Técnicas Moleculares A

Cell lysis

Protein removal

DNA precipitation

Process Common procedure

SDS, sarcosyl CTAB

Proteinase K Lysozyme

Freezing Sonication Grinding

Chemical

Enzymatic

Mechanic

Alcohol Ethanol Iso-propanol

Phenol chloroform

Sodium chloride Sodium acetate

Membrane Beads

Organic solvents

Salt

DNA binding

Obteno e manipulao de cidos nuclicos

FERRAMENTA IMPORTANTE: Endonucleases de

restrio

Bacterifagos - > vrus infectam bactrias

1950s - fagos infectam cepas especficas

certos fagos restritos a certas cepas (Luria)

1962 - endonuclease clivam DNA no protegido

DNA no protegido degradado por endonuclease restringindo infeco

1968 - purificao 1a endonuclease de restrio

1970 - purificao e caracterizao Hin dII

corte mesmo stios - mapa de restrio


Clonagem molecular o processo de construo de molculas de DNA recombinante e da sua propagao em hospedeiros

apropriados que possibilitam a seleco do DNA recombinante.


SOUTHERN BLOT

Restriction enzymes

molecular scissors

Southern blot steps

-processo que determina a ordem dos nucleotdeos (blocos que constituem a molcula de DNA) em uma amostra .

SEQUENCIAMENTO

Marcadores moleculares

PCR Polymerase Chain Reaction

-sntese enzimtica in vitro de milhes de

cpias de um segmento especfico de DNA

na presena da enzima DNA polimerase.

-sua reao baseia-se no anelamento e

extenso enzimtica de um par de

oligonucleotdeos (pequenas molculas de

DNA de fita simples) utilizados como

indicadores (primers) que delimitam a

sequncia de DNA de fita dupla alvo da

amplificao.


- Isoenzimas

-RFLP

baseados em PCR

- RAPD

- AFLP

-Microsatlites

-SNPs

- Genes nucleares e mitocondriais

Marcador molecular todo e qualquer fentipo molecular

oriundo de um gene expresso (como em isoenzimas) ou de um

segmento especfico de DNA (expresso ou no).


Eletroforese em gel - uma tcnica de separao de macromolculas que envolve a migrao das mesmas em um

determinado gel durante a aplicao de uma corrente eltrica. As

molculas so separadas de acordo com o seu tamanho, as menores iro

migrar mais rapidamente que as de maior tamanho.


Genotipagem automtica anlise do produto amplificado em sequenciador. O equipamento determinar o tamanho do fragmento

detectando a fluorescncia acoplada ao iniciador.


Isoenzimas variao allica de protenas.

- Eletroforese em gel de amido e visualizao do produto enzimtico por

mtodos histoqumicos;

-Diferenas na mobilidade de isoenzimas em um campo eltrico so

resultantes de diferenas ao nvel de sequncias de DNA que codificam tais

enzimas;

-Fentipo molecular - co-dominante.


Homozigoto Heterozigoto


RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism

-polimorfismo no comprimento de

fragmentos obtidos por corte (com

enzimas de restrio) da fita dupla

de DNA ;

-co-dominantes.

PCR RFLP

- Amplificao de um dado gene e

posterior corte com enzimas de

restrio.


RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism

Anemia falciforme

PCR (Reao em Cadeia da Polimerase)

Desnaturao: 95C

Anelamento: 55C

Extenso: 72C

25 a 40 ciclos

Amplificao in vitro de cidos nuclicos: aumento da possibilidade de visualizar estas molculas

DNA molde (alvo)

Iniciadores

Nucleotdeos (dNTPs)

DNA polimerase

ons Magnsio (cofator da enzima)

Tampo (manuteno do pH timo)


PCR Polymerase Chain Reaction


RAPD - Randomly Amplified

Polymorphic DNA

-variao do protocolo de PCR, com

duas caractersticas distintas:

a) utiliza um primer nico ao

invs de um par de primers;

b) primer nico tem sequncia

arbitrria, e portanto sua

sequncia alvo desconhecida.

-dominantes


Homozigoto ?

Heterozigoto ?


AFLP -Amplified Fragment Length Polymorphism

- DNA total clivado com enzimas

de restrio;

-uma frao dos fragmentos

gerados amplificada

seletivamente via PCR;

-rene a vantagem da PCR

especfica com a vantagem da

RAPD em se explorar sequncias

arbitrrias;

-dominante


MICROSSATLITES

-cada ilha microssatlite, (CA, TG, ATG, etc.)constitui um loco

gentico altamente varivel,

multiallico, de grande contedo

informativo.

-cada segmento amplificado de

tamanho diferente representa um

alelo diferente do mesmo loco.

TTCGATTCTAAGGCCTTGCTAGCAGAAGC

CGGCGAATATCAGTTACACACACACACAC

ACACACACACACACACACACACACACACA

ACACTGTCTGCTAGGCTTCTGCTAGCAAG

GCCTTAGAATCACTAGTGAATTCGCGGCC

GCCT


Homozigoto

Heterozigoto

SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS

(SNPS)


SEQUENCIAMENTO

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