Diapositive 1

SPECIATION CHIMIQUE DU FER DANS L’OCEAN :

Les complexes fer-porphyrines,méthode de détection et mécanismes de production

Au : Laboratoire d’Océanographie et de Biogéochimie (UMR CNRS 6535)Directeur de thèse : Stéphane BLAIN (Pr.)

Soutenance de thèse présentée par Lilita VONG

14 janvier 2008

Diapositive 2

(ECHANGEURS D’ELECTRONS)Rôle dans les réactions biochimiques

Qu’est-ce qu’un complexe fer-porphyrine ?

pont méthénique

noyau pyrrolique

STRUCTURE COMMUNE DES PORPHYRINES

+ ou – SOLUBLEdans les solutions aqueuses

(AGGREGATION, ADSORPTION)

FER-PORPHYRINES

METALLO-PORPHYRINES

cuivre

cobaltmanganèse

magnésium

Diapositive 3

partie protéique

fer-porphyrine

ENZYME contenant une fer-porphyrine : Catalases

PeroxydasesCytochromes (a, a3, b, b6, c, c1,d1, f, P450)Hémoglobine, myoglobine

Exemples de complexes fer-porphyrines

Élimination des radicaux libresStockage et transport d’oxygène… etc.

Rôles clés dans les fonctions physiologiques

Chaînes de transfert d’électrons (respiratoires et photosynthétiques)

Complexe IComplexe IV

Complexe III

Complexe IICytochrome c

Cytochrome c oxydase

Cytochrome bc1

MATRICE MITOCHONDRIALE

ESPACE INTERMEMBRANAIRE

électron

ATP Synthase

H+

ATP

H+ H+ H+

Rôles dans les fonctions physiologiques

Diapositive 4

Les fer-porphyrines : des molécules ubiquistes

Lorsque ces organismes meurent, le contenu de leur(s) cellule(s) est libéré dans le milieu extérieur…

Libération possible de ces complexes fer-porphyrines intracellulairesdans l’eau de mer, Dissolution possible des fer-porphyrines dans la phase dissoute (<0,2 µm)

Diapositive 5

Les fer-porphyrines : sources de fer dans l’océan ?

LE PROBLEME :

La biodisponibilité en ferest TRES PEU CONNUE

40 % de la surface océanique mondiale

Limitation en FER

La croissance du phytoplancton peut être limitée par le fer

RESOUDRE LASPECIATION CHIMIQUE du fer

Diapositive 6

La spéciation chimique du fer dans l’océan …

Fer intracellulaire

Fer extracellulaire(débris détritiques)

Fer colloïdalFer humique

Fer inorganique (1%) Fer organique (99%)Fe(OH)3Fe(OH)2+Fe(H2O)62+FeCO3…

FRACTIONS DE TAILLE

PARTICULAIRE

COLLOIDAL

DISSOUS

Aluminosilicates

Ordre du NANOMOLAIRE

NO

O

C

OH

COOH

NO O

OH

O

N NO

O

COOH

sidérophore

?PORPHYRINE

Le fer dissous est utilisé par les micro-organismes,et il est majoritairement sous forme organique.

Diapositive 7

Objectif 2:Étudier un mécanisme de production des

fer-porphyrines.

Objectif 1:Mettre au point une méthode capable de

mesurer les fer-porphyrines dans l’eau de mer.

Objectifs :

Pourrait-on retrouver les fer-porphyrines dans l’eau de mer, en phase dissoute (<0,2 µm) ?

Diapositive 8

PARTIE 1Comment doser les FePy dans l’eau de mer ?

Diapositive 9

Luminol

O2

METALLOPORHYRINES (fer-porphyrines)

pH 13

Le luminol

Le point de départ …

Réaction de chimiluminescence avec l’hémoglobine

Pour des tests d’immuno-essais: (Motsenbocker et al., 1993)

HHP

PHOTONS

Aminophthalate

Diapositive 10

transférable en analyse par injection en flux (FIA)

Quelles sont les principales exigences de ce développement analytique ?

Pour être utilisée en océanographie, la réaction doit être :

adaptée pour l’analyse d’eau de mer

spécifique aux fer-porphyrines

assez sensible pour mesurer des concentrations naturelles

Diapositive 11

Poubelle

Fluide porteur

Réactif (luminol)

Echantillon

étape 1Peut-on appliquer la réaction de chimiluminescence en FIA ?

FIA = Analyse par injection en flux

Avantages :Peu de manipulation sur l’échantillonConsomme peu de réactifsApplicable à bord de naviresPeu coûteuse

nM d’équivalent hémine

CALIBRATION avec l’HEMINECommercialiséeSoluble

HEMINE (FePy modèle)

Diapositive 12

Peut-on appliquer la réaction à des analyses d’eau de mer ? étape 2

pH 13 Formation de précipités:Incompatibles avec la FIARisque d’adsorption des fer-porphyrines

… NONSANS TRAITEMENT

AVEC TRAITEMENT … OUI

Utilisation de l’EDTA qui empêche la précipitationHors ligne

En ligne

Poubelle

NaOH 0.1M

Luminol 1.5 mMdans NaOH 0.1M

� Automatisation maximale de l’analyse

Poubellechimique

(a)(b)

(c)

(d)

(e)

(f)(g)

NaCl 0.5MEDTA 0.25MLuminol 1.5 mMdans NaOH 0.5M

� Amélioration de la sensibilité et de la reproductibilité

0,38 nM (n=10) 0,11 nM (n=10)

Diapositive 13

La FIA est-elle spécifique aux fer-porphyrines? étape 3

PAS D’INTERFERENCES !

Autres métallo-porphyrineset porphyrines libres(12 molécules)

Tests de spécificité :Luminol

PHOTONS

FePy

Interférents (dans d’autres conditions de pH…) :Fe2+, Fe3+, Cu2+, Co2+, H2O2

Ligands (en compétition avec FePy) :DFOB, Fe-DFOB, acides humiques et phytiques

ligands

Diapositive 14

Dunaliella tertiolectaPHYTOPLANCTON

QUOTA INTRACELLULAIRE (FePy)1 à 5

(x 10-18 moles d’équivalent hémine.cellule-1)

Application de la FIA ? étape 4

!! PREMIERES CONCENTRATIONS EN MILIEU NATUREL !!

~ 11 nM (Etang de Berre)

~ 9 nM (Rhône)

~ 1 à 2 nM (Baie de Marseille, Guyane)

Spectrophotométrie (Gledhill, 2007)

Calcul théorique (Ewetz et Thore, 1978)(Miller et Vogelhut, 1978)

(Océan austral)< LD

(En phase dissoute)

Diapositive 15

Conclusions :

transférable en FIA

Pour être utilisée en océanographie, la réaction doit être :

adaptée pour l’analyse d’eau de mer

spécifique aux fer-porphyrines

assez sensible pour mesurer des concentrations naturelles

� Avec un traitement spécifique

� 0,11 nM équivalent hémine

… a-t-on répondu à nos objectifs ?

Diapositive 16

La suite de ce travail

2ème possibilité:ETUDE DES MECANISMES DE PRODUCTION de FePy (cultures)

1ère possibilité:POURSUIVRE LE DEVELOPPEMENT ANALYTIQUE(Diminution de LD) (phase de pré-concentration)

Limite de détection : 0,11 nM équivalent hémine

BILAN POSITIF :

CETTE FIA EST LA PREMIERE METHODE DE DOSAGE DES FePyDANS L’EAU DE MER :

Diapositive 17

PARTIE 2Étude de mécanismes

de production des fer-porphyrines

Diapositive 18

CULTURES NON AXENIQUES

Phytoplancton

Dunaliella salinaCHLOROPHYCEE

Quel mécanisme choisit-on d’étudier ?

LA PREDATION (=LE BROUTAGE)

Cause de mortalitésouvent dominantedans le domaine pélagique

Phytoplancton Microzooplancton

MODELE SIMPLE : Phytoplancton – Microzooplancton

Phagotrophie

Oxyrrhis marinaDINOPHYCEE

Microzooplancton

Prédateur associé

(5 fois plus gros)

Diapositive 19

Etape 1

Proies+

Prédateurs

BROUTAGE (OBSCURITE) (24h)

Principe :

Proiestémoin

La consommation du phytoplancton par le microzooplancton induit une libération de fer-porphyrines dans l’eau de mer (phase dissoute).

HYPOTHESE

broutage

DISCONTINUEBrest (cellules)

Marseille (FePy)

Diapositive 20

Le broutage n’apparaît pas comme un mécanisme de production de FePy

Libération de fer-porphyrines dans les cultures de phytoplancton

CONSOMMATION du phytoplancton par le microzooplancton

Résultats et discussion : Etape 1

Dunaliella salina

Temps (heure)

0 10 20 30

LN

(ce

llule

/L)

131415161718192021

Oxyrrhis marina

Temps (heure)

0 10 20 30

LN

(ce

llule

/L)

14,214,414,614,815,015,215,415,6

n =3

n =3

Temps (jours)

0 5 10 15 20 25 30

Con

cent

ratio

ns e

n F

ePy

(

nM)

0

1

2

3

4

5

6Lot Témoin Lot Broutage

Temps (heures)

n =3

Diapositive 21

Principe et résultats: Etape 2

Production de fer-porphyrines lors de la phase exponentielle

Témoin(stérile)

phytoplancton

SUIVI DE CULTURES DE PHYTOPLANCTON(2 semaines) n = 6

n = 3

Temps (jours)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

[phy

topl

anct

on]

(1

09 cel

lule

/L)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

fer

Temps (jours)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Con

cent

ratio

ns e

n F

ePy

(

nM e

q. H

em)

-2

0

2

4

6

8

10

12(n = 3)

(n = 3)

Diapositive 22

CAPACITE de PRODUCTIONKp = 1,8 x 10-18moles FePy/L/cellule/jour

QUOTA INTRACELLULAIRE1 à 5 x 10-18moles FePy/cellule

PEU REALISTE qu’une cellule soit capable de produire l’équivalent de son contenu intracellulaire en fer-porphyrines pour le libérer dans l’eau de mer

Discussion : Etape 2

Temps (jours)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Con

cent

ratio

ns e

n F

ePy

(

nM e

q. H

em)

-2

0

2

4

6

8

10

12

���� HYPOTHESE 1 : Une production de fer-porphyrines par les bactéries ?

���� HYPOTHESE 2 : Une interférence chimique (chimiluminescence)?

0,3 à 1,4FePy extracellulaireFePy intracellulaire

RAPPORT =

(n = 3)

Diapositive 23

Hypothèse 1 : production par les bactéries ? Etape 3?

HYPOTHESE 1:Une production par les bactéries ?

Temps (jours)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Con

cent

ratio

ns e

n F

ePy

(

nM e

q. H

em)

-2

0

2

4

6

8

10

12

n = 6 n = 3

Bactéries

Temps (jours)0 2 4 6 8

LN c

once

ntra

tion

bact

érie

nne

LN

(C

ellu

le/L

)

1416182022242628

0 2 4 6 8

Con

cent

ratio

n en

FeP

y

(nM

)

-20

-10

0

10

20

Temps (jours)

fer

NON

Diapositive 24

Etape 3?Hypothèse 2 : existence d’un interférent ?

… si oui, quel est-il ?

Temps (jours)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Con

cent

ratio

ns e

n F

ePy

(

nM e

q. H

em)

-2

0

2

4

6

8

10

12

n = 6 n = 3

2ème INDICE:

produit pendant la phase exponentielle…

3èmeINDICE:

Production par le phytoplancton de superoxyde(phase exponentielle)(Marshall et al., 2005)

intervient dans l’oxydation du luminol…1er INDICE:

Luminol

PHOTONS

FePy

Le radicalsuperoxyde

O2°-

Diapositive 25

Comment éliminer les radicaux superoxydes ? Etape 3?

MISE AU POINT: PROTOCOLE D’ELIMINATION DES SUPEROXYDES

Quelle méthode choisir ?

gluthatione

acide fulviqueacide ascorbique alpha-tocophérol

…SUPEROXYDE DISMUTASE

SOD(Méthode enzymatique)

Superoxyde (O2°-) H2O2

O22 H+

SOD active

pH eau de mer

O2°-

pH 13

SOD inactive

La SOD n’empêchera pas la chimiluminescenceprovoquée par les fer-porphyrines

Diapositive 26

Vérification : Etape 3?

Temps (jours)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18Con

cent

ratio

ns e

n F

ePy

(

nM e

q. H

em)

-2

0

2

4

6

8

10

12

SANS SOD(résultat précédent)

DONC :

INTERFERENCE AVEC LES SUPEROXYDES (ARTEFACT)

Temps (jours)

0 2 4 6 8 10 12 14

Con

cent

ratio

n en

FeP

y (n

M)

-202468

1012

AVEC SOD

Diapositive 27

Etape 4Principe :

La consommation du phytoplancton par le microzooplancton induit une libération de fer-porphyrines dans l’eau de mer (phase dissoute).

HYPOTHESE

Ajout de prédateurs :-en phase exponentielle-en phase stationnaire… du phytoplancton

+ SOD

EXPERIENCE DE BROUTAGE

Proies

Proies+

Prédateursbroutage

témoin

CONTINUE: Marseille (cellules + FePy)

Diapositive 28

Résultats : Etape 4

BroutageTémoin

0 2 4 6 8 10 12

LN (

cellu

le/L

)

6

8

10

12

14

16

18

20

ajout du prédateur

En phase exponentielle En phase stationnaire

Temps (jours)

0 5 10 15 20

LN (

cellu

le/L

)

1012141618202224

ajout du prédateur

Temps (jours)

Phy

topl

anct

on

Phy

topl

anct

onTemps (jours)

0 2 4 6 8 10 12

LN (

nM)

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

fer

Temps (jours)

0 5 10 15 20

LN (

nM)

-2

-1

0

1

2

3

[FePy]

[FePy]

Diapositive 29

Discussion : Etape 4

QUOTA INTRACELLULAIRE1 à 5 x 10-18moles FePy/cellule/

k � 2,2 (± 0,5) x 10-18 moles de fer-porphyrines par cellule broutéeCAPACITE DE RELARGUAGE :

0,03 à 1,43FePy extracellulaireFePy intracellulaire

RAPPORT =

Il est PLAUSIBLE :que la quantité de FePy libérée par une cellule broutée soit du même ordre de grandeur que son contenu intracellulaire.

Le broutage est un mécanisme de production des fer-porphyrines

Diapositive 30

CONCLUSIONS GENERALESet

PERSPECTIVES

Diapositive 31

Conclusions:

Pourrait-on retrouver les fer-porphyrines dans l’eau de mer, en phase dissoute (<0,2 µm) ?

Partie 1 : DEVELOPPEMENT ANALYTIQUE:Mise au point d’une méthode de détection des complexes fer-porphyrinesEt détermination de concentrations naturelles

Partie 2 : ETUDE DE MECANISME DE PRODUCTION : Le broutage peut générer une libération de complexes fer-porphyrines dans le milieu (Cultures).

On peut retrouver les fer-porphyrines dans l’eau de mer

(rôle possible dans la complexation organique et la biodisponibilité du fer dans l’océan)

Diapositive 32

Perspectives :

Sur la méthodologie :

Méthode de pré-concentrationEfforts sur la diminution de la limite de détection

Méthode de dissolution/désorption Possibilité de travailler sur la phase particulaire

Développer un protocole pour mesurer les porphyrines libresIndirectement avec une ferrochélatase

Porphyrine libre + Fer Fer-porphyrineferrochélatase

Diapositive 33

Sur la biogéochimie des complexes fer-porphyrines :

Perspectives :

Processus de production de fer-porphyrines

Lyse virale

Processus de « dégradation » de fer-porphyrines

Éclairement … (les fer-porphyrines sont photosensibles)

Faible solubilité qui entraîne :

AUTO-AGGREGATIONADSORPTION

Rôle des fer-porphyrines dans la biodisponibilité du fer dans l’océan

Les fer-porphyrines sont-elles biodisponibles ?

Les porphyrines libres sont-elles capables de chélater le fer dissous ?

Broutage (autre mode)

Diapositive 34

Merci de votre attention …

…et…

Diapositive 35

Équipe Monitorat

MERCI POUR VOTRE SOUTIEN ET VOTRE BIENVEILLANCE !Badr Al-Ali + Dominique Estival + Lionel Einsenhauer + Marc Garel+ Zi Huan Hu + Antoine Nowaczyk + Cathy Perrot + J-L Fuda + Julien Touboul + Les POTES du GIS …