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TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR PARA EL MONITOREO DE

BIOREACTORESNombre: Dra. Claudia Etchebehere Institución: Grupo de Ecología Microbiana. Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, Montevideo, Uruguay

3er curso RED TRITÓN Valparaíso (Chile) 26-julio-2017

CONTENIDO


‣ Generalidades de los microorganismos.

‣ Cómo estudiamos los microorganismos.

‣ Gen del ARNr de 16S como marcador evolutivo.

‣ Técnicas de biología molecular.

‣ Cómo aplicarlas al monitoreo de microorganismos.

‣ Antes de empezar debemos conocer la pregunta a responder.

‣ Muestreo y conservación de muestras.

‣ Extracción de ADN, ARN.

‣ Importancia de los datos de operación.

‣ Tips para aplicar las técnicas de biología molecular.

Generalidades sobre los microorganismos


! Organismos microscópicos (0,5 a 25 micras) ! Incluyen: hongos microscópicos, bacterias, archaeas y virus. ! Organismos unicelulares ! Reproducción por fisión binaria ! Nombre: Género y especie (por ejemplo Escherichia coli)

QUÉ NECESITAN PARA CRECER


‣ Fuente de energía y carbono

‣ Nutrientes ‣ Nitrógeno ‣ Fósforo ‣ Minerales

‣ Importancia del pH ‣ Importancia de la Temperatura ‣ Oxígeno, nitrato, nitrito, etc. ‣ Anaerobiosis.

DIVERSIDAD FILOGENETICA


Fuente: Michael T. Madigan, John M. Martinko. 2004. Brock Biología de los Microorganismos 10ed.

Mitad de la biomasa terrestre son microorganismos

CÓMO SE ESTUDIAN LOS MICROORGANISMOS


‣ Microscopio observación en fresco

‣ Microscopio con tinción especial (FISH).

‣ Cultivo en el laboratorio.

‣ Determinación de actividad (respirometría, actividad metanogénica)

‣ Técnicas basadas en el estudio del ADN

OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO


‣ Observar el lodo en fresco con microscopio óptico.

‣ Estudio de eucariotas. ‣ Cuantificación relativa de filamentos. ‣ Tamaño de los flóculos. ‣ Poca información sobre Bacteria y Archaea

FlSH


‣ Se utiliza para identificar microorganismos (especies diferentes de bacterias filamentosas, bacterias nitrificantes).

‣ Se puede cuantificar por análisis de imágenes.

Fuente: Travers, Tesis de Maestría.

Acúmulo de bacterias oxidadoras de amonio

MÉTODOS DE CULTIVO


‣ Diseñar medios de cultivo de acuerdo al microorganismo que queremos crecer.

‣ Incubar en las condiciones adecuadas (atmósfera, luz, temperatura)

‣ Se puede cuantificar (ejemplo Coliformes en agua)

‣ Es trabajoso y lleva tiempo.

‣ LA MAYORIA DE LOS ORGANISMOS DE LA NATURALEZA NO SE PUEDEN CULTIVAR

DETERMINACION DE VELOCIDAD


‣ Velocidad de consumo de oxígeno (Respirometría).

‣ Velocidad de producción de metano.

‣ Velocidad de producción de hidrógeno.

http://go.galegroup.com/ps/anonymous?p=AONE&sw=w&issn=16929918&v=2.1&it=r&id=GALE%7CA259751174&sid=googleScholar&linkaccess=fulltext&authCount=1&isAnonymousEntry=true

MÉTODOS A PARTIR DEL ADN


‣ A partir del ADN es posible conocer que microorganismos hay en una muestra

‣ El gen del ARNr de 16S es un marcador evolutivo, conociendo su secuencia se conoce el microorganismo.

‣ Métodos rápidos

‣ Se puede conocer la composición de toda la comunidad

DEFINICIÓN DE ESPECIE


‣ Definición de especie en microbiología

‣ Dos microorganismos son de la misma especie si:

‣ Presentan coherencia genómica ‣ Presentan un % de hibridación ADN-ADN mayor de 70% ‣ Métodos basados en análisis de genomas

‣ Tienen similar fenotipo

‣ Son monofiléticos ‣ Pertenecen a la misma rama evolutiva

GEN DEL ARNr DE 16S COMO MARCADOR EVOLUTIVO


‣ Carl Woose, filogenia molecular

‣ Propuso la utilización del gen del ARNr como cronómetro evolutivo

GEN DEL ARNr DE 16S


ARNr de 16S


Estructura secundaria del ARNr de 16S de E. coli

Secuencias muy conservadas Secuencias muy variables Largo adecuado (1500bp)

CARACTERIZACION DE UN AISLAMIENTO


COMPARACION DE SECUENCIA CON BASES DE DATOS


! NCBI http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ● Blast

! EZ Taxón

! Ribosomal Database project http://rdp.cme.msu.edu/ ● RDP classifier ● Seqmatch

% hibridación ADN-ADN >70%

Similitud >97% en el gen del ARNr de 16S

DEFINICIÓN DE OTU

Similitud de secuencia> 97%

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

http://rdp.cme.msu.edu/

PORQUÉ UTILIZAR TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR


‣ Sólo se puede cultivar una pequeña fracción de los microorganismos (menos del 1%)

‣ Es más rápido (cultivo puede llevar semanas o meses)

‣ Se pueden analizar muchas muestras simultáneamente

‣ Se puede guardar muestras a -20°C o -80°C y luego analizarlas.

ELEGIR LA MEJOR ESTRATEGIA


‣ Antes de elegir la estrategia a aplicar pensar que pregunta queremos responder.

‣ Muchas veces la estrategia mas simple es la mejor.

‣ Cada técnica tiene su limitación, antes de aplicarla debemos conocer las limitaciones.

PREGUNTAS A RESPONDER


‣ ¿Qué microorganismos están en el reactor?

‣ ¿Cómo cambia la comunidad microbiana al cambiar el tipo de operación?

‣ ¿Porqué el reactor funciona mal?

¿QUÉ MICROORGANISMOS HAY EN EL REACTOR?


‣ Procesos nuevos

‣ Anammox ‣ Remocion de compuestos recalcitrantes ‣ Producción de hidrogeno

‣ Bacterias poco conocidas ‣ Archaeas nitrificantes ‣ Chloroflexi ?

¿CÓMO CAMBIA LA COMUNIDAD AL CAMBIAR LAS CONDICIONES DE OPERACIÓN?


‣ Cambios de parámetros de operación como: ‣ OLR ‣ HRT ‣ pH, Temp, nutrientes.

‣ Comparar diferentes tipos de reactor

‣ Comparar diferente inóculo

¿POR QUÉ EL REACTOR FUNCIONA MAL?


‣ Problemas de bulking

‣ Acidificación de reactores metanogenicos

‣ Inhibición de metanogénesis

‣ Metano en reactores de hidrógeno

‣ Problemas de hidrólisis

ELEGIR LA MEJOR ESTRATEGIA


SEGÚN LA PREGUNTA LA ESTRATEGIA


MUESTREO


‣ Definir períodos de tiempo, condiciones, etc.

‣ Tomar mas de una muestra por periodo.

‣ Tener en cuenta tratamientos estadísticos en caso de que sean necesarios.

‣ Sistematizar la toma de muestras (hacerla siempre igual).

‣ Estimar la biomasa necesaria para extraer ADN o ARN (0,5g biomasa).

‣ Muestreo para FISH requiere fijar la muestra en el momento.

MÉTODOS DE EXTACCIÓN DE ADN


‣ Conocer las bases de los métodos

‣Método Griffiths ‣Griffiths, R.I., Whiteley, A.S., O’Donnell, A.G. and Bailey, M.J. (2000). Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Applied and Environmental Microbiology, 66, 5488-5491.

‣Kits (Qiagen, MoBio) ‣http://www.mobio.com

http://www.mobio.com/

http://www.mobio.com/

EXTRACCIÓN DE ADN


‣ Lisis celular (mecánica y con enzimas)

‣ Separación de proteínas y otros componentes.

‣ Precipitación de ADN ‣ (etanol, isopropanol, PEG).

‣ Solo se requiere una microcentrífuga

PROBLEMAS FRECUENTES


● Presencia de inhibidores

● Baja concentración (poca cantidad de muestra).

● Degradación del ADN con el tiempo.

● SIEMPRE UTILIZAR EL MISMO MÉTODO PARA PODER COMPARAR

TRABAJANDO CON ARN


‣ La gran ventaja de estudiar el ARN es que me permite conocer los microorganismos que estan activos en la muestra y los genes que están funcionando

MÉTODOS DE EXTRACCION DE ARN


‣ Lisis celular (mecánica y con enzimas)

‣ Separación de proteínas y otros componentes.

‣ Purificación con fenol cloroformo

‣ Precipitación de ADN y ARN

‣ Tratamiento con ADNasa

PROBLEMAS DE TRABAJAR CON ARN


‣ Los ARN tienen una vida media muy corta se degradan muy fácilmente.

‣ El ARN mas inestable es el ARN mensajero.

‣ Mucho cuidado al extraer el ARN con ARNasas (mesada limpia, inhibidos de ARNasas, agua tratada, etc.).

‣ Guardar a -80oC en seguida de extraer.

‣ Se recomienda en seguida pasar a ADN copia.

‣ Para conocer los microorganismos activos alcanza con analizar el ARNr

‣ Para conocer los genes que están activos tenemos que analizar el ARN mensajero.

‣ Cuando extraemos el ARN el 90% son ARN ribosomales.

‣ Para metatranscriptomica incluir método de eliminar el ARN ribosomal

CONTROL DEL ADN Y ARN EXTRAÍDO


‣ Geles de agarosa teñidos con Bromuro de etidio o con SYBR green

‣ Espectrofotómero (nanodrop)

CONSERVACION DE MUESTRAS


‣ Conservar el ADN a -20oC.

‣ Conservar el ARN a -80oC siempre mejor guardar el ADNcopia.

‣ SIEMPRE GUARDAR MUESTRA PORQUE EL ADN SE DEGRADA

‣ GUARDAR SUFICIENTE MUESTRA PARA LO QUE QUERAMOS HACER.

‣ En el caso de querer cultivar guardar en heladera pero no por mucho tiempo porque cambia la comunidad. Guardar en frasco cerrado.

‣ ROTULAR LAS MUESTRAS DE FORMA CONSISTENTE

Dia 2 R1 M1 24-07

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)


CONSERVACION DE MUESTRAS


‣ Conservar el ADN a -20oC.

‣ Conservar el ARN a -80oC siempre mejor guardar el ADNcopia.

‣ SIEMPRE GUARDAR MUESTRA PORQUE EL ADN SE DEGRADA

‣ GUARDAR SUFICIENTE MUESTRA PARA LO QUE QUERAMOS HACER.

‣ En el caso de querer cultivar guardar en heladera pero no por mucho tiempo porque cambia la comunidad. Guardar en frasco cerrado.

‣ ROTULAR LAS MUESTRAS DE FORMA CONSISTENTE

Dia 2 R1 M1 24-07

OBTENCIÓN DE DATOS DE OPERACION DEL REACTOR


‣ Para poder interpretar los datos es fundamental tener datos de oración y performance del reactor en el momento de sacado de las muestras.

‣ Guardar datos de el día en que se saca la muestra y del período.

‣ Los datos mas triviales son igualmente importantes ‣ pH ‣ temperatura ‣ observación visual del lodo (cambios de color, de

aspecto, de sedimentación). ‣ OLR, HRT, concentración de sustrato, productos,

composición del efluente, etc.

TIPS PARA APLICAR LAS TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR


‣ Determinar la pregunta y elegir la técnica mas adecuada.

‣ Pensar el muestreo antes de empezar a operar los reactores y hacer el muestreo siempre igual.

‣ Tomar mas de una muestra por condición de operación.

‣ Tomar suficiente cantidad de muestra y conservarla adecuadamente.

‣ Tomar datos en el momento de la toma de muestra y en el periodo.

‣ Extraer el ADN en el momento de hacer la técnica.

‣ La calidad de los resultados depende del diseño del muestreo, de la elección de la técnica y de los datos de operación que tomamos.

METODOS DE BIOLOGIA MOLECULAR UTILIZADOS


TRATAMIENTO Y RECICLAJE DE AGUAS INDUSTRIALES M E D I A N T E S O L U C I O N E S S O S T E N I B L E S FUNDAMENTADAS EN PROCESOS BIOLÓGICOS. RED TEMÁTICA 316RT0508

Financiado por:


Con la colaboración de:

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