UNIVERSIDAD RICARDO PALMA

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Transformación genética en Morus nigra “Mora negra” mediada por Agrobacterium tumefaciens

Curso: Taller de Biotecnología Vegetal

Integrantes:

Custodio Zegarra, David. 33 %Dávila Burga, Nicholas. 32 %Rivera Charun, Maria Lucia. 35 %

Profesor:

Dr. Quiñones, Mauro

Lima – Peru

2012

INTRODUCCION

La transformación genética es la alteración de una célula que resulta de la introducción y

expresión de material genético externo (DNA).

La tecnología de la transformación genética o transferencia de genes específicos permite

introducir características nuevas en cultivos tradicionales sin alterar drásticamente el acervo

genético propio de la especie, haciendo posible introducir genes provenientes no sólo de

especies vegetales muy alejadas desde el punto de vista evolutivo sino, incluso de hongos,

virus, bacterias y animales. También es posible introducir genes cuyos productos se expresen

sólo en órganos específicos de la planta o en un determinado momento de su desarrollo.

De los métodos de transformación genética existentes, la transferencia de genes mediada por

Agrobacterium es la más ventajosa (López, 2004). Agrobacterium tumefaciens ·bacteria

causante de la agalla en corona” penetra por los tejidos lesionados y causa una proliferación

celular en el punto de la lesión formándose una agalla o tumor. Durante el contacto con las

células vegetales lesionadas, se transfiere un segmento del DNA del plásmido Ti de A.

tumefaciens desde la bacteria a la célula vegetal, donde se integra en uno o más de sus

cromosomas. Este DNA transferido o T-DNA da como resultado la expresión de un mayor nivel

endógeno de los reguladores de crecimiento. Clonando genes extraños en el T-DNA del

plásmido Ti se puede aprovechar la capacidad de A. tumefaciens para transferir nuevo DNA al

genoma de la planta, como la introducción de un gen resistente a antibióticos en la que las

células transformadas se pueden seleccionar por su capacidad para crecer en un medio que

contenga el antibiótico selectivo, mientras que las células no transformadas no crecerán.

El objetivo del presente trabajo será transformar genéticamente a Morus nigra por medio de

Agrobacterium tumefaciens.

II. ANTECEDENTES

1. De Faria et al. (1997) optimizaron los protocolos de regeneración y transformación en

frambuesa, con la finalidad de lograr un sistema efectivo para la transferencia de

genes mediada por Agrobacterium, obteniendo que en un medio que contiene 300

mg/ml de kanamicina el desarrollo de las raíces y la detección de los genes GUS

mediante Southernblot son indicadores de la transformación genética.

2. Zhong et al. (1999) Varios factores afectan a la transformación genética mediada por

Agrobacterium tumefaciens en Morera. Explantes como hojas, brotes y callos,

mostraron frecuencia de transformación de 8,7%, 5,6% y 2,8% respectivamente. La

consistencia de agrobacterias, el tiempo de inmersión de los discos de hojas de morera

en agrobacterium y el tiempo de co-cultivo tiene efectos directos en la frecuencia de

transformacion. AgNO3 tiene importancia en la estimulación de transformación

genética en Morera.

3. Gonzáles et al. (2000). Evaluaron la capacidad de A. rhizogenes en la transformación

genética de las células de tejidos de diferente edad y regeneraron raíces

transformadas utilizando tres genotipos de Lima ácida. Como resultado, los explantes

de tejidos maduros regeneraron el mayor número de raíces y lo contrario ocurrió con

los explantes de tejidos jóvenes (control).

4. Valderra et al. (2000). Dieron a conocer a Agrobacterium tumefaciens y sus especies

relacionadas como A. rhizogenes y A. vitis como patógenos reconocidos de plantas,

capaces de introducir parte de su material genético dentro del genoma de la planta.

Por esta razón, proponen su uso como herramienta de la ingeniería genética.

5. Garcia et al. (2000) El método de transformación más utilizado hasta la fecha es el

basado en la Agrobacterium tumefaciens para transferir e integrar ADN propio - un

tramo concreto, denominado T-ADN - en la célula vegetal a la que infecta. Si

introducimos genes ajenos entre los bordes del T-ADN, la bacteria introducirá estos

genes en la célula vegetal y los integrará en un cromosoma de ésta. Una vez

integrados, los genes se expresarán y se transmitirán a la descendencia del mismo

modo que lo hacen los que componen el genoma original.

6. Hoekema et al., 1983 citado por López, M. et al; (2001) La bacteria

Agrobacterium tumefaciens contiene un plásmido inductor de tumores (Ti), parte del

cual –el ADN-T (transferred DNA) – se transfiere al núcleo de las células vegetales

heridas de plantas dicotiledóneas. Agrobacterium es usualmente utilizado para

producir plantas transgénicas que expresen genes de interés.

7. Chen et al. (2002) La expresión transitoria de βglucuronidasa (GUS) fue utilizada para

optimizar las condiciones biológicas mediadas por Agrobacterium tumefaciens para la

capa de células transversal delgada (tTCL) del fruto de platano (Musa spp.). Se

demostró que la generación de plántulas in vitro tuvieron una mayor regeneración de

brotes y una mayor expresión del gen GUS en la capa de células transversal delgada

(tTCL). Cefotaxima y carbenicilina mostraron poca sensibilidad, mientras que

higromicina fue bastante sensible l Platano (Musa spp). El pretratamiento de

Agrobacterium fue uno de los factores más importantes en la transformación genética

del banano, este incluía una concentración importante de sacarosa.

8. Blanco et al. (2003). Optimizaron la eficiencia en la transformación genética con

Agrobacterium rhizogenes, inoculando secciones de zanahoria con la cepa de A.

rhizongenes A4TC. Éstas fueron co-cultivadas con acetosiringona, floroglucinol y una

combinación de ambos. La mayor eficiencia de transformación se obtuvo con

acetosiringona (100 mM) en combinación con floroglucinol (25 mg l -1); la inclusión de

kanamicida resultó un mecanismo eficiente para discriminar entre raíces

transformadas y no transformadas. La bacteria fue eliminada completamente en 48

horas con Cefatoxime en dosis de 500 mg l-1.

9. Chavez et al. (2003). Regeneraron plantas transgénicas de Naranjo agrio (Citrus

aurntium L.) a partir de raíces transformadas con Agrobacterium rhizogenes. Para ello

cultivaron por 96 horas segmentos internodales de tallo de plantas germinadas in

vitro con A. rhizogenes cepa A4 con el plásmido ESC4. Para la regeneración de los

segmentos de las raíces transformadas éstas se transfirieron a medios MS con tres

combinaciones de reguladores de crecimiento: a) 2.5 mg/L de BA con 0.5 mg/L de

ANA; b) 5.0 mg/L de BA con 1.0 mg/L de ANA; c) 10 mg/L de BA con 2. 0 mg/L de ANA.

10. Díaz M. et al (2003) La ingeniería genética o transformación genética, técnica conocida

como del ADN recombinante, permite introducir en plantas genes provenientes no

sólo de otras especies vegetales muy alejadas desde el punto de vista evolutivo sino

incluso de hongos, virus, bacterias y animales.

11. Díaz et al. (2004). Realizaron un estudio a 4 especies fitopatógenas comprendidas

dentro del género Agrobacterium, centrándose en A. tumefaciens y A. rhizogenes.

Demostraron que ambas bacterias son capaces de infectar una amplia variedad de

especies de dicotiledóneas a partir de la infección de las heridas, atacando células

individuales y provocando su proliferación. Concluyendo que la capacidad patogénica

de estas bacterias se debe a la presencia de megaplásmidos (150-200 Kb) llamados Ti

(tumor inducing o inductor de tumores) o Ri (por root – inducing o inductor de raíces).

12. Valdez et al. (2004). Desarrollaron un método para la transformación genética de dos

variedades costarricenses de Maíz: CR-7 y Diamantes 8843, con el objetivo de permitir

una posterior transferencia de genes de origen viral a su genoma, y conferirles

además, resistencia a la enfermedad ocasionada por el virus del rayado fino del maíz.

Utilizaron el método de bombardeo de microproyectiles, en callos organogénicos

derivados de ápices jóvenes.

13. Bhatnagar et al. (2004) El precultivo de explantes sobre medio de regeneración

durante 5 días y co-cultivo durante 3 días se encontró óptimo. Con el ensayo

histoquímico GUS hasta un 40% hipocotilo, 50% cotiledón, 50% de la hoja y 54%

explantes de hoja de callos dieron positivo a Agrobacterium. Agrobacterium cepa

LBA4404 fue más infecciosa que GV2260 y A281 y entre los plásmidos ensayados,

pBI121 transformado con éxito el 100% de los explantes seguido por p35SGUSINT (90-

100%). Aproximadamente, 50% de los explantes sobrevivió a la selección.

14. Valderrama et al. (2005) Se describen los procesos por los cuales Agrobacterium

realiza la transferencia de ADN a la planta, puntualizando que son 7 eventos los

fundamentales para la interacción A. tumefaciens-planta: (i) reconocimiento y

adherencia; (ii) identificación de señales de la planta; (iii) activación de genes vir; (iv)

generación del ADN-T; (v) exportación del ADN-T hacia la planta; (vi) importación del

ADN-T dentro del núcleo de la planta; (vii) integración del ADN-T dentro del genoma

del hospedero.

15. Valderrama et al (2005) destacan el uso de A. tumefaciens en la expresión y

producción de interleukina-2 y la producción de vacunas en plantas, producción de

plantas utilizadas en procesos de y mejoramiento del contenido nutricional de algunos

alimentos.

16. Broothaerts et al. (2005). Idearon un nuevo método de transformación genética que

consistía en la utilización de otras especies bacterianas naturalmente simbióticas con

plantas (distintas del género Agrobacterium) como Sinorhizobium meliloti,

Mesorhizobium y Rhizobium sp. Logrando transformar genéticamente plantas de

tabaco, arroz y Arabidopsis.

17. Celikkol (2009) Transformaron explantes de Lens culinaris “lenteja” por la inoculación

con la de Agrobacterium tumefaciens utilizando la técnica de suspensión bacteriana en

que los explantes fueron sujetos a una presión de 200 mmHg por 20 min. Los retoños

de los transgénicos fueron transferidos a tierra con éxito y cultivados a la madurez en

el invernadero.

18. Hodson, E. (2006) el desarrollo de técnicas de manipulación genética constituye un

valioso apoyo a los sistemas de mejoramientos convencional, principalmente en

aquellas situaciones en las cuales el acceso a genes de interes se encuentra limitado.

19. Jia et al. (2006) Se demostró que la cepa de Agrobacterium tumefaciens denominada

LBA4404 fue más eficiente que C58Cl en la frecuencia de transformación de Morera

Morus spp.

20. Lopez & Chaparro (2006) Se ha demostrado que la transformación de papa (Solanum

tuberosum) mediada por Agrobacterium tumefaciens es dependiente del genotipo y

que la mayoría de protocolos de transformación reportados son ineficientes al

aplicarlos en la subespecie andigena. Se transformaron explantes internodales

mediante el vector pCambia2301 que posee un gen reportero de la E-glucoronidasa y

un gen de resistencia a la kanamicina. Se obtuvo un porcentaje de transformación

inicial de 31 ± 2,5%, que se expresó mediante formación de callo sobre medios de

selección y una frecuencia final con base en el ensayo GUS de 30%.

21. Betancourt B. (2007) desarrolló una metodología de transformación genética en

variedades comerciales de Saccharum spp. “caña de azúcar” usando Agrobacterium

tumefaciens. La transformación fue evaluada mediante la expresión transitoria del gen

GUS. Se demostró que la expresión fue significativamente superior al usar explantes

meristematicos con alta capacidad regenerativa.

22. Estrada et al. (2007). Reportaron un procedimiento rápido, reproductible y eficiente

de transformación de diversos cultivares comerciales silvestres y criollos de Phaseolus

vulgaris ``Frejol``, empleando la cepa K599 de Agrobacterium rhizogenes. En este

sistema produjeron plantas cuyas raíces son los únicos tejidos transformados, el resto

de la planta no expresa ningún transgene.

23. Valerio R. & de García E. (2008) utilizaron el método de balística para transformar

ápices caulinares in vitro de plantas de plátano con micropartículas de tungsteno

recubiertas con ADN de plásmido plásmido CAMBIA3201 portador de los genes GUS y

bar. La transformación de los ápices se logró a una distancia tejido-cañón de 9,5cm,

presión de He de 150psi y concentración de ADN de 2μg/disparo. Se obtuvo un total

de 22 plantas transformadas con los genes gus y bar, cuya presencia fue demostrada

por la prueba histoquímica de GUS, y su inserción al ADN mediante la amplificación

(PCR) de fragmentos con iniciadores específicos.

24. Garrido, et al. (2009). Transformaron genéticamente a Uncaria tomentosa “Uña de

gato” con la finalidad de obtener alcaloides monoterpénicos que poseen propiedades

citotóxicas, inmunomoduladoras y antileucémicas. Utilizaron como explantes hojas,

raíces y entrenudos de plántulas in vitro y eliminaron a la bacteria con claforan o

vancomicina. Por último, confirmaron la transformación por PCR.

25. Mannan et al. (2009). Evaluaron métodos para la transformación genética de

Artemisia absinthium ”Hierba Santa” mediada por Agrobacterium tumefaciens,

obteniendo un 100% de eficiencia al utilizar explantes de hojas y raíz, inoculando la

bacteria por 5 minutos e incubando por 3-4 días en un medio B5 con 0.5mg/L de 2, 4-D

y un pH 5.8.

26. Zenita et al. (2009). Emplearon distintos tejidos como explantes y distintas

concentraciones de Agrobacterium, logrando obtener expresión transitoria de Gus en

explantes cocultivados. Las condiciones óptimas fueron en el cocultivo por 48 horas en

medio MS, conteniendo una dilución 1:100 de un cultivo bacteriano de la cepa C58C1 a

0.6 OD a 550 nm. Por otro realizaron los experimentos pertinentes para identificar el

umbral de la expresión Gus basal en explantes no transformados de C. odorata

mediante ensayos de fluorometría empleando el sustrato X-Gluc. Mediante la

realización de este trabajo lograron obtener un nuevo método de transformación

genética mediada por Agrobacterium tumefaciens, y demuestraron la posibilidad de

modificar genéticamente al cedro rojo para evitar que plagas o herbicidas afecten su

desarrollo.

PROBLEMÁTICA

En los últimos años, Morus nigra “Mora negra” se ha visto como una alternativa a los cultivo

de Coca, por ser el alimento del gusano de seda y por ende una actividad rentable dentro del

marco legal. Sin embargo, Morus nigra, presenta un largo periodo vegetativo y es menos

apetecible por Bombix moris a comparación de Morus alba, además esta planta se ve

afectada por virus (Carlavirus, Tsuchizaki, 1976) y nematodos como Meloidogyne incognita.

Por estas razones es necesario el fitomejoramiento de los cultivos de Morus nigra “Mora

negra” a través de la introducción de genes mediada por Agrobacterium tumefasciens, con la

finalidad de acortar el periodo de su ciclo vegetativo y aumentar la resistencia a virus y

hacerla mas apetecible al gusano de seda.

HIPOTESIS

La transferencia de genes mediada por Agrobacterium tumefsciens producirá el mejoramiento

genético en plantas de Morus nigra.

OBJETIVOS

Objetivo general

Obtener plantas de Morus nigra mejoradas genéticamente por Agrobacterium

tumefaciens.

Objetivos específicos

Cultivar cepa de A. tumefaciens.

Inocular el cultivo bacteriano al explante e incubar

Eliminar el vector con bactericida (claforan) y Trasferenir los explantes a un medio sin

antibiótico.

Determinar la expresión genética de la transformación mediante la observación del

crecimiento celular.

MATERIALES Y EQUIPOS

1. Material biológico:

- Vitroplantas de Morus nigra

- Cepas de Agrobacterium tumefacien

2. Cámara de flujo laminar

3. Autoclave

4. Shaker horizontal u orbital

5. Incubadora

6. Macro y microelementos

7. Vitaminas, fitohormonas

8. Carbohidratos y agentes gelificantes

9. Material de vidrio.

10. Antibiótico (clarofán)

11. Componentes del medio de cultivo para A. tumefaciens.

METODOLOGIA

Cultivo de cepas de Agrobacterium tumefaciens

Se cultivará Agrobacterium tumefaciens en el medio LB líquido durante 12 horas a

temperatura ambiente, esperando que etapa de crecimiento exponencial suceda.

Inoculación e incubación de Agrobacterium tumefaciens.

Las plántulas in vitro y las cepas de Agrobacterium tumefaciens se llevan a la cámara de flujo

laminar. Se abrirá y flameará el frasco que contiene la plántula, y con ayuda de una pinza se

remueve la plántula. Esta es colocada en una placa Petri previamente esterilizada. Se

realizaran cortes en sos entrenudos de las plántulas con un bisturí esterilizado y se

introducirán a un Erlennmeyer con medio de cultivo líquido. Una vez sembrado se sellará con

papel platino evitando la contaminación con otras bacterias del aire. Finalmente se incubará

en un shaker a 125 rpm entre 24 y 72 horas a 22ºC – 25ºC.

Eliminación del vector en los explantes con bactericida (claforan) y Trasferencia a medio de

cultivo sin antibiótico.

Pasado el tiempo de incubación, se transferirán los explantes a un envase con medio de cultivo

con antibiótico (Claforan) y se dejará en incubará en un shaker a 125 rpm a 22ºC – 25ºC

durante 24 horas. Este procedimiento se repetira 3 a 6 veces hasta eliminar totalmente la

bacteria.

Los explantes obtenidos se transferirán a un medio de cultivo sin antibióticos.

Determinar la expresión genética de la transformación mediante la observación del

crecimiento celular.

Transcurridas 2 o 3 semanas se observará el desarrollo de organos transgénicos en la planta

tratada.

CRONOGRAMA

DURACIÓN

DEL PROYECTO

ACTIVIDADES

Semana

1

Semana

2

Semana

3

Recopilación de Información X X X

Adquirir Material biológico A.

tumefaciensX X

Preparación del vector A.

tumefaciensX X

Realizar el co-cultivo de Morus

nigra y A. tumefaciensX X

Eliminar las bacterias del medio de

cultivo.X

Determinar la expresión genética

de la transformaciónX

Redacción del informe final de la

investigación y Sustentación de la

Investigación

X

V. PRESUPUESTO:

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

MATERIALES PRESUPUESTO

Alcohol etílico al 96% (3L) S/.16.00

Algodón (500gr) S/.12.00

Azúcar S/. 2.50

Papel platino (16m) S/.12.00

Mascarillas S/. 3.00

Detergente S/. 3.50

Lejía (500ml) S/. 3.50

TOTAL S/. 50.50

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