser empregados, como PCR, PCR

seguida de hibridação (LIPA – line probe assay), PCR em tempo real rtPCR (Van doorn

et al., 1998; Queiroz et al., 2000; Boonjakuakul et al, 2004). Levando-se em

consideração as variações regionais na seqüência dos genes que codificam esses fatores,

os iniciadores das reações devem ser testados para as diferentes populações (Queiroz et

al., 2006).

59

Também chamados de indiretos, os métodos não endoscópicos têm sua

indicação para detecção do H. pylori em pacientes que não necessitam exame direto da

mucosa gástrica, dificuldades na obtenção de biópsias (úlceras com sangramento e

terapia anticoagulante), avaliação da eficácia da erradicação do microorganismo e

estudos epidemiológicos (Hirschl & Makristathis, 2007). Compreendem a pesquisa de

anticorpos anti-H. pylori em amostras de soro, urina e saliva, a pesquisa de antígenos de

H. pylori nas fezes e o teste respiratório através da ingestão de solução de uréia marcada

com carbono-13 e carbono-14 (Bittencourt et al., 2006; Siqueira et al., 2007).

De grande importância nos estudos epidemiológicos, os testes sorológicos se

baseiam na detecção de anticorpos específicos: IgG, IgM ou IgA, contra o H. pylori

(Bittencourt et al., 2006).

Uma resposta imunológica celular e humoral, que resulta na produção de

anticorpos anti-H. pylori das classes IgM, IgA e IgG é induzida no hospedeiro através

da infecção pela bactéria H. pylori. Os anticorpos específicos da classe IgA e IgG

atingem níveis detectáveis, aproximadamente, 3 semanas a 3 meses depois do início da

infecção aguda e podem ser observados até cerca de 2 anos após a erradicação do H.

pylori. Em razão da infecção provocada pela bactéria ser restrita à mucosa, em

determinados casos, a estimulação antigênica pode ser lenta e, em poucas semanas ou

meses após nova infecção, resultados falsos-negativos podem ocorrer (Bittencourt et al.,

2006).

Em razão de sua rapidez, simplicidade, baixo custo, reprodutibilidade, com

inúmeros kits disponíveis no mercado, o ensaio imunoenzimático (ELISA), dentre os

vários métodos disponíveis, é o mais utilizado. Contudo, podem apresentar resultados

falsos-negativos em crianças, idosos e pessoas imunodeprimidas, que não desenvolvem

reação imunológica contra a infecção (Gilger et al., 2002).

A pesquisa da bactéria nas fezes é realizada através de método imunoenzimático

empregando anticorpos mono ou policlonais (Bittencourt et al., 2006).

Recentemente foram lançados no mercado testes imunocromatográficos para

detecção de antígenos nas fezes, de execução fácil, que permitem a obtenção de

resultados em poucos minutos, com sensibilidade e especificidade semelhantes àquelas

observadas com os testes imunoenzimáticos (Kato et al., 2004; Antos et al, 2005).

Para a realização do teste respiratório administra-se uma solução de uréia

marcada com carbono-13 e carbono-14; a urease bacteriana converte a uréia em amônia

e bicabornato, que é absorvido e convertido em CO2 nos pulmões; o paciente expira em

60

um balão ou outro recipiente próprio onde a presença de carbono marcado pode ser

detectada por cintilação ou espectrografia (Tonelli & Freire, 2000). Este teste apresenta

mais de 90% de sensibilidade e é altamente específico. Também pode ser utilizado em

estudos epidemiológicos, sendo de preferência para o controle da erradicação da

infecção pelo H. pylori, por não ser um teste invasivo (Siqueira et al., 2007).

Recomenda-se a utilização de, pelo menos, dois testes para o diagnóstico mais

acurado da infecção pelo H. pylori (Bittencourt et al., 2006).

61

1.9 OBJETIVOS

1.9.1Objetivo Geral

Determinar o padrão de resposta imunológica ao H. pylori em amostras de

biópsias gástricas de pacientes com gastrite com ênfase na resposta T regulatória.

1.9.2 Objetivos específicos

Quantificar no tecido gástrico a presença de células CD4, CD8, Células B,

Neutrófilos e Linfócitos T regulatórios.

Correlacionar a presença de infecção pelo H. pylori entre os pacientes com o

perfil fenotípico do infiltrado inflamatório e os achados histopatológicos.

62

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 POPULAÇÃO DE ESTUDO

O estudo realizado caracterizou-se como estudo transversal analítico, constituído

de cinquenta amostras de biópsias gástricas, provenientes do arquivo de anatomia

patológica de um Laboratório de Análises Clínicas e Patologia Privado de Belém-PA, de

pacientes com diagnóstico clínico (endoscópico) de gastrite.

Previamente, todos os sujeitos pesquisados foram informados sobre a pesquisa, de

maneira acessível. Após o esclarecimento da importância deste estudo, foi solicitada sua

permissão, através da assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo

1), conforme rege a Resolução 196/96, do Conselho Nacional de Saúde, sobre aspectos

éticos envolvendo a pesquisa com seres humanos, autorizando suas participações nesta

pesquisa, possibilitando a coleta de material biológico para pesquisa.

2.2 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO NO ESTUDO

2.2.1 Critérios de inclusão

Indivíduos com idade igual ou superior a 18 anos;

Não fizeram uso de antagonistas de receptores H2, inibidores de bomba de

prótons; ou drogas antimicrobianas, há pelo menos 60 dias anteriores à obtenção do

material;

Não apresentarem deficiência de natureza mental;

Assinarem o Termo de Esclarecimento e Consentimento Livre.

2.2.2 Critérios de exclusão

Menores de idade;

Fizeram uso de antagonistas de receptores H2, inibidores de bomba de prótons;

ou drogas antimicrobianas, a pelo menos 60 dias anteriores à obtenção do

material;

Portadores de deficiência mental de qualquer natureza;

63

Portadores de outras patologias gástricas que não gastrite;

Portadores de doenças infecto contagiosas;

Portadores de doenças consuptivas;

Não assinarem o Termo de Esclarecimento e Consentimento Livre.

2.3 COLETA E PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS

2.3.1. Biópsias: A biópsia gástrica foi coletada durante o exame de endoscopia digestiva

alta, utilizando-se uma pinça gástrica. Sendo retiradas duas amostras da região antral

para extração do DNA, que foram acondicionadas em tubo eppendorf estéril e

congeladas para posterior análises. E biópsias gástricas da região antral e da área de

lesão da mucosa, quando houvesse, para análise histopatológica.

2.3.2 Análise Histopatológica

A análise histopatológica e a detecção histopatológica do H. pylori das amostras

foram realizadas no Núcleo de Medicina Tropical da Universidade Federal do Pará.

As biópsias chegaram ao laboratório, fixadas em solução de 10% de formalina em

tampão fosfato, onde foram processadas, submetidas a banhos seqüenciais de álcoois

70%, 80%, 90%, 100% e 100% uma hora em cada, e incluídas em parafina.

Posteriormente, foram feitos cortes histológicos seqüenciais de aproximadamente 4 mm

de espessura, dispostos em lâminas e corado pela Hematoxilina-Eosina (HE), para a

análise histopatológica.

2.4 DESCRIÇÃO DAS TÉCNICAS LABORATORIAIS

2.4.1 Detecção Histopatológica do H. pylori

Para a detecção do H. pylori foi utilizado o método Gram modificado e

microscopia óptica convencional, identificando a bactéria mediante suas características

morfológicas, forma curva e espiralada, e coloração azul intensa.

2.4.2 Detecção das células CD4, CD8, linfócitos B, Neutrófilos e linfócitos T

regulatórios na biópsia gástrica.

64

Para quantificação das interleucinas na mucosa gástrica foram utilizado kits de

imunohistoquímica, que obedeceu às seguintes etapas:

1- Desparafinização das lâminas em xilol I (20 minutos), xilol II (10 minutos) em

temperatura ambiente;

2- Hidratação das lâminas em etanol absoluto I (5 minutos), etanol absoluto II (2

minutos), etanol 95% (2 minutos), etanol 80% (2 minutos), etanol 70% (2minutos);

3- Lavar os cortes com água corrente (5 minutos), água destilada (5 minutos) e PBS (5

minutos). OBS: PBS pH 7,4;

4- Bloqueio de pigmento formólico, onde os cortes foram imersos em solução de

hidróxido de amônia 25% por 30 minutos em temperatura ambiente.

- 250 ml de Hidróxido de amônia

- 750 ml de Álcool 95% / 1000ml

5- Lavar os cortes em água corrente (5 minutos), água destilada (5 minutos) e PBS (5

minutos)

6- Bloqueio da peroxidase endógena com 3 incubações de 15 minutos cada em peróxido

de hidrogênio 3% em câmara escura.

- 85,7 ml de Peróxido de hidrogênio

- 914,3 ml de Água destilada / 1000ml

7- Lavagem em água corrente (5 minutos), água destilada (5 minutos), PBS (5 minutos)

Para a recuperação antigênica os cortes foram imersos em tampão de ácido acético

diaminotetraetileno (Tris/EDTA) pH 9,0 já aquecido em banho-maria a 95ºC por 20 a 25

minutos. A Seguir, lavou-se em água corrente (5 minutos), água destilada (5 minutos),

PBS (5 minutos).

Para bloqueio das proteínas inespecíficas foi realizada a imersão dos cortes em

solução de leite molico 10% por 30 minutos.

O passo seguinte será a incubação das lâminas com anticorpo primário diluídos em

Soro Albumina Bovina (BSA) a 1% nas concentrações pré-estabelecidas por 12 horas a

4ºC. Pinga-se 100µl do anticorpo diluído.

Para análise das citocinas as lâminas foram colocadas em solução de saponina por

10 minutos. Posteriormente, fez-se duas lavagens em PBS (5 minutos); incubou-se com

o anticorpo secundário; pingou-se sobre as lâminas a biotina , deixou-se a temperatura de

37ºC e aguardou-se por 30 minutos; realizou-se mais duas lavagens com PBS (5

minutos).

65

Para análise das citocinas, as lâminas foram colocadas em solução de saponina por

10 minutos. Posteriormente, fez-se duas lavagens de PBS (5 minutos); incubou-se com

anticorpo secundários; pingou-se sobre as lâminas a biotina, deixou-se a temperatura de

37°C e aguardou-se por 30 minutos, realizou-se mais duas lavagens com PBS (5

minutos).

Após esse tempo pingou-se sobre as lâminas a estreptavidina, a 37ºC por 30

minutos.

Mais duas lavagens em PBS, por cinco minutos foram realizadas.

Revelou-se as lâminas em solução substrato (DAB), por 2 a 3 minutos.

Lavou-se as lâminas em água corrente por cinco minutos.

O passo seguinte foi contracorar as lâminas em hematoxicilina de Mayers por 1

minuto.

Lavou-se em água corrente até que a mesma ficasse clara.

Desidratou-se em concentrações crescentes de álcool (70%, 95%, 100%, 100%) por

dois minutos cada.

Deixou-se secar em T.A. over night ou em estufa por 5 a 10 minutos a temperatura

de 37ºC.

Finalmente, montou-se entre lamínula e cola apropriada.

66

2.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Após a análise descritiva, os resultados foram apresentados sob a forma de

tabelas e gráficos.

Na análise das variáveis quantitativas, foram utilizadas medidas de tendência

central (média, mediana) e medidas de variabilidade (máximo, mínimo e desvio-

padrão).

Para verificar se havia diferença significativa entre as médias foi utilizado Teste

t de Mann-Whitney.

Para verificar a existência de correlação entre as variáveis foi adotado o Teste de

Correlação de Pearson.

Para aplicação dos testes foi utilizado o programa de computação estatística

BIOESTAT 5.0 (Ayres et al., 2003).

A interpretação dos testes foi realizada de acordo com a convenção científica,

isto é, o resultado foi chamado de estatisticamente significante se o valor de p era menor

que 0,05 (p>0,05). Sugerindo a não rejeição da hipótese de nulidade de que as variáveis

envolvidas estão de alguma forma associada.

67

4. RESULTADOS

4.1 AMOSTRA

A população deste estudo foi constituída por 50 amostras de indivíduos

portadores de gastrite, em que foram realizadas biópsias gástricas durante exame de

endoscopia digestiva alta, com posterior análise das lâminas oriundas do arquivo de

patologia do Laboratório Sabin.

4.2 DETECÇÃO HISTOPATOLÓGICA DO H.pylori

Através da utilização do método Gram modificado e microscopia óptica

convencional, foi possível detectar a presença ou ausência da bactéria no material

estudado. Deste modo, o H. pylori foi encontrado em 72% (36) da amostra estudada,

enquanto que 28% (14) desta não apresentava a bactéria (Tabela 1).

Tabela 1 - Resultado das amostras estudadas quanto a presença e ausência de H. pylori.

H. pylori Frequência Porcentagem Porcentagem acumulada

não 14 28.0% 28.0%

sim 36 72.0% 100.0%

Total 50 100.0% 100.0%

sim = H. pylori presente; não = H. pylori ausente

Int. Conf. 95%

não 16.2% 42.5%

sim 57.5% 83.8%

68

4.3 DETECÇÃO DAS CÉLULAS CD4, CD8, CD20, NEUTRÓFILOS E

LINFÓCITOS T REGULATÓRIOS

4.3.1 CÉLULA CD 20

Tabela 2: Estatística descritiva da variável CD20

Variáveis H. pylori positivo H. pylori negativo

Tamanho da Amostra 36 14

Média 7.27 8.71

Desvio Padrão 2.41 1.68

p = 0,0276

Quanto a presença de célula CD20 na amostra estudada representada na tabela

acima, foi observado que quando o H. pylori não estava presente havia uma quantidade

de células CD20 significativamente maior do que quando o mesmo se fazia presente,

com uma média de 8,71 e desvio padrão de 1,68 para H. pylori negativo e, média de

7,27 com desvio padrão de 2,41 para H. pylori positivo. Aplicando o Teste t Mann-

Whitney encontramos um valor de p menor que 0,05 (p<0,05) demonstrando que o

resultado foi estatisticamente significante.

69

Figura 15 - Quantidade de células CD20 encontradas em lâminas H. pylori positivo e H.

pylori negativo.

A figura acima indica que quando o H. pylori não se fazia presente no material

estudado, a quantidade de células CD20 encontradas foi significativamente maior de

que quando o mesmo era positivo.

70

4.3.2 CÉLULA CD4

Tabela 3: Estatística descritiva da variável CD4

Variáveis H. pylori positivo H. pylori negativo

Tamanho da Amostra 36 14

Média 15,44 20,14

Desvio Padrão 5,47 3,78

p = 0,0073

Quanto a presença de célula CD4 na amostra estudada representada na tabela

acima, a média encontrada foi de 15,44 células por campo examinado quando o H.

pylori se fazia presente e desvio padrão de 5,47, enquanto que nas amostras em que não

era encontrado o H. pylori média de células CD4 foi de 20,14 e desvio padrão de 3,78.

Aplicando o Teste t Mann-Whitney encontramos um valor de p menor que 0,005

(p<0,005) demonstrando que o resultado foi estatisticamente altamente significativo.

Figura 16 - Quantidade de células CD4 encontradas nas amostras contendo H. pylori

positivo e H. pylori negativo.

O gráfico acima demonstra que quando o H. pylori não se fazia presente na

amostra estudada o número de células CD4 encontradas era altamente significativo em

relação as amostras quando o H. pylori era positivo.

71

4.3.3 CÉLULA CD8

Tabela 4: Estatística descritiva da variável CD8

Variáveis H. pylori positivo H. pylori negativo

Tamanho da Amostra 36 14

Média 12,31 14,43

Desvio Padrão 4,86 3,83

p = 0,2153

A análise descritiva quanto a presença de célula CD8 na amostra estudada

representada na tabela acima, a média encontrada foi de 12,31 células por campo

examinado quando o H. pylori se fazia presente, enquanto que nas amostras em que não

era encontrado o H. pylori média de células CD8 foi de 14,43; o desvio padrão da

amostra foi de 3,83 para H. pylori negativo e de 4,86 para H. pylori positivo; Aplicando

o Teste t Mann-Whitney encontramos um valor de p maior que 0,05 (p>0,05), não

havendo, portanto, diferença estatística.

Figura 17 - Quantidade de células CD8 encontradas nas amostras contendo H.

pylori positivo e H.pylori negativo.

O gráfico acima demonstra que tanto na presença, quanto na ausência de H.

pylori estatisticamente não há diferença quanto ao número de células CD8 encontradas

na amostra estudada.

72

4.3.4 NEUTRÓFILOS

Tabela 5: Estatística descritiva da variável Neutrófilos

Variáveis H. pylori positivo H. pylori negativo

Tamanho da Amostra 36 14

Média 11,14 21,79

Desvio Padrão 4,83 5,64

p = 0 < 0,00001

Quando se avaliou a variável Neutrófilos, encontrou-se os seguintes valores

representados na tabela acima. A média encontrada foi de 11,14 células por campo

examinado quando o H. pylori se fazia presente, enquanto que nas amostras em que não

era encontrado o H. pylori a média foi de 21,79; o desvio padrão da amostra foi de 5,64

para H. pylori negativo e de 4,83 para H. pylori positivo. Aplicando o Teste t Mann-

Whitney encontramos um valor de p menor que 0,00001, não sendo altamente

significativo em relação ao H. pylori, levando crer que essa bactéria inibe a resposta

inflamatória.

Figura 18 - Quantidade de Neutrófilos encontrados na presença e ausência de H. pylori

O gráfico acima demonstra que na presença do H. pylori há uma inibição da

resposta inflamatória.

73

4.3.5 FOxP3

Tabela 6: Estatística descritiva da variável FOxP3

Variáveis H. pylori positivo H. pylori negativo

Tamanho da Amostra 36 14

Média 7,4 2,92

Desvio Padrão 3,58 2,52

p = 0 < 0,0001

A análise descritiva quanto a presença de célula T regulatória (FOxP3) na

amostra estudada representada na tabela acima, a média encontrada, por campo

examinado, foi de 7,4 células quando o H. pylori se fazia presente, enquanto que nas

amostras em que não era encontrado o H. pylori a média de linfócitos T regulatório

FOxP3 foi de 2,92; o desvio padrão da amostra foi de 2,52 para H. pylori negativo e de

3,58 para H. pylori positivo. Aplicando o Teste t Mann-Whitney encontramos um valor

de p menor que 0,0001, demonstrando, estatisticamente, ser altamente significativo.

Figura 19 - Quantidade de células Treg (FoxP3) encontradas nas amostras de H. pylori

positivo e H. pylori negativo

O gráfico acima demonstra que a bactéria H. pylori estimula a presença de

linfócito T regulatório.

74

4.4 FREQUÊNCIA DE H. pylori

Tabela 7: Frequência de H. pylori quanto ao número de cruzes, onde 0 = ausência; 1=

uma cruz; 2 = duas cruzes; 3 = três cruzes.

H. pylori Frequência Porcentagem Porcentagem acumulada

0 14 28.0% 28.0%

1 16 32.0% 60.0%

2 12 24.0% 84.0%

3 8 16.0% 100.0%

Total 50 100.0% 100.0%

Nas amostras estudadas, 14 (28%) não havia contaminação pela bactéria H.

pylori em nenhum dos três campos examinados; dezesseis amostras apresentaram

contaminação em apenas um dos campos examinados; doze, apresentavam dois campos

contaminados; em oito, todos campos examinados apresentavam-se infectados pelo H.

pylori.

4.4 TESTE DE CORRELAÇÃO DE PEARSON

O coeficiente de correlação de Pearson, também chamado de "coeficiente de

correlação produto-momento" ou simplesmente de "ρ de Pearson" mede o grau da

correlação (e a direção dessa correlação - se positiva ou negativa) entre duas variáveis

de escala métrica (intervalar ou de rácio/razão).

Este coeficiente, normalmente representado por ρ assume apenas valores entre -1

e 1. Assim, temos:

ρ = 1 Significa uma correlação perfeita positiva entre as duas variáveis.

ρ = -1 Significa uma correlação negativa perfeita entre as duas variáveis - Isto é, se

uma aumenta, a outra sempre diminui.

ρ = 0 Significa que as duas variáveis não dependem linearmente uma da outra. No

entanto, pode existir uma dependência não linear. Assim, o resultado ρ = 0 deve ser

investigado por outros meios.

75

4.4.1 H. pylori e CD4

Figura 20 - Correlação negativa entre a quantidade de células CD4 e H. pylori.

Há evidências estatísticas suficientes para afirmar que a quantidade de células

CD4 independem da presença do H. pylori, dado ρ = -0,4655.

76

4.4.2 H. pylori e CD8

Figura 21 - Correlação negativa entre a quantidade de células CD8 e H. pylori.

Apesar da diferença de média não ser estatisticamente significativa, a correlação

apesar de fraca, foi negativa e significante, levando crer que o H. pylori inibe a resposta

T citotóxica.

77

4.4.3 H. pylori e CD20

Figura 22 - Correlação negativa entre a quantidade de células CD20 e H. pylori.

Estatisticamente há evidências para se afirmar que o número de células CD20

não sofre influência da presença de H. pylori, haja vista ρ = -0,3605.

78

4.4.4 H. pylori e FOXP3

Figura 23 - Correlação positiva entre a quantidade de células Treg FoxP3 e H. pylori.

Estatisticamente a correlação entre FOXP3 e H. pylori é forte, positiva e

significante, dado ρ < 0,0001, levando a crer que a bactéria H. pylori estimula o

aumento do linfócito T regulador.

79

4.4.5 H. pylori e Neutrófilos

Figura 24 - Correlação negativa entre a quantidade de neutrófilos e H. pylori.

Estatisticamente observa-se que a correlação entre a bactéria H. pylori e

neutrófilos é fraca e negativa, ρ = -0,7898, demonstrando que a atividade da gastrite

independe da presença da bactéria.

80

4. DISCUSSÃO

Na grande maioria dos indivíduos infectados pela bactéria Helicobacter pylori,

apresentam uma inflamação que é restrita à mucosa da região antral do estômago.

Porém, em outros indivíduos, observa-se que há um comprometimento, também, ao

nível do corpo gástrico, determinando um quadro de pangastrite, podendo, por sua vez,

evoluir para vários graus de atrofia, tendo como consequência a diminuição da produção

de ácido clorídrico, levando a presumir que tais eventos sejam precursores do câncer

gástrico (Ladeira et al., 2003).

Apesar do alerta, o que se tem observado é que apenas 1% desses indivíduos que

foram infectados pelo H. pylori desenvolverão a neoplasia maligna do estômago. Este

fato pode estar relacionado com as diferenças na expressão de produtos bacterianos

específicos, a diferentes respostas do hospedeiro, ou a diferentes interações entre a

bactéria e o hospedeiro (Peek et al., 2002; Peek et al., 2006).

O Helicobacter pylori ao colonizar a mucosa do estômago promove uma

destruição da barreira de proteção da mesma, fazendo com que o ácido gástrico agrida a

própria mucosa, levando à inflamação, caracterizando a gastrite (Ladeira et al., 2003).

Nos últimos anos, uma variedade de testes tem sido usados no diagnóstico do H.

pylori. A escolha de qual teste a ser utilizado vai depender do número de casos, dos

dados clínicos informados, da localização precisa e dos custos e benefícios que

envolvem toda metodologia a ser empregada (Dunn et al, 1997).

A detecção histopatológica do Helicobacter pylori em amostras de biópsia

gástrica é considerada padrão ouro (El Zirraity et al., 1996).

Este exame é feito após a endoscopia, com a retirada de fragmento, no qual

utiliza-se uma variedade de colorações para detectar a bactéria, sendo necessário várias

horas ou mesmo dois dias para se obter o resultado. O microorganismo pode ser

identificado por diversas colorações histológicas, como Giemsa, hematoxilina e eosina

Warthin-starry, steiner, carbofulcsina. Nesse experimento foi adotado a coloração pela

hematoxilina-eosina para identificação da bactéria H. pylori.

Nesta pesquisa, utilizamos como método de escolha a endoscopia digestiva alta

associada a biópsia da mucosa do antro e corpo do estômago, a semelhança de inúmeros

trabalhos encontrados na literatura médica como de Dunn et al. (1997), Shomer et al.

(1998).

81

Pudemos observar, a semelhança do que foi observado por Dunn et al. (1997),

que o grau de inflamação da mucosa gástrica varia muito, indo desde uma leve

inflamação da lâmina própria, mantendo-se intacta a arquitetura celular, até a uma

inflamação intensa com formação de microabcessos e reação atípica do epitélio.

Neste estudo foi adotado o Sistema Sidney modificado para quantificar a

presença do Helicobacter pylori. Assim, quando em nenhum dos campos examinados

era encontrada a bactéria foi denominado de ausente; quando apenas 1 dos campos

examinados estava contaminado, denominou-se leve; quando dois dos campos

examinados estavam contaminados, chamamos de moderado; quando os três campos

examinados apresentavam-se contaminados pelo H. pylori, foi chamado de intenso.

Observa-se que na literatura, na grande maioria dos trabalhos, é adotado o método

descrito acima, como podemos observar em trabalhos de Gold et al.(2001), Ohyaguchi

et al. (2005), Shomer et al. (1998), Pereira et al. (2001).

Dos cinquenta pacientes estudados, catorze não apresentaram contaminação pela

bactéria e, trinta e seis estavam contaminados, sendo que 16 na forma leve, treze na

forma moderada e, sete na forma intensa. Corroborando com nossos achados,

encontramos que no trabalho de Gold et al. (2001) demonstraram resultados

semelhantes quando analisando histologicamente 33 casos de pacientes que foram

submetidos a endoscopia digestiva alta com biópsia da mucosa antral e corpo gástrico.

Outro importante trabalho é o de Ohyaguchi et al. (2005), que ao realizar estudo em

população japonesa, adotou o método de biópsia semelhante aquele realizado em nosso

experimento, onde guarda semelhança com o resultado desta pesquisa, apenas adotando

um quantitativo maior de casos. Shomer et al. (1998), em estudo experimental,

observaram, também, que houve uma variação histológica de moderada a intensa

quando a gastrite estava associada a presença do Helicobacter pylori.

Nesse experimento foi adotada a coloração pela hematoxilina-eosina para

identificação da bactéria H. pylori. Nas condições deste experimento, ocorreu 100% de

aproveitamento de todo material usado no desenvolvimento desta pesquisa.

A desregulação do sistema imune em muitas doenças é uma marca registrada.

No que diz respeito a infecção pelo H. pylori, a condição sine qua non é a gastrite, tanto

na forma crônica (linfócitos), quanto na forma aguda (neutrófilos) de inflamação. Nas

últimas décadas, estudos tem demonstrado descobertas importantes no que diz respeito

a patogenia da infecção pelo H. pylori, identificando os principais fatores de virulência

82

que, por sua vez, contribuem para os variados resultados clínicos (Wilson & Crabtree,

2007).

Assim, entender se a resposta de um tipo de célula em particular, representa

meramente uma resposta inata, ou adaptativa, é difícil, e o reconhecimento de que as

células, tais como células B podem responder diretamente ao H. pylori, ou através da

via de interação das células T ativadas, demonstra a complexidade da resposta imune

(Mai et al., 1992; Gobert et al., 2002; Panchal et al., 2003).

O tecido contaminado pelo H. pylori caracteriza-se pela presença de infiltrado de

polimorfonucleares (PMN), principalmente neutrófilos, que invadem o epitélio gástrico,

determinando uma série de mudanças neste epitélio, tais como depleção mucínica,

vacuolização citoplasmática e uma grande desorganização das glândulas mucosas, que

com o tratamento antimicrobiano esses desarranjos tendem a desaparecer. Entretanto,

uma boa quantidade de PMN persistem por muitos meses (Dunn et al., 1997).

Nesse estudo foi utilizado como parâmetro para avaliar a atividade da gastrite a

contagem de neutrófilos. Os resultados encontrados demonstraram que quando o

paciente, portador de gastrite, apresentava contaminação pelo H. pylori a quantidade de

neutrófilos era menor que na amostra de pacientes não contaminados pela bactéria,

levando a crer que essa inibe a resposta inflamatória.

Estudos realizados por Kandulski et al. (2010) demonstraram resultados

semelhentes ao desta pesquisa, chegando a conclusão semelhante.

Entretanto, os estudos de Karttunen et al. (1995), Israel & Peek (2001),

Rautemaa et al. (2001), Kondo et al. (2004), Algood et al. (2006) e Harris et al. (2008)

demonstraram resultados diferentes desta pesquisa, ou seja, quando havia a

contaminação pela bactéria o número de neutrófilos era maior que aqueles não

contaminados, podendo estar relacionado com outras variáveis não enquadradas nesta

pesquisa, levando-se em conta que esse resultado vai de encontro com o esperado, haja

vista que os neutrófilos medeiam as fases iniciais das reações inflamatórias. Não

obstante, acreditamos que tal fato pode estar relacionado com a intensidade da gastrite,

compartilhando o pensamento de alguns autores, sendo provável que a intensidade e a

forma das respostas inflamatória e imune, associadas a virulência da cepa, possam ser

responsáveis pelas diversas manifestações de doenças gastroduodenais.

Por outro lado, Yuceyar et al.(2002) não relataram nenhuma diferença

significativa entre os pacientes H. pylori infectados e indivíduos não infectados no que

diz respeito ao perfil de linfócitos periféricos, alegando que a infecção pelo H. pylori

83

induz inflamação crônica e local na mucosa gástrica, podendo não influenciar na

contagem absoluta de glóbulos.

Contudo, quando correlacionamos a presença de H. pylori e neutrófilos,

observamos que esta correlação é fraca e negativa, fazendo-nos pensar que a atividade

da gastrite independe da presença da bactéria.

Embora as respostas inflamatórias e imune possam agravar as lesões

degenerativas do epitélio, desencadeadas pela bactéria, são incapazes de eliminá-la.

É provável que a intensidade e a forma das respostas inflamatórias e imune,

associadas a virulência da cepa, possam estabelecer doenças gastroduodenais diferentes.

O linfócito T auxiliar (CD4+) tem a função de coordenar a defesa imunológica

contra vírus, bactérias e fungos, principalmente através da produção e liberação de

substâncias chamadas citocinas (Abbas et al., 2011).

Estudos demonstram que a gastrite crônica ativa está associada ao acúmulo de

células CD4+ na lâmina própria do estômago (Shomer et al., 1998; Scholte et al., 2002;

Israel & Peek, 2001).

Nesta pesquisa foi observado que quando não havia contaminação pelo H.

pylori, o número de células CD4+ era altamente significativo em relação as amostras

contendo a bactéria, demonstrando que a quantidade de células CD4+ independem da

presença da bactéria Helicobacter pylori, haja vista que todas as reações imunológicas,

fenotipicamente, são dependentes das células TCD4+. Por outro lado, nas condições

deste estudo, podemos concluir que a quantidade de células CD4+ não guarda relação

com grau evolutivo da gastrite, nem tampouco com a presença ou ausência da bactéria

H. pylori, mas sim com a patologia em si.

Em estudo envolvendo variadas doenças gastrointestinais desenvolvido por

Chen et al. (2013), demonstraram que as células CD4+ foram observadas em maior

quantidade nos indivíduos infectados pelo H. pylori. Entretanto, não podemos afirmar

que tais resultados divergem dos encontrados neste experimento, haja vista que em

nosso estudo foram envolvidos apenas indivíduos portadores de gastrite.

Estudos desenvolvidos por Beswick et al. (2009), demonstraram que as células T

CD4+ são suprimidas anti a infecção pelo H. pylori.

Contudo, Chen et al. (2013) demonstraram que as células T CD4+ estão

associadas com a redução do risco do desenvolvimento de doenças gástricas mais

graves.

84

Wu et al. (2011) concluiram que pacientes com gastrite crônica intensa

apresentam uma quantidade de células CD4+ mais elevada em comparação com aqueles

que apresentavam gastrite crônica leve e moderada, o que em nosso experimento foi

indiferente.

Quando aplicamos a correlação de Pearson em nosso experimento pudemos

observar que há evidências estatísticas suficientes para afirmar que a quantidade de

células CD4 independem da presença da bactéria Helicobacter pylori.

Com base nos resultados encontrados na literatura, comparados com os deste

experimento, entendemos que esta pesquisa não se afasta daquilo que foi concluído por

outros autores apesar de ter demonstrado resultados diferentes, pois entendemos que há

uma correlação entre essas células e a patogênese causada pela infecção do H. pylori.

Outrossim, entendemos também que em número de casos maiores, talvez pudéssemos

ter encontrado resultados semelhantes àqueles encontrados na literatura, assim como

poderia estar relacionado ao tempo de exposição ao microorganismo.

O linfócito T citotóxico é um importante leucócito que ataca células que se

tornam anormais, geralmente tumorais ou infectadas por vírus e bactérias. Os linfócitos

T citotóxicos (CD8+) são importantes para a saúde, principalmente por inibirem a

instalação e proliferação de cânceres e outros males atrelados ao incorreto

funcionamento de células do próprio organismo (Cocchi et al., 1995).

Segundo Abbas et al. (2011), a ativação completa das células TCD8+ virgens e a

diferenciação em CTL funcionais e células de memória podem exigir a participação das

células TCD4+ auxiliares.

Tummala et al. (2004), descreve em seu trabalho a relação entre o aumento de

células CD8+, assim como CD4+ em pacientes portadores de gastrite crônica.

A infecção pelo H. pylori estimula o epitélio gástrico a secretar uma variedade

de citocinas que determinam uma reação inflamatória no interior da mucosa gástrica

(Tummala et al., 2004).

Em nosso estudo pudemos observar que a quantidade de células CD8+

encontradas tanto nas amostras contaminadas pelo H. pylori, quanto as que não

continham a bactéria foram aproximadamente iguais, tanto que não houve diferença

estatística.

Resultado semelhante ao da nossa pesquisa pudemos observar no trabalho

desenvolvido por Choileain & Redmond (2006).

85

Ruiza et al. (2012) observaram em seu experimento que o número de células

CD8+ não eram estatísticamente significantes quando havia contaminação do estômago

de ratos pelo H. pylori.

Quando, em nosso experimento, aplicamos a correlação de Pearson entre a

CD8+ e presença do H. pylori, observa-se que esta correlação é fraca e negativa, porém

significante, levando a crer que a bactéria H. pylori inibe a resposta T citotóxica.

Em seres humanos a imunomarcação da molécula CD20 vem sendo usada para

avaliar qualitativamente a inflamação crônica (Lins et al., 2008).

A presença de um grande número de linfócitos B e células plasmáticas na

mucosa gástrica é a evidência de uma resposta humoral ante uma infecção crônica por

H. pylori (Tummala et al., 2004).

Este marcador de linfócitos B é positivo na membrana plasmática das células

atípicas do linfoma, definindo-o como de linhagem ou imunofenótipo B. Mesmo em

algumas células em mitose ou em apoptose é possível observar marcação.

Esta pesquisa demonstrou uma ligeiro predomínio de células CD20 nas amostras

em que não havia contaminação pelo H. pylori, entretanto, estatisticamente, foi

significante, demonstrando que as células CD20 tem papel importante na resposta

humoral ante a infecção crônica pelo H. pylori.

É escassa a literatura envolvendo gastrite, infectada ou não por H. pylori e

contagem de células CD20 (linfócitos B).

Porém, em experimento desenvolvido por Tummala et al. (2004), demonstraram

a presença das células CD20 na mucosa gástrica de portadores de gastrite crônica

infectados por H. pylori, entretanto carece de estudo comparativo com aqueles não

contaminados pela bactéria a semelhança de nosso experimento.

Quando correlacionamos células CD20 e H. pylori, observamos que

estatisticamente estas células não sofrem qualquer tipo de influência na presença da

bactéria.

As células Treg apresentam um papel importante na tolerância e controle

periférico da resposta imunológica, agindo sobre diversos tipos celulares, entre eles

Células TCD4+, TCD8+, células B, natural killers e células dendríticas. Não se sabe,

contudo, qual o(s) mecanismo(s) utilizado, e se este é o mesmo para cada tipo celular

específico (Rudensky & Campbell, 2006).

Esta supressão e imunorregulação exercida pelas células Treg constituem uma

forma de controlar a resposta inflamatória excessiva e danosa ao organismo, haja vista

86

que a inexistência deste controle pode determinar a hiper-reatividade do sistema imune

levando ao surgimento de doenças de natureza autoimune e alérgicas. Ao mesmo tempo,

se estas células exercem sua função de maneira acentuada, o excesso de controle levará

a falta de uma resposta inflamatória eficaz e vigorosa, necessária para controlar

infecções e neoplasias (Borrego et al., 2007; Cruvinel et al., 2008; Ferreira et al., 2010).

Assim, pode-se afirmar que a ausência de células Treg no decorrer da instalação

de uma doença infecciosa promoveria resistência à infecção, bem como sua presença

pode traduzir maior susceptibilidade e supressão da resposta imunológica. (Belkaid &

Rouse, 2005; Belkaid, 2007).

O interesse em se estudar células T regulatórias se deve à função chave dessa

população celular na manutenção dos mecanismos de autotelerância e regulação da

resposta imune (Sakaguchi et al., 1995).

Apenas como exemplo, muito embora não guarde relação com esta pesquisa,

Hori et al. (2003) demonstraram que o fator de transcrição FoxP3 é predominantemente

expresso nas Tregs tímicas e periféricas. Células CD4+CD25-transfectadas com FoxP3,

são capazes de suprimir a proliferação de outras células T e o desenvolvimento de

doença auto-imune e doença inflamatória in vivo e (Hori et al., 2003; Fontenot et al.,

2003).

Tudo leva crer que FoxP3 seja um gene de grande importância no

desenvolvimento e função das Tregs no ser humano (Hori et al., 2003; Sakaguchi,

2004). Fato este, que nos levou a nos interessarmos em pesquisar FoxP3.

A principal função das Tregs é regular negativamente as respostas imunes. Elas

são capazes de inibir várias células, tanto relacionadas a imunidade inata quanto a

adaptativa (Thornton et al., 2004).

Analisando artigos da literatura pudemos observar que há inúmeras evidências

sugerindo a relação das Tregs com o desencadeamento de doenças que efetivamente

determina quebra da autotolerância. Outrossi, o inadequado funcionamento das Tregs

poderá estar relacionado à indução, intensidade e forma de evolução de diversas

patologias que acometem os seres humanos.

Estudos demonstram que a função das Tregs nesse contexto é bastante

complexa. No caso das doenças crônicas, sua função supressora pode ser desfavorável

para a eliminação de alguns patógenos. Em contrapartida, suas características

regulatórias são fundamentais para evitar que o sistema imunitário elabore uma resposta

87

contra bactérias comensais, como por exemplo, as bactérias que colonizam a mucosa

gastrointestinal, ressalte-se o H. pylori.

Ultimamente, tem sido sugerida a influência da participação das Tregs em

doenças causadas por Helicobacter hepaticus, Helicobacter pylori e Cytomegalovirus

entre outras.

Nas condições deste experimento, ao ser quantificada a presença de linfócitos T

reguladores (Treg) em 50 pacientes portadores de gastrite, através da detecção

imunohistoquímica do fator transcricional Foxp3+, constatou-se que a presença de

Foxp3+ é maior naqueles pacientes que apresentavam gastrite com H. pylori, o que nos

faz crer que a bactéria H. pylori estimula o aumento do linfócito T regulador, podendo

restringir uma resposta inflamatória eficiente, o que culminaria em formas mais graves

da doença.

Fernández et al. (2008) estudando a ativação do sistema de células T regulatórias

por H. pylori, demonstrou que a infecção de células da mucosa gástrica na presença de

H. pylori provoca uma subexpressão do receptor de cadeia alfa (CD25) nos linfócitos T

CD4+ migrados para o foco inflamatório. Estes linfócitos também expressam anergia de

outras células T, o que poderia favorecer a persistência bacteriana e a cronificação da

infecção. O mesmo pode ser observado através dos resultados desta pesquisa quando

encontramos valores bem expressivos de FoxP3 nos indivíduos com gastrite positiva

para H. pylori em relação aos casos de gastrite sem a presença da bactéria.

Kao et al (2006), demonstraram que a infecção pelo H. pylori altera o equilíbrio

das DCs em direção a uma resposta T regulatória, suprimindo a indução eficaz do TH17

H. pylori específico. Nesse estudo pudemos observar que a infecção produzida pelo H.

pylori ao nível da mucosa gástrica determina um aumento da resposta celular gástrica T

reguladora.

Um estudo experimental, envolvendo ratos, desenvolvido por Rad et al (2006),

identificou um grande número de linfócitos FoxP3 em biópsias de estômagos de ratos

H. pylori positivos, concluindo que estas células participam da resposta imune para H.

pylori.

Em outro estudo experimental com ratos, Raghavan et al. (2003) demostraram

que quando ratos encontravam-se infectados por H. pylori haveria uma ausência de

células T reg, estando associada com aumento da patologia gástrica.

88

Lundgren et al. (2003) concluiram em seu experimento que células T reg

específicas circulam para suprimir as resposta de memória de células T em pessoas

infectadas pelo H. pylori.

Harris et al. (2008), estudando 115 pacientes entre crianças e adultos, residentes

em Santiago do Chile, concluíram que as patologias gástricas são bem menos agressivas

em crianças quando infectadas pelo H. pylori e apresentam resposta T reguladora

aumentada, quando comparadas com adultos infectados, sugerindo que Treg regula a

resposta inflamatória induzida por H. pylori em crianças.

A correlação de Pearson entre H. pylori e FOXP3 é forte, positiva e significante,

o que nos leva a crer que a bactéria atua estimulando o aumento do linfócito T

regulador.

89

5. CONCLUSÕES

Nas condições desta pesquisa podemos afirmar:

72% das amostras estavam contaminadas pelo H. pylori, destes o maior grupo

encontrava-se na faixa de leve a moderada (77,77%).

A quantidade de células CD4 foi bem maior nas amostras que não estavam

contaminadas pelo H. pylori. Portanto, pode-se afirmar que a quantidade de células CD4

independe da presença do H. pylori.

É possivel afirmar que a bactéria H. pylori inibe a resposta T citotóxica.

Os linfócitos B não sofrem influência na presença do H. pylori.

A atividade da gastrite não depende da presença do H. pylori. Por outro lado,

pode-se afirmar que a bactéria inibe a resposta inflamatória.

A quantidade de células T regulatórias FOXP3 encontradas nas amostras

contaminadas pelo H. pylori nos leva a crer que a bactéria estimula o aumento de

linfócito T regulatório, podendo está relacionado com a supressão de uma resposta

inflamatória eficaz, culminando com formas mais agressivas de gastrite.

Por fim, apesar do desenvolvimento de inúmeros trabalhos envolvendo a

bactéria Helicobacter pylori, entendemos que careça de mais estudos com propostas de

acompanhamento e esclarecimento quanto a função exata das células Treg, bem como

suas implicações funcionais, relacionados a patologia inflamatória gástrica, no intuito de

esclarecer os mecanismos relacionados ao adoecimento e resistência à doença, para

então buscar terapias eficazes que atuarão nos mecanismos da resposta imunológica

90

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ANEXO 1 - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLOÓGICAS

DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Título da pesquisa: Determinação do perfil imunológico com ênfase na resposta T

regulatória ante a infecção pelos diferentes tipos de cepas do H. pylori em pacientes

com gastropatia inflamatória.

Pesquisadores responsáveis: Jair Francisco de Santana Graim e Juarez Antonio

Simões Quaresma.

Justificativa, Objetivos e Procedimentos da Pesquisa: Helicobacter pylori (H. pylori)

é uma bactéria que causa inflamação persistente na mucosa do estômago e do intestino,

com diferentes lesões em humanos, tais como gastrite crônica, úlcera péptica e câncer

de estômago.

Esta pesquisa possui como principal objetivo a identificação de fatores que podem ser

usados como marcadores de risco para essa doença, possibilitando desse modo,

diagnóstico e tratamento mais eficazes. Para tanto é necessário realizar biópsias do

estômago. Com essa finalidade prestamos os seguintes esclarecimentos:

Esta pesquisa não oferece nenhum risco adicional ao paciente que fará a endoscopia

com biópsias do estômago para estudo de cepas virulentas do H. pylori, já que a

endoscopia será realizada por um profissional HABILITADO E EXPERIMENTADO

EM ENDOSCOPIA DIGESTIVA.

Portanto, para o paciente, os riscos de participar da pesquisa será tão somente aqueles a

que ele já está exposto em virtude do procedimento de endoscopia com biópsia visando

um maior conhecimento sobre a infecção causada por esta bactéria em nossa em nosso

Estado.

O material coletado para a pesquisa será usado exclusivamente para este fim, assim

como o questionário e, após o término da pesquisa, serão descartadas de acordo com as

normas de biossegurança.

Ao paciente, o risco de constrangimento pela participação na pesquisa em decorrência

da divulgação de informações será minimizado pelo sigilo absoluto da identidade do

mesmo por parte dos pesquisadores, se for necessário, autoridades de saúde poderão ser

informados para tomar medidas que beneficiem o participante da pesquisa ou outras

pessoas. Aos que se sentirem insatisfeitos ou incomodados é garantido o direito de

abandonar a pesquisa a qualquer momento, sem que isso interfira com o tratamento do

paciente. Aos que permanecerem até o final, é garantido o direito de saber os resultados

parciais e finais da pesquisa.

Os exames realizados pela pesquisa serão gratuitos, não necessitando nenhum custo por

parte do participante para sua realização.

Solicitamos assim, a sua autorização para efetuarmos os referidos exames e realizarmos

uma entrevista, sendo que a mesma é confidencial; para desenvolvermos o estudo em

questão.

Métodos alternativos existentes: Neste trabalho não há prática de outros métodos,

restringindo-se apenas aos descritos acima para a realização do estudo.

Forma de acompanhamento e assistência: Quando necessário, o voluntário receberá

toda assistência médica aos agravos decorrentes das atividades da pesquisa. Basta

procurar os pesquisadores Jair Graim, pelo fone (91) 9146-3281 e Juarez Quaresma,

pelo fone (91) 8125-8200 e também no endereço Av. Magalhães Barata nº 992, no

Hospital Ophir Loyola.

Ressarcimento de pesquisa e indenizações: Não há qualquer tipo de despesa por parte

do paciente e nem sequer qualquer forma de indenização pelo mesmo pela sua

participação neste estudo.

___________________________________________

Dr. Juarez Quaresma

CONSENTIMENTO PÓS-INFORMADO: Declaro que li as informações acima

sobre a pesquisa, e que me sinto perfeitamente esclarecido sobre o conteúdo do mesmo,

assim como seus benefícios. Declaro ainda que por minha livre vontade, aceito

participar da pesquisa cooperando com a coleta de material para exame.

Belém, _____/_____/_____

____________________________________

ASSINATURA DO PACIENTE

Em caso de dúvidas com respeito aos aspectos éticos deste estudo, você poderá

consultar o CEP do Núcleo de Medicina Tropical-NMT/Universidade Federal do

Pará-UFPA

Endereço: Av. Generalíssimo Deodoro, 92

Bairro: Umarizal, Município: Belém, UF: PA

CEP: 66.055-240

Telefone: (91)3201-6857

E-mail: cepbel@ufpa.br

ANEXO 2 – TERMO DE ACEITE DO NÚCLEO DE MEDICINA TROPICAL

DA UNIVERDIDADE FEDERAL DO PARÁ