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TECNICAS MOLECULARES EN EL ESTUDIO DE HLA (SSO – SSP)
Lic. T.M. Arturo ArzapaloHNERM
SERVICIO DE BANCO DE ORGANOS
Y LABORATORIO DE HISTOCOMPATIBILIDAD
POLIMORFISMO DE HLA
SISTEMA HLA PRESENTA ALTO
GRADO DE POLIMORISMO(PRESENCIA DE MULTIPLES ALELOS
EN UN LOCUS)
TIPIFICACION DE HLA MOLECULAR
HLA SEROLOGICOESTUDIO FENOTIPICO
HLA MOLECULARESTUDIO GENOTIPICO
MICROLINFOCITOTOXICIDAD MEDIADA POR COMPLEMENTO
PCR- SSOPCR- SSPPCR- SBT
A DIFERENCIA DE LOS METODOS SEROLOGICOS LOS METODOS MOLECULARES PERMITEN ESTUDIAR LAS MULTIPLES
DIFERENCIAS ALELICAS DEL HLA
ENFERMEDAD INJERTO CONTRA HUESPED EICH – GVHD
• COMPLICACION DE MAYOR IMPORTANCIA EN EL TRASPLANTE ALOGENICO DE CELULAS MADRE: (LEUCEMIAS, LINFOMAS, APLASIA..)
• UNA AFECCIÓN EN LA CUAL LAS CÉLULAS DEL DONANTE ATACAN A LOS TEJIDOS DEL RECEPTOR
• LOS ANTIGENOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD (HLA) ESTAN INVOLUCRADOS EN EL RECHAZO DEL INJERTO CONTRA EL HUESPED
• ES NECESARIO ENCONTRAR UN DONANTE COMPATIBLE “HLA
IDENTICOS”
TIPIFICACION POR PCR-SSO
• SSO (Oligonucleotido de Sequencia Especifica)– Son SONDAS complementarias al ADN objetivo
– ADN amplificado por PCR se hibridiza con SONDAS de SSO.
– Pueden llegar a resolucion generica o intermedia.
– De Alto rendimiento.
GARANTIZAN LA DISCRIMINACION ENTRE LA SECUENCIA DEL ADN OBJETIVO (ALELO) Y OTRO ESTRECHAMENTE
RELACIONADO.
SECUENCIA DEL PCR - SSO
EXTRACCION DE ADN
AMPLIFICACIONGENERICA DEL LOCUS A, B Y DR
DESNATURALIZACIONDEL MOLDE DE ADN EN CADENAS SIMPLES
HIBRIDIZACION CON SONDAS ESPECIFICAS PARA LOS ALELOS POLIMORFICOS DE HLA
IDENTIFICACIONUSANDO UN CONJUGADO UNIDO A UNA ENZIMA O FLUOROCROMO
SONDAS
3’ 5’
SONDA
SOPORTE
SE ENCUENTRAN UNIDOS A UN SOPORTE Y SON ESPECIFICOS PARA UN ALELO DE HLA
SOPORTE SOLIDO:
- PERLAS DE LUMINEX
- MEMBRANA DE NYLON
- TIRAS DE NITROCELULOSA
- PLACAS DE
MICROTITULACION
- MICROCHIPS
PERLAS DE LUMINEX
ESPECIFICIDAD DE LAS SONDAS
LAS SONDAS PERMITEN LA DETECCION DE ALELOS ESPECIFICOS POR HIBRIDIZACION
DETECCION DE SECUENCIAS ESPECIFICOS POR HIBRIDIZACION CON SONDAS
SONDA
AMPLIFICACION
SE REALIZA LA PCR USANDO PRIMERSGENÉRICOS PARA LOCUS A, B, DR
LOCUS A y B EXON 2 y 3
LOCUS DR EXON 2
LOS PRIMERS ESTAN MARCADOS CON BIOTINA
EXON
B
BPRIMER
GEN HLA (ADN)
5’ 3’
ADN amplificado
BiotinaB
DESNATURALIZACION - HIBRIDIZACION
EL ADN SE DESNATURALIZA PARA OBTENER CADENAS SIMPLES DE ADN
CADA SONDA ES ESPECÍFICA DE UNA SECUENCIA POLIMORFICA (ALELO)
PERO ESTA SECUENCIA PUEDE SER COMPARTIDA POR DIFERENTES ALELOS
LAS SONDAS SE UNEN A LA SECUENCIA COMPLEMENTARIA DEL ADN
3’ 5’
5’ 3’
ADN amplificado
SONDA
BiotinaB
5’ 3’
B
DETECCION
SE USA CONJUGADO ESTREPTAVIDINA MARCADO CON:
FLUOROCROMO: FLUORESCENCIA
ENZIMA + SUSTRATO: COLORIMETRIA
3’ 5’
5’ 3’
DNA amplificado
SONDA
Biotina
Estreptavidina
Fluorocromo
B
TIPIFICACION POR SSP
• PCR-SSP :ES UN METODO QUE USA PRIMERS DE SECUENCIA ESPECIFICA QUE PERMITIRA AMPLIFICAR SOLO ALELOS ESPECIFICOS
• INVOLUCRA DISEÑO CUIDADOSO DE PRIMER, DONDE EL EXTREMO 3’ DEL PRIMER COINCIDA SOBRE EL NUCLEOTIDO DE LA SECUENCIA POLIMORFICA A SER ANALIZADO (ALELO)
• ES UNA PRUEBA RAPIDA
• DE BAJO RENDIMIENTO
FUNDAMENTOLA AMPLIFICACION OCURRIRA SOLO SI EL EXTREMO 3’ DEL PRIMER COINCIDA PERFECTAMENTE AL ALELO POLIMORFICO
EL PRIMER DE SECUENCIA ESPECIFICA (SSP) QUE TERMINA EN AGTACT AMPLIFICARA SOLO AL MOLDE QUE PRESENTA LA SECUENCIA COMPLEMENTARIA
LOS RESULTADOS SON DETERMINADOS DIRECTAMENTE POR ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
X
SECUENCIA DEL PCR - SSP
EXTRACCION DE ADN
AMPLIFICACION DE ADN EN UNA PLACA DE 96 POZOS
LOS AMPLICONES SON ANALIZADOS POR ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
ANALISIS DE DATOS:
LAS MUESTRAS PRODUCIRAN 2 PRODUCTOS DE PCR (CONTROL Y ALELO ESPECIFICO) SOLO EN AQUELLOS POZOS Q CONTINEN EL PRIMER COMPLEMENTARIO AL ALELO DE HLA EN LA MUESTRA
ANALISIS DE DATOS:
POZOS QUE NO POSEEN ALELOS COMPLEMENTARIOS DEL PACIENTE TENDRAN UNA SOLO BANDA DE CONTROL DE AMPLIFICACION
CADA POZO DE REACCION CONTIENE
UNA MEZCLA DE PRIMERS DE SECUENCIA ESPECIFICA Y UN
PRIMER CONTROL DE AMPLIFICACION
ELECTROFORESIS
SIEMPRE VISIBLE UNA BANDA DE CONTROL INTERNO COMO CONTROL DE UNA AMPLIFICACION SATISFACTORIA
LA AUSENCIA DE AMPLIFICACION DE CUALQUIER POCILLO PUEDE ANULAR LOS RESULTADOS DE LA PRUEBA
UNA REACCION POSITIVA: SI HAY AMPLIFICACION DE UN ALELO DE HLA ESPECIFICO
SE USA BROMURO DE ETIDIO O SYBER GREEN
SSO - SSP
SSO SSP
TECNOLOGIA BASADA EN LA AMPLIFICACION DE PCR CON
HIBRIDIZACION CON SONDASESPECIFICAS
UTILIZA PRIMER ALELO ESPECIFICOSSON ESPECIFICO PARA UN DETERMIANDO ALELO POLIMORFICO
USA SOFTWARE PARA SU INTERPRESTACION SE REALIZA EN 10 HORAS (DOS DIAS)
ANALISIS SENCILLO Y RAPIDO USANDO ELECTROFORESIS PARA LA OBSERVACION (2 HORAS)
BAJA E INTERMEDIO RESOLUCION BAJA Y ALTA RESOLUCION
NECESITA 20 ng de ADN NECESITA 100 ng DE ADN
SE TRABAJA VARIAS MUESTRAS A LA VEZ SE TRABAJA POR MUESTRAS INDIVIDUALES