Tolerancia a estreses abióticos

-

Tolerancia a estreses abióticos

Ruth Heinz

Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Universidad de Buenos Aires

Agrobiotecnología

2016

Solutos compatibles

Bomba de Na+/H+

Sobrexpresión de citoquininas

Factores de transcripción

Proteínas LEA

Citrato sintetasa

Estreses abióticos

Referencias

Problemas y pérdidas producidas por estreses abióticos

Respuestas a estreses abióticos

Solutos compatibles

Estrategias para aislar genes de tolerancia

a estreses abióticos en plantas

Sumario

Uso de genómica funcional para la búsqueda

de genes de tolerancia a estreses abióticos

Búsqueda de genes regulados por factores de

transcripción inducibles por estreses abióticos

Ejemplos de tolerancia frente a diferentes

estreses abióticos: Agrobiotecnología

Tolerancia

a estreses abióticos

Estreses

abióticos • Las plantas son frecuentemente sometidas

a estreses, condiciones externas que

adversamente afectan su crecimiento,

desarrollo o productividad.

• Los estreses pueden ser bióticos, provocados

por otros organismos, o abióticos, causados

por condiciones desfavorables en el ambiente

físico o químico.

• Los estreses disparan un amplio rango

de respuestas en la planta, desde alteraciones

en la expresión genética y el metabolismo

celular, a cambios en la tasa de crecimiento

y rendimientos de los cultivos.

• La tolerancia o sensibilidad a los estreses

depende de las especies, del genotipo y

del estadío de desarrollo de la planta.

Agrobiotecnología

Tolerancia


La mayoría de estos factores ambientales induce estrés osmótico

Diferentes factores ambientales

que resultan en estreses abióticos

Tomado de: Holmberg and Bülow, Trends in Plant Science, 1998.

• Se espera que la población mundial duplique su número para el año 2050. • En ese momento, la población mundial alcanzará los 11.000 millones de personas, de las cuales el 90% residirá en países en desarrollo. • La producción de alimento deberá duplicarse o triplicarse para entonces. • En Latinoamérica sólo el 7% del total de

tierra es cultivable. Los esfuerzos por satisfacer las demandas de una población en aumento han conducido al cultivo de suelos

de pastoreo y, en algunos casos, de tierras forestales, así como también de tierras marginales (suelos salinos, ácidos, etc.).

Demandas

y restricciones

futuras de la

agricultura

Agrobiotecnología

Tolerancia


Problemas y pérdidas producidas

por estreses abióticos

Agrobiotecnología

Tolerancia


Muchas tierras

cultivables se

pierden debido

al exceso de uso

o al mal manejo

de los suelos

La producción

alimentaria en aumento

es el principal factor de

presión ejercido sobre

los recursos de la tierra.

Esto acentúa

la degradación de los

suelos y conduce a

fenómenos de

desertificación y pérdida

de los mismos.

Más de 3.500 millones de

ha (25% de la superficie

total) están afectadas por

la desertificación a nivel

mundial. En Sudamérica,

la desertificación afecta

unos 250 millones de ha.

Las principales causas

de desertificación son la

salinidad y la sequía.

El acceso a la

alimentación de más de

900 millones de personas

corre peligro debido a

que las tierras de las que

dependen están

amenazadas por este

problema.

Agrobiotecnología

Tolerancia


Las aplicaciones

biotecnológicas

contribuirán a

la recuperación

de suelos

inapropiados

para el cultivo

Para aumentar la

producción agrícola

y preservar los suelos

se requiere

implementar políticas

sociales y económicas

de largo plazo,

introducir nuevas

formas de manejo

agronómico

e incrementar la

investigación científica

y tecnológica.

Las aplicaciones

biotecnológicas, en

particular el uso de

cultivos transgénicos,

prometen incrementar

la producción agrícola

disminuyendo los

costos de producción.

El uso de plantas

tolerantes a estreses

abióticos podría

permitir el uso y la

recuperación de tierras

afectadas por salinidad,

acidez, sequía, etc.

Agrobiotecnología

Tolerancia


Rendimiento

máximo

Rendimiento

promedio

Pérdidas promedio

(Kg/Ha)

Pérdidas

abióticas

Cultivo (Kg/Ha) (Kg/Ha) Bióticasa Abióticasb (% rend. max.)

Maíz 19.300 4.600 1.952 12.700 65,8

Trigo 14.500 1.880 726 11.900 82,1

Soja 7.390 1.610 666 5.120 69,3

Sorgo 20.100 2.830 1.051 16.200 80,6

Avena 10.600 1.720 924 7.960 75,1

Cebada 11.400 2.050 765 8.590 75,4

Papa 94.100 28.300 17.775 50.900 54,1

Remolacha 121.000 42.600 17.100 61.300 50,7

a Los estreses bióticos incluyen enfermedades, insectos y malezas.

b Los factores abióticos ambientales incluyen, pero no se limitan a, sequía, salinidad, inundación, y

altas y bajas temperaturas.

Rendimientos y pérdidas promedio de los principales cultivos

Adaptado de: Buchanan, Gruissem and Jones. Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000.

La incidencia de los factores ambientales sobre

los rendimientos es mayor en las zonas tropicales

a Las zonas subtropicales y templadas se consideran templadas. Las zonas entre 23,5º latitud Norte y 23,5º latitud Sur se consideran

tropicales. b Asia está representada por Filipinas, Thailandia e India. Centro América está representada por México y Colombia.

Tomado de: Chispeels y Sadava, Plants, Genes and Crop Biotechnology, 2003..

12,9 (Zimbabwe) 1,4 22,2 (USA) 4,0 Ma í z

7,4 (Asia) b 2,0 10,5 (Jap ó n) 4,1 Arroz

100 15,7 100 20,8 % rendimiento r é cord

4,8 (Zimbabwe) 1,0 7,3 (Jap ó n) 1,6 Soja

9,6 (Zimbabwe) 1,0 8,6 (USA 1,7

10,3 (Asia) 1,2 20,1 (USA) 2,3 Sorgo

10,3 (Asia,

Zimbabwe,

Am é rica Central)

1,4 14,1 (USA) 3,0 Trigo

--- 6,9 65,0 (USA) 13,6 Batata

60,0 (Am é rica

Central) b

8,7 126.0 (USA) 18,1 Papa

R é cord Promedio R é cord Promedio Cultivo

Rendimiento clima tropical ( Tm /ha) Rendimiento clima templado ( Tm /ha) a

12,9 (Zimbabwe) 1,4 22,2 (USA) 4,0 Ma í z

7,4 (Asia) b 2,0 10,5 (Jap ó n) 4,1 Arroz

100 100 20,8 r é

4,8 (Zimbabwe) 1,0 7,3 (Jap 1,6 Soja

9,6 (Zimbabwe) 1,0 8,6 (USA 1,7

10,3 (Asia) 1,2 20,1 (USA) 2,3 Sorgo

10,3 (Asia,

Zimbabwe,

Am é rica Central)

1,4 14,1 (USA) 3,0 Trigo

--- 6,9 65,0 (USA) 13,6 Batata

60,0 (Am é rica

Central) b

8,7 126.0 (USA) 18,1 Papa

R é cord Promedio R é cord Promedio Cultivo

Rendimiento clima tropical ( Tm /ha) Rendimiento clima templado ( Tm /ha) a

La creciente

demanda de

agua es uno de

los problemas

más acuciantes

que enfrentará

la agricultura

intensiva

Agrobiotecnología

Tolerancia


Uso

de a

gu

a (

Km

cu

bic

os)

Agricultura Industria Uso doméstico

El uso de agua en la agricultura se ha incrementado

siguiendo una función lineal en los últimos 70 años

Agrobiotecnología

Tolerancia


Aproximadamente

60 millones de

hectáreas están

sometidos a

procesos erosivos

en la Argentina

Cada año se suman

unas 650.000

hectáreas a los

procesos de erosión

Unos 9,5 millones de

personas están

localizadas en tierras

áridas o semiáridas

El desarrollo de

las tierras áridas

y semiáridas es

un problema

geo-económico

importante de

la Argentina

Respuestas a estreses abióticos

Agrobiotecnología

Tolerancia


- Estrés letal que puede conducir a

la muerte de la planta debido al

incremento de los procesos de

senescencia.

- Estrés sub-letal o estrés letal precedido

por un estrés sub-letal durante el

cual pueden producirse cambios

adaptativos que permiten la

supervivencia de la planta (tolerancia).

• En un ambiente desfavorable,

una planta podría enfrentar

las siguientes situaciones:

• Estas adaptaciones pueden

ocurrir a nivel molecular,

(expresión génica y síntesis

. proteica) o a nivel bioquímico

. (síntesis de nuevos metabolítos),

. lo que conduce a respuestas

. celulares y fisiológicas alteradas.

Respuesta de las plantas a niveles letales

o sub-letales de estrés

Tomado de: Grover et al., Current Science, 2001.

• A nivel de toda la planta:

- Reducciones en la germinación de las semillas

- Reducciones en el establecimiento de las plántulas

- Pobre vigor de los brotes

- Decrecimiento en la extensión de las raíces

- Enrollamiento y senescencia de las hojas

. - Disminución de la tasa fotosintética

. - Reducción en la viabilidad del polen

- Reducción y llenado incompleto de los granos

• A nivel celular o subcelular:

- Niveles incrementados de diferentes osmolitos (sequía y salinidad)

- Represión general de la biosíntesis de proteínas (sequía y salinidad)

- Cambios selectivos en los niveles de K+/Na+ (sequía y salinidad)

- Incremento en la insaturación de los lípidos de membrana

. (descenso de temperatura)

- Regulación positiva de la glucólisis y enzimas requeridas

para la fermentación alcohólica (anaerobiosis; innundaciones)

Respuesta de las plantas a niveles letales

o sub-letales de estrés

Las plantas responden al estrés tanto a nivel celular como del conjunto de los tejidos. Los estreses constituyen

señales ambientales que son percibidas y reconocidas por las plantas. Las señales son transducidas en las

células y transmitidas a través de la planta. Típicamente, la transducción de señales a nivel celular resulta en la

alteración de la expresión genética, lo que a su vez influye sobre el metabolismo y el desarrollo de la planta.

Respuestas a estreses ambientales


ácido jasmónico, ,

ácido abscísico ,

etileno , Ca 2+

Las rutas de señalización del estrés hídrico y salino son inducidas por exceso de Na+ o

por cambios osmóticos. Las rutas de señalización iónica y osmótica derivan en la

restauración de la homeostasis a nivel celular y de la planta.

Demarcación funcional de las rutas de señalización de

estreses inducidos por salinidad y sequía

Adaptado de: Zhu, Annual Review in Plant Biology, 2002.

Rutas de

transducción

de señales

involucradas

en las

respuestas a

estreses

abióticos

Agrobiotecnología

Tolerancia


MPK, MPKK, MPKKK, : MAP quinasa, MAPK quinasa y MAPKK quinasa, respectivamente; CaM: Calmodulina; CDPK: proteína

quinasa dependiente de calcio; SOS3, SOS2: proteína quinasas (Salt overly sensitive); LEA: proteínas abundantes en la

embriogénesis tardía; Hsfs: factores de choque térmico; GPCR: receptor acoplado a proteína G; RLKs: quinasas de tipo receptor

Señal

de estrés

Sensores:histidina kinasa,

canales ionicos,

Hsfs, GPCR, RLKs

Ca2+ Ca2+MAPKKK

MAPKK

MAPKK

CaM, CaN,

CDPKSOS3

SOS2Fosforilación

de proteínas

Factores de

transcripción

antioxidantes,

osmolitos

Protección de

macromoléculas,

reparación de daños,

homeostasis osmótica

Transportadores

iónicos

proteínas

de tipo LEA

homeostasis

ionica

Protección celular,



membrana

plasmáticare

ce

pc

ión

tran

sd

ucc

ión

de

señ

ale

s

Efe

cto

res

/

niv

ele

s d

e a

cc

ión

Señal

de estrés

Sensores:histidina kinasa,

canales ionicos,

Hsfs, GPCR, RLKs

Ca2+ Ca2+MAPKKK

MAPKK

MAPKK

CaM, CaN,

CDPKSOS3

SOS2Fosforilación

de proteínas

Factores de

transcripción

antioxidantes,

osmolitos

Protección de

macromoléculas,



Transportadores

iónicos

proteínas

de tipo LEA

homeostasis

ionica

Protección celular,



membrana

plasmáticare

ce

pc

ión

tran

sd

ucc

ión

de

señ

ale

s

Efe

cto

res

/

niv

ele

s d

e a

cc

ión

CaM, CDPK

estrés biótico

y heridas

sequía y alta salinidad

calor frío

AJ ABA

MYB MYCAREB/ABF

(bZIP)NAC HDZF DREB1D/CBF4

(AP2/ERF)

DREB2

(AP2/ERF)DREB1/CBF

(AP2/ERF)

MYBR MYCR ABRE NACR HDZR DRE/CRT

Expresión de genes inducibles por estrés

Tolerancia a estrés

Los factores de transcripción que controlan respuestas inducibles por estrés están representados por elipses. Los elementos que actúan en cis

controlando la trascripción inducida por el estrés están representados como cajas. Los círculos pequeños sobre los factores de transcripción

representan modificaciones (tales como fosforilaciones) inducidas por el estrés que resultan en su activación.

Adaptado de: Nakashima y Yamaguchi-Shinozaki, Abiotic stress adaptation in plants, 2010.

Control transcripcional de las respuestas a estrés

Análisis proteómico

órgano especifico para

respuesta a estreses

abióticos

Setsuko Komatsu and Zahed Hossain

Frontiers in Plant Science, 2013, 4, 71

El esquema incluye tres espacios que están definidos por la membrana plasmática y

el tonoplasto. Se muestran los efectos de la acción de proteínas relacionadas con la

tolerancia al déficit de H2O. El esquema se focaliza en los eventos bioquímicos y no

incluye eventos de señalización o rutas que conducen a alterar la expresión génica.

Funciones

bioquímicas

asociadas con

la tolerancia al

estrés hídrico

Adaptada de: Bohnert and Jensen, Trends in Biotechnology, 1996.

Agrobiotecnología

Tolerancia


Las respuestas de tolerancia a estrés hídrico se basan en:

Aumentar la actividad de bombas Na2+/H+

. en las membranas plasmáticas de células de raíz

. y en los tonoplastos del mesófilo y de otros tejidos

. (exportación y compartimentación de sodio)

Controlar la expresión, actividad y propiedades de .

. los sistemas de transporte de potasio y la actividad

. de las acuoporinas

Controlar el flujo de agua y el nivel de turgencia . .

incrementando la producción de solutos compatibles .

. (ajuste osmótico)

Proteger las enzimas, complejos proteicos y estructuras

. de membrana incrementando la capacidad de detoxificación

. de radicales hidroxilos y la producción de osmoprotectores.

Respuestas de tolerancia al estrés hídrico

Solutos compatibles

Agrobiotecnología

Tolerancia


W : potencial de H2O W = S + P

S : potencial de soluto P : potencial de presión

Adaptado de: Buchanan, Gruissem and Jones, Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000.

Parámetros

que

determinan

el ajuste

osmótico

con ajuste

osmótico

sin ajuste

osmótico

p = + 0,5 Mpa

s = – 2,0 MPa

w = – 1,5 MPa

p = 0 MPa

s = – 1,2 MPa

w = – 1,2 MPa

Déficit de H2O

Suelo

w = – 1,2 MPaAgrobiotecnología

Tolerancia


turgencia tensión

El movimiento de

agua hacia dentro

o fuera de la

célula depende

del gradiente de

potencial de agua

(w) a través de

la membrana

plasmática


Agrobiotecnología p = 0 MPa

s = – 2,0 MPa

w = – 2,0 MPa

Valores

intracelulares

w externo < w internoH2O

Membrana plasmática

w externo = – 2,5 MPa

Valores

intracelulares

p = + 0,5 MPa

s = – 1,6 MPa

w = – 1,1 MPa

Membrana

plasmática

Pared celular

H2Ow externo > w interno

w externo = 0 MPa

VacuolaRodeada por la membranadel tonoplasto

Célula plasmolizada:

Los iones de sodio y cloruro, que pueden interrumpir el

metabolismo en el citoplasma, se concentran en la vacuola.

Por el contrario, la concentración de glicina-betaína es alta

en los cloroplastos y el citoplasma, pero baja en la vacuola.

Ajuste osmótico

en una célula

del mesófilo

en una hoja

de espinaca

sometida

a exceso de sal


Agrobiotecnología

Tolerancia


a No todos los compuestos que se acumulan se encuentran en todas las especies; las rutas bioquímicas son

específicas para órdenes y familias de plantas. b Las LEAs (late-embryogenesis abundant proteins) y las dehidrinas, así como las proteínas relacionadas con la

patogénesis, son ejemplos del reclutamiento de proteínas con “otra función” en las respuestas de estrés abiótico.

Funciones sugeridas de compuestos que se producen en

las plantas como respuesta al estrés hídrico

Adaptado de: Bohnert and Jensen, Trends in Biotechnology, 1996.

Balance iónico, protección de la cromatinaEspermina, espermidinaPoliaminas

Carotenoides, antocianinas,

betalaínas

Glicina betaína

-alanina betaína

Dimetilsulfonio propionato

Acíclicos (ej., manitol)

Cíclicos (ej., pinitol)

Sacarosa

Fructanos

Prolina

Ectoína

LEA/dehidrinasb

Osmotinab

SOD/catalasa

Potasio

Componente específico

Protección contra la fotoinhibiciónPigmentos y

carotenoides

Osmoprotector

Osmoprotector

Osmoprotector

Aminas cuaternarias

Reserva de carbono, ajuste osmótico

Osmoprotector, ajuste osmótico

Polioles

Ajuste osmótico

Osmoprotector, reserva de carbono

Azúcares

Ajuste osmótico

Osmoprotector

Aminoácidos

Osmoprotección

Proteínas relacionadas con patogénesis

Detoxificación de radicales

Proteínas

Ajuste osmótico, requisitos de

macronutrientes,

exclusión / exportación de sodio

Iones

Funciones sugeridasGrupo de productosa

Balance iónico, protección de la cromatinaEspermina, espermidinaPoliaminas

Carotenoides, antocianinas,

betalaínas

Glicina betaína

-alanina betaína

Dimetilsulfonio propionato

Acíclicos (ej., manitol)

Cíclicos (ej., pinitol)

Sacarosa

Fructanos

Prolina

Ectoína

LEA/dehidrinasb

Osmotinab

SOD/catalasa

Potasio

Componente específico

Protección contra la fotoinhibiciónPigmentos y

carotenoides

Osmoprotector

Osmoprotector

Osmoprotector

Aminas cuaternarias

Reserva de carbono, ajuste osmótico

Osmoprotector, ajuste osmótico

Polioles

Ajuste osmótico

Osmoprotector, reserva de carbono

Azúcares

Ajuste osmótico

Osmoprotector

Aminoácidos

Osmoprotección

Proteínas relacionadas con patogénesis

Detoxificación de radicales

Proteínas

Ajuste osmótico, requisitos de

macronutrientes,

exclusión / exportación de sodio

Iones

Funciones sugeridasGrupo de productosa

Amidinas

Estructuras químicas de solutos celulares compatibles

+ +

NH3(CH2)3NH (CH2)4NH (CH2)3NH3

Espermina

Compuestos con amonios cuaternarios


--

-

-

-

Colina-O-sulfato

+ +


Espermina



--

-

-

+ +


Espermina



--

-

-

-

Colina-O-sulfato

Proteína desnaturalizada:

pocas moléculas de H2O unidas

a la proteína; alta entropía

Proteína intacta: moléculas de H2O

rodeando a la proteína en forma

altamente ordenada; baja entropía

La capa de hidratación

de las macromoléculas

no es perturbada por los

solutos compatibles.

Los solutos

compatibles

preservan

la capa

de hidratación

de las

macromoléculas


Agrobiotecnología

Tolerancia


Estrategias para aislar genes

de tolerancia a estreses abióticos

Agrobiotecnología

Tolerancia


ABF: ABRE binding factor;

AtHK1: histidin quinasa 1

de Arabidopsis thaliana;

bZIP: basic leucine zipper

transcription factor;

CBF/DREB: C-repeat-

binding

factor/dehidratation-

responsive binding protein;

CDPK: protein quinasa

dependiente de Ca2+;

COR: cold-responsive

protein;

Hsp: Heat-shock protein;

LEA: late embryogenesis

abundant;

MAP: mitogen-activated

protein;

MYC/MYB: familias de

actores de transcripción

PLD: fosfolipasa;

Ptd-OH: ácido fosfatídico;

PX: peroxidasa;

ROS: especies reactivas

de oxígeno;

SOS: salt overly sensitive

SOD:

superoxidodismutasa;

SP1: stable protein 1

Las

respuestas

al estrés

abiótico

involucran

mecanismos

complejos

Agrobiotecnología

Tolerancia


Adaptado de: Vinocur and

Altman, Current Opinion in

Biotechnology, 2005. sequía

frio

salinidad

polución

química calor

estreses primarios estreses secundarios

estrés osmótico

estrés oxidativo

Disrrupción de la

homeostásis osmótica

e iónica ; daños a

proteínas funcionales

y estructurales y a

membranas celulares

Sensado , percepción

y transducción

de señales

Control transcripcional

Mecanismos de

respuesta al estrés

Osmosensores ( ej ., AtHK1),

enzimas que clivan fosfolípidos ( ej ., PDL),

segundos mensajeros ( ej ., Ca 2+ , PtdOH , ROS),

MAP quinasas , sensores de Ca 2+ ( ej ., SOS3),

quinasas dependientes de Ca 2+ ( ej ., CDPKs )


( ej ., CBF/DREB, ABF, HSF, bZIP , MYC/MYB

Activación génica

Detoxificación (SOD, PX)

Chaperonas ( Hsp , SP1, LEA, COR)

Osmoprotección ( prolina , glicina- betaína ,

polioles azúcares)

Movimiento de agua e iones

( acuoporinas ,

transportadores de iones)

Restablecimiento de la homeostásis celular,

protección funcional y estructural de proteínas

y membranas celulares

Tolerancia al estrés

Genes y proteínas asociadas a estreses

Tolerancia adquirida a estrés

Mejoramiento

vegetal y

marcadores

moleculares

(ej., QTLs)

Transformación

genética

Metabolitos asociados a estreses

Hsps,

chaperonas

y proteínas

LEA

Componentes

de rutas de

señalización,

factores de

transcripción

Transporte

de agua e

iones

Osmolitos,

osmo-

protectores

Poliaminas Metabolismo

de carbono

Otros

mecanismos

de respuesta

a estrés

(ej., apoptosis)

Detoxificación

y scaveging

de ROS

Estrategias para desarrollar plantas tolerantes al estrés

mediante ingeniería genética

Adaptado de: Vinocur and Altman, Current Opinion in Biotechnology, 2005.

La tolerancia adquirida al estrés puede ser incrementada modificando la expresión de genes y proteínas

o por la sobrexpresión de metabolitos asociados al estrés. La tolerancia es un carácter que depende de

la actividad concertada de muchos genes, proteínas y rutas metabólicas. La tolerancia a los estreses

abióticos puede desarrollarse por ingeniería genética o mejoramiento asistido con marcadores

moleculares y quantitative trait loci (QTLs).

Hsp: heat shock protein

LEA: late embryogenesis

abundant

ROS: reactive oxygen

species

Estrategias

para desarrollar

plantas

tolerantes al

estrés mediante

ingeniería

genética

Adaptado de: Holmberg and Bülow, Trends in Plant Science, 1998.

Buscar organismos que vivan

bajo condiciones medioambientales

extremas de estrés

Estudiar los organismos bajo

condiciones estresantes

y no estresantes

Aislar y clonar aquellos genes

que confieren la tolerancia al estrés

Caracterizar el producto génico

en un sistema modelo procariota

Introducir el gen en un sistema

vegetal y estudiarlo bajo estrés

Introducir el gen en un cultivo

y proceder con ensayos de campo

Buscar organismos que vivan

bajo condiciones medioambientales

extremas de estrés

Estudiar los organismos bajo

condiciones estresantes

y no estresantes

Aislar y clonar aquellos genes

que confieren la tolerancia al estrés

Caracterizar el producto génico

en un sistema modelo procariota

Introducir el gen en un sistema

vegetal y estudiarlo bajo estrés

Introducir el gen en un cultivo

y proceder con ensayos de campo

Agrobiotecnología

Tolerancia


Craterostigma plantagineum es una planta poiquilohídrica

modelo para el estudio de tolerancia a la deshidratación

Los dos azúcares más prominentes hallados

en C. plantagineum son 2-octulosa y

estaquiosa. 2-octulosa predomina en las

hojas y es convertido en sacarosa durante la

deshidratación. Estaquiosa predomina en las

raíces, tanto en condiciones normales como

bajo deshidratación

Arriba: C. plantagineum (“Planta de la Resurrección”).

Abajo: efecto de la deshidratación. Planta totalmente

túrgida (izquierda); planta deshidratada (centro);

planta hidratada por 12 h (derecha). , , 2001. Tomado de: Bartels and Salamini Plant Physiology

Bromus pictus es una gramínea patagónica resistente a frio y sequia con alto contenido de fructanos

Florencia Del Viso (tesis doctoral 2010)

0-2 cm 2-4 cm 4-6 cm Lamina Tip Lamina 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2

RNA

2,4 Kb.-

0-2 2-4 4-6 Lamina tip Lamina

Northern Blot FRUCTOSIDOS TOTALES

0

10

20

30

40

50

60

70

0-2 cm 2-4 cm 4-6 cm Lamina Tip Lamina

nm

ole

s F

ruc

tós

ido

s/ m

g P

F

Exón 1 Exón 3 Exón 4 Intrón 1 Intrón 2 Intrón 3

300 140 9 454 850 700 655 227 (pb)

Miniexón TAA 3´ ATG ?

Bp 6-SFT

5´ ?

1. Aislamiento y caracterización de ADNc y secuencias genómicas completas.

2. Expresión en sistemas heterólogos (Piccia pastoris)

3. Transformación y evaluación de modelos de plantas.

4-Transformación decultivos de importancia agronómica para incrementar la

resistencia al estrés provocado por el frío y la sequía.

Thellungiella halophila es una planta halófila modelo

para el estudio de la tolerancia a salinidad

Thellingiella halophila es una pequeña halófila altamente tolerante

al estrés salino. Tiene un ciclo de vida corto y comparte muchas

similitudes biológicas y moleculares con Arabidopsis thaliana.

La fotografía muestra plantas de T. halophila y A. thaliana cultivadas

durante 7 días en medio saturado con 0, 200 y 600 mM de NaCl.

Tomado de: Vinocur and Altman, Current Opinion in Biotechnology, 2005.

Thellungiella halophila es una planta halófila modelo

para el estudio de la tolerancia a salinidad

Tomado de: Seki et al., The Plant Cell, 2001.

Análisis de la expresión genética frente a estrés inducido por frío utilizando

microarreglos de 1.300 genes de Arabidopsis. Los genes señalados en la imagen

corresponden a controles positivos (rd29A), negativos (nAChRE) y a controles internos

no inducibles (α-tubulina). Se utilizaron sondas realizadas con ADNc de plantas

estresadas y no estresadas con frío. La coloración roja indica inducción génica; la

coloración verde, inhibición. Lo puntos en amarillo indican que no hay cambios en la

expresión génica.

rd29A nAChRE a-tubulin

Uso de genómica funcional para la búsqueda

de genes de tolerancia a estreses abióticos

Clasificación de genes inducibles o reprimibles por frío, sequía y salinidad mediante análisis con

microordenamientos. Los números entre paréntesis (panel izquierdo) indican genes cuya inducción

es mayor de cinco veces para el estrés en cuestión y menor de tres veces para los restantes.

Identificación de genes inducibles por estrés abiótico

Tomado de: Seki et al., The Plant Journal, 2002.

Análisis por Northern blot para tres genes altamente inducibles por salinidad

(RAFL08-19-G15), sequía (RAFL08-08-O14) y frío (RAFL04-12-P22). Se muestra

la expresión de un gen constitutivo (RAFL05-14-L02) como control interno.

Identificación de genes de Arabidopsis thaliana inducidos

por estreses de frío, sequía y salinidad

Tomado de: Seki et al., The Plant Journal, 2002.

Estrategia para

identificar genes

inducidos por

frío y sequía

que son blanco

del factor de

transcripción

DREB1A

(Dehydration

Responsive

Element Binding

Protein)


Identificación

de genes

regulados por

factores de

transcripción

inducibles

por estreses

abióticos

a

a

Agrobiotecnología

Tolerancia


Los genes inducibles por frío y sequía fueron clasificados en dos grupos: los

que son blancos de la acción de DREB1A y los que no son inducibles por este gen.

Identificación de genes inducibles por estrés abiótico


Genes que son blanco de DREB1A: 12rd29A, cor15a, kin1, kin2, rd17, erd10, FL3-

5a3, FL5-77, FL5-2122, erd4, FL5-94, FL3-27

FL6-55, FL5-2D23,

FL2-56, FL5-3J4,

rd20

Genes

específicos

inducidos por

sequía: 5

Genes inducibles por

Sequía y frío: 16

Genes que no son blanco

de DREB1A: 4FL5-3M24, FL5-3A15,

FL5-2O24, FL5-1A9

Genes inducibles

por frío: 2

FL5-90, DREB1A

Tratamientos estrés abiótico evaluados en hoja

Salinidad

Frío

Plantas crecidas en invernáculo y en estadio de segunda hoja

expandida fueron regadas con solución 150 mM de NaCl durante 3

días (adaptado de Liu y Bard, 2003)

Plantas crecidas en invernáculo y en estadio de segunda hoja

expandida fueron tratadas en cámaras a 10 grados durante 24

horas (Huang y col. 2005).

Estudios de expresión de genes candidatos

frente a estreses abióticos

4 plantas/maceta

Control Plantas crecidas en invernáculo y en estadio de segunda hoja

expandida continuaron su crecimiento en invernáculo mientras las

otras recibían los tratamientos correspondientes.

Fernández et al 2008, BMC 8:11

Estudios de expresión de genes candidatos

frente a estreses abióticos

Análisis de expresión a gran escala mediante el uso de micromatrices de ADNc

a partir del banco local de ESTs

OBTENCIÓN DE ADNc

Y AMPLIFICACIÓN

IMPRESIÓN

ESCANEO Y PROCESAMIENTO DE LAS IMÁGENES

OBTENCIÓN DE MATRIZ DE EXPRESIÓN GÉNICA

HIBRIDACIÓN

GENERACIÓN DE SONDAS

Gentron Suc. Argentina

Microarreglo para deteccion de genes candidatos para respuesta a frío y salinidad

80 genes diferenciales para

frío/sal 48 up/down en ambos estreses 17 inducidos estrés específicos 12down estrés especificso 3 patrones opuestos

Ctr

l2

Ctr

l1

Frio

1

Frio

3

Frio

2

Sa

l3

Sal2

Sal1

F401 H110 T289 EF432 F550 H124 F543 H354 H125 H123 F549 F443 H387 H302 T221 F231 T234 H385 F175 H111 F209 H136

H304 H209 F230 F137 EF502 T340 H322 T253 EF624 F216 H411 F210 F171 T107 T111 F192 T322 T187 T464 H329 EF127 F489 F202 T120 H368 F577 T124 T307 F494 T368 F561 F482 F572 F554 EF264 F455 T243 F305 F340 T283 F593 T129 F491 T411 F496 F557 H406 F379 F514 F426 H360 F176 T479 F295 T155 F373 F319 F467

Cluster jerárgico

Fernández et al 2008, BMC 8:11

Secuenciación de alto rendimiento

Roche / 545 FLX (2004) o Titanium 2009

Illumina Solexa Genome analyzer (2006)

Applied Biosystems SOLIDTM System (2007)

Pacific Biosciences SMRT (2010)

Ion Torrent (2010)

Desarrollo de

plataformas

automatizadas para

secuenciación

masiva

?21-28 Mb/h25 Mb/h13 Mb/h0,03-0,07 Mb/hProducción de

secuencia

1-10 kpb75 pb100 pb300-400 pb700-900 pbLongitud de

lectura

Ninguna

(molécula

única)

PCR en

emulsión

¨Bridge¨ PCRPCR en

emulsión

Amplificación

in vivo

vía clonado

de ADN

Método de

amplificación

del templado

Secuenciación

por síntesis

Secuenciación

por ligación

Secuenciación

por síntesis

con

terminadores

reversibles

Piro-

secuenciación

sobre soporte

sólido

Secuenciación

automática

por el método

de Sanger

Química de

secuenciación

Pacific

Biosciences

ABI SOLIDIllumina

Genome

Analyzer

Roche 454

Titanium

ABI 3730xl

Genome

Analyzer

Plataforma de

secuenciación

?21-28 Mb/h25 Mb/h13 Mb/h0,03-0,07 Mb/hProducción de

secuencia

1-10 kpb75 pb100 pb300-400 pb700-900 pbLongitud de

lectura

Ninguna

(molécula

única)

PCR en

emulsión

¨Bridge¨ PCRPCR en

emulsión

Amplificación

in vivo

vía clonado

de ADN

Método de

amplificación

del templado

Secuenciación

por síntesis

Secuenciación

por ligación

Secuenciación

por síntesis

con

terminadores

reversibles

Piro-

secuenciación

sobre soporte

sólido

Secuenciación

automática

por el método

de Sanger

Química de

secuenciación

Pacific

Biosciences

ABI SOLIDIllumina

Genome

Analyzer

Roche 454

Titanium

ABI 3730xl

Genome

Analyzer

Plataforma de

secuenciación

Secuenciación de alto rendimiento

• Pronunciado descenso en el costo de secuenciación por base secuenciada

• Datos cualitativos (secuencia) y cuantitativos (abundancia de la secuencia)

• Posibilidad de incluir muchas situaciones por corrida

Identificación

de genes

inducibles

por estreses

abióticos

mediante

enfoques

transcriptómicos

Agrobiotecnología

Tolerancia


Planta no estresada

(estado de referencia)Planta estresada

(estado experimental)

ARNm ARNm

ADNc ADNc

Secuenciación

masiva

Secuenciación

masiva

Análisis bioinformático.

Selección de genes candidado

Análisis de función génica

Clonado de genes candidatos

Ensayos en sistemas modelo

Estudio transcriptómico relacionado a la senescencia foliar en girasol

• Diferentes estudios han sido realizados con el objetivo de identificar genes asociados a la

senescencia sobre- y sub-expresados a lo largo de distintos estadios del proceso.

• Una de las técnicas pioneras de alto desempeño que permite el estudio simultáneo de miles

de genes fue el desarrollo de micromatrices de oligonucleótidos.

MICROMATRIZ (Agilent 44Kx4) 42.386 sondas

74 controles específicos 1.417 controles Agilent

133,682 EST Genbank (Helianthus annuus L.)

(4x44, www.agilent.com)

(Fernández y col ., Plos One 2012)


Genes asociados a la senescencia

≈1.200 SAGs de Arabidopsis

Leaf senescence database

(http://psd.cbi.pku.edu.cn/)

≈41.000 unigenes de girasol

Sunflower unigene Repository

(http://atgc-sur.inta.gob.ar/)

Condición Control Déficit H.

Campo 167 152

Invernáculo 103 60

Campo

Control

Campo

Déficit h.

Invernáculo

Control

Invernáculo

Déficit h.

369 unigenes candidatos

alta identidad de secuencia

Moschen 2013,, Tesis doctoral



≈23.000 FTs de Arabidopsis,

Oryza sativa, Populus trichocarpa,

Vitis vinifera, Zea mays.

Plant Transcription Factor Database

(http://plntfdb.bio.uni-potsdam.de/v3.0/)

≈41.000 unigenes de girasol

Sunflower unigene Repository

(http://atgc-sur.inta.gob.ar/)

Condición Control Déficit h.

Campo 140 136

Invernáculo 123 86

687 unigenes candidatos

alta identidad de secuencia.

Campo Control Campo Déficit h. Invernáculo Control Invernáculo Déficit h.


(Kim y col., 2009)

NAC

MYB

AP2-EREBP

HB

ANAC055

ANAC019

ANAC029

MYB44

MYB73

ERF3

ERF72

ERF104

HAHB4

(Balasadeh y col., 2013)

0 5

Log2 FC

T0 T1 T2


Análisis de correlaciones entre FT

ANAC19 ANAC02

ANAC47

ANAC55

ANAC81

Correlación de Spearman p-valor <0,01

Capítulo 4 Estudio integrador relacionado a la senescencia foliar en girasol

Biología de Sistemas

Genómica Transcriptómica Proteómica Metabolómica

(Thimm y col., 2004)

Mapman

BINCODE NAME IDENTIFIER DESCRIPTION TYPE

1 PS

1.1 PS.lightreaction

1.1.1 PS.lightreaction.photosystem II

1.1.1.1 PS.lightreaction.photosystem II.LHC-II HeAn_C_11607 moderately similar to ( 431) AT3G47470 | Symbols: LHCA4, CAB4 | LHCA4 (LIGHT-HARVESTING CHLOROPHYLL-PROTEIN COMPLEX I SUBUNIT A4); chlorophyll binding | chr3:17493622-17494773 REVERSEmoderately similar to ( 231) CB12_PETHY Chlorophyll a-b binding protein, chloroplast precursor (LHCI type II CAB) - Petunia hybrida (Petunia)moderately similar to ( 378) loc_os08g33820 12008.m080044 protein chlorophyll a-b binding protein 4, chloroplast precursor, putative, expressed Contig11607T

1.1.1.2 PS.lightreaction.photosystem II.PSII polypeptide subunits HeAn_C_3889 moderately similar to ( 225) AT2G39050 | Symbols: | hydroxyproline-rich glycoprotein family protein | chr2:16303427-16305336 FORWARDweakly similar to ( 153) PSBP_SOLTU Oxygen-evolving enhancer protein 2, chloroplast precursor (OEE2) (23 kDa subunit of oxygen evolving system of photosystem II) (OEC 23 kDa subunit) (23 kDa thylakoid membrane protein) - Solanum tuberosum (Potato)moderately similar to ( 229) loc_os07g48500 12007.m09063 protein stress responsive protein, putative, expressed Contig3889T

1.1.2 PS.lightreaction.photosystem I HeAn_C_677 moderately similar to ( 260) AT1G45474 | Symbols: LHCA5 | LHCA5; pigment binding | chr1:17179353-17180439 FORWARDweakly similar to ( 130) CB12_PETHY Chlorophyll a-b binding protein, chloroplast precursor (LHCI type II CAB) - Petunia hybrida (Petunia)moderately similar to ( 247) loc_os02g52650 12002.m10295 protein chlorophyll a-b binding protein 4, chloroplast precursor, putative, expressed Contig677T

1.1.2.1 PS.lightreaction.photosystem I.LHC-I HeAn_S_37979 moderately similar to ( 304) AT4G12800 | Symbols: PSAL | PSAL (photosystem I subunit L) | chr4:7521469-7522493 FORWARDmoderately similar to ( 303) PSAL_CUCSA Photosystem I reaction center subunit XI, chloroplast precursor (PSI-L) (PSI subunit V) - Cucumis sativus (Cucumber)moderately similar to ( 262) loc_os12g23200 12012.m26900 protein photosystem I reaction center subunit XI, chloroplast precursor, putative, expressed DY919999T

1.1.2.2 PS.lightreaction.photosystem I.PSI polypeptide subunits HeAn_C_3253 moderately similar to ( 229) AT2G31040 | Symbols: | ATP synthase protein I -related | chr2:13209094-13211012 REVERSEmoderately similar to ( 207) loc_os01g48300 12001.m43139 protein expressed protein Contig3253T

11 lipid metabolism

11.3 lipid metabolism.Phospholipid synthesis HeAn_S_18559 moderately similar to ( 222) AT3G18850 | Symbols: LPAT5 | LPAT5; acyltransferase | chr3:6499529-6500840 REVERSEvery weakly similar to (87.8) LPAT2_BRAOL 1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase 2 (EC 2.3.1.51) (Lysophosphatidyl acyltransferase 2) - Brassica oleracea (Wild cabbage)moderately similar to ( 224) loc_os01g57360 12001.m11887 protein 1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase 4, putative, expressed GE503752T

11.3.2 lipid metabolism.Phospholipid synthesis.choline kinase HeAn_S_17701 moderately similar to ( 254) AT4G09760 | Symbols: | choline kinase, putative | chr4:6148955-6151150 REVERSEmoderately similar to ( 265) loc_os05g45880 12005.m08713 protein ethanolamine kinase 1, putative, expressed GE505193T

3.1.1001 minor CHO metabolism.raffinose family raffinose minor CHO metabolism.raffinose M

13.1.7.1002 amino acid metabolism.synthesis.histidine histidine amino acid synthesis.histidine M

Moschen 2013,, Tesis doctoral

Estudio metabolómico relacionado a la senescencia foliar en girasol

Ensayo a campo (GC-TOF-MS)

Estudio integrador relacionado a la senescencia foliar en girasol

Campo control: Tiempo 1 vs Tiempo 0

Estudio integrador transcriptomica/metabolomica relacionado a la

senescencia foliar en girasol

Moschen 2013, Tesis doctoral

Esquema del (Programa Mapman) de genes (cuadrados) y metabolitos (círculos) Up regulados (rojo o

downregulados(azul) durante el proceso de senescencia


Solutos compatibles

Agrobiotecnología

Tolerancia


- Se transformaron plantas de tabaco con una

construcción genética que contenía el gen mtlD

de E. coli bajo el promotor de 35S de CaMV.

- Se realizaron experiencias de crecimiento

en medios de alta concentración salina.

- Se evaluó la altura de la parte aérea y el peso

fresco de las plantas.

- Las plantas transgénicas toleraron mayores

niveles de salinidad.

Transformación

de tabaco con

el gen de

manitol-1P

deshidrogenasa

de Escherichia coli

Agrobiotecnología

Tolerancia


Fructosa 6 - fosfato

mtlD Manitol 1 - fostato

deshidrogenasa

Manitol 1 - fosfato

Manitol

Glucosa 6 - fosfato

Fructosa

Fructosa 1,6 - difosfato

Fosfatasa no

específica Fosfatasa

inespecífica

Plantas de tabaco transgénicas que

acumulan manitol y plantas control a los 30

días de crecimiento en medio de cultivo

conteniendo 250 mM de NaCl.

NT: no transgénica; T: transgénica.

Raíces de plantas de tabaco que acumulan

manitol y plantas control a los 30 días en medio

de cultivo sin sales (izquierda) y conteniendo

250 mM de NaCl (derecha).

NT: no transgénica; T: transgénica.

Transformación de tabaco con el gen

de manitol-1P deshidrogenasa de Escherichia coli

Tomado de: Tarczynski et al., Science, 1993.

NT T NT T

NT T

- Se caracterizó el perfil de expresión del gen en B.

píctus, se asiló y clonó el mismo

- Se expreso en el sistema heterólodo Pichia pastoris

-Se transformaron plantas de tabaco con una

construcción genética que contenía el gen 6-SFT

bajo el promotor de 35S de CaMV.

-Se evaluó la actividad enzimática así como el

contenidio de fructanos en hojas de tabaco.

-Se realizaron ensayos sometiendo a plantas

previamente aclimatados o sin aclimatación a

condiciones de estrés por temperaturas de

congelamiento

- Se evaluó la perdidas de electrolitos así como la

altura de la parte aérea y el peso fresco de las plantas

en relación a controles no transgénicos.

Transformación

de tabaco con

el gen fructan 6-

fructosyltransfera

(6-SFT) de la

gramínea

patagónica

Bromus pictus

Agrobiotecnología

Tolerancia


Del Viso et al, 2011, J Plant Phys. 168 : 493–499

Transformación de tabaco con el gen fructan 6-fructosyltransfera (6-SFT)

de la gramínea patagónica Bromus pictus

Las lineas trangénicas tanto aclimatadas como no aclimatadas presentaron menor daño de membrana plasmática comparada con

controles no trangénicos y mayores nivles de fructanos. Las lineas trangénicas reasumieron el desarrollo despues del tratamiento de

congelamiento.

La ruta de síntesis de D-ononitol y D-pinitol a partir de glucosa 6-P es inducible por sequía y/o

salinidad en varias familias de plantas halófilas. En la planta del hielo (Mesembryanthemun

crystallinum) se ha demostrado la inducción coordinada de la transcripción de inps1 y imt1. En

cambio, inps1 no se induce bajo estrés y el gen imt1 no está presente en Arabidopsis thaliana.

Ruta de síntesis de D-ononitol y de D-pinitol

en la planta del hielo (Mesembryanthemun crystallinum)

Adaptada de: Bohnert and Jensen. Trends in Biotechnology,1996.

Pool de glucosa 6 - fostato

Pool de myo - inositol 1 - fosfato

inps1 Inositol 1 - fosfato

sintetasa

Inositol

monofosfatasa imp1

myo - inositol

Inositol

O - metiltransferasa imt1

D - Ononitol

D - Pinitol

oep1 Ononitol

epimerasa

Fosfoinosítidos,

fosfolípidos, fitatos

D - glucuronato - 1 - fosfato,

síntesis de pared celular,

galactinol para azúcares

de rafinosa

Vía

ub

icu

a; n

o in

du

cib

le p

or

estr

és e

n A

rabid

op

sis

th

alia

na

Vía

ub

icu

a y

su

exte

nsió

n, la

cu

al e

s in

du

cib

le p

or

estr

és e

n M

ese

mb

rya

nth

em

um

cry

sta

llin

um

Acumulación de mio-inositol y D-ononitol en plantas de tabaco

no transformadas (SR1) y en una línea transgénica (I5A)

transformada con el gen de imt1 de M. crystallinum en condiciones

de carencia de riego. Las plantas fueron privadas de agua durante

8 días. Las plantas I5A exhibieron mayor tasa fotosintética,

mayor nivel de fijación de CO2 y mayor recuperación de la

fotosíntesis que los controles en condiciones de estrés .

Expresión

constitutiva del gen

de la mio-inositol

O-metiltransferasa de

Mesembryanthemum

crystallinum en

Nicotiana tabacum

Tomado de: Sheveleva et al., Plant Physiol.,1997.

Agrobiotecnología

Tolerancia


mio-inositol D-ononitol

CMO: colina monooxigenasa

COD: colina oxidasa

CDH: colina deshidrogenasa

BADH: betaína aldehído

deshidrogenasa

GSMT: glicina sarcosina

metiltransferasa

SDMT: sarcosina dimetiltransferasa

Fd(red) / Fs(ox): ferredoxina en

forma reducida u oxidada

SAH: S-adenosilhomocisteína

SAM: S-adenosilmetionina

Rutas biosintéticas presentes en diferentes organismos

para la síntesis de glicina betaína

Adaptado de: Murata and Chen Curr. Opin. Plant Biol., 2002.

Rutas de dehidrogenación/oxidación de la colina

Ruta de metilación de la glicina

a) Plantas

c) Arthrobacter globiformis

b) Escherichia coli

colina glicina betaínabetaína aldehído

colina

colina betaína aldehído

glicina betaína

glicina betaína

glicina betaínaglicina sarcosina (N-metilglicina) N,N-dimetilglicina

Rutas de dehidrogenación/oxidación de la colina

Ruta de metilación de la glicina

a) Plantas

c) Arthrobacter globiformis

b) Escherichia coli

colina glicina betaínabetaína aldehído

colina

colina betaína aldehído

glicina betaína

glicina betaína

glicina betaínaglicina sarcosina (N-metilglicina) N,N-dimetilglicina

Rutas de deshidrogenación/oxidación de la colina

* La ruta de metilación de la

glicina fue identificada en dos

microorganismos halófilos:

Actinopolyspora halophila y

Ectothiorhodospira halochocloris

*

- Se transformaron plantas de Arabidopsis thaliana con una construcción

que contiene el gen codA de la bacteria del suelo Arthrobacter globiformis

dirigido por el promotor 35S de CaMV. Se agregó una señal de transporte

a cloroplastos a la secuencia del transgén para permitir la acumulación

de la enzima en dicha organela.

- El contenido de glicina-betaína en hojas de plantas transgénicas aumentó

respecto del control.

Contenido (mol g-1 peso fresco)

Control Línea 1 Línea 2 Línea 3

Colina 1,5 ± 0,3 1,4 ± 0,3 0,8 ± 0,2 1,0 ± 0,3

Glicina-betaína

0,0 0,9 ± 0,2 1,2 ± 0,2 0,8 ± 0,3

- Las plantas transgénicas exhiben tolerancia al estrés salino y a altas

y bajas temperaturas.

p35S rbcS tr codA tnos

Transformación de Arabidopsis thaliana con el gen

de colina oxidasa de Arthrobacter globiformis

Tomado de: Hayashi et al., The Plant Journal, 1997.

Se hicieron germinar 5 semillas de plantas controles

y 5 semillas de cada una de las líneas transgénicas

en placas de Petri suplementadas con varias

concentraciones de NaCl. Después de incubar a 0oC

por 2 días, las placas se incubaron a 22oC para

permitir la germinación y el crecimiento de plántulas.

Se midió la altura total de las plantas desde el tope

de la parte aérea hasta la punta de la raíz a los 5 días

de transferir las semillas a 22oC.

300 0,0 0,2 ± 0,0 0,1 ± 0,0 0,2 ± 0,0

100 0,2 ± 0,0 2,5 ± 0,3 2,0 ± 0,1 2,2 ± 0,1

Control Línea 1 Línea 2 Línea 3

200 0,1 ± 0,0 0,8 ± 0,1 0,1 ± 0,0 0,7 ± 0,1

0 3,0 ± 0,3 3,0 ± 0,2 3,0 ± 0,3 3,0 ± 0,2

Tamaño de la planta (cm)

NaCl

(mM)

Transformación de Arabidopsis thaliana con el gen

de colina oxidasa de Arthrobacter globiformis

Tomado de : Hayashi et al., The Plant Journal, 1997.

Efecto del estrés salino

sobre la germinación y el crecimiento

de plantas transgénicas y control

Efecto del estrés salino en plantas transgénicas

y controles desarrolladas

A: Planta control no transgénica

B: Planta transgénica

Transformación

de Arabidopsis

thaliana con el

gen de colina

oxidasa

de Arthrobacter

globiformis

Se cultivaron plantas

controles sin transformar

y transgénicas en medio

hidropónico por 30 días.

Las plantas se

transfirieron luego

a medio suplementado

con 200 mM de NaCl

y se las incubó por 10

días con luz.


Agrobiotecnología

Tolerancia


5 c

m

A B

Inducción de daños visibles en hojas de plantas

controles y transgénicas por bajas temperaturas

Se cultivaron plantas transgénicas y controles durante 30 días y se las

incubó a 5oC bajo luz continua por 7 días. A continuación, las plantas

fueron incubadas en condiciones normales por 2 días.

A: Planta control no transgénica

B: Planta transgénica

A B

Transformación

de Arabidopsis

thaliana con el

gen de colina

oxidasa

de Arthrobacter

globiformis


Agrobiotecnología

Tolerancia


Efecto de altas temperaturas durante la imbibición y subsiguiente germinación de semillas

de plantas no transgénicas y transgénicas. La semillas fueron imbibidas a 22, 40, 50 y 55oC

por 1 hora y luego sembradas en placas. Luego de incubarlas a 4oC por 2 días, las semillas

fueron mantenidas a 22oC por 3 días.

No transgénica Transgénica

22°C 50°C

55°C 40°C

Tolerancia a altas temperaturas en plantas de Arabidopsis thaliana

que expresan el gen de colina oxidasa de Arthrobacter globiformis

22°C 50°C

55°C 40°C

Tomado de: Alia et al., The Plant Journal, 1998.

* No se dispone de datos

codA: gen de colina oxidas de E. coli; cox: gen de colina colina oxidasa de A. globiformis; BetA y BetB: genes de betaína deshidrogenasa

y de betaína aldehido deshidrogenasa de E. coli;

Comportamiento frente a distintas formas de estrés de

plantas modificadas para sobrexpresar glicina betaína

Adaptado de: Chen and Murata, Curr. Opin. Plant Biol., 2002.

Salinidad

Salinidad

Frío, salinidad

13 mol g –1 ps

*

0,035 mol g –1 pf

cox

betA

betA / betB

Nicotiana tabacum

Salinidad0,3 mol g –1 pfcodADiospyros kaki

Salinidad0,82 mol g –1 pfcodABrassica juncea

Sequía, salinidad13 mol g –1 pscox Brassica napus

Frío, salinidad

Sequía, salinidad

5,3 mol g –1 pf

5,0 mol g –1 pf

codA

betA

(modificado)

Oryza sativa

Frío

Frío, salinidad

Calor

Luz intensa

Salinidad

Heladas

Heladas, salinidad

1,2 mol g –1 pf

1,2 mol g –1 pf

1,2 mol g –1 pf

1,2 mol g –1 pf

1,2 mol g –1 pf

1,2 mol g –1 pf

19 mol g –1 ps

codA

codA

codA

codA

codA

codA

cox

Arabidopsis thaliana

Tolerancia

aumentada

Acumulación

máximaGenEspecies

Salinidad

Salinidad

Frío, salinidad

13 mol g –1 ps

*

0,035 mol g –1 pf

cox

betA

betA / betB

Nicotiana tabacum

Salinidad0,3 mol g –1 pfcodADiospyros kaki

Salinidad0,82 mol g –1 pfcodABrassica juncea

Sequía, salinidad13 mol g –1 pscox Brassica napus

Frío, salinidad

Sequía, salinidad

5,3 mol g –1 pf

5,0 mol g –1 pf

codA

betA

(modificado)

Oryza sativa

Frío

Frío, salinidad

Calor

Luz intensa

Salinidad

Heladas

Heladas, salinidad

1,2 mol g –1 pf

1,2 mol g –1 pf

1,2 mol g –1 pf

1,2 mol g –1 pf

1,2 mol g –1 pf

1,2 mol g –1 pf

19 mol g –1 ps

codA

codA

codA

codA

codA

codA

cox

Arabidopsis thaliana

Tolerancia

aumentada

Acumulación

máximaGenEspecies

Adaptado de: Chen and Murata, Curr. Opin. Plant Biol., 2002..

Tolerancia frente a distintas formas de estrés de plantas

modificadas para producir otros solutos compatibles

* No se dispone de datos

Sequía

Sequía

Sequía

Sequía

3,2 mg g –1 ps

*

*

90 g g –1 pf

Tabaco

Papa

Tabaco

Tabaco

TPS1

TPS1

TPS1

otsA, otsB

Trehalosa

Salinidad61,5 mol g –1 pfCaquiS6PDHSorbitol

Heladas, salinidad

Salinidad

600 g g –1 pf

4 mg g –1 pf

Arabidopsis

Tabaco

Anti-proDH

P5CF127A

Prolina

Sequía, salinidad35 mol g –1 pfTabacoimt1D-ononitol

Salinidad

Salinidad

Salinidad

Estrés oxidativo

10 mol g –1 pf

6 mol g –1 pf

3,8 mg g –1 ps

7 mol g –1 pf

Arabidopsis

Tabaco

Tabaco

Tabaco

mt1D

mt1D

mt1D

mt1D

Manitol

Sequía

Sequía

0,35 mg g –1 pf

0,5 % ps

Tabaco

Remolacha

azucarera

sacB

sacB

Fructano

Tolerancia

aumentada

Acumulación

máxima

Planta

hospedadoraGen

Solutos

compatibles

Sequía

Sequía

Sequía

Sequía

3,2 mg g –1 ps

*

*

90 g g –1 pf

Tabaco

Papa

Tabaco

Tabaco

TPS1

TPS1

TPS1

otsA, otsB

Trehalosa

Salinidad61,5 mol g –1 pfCaquiS6PDHSorbitol

Heladas, salinidad

Salinidad

600 g g –1 pf

4 mg g –1 pf

Arabidopsis

Tabaco

Anti-proDH

P5CF127A

Prolina

Sequía, salinidad35 mol g –1 pfTabacoimt1D-ononitol

Salinidad

Salinidad

Salinidad

Estrés oxidativo

10 mol g –1 pf

6 mol g –1 pf

3,8 mg g –1 ps

7 mol g –1 pf

Arabidopsis

Tabaco

Tabaco

Tabaco

mt1D

mt1D

mt1D

mt1D

Manitol

Sequía

Sequía

0,35 mg g –1 pf

0,5 % ps

Tabaco

Remolacha

azucarera

sacB

sacB

Fructano

Tolerancia

aumentada

Acumulación

máxima

Planta

hospedadoraGen

Solutos

compatibles

Anti-proDH: ADNc antisentido del gen de prolina deshidrogenasa de A. thaliana; imt: gen de myo-inositol O-metil transferasa de M.

crystallinum; mt1D: gen de la manitol-1-fosfato deshidrogenasa de E. coli; otsA y otsB: genes de trehalosa-6-fosfato sintetasa y de

treahalosa-6-fosfato fosfatasa de E. coli; P5CS: gen de ´-pirrolina-5-carboxilato sintetasa de V. aconitifolia; P5CF127A: gen mutado de

´-pirrolina-5-carboxilato sintetasa de V. aconitifolia; SacB: gen de la levanosacarasa de B. subtilis; S6PDH: gen de la sorbitol-6-fosfato

deshidrogenasa de manzano; TPS1: gen de la trehalosa-6-fosfato sintetasa de levadura.


Bombas de Na+/H+

Agrobiotecnología

Tolerancia


El estrés por alta concentración de Na+ da lugar a una señal mediada por

Ca2+ que activa el complejo de kinasas SOS3-SOS2, el que a su vez

estimula la actividad de intercambio Na+/H+ de SOS1 y regula la expresión

de distintos genes a nivel transcripcional y post-transcripcional.

Regulación de

la homeostasis

de Na+ y K+

por la ruta SOS

Adaptado de: Zhu. Annual Review in Plant Biology, 2002.

Agrobiotecnología

Tolerancia


H+

exclusión

compartimentalización

exportación

Plantas controles (A) y transgénicas (B)

crecidas en 5 mM NaCl

Plantas controles (C) y transgénicas (D)

crecidas en 200 mM NaCl

A: Frutos de plantas controles

B: Frutos de plantas transgénicas

Tolerancia a estrés salino en plantas de tomate transformadas

con el gen nhx1 de la bomba vacuolar de Na+/H+ de Arabidopsis thaliana

Tomado de: Zhang and Blumwald.

Nature Biotechnology, 2001

A B

C

D

A B

Tolerancia a estrés salino en plantas de Brassica napus transformadas

con el gen nhx1 de la bomba vacuolar de Na+/H+ de Arabidopsis thaliana

Las diferentes líneas transgénicas presentan niveles de expresión

X1OE1: nivel alto; X1OE2: nivel medio; X1OE3: nivel bajo

Plantas transgénicas y control crecidas en 200 mM de NaCl

X1OE1 X1OE2 X1OE3 ControlesX1OE1 X1OE2 X1OE3 Controles

Tomado de: Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001.

Se transformaron plantas de P. dilatatum con una construcción que

permite expresar el gen nhx1 de A. thaliana en forma constitutiva

Texto: Arial 24

Plantas transgénicas (T) y control (WT) regadas con 250 mM NaCl

T WT T WT T T

Gen

tile

za:

Ing

. A

gr.

G. S

ch

rau

f

Tolerancia a estrés salino en plantas de Paspalum dilatatum transformadas con el gen nhx1 de Arabidopsis thaliana


Sobrexpresión de citoquininas

Agrobiotecnología

Tolerancia


• La salinidad y la sequía aceleran el proceso de

. senescencia en las plantas.

• Bajo un estrés no letal, las plantas tienden a florecer

. más rápidamente.

• El estrés modifica la relación fuente/sumidero

• Las citoquininas retrasan el proceso de senescencia

El retraso de la senescencia originada por el estrés puede proveer

mecanismos de supervivencia mediante la activación de mecanismos

de evasión (regulación del turn-over proteico, mayor eficiencia en el

uso de agua, consumo de nutrientes de almacenamiento, retraso de

la floración inducida por estrés)

Se expresó un gen de la enzima isopentenil transferasa (IPT) bajo un

promotor inducible por senescencia para mantener niveles óptimos

de citoquininas y retrasar el estrés inducido por este proceso. La IPT

es el factor limitante de la biosíntesis de citoquininas.

Tolerancia

a estrés hídrico

en tabaco

transformado

con el gen ipt

bajo un

promotor

inducible

por senescencia

Agrobiotecnología

Tolerancia

a estreses abióticos SARK IPT

El promotor utilizado proviene del gen de

una quinasa tipo receptor asociada a

senescencia (SARK) de Phaseolus vulgaris.

El gen SARK es inducido por este proceso.

Fila superior: sin riego segunda semana

Fila inferior: riego restaurado, tercera semana

Tolerancia

a estrés hídrico

en tabaco

transformado

con el gen ipt

bajo un

promotor

inducible

por senescencia

No transgénica Transgénica

Agrobiotecnología

Tolerancia


Gen

tile

za D

r. E

. B

lum

wald

Tolerancia

a estrés hídrico

en tabaco

transformado

con el gen ipt

bajo un

promotor

inducible

por senescencia

Agrobiotecnología

Tolerancia


La tolerancia a estrés hídrico puede visualizarse como un

carácter de productividad en condiciones de escasez de agua

Plantas transgénicas y control cultivadas en condiciones de riego

diario normal (derecha) y bajo 30% del riego diario normal (izquierda)

Gen

tile

za D

r. E

. B

lum

wald

Peso fresco de plantas Producción de semillas

1 L/día 0,3 L/día Sequía

Rendimiento de semillas

Pe

so

se

co

(g s

em

illa

/pla

nta

)

Peso

fre

sco

(g

/pla

nta

)

sem

illa

s /p

lan

ta

Tolerancia

a estrés hídrico

en tabaco

transformado

con el gen ipt

bajo un

promotor

inducible

por senescencia

Agrobiotecnología

Tolerancia


Gen

tile

za D

r. E

. B

lum

wald


Expresión de factores de transcripción

Agrobiotecnología

Tolerancia


Transformación

de plantas de

Arabidopsis

thaliana

con el gen

del factor de

transcripción

Hahb-4

de girasol

Agrobiotecnología

Tolerancia


La

disponibilidad

de agua regula

la expresión

del gen hahb-4

en los

diferentes

órganos de la

planta

Gen

tile

za D

r. R

. C

han

Hahb-4 es un factor de transcripción de girasol que

pertenece a la familia Hd-Zip. Los factores de este tipo

contienen un dominio de unión a ADN asociado con

un cierre de leucinas y estarían involucrados en procesos

del desarrollo vinculados a factores ambientales.

Transformación de plantas de Arabidopsis thaliana

con el gen del factor de transcripción Hahb-4 de girasol

Plantas

transformadas

con

el gen Hahb-4

(derecha ) y

no transgénicas

(izquierda)

sometidas a

sequía. Gentileza Dr. R. Chan

Transformación

de plantas de

Arabidopsis

thaliana

con el gen

del factor de

transcripción

Hahb-4

de girasol

Agrobiotecnología

Tolerancia


WT T WT T

T WT T WT

Plantas de

Arabidopsis

thaliana de 28

días post-

germinación

sometidas a

estrés hídrico

extremo

Las mismas

plantas que en

el panel

superior a las 24

h de resumido el

riego normal Gen

tile

za D

r. R

. C

han

Ensayos de campo con plantas de trigo transformadas

con el gen Hahb-4 de girasol

Villalonga

a

ab ab

a

ab

b

0

1000

2000

3000

4000

Wild

Type

Ta.IV

.ii.a

.3

Ta.IV

.ii.a

.4

Ta.IV

.ii.a

.6

Ta.IV

.ii.a

.12

BI 300

4

Yie

ld(k

gh

a-1)

0

500

1000

1500

2000

Wild type Ta.IV.ii.a.3 Ta.IV.ii.a.4 Ta.IV.ii.a.6 Ta.IV.ii.a.12

Yie

ld(k

gh

a-1)

Monte Buey

32°55’08”S

62°27’28”W

39°54’51”S

62°37’12”W

Villalonga

Monte BueyGentileza Ing. Agr. G. Watson

Etapas de experimentacion para la llegada de un cultivo

transgénico al mercado


Proteínas LEA

Agrobiotecnología

Tolerancia


Se transformaron plantas de arroz con el gen hva1

de cebada que codifica una proteína LEA (Late

Embryogenesis Abundant). La secuencia se puso

bajo la dirección del promotor de actina de arroz.

Las plantas transgénicas exhibieron mayor crecimiento

de hojas y raíces en condiciones de estrés.

Planta control

no transgénica (NT)

y dos líneas

transgénicas (36, 41)

que fueron

sometidas a tres

ciclos consecutivos

de estrés hídrico

de 7 días cada uno,

consistentes en

5 días sin riego

seguidos por 2 días

con riego. Tomado de: Xu et al., Plant Physiol., 1996.

Sobreexpresión

del gen hva1

de cebada

(Hordeum vulgare

L.) en plantas

transgénicas

de arroz

Agrobiotecnología

Tolerancia



Citrato sintetasa

Agrobiotecnología

Tolerancia


- Los suelos ácidos y con alta concentración de aluminio resultan tóxicos para

las raíces, las cuales no son capaces de desarrollarse y absorber los nutrientes

disponibles.

- El exudado de ácidos orgánicos produce la quelación del aluminio produciendo

tolerancia al mismo.

- Se transformaron plantas de Nicotiana tabacum con una construcción que contiene

el gen de citrato sintetasa (csb) de la bacteria Pseudomonas aeruginosa dirigido

por el promotor 35S de CaMV.

- Se cuantificaron los niveles de citrato en la planta y del exudado por las raíces,

en raíces transgénicas con CSb y controles sin transformar.

- Las plantas transformadas toleraron altas concentraciones de aluminio.

Línea Niveles de citrato (mmol

por gramo de peso fresco)

Eflujo de citrato (nmol

por plántula por hora)

Control 0,43 ± 0,05 57 ± 7,2

CSb-4 1,41 ± 0,07 105 ± 12,2

CSb-11 1,62 ± 0,08 111 ± 12,6

CSb-15 2,31 ± 0,10 163 ± 14,3

CSb-18 4,47 ± 0,35 231 ± 15,3

Tolerancia a aluminio en plantas de tabaco transformadas

con el gen de citrato sintetasa de Pseudomonas aeruginosa

Tomado de: de la Fuente et al., Science, 1997.

A B

C

D E F G

I H J

A: Plantas controles germinadas

en medio con (derecha) y sin

(izquierda) 300 M de aluminio,

2 semanas post-germinación.

B y C: Plantas controles (B)

y CSb-18 (C) germinadas

en medio conteniendo 0, 75, 300

y 1000 M de aluminio, 10 días

post-germinación.

D y E: Plántulas CSb-4 y CSb-18

de una semana germinadas

en 200 M de aluminio.

H: Segregación del fenotipo

de tolerancia a aluminio

en la progenie de CSb-18 luego

de 4 semanas de crecimiento

en medio con 300 M de aluminio.

Las flechas indican

las plántulas susceptibles.

F, G, I y J: Tinción con hema-

toxilina de los pelos y la punta

de las raíces de plántulas de 7 días

tratadas por 1 h con 100 M

de aluminio. (F) y (I) son controles

y (G) y (J) plántulas CSb-18.

Tolerancia a aluminio en plantas de tabaco transformadas

con el gen de citrato sintetasa de Pseudomonas aeruginosa


Plantas de papaya (Carica papaya) control

y transformadas con el gen csb a los 30 días de

cultivo en presencia de 300 M de aluminio.

Izquierda: planta de papaya transgénica;

derecha: planta transformada con el vector vacío.

Tolerancia

a aluminio en

plantas de papaya

transformadas

con el gen de

citrato sintetasa

de Pseudomonas

aeruginosa


Agrobiotecnología

Tolerancia


• En suelos alcalinos (compuestos fosforados con calcio y magnesio) y ácidos

(compuestos fosforados con hierro y aluminio) la disponibilidad de fósforo

soluble es baja.

• El exudado de ácidos orgánicos por parte de las raíces aumenta su

disponibilidad.

• Se introdujo en plantas de tabaco el gen de citrato sintetasa de Pseudomonas

aeruginosa bajo el promotor 35S de CaMV.

Línea

actividad CS

(mg CoA min-1mg-1

proteína)

eflujo de citrato

(nmol por plántula por

hora)

1522 (control) 225 ±11 57 ± 7,2

CSb-4 430 ± 14 105 ± 12,2

Csb-18 595 ± 18 231 ± 15,3

• Las plantas que expresaron la citrato sintetasa fueron capaces de solubilizar

y absorber el fósforo inmovilizado en suelos alcalinos.

Incremento de la captación de fósforo en plantas de tabaco que

expresan el gen de la citrato sintetasa de Pseudomonas aeruginosa

Tomado de: López-Bucio et al., Nature Biotechnology, 2000.

Crecimiento y productividad de líneas de

tabaco CSb sometidas a distintos

tratamientos con fósforo. Se cultivaron

plantas transgénicas (CSb-4 y CSb-18) y

control (1522) en suelo alcalino estéril de

bajo contenido de fósforo, con o sin

agregado de fósforo. Las plantas fueron

fotografiadas luego de 4 meses en el

invernáculo.

A: Plantas cultivadas sin agregado de P. e P.

B y C: Plantas cultivadas con el agregado

de 22 ó 108 mg de PO4H2Na por kg de

suelo, respectivamente

D: Frutos de plantas cultivada con 22

ppm de PO4H2Na

E: Vista superior de una maceta

conteniendo la planta CSb-18 en que se

observan precipitados de citrato de calcio

(flechas).

F-H: Tinción de raíces de la planta CSb-

18 con Tryptan blue. F: planta no

inoculada. G y H: planta inoculada con la

micorriza Glomus fasciculatum

A B C

G

E D

H F




1522 CS-4 CS-18 1522 CS-4 CS-18 1522 CS-4 CS-18

1522 CS-4 CS-18

A B C

D

Efecto de citrato

en la acumulación

de biomasa de plantas

de tabaco cultivadas

en medio conteniendo una

fuente insoluble de fosfato

Se cultivaron plantas

transgénicas (CSb-4

y CSb-18) y control (1522)

en medio (pH 8,0)

suplementado o no con 1 mM

de ácido cítrico. Las fuentes

soluble e insoluble de fosfato

(PO4H2Na y Ca10(PO4)6(OH)2)

se ajustaron a 1 mM. Las

plántulas se cosecharon

a los 15 días y se determinó

el peso seco. Datos promedio

de tres experimentos

independientes.




Sin

Nuevas estrategias basadas en gene targeting

Ejemplos de otros genes utilizados para conferir

tolerancia a estreses abióticos

Umezawa et al., Current Opinion in Biotechnology, 2006.













1. Umezawa, T., Fujita, M., Fujita, Y., Yamaguchi-Shinozaki, K. And

Shinozaki, K. Engineering drought tolerance in plants: discovering and

tailoring genes to unlock the future. Current Opinion in Biotechnology,

17:113-122, 2006.

2. Vinocur, B. And Altman, A. Recent advances in engineering plant

tolerance to abiotic stress: achievements and limitations. Current Opinion

in Biotechnology, 16:123-132, 2005.

3. Zhu, J.-K. Salt and drought stress signal transduction in plants. Annual

Review in Plant Biology, 53:247-273, 2002.

4. Iba, K. Acclimative response to temperature stress in higher plants:

approaches of gene engineering for temperature tolerance. Annual

Review of Plant Biology, 53:225-245, 2002.

5. Seki, M., Narusaka, M., Ishida, J., Nanjo, T., Fujita, M., Oono, Y., Kamiya,

A., Nakajima, M., Enju, A., Sakurai, T., Satou, M., Akiyama, K., Taji, T.,

Yamaguchi-Shinozaki, K., Carninei, P., Kawai, J., Hayashizaki, Y. and

Shinozaki, K. Monitoring the expression profiles of 7000 Arabidopsis

genes under drought, cold and high-salinity stresses using a full-length

cDNA microarray. The Plant Journal, 31:279-292, 2002.

6. Chen, H.H. and Murata, N. Enhancement of tolerance of abiotic stress by

metabolic engineering of betaines and other compatible solutes. Current

Opinion in Plant Biology, 5:250-257, 2002.

7. Zhang, H.X. and Blumwald, E. Transgenic salt-tolerant tomato plants

accumulate salt in follage but not in fruit. Nature Biotechnology, 19:765-

768, 2001.

8. Zhu, J.-K. Plant salt tolerance. Trends in Plant Sciences, 6:66-71, 2001.

9. Kazuo Nakashima, Yusuke Ito, and Kazuko Yamaguchi-Shinozaki. Plant

Physiol. Vol. 149, 2009

Referencias

Agrobiotecnología

Tolerancia


Documents

Tolerancia a estreses abióticos