Biological NanomachinesBiological Nanomachines

Yann R ChemlaDept. of Physics, University of Illinois at Urbana‐Champaign

Saturday Physics for Everyone, Sept. 14, 2013

Biophysics at Illinois

WHAT IS BIOPHYSICS?Part I:

WHAT IS BIOPHYSICS?

Physicists doing biology?

Q: Why are physicists interested in biology?A: Physicists want to understand the world around us

E. coli cells 

Simple Complex

A catDNA

Simple Complex

What is biophysics?

Applying techniques or ideas from physics to biological problems

“… Central problems in biology … will become p gyaccessible to analysis through basic physical laws. ”

A biophysicist’s description of biological phenomena aims to be:p

• Quantitative (mathematical)• Simple (captures enough detail but not too much)

Physics in a New Era – NRC (2001)

• General (applicable to more than one system)

Grand challenges: “Applying Physics to Biology”“Understanding Complex Systems”

MOLECULAR NANOMACHINESPart II: 

MOLECULAR NANOMACHINES

The cellular “factory”The cell = a nano‐scale factory of molecular machines 

DNA genetic “blueprint” to all components of the cell

Molecular machine

Drawing courtesy of M. Spies

DNA – genetic “blueprint” to all components of the cellProteins – carry out cellular tasks

Molecular machines

Molecular machines move cargo around the cell

http://www.xvivo.net/the‐inner‐life‐of‐the‐cell/

Molecular machines

Molecular machines copy the cell’s DNA

http://www.dnalc.org/resources/3s/03‐mechanism‐of‐replication‐basic.html

Molecular machines

Molecular machines propel cells

Molecular distances

0 1 mm

Strand of hair Bacterial cell (E. coli)1 micron

Strand of DNA1 nanometer> >0.1 mm 1 micron

= 1/100 X1 nanometer= 1/100,000 X

> >

Limit of light microscope

Molecular forces

Force exerted by a molecular nanomachine

Weight of a small apple>

1 Newtonmolecular nanomachine

1 picoNewton (pN)= 1/1,000,000,000,000 X

The apple that fell on Newton’s head

Molecular energies

100 MegaJoules

Gallon of gasoline Calories in apple50 Calories

ATP: fuel of the cell> > 100 pN∙nm100 MegaJoules 50 Calories

= 1/1,000 X> > 100 pN∙nm

= 1/100,000,000,000,000,000,000,000,000 X

Adenosine Triphosphate (ATP)

Adenosine Diphosphate (ADP)

+Phosphate (Pi)

Measurement

How do you measure anything?

• Too small to see• Too small to see• Forces & energies too small to detect

“Traditional” biochemistry

Test lots of molecules together in a test tube

“Bulk” biochemistryIndividual proteins move stochastically (= at random)This is a problem when doing traditional “bulk” biochemistry 

This one went slow

This one pausedIdeally, we want to study these one molecule at a time

This one stopped

START FINISH

Measurement

How do you measure anything?

• Too small to see• Too small to see• Forces & energies too small to detect

Single‐molecule techniques to the rescue!

240

280

center

120

160

200

240

Pho

tons

width 250 nm

0

40

80

05

1015

2025

510

1520

25 X DataY axis

Optical traps

Sensitive to individual molecules!

2525 X Dataaxis

Single‐molecule fluorescence

SINGLE‐MOLECULE TECHNIQUESPart II:

SINGLE MOLECULE TECHNIQUES

Optical “tweezers”

Gradient force: F = (p∙E) = α E2∆ ∆

Linear spring K ~ 0.1pN/nm – measure pN, nmAshkin et al., Opt. Lett. 11, 288 (1986)

The optical trap...

...A really expensive LEGO set

19

High‐resolution trapsOptical tweezers can access Ångstrom length scales!

1 Ångstrom = 1/10 nanometer

Temperature controlled, noise‐free environment

CAGT...

GTCA...

1 DNA basepair = 3.4Å

1Å

59 Loomis

Typical geometriesTypical trap experiments involve tethering a single molecule & detecting changes to its length:

Surface‐based (kinesin)

Visscher et al. Nature (1999)

B t th thBut there are many others...

Example experiment

Stretching a DNA “hairpin”:

3’ biotin 3’ digoxigenin

Hairpin

Streptavidin bead Anti‐digoxigenin bead

DNA handle DNA handle

Hairpin see also: Woodside et al., PNAS (2006)

Traps in action

Gone fishing

24

DNA Hairpin

Transition Force~15 pN15 pN

Red = stretchingGreen = relaxing

Hairpin protocol: Woodside et al., PNAS (2006)25

DNA MOTORSPart III:

DNA MOTORS

DNA Helicases

5’3’

Helicases unwind the strands of DNA

ATPFuel:

5’

ATP

ADP + Pi5’

• Uses ATP fuel to move on one strand of DNA

3’3’

• Unwinds double‐stranded DNA ahead 

• Critical role in replication, recombination and repair

27Review of helicase: Lohman et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2008

Repair helicase

Helicases are involved in repairing damaged DNA

XPD helicase atomic structure

TFIIHXPB XPD

XPD helicase atomic structure

RPA

Fan et al., Cell (2008) Nucleotide excision repair

M i i di f DNA h i i ( d f )

Hairpin AssayMonitor unwinding of a DNA hairpin (under constant force)

Change (Δx) in tether extension reveals unwinding activity Δx

Qi et al., eLife 2013

XPD Stepping Dynamics

5 10

11 12 1314 AT

TAAT

23

47

8

9

106 ATGCTACG

DNA sequence affects reversals

12 CG

GCGC

Time (s)

Average step size is 1‐bp Backstepping is frequent

Step‐finding: Kerssemakers et al., Nature (2006)

Step size (bp)

Qi et al. eLife (2013)

Helicase mechanism

3’5’Conclusions

1 XPD unwinds 1 bp at a time

3’

ATP

ADP + P

1. XPD unwinds 1 bp at a time2. Unwinds & slips DNA repetitively3. Stalling & backstepping related to DNA 

sequence

5’

3 ADP + Pi

New model

1. Helicase unwinds by “passive mechanism”2. Repetitive mechanism related to role in repair

31

Fishing... in the dark

32

“Wouldn’t it be nice to see what’s on the fishing line?”

Single‐molecule fluorescence

It is possible to see light from a single molecule!It is possible to measure distances with pairs of fluorescent molecules

240

280

FRET

120

160

200

240

Phot

ons

0

40

80

05

1015

2025

510

1520

25 X DataY axis

“Spectroscopic ruler”

Courtesy of Paul Selvin

X Dis

Roy, Hohng & Ha, Nat. Meth. (2008)

Fluorescence & Trap

PhotoBead 1 Bead 2

ons/s

1 μmFluor.

34Comstock et al., Nat. Meth. (2011)

UvrD 2B‐domain orientation

Closed“Off” – stalled?

Open“ON” – moving?

~160°2B 2B160

rotation

High FRETLow FRET

2B

UvrD helicase atomic structure

Conformation switches function?Crystal structure: Closed at junction (presumed unwinding).Biochemistry and single molecule:  Open during motion.  Closed at junction → stalled.

FRET+

Trap

35Jia, Lohman et al., JMB 2011.  Park, Ha et al., Cell 2010.  Lee and Yang, Cell 2006.  Singleton et al., Ann. Rev. Biochem. 2007.

Measuring UvrD conformation

1215182124

ound

 (bp)

-30369

12

DNA Unw

o

0.5

1 IDonorIAcceptor

ons (kHz)

Dual‐labeled UvrD

0

1

Photo

cy

0.5

RET Efficien

Open

Closed

48 49 50 51 52 53 54 55 560

Time (s)

FR

36

Open

Comstock et al., in preparation

Conformation & directionality

Correlation between:conformation (closed/open) & directionality (unwinding/annealing)

ity (b

p/s)

Veloci

FRET

Comstock et al., in preparation

Strand reversal?Conclusions

1. Closed when unwinding hairpin2 O h li

5’3’

2. Open when reannealing

New model

ClosedOpen

5’

1. 2B domain remains anchored to dsDNA2. Motor domains switch strands*

5’

3’l dClosed

Open

38*Dessinges, et. al., PNAS 2004.  

OUTLOOKPart IV:

OUTLOOK

Biophysicists wear many hats...

Molecular biology

Optics

Nature of researchl b ld

Data collection and analysis

Experimentalist – build instrumentsBiologist – develop the biological systemTheorist – model the data

Take home messageHey – You put physics into my biology!No – You put biology into my physics!

BIOLOGY PHYSICSQuantification of Biological Systems

TAKE‐HOME MESSAGE

41

These advances present new directions for BOTH biology and physics. 

AcknowledgementsAcknowledgements

XPD XPD HelicaseHelicase steppingsteppingZhi Qi†Zhi Qi†XPD XPD HelicaseHelicase steppingsteppingZhi Qi†Zhi Qi†Zhi Qi†Zhi Qi†Maria Spies & Robert PughMaria Spies & Robert Pugh(Univ. of Iowa)(Univ. of Iowa)

Zhi Qi†Zhi Qi†Maria Spies & Robert PughMaria Spies & Robert Pugh(Univ. of Iowa)(Univ. of Iowa)

UvrDUvrD trap & fluorescencetrap & fluorescence::Matt Comstock*Matt Comstock*UvrDUvrD trap & fluorescencetrap & fluorescence::Matt Comstock*Matt Comstock*Kevin WhitleyKevin WhitleyTaekjip Ha (Univ. of Illinois)Taekjip Ha (Univ. of Illinois)Tim Lohman &Tim Lohman & HaifengHaifeng JiaJia

Kevin WhitleyKevin WhitleyTaekjip Ha (Univ. of Illinois)Taekjip Ha (Univ. of Illinois)Tim Lohman &Tim Lohman & HaifengHaifeng JiaJia Now at:Now at:Tim Lohman & Tim Lohman & HaifengHaifeng JiaJia(Washington Univ.)(Washington Univ.)Tim Lohman & Tim Lohman & HaifengHaifeng JiaJia(Washington Univ.)(Washington Univ.) † † Columbia Univ.Columbia Univ.

* Michigan State Univ.* Michigan State Univ.

Funding:Funding: