Rights / License: Research Collection In Copyright - Non ...22360/eth-22360-02.pdfInhaltsverzeichnis 7 5.2 TheoriederSIIS-Kreuzrelaxation 130 5.2.1 Sprungmodelle 131 5.2.2 Diffusionsmodelle

Research Collection

Doctoral Thesis

Untersuchungen zur Dynamik von Peptiden und Proteinen mitNMR-Relaxationsmethoden

Author(s): Ernst, Matthias

Publication Date: 1993

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Diss.ETH Nr. 10390

Untersuchungen zur Dynamik von Peptiden und

Proteinen mit NMR-Relaxationsmethoden

ABHANDLUNG

zur Erlangung des Titels

Doktor der Naturwissenschaften

der

EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE

ZÜRICH

Vorgelegt von

MATTHIAS CHRISTOPH ERNST

Diplom Chemiker ETH

geboren am 2. Februar 1964

aus Freiburg im Breisgau (Deutschland)

Angenommen auf Antrag von

Prof. Dr. Richard R. Ernst, Referent

Prof. Dr. Christian Griesinger, Korreferent

Zürich, 1993

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Inhaltsverzeichnis 5

Inhaltsverzeichnis


Abkürzungen und Symbole 9

Zusammenfassung 13

Abstract 15

Einleitung 17

Struktur und Dynamik von Molekülen 17

Antamanid 21

Relaxation in Spinsystemen 25

Einleitung 25

Allgemeine Redfield-Theorie 27

Operatordarstellung des Relaxationssuperoperators 29

Korrelationsfunktionen starrer Moleküle 33

Korrelationsfunktionen dynamischer Moleküle 38

Berechnung der Winkelkorrelationsfunktion 44

1 Ungehinderte rotatorische Diffusion 46

2 Beschränkte rotatorische Diffusion 47

3 Sprungmodelle 49

„Normal Mode" Darstellung der Relaxation 55

Relaxation im rotierenden Koordinatensystem 60

Struktur und Dynamik von Antamanid in Dioxan 63

Einleitung 63

Zuordnung der chemischen Verschiebungen 66

Messung von Struktur- und Dynamikdaten in Dioxan 68

6

3.3.1 ROE-Aufbauraten 68

3.3.2 NH-Tlp-Relaxationszeiten 73

3.3.3 Kohlenstoff TrRelaxationszeiten 76

3.3.4 3J(NH-Ha)-Kopplungskonstanten 77

3.4 Strukturberechnung in Dioxan 78

3.4.1 Implementierung der MEDUSA-Prozedur 78

3.4.2 Charakterisierung des Konformationsensembles 82

3.4.3 Charakterisierung der Konformationspaare 87

3.5 Diskussion der Ergebnisse 90

4 Bewegung von Phenylalaninseitenketten 93

4.1 Einleitung 93

4.2 Einfluß der internen Bewegung auf die Relaxation 94

4.3 Bewegungsmodelle für die Phenylalaninseitenkette 100

4.3.1 Bewegungsmodell für das Ca-Atom 101

4.3.2 Bewegungsmodelle für Cß und C^ 101

4.3.3 Bewegungsmodelle für C5 und Ce 102

4.4 Messung der Relaxationsdaten 104

4.4.1 Kohlenstoff TrZeiten 104

4.4.2 Kern-Overhauser-Effekt (NOE) 105

4.4.3 Heteronukleare kreuzkorrelierte Kreuzrelaxation 106

4.5 Simulation der Energiepotentiale 111

4.6 Anpassung der Bewegungsmodelle an die Meßwerte 114


5 Kreuzkorrelierte SIIS-Kreuzrelaxation 129

5.1 Einleitung 129


5.2 Theorie der SIIS-Kreuzrelaxation 130

5.2.1 Sprungmodelle 131

5.2.2 Diffusionsmodelle 133

5.2.3 Beschreibung im rotierenden Koordinatensystem 135

5.2.4 SIIS-Kreuzrelaxation in Methylgruppen 137

5.3 Berechnung der Kreuzrelaxationsratenkonstante 137

5.4 Numerische Simulation des AMX-Spinsystems 144

5.5 Experimentelle Realisierung der SIIS-Kreuzrelaxation 148

5.6 Experimentelle Ergebnisse 151

5.6.1 Messungen an Antamanid 151

5.6.2 Messungen an Ubiquitin 158


6 Zusammenfassung und Ausblick 163

7 Anhang 165

7.1 Meßwerte in Dioxan 165

7.2 Implementierung der MEDUSA-Prozedur 169

7.3 Spektrale Leistungsdichtefunktionen 183

7.4 Relaxationszeiten von Antamanid in Chloroform 189

8 Literaturverzeichnis 195

Danksagungen 203

Lebenslauf 207

8


Abkürzungen und Symbole

ABNR

ADC

CHARMM

COSY

CSA

DC

DIPSI

DQF

DQF-COSY

EXSY

HMBC

HMQC

INEPT

MD

MEDUSA

NMR

NOE

NOESY

rf

RIS

ROE

ROESY

TOCSY

TPPI

adapted-base Newton-Raphson algorithm

Anti Distance Constraint

Chemistry at Harvard Macromolecular Mechanics (ein

MD-Programm)

Correlation Spectroscopy

Chemical Shielding Anisotropy

Distance Constraint

Decoupling in the Presence of Scalar Interaction

Double Quantum Filter

Double Quantum Filtered COSY

Exchange Spectroscopy

Heteronuclear Multiple Bond Correlation Spectros¬

copy

Heteronuclear Multiple Quantum Correlation Spec¬

troscopy

Insensitive Nuclei Enhanced by Polarisation Transfer

Molecular Dynamics

Multiconformational Evaluation of Distance Informa¬

tion Using a Stochastically Constrained Minimization

Algorithm

Nuclear Magnetic Resonance

Nuclear Overhauser Effect

Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy

Radio Frequency

Rotational Isomeric State

Rotating Frame Overhauser Effect

Rotating Frame Overhauser Effect Spectroscopy

Total Correlation Spectroscopy

Time Proportional Phase Incrementation

10

A Eigenoperator des Hamiltonsuperoperators

B0 statisches Magnetfeld

Bj rf-Feldstärke

B-l Basisoperator

C(t) Korrelationsfunktion

dn m(ß(0) reduziertes Wigner Rotationsmatrixelement

D Diffusionskonstante des „rotational tumbling"

Dt Diffusionskonstante der ersten internen Bewegung

D2 Diffusionskonstante der zweiten internen Bewegung

DSE Diffusionskonstante nach Stokes-Einstein

Dn TO(ß(0) Wigner Rotationsmatrixelement des Ranges l

E Energie

h Plancksches Wirkungsquantum

h Plancksches Wirkungsquantum geteilt durch 2ji

H Hamiltonsuperoperator

H(0 Hamiltonoperator

H (t) Hamiltonoperator in der Wechselwirkungsdarstellung

Hm(t) Hamiltonoperator des gesamten Systems

HQ statischer Teil des Hamiltonoperators

Hj(f) zeitabhängiger Teil des Hamiltonoperators

/ skalare J-Kopplungskonstante

/(to) spektrale Leistungsdichtefunktion

k Boltzmannkonstante

K Matrix der Übergangswahrscheinlichkeiten

p. Gleichgewichtspopulation i

P Matrix der bedingten Wahrscheinlichkeiten

P(x(t), t\ x(0)) Bedingte Wahrscheinlichkeit das System zum Zeit¬

punkt t im Zustand x(t) zu finden, wenn das Systemzum Zeitpunkt Null im Zustand x(0) war.

Pfic) Legendre-Polynom vom Grad /


Q Gütefaktor

Qm modifizierter Gütefaktor

rKi Abstand der beiden Protonen k und /

R hydrodynamischer Radius eines Moleküls

t Zeit

T Temperatur

Tl longitudinale Relaxationszeit

T1P longitudinale Relaxationszeit im rotierenden Koordi¬

natensystem

T2 transversale Relaxationszeit

Tln, Spintensoroperator des Ranges / und der magneti¬schen Quantenzahl m

wi Übergangswahrscheinlichkeit

Ya» Kugelflächenfunktion des Ranges / und der magneti¬schen Quantenzahl m

a Rotationswinkel einer internen Bewegung

a(0 Eulerwinkel

ß Bindungswinkel in der Aminosäureseitenkette

ß(') Eulerwinkel

Y gyromagnetisches Verhältnis

w Eulerwinkel

f RelaxationssuperoperatorrB B

Kreuzrelaxationsratenkonstante zwischen den beidenDj, D2

Operatoren B2 und Bx8 chemische Verschiebung

8m,n

Kronecker-Delta

A Laplaceoperator

Tl Viskosität

e Neigungswinkel der Spinlockachse

^0 magnetische Feldkonstante im Vakuum

%*m reelle zeitabhängige Funktion der Wechselwirkung \l

12

o.. Hauptachsenwert des chemischen Verschiebungsten¬sors

a(t) Dichteoperator

oeq Gleichgewichtsdichteoperator

oT(t) Dichteoperator in der Wechselwirkungsdarstellung

x Korrelationszeit

t Korrelationszeit des „rotational tumbling"

x effektive Korrelationszeite

x Korrelationszeit eines Austauschprozesses

t .Korrelationszeit einer internen Bewegung

t Mischzeitm

cpQ Restriktionswinkel der beschränkten Diffusion

((>. dihedraler Winkel im Peptidgerüst

<&'(*) Satz von Eulerwinkeln, die eine Orientierung des Ten¬

sors im i-ten internen Koordinatensystem beschreiben

<J>lab(£) Satz von Eulerwinkeln, welche die Orientierung eines

Tensors im Laborkoordinatensystem beschreiben

Omo1 Satz von Eulerwinkeln, welche die Orientierung eines

Tensors im molekülfesten System beschreiben

X erster Torsionswinkel der Seitenkette in Aminosäuren

X2 zweiter Torsionswinkel der Seitenkette in Aminosäu¬

ren

¥(Q, t) Wahrscheinlichkeitsfunktion für die Orientierungen Q,

(o Kreisfrequenz

u>0 Resonanzfrequenz

weff effektive Resonanzfrequenz im gekippten rotierenden

Koordinatensystem

Q(t) Satz von Eulerwinkeln, welche die Transformation

zwischen zwei Koordinatensystemen beschreiben

Q,l(t) Satz von Eulerwinkeln, welche die Transformation

vom (i-l)-ten in das i-te interne Koordinatensystembeschreiben

Zusammenfassung 13

Zusammenfassung

Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit der Untersuchung interner

Bewegungen in Peptiden und Proteinen mit Hilfe von NMR-Relaxa¬

tionsmethoden.

Die Dynamik des Peptidgerüstes von Antamanid in Dioxan wurde

mit Kernresonanzmethoden untersucht und mit dem bekannten Ver¬

halten in Chloroform verglichen. Basierend auf dem MEDUSA Such¬

algorithmus wurde eine große Anzahl Konformationen erzeugt, die

auf den experimentellen Abstände aus ROESY-Spektren beruhen.

Diese Konformationen wurden zu Paaren kombiniert, welche die

experimentellen Daten deutlich besser beschreiben als die Einzel¬

strukturen. Die Bewertungsfunktion für die Paarbildung wurde

gegenüber dem ursprünglichen MEDUSA Ansatz modifiziert und

verbessert, so daß eine Bewertung der Signifikanz der einzelnen

Paare möglich ist. Die jeweils besten Strukturpaare weisen in beiden

Lösungsmitteln ähnliche Eigenschaften auf. In Dioxan wurde eine

schnellere Interkonversion des Peptidgerüstes (x «10 |i.s) als in

Chloroform gefunden.

Die Seitenkettenbewegung der vier Phenylalaninreste in Antamanid

wurde mit Hilfe von NMR-Relaxationsmessungen analysiert. Ver¬

schiedene Bewegungsmodelle mit zwei Freiheitsgraden wurden an

eine große Zahl von Relaxationsdaten numerisch angepaßt, um

damit die Unterscheidbarkeit dieser Modelle zu testen. Hierbei

zeigte sich, daß nicht für alle vier Phenylalaninreste eine signifikante

Unterscheidung der untersuchten Modelle möglich war. Nur zwei

der vier Reste erlaubten eine eindeutige Aussage über das beste

Modell. Die Bewegung der Phenylringe wird in Antamanid am

besten durch 180" Sprünge mit Korrelationszeiten im Bereich von

x2 = 50-200 ps beschrieben, während die Bewegung um die erste Bin¬

dung am besten durch eine beschränkte rotatorische Bewegung um

14

einen Winkelbereich von ca. ±50° mit einer Korrelationszeit Xj ~ 500-

1500 ps beschrieben wird.

Zur Untersuchung von Seitenkettenbewegungen wird ein neues

Experiment (SIIS-Kreuzrelaxation) vorgeschlagen, das die Kreuzrela¬

xation zwischen dem Sz-Einspin- und dem 4S2Il2I2z-Dreispintermbenützt. Die SIIS-Kreuzrelaxation beruht auf der Kreuzkorrelation

der beiden heteronuklearen dipolaren Kopplungen in einer CH2-

Gruppe. Sie erlaubt für einen bestimmten Bereich von Korrelations¬

zeiten durch eine einfache Analyse des Vorzeichens von Kreuzpeaksdie Unterscheidung beschränkter und unbeschränkter Bewegungen

um die erste Bindung der Seitenkette in Aminosäuren. Nur für eine

freie Bewegung um die C-C-Bindung kann die Kreuzrelaxationsra¬

tenkonstante positiv werden und so zu einem negativen Kreuzpeakin einem 2D-Spektrum führen.

Abstract 15

Abstract

This thesis is concerned with the analysis of internal motional proc-

esses in peptides and proteins based on NMR relaxation methods.

The dynamic of the peptide backbone of antamanide in dioxane is

investigated and compared with the known dynamic behaviour in

chloroforme. Based on distances derived from ROESY spectra, a

large number of conformations were generated by applying the

MEDUSA search algorithm. In order to improve the agreement with

the experimental data, pairs of structures were formed by optimizingthe populations in a normalized quality function. This function was

modified and improved to allow an estimation of the significance of

the differences in the generated ensemble of pair structures. In com-

parison to the behaviour in Chloroform we found similar characteris-

tics of the best pair structures in dioxane but the correlation time of

the exchange process (x « 10 jis) is faster than in Chloroform.

The side-chain motion of the Phenylalanine residues in antamanide

has been investigated, modelling the internal motion with two

degrees of freedom. Several physical modeis have been fitted to a

large number of relaxation data. The differences between the physi¬cal modeis were not always significant and only two of the four resi¬

dues allowed an unambiguous selection of one of the modeis. For the

other two residues no final conclusions about the type of internal

motion could be drawn. The motion of the phenyl ring is best

described by a two site jump model with a correlation time of x2 =»

50-200 ps and a spacing of the two positions by 180°. The motion

about the first side-chain bond in Phenylalanine was found to be a

restricted rotational diffusion with an restriction angle of approxi-

mately ±50° and a correlation time of xa * 500-1500 ps.

A new experiment (named SÜS cross relaxation) for the investigationof side-chain motion is proposed, which is based on the cross rela¬

xation from Sz polarization to 4SzIlzI2z three spin order. It is based

16

on the cross correlation between the two heteronuclear dipolar inter-

actions in a CH2 group. The SIIS cross relaxation experiment allow s

to distinguish between a restricted and an unrestricted internal rota-

tion about the first bond in amino acid side chains based on the signof the cross peak in a 2D correlation spectrum. Only for an unre¬

stricted type of motion the cross relaxation rate constant gets positivefor a certain ränge of internal correlation times leading to a negative

cross peak in the spectrum.

Einleitung 17

1 Einleitung

1.1 Struktur und Dynamik von Molekülen

Die hochauflösende NMR-Spektroskopie in Flüssigkeiten [1,2] ent¬

wickelte sich in den vergangenen Jahren zu einer der wichtigsten

Methoden zur Bestimmung der dreidimensionalen Struktur von bio¬

logisch relevanten Molekülen [3]. Sie bietet damit zur Zeit die ein¬

zige Alternative und Ergänzung zur Strukturbestimmung mittels

Röntgenbeugung im Einkristall. Basierend auf Abständen zwischen

vielen Protonen, welche man durch die Auswertung von NOE-

(„nuclear Overhauser effect") und ROE-Spektren („rotating frame

Overhauser effect") erhalten kann, werden heute Moleküle bis zu

einer Masse von ca. 20.000 Dalton routinemäßig untersucht. Dies

entspricht einem Protein mit ungefähr 200 Aminosäuren und ist

damit für ein biologisch aktives Molekül klein. Die Limitierung der

Methode auf Moleküle dieser Größe ist charakteristisch für die

NMR-Spektroskopie. Aufgrund der Abnahme der transversalen

Relaxationszeit T2 mit zunehmender Größe der Moleküle, nimmt die

Linienbreite mit steigender molekularer Masse stark zu. Dies hat zur

Folge, daß die Auflösung und die Empfindlichkeit der Spektrenschlechter werden und gewisse Experimente aufgrund der Linien¬

breite nicht mehr möglich sind. Mit zunehmender Größe der Prote¬

ine nimmt häufig auch die Löslichkeit ab und führt so zu einer redu¬

zierten Empfindlichkeit. Große Proteine bilden teilweise schon bei

relativ geringen Konzentrationen Aggregate, und darüber hinaus ist

ihre Stabilität in Lösung ein weiteres Problem, welches eine aufwen¬

dige Probenvorbereitung erfordert [4].

Erst in letzter Zeit wird versucht, auch dynamische Eigenschaften

von biologisch interessanten Molekülen mit Hilfe der NMR-Spektro¬

skopie zu charakterisieren. Der Grund für dieses Interesse ist, daß

die biologische Aktivität einer Substanz häufig nicht nur mit der

18 Kapitel 1.1

Struktur des Moleküls in Lösung, sondern auch eng mit seinen dyna¬mischen Eigenschaften verbunden ist.

Eine volle experimentelle Charakterisierung aller dynamischen Pro¬

zesse in einem Molekül ist ein Ziel, das wahrscheinlich kaum jemalserreicht werden kann. Die Anzahl unabhängiger Parameter, die zu

einer vollständigen Beschreibung der Dynamik notwendig sind,

wird immer viel größer sein als die Zahl der meßbaren bewegungs¬

empfindlichen Größen. Daher muß man die Modelle zur Beschrei¬

bung der internen Bewegungen stark vereinfachen. Dies trifft auch

auf die NMR-Spektroskopie zu, obwohl sie für die Beobachtung vie¬

ler unterschiedlicher Zeitbereiche benutzt werden kann. Die Art der

Einwirkung eines dynamischen Prozesses auf die NMR-Spektrosko¬

pie ist von dessen Geschwindigkeitskonstanten abhängig:

- Sehr langsame Prozesse (z.B. Faltung der Proteine, Protonenaus¬

tausch, stark gehinderte Seitenkettenbewegungen) können durch

die Interkonversion mehrere diskreter Konformationen beschrie¬

ben werden. Diese Prozesse kann man entweder direkt durch die

Aufnahme zeitaufgelöster Spektren (x > 1 s), über Linienform-

effekte (lD-Austauschspektroskopie) oder durch 2D-EXSY-Spek-tren (x > 1 ms) messen.

- Prozesse im mittleren Zeitbereich (1 ms > x > los, z.B. Peptidkon-

formationsänderungen) können mittels Tx -Messungen beobachtet

werden, wenn eine Modulation der chemischen Verschiebung oder

J-Kopplung erfolgt.

- Prozesse im schnellen Zeitbereich (30 ps > x > 10 ns, z.B. „rotatio-

nal tumbling" des gesamten Moleküls, Seitenkettenbewegungen,

Konformationsänderungen) beeinflussen direkt die Relaxationsra¬

tenkonstanten über eine Modifikation der spektralen Leistungs¬

dichtefunktion. Daher können sie über eine direkte Messung von

Relaxationsratenkonstanten charakterisiert werden.

Struktur und Dynamik von Molekülen 19

- Lokale Schwingungen einzelner Atome oder Atomgruppen

(30 ps > x), die durch harmonische oder anharmonische Bewegun¬

gen beschrieben werden, führen zu gemittelten Parametern (z.B.

Bindungslängen, Bindungswinkeln).

Eine theoretische Beschreibung des Einflusses von internen Bewe¬

gungen auf die Korrelationsfunktion und damit auf die Relaxation

wurde zuerst von Woessner [5] formuliert. Dieser betrachtete die

Relaxation der Protonen in einer rotierenden Methylgruppe, die an

einem großen Molekül befestigt ist, für die Modelle einer freien rota¬

torischen Diffusion und eines Dreisprungmodells unter der

Annahme einer isotropen Bewegung des gesamten Moleküls. Ausge¬

hend von diesen ersten Berechnungen wurden immer komplexere

physikalische Modelle für interne Bewegungen formuliert und

berechnet [6,7] und auf axialsymmetrische und asymmetrischen Dif¬

fusionstensoren ausgedehnt.

Ein anderes Vorgehen für die Charakterisierung der internen Bewe¬

gung wurde von Lipari und Szabo [8,9] vorgeschlagen. Ihre Beschrei¬

bung der internen Dynamik, die unter dem Namen „model free

approach" bekannt wurde, geht von einer allgemeinen Beschreibungder internen Bewegung durch eine Korrelationszeit und einen Ord¬

nungsparameter aus. Die beiden Parameter sind nicht an ein physi¬kalisches Modell gebunden, sondern werden erst in einem zweiten

Schritt durch unterschiedliche Bewegungsmodelle interpretiert. Es

ist besonders geeignet, um viele ähnliche Bewegungen miteinander

zu vergleichen und die Zeitkonstante und räumliche Beschränkung

der Bewegung abzuschätzen. Dieses „Modell" findet heute mit ver¬

schiedenen Modifikationen und Erweiterungen hauptsächlich Ver¬

wendung für die Beschreibung der Bewegung des Peptidgerüstes in

Proteinen [10-14].

Die Analyse der Seitenkettenbewegung in Peptiden und Proteinen

wird häufig auf der Basis von gemittelten J-Kopplungen durchge¬führt. Ausgehend von einer kleinen Anzahl diskreter Konformatio-

20 Kapitel 1.1

nen, die durch einen unterschiedlichen Xj-Winkel charakterisiert

sind, berechnet man über die Karplusbeziehungen [15-17] die theore¬

tischen J-Kopplungen aus den dihedralen Winkeln der unterschiedli¬

chen Konformationen. Durch eine Optimierung der Populationenversucht man, den gemittelten Wert der theoretischen Kopplungenan die experimentellen J-Kopplungen anzupassen.

In der vorliegenden Arbeit werden in Kapitel 2 die Grundlagen der

Relaxationstheorie in Flüssigkeiten, soweit sie für die Beschreibungder Experimente benötigt werden, in einer einheitlichen Form

zusammengefaßt. Kapitel 3 behandelt die Dynamik des Peptidgerü¬stes von Antamanid in Dioxan. Diese wurde mit dem MEDUSA-

Ansatz untersucht, der so modifiziert wurde, daß eine Bewertungder Signifikanz der Ergebnisse möglich ist. Die Resultate werden mit

den Ergebnissen einer ähnlichen Untersuchung in Chloroform ver¬

glichen.

Die Dynamik der vier Phenylalaninseitenketten in Antamanid wird

in Kapitel 4 analysiert. Mit der Messung heteronuklearer Relaxati¬

onsdaten wird versucht, die Bewegung der Phenylalaninseitenketten

zu charakterisieren. Dieser Ansatz ist teilweise komplementär zu der

Charakterisierung der Seitenkettenbewegung über J-Kopplungskon-

stanten, da man bei der Relaxationsanalyse hauptsächlich Informa¬

tionen über die Geschwindigkeitskonstanten erhält und praktischkeine Information über Populationen. Mittels einfacher physikali¬scher Modelle für die Beschreibung der Seitenkettenbewegung sol¬

len die Grenzen einer solchen Charakterisierung untersucht werden.

Hierbei geht es vor allem um die Frage, ob man unterschiedliche

physikalische Modelle innerhalb der heute gegebenen Meßgenauig¬keit signifikant unterscheiden kann.

In Kapitel 5 wird die SIIS-Kreuzrelaxation zwischen einem S2-Ein-

spinterm und dem 4S27l272z-Dreispinterm als neues Experiment zur

Charakterisierung der Bewegung um den ersten Torsionswinkel in

der Seitenkette von Aminosäuren vorgeschlagen. Es erlaubt die

Antamanid 21

Unterscheidung von gehinderten und ungehinderten Bewegungenum den %1-Winkel. Dieses Experiment wurde ebenfalls an Antama¬

nid und an Ubiquitin, einem kleinen Protein, getestet.

1.2 Antamanid

Viele der in dieser Arbeit beschriebenen Methoden und Untersu¬

chungen wurden an Antamanid durchgeführt. Daher sollen kurz die

wichtigsten Eigenschaften dieser Substanz zusammengefaßt werden.

Antamanid ist ein zyklisches Dekapeptid mit der Aminosäurese¬

quenz âl^Pro-^roÂla^Phe-^he-^ro-^ro^Phe-^Phe (Abbil¬

dung 1.1), das zuerst aus dem giftigen grünen Knollenblätterpilz(„Amanita Phalloides") isoliert wurde. Es ist ein Antitoxin gegen die

im selben Pilz vorkommenden Phallotoxine und wurde zuerst von

Wieland et al. [18] im Jahre 1968 isoliert, charakterisiert und syntheti¬siert. Eine Übersicht über die Biochemie der verschiedenen Wirk-

H3Q PH3

H2C-CH2 CH2 CH2 CHh2c_CH2

H2Cv ,CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NN CH2N Pro7 Phe6 Phe5 Ala4 ,NCfHI Pro3 |CO CO

Proq m 1 o \

yC\$ Phe Pne Val Pr°N

H2c' N-CO-CH-NH-CO-CH-NH-CO-CH-NH-CO-HC' ^CH2H2C-C^ L2 CH2 L3 H^-Ck

Abbildung 1.1: Aminosäuresequenz und Strukturformel des zyklischen Deka-

peptids Antamanid. Die pseudo C2-Symmetrie des Moleküls ist in dieser Dar¬

stellung deutlich sichtbar.

22 Kapitel 1.2

Stoffe in diesen Pilzen findet man in einem Übersichtsartikel von

Wieland und Faulstich [19]. Verschiedenartig modifizierte Antama¬

nide wurden aus unterschiedlichen Lösungsmitteln kristallisiert und

die Struktur dieser Kristalle mittels Röntgenbeugung [20-29] ermit¬

telt. Hierbei liegt das Antamanid teilweise mit Alkalimetallionen

(Na+, Ca2+) komplexiert vor.

In Antamanid wurden bereits dynamische Prozesse auf unterschied¬

lichen Zeitskalen beobachtet. Aufgrund von eindimensionalen

NMR-Spektren [30-32] und späteren Ultraschallmessungen von

Burgermeister et al. [33,34] wurde schon früh vermutet, daß zwei

unterschiedliche relativ schnell austauschende Konformationen

(k ~ 106 s"1) von Antamanid in einer Dioxanlösung im Gleichgewicht

vorliegen. Diese Bewegung des Peptidgerüstes kann durch die

Zugabe von Alkalimetallionen (Na+ oder Ca2+) eingefroren werden

[33,34]. Mit Röntgenbeugungsmethoden kann man eine solche

Bewegung nicht untersuchen, da man hierbei das Vorkommen meh¬

rerer unterschiedlicher Konformationen im Kristall nicht von einer

zeitlichen Unordnung der einzelnen Moleküle unterscheiden kann

[35].

Erst mit Hilfe zweidimensionaler Kernresonanzmethoden gelang es

Kessler et al. [36-38] eine unabhängige Strukturbestimmung für

Antamanid in Chloroform durchzuführen. Hierbei zeigte sich, daß

die experimentellen Daten nur schlecht mit einer einzigen starren

Konformation vereinbar waren. Daher mußte zur Erklärung der

experimentellen Daten ein dynamisches Gleichgewicht zwischen

zwei bzw. vier Strukturen angenommen werden, die untereinander

relativ schnell austauschen und so gemittelte Strukturdaten ergeben.Dieses Problem der Dynamik des Peptidgerüstes wurde später von

Brüschweiler und Blackledge et al. [39,40] in Chloroform mit der

MEDUSA-Prozedur („multiconformational evaluation of distance

Information using a stochastically constrained minimization algo-

Antamanid 23

rithm") neu untersucht. Diese Methode wird in Kapitel 3 eingehendbeschrieben und auf Antamanid in Dioxan angewandt.

Neben diesem dynamischen Gleichgewicht des Peptidgerüstes fin¬

det man auch eine schnelle Bewegung der Prolinringe, die eine

Inversion des Fünfringes zeigen. Diese „Puckeringbewegung"wurde an Prolinringen in unterschiedlichen Peptiden gemessen und

theoretisch analysiert [41-50]. In nicht gehinderten freien Prolinen ist

diese Bewegung schnell [46,47], während sie in zyklischen Peptidenstark gehindert sein kann. Die Bewegung der vier Proline in Anta¬

manid wurde zuerst von Kessler et al. [51,52] und später von Mädi et

al. [53] mit Hilfe von J-Kopplungskonstanten und Relaxationsmes¬

sungen eingehend analysiert.

Als dritte wichtige Art der internen Bewegung in Antamanid sind

die Seitenkettenbewegungen zu erwähnen. Hier sind insbesondere

die vier Phenylalaninseitenketten interessant, die Rotationen sowohl

um den xx- als auch um den %2-Winkel zeigen können. Mit Hilfe

einer Analyse der 3J(Ha-Hß)-Kopplungen wurden die Populationender drei gestaffelten Konformationen für den dihedralen Winkel xx

von Kessler et al. [54] bestimmt. Diese Untersuchung ergab für die

beiden Phenylalaninreste 5 und 6 eine gleichmäßige Besetzung der

drei gestaffelten Konformationen mit jeweils pj = p2 = p3 = 0.33,

während die beiden anderen Phenylalanine (Phe9 und Phe10) eine

bevorzugte Besetzung des Rotameren Xj = -60° mit 91% bzw. 78%

aufwiesen. Das Rotamer Xj = 180° hatte hierbei eine Population von

14% bzw. 13%.

24 Kapitel 1.2

Relaxation in Spinsystemen 25

2 Relaxation in Spinsystemen

2.1 Einleitung

Die Zeitevolution eines Spinsystems ohne dissipative Prozesse wird

durch die Liouville-von Neumann Gleichung [1]

j-ta(t) = -i[H(t),a(t)} (2.1)

beschrieben. Für Intervalle mit einem zeitunabhängigen Hamilton¬

operator H(f0) erhält man als Lösung der Differentialgleichung [1]:

-i'H(fn)At + <H(fn)Afo(t0 + At) = e

'°-a(t0)-e

'"'(2.2)

Diese Lösung ist für alle Fälle gültig, in denen der Hamiltonoperatornach der Transformation in ein geeignetes Koordinatensystem eine

abschnittsweise konstante Form besitzt, wie dies z.B. bei der chemi¬

schen Verschiebung, der skalaren J-Kopplung oder rf-Feldern nach

der Transformation in ein rotierendes Koordinatensystem der Fall ist.

Betrachtet man dagegen Hamiltonoperatoren, die ein stochastisch

zeitabhängiges Verhalten zeigen, so kann dieser Ansatz nicht ver¬

wendet werden und eine analytische Integration der Liouville-von

Neumann Gleichung ist oft nicht möglich. Das Phänomen der Rela¬

xation in Spinsystemen wird durch Hamiltonoperatoren dieser Art

hervorgerufen.

Bereits 1946 führte Felix Bloch als erster Relaxationsphänomene in

seinen empirischen Bewegungsgleichungen zur Beschreibung des

makroskopischen Magnetisierungsvektors ein [55], indem er zwei

Relaxationszeiten, T1 für den Zerfall der longitudinalen und T2 für

den Zerfall der transversalen Komponenten, annahm. Die longitudi¬nale Komponente relaxiert in diesem Modell gegen den thermischen

Gleichgewichtswert, während die transversale Komponente gegen

Null geht. Eine Relaxationstheorie auf der Basis von Ubergangs-wahrscheinlichkeiten zwischen den Populationen wurde zuerst von

26 Kapitel 2.1

Bloembergen, Purcell und Pound [56] vorgeschlagen und späterunter dem Namen „BPP-Theorie" bekannt. Eine umfassende theore¬

tische Beschreibung der Relaxationsphänomene in Spinsystemen,die heute unter der Bezeichnung „Redfield-Theorie" breite Verwen¬

dung findet, wurde von Wangness, Bloch und Redfield [57-61] auf

der Basis der Dichteoperatortheorie entwickelt. Hierbei betrachtet

man ein abgeschlossenes System, das man in zwei offene Systeme,nämlich in das eigentliche Spinsystem und in die Umgebung aufteilt.

Unter der Annahme, daß die Störung des Spinsystems durch die

Umgebung klein ist, kann man mit einer Störungsrechnung 2. Ord¬

nung die Zeitevolution des Dichteoperators unter dem Einfluß der

Umgebung berechnen.

Neben der „Redfield-Theorie" wurden auch andere theoretischen

Modelle zur Beschreibung von Relaxationsphänomenen in Spinsy¬stemen entwickelt. Der wohl bekannteste alternative Ansatz beruht

auf der Theorie von Transportphänomenen in Flüssigkeiten nach

Mori [62]. Hierbei wird das Problem der Relaxation mit Hilfe von

Projektionsoperatoren formuliert, wodurch man einige kritische

Punkte der Redfield-Theorie vermeidet. Eine Zusammenfassung der

Beschreibung der Spinrelaxation im Formalismus der Mori-Theorie

findet man in einem Übersichtsartikel von Kivelson und Ogan [63].

Dieser Formalismus hat sich aber in der hochauflösenden NMR-

Spektroskopie nicht durchgesetzt.

Eine Übersicht über die Grundlagen der Relaxation in Spinsystemenfinden sich bereits bei Abragam [64], sowie in dem Buch von

McConnell [65]. Die neuere Literatur über Grundlagen und Anwen¬

dung der Relaxation in der Kernresonanzspektroskopie ist in einem

zweiteiligen Übersichtsartikel von Kowalewski [6,7] zusammenge¬

faßt.

Allgemeine Redfield-Theorie 27

2.2 Allgemeine Redfield-Theorie

Zur Beschreibung der Relaxation eines Spinsystems wird der

gesamte Hamiltonoperator H(0((r) in einen zeitunabhängigen Teil H0und in einen zeitabhängigen Teil Ha(f) zerlegt [64]:

H(o((t) = H0 + Ha(f) (2.3)

Der zeitabhängige Teil Ha(t), der aus mehreren unterschiedlichen

Wechselwirkungen bestehen kann, beschreibt stochastische Vor¬

gänge, die für die Relaxation verantwortlich sind. Dieser Teil des

Hamiltonoperators kann im Rahmen einer Störungstheorie 2. Ord¬

nung behandelt werden. Die Liouville-von Neumann Gleichung für

den gesamten Hamiltonoperator

ô(r) = -;[H(0,(t),o-(f)] (2.4)

wird mit dem statischen Teil H0 des Hamiltonoperators in eine

Wechselwirkungsdarstellung transformiert. Der Dichteoperatortransformiert in diese Wechselwirkungsdarstellung gemäß

oT(t) = e+'H°'.o(t).e-'H<>1, (2.5)

und der zeitabhängige Teil des Hamiltonoperators wird in dieser

Darstellung beschrieben durch

HT1(t) = e+tH°t.Hi(t).e-'Hot . (2.6)

Damit kann auch die Liouville-von Neumann Gleichung (2.4) in die¬

ser Wechselwirkungsdarstellung formuliert werden:

j-to\t) = -i H/o»«-'-* °

-J^ °)'ö(»

=-i[H[{t),o\t)\

28 Kapitel 2.2

In dieser Darstellung erhält man eine Beziehung, die den statischen

Teil H0 des Hamiltonoperators nicht mehr enthält. Diese Differenti¬

algleichung läßt sich formal integrieren, in die Ausgangsgleichungeinsetzen und man erhält nach erneutem Differenzieren folgendenAusdruck:

t

± oT(t) = -i [H[(0, oT(0)]-fdx • [H[(t), [H[(f - x), oT(0)] ] (2.8)

o

Unter Berücksichtigung der folgenden fünf Näherungen kann die

Gleichung (2.8) für die Beschreibung eines statistischen Ensembles

umgeschrieben und vereinfacht werden [64]:

- Hj(0 ist eine kleine Störung im Vergleich zum statischen Hamil¬

tonoperator H0. Dies hat zur Folge, daß man die Störungsrechnungin der zweiten Ordnung abbrechen darf und oT(0) auf der rechten

Seite durch oT(f) ersetzen kann.

- Hj(f) beschreibt einen stationären zeitsymmetrischen Prozeß. Dies

bedeutet, daß das Ensemblemittel zeitinvariant ist und sich nega¬

tive und positive Zeiten x gleich verhalten.

- Hß) beschreibt einen stochastischen, d.h. mittelwertsfreien Pro¬

zeß. Diese Annahme stellt keine Einschränkung der Allgemeinheitdar, da alle nicht verschwindenden Anteile des stochastischen

Hamiltonoperators Hx{t) in einem modifizierten statischen Hamil¬

tonoperator H0 berücksichtigt werden können.

- H[(t) und der Anfangsdichteoperator oT(0) sind nicht korreliert.

Dies bedeutet, daß man im ersten Term der Gleichung (2.8) die bei¬

den Operatoren unabhängig voneinander mittein kann und führt

dazu, daß der erste Term in Gleichung (2.8) Null wird.

- Die Integrationszeit t ist viel größer als die Korrelationszeit x des

stochastischen Hamiltonoperators. Man kann dann die obere Inte¬

grationsgrenze durch °o ersetzen.

Operatordarstellung des Relaxationssuperoperators 29

Wendet man alle diese Näherungen auf Gleichung (2.8) an, so erhält

man eine quantenmechanische Mastergleichung

j-t aT(t) = -jdx [H[(t\ [Hl(t - x), oT(0] ] . (2.9)

o

Hierbei deuten die Querstriche den Ensemblemittelwert an, und

aT(t) beschreibt nun das ganzes Spinensemble. Transformiert man

Gleichung (2.9) in das Laborsystem zurück, so erhält man:

oo

jiW) = -ilH0,W)]-\dxo

r -iHn(„

+iHnt r -iHn(t-x)„,

+iHn(t-T)

~~

-\1

x[e °HJt)e °,[e°K

>H1(t-x)e°

',a(t)-a0\\

= - i [H0, otF)] - f {W) - o0} (210)

Zur Vereinfachung der Notation wird in Zukunft der Querstrich

über dem Dichteoperator für das Ensemblemittel weggelassen, und

das Ensemblemittel für die Hamiltonoperatoren wird mit (...) ange¬

deutet.

2.3 Operatordarstellung des Relaxationssuperoperators

In vielen Fällen ist es sinnvoll, den Hamiltonoperator in einer Basis

von sphärischen Tensoroperatoren [1,64] zu entwickeln, da dadurch

die Berechnung der verschiedenen Relaxationswege vereinfacht

wird. Im allgemeinsten Fall kann man Hfl) schreiben als

i

Hx(0 = X^W • X X (-l)" • Y/!-m« • Ttt ' (2-11)V- l m = -l

wobei n der Index für die verschiedenen Wechselwirkungen, / der

Rang der Wechselwirkung und m die magnetische Quantenzahl ist.

30 Kapitel 2.3

Y,^(t) sind die sphärischen Kugelflächenfunktionen [66], die den

räumlichen Anteil des Hamiltonoperators der Wechselwirkung u

beschreiben. Der Spinanteil wird durch die Spintensoroperatoren

X^ [1] beschrieben. Für eine Wechselwirkung vom Rang l = 2 zwi¬

schen zwei Spins a und b sind diese gegeben als:

(a,b)_ J_

i2,0 -

g LJJaz Jbz la ifeJ

_(«, fc) 1 rT+T T T±l

T2,±l =T2-[/a--/bz+ Jaz-J6l

(a,b) 1rJ± t±-|

2(2.12)

|(,l)(t) enthält alle Konstanten für eine spezifische Wechselwirkung

fx und kann ebenfalls zeitabhängig sein. Für die dipolare Wechsel¬

wirkung zwischen zwei Spins a und b findet man folgenden Aus¬

druck:

1° (0 =-S.Ü».^ (213)

In diesem Fall erhält man nur dann eine zeitliche Abhängigkeit von

%(|1)(r), wenn sich der Abstand ra b(t) zwischen den beiden Atomker¬

nen aufgrund einer internen Bewegung ändert. Für die chemische

Verschiebungsanisotropie erhält man für einen allgemeinen Tensor

die folgende Beziehung:

|CSA(t) =£*

. (2o(«)_ („(«) + „(«))) (2.14)'(«) u 15 i 22

vxx yy

Setzt man die Zerlegung des Hamiltonoperators aus Gleichung (2.11)

in die Mastergleichung (2.10) im Laborsystem ein, so erhält man fol¬

genden Ausdruck für den Relaxationssuperoperator:

koordinatensystem:

Labor¬imRelaxationssuperoperatorsdesFormulierungendgültige

diemanerhältsoein,(2.15)GleichunginBeziehungdiesemanSetzt

(2.18)"

5>WV<=

C-«

t-,u»X—I+lH„T_(tl)

V

/"VA\-<.»=

^+iH0T_

(n)-iH0x

Ausdruck:folgendendenLaborsystemdas

inWechselwirkungsdarstellungdervon(2.15)Gleichungintoren

Tensoropera¬derTransformationdiefürmanerhältDamiterfüllen.

(2.17)=<op.Ap[H0,Ap]=H0Ap

Beziehungdiewelche

(216)5>wV=rff

schreiben

H0HamiltonsuperoperatorsdesEigenoperatorender}{ABasis

derinT;(^SpintensoroperatorendienunkannManist.bestimmt

Kugelflächenfunktionendiedurchderberechnen,Anteilräumlichen

denfürnurKorrelationsfunktionendiemußundherausnehmen

EnsemblemittelwertesstatistischendesBerechnungderaussieman

kannVoraussetzungdieserUntersind.zeitunabhängig^((l)(0alle

daßwerden,ausgegangendavonVereinfachungzursollweiterenIm

(2.15)>aj'e

1l,,m''

Le'J;,mee„1/,Ho(f-^)T^')+r/,H0(t-T)V,Ho't°V'H<>'

1,1'oH,H'm,m'

(-i)"'+ra>'(r(or(x)^.m(0)rf>)SS=fto)

31RelaxationssuperoperatorsdesOperatordarstellung

32 Kapitel 2.3

f(o) = X|(^>£ (-if^Za^/^.e^'-V'H,H m,m' p,p'

1,1'CO

x \dx <Y,%(0) • Y\^(x)) e"^'X [Af [A\„ o] ]

0 (2.19)

Um diese Beziehung zu vereinfachen, kann man das Integral in Glei¬

chung (2.19) durch die spektrale Leistungsdichtefunktion /(to) erset¬

zen, die als die Fouriertransformierte der Korrelationsfunktion C(x)

gemäß

oo

/(co) = J dx C(x) • e'mx (2.20)

—oo

definiert ist. Man erhält damit für das Integral aus Gleichung (2.19)

unter Vernachlässigung seines Imaginärteiles

)dx <Y;>)Y^:(x)> • e"">' = \ O«,,) . (2.21)

o

Der Imaginärteil des Integrals führt zu einer geringen Verschiebungder Energieniveaus und kann in einen modifizierten statischen

Hamiltonoperator H0 einbezogen werden [64]. Im Normalfall wird

dieser Term vernachlässigt. Außerdem werden alle schnell rotieren¬

den, nichtsäkularen Terme mit to * co, vernachlässigt.

Die Berechnung der spektralen Leistungsdichtefunktionen für ver¬

schiedene Wechselwirkungen und Bewegungsmodelle ist eines der

zentralen Probleme der Auswertung von NMR-Relaxationsdaten.

Falls die beiden Indizes n und u', welche die betrachteten Wechsel¬

wirkungen charakterisieren, gleich sind, spricht man von einer Auto¬

korrelationsfunktion, sind die beiden verschieden von einer Kreuz¬

korrelationsfunktion. In den folgenden beiden Kapiteln wird auf die


Berechnung dieser Korrelationsfunktionen und der spektralen Lei¬

stungsdichten näher eingegangen.

Der zweite wichtige Teil der Berechnung von Relaxationsratenkon¬

stanten ist die Auswertung der möglichen Kommutatoren in Glei¬

chung (2.19), die bestimmen, welche Frequenzen der spektralen

Leistungsdichtefunktion für einen spezifischen Relaxationsweg mit

welcher Gewichtung auftreten. Hierzu ist es oft von Vorteil, die

Kreuzrelaxation zwischen zwei Operatoren B1 und B2 zu betrachten,

da man dann die Kreuzrelaxationsratenkonstante rB> b2 aus dem

Relaxationssuperoperator f berechnen kann. Hierzu läßt man diesen

auf den Operator Ba wirken und projiziert den resultierenden Dich¬

teoperator auf B2:

triBl-fiB,)}r = —

B»,B* tr{B+-B2}

H, n' m, m' p, p'

1,00,00 , ,trjBlÂA^B,]]}

tr{B2-B2} (222)

Auf diesen wichtigen Ansatz zur Berechnung von Relaxationsraten¬

konstanten zwischen verschiedenen Operatortermen im Dichteope¬

rator wird in Kapitel 2.7 näher eingegangen.

2.4 Korrelationsfunktionen starrer Moleküle

Geht man von der Annahme eines starren Moleküls in Lösung aus,

so ist nur die Bewegung des gesamten Moleküls im Lösungsmittel,

das sogenannte „rotational tumbling", relaxationsaktiv. Man muß

also für diese Art der Bewegung die Korrelationsfunktion

CÄ!Ä(0 = <y$(*hb(')) • Yff(*tab(0))> (2.23)

34 Kapitel 2.4

berechnen. Hierbei bezeichnet <& (0 den Satz von zeitabhängigen

Eulerwinkeln, welche die Orientierung der betrachteten Wechselwir¬

kung u bzw. u' im Laborkoordinatensystem beschreiben. Eine Trans¬

formation der Kugelflächenfunktionen in das Hauptachsensystemdes Diffusionstensors, d.h. in ein mit dem Molekül mitrotierendes

Koordinatensystem, kann mit Hilfe der Wigner Rotationsmatrizen

beschrieben werden.

Yi m(*lab(0) = X D». «(Q(f)) Yi «(°mo1} (2-24)

n = -l

Die Elemente der Wigner Rotationsmatrizen kann man als drei auf¬

einanderfolgende Rotationen um verschiedene Achsen darstellen

^mm)) = e-ma(i).dlnmm)).em^ ,(2.25)

wobei Q(t) = (<x(0, ß(0,7(0) den expliziten Satz der verwendeten

zeitabhängigen Eulerwinkel darstellt, welche die Transformation des

Laborkoordinatensystems in das rotierende Koordinatensystembeschreiben. <E>mo1 sind die Eulerwinkel, welche die Orientierung der

betrachteten Wechselwirkung u relativ zum molekülfesten System

(d.h. im Hauptachsensystem des Diffusionstensors) beschreiben. Für

den Spezialfall einer isotropen Bewegung ist der Diffusionstensor

kugelsymmetrisch und das bewegte Koordinatensystem kann eine

beliebige fixe Orientierung zum Diffusionstensor einnehmen. Für

Systeme mit internen Bewegungen ist es in diesem Fall von Vorteil,

die z-Achse des bewegten Koordinatensystems parallel zur Achse

der ersten internen Bewegung zu wählen, da man dann eine Trans¬

formation weniger durchführen muß. Man erhält so einen neuen

Ausdruck für die Korrelationsfunktion, in dem die Kugelflächen¬

funktionen im molekülfesten System zeitunabhängig sind und daher

nicht mehr in den statistischen Ensemblemittelwert einbezogen wer¬

den müssen:


cüK'JXco = X<D'»>(t))D^'(Q(0))>n,n'

xY,(,l)f*mol')Y,('i,)*fOmo1^11, n

^ *

/', n' ^(2.26)

Den Ensemblemittelwert aus Gleichung (2.26) kann man berechnen,

indem man einen Ansatz mit bedingten Wahrscheinlichkeiten [71]

benutzt

(D'„;m(Q(0)D'„,m,(ß(0))) = JdQ(0)JdQ(0-P(Q(0,'|ß(0))

xP(Q(0)) • D|,;m(Q(0) • D<, m,(Q(0»(227)

und die bedingten Wahrscheinlichkeiten aus der zugrundeliegenden

Diffusionsgleichung berechnet. Hierbei ist P(Q(0> *| ß(0)) die

bedingte Wahrscheinlichkeit, eine Orientierung Q(r) zum Zeitpunktt zu finden, wenn man weiß, daß das System zum Zeitpunkt t = 0

die Orientierung Q(0) eingenommen hatte.

P(Q(0)) =

—, (2.28)

ist für den Fall einer isotropen Lösung eine Konstante, da alle mögli¬chen Anfangsorientierungen des Diffusionstensors gleich wahr¬

scheinlich sind und die Integration der Anfangswahrscheinlichkeitüber die Einheitskugel

2n ji 2jc

JdQ • P(Q(0)) = Jdajsinßdß jdy P(a(0), ß(0), 7(0)) = 1 (2.29)

a 0 0 0

immer eins sein muß. Die Differentialgleichung, welche den zeitli¬

chen und räumlichen Verlauf der Wahrscheinlichkeit einer bestimm¬

ten Orientierung Q beschreibt, ist gegeben durch

36 Kapitel 2.4

|-W(Q, *) = -?• AV(Q, 0 , (2.30)

wobei A der Laplaceoperator auf einer Kugeloberfläche und ¥(Q, 0

die Wahrscheinlichkeit ist, eine Orientierung Q des Moleküls zum

Zeitpunkt t zu finden. Die Diffusionskonstante DSE ist über die

Stokes-Einstein Beziehung für eine rotatorische Diffusion [64]

mit der Viskosität n und dem hydrodynamischen Radius R des Teil¬

chens verknüpft. In der Relaxationstheorie wird normalerweise nicht

die Stokessche Diffusionskonstante DSE für eine rotatorische Bewe¬

gung, sondern eine modifizierte Diffusionskonstante D verwendet,

wie sie in Gleichung (2.31) definiert wurde. Diese Beziehung kann

man benutzen, um den effektiv wirksamen Radius eines Teilchens

aus NMR-Relaxationsdaten zu bestimmen oder um den Einfluß von

Temperatur und Viskositätsänderungen auf die Relaxationsraten¬

konstanten zu berechnen.

Für den Fall einer isotropen Bewegung erhält man den folgendenAusdruck für die bedingte Wahrscheinlichkeit

P(Q(0,f|Q(0)) = X^r •Ofi(^DU(n(f)^'<,+1)D' '(232)

m,n8jC

der nur von der Diffusionskonstanten D, wie sie in Gleichung (2.31)

definiert wurde, und dem Rang / der Wechselwirkung u abhängt.

Liegt eine anisotrope Bewegung vor, so erhält man einen komplexe¬ren Ausdruck für die bedingte Wahrscheinlichkeit, da die drei

Hauptwerte des Diffusionstensors zu berücksichtigen sind. Dieser

Fall soll hier nicht diskutiert werden, da er im weiteren nicht benö¬

tigt wird. Eine ausführliche Darstellung der allgemeinen Ausdrücke

für anisotrope Bewegungen findet man in der Literatur [73]. Setzt


man Gleichung (2.28) und (2.32) in Gleichung (2.26) ein und berück¬

sichtigt die Orthogonalität der Wigner Rotationsmatrizen

87t2JdQ • D'n>) • D[, m,(Q) =

2?TT' «I. >*»>, m'K, n' • <2-33)

Q

so erhält man [73]

K'JLWQK,JPQ))> = ^r/(l+l)D\vK,m\n' (2-34)

für den Ensemblemittelwert der Wigner Rotationsmatrizen. Hierbei

bedeutet die Integration über Q eine Integration über alle möglichen

Orientierungen des Tensors, d.h.

2ji n In

\dQ = \da- fsinßdß jdy . (2.35)

ß 0 0 0

Berechnet man die gesamte Korrelationsfunktion unter Berücksichti¬

gung des Additionstheorems für die Kugelflächenfunktionen [66]

X n-W^-W = ^-^(cosO^^)) , (2.36)

m = -/

so erhält man das endgültige Ergebnis für ein Molekül, welches

einem isotropen „rotational tumbling" unterworfen ist:

r00,0Om_

y ! -/(H-l)Pt

^l,l',m,m'V>~

Zu 21 + 1n,n'

xY^(Omol)Y^'V(^mo% ,-8 ,8,'." '," v ' 1,1 n,n m,m

^-.e-'(' + 1)D'.P,(cos(e^-^))6,„8.

471 ''1,1 m, m

(2.37)

Hierbei ist P,(cos (9(|i)' ^*)) das Legendre-Polynom vom Grad /

und 0(tl)'(|1') ist der Winkel zwischen den Orientierungen der beiden

38 Kapitel 2.5

Wechselwirkungen im molekülfesten Koordinatensystem. Diese

Unabhängigkeit der Korrelationsfunktion von den beiden Indizes m

und m' ist ein allgemeines Merkmal für Korrelationsfunktion in iso¬

tropen Lösungen [73], d.h. mit einer Gleichverteilung aller mögli¬chen Anfangsorientierungen. Für den Fall / = 2 erhält man damit

für die spektrale Leistungsdichte die folgende Beziehung:

m:£>p) = ^ P2(cos (e<">- <*>)) -^^K,m> (2-38)

Ersetzt man in Gleichung (2.38) die Diffusionskonstante D durch die

Korrelationszeit x nachc

xc = 6-L , (2.39)

so erhält man die folgende Formulierung für die spektrale Leistungs¬dichtefunktion eines starren Moleküls in isotroper Lösung und unter

isotropem „rotational tumbling":

/&?>,) =

|£• P2(cos (8<*>- <*>))• i+2(JCT)A,m, (2.40)

2.5 Korrelationsfunktionen dynamischer Moleküle

Das Modell eines starren Moleküls ohne interne Freiheitsgrade, wie

es im vorherigen Kapitel behandelt wurde, ist eine stark vereinfachte

Beschreibung der Realität. Jedes Molekül in Lösung zeigt interne

Bewegungen auf sehr unterschiedlichen Zeitskalen, die sich ver¬

schieden auf die Kernresonanzspektroskopie auswirken. Schnelle

Bewegungen führen zu gemittelten molekularen Parametern (z.B.

Bindungslängen und Bindungswinkel), während langsame Bewe¬

gungen eine Mittelung der Relaxationsratenkonstanten zur Folgehaben. Nur falls die Korrelationszeit der internen Bewegung in der

selben Größenordnung wie die Korrelationszeit des „rotational tum-


bling" ist, erhält man eine direkte Beeinflussung der Relaxationsra¬

tenkonstanten durch die interne Bewegung.

Eine exakte Berechnung der Korrelationsfunktion für Moleküle mit

einer oder mehreren internen Bewegungen erfordert das Lösen einer

mehrdimensionalen Diffusionsgleichung, die sowohl das „rotational

tumbling" als auch die internen Freiheitsgrade gleichzeitigbeschreibt. Um diesen Ansatz zu verfolgen, muß man jedoch das

genaue Potential der internen Bewegungen kennen. Schon bei eini¬

gen wenigen internen Bewegungen wird die Lösung dieses Pro¬

blems komplex, da man zur Darstellung der Lösung mit nur einem

internen Freiheitsgrad bis zu 100 Basisfunktionen braucht [67], um

eine konvergente Lösung zu erhalten. Aufgrund dieser Anforderungstößt man jedoch bald an die Grenze des numerisch möglichen. Es

gibt verschiedene Ansätze, um dieses Problem zu umgehen und

Systeme mit mehreren internen Bewegungen trotzdem behandeln zu

können.

Nordio et al. [67-70] verfolgen für die Bewegung langer Seitenketten

den Ansatz der „Rotational Isomeric State" (RIS) Näherung, bei der

man die Bewegung der Seitenkette auf Sprünge zwischen diskreten

Konformationen einschränkt. Jede Bindung kann drei Konformatio¬

nen, nämlich „trans" (t), „gauche+" (g+) oder „gauche"" (g") einneh¬

men, und die gesamte Konformation der Seitenkette kann als eine

Sequenz dieser lokalen Konformationen beschrieben werden. Um

sterische Hinderung bestimmter Konformationen zu berücksichti¬

gen, wird für ungünstige Abfolgen von Konformationen und für zu

kurze Abstände zweier Kohlenstoffatome ein „Penalty"-Energieterm

eingeführt, der die Besetzung dieser Zustände erschwert. Anschlie¬

ßend kann man die Übergangswahrscheinlichkeiten zwischen den

einzelnen Zuständen berechnen und über die bedingten Wahrschein¬

lichkeiten die Korrelationsfunktionen für alle C-H dipolaren Vekto¬

ren des Systems berechnen.

40 Kapitel 2.5

In dieser Arbeit soll eine andere Näherung benutzt werden. Wir

gehen davon aus, daß die verschiedenen Bewegungen in der Seiten¬

kette und das „rotational tumbling" nicht miteinander korreliert sind

und man daher die Korrelationsfunktionen der einzelnen Bewegun¬

gen separieren und getrennt berechnen kann.

Um interne Bewegungen in die Berechnung von Korrelationsfunk¬

tionen einzubeziehen, muß man Gleichung (2.26) umschreiben, da

dann auch die Kugelflächenfunktionen im Hauptachsensystem des

Diffusionstensors zeitabhängig werden und man erhält die Bezie¬

hung:

£$;$(') - Y<D'n!mwt))Dln,m,M0))

-(V-) ifatnol, WVdfMOl,xY^(<I>m<"(0)Y//V< (3>mo'(0))>

(2.41)

Das Ensemblemittel bezieht hierbei nicht nur die Wigner Rotations¬

matrizen ein, sondern auch die Kugelflächenfunktionen im Molekül¬

koordinatensystem. Wir betrachten hier den Fall einer beweglichenSeitenkette, die an einem starren Körper befestigt ist und sich um alle

Seitenkette

Abbildung 2.1: Definition der verschiedenen Koordinatensysteme, welche zur

Beschreibung der internen Rotationen einer Seitenkette, die an ein großes Mole¬

kül gebunden ist, verwendet werden.


C-C-Bindungen bewegen kann. Um die Korrelationsfunktion berech¬

nen zu können, transformiert man die Kugelflächenfunktionen nach¬

einander in eine Serie geeigneter Koordinatensysteme, die folgender¬maßen definiert sind (Abbildung 2.1) [74,75]:

- Das Laborkoordinatensystem (lab) ist fest im Raum ausgerichtetmit der z-Achse in Richtung des magnetischen Feldes B0.

- Das molekülfeste System (mol) ist das Koordinatensystem, das

durch die Hauptachsen des Diffusionstensors definiert wird.

- Das erste interne Koordinatensystem (1) ist mit der z-Achse paral¬lel zur ersten internen Rotationsachse ausgerichtet, d.h. die

z-Achse ist entlang der ersten Bindung in der Seitenkette. Die

y-Achse steht senkrecht auf der ersten und der folgenden internen

Rotationsachse, d.h. sie steht senkrecht auf der Ebene, definiert

durch die erste und zweite Bindung in der Seitenkette.

- Das n-te intern Koordinatensystem (n) ist analog dazu definiert.

Die z-Achse ist entlang der n-ten Bindung in der Seitenkette, und

die y-Achse steht senkrecht auf der Ebene, die durch die n-te und

(n+l)-te Bindung aufgespannt wird.

Die Transformationen zwischen den verschiedenen Koordinatensy¬stemen bis in das zeitunabhängige Koordinatensystem am Ende der

Seitenkette kann wiederum analog zu Gleichung (2.39) durch

Wigner Rotationsmatrizen beschrieben werden:

42 Kapitel 2.5

« = -/

«J, , Hj.

x^^^ra-.-.-Di,;^ ^(0)

x Y,„(Of)

;>"f (2.42)

Hierbei ist die Bewegung im Koordinatensystem (F) zeitunabhängigund die aufeinanderfolgenden Transformationen werden durch den

Satz von Eulerwinkeln {ßmo'(0, ^(0, •••, ßF(0> beschrieben. Setzt

man diese Transformation der Koordinatensysteme für die Kugelflä¬chenfunktionen in die Korrelationsfunktion (2.41) ein, so erhält man

n, ttr n',n'vnr, ,nf n\, ,n'f

x<Dln'm(Qmol(t)).Dln,^mo'(0))

xDlnln(Q\t)).Dln,in,(Cl\0))....

xDln\ (a\t)).Dln,„,

(ßf(0))>"p "f -1 "p"f-i

. (2.43)

Hierbei muß der Ensemblemittelwert über sämtliche Wigner Rotati¬

onsmatrizen berechnet werden. Gleichung (2.43) ist allgemein gültig,

aber zur vereinfachten Berechnung dieser Korrelationsfunktion wer¬

den im weiteren folgende Näherungen gemacht:

- Die Gesamtbewegung des Moleküls ist isotrop.


- Das „rotational tumbling" des Moleküls und die internen Bewe¬

gungen sind nicht korreliert, d.h. man kann die Mittelung für die

Molekülbewegung und die internen Bewegungen separat ausfüh¬

ren.

- Die Geometrie der Seitenkette ist starr, d.h. alle Bindungswinkelund Bindungslängen sind konstant.

Bei der oben gegebenen Definition der Koordinatensysteme haben

die drei Eulerwinkel in den Wigner Rotationsmatrizen (2.25) fol¬

gende Bedeutung: a(0 beschreibt die Rotation um die z-Achse des

gewählten Koordinatensystems, ß(0 ist eine Rotation in der Ebene

der beiden Bindungen und führt die alte z-Achse in die neue z-Achse

über, d.h. ß(0 ist konstant und genau der Bindungswinkel zwischen

den beiden z-Achsen. y(t) ist eine Rotation um die neue z-Achse, die

aufgrund der Wahl der beiden Koordinatensysteme immer Null ist.

Setzt man diese Beziehungen in Gleichung (2.43) ein und berücksich¬

tigt, daß der Winkel ß(0 konstant und 7(0 immer Null ist, so erhält

man für die Korrelationsfunktion einen vereinfachten Ausdruck:

c»:ä<o = 27ê"/(;+1)%^'8",A1>v

x X I/Äl^-^Hl» •••» Wp M'-> —, W'r-

X<2,nSh)-dl3,np3)-----<pnF_1®r)

+ in.a(t) -i«'o,(0) +inraJt) -in'aJO)

x{e*

e*

•... • eF

eF

) (244)

Damit sind nur noch die Terme e'na zeitabhängig, welche die Rota¬

tion um die verschiedenen Bindungen beschreiben. Alle anderen

Terme sind nur durch die Geometrie der Seitenkette bestimmt und

44 Kapitel 2.6

damit konstant. Unter der Annahme daß auch die internen Rotatio¬

nen um die verschiedenen Bindungen unabhängig sind, kann man

die Bewegungen um die einzelnen Bindungen separat mittein und

hat damit die Berechnung der Gesamtkorrelationsfunktion auf die

Berechnung der einzelnen Winkelkorrelationsfunktionen

ClM{t) = {e+ma(l).e-m'm) (2.45)

reduziert. Man kann diese nun für unterschiedliche Bewegungsmo¬delle berechnen und die Ergebnisse dann in Gleichung (2.44) einset¬

zen und so die gesamte Korrelationsfunktion bzw. die spektralen

Leistungsdichtefunktion für ein bestimmtes Modell berechnen.

Im allgemeinen Fall sind diese Winkelkorrelationsfunktionen nicht

diagonal im Sinne der beiden Indizes m und m'. Für einige Modelle

können die Außerdiagonalelemente sogar komplex werden, d.h. die

partielle Korrelationsfunktion für m*m' ist nicht reell. Die gesamte

Korrelationsfunktion für die Orientierung der betrachteten Wechsel¬

wirkung ist jedoch immer reell, da es zu jeder der hier betrachteten

Teilkorrelationsfunktionen (2.45) das konjugiert komplexe Gegen¬stück gibt und daher die Imaginärteile in der Gesamtsumme wegfal¬len.

2.6 Berechnung der Winkelkorrelationsfunktion

Eine Möglichkeit zur Beschreibung der Seitenkettenbewegung sind

Sprungmodelle, bei denen man instantane Sprünge zwischen diskre¬

ten Gleichgewichtspositionen annimmt. Hierbei können die

Geschwindigkeitskonstanten der einzelnen Sprünge unterschiedlich

sein. Oft geht man davon aus, daß die diskreten Positionen mit

einem gleichen Winkelabstand über den Einheitskreis verteilt sind.

Die Komplexität der Modelle hängt davon ab, durch wieviele freie

Parameter das Modell charakterisiert wird, d.h. wieviele unabhän¬

gige Übergangswahrscheinlichkeiten und Populationen auftreten.


Diese Art von Modellen ist sinnvoll, wenn das Energiepotential für

die Rotation um die betrachtete Bindung ausgeprägte Minima zeigt.

Ein anderer Ansatz zur Beschreibung der Seitenkettenbewegung

geht von einer rotatorischen Diffusion um die Bindung aus, welche

in ihrem Winkelbereich beschränkt oder unbeschränkt sein kann.

Dieser Typ von Modellen ist dann sinnvoll, wenn der Potentialver¬

lauf in einem bestimmten Winkelbereich flach ist.

Eine Kombination der Modelle kann in manchen Fällen sinnvoll und

notwendig sein, um eine gute Beschreibung der Realität zu errei¬

chen. Man kann z.B. ein Sprungmodell mit einer rotatorischen Diffu¬

sion kombinieren, die auf einen kleinen Winkelbereich beschränkt

ist. Man erhält dann eine Bewegung mit kleiner Amplitude um die

Gleichgewichtslagen des Sprungmodells und eine zweite überla¬

gerte Bewegung zwischen den Gleichgewichtslagen.

In den folgenden drei Teilkapiteln sollen die Korrelationsfunktionen

für unterschiedliche Modelle berechnet werden. Der generelle

Ansatz zur Berechnung der Winkelkorrelationsfunktion geht für alle

betrachteten Modelle von den bedingten Wahrscheinlichkeiten [71]

aus. Unter Verwendung dieser Wahrscheinlichkeiten kann man die

Korrelationsfunktion in einer modifizierten Form schreiben

C.m-(0-jda(0)jda(0-e+,'ma(V'''"'a(0)

xP(a(0,t|a(0))-P(a(0))f {2M)

wobei man die Anfangswahrscheinlichkeit P(a(0)) im Falle der Dif¬

fusionsmodelle als gleichverteilt über den gesamten möglichen Win¬

kelbereich annimmt. Für Sprungmodelle nimmt man als Anfangs¬wahrscheinlichkeit im allgemeinen die Besetzung der einzelnen

Positionen nach der Boltzmannverteilung gemäß ihren Energien an.

Damit hat man das Problem wieder, wie bei der Berechnung der Kor¬

relationsfunktion für das „rotational tumbling", auf die Berechnungder bedingten Wahrscheinlichkeit P(a(0, *| a(0)) reduziert.

46 Kapitel 2.6

Bei isotropem „rotational tumbling" werden für die erste interne

Bewegung nur die Diagonalelemente der Winkelkorrelationsfunk¬

tion benötigt (siehe Gleichung (2.44)), da bereits aus der Berechnungdes „isotropen tumbling" ein 8

,für die erste Bewegung resultiert.

Für alle weiteren internen Bewegungen ist dies nicht mehr der Fall

und man muß sämtliche Elemente der Matrix von möglichen Korre¬

lationsfunktionen berücksichtigen, sofern sie für das untersuchte

Modell nicht diagonal werden. Dieser Punkt wird in der Literatur

häufig nicht korrekt dargestellt. Man findet in vielen Publikationen

nur den Diagonalteil dieser Winkelkorrelationsfunktionen mit einem

Faktor 8m ,und dem Argument, daß alle anderen Elemente Null

sind. Besonders für die Sprungmodelle trifft dies nicht zu und es ist

wichtig, bei mehr als einer internen Bewegung diese zusätzlichen

Elemente zu berücksichtigen.

2.6.1 Ungehinderte rotatorische Diffusion

Dieses Modell wurde zuerst von Woessner [5] und Hubbard [76,77]

zur Beschreibung der Bewegung einer Methylgruppe vorgeschlagenund berechnet. Zur Berechnung der bedingten Wahrscheinlichkeiten

für eine freie interne Rotation muß man die eindimensionale Diffusi¬

onsgleichung für die Wahrscheinlichkeit der Orientierung oc [78]

|-y (et, 0 = -5-^— ^V («, t) (2.47)öt

a -sin2a da?

unter der Annahme einer Deltafunktion

V(a, t = 0) = 8(a - a(0)) (2.48)

als Anfangsbedingung lösen. Hierbei ist W(a, 0 die Wahrscheinlich¬

keit eine Winkelorientierung a zum Zeitpunkt t zu finden. Nach der

Normierung erhält man als Lösung die gesuchte bedingte Wahr¬

scheinlichkeitsfunktion


««*,«>»-> .„,(-«»- (2.49)

mit

D'

D,. =

^-^. (2.50)

a sin a

Diese Lösung beschreibt eine normierte Gaussfunktion mit dem

Erwartungswert a(0) und der Standardabweichung j2Dtt. Setzt

man dieses Ergebnis in Gleichung (2.46) zur Berechnung der Korre¬

lationsfunktion ein, so erhält man als Endergebnis

C m<(0 = e'm2Di' 8,

(2.51)

einen einfachen exponentiellen Zerfall mit der Diffusionskonstanten

D; und dem Quadrat der magnetischen Quantenzahl m als Parame¬

ter [5].

2.6.2 Beschränkte rotatorische Diffusion

Dieses Modell beruht auf einer beschränkten Diffusion im Winkelbe¬

reich ±cp0 [78,79] um die Bindungsachse. Auch hier geht man vom

gleichen Ansatz wie in Kapitel 2.6.1 aus und berechnet die bedingteWahrscheinlichkeit durch Lösen der Differentialgleichung (2.47).

Zusätzlich zur Anfangsbedingung (2.48) muß man in diesem Fall

auch noch die Randbedingungen

al^^ = +,0= ^(a'^ = -,0

= 0 (152)

berücksichtigen, um eine Diffusion über den Winkelbereich hinaus

zu verhindern. Diese Randbedingung folgt aus dem 1. Fickschen

Gesetz. Dadurch kann man die Differentialgleichung (2.47) nicht

mehr geschlossen lösen, sondern man kann sie nur noch in der Form

48 Kapitel 2.6

einer unendlichen Summe schreiben. Die bedingte Wahrscheinlich¬

keit berechnet sich zu

P(cc(0,f|a(0))1 1 ^ fkn2% %

k = l[2%

(kn \ -t/T,xcos _(a(0 + 9o) ye

(2.53)

und kann zur Berechnung der Korrelationsfunktion verwendet wer¬

den. Setzt man dieses Ergebnis in Gleichung (2.46) ein und berechnet

die Winkelkorrelationsfunktion, so erhält man

Cm, m'C) = X Em,M ' Em',M ' e

-t/T,

it = 0

(2.54)

mit der Funktion

Em,0(%)sin(m(p0)

Jm,ft*0«Po> =

4

. .

Arn tot

sm(m<p0--=-) sm(mcp0 + -y)+ (-D

JcTt

m(P0-ykn

und den Korrelationszeiten

J?o_

(2.55)

(2.56)

Ein wichtiger Punkt im Unterschied zur freien Rotation um eine

interne Bindung ist, daß in Gleichung (2.54) im Gegensatz zu Glei¬

chung (2.51) die beiden Indizes der Korrelationsfunktion verschie¬

den sein können und kein Term 8m ,in die Gleichung eingeht. Dies

führt zu einer viel komplizierteren Berechnung der gesamten Korre-


lationsfunktion (2.44) und damit der spektralen Leistungsdichte¬funktion.

2.6.3 Sprungmodelle

Man kann Gleichung (2.46) für diskrete Populationen umschreiben

und erhält dann eine analoge Gleichung für die Berechnung der

Winkelkorrelationsfunktion:

„ w—i +ima -tm'a

Cm-(0 = Xe '-e ;-P(M;,0).P; (2.57)

Im weiteren bezeichnet P(...|...) stets eine bedingte Wahrscheinlich¬

keit und pt immer eine Gleichgewichtspopulation. Da man von

einem Modell mit diskreten Sprüngen zwischen verschiedenen

Zuständen ausgeht, können die bedingten Wahrscheinlichkeiten

durch eine Differentialgleichung erster Ordnung beschrieben wer¬

den. Die Matrixdarstellung der Differentialgleichung für die beding¬ten Wahrscheinlichkeiten ist

^P(0 = -K-P(0, (2.58)

wobei die einzelnen Matrixelemente von P(t) die bedingten Wahr¬

scheinlichkeiten

Pu](t) = P(j,t\i,0) (2.59)

repräsentieren und die Anfangsbedingung

p.,/°) = 8,>; (2-60)

ist. Die Matrix K enthält die Ratenkonstanten für Sprünge zwischen

zwei Positionen, d.h. K > 0 ist die Geschwindigkeitskonstante für

einen Sprung zwischen den Positionen / und i. Für die Geschwin¬

digkeitskonstanten gilt zusätzlich die folgende einschränkende

Bedingung

50 Kapitel 2.6

*mm = -XK-' (161)

n *m

die aus dem Erhaltungssatz für die Gesamtpopulation folgt. Die all¬

gemeine Lösung dieser Differentialgleichung ist eine Summe von

Exponentialfunktionen

P,,/0 = X^';)-e^f' (2-62)

k

wobei Xk die Eigenwerte der Matrix K sind und die Koeffizienten

c^J aus den Randbedingungen berechnet werden können. Das Dif¬

ferentialgleichungssystem (2.58) kann man bis zu einer Größe der

Matrix K von 3x3 allgemein analytisch lösen, bei größeren Syste¬

men muß man sich auf numerische Lösungen oder Spezialfällebeschränken. Es sollen hier nun einige einfache Fälle diskutiert wer¬

den, bei denen man zwei bzw. drei unterschiedliche Positionen hat

und die zu relativ einfachen Lösungen führen.

Für ein System mit nur zwei diskreten Positionen, die sich um einen

beliebigen Winkel Act unterscheiden, erhält man im allgemeinen Fall

mit zwei beliebigen Populationen

P(i, t\i,0) = p, + (1-p,) e~'/T' (2.63)

-t/r'

P(j*i,t\i,0) = p;(l-e ) ,(2.64)

wobei Pj und p2 die Populationen der zwei Positionen sind und die

Korrelationszeit x' der Kehrwert der Summe der beiden Sprungraten

w1 und w2 ist. Die Diagonalelemente der Winkelkorrelationsfunk¬

tion, d.h. die Funktionen C^ m(t), sind dann eine reelle Funktion der

relativen Orientierung der beiden möglichen Positionen und man

erhält für sie den folgenden Ausdruck:

C*>m(t) = 1 - 2 • (Pl - p\) (1 - cos (mAa)) • (1 - e"f/T') (2.65)


Hierbei ist px die Population der Position 1, p2 = 1 - p1 die Popula¬

tion der Position 2 und Act = a(l) - a(2) die Differenz des Rotations¬

winkels an den beiden Positionen. In diesem allgemeinen Fall sind

die Außerdiagonalelemente der Korrelationsfunktion komplex. Für

den einfachen Fall von zwei gleich besetzten Positionen (pl = p2 =

1/2), die um 180° Grad auseinanderliegen, erhält man immer noch

eine volle Matrix der Korrelationsfunktionen, die allerdings alle reell

sind:

Cm,m'(0= ^[l+(-Dm]-[l+(-Dm']+ä[i-(-m-[i-(-i)mw/T'4

. (2.66)

Die allgemeine Lösung des Dreisprungmodells, bei dem die Lage

aller Minima, sowie sämtliche Übergangswahrscheinlichkeiten frei

sind, ist prinzipiell analytisch möglich, aber aufwendig und besitzt

sieben Parameter. Daher soll hier nur ein vereinfachtes Modell

betrachtet werden, bei dem die Potentialkurve der Energie symme¬

trisch ist (Abb. 2.2) [80]. Damit reduziert sich die Anzahl der freien

Parameter auf drei Übergangswahrscheinlichkeiten wv u>2, w3 und

einen Winkel Q, der die Lage der beiden symmetrischen Minima

beschreibt. Die a priori Wahrscheinlichkeiten, d.h. die Gleichge¬

wichtspopulationen für die drei Positionen sind durch die Boltz-

mann-Verteilung gegeben. Die Geschwindigkeitskonstanten zwi¬

schen den Minima sind folgendermaßen definiert:

w(l -> 3) = w{\ -> 2) = w1

wQ. -> 1) = w(3 -> 1) = H72

«K3-»2) = u>(2->3) = w3 (267)

Mit Hilfe der Mikroreversibilität kann man die apriori Wahrschein¬

lichkeiten mit Hilfe der Geschwindigkeitskonstanten auszudrücken:

52 Kapitel 2.6

P\ =

W2

2w1 + w2' Pi = P3

Iw^ + w2(2.68)

Um die bedingten Wahrscheinlichkeiten für dieses System zu erhal¬

ten, muß man die Differentialgleichung für die Populationen lösen,

wobei diese durch die Matrix K aus Gleichung (2.58) charakterisiert

sind:

K =

2w, -w-,

-W1 W2 + H>3

-w.

-Wi

-», -H73 W2 + U>3

(2.69)

Unter Berücksichtigung der Anfangsbedingungen

P,,(0) = lundP,^,(0) = 0 (2.70)

kann man die neun bedingten Wahrscheinlichkeiten in einer lang¬

wierigen, aber nicht schwierigen Berechnung [80] für das in Abbil¬

dung 2.2 definierte System bestimmen

1

\2/

yi/

\ä/

E2 E12=E13 Ei E13 E3=E2 E23

<4

1 I I I *

t -ß 0 Q K

a

Abbildung 2.2: Potentialkurve für das symmetrische Dreisprungmodell mit der

Definition der verwendeten Parameter und Energien.


P(l,t|l,0) = p1 + 2p2(l-e"fAl)

P(2, r| 2,0) = P(3, t\ 3, 0) = p2 +1

(Pl • e"'"'1 - e^*2)

P(2, r| 1,0) = P(3, t\ 1,0) = p2 (1 - e"'Al)

P(l,t|2,0) = P(l,t|3,0) = p1(l-e",Al)

P(2, f| 3, 0) = P(3, t\ 2,0) = p2 +1 (p/"*1 - e"'/T2)

(2.71)

wobei die beiden Konstanten pa und p2 die a priori Wahrscheinlich¬

keiten sind, die in Gleichung (2.68) definiert wurden und die beiden

Korrelationszeiten

1und x, =

—^ (2.72)1 210J + w2

2 2it>3 + w.^

sind. Die bedingten Wahrscheinlichkeiten können nun wieder in

Gleichung (2.57) eingesetzt werden, und man erhält die Diagonalele¬mente der Winkelkorrelationsfunktion:

C>m(0= [ [2p2 (-1 )m cos (mV)+Pl]2

+ 2Plp2- [(-l)m-cos(mfl)] -e"f/Tl

+ 2p2-sin2(mu)-eT2 ]

(2.73)

Da im weiteren dieses Modell nur für die erste interne Bewegungverwendet wird, soll auf die Berechnung der Außerdiagonalele¬mente verzichtet werden. Aus dem allgemeinen Ergebnis sollen

einige Spezialfälle abgeleitet werden. Unter der Annahme, daß die

Barrieren zwischen den Positionen 1 und 3 sowie 1 und 2 unendlich

hoch sind, d.h. die Übergangswahrscheinlichkeit w2 und die Popula¬tion pj Null sind, erhält man das Resultat eines Zweisprungmodells

54 Kapitel 2.6

(Gleichung (2.65)) zwischen den beiden Positionen 2 und 3 für den

Spezialfall, daß beide Populationen gleich groß und gleich ein Halb

sind.

Macht man die Barriere zwischen den Positionen 2 und 3 groß, so

wird die Rate u?3 klein, und man erhält den Fall eines gehinderten

Dreisprungmodells, bei dem einer der drei möglichen Übergängeverboten ist. An der Korrelationsfunktion ändert sich in diesem Falle

nur die Definition der zweiten Korrelationszeit, da nur diese durch

die Rate w3 beeinflußt wird.

Ein anderer wichtiger Spezialfall ist das Dreisprungmodell mit glei¬chen Populationen und gleichen Raten, d.h.

V\ = Vi = P3 = 1/3 (2-74)

und

w1 = w2 = w3 = w. (2.75)

Hierbei erhält man eine Winkelkorrelationsfunktion, die nur noch

von zwei Parametern, der Sprungrate w und der Position Q der bei¬

den symmetrischen Positionen abhängig ist:

Ca (0 =

2

{? (-l)mcos(mf3) + ^}

2 m2 2 -y

-'/t,

+ (öK-l) -cos(mfl)] +^sin2(m^)}e1

J (2.76)

Man kann diese Beziehung weiter vereinfachen und erhält für eine

äquidistante Verteilung der drei Positionen (£2 = 120°):

C^(0 =

offl>0 + e-,/Tl(l-8m;0) (2.77)

Auch hier gibt es wieder Außerdiagonalelemente der Winkelkorrela¬

tionsfunktion für m±m'. Diese werden im weiteren nicht benötigt


und sollen daher nicht berechnet werden. Man findet sie in der Lite¬

ratur [72].

2.7 „Normal Mode" Darstellung der Relaxation

GrundsätzUch kann man die Relaxation direkt auf der Basis von

Gleichung (2.10) berechnen und die Differentialgleichung zur

Beschreibung der Zeitevolution für alle Elemente des Dichteopera¬tors in einer beliebigen Basis lösen. Betrachtet man nur longitudinale

Magnetisierung, so kann man sich auf die Diagonalelemente des

Dichteoperators in der Eigenbasis des Hamiltonoperators beschrän¬

ken und so die Größe des Systems stark reduzieren. Für die physika¬lische Intuition ist es jedoch sehr oft besser, den Dichteoperator in

einer Basis von symmetrieangepaßten Basisoperatoren [73] zu ent¬

wickeln, da diese in vielen Fällen direkt mit beobachtbaren Größen

in Beziehung gebracht werden können und zum Beispiel die Rela¬

xation einzelner Multiplettlinien im Spektrum beschreiben. Diese

Basisoperatoren sollten orthogonal sein im Sinne der Beziehung

Tr{Bl-Bn} =dmn-const . (2.78)

Die Wahl der Basisoperatoren ist ähnlich zu der Zerlegung des Dich¬

teoperators in Produktoperatoren [1], aber die Normierung der Ope¬ratoren ist in den beiden Ansätzen häufig unterschiedlich. Um eine

symmetrische Relaxationsmatrix zu erhalten, d.h. damit die Relaxati¬

onsratenkonstanten rB B und TB B gleich groß sind, genügt es,

daß alle Basisoperatoren eines Systems gleich normiert sind, da eine

Skalierung mit einem konstanten Faktor nicht relevant ist. In dieser

Darstellung soll im Gegensatz zur Darstellung bei Werbelow und

Grant [73] die Normierung des Produktoperatorformalismus über¬

nommen werden. Die Werte der Relaxationsratenkonstanten werden

durch diese Wahl der Basisoperatoren nicht beeinflußt. Die Zerle¬

gung des Dichteoperators in symmetrieadaptierte Basisoperatorenhat zusätzlich den Vorteil, daß man das System in Unterräume auf-

56 Kapitel 2.7

teilen kann, die sich aufgrund ihrer unterschiedlichen Symmetrieei¬

genschaften ergeben und so die Dimension des Problems weiter

reduzieren.

Da im weiteren nur die Relaxation longitudinaler Magnetisierungbetrachtet wird, soll auch die Darstellung hierauf beschränkt wer¬

den. Sie folgt in der Notation und in der Numerierung der Basisope¬

ratoren („normal modes") weitgehend derjenigen von Werbelow

und Grant [73]. Ein Satz von orthogonalen Basisoperatoren wird

unter Berücksichtigung der folgenden Bedingungen [81,82] gene¬

riert, wobei man bei der Wahl der einzelnen Operatoren eine gewisseFreiheit hat:

- Die Gesamtpolarisationen der einzelnen Gruppen magnetisch

äquivalenter Spins bilden die ersten Basisoperatoren.

- Alle anderen Basisoperatoren sollten im thermischen Gleichge¬wicht Null sein. Hierdurch erreicht man eine Separation der auto-

korrelierten und der kreuzkorrelierten spektralen Leistungsdichte¬funktionen [81].

- Alle Basisoperatoren für die Beschreibung longitudinaler Rela¬

xation müssen in der Basis der Eigenvektoren des Hamiltonopera¬tors diagonal sein.

- Die Basisoperatoren müssen orthogonal und gleich normiert sein.

- Gibt es mehrere mögliche Sätze von Basisoperatoren, so wird jene

Darstellung genommen, welche die meisten unabhängigen meßba¬

ren Größen beschreibt.

Im Falle von Spinsystemen ohne entartete Energieübergänge kann

man die longitudinalen Basisoperatoren aus dem Einheitsoperatorund den Sz-Operatoren der einzelnen Spins erzeugen, indem man

alle möglichen Tensorprodukte der S2-Operatoren bildet. In einem

Spinsystem mit entarteten Energieübergängen, müssen aufgrund der

Permutationssymmetrie der magnetisch äquivalenten Spins auch die

Normal Mode" Darstellung der Relaxation 57

Basisoperatoren dieser Permutationssymmetrie genügen. Daher ent¬

halten die Basisoperatoren in diesem Fall auch Nullquantenterme.

Der Erwartungswert der Basisoperatoren ist definiert als die Spurdes Operators mit dem Dichteoperator, d.h. die Zeitevolution des

Erwartungswertes eines Basisoperators ist gegeben durch

<B,.>(0 = fr{B+.(o(0-oe<i)} (2.79)

Die Spurbildung erfolgt hier mit einem Differenzdichteoperatoro(0-oeq, damit das System gegen das thermische Gleichgewichtrelaxiert. Man kann die Zeitevolution der longitudinalen Basisopera¬toren in einer Matrixdarstellung formulieren und erhält dabei eine

Differentialgleichung erster Ordnung

d_dt

(ßiXO

<ß2X0

<ß„>(0

= -r

<ßaX0

<ß2>(0

<ß„)(0

(2.80)

welche in der Matrix

r =

....ß„.ßi

r r rBVB1 B2,B2

"•

Bn,B2

BVBn

(2.81)

sämtliche longitudinalen Auto- und Kreuzrelaxationsratenkonstan-

ten des betrachteten Systems enthält, die gemäß Gleichung (2.22)

definiert sind. Die Basisoperatoren können aufgrund ihrer Symme¬trie gegen die Inversion aller Spins in symmetrische und antisymme¬trische Operatoren eingeteilt werden. Ändert sich das Vorzeichen

eines Operators bei Spininversion, so wird er als antisymmetrischbezeichnet und mit einen Index a links oben charakterisiert, ändert er

sein Vorzeichen nicht, so wird er als symmetrisch und mit einen

58 Kapitel 2.7

Index s bezeichnet. Aufgrund dieser Einteilung in symmetrische und

antisymmetrische Basisoperatoren erhält der Relaxationssuperopera¬tor für bestimmte Relaxationswechselwirkungen eine Blockdiago¬

nalform, wodurch die Größe des gekoppelten Differentialglei¬

chungssystems weiter reduziert wird.

Die Spinordnung ist die Anzahl der kartesischen Spinoperatoren, in

die der Basisoperator zerlegt werden kann, d.h. Sz ist ein Term mit

der Spinordnung eins, und 2SZIZ hat die Spinordnung zwei. Die

Berechnung der Matrixelemente des Relaxationssuperoperators

(Gleichung (2.22)) beruht auf einem Doppelkommutator des Basis¬

operators mit dem Spinanteil der betrachteten Wechselwirkung.Wird der Spinanteil durch bilineare Terme dargestellt, so kann sich

die Spinordnung des Basisoperators durch den Doppelkommutatornicht oder um plus oder minus zwei ändern [83]. In diesem Fall

bleibt also die oben erwähnte Symmetrie gegen Spininversion erhal¬

ten, d.h. unter einer Wechselwirkung mit der Spinordnung zwei zer¬

fällt die Relaxationsmatrix T in zwei unabhängige Blöcke, die nicht

miteinander kreuzrelaxieren. Das wichtigste Beispiel einer Wechsel¬

wirkung der Spinordnung zwei ist die Relaxation durch Dipol-

Dipol-Wechselwirkungen.

Kann man den Spinanteil der Relaxationswechselwirkung durch

Operatoren mit einer Spinordnung von eins darstellen, so ändert

sich die Spinordnung der Operatoren durch den Doppelkommutatornicht. Daher kann eine solche Wechselwirkung nur Autorelaxations¬

raten erzeugen. Ein wichtiges Beispiel für diese Art von Wechselwir¬

kung ist die chemische Verschiebungsanisotropie. Nur durch Kreuz¬

korrelationen zweier Wechselwirkungen mit einer Spinordnung von

eins und zwei kann sich die Spinordnung der Basisoperatoren durch

den Doppelkommutator um eins ändern, so daß man Kreuzrelaxa¬

tion zwischen den beiden Symmetrieblöcken erhält.

Für den einfachen Fall eines AX-Spinsystems sollen hier die Basis¬

operatoren und die Relaxationsraten kurz diskutiert werden. Das


AMX- und das AX3-Spinsystem, die in dieser Arbeit ebenfalls ver¬

wendet werden, sollen nur kurz behandelt werden und für die

Details wird auf die Literatur verwiesen. Stellt man die Basisoperato¬

ren für das AX-Spinsystem auf, so erhält man zwei antisymmetrische

Operatoren und einen symmetrischen Operator [73]

a-nAX c

ßj=

sz B2 I, K = 2S2I2(2.82)

welche durch Kreuzrelaxationsratenkonstanten miteinander gekop¬

pelt sind. Unter Berücksichtigung von dipolarer und CSA-Relaxation

erhält man eine volle Matrix:

TV1A_

r r r

K, s. L, L 2S/,/

F2Sz/z,S2r2S2/2J2r2S2/2>2S2/;

(2.83)

Die Autorelaxationsratenkonstanten T sind nur durch die Auto-nn

korrelationsfunktionen der dipolaren und CSA-Tensoren, die Kreuz-

relaxationsratenkonstanten zwischen den Ein- und Zweispintermen

nur durch die Kreuzkorrelation der dipolaren und CSA-Tensoren

bestimmt. Vernachlässigt man die CSA-Relaxation, so reduziert sich

das System der gekoppelten Differentialgleichungen auf ein 2x2

und ein lxl System, die sich unabhängig voneinander entwickeln,

d.h. die Matrix erhält die Form

p/ix _

r r

r r'z'Sz Vz

o

0

0 o r.

(2.84)

Die Elemente der Relaxationsmatrix für Dipol-Dipol- und „random

Field"-Wechselwirkung finden sich bei Werbelow und Grant [73], die

Beiträge der CSA-CSA-Autokorrelation und der Dipol-CSA-Kreuz-korrelation wurden zuerst von Goldman [84] ausführlich beschrie-

60 Kapitel 2.8

ben und seither experimentell und theoretisch an Modellsystemen[85-88] verifiziert, auf den Fall einer anisotropen Bewegung des

Moleküls verallgemeinert [89] und als Methode zum Transfer von

Polarisation [90] verwendet. Die Unterdrückung dieser Kreuzkorre¬

lation zwischen dipolaren und CSA-Tensoren ist für die genaue Mes¬

sung von Relaxationsraten der N-H-Spinsysteme in Makromolekü¬

len wichtig [91,92].

Die Dipol-Dipol-Beiträge für das AMX-Dreispinsystem finden sich

ebenfalls bei Werbelow und Grant [73]. Die dipolare Kreuzkorrela¬

tion in homonuklearen Systemen wurde zuerst von Dalvit und

Bodenhausen [93-95] im Laborkoordinatensystem und von Brüsch-

weiler et al. [96] in einem geneigten rotierenden Koordinatensystem

experimentell gemessen. Die Beiträge der Kreuzkorrelation zwi¬

schen dipolaren und CSA-Tensoren zur Relaxationsmatrix findet

man bei Burghardt et al. [97] für den allgemeinen Fall eines beliebig

geneigten rotierenden Koordinatensystem.

Auch für das AX3-Spinsystem findet man die Dipol-Dipol-Beiträgein dem Übersichtsartikel von Werbelow und Grant [73], und der Ein¬

fluß der Kreuzrelaxation auf die Tr und T2-Zeiten in CH3-Gruppenwird bei Kay und Torchia [98] ausführlich diskutiert.

2.8 Relaxation im rotierenden Koordinatensystem

Legt man während der Mischzeit xm ein schwaches rf-Feld mit der

Feldstärke yBx an, so erhält man eine neue Quantisierungsachse (z-

Achse) in einem rotierenden und geneigten Koordinatensystem. Bei

einem Frequenzoffset von Ato erhält man ein effektives Feld der

Stärke

tof = J(Y!ß1)2+(A(Oi)2 (2.85)

mit einem Winkel

©, = tan"1 tyB/Aw,) (2.86)

Relaxation im rotierenden Koordinatensystem 61

zwischen der neuen Achse und der z-Achse des statischen Magnet¬feldes. Man kann zeigen [60,99], daß die statischen Elemente des

Dichteoperators entlang dem effektiven Feld und die Elemente des

Dichteoperators, die um das effektive Feld präzessieren, entkoppeltsind, wenn die Matrixelemente des Relaxationssuperoperators viel

kleiner sind als vfx . Sofern die Inhomogenität des Bj-Feldes stark

genug ist, werden die oszillierenden Terme durch die Inhomogenitätdes Bx-Feldes während der Mischzeit zerstört, ansonsten zeigen sie

sich in einem zusätzlichen überlagerten oszillatorischen Beitrag als

Funktion der Mischzeit x auf der Kreuzrelaxation. Die stärkstenm

Beiträge zu diesen oszillatorischen Effekten kommen im allgemeinenvon Nullquantentermen nichtäquivalenter Kerne, da diese durch die

Inhomogenität des rf-Feldes am wenigsten beeinflußt werden.

Unter diesen Bedingungen kann man einen modifizierten Satz von

Basisoperatoren zur Beschreibung des longitudinalen Relaxations¬

verhaltens in dem geneigten rotierenden Koordinatensystem benut¬

zen. Alle kartesischen Operatoren im Laborsystem müssen durch die

entsprechenden Operatoren im neuen Koordinatensystem

£ = JfZcose, + Ii:esine,

'?* = Vos©+J,2sin0,

f = J<y >y (2.87)

ersetzt werden. Diese Notation geht von einem Spinlockfeld entlangder x-Achse aus. Hierbei muß die Stärke des Spinlockfeldes größerals die maximale skalare Kopplung sein, da sonst die Näherung, daß

alle Linien eines Multipletts die gleiche Spinlockachse einnehmen,

nicht mehr gilt. Bull [83] hat auch für den Fall eines schwachen selek¬

tiven rf-Feldes einen geeigneten Satz von Basisoperatoren für die

Beschreibung der longitudinalen Relaxation in einem geneigtenrotierenden Koordinatensystem hergeleitet.

62 Kapitel 2.8

Diese Art von Relaxationsexperimenten im rotierenden Koordina¬

tensystem wurde zuerst im homonuklearen ROESY-Experiment

(„rotating frame Overhauser spectroscopy") [100] realisiert und von

Bull [101] theoretisch verallgemeinert. Die Matrixelemente der Rela¬

xationsmatrix für unterschiedliche Spinsysteme mit und ohne Dipol-CSA-Kreuzkorrelation findet man in den Arbeiten von Bull [101,102]

und Burghardt et al. [97], sowie in einem Übersichtsartikel über Rela¬

xation im rotierenden Koordinatensystem von Bull [83].

Struktur und Dynamik von Antamanid in Dioxan 63

3 Struktur und Dynamik von Antamanid in Dioxan

3.1 Einleitung

Bei der Bestimmung der Struktur von Antamanid in Chloroform

[39,40] zeigte sich, daß die experimentellen Daten sich nicht mit einer

starren Struktur vereinbaren lassen. Zum einen konnten nicht alle

NOE- („nuclear Overhauser effect") und J-Kopplungsbedingungenerfüllt werden, zum anderen zeigten sich aber auch feldstärkeabhän¬

gige Relaxationseffekte in den Tlp-Messungen der NH-Protonen in

Antamanid. Diese deuten auf einen zusätzlichen langsamen Aus¬

tauschprozeß hin, dessen Zeitkonstante bei 300 K ca. 43 us beträgt.Eine eindeutige Bestimmung des Austauschprozesses war in diesen

Untersuchungen nicht möglich, aber es wurde hier ein Brechen der

Wasserstoffbrücken vermutet.

Um eine langsame Dynamik von Molekülen zu beschreiben, werden

häufig mehrere einzelne Konformationen dynamisch kombiniert.

Diese optimierten Kombinationen führen erwartungsgemäß immer

zu einer Verbesserung der Beschreibung der experimentellen Daten.

Die einzelnen Konformationen werden jedoch häufig unter der

Annahme erzeugt, daß das Molekül in einer starren Konformation

vorliegt. Hierdurch wird die Bandbreite der möglichen Konformatio¬

nen eingeschränkt, da bereits eine einzelne Struktur die experimentel¬len Daten gut beschreiben muß, um durch den Algorithmus zur

Erzeugung der Strukturen ausgewählt zu werden. Um diese Ein¬

schränkung zu umgehen und eine breitere Streuung der Konforma¬

tionen zu erhalten wurde die MEDUSA-Prozedur („multiconforma¬

tional evaluation of distance information using a stochastically con¬

strained mirtimization algorithm") [39,40] zur Erzeugung von Struk¬

turen vorgeschlagen. Hierbei muß jede einzelne erzeugte Struktur

nur eine Teilmenge der vorhandenen „distance constraints" erfüllen

und erst durch die Kombination zweier oder mehrerer Strukturen

werden sämtliche experimentellen Daten richtig beschrieben.

64 Kapitel 3.1

Ein Vergleich des NH-Bereiches der beiden lD-Protonenspektren

von Antamanid in Chloroform (bei T = 320K) und Dioxan (bei

T = 300 K) (Abb. 3.1) zeigt deutliche Unterschiede zwischen den bei¬

den Lösungsmitteln. Die Linienverbreiterungen der Amidprotonen

in *Val und 6Phe ist nur in Chloroform sichtbar und die 3J(NH-Ha)-Kopplungskonstanten scheinen in Dioxan eine geringere Streuung

aufzuweisen. Dies könnte auf eine schnellere Bewegung des Peptid¬

gerüstes hindeuten, welche zu einer stärkeren Ausmittelung der

Kopplungskonstanten führen würde. Die starke Verschiebung ein¬

zelner Linien kann durch die unterschiedliche Temperatur und

durch die unterschiedlichen Wasserstoffbrückenbindungen in den

beiden Lösungsmitteln erklärt werden. In Dioxan können die NH-

Protonen des Antamanids intermolekulare Wasserstoffbrücken zum

Lösungsmittel bilden, während in Chloroform nur intramolekulare

Wasserstoffbrücken innerhalb des Moleküls möglich sind.

a)

b)

4NH

A

9NH 6NH 10NH 1NH 5NH

4NH 6NH 1NH 10NH

—i 1 1 -[' -—i i i t 1 i i 1 r -] 1 1 n r-

8.3 7.8 7.3 8[ppm]

Abbildung 3.1: NH-Region des lD-Protonenspektrums von Antamanid in a)

Dioxan bei T = 300 K und b) in CDC13 bei T = 320 K. Man sieht die Linienverbrei¬

terungenbei 6NH und 1NH im Chloroformspektrum.

Einleitung 65

Die ersten Untersuchungen, die auf ein dynamisches Gleichgewicht

von Antamanid in Lösung hindeuteten, waren Ultraschallmessun¬

gen von Burgermeister [33,34] in Dioxan. Patel [30-32] fand später

ein unterschiedliches Verhalten des Antamanids in Lösungsmittelndie als Wasserstoffbrückenakzeptoren wirken können und solchen,

die diese Eigenschaft nicht besitzen. Alle weiteren Untersuchungenwurden jedoch in Chloroform durchgeführt. Ziel der Untersuchung

von Antamanid in Dioxan war es, die Struktur und Dynamik des

Peptidgerüstes zu bestimmen und diese mit der bekannten Struktur

in Chloroform zu vergleichen, wie sie von Blackledge et al. [40]

ermittelt wurde. Hierzu mußte als erstes die Zuordnung der chemi¬

schen Verschiebungen der Protonen und Kohlenstoffatome in

Dioxan bestimmt werden. Danach wurden ROE-Aufbauraten („rota¬

ting frame Overhauser effect") zur Berechnung von „distance con-

straints", sowie weitere experimentelle Größen (NH-Tlp-Zeiten,Kohlenstoff Ta-Zeiten und 3J(NH-Ha)-Kopplungskonstanten)gemessen, die bei der Bestimmung der Struktur und Dynamik wert¬

volle Informationen liefern.

Für sämtliche Messungen wurde eine 36.8 mM Lösung von Antama¬

nid in 99.5% deuteriertem Dioxan bei einer Temperatur von

T = 300 K verwendet. Alle Messungen mit Ausnahme der HMQC-

und HMBC-Spektren sowie der 13C-T1-Messungen wurden auf

einem Bruker MSL-400 Spektrometer (Protonenresonanzfrequenz400.13 MHz), die restlichen Messungen an einem Bruker AMX-600

Spektrometer (Protonenresonanzfrequenz 600.13 MHz) durchge¬führt. Die Eichung der chemischen Verschiebungen der Protonen

erfolgte mittels der Signale des nicht deuterierten Dioxans mit

8 = 3.58 ppm. Die 13C-chemischen Verschiebungen wurden in den

1H-detektierten Experimenten auf die Resonanzfrequenz der proto-

nierten Kohlenstoffatome (8 = 67.6 ppm) und in den 13C-detektierten

Experimenten auf die Resonanzfrequenz der deuterierten Kohlen¬

stoffatome (8 = 66.5 ppm) des Dioxans bezogen.

66 Kapitel 3.2

3.2 Zuordnung der chemischen Verschiebungen

Die Zuordnung der chemischen Verschiebungen der Protonen

erfolgte mit Standardmethoden [3]. Für das DQF-COSY [103,104],

das TOCSY [105,106] mit einer DIPSI-2 Mischsequenz [107,108] und

einer Mischzeit von 30 ms bzw. 63 ms, das NOESY [109,110] mit

einer Mischzeit von xm = 300 ms und das „compensated" ROESY

[100,111,112] wurden jeweils 1024 tpZeiten mit 32 Experimenten und

2048 reellen Datenpunkten aufgenommen. Die Unterscheidung der

positiven und negativen Frequenzen erfolgte mit Hilfe der TPPI-

Methode („Time Proportional Phase Incrementation") [113]. Alle

Spektren wurden nach der Apodisierung und „zerofilling" auf 2048

mal 2048 komplexe Datenpunkte fouriertransformiert und phasen¬

korrigiert. Die gemessenen chemischen Verschiebungen für sämtli¬

che Protonen finden sich in Tabelle 3.1. Eine eindeutige Zuordnungder aromatischen Protonen war erst mit Hilfe der heteronuklearen

Korrelationsspektren möglich, da im aromatischen Bereich starke

Überlappungen von Kreuzpeaks auftraten. Die Intensitäten des

NH Ha Hß Hp-H0

HyHm

H8

HpH8.

Val1 7.46 4.38 1.99 0.92 0.93

Pro2 3.78 1.69 1.99 1.56 1.91 3.45 3.53

Pro3 4.21 2.03 2.41 1.65 1.81 3.44 3.44

Ala4 8.54 4.37 1.21

Phe5 7.38 4.57 2.77 3.06 7.12 7.15 7.10

Phe6 7.87 4.67 2.86 3.18 7.25 7.25 7.17

Pro7 3.60 1.64 1.96 1.62 1.89 3.26 3.37

Pro8 4.04 1.74 2.20 0.66 1.46 3.00 3.22

Phe9 8.20 4.56 3.06 3.06 7.21 7.29 7.17

Phe10 7.64 4.40 3.06 3.06 7.04 7.08 7.06

Tabelle 3.1: Chemische Verschiebung der Protonen von Antamanid in Dioxan

bei T = 300 K. Die Eichung erfolgte auf die Linie des nicht deuterierten Dioxans

mit 8 = 3.58 ppm.

Zuordnung der chemischen Verschiebungen 67

NOESY-Spektrums waren erwartungsgemäß klein, da man sich bei

einer Temperatur von 300 K nahe beim Nulldurchgang der homonu¬

klearen Kreuzrelaxation von u)0xc = 1.12 befindet. In den Spektrenfanden sich sowohl positive als auch negative Kreuzpeaks. Daher

wurden für die Zuordnung und auch später für die Berechnung von

Protonenabständen nur ROESY-Spektren verwendet.

Die Zuordnung der Kohlenstoffresonanzen erfolgte mit HMQC-

(„Heteronuclear Multiple Quantum Correlation Spectroscopy")[114,115] und HMBC-Spektren („Heteronuclear Multiple Bond Cor¬

relation Spectroscopy") [116]. Die Zahlenwerte der chemischen Ver¬

schiebungen wurden dann in den besser aufgelösten lD-13C-Spek-tren gemessen und sind in Tabelle 3.2 wiedergegeben. Sämtliche

Kohlenstoffatome des Antamanids sind in den lD-Spektren aufge¬löst und konnten zugeordnet werden.

Bei der Aufnahme der homonuklearen ROESY-Spektren fanden sich

von fast allen NH- und Ha-Resonanzen Austauschpeaks zu einem

zweiten Satz von Resonanzfrequenzen. Dieser zusätzliche Satz von

Ca Cß S Q CE CS C

Val1 57.8 32.5 19.5/20.3 171.3

Pro2 60.4 29.8 26.4 48.8 171.1

Pro3 62.6 32.9 23.5 47.7 172.3

Ala4 50.6 18.6 174.6

Phe5 56.2 38.5 139.3 131.0 129.6 127.6 171.2

Phe6 53.6 38.2 138.6 131.4 129.5 127.9 171.1

Pro7 60.3 29.7 26.3 48.5 171.0

Pro8 62.5 32.6 22.8 47.7 171.3

Phe9 57.5 39.6 139.5 130.8 129.8 127.8 173.9

Phe10 57.5 37.9 140.1 131.1 129.3 127.2 171.7

Tabelle 3.2: Chemische Verschiebung der Kohlenstoffatome von Antamanid in

Dioxan bei T = 300 K. Die Eichung erfolgte auf die Kohlenstoffresonanz des pro-tonierten Dioxans mit 8 = 67.6 ppm.

68 Kapitel 3.3

Resonanzfrequenzen scheint zu einer zweiten Konformation zu

gehören, die in einem langsam austauschenden dynamischen Gleich¬

gewicht mit der Hauptkonformation steht. Die relative Intensität der

Diagonalpeaks dieser zweiten Konformation betrug ca. 2% und

wurde nicht weiter untersucht.

3.3 Messung von Struktur- und Dynamikdaten in Dioxan

3.3.1 ROE-Aufbauraten

Um die homonukleare Kreuzrelaxationsrate im rotierenden Koordi¬

natensystem zu bestimmen, wurden „offset compensated" ROESY-

Spektren [112] mit einem Spinlockfeld von 7ß1/2n = 3850 Hz und

sechs unterschiedlichen Mischzeiten (xm = 20 ms, 35 ms, 50 ms,

75 ms, 150 ms und 300 ms) aufgenommen. Für alle Spektren wurden

1024 tj-Zeiten mit jeweils 32 Experimenten und 2048 reellen Daten¬

punkten aufaddiert. Die Spektren wurden nach der Apodisierungund „zerofilling" auf 4096 mal 4096 komplexe Datenpunkte fourier-

transformiert und phasenkorrigiert. Nach einer Basislinienkorrektur

mit einem Polynom fünfter Ordnung wurden sämtliche zugeordne¬

ten und aufgelösten Kreuzpeaks in allen sechs ROESY-Spektren inte¬

griert. Abbildung 3.2 zeigt die NH-Ho/ß-Region des ROESY-Spek-

trums mit einer Mischzeit von 150 ms. Die Zuordnung der einzelnen

Kreuzpeaks ist eingetragen, soweit diese eindeutig ermittelt werden

konnte. Insbesondere im Bereich der Hß gibt es Überlagerungen der

Resonanzen, die eine eindeutige Zuordnung einiger Kreuzpeaks

unmöglich machen.

Um aus den Kreuzpeakvolumina der ROESY-Spektren Abstandsin¬

formationen der Protonen zu erhalten gibt es mehrere Möglichkei¬ten. Der einfachsten Methode liegt die „initial rate" Annahme

zugrunde. Hierbei nimmt man an, daß für genügend kurze Misch¬

zeiten x,das Volumen der Kreuzpeaks proportional zur Kreuzrela¬

xationsratenkonstante und damit zum Kehrwert der sechsten Potenz

des Abstandes ist [117]:


Eo. m h. 0) I i- CO m

i i l . i,i. 1 . | , 1

cci cd

l.i.l.i,

CO

I . i ,

ca

i — ca

E.

Q.Q.

m

•1

Igelc*-

¥1

ca

5°| CO

s| —-

\o

JoCO

x

,».'*-.*tBam-9 »<*t •« •-»««•*.•»»»«•*'••*•••*—«•«»*, **•» ••«•«««•n

n r- - «I - <°.CO

Sß KÖ o OS Ö

-

O) --' CM

SK*" •1 -

>n

Ö00

o\

3^1

5 CO*

SC

WS»

Ö

äffo

• «* --< »

»1-

~

— \0 <tc^- Ö Ö Ö

-aÄi Ö On </-> {& ^-

pM'l •1 V S

**

- CD

5 ~

VC

-

Abbildung 3.2: NH-H^ß-Region des ROESY-Spektrums mit 150 ms Mischzeit.

Die Zuordnung der einzelnen Kreuzpeaks ist soweit als möglich eingetragen.Besonders im Bereich der Hß gibt es Überlagerungen von Kreuzpeaks, die keine

eindeutige Zuordnung erlauben.

70 Kapitel 3.3

Eine lineare Auftragung der Integrale gegen die Mischzeiten zeigte,daß teilweise bereits für Mischzeiten x < 75 ms diese Linearität

m

nicht mehr erfüllt war.

Die genauste Methode zur Bestimmung der Distanzen ist die Anpas¬

sung der vollen Relaxationsmatrix an die experimentellen Werte

(„complete relaxation matrix approach") [118-121]. Hier wurde ein

anderer Weg für die Auswertung der Aufbauraten gewählt. Unter

der Annahme eines isolierten Zweispinsystems kann man die Kreuz-

peakintensitäten lAB{xm) als Funktion der Mischzeit xm für die

Kreuzrelaxation der beiden Spins analytisch berechnen [1]:

QV^) = -L7^(^ *""-elÄT""-) (3.2)

mit

und

R=±(Rl + R2) (3.3)

Q = 1/(R1-R2)2 + 4R;2 (3.4)

Ru ist die gesuchte Kreuzrelaxationsratenkonstante zwischen den

beiden Spins, Rj und R2 sind die Autorelaxationsratenkonstanten.

n-, sind die Anzahl äquivalenter Spins und M0 ist die Anfangsma¬

gnetisierung. Mit Hilfe eines nichtlinearen Dreiparameterfits wurden

die Parameter R12, R1 und R2 an die gemessenen Kreuzpeakintensi-täten angepaßt und so die Kreuzrelaxationsraten bestimmt. Dabei

wurden die Intensitäten für den durch das Spinlockfeld.erzeugtenkohärente Magnetisierungstransfer nach der Methode aus Referenz

[122] und [123] korrigiert, indem der theoretische TOCSY-Transfer


unter Berücksichtigung der beiden effektiven Spinlockachsen und

der J-Kopplungskonstanten berechnet wurde. Diese Korrektur fand

nur bei Kreuzpeaks nahe der Diagonalen Anwendung, da nur dort

ein signifikanter Beitrag des TOCSY-Transfers zu erwarten ist. Die

Anfangsmagnetisierung M0 wurde durch die Integration über einige

gut aufgelöste Diagonalpeaks in dem ROESY-Spektrum mit 20 ms

Mischzeit bestimmt. Die so berechneten Werte für die Kreuzrelaxati-

onsratenkonstanten für sämtliche aufgelösten Protonenpaare finden

sich in Tabelle 7.1 im Anhang 7.1.

Unter Vernachlässigung von internen Bewegungen ist der Abstand

zweier Protonen direkt proportional zum Kehrwert der sechsten

Wurzel der Kreuzrelaxationsratenkonstante

r12 = Jfc--^=, (3.5)

und mit Hilfe einer Eichung auf die bekannten Abstände von gemi¬nalen Protonen kann man die Konstante k berechnen

k = r6JR

.

(3.6)

gern V gernv**/

Berechnet man den Mittelwert der Kreuzrelaxationsratenkonstanten

der vier aufgelösten geminalen Protonenpaare, so erhält man

R = 3.241 s"1. Mit einem geminalen Protonen-Protonen Abstand

von r = 1.779 Ä führt dies zu einem Wert von

* = 2.1642 Ä s"1/6. (3.7)

Diese Gleichungen (3.5) bis (3.7) gelten nur für starre Moleküle, da

eine zusätzliche interne Bewegung den Wert der Konstanten k beein¬

flußt. Daher ist es besonders wichtig, daß die gewählten geminalen

Eichsysteme eine möglichst geringe interne Bewegung zeigen. In die

Fehler der so berechneten Abstände gehen die Fehler der Integraleund der hieraus berechneten Kreuzrelaxationsratenkonstanten, die

Fehler der gewählten geminalen Eichsysteme und die Fehler auf-

72 Kapitel 3.3

grund der internen Bewegungen des Moleküls ein. Um die experi¬mentellen Fehler abzuschätzen, wurden die berechneten Werte der

Abstände (Tabelle 7.1 in Anhang 7.1) aus den Kreuzpeaks oberhalb

und unterhalb der Diagonale der Spektren verglichen. Man findet

Abweichungen in der Größenordnung von ca. 5%.

Da in der Berechnung der Molekülstruktur nur die Abstände des

Peptidgerüstes verwendet werden, d.h. die Abstände zwischen den

NH- und Ha-Protonen, und keine Abstände zu den Protonen in den

Seitenketten, sind diese in Tabelle 3.3 noch einmal zusammengefaßt.Oberhalb der Diagonalen finden sich die gemittelten Abstände (in A)

und unterhalb der Diagonalen die berechneten Kreuzrelaxationsra-

tenkonstanten R12 (in s"1). Ein X in der Tabelle bedeutet, daß der

betreffende Kreuzpeak beobachtet wurde, aber aufgrund von tj-Rau¬

schen oder Überlagerung mit einem anderen Kreuzpeak nicht inte¬

griert werden konnte. Ein A bedeutet dagegen, daß der entspre¬

chende Kreuzpeak nicht beobachtet wurde. Diese nicht vorhandenen

Kreuzpeaks liefern ebenfalls wertvolle Strukturinformationen, da

man aus ihnen schließen kann, daß die Entfernung zwischen den

beiden Protonen oberhalb einer bestimmten Schranke liegt.

Vergleicht man diese Tabelle mit der entsprechenden Tabelle aus

Referenz [40] für die Strukturbestimmung in Chloroform so fällt auf,

daß fast alle in Dioxan sichtbaren ROE-Kreuzpeaks auch in den

Chloroformspektren gefunden wurden. Die einzigen beiden ROE's,

die nur in einem der beiden Lösungsmittel auftreten, sind 5NH-6NH

(nur in Chloroform r=3.0 Ä) und 1NH-4NH (nur in Dioxan r=4.0 Ä).

Alle anderen NOE's sind entweder in beiden Lösungsmitteln vor¬

handen, oder konnten in einem der beiden Lösungsmittel nicht auf¬

gelöst werden. Vergleicht man die berechneten Abstände, so findet

man deutliche Unterschiede zwischen den beiden Lösungsmitteln.

Diese Ähnlichkeiten der experimentell bestimmten Abstände lassen

erwarten, daß auch die Strukturen in den beiden Lösungsmitteln

ähnlich sind.


IN 4N 5N 6N 9N ION la 2a 3a 4a 5a 6a 7a 8a 9a 10a

IN / (4.1) X A A X X X A A 3.1 A A A A 2.2

4N 0.02 / 3.2 A A A A 2.6 3.3 3.1 A A A A A A

5N X 0.09 / A A A X 3.4 (4.7) 2.3 X A A A X A

6N A A A / A 2.8 X A A X 2.3 X (4.7) A A 3.2

9N A A A A / X A A A A X A 2.6 3.2 X A

ION X A A 0.21 X / A A A X A A 3.5 A 2.4 2.5

la X A X X A A / A A A X A A A X A

2a X 0.36 0.07 A A A A / 2.1 A A A X A A A

3a A 0.09 0.01 A A A A 1.34 / A A A A A A A

4a A 0.12 0.65 X A X A A A / A A A A A A

5a 0.11 A X 0.79 X A X A A A / A A A A X

6a A A A X A A A A A A A / A A A A

7a A A A 0.01 0.38 0.06 A X A A A A / 2.0 A A

8a A A A A 0.11 A A A A A A A 1.43 / A A

9a A A X A X 0.58 X A A A A A A A / X

10a 0.90 A A 0.10 A 0.41 A A A A X A A A X /

Tabelle 3.3: Übersicht über die Abstände zwischen den Protonen des Peptidge¬rüstes. Oberhalb der Diagonalen sind die berechneten Abstände in Ängströmangegeben, unterhalb der Diagonalen die berechneten Kreuzrelaxationsraten-

konstanten R12 in s"1. Ein A bedeutet, daß der entsprechende ROESY-Kreuzpeakin den Spektren fehlt, ein X, daß der entsprechende Kreuzpeak nicht aufgelöst ist

und daher nicht integriert werden konnte.

3.3.2 NH-Tlp-RelaxationszeitenBei der Untersuchung von Antamanid in Chloroform [40] fand sich

eine starke rf-Feldabhängigkeit der T^-Relaxation der Amidproto¬

nen, die auf einen langsamen Austauschprozeß mit einer Geschwin¬

digkeitskonstanten in der Größe der rf-Feldstärke hindeutet. Ver¬

mutlich wird die chemische Verschiebung der Amidprotonen durch

eine Änderung der Wasserstoffbrückenbindungen moduliert.

Nimmt man einen Austauschprozeß zwischen zwei unterschiedli-

74 Kapitel 3.3

chen Konformationen an, so erhält man für die Relaxationsratenkon¬

stante [125,126]

wobei T* den dipolaren Anteil an der Relaxation und Tf? den Bei¬

trag durch den Austauschprozeß beschreiben. Nur der Beitrag des

Austauschprozesses ist von der rf-Feldstärke yB1 abhängig:

-L=^2-(A0))2. T"(3.9)

TiP 1 + (YVJ

Hierbei sind p1 und p2 die Populationen der beiden Konformatio¬

nen, x die Zeitkonstante des Austauschprozesses und Aco die Diffe¬

renz der chemischen Verschiebungen. Aufgrund dieser Abhängig¬keit nimmt die Relaxationszeit mit steigender Feldstärke quadratisch

zu.

Die Tlp-Relaxation für die Amidprotonen von Antamanid in Dioxan

wurde bei den rf-Feldstärken yB1/2n zwischen 1.20 kHz und

10.33 kHz gemessen. Für jede Feldstärke wurden 16 lD-Spektren mit

unterschiedlichen Mischzeiten xm zwischen 4 us und 2 s gemessen.

Die Trägerfrequenz wurde für alle Spektren in die Mitte des NH-

Bereiches gelegt, um „off-resonance" Effekte zu minimieren. Nach

Fouriertransformation und Basislinienkorrektur wurden die einzel¬

nen Amidresonanzen integriert und die Relaxationszeiten mit einem

nichtlinearen Zweiparameterfit einer exponentiellen Funktion der

Form

I(xm) = 70.(l-fl-efVTlp) (3.10)

bestimmt. Die numerischen Werte finden sich in Tabelle 7.2 im

Anhang 7.1. Die Abhängigkeit der Tlp-Relaxationszeiten von der rf-

Feldstärke sieht man am besten in einer Auftragung von Tlp gegen


das Quadrat der rf-Feldstärke, da man dann eine lineare Beziehung

der beiden Größen erhält. In Abbildung 3.3 erkennt man keinen

signifikanter Einfluß der Feldstärke auf die Relaxationszeiten. Für

Feldstärken über 4 kHz findet man einen schwachen linearen

Anstieg, aber die beobachteten Effekte sind so klein, daß man andere

Ursachen (z.B. Temperaturänderungen aufgrund der unterschiedli¬

chen rf-Einstrahlung) als deren Ursache nicht ausschließen kann.

Das Verhalten unterhalb von 4 kHz mit einem Anstieg der Tlp-Rela-xationszeit für kleinere Feldstärken konnte nicht erklärt werden. Die

beiden NH-Resonanzen von Phe5 und Val1 Hegen sehr nahe neben

den intensiven Aromatenresonanzen (siehe Abb. 3.1) und weisen

daher eine geringere Genauigkeit auf als die anderen vier Linien. Die

U.£U

O 4NH

D 9NH

O 6NH

0.18-

*

A10NHx 1 NH

X**

* 5NHX %

0.16-

* X

*X

*

* *

TlP [s]

0.14- O

0.12-

o°

=>o

O

A

o

6

O

oO

A"

D

o

A

a

0.10- r- r~

D

1

a

—i 1

D

-i 1 1—

"T''•

0.0 20.0 40.0 60.0 80.0

(TB^tkHz]

100.0 120.0

Abbildung 3.3: Tip-Relaxationszeiten (bei T = 300K) der Amidprotonen in

Antamanid aufgetragen gegen das Quadrat der rf-Feldstärke. Die Genauigkeitder Messungen für 5 NH und 1 NH sind deutlich schlechter, da diese direkt

neben den aromatischen Protonen (siehe Abb. 3.1) liegen.

76 Kapitel 3.3

Messungen bei 2.84 bzw 2.94 kHz zeigten eine große und nicht

erklärbare Streuung der Meßwerte (siehe Tabelle 7.2).

Das Verhalten der verschiedenen Amidprotonen legt den Schluß

nahe, daß bei der gemessenen Temperatur von T = 300 K kein Aus¬

tauschprozeß mit einer beobachtbaren Zeitkonstante xex stattfindet,

d.h daß alle ablaufenden Austauschvorgänge schneller als der Kehr¬

wert der verwendeten Feldstärken sind. Langsamere Prozesse kön¬

nen ebenfalls ausgeschlossen werden, da diese entweder als Aus-

tauschpeaks in den ROESY-Spektren auftreten, oder aber zu sichtba¬

ren Linienverbreiterungen führen müßten.

3.3.3 Kohlenstoff Tj-Relaxationszeiten

Für sämtliche Kohlenstoffatome wurden die Tj-Relaxationszeitennach der „Inversion Recovery" Methode [124] mit Protonenentkopp¬

lung während der Mischzeit und 13C-Detektion bei einer Protonen¬

resonanzfrequenz von 600 MHz gemessen. Nach der Fouriertrans-

formation wurde die Basislinie mit einem Polynom fünften Grades

korrigiert. Mit einem nichtlinearen Dreiparameterfit eines monoex-

ponentiellen Zerfallsgesetzes der Form

7(xm) = J0(l-a-e"VTl) (3.11)

an die Peakmaxima wurde die Zeitkonstante T1 bestimmt. Die

numerischen Werte der Kohlenstoff Tj-Zeiten finden sich in Tabelle

7.3 im Anhang 7.1. Ein Vergleich der Relaxationszeiten in Dioxan

und in Chloroform (Tabelle 7.3, Spalte 4) zeigt, daß das Verhältnis

T^CDCL;) zu T^Dioxan) für die Ca-Kohlenstoffatome in einem

engen Bereich (1.47 bis 1.55) liegt. Aufgrund der viel größeren Visko¬

sität des Dioxans (n = 1.150 cp, T = 300 K), sind alle Relaxationszeiten

deutlich kürzer als in Chloroform (r) = 0.553 cp, T = 320 K). Für ein

starres Molekül sollte dieses Verhältnis für alle Atome den selben

Wert haben. In den Seitenketten findet man sowohl deutlich niede¬

rere als auch deutlich höhere Werte für das Verhältnis der Relaxati-


onszeiten, was ein Hinweis auf zusätzliche interne Beweglichkeitenist. Berechnet man die Korrelationszeit des Antamanids aus den 13C-

Tj-Relaxationszeiten der a-Kohlenstoffatome in Dioxan, so erhält

man den Wert xc = 335 ps im Vergleich zu xc = 195 ps für die Chloro¬

formlösung bei T = 300 K.

3.3.4 3J(NH-Ha)-KopplungskonstantenEine weitere Quelle von Struktur- und Dynamikinformationen sind

3J-Kopplungen, deren Größe über die verallgemeinerten Karplusbe¬

ziehungen [15-17] von dem dihedralen Winkel abhängt. Für Anta¬

manid in Dioxan wurden die homonuklearen 3J(NH-Ha)-Kopplun-gen gemessen, die den dihedralen Winkel 0(HN-N-Ca-Ha) bestim¬

men. Die Bestimmung erfolgte über den Fit eines Paares von

Lorentzlinien an das basislinienkorrigierte 1D-Spektrum bei

600 MHz Protonenresonanzfrequenz. Die Separation der beiden

Linienpositionen ist direkt die gesuchte Kopplungskonstante, wel¬

che in Tabelle 3.4 für alle sechs in Frage kommenden Aminosäuren

A: 3J = 9.4 cos28 - 1.1 cose + 0.4

Abbildung 3.4: Zwei unterschiedliche Parametrisierungen der Karplusbezie¬hung für die 3J(NH-Ha)-Kopplungskonstanten, die sich stark in den angenom¬

menen Extremwerten unterscheiden (A [17], B [3]).

78 Kapitel 3.4

Aminosäure Val1 Ala4 Phe5 Phe6 Phe9 Phe10

3J(NH-Ha) [Hz]

(Dioxan)8.3±0.2 8.410.2 8.110.2 7.5 + 0.2 8.410.2 7.9 + 0.2

3J(NH-Ha) [Hz]

(Chloroform) [40]7.3 + 0.2 8.610.2 6.8 + 0.2 6.610.2 8.3 + 0.2 6.710.2

Tabelle 3.4: ^(NH-H^-Kopplungskonstanten von Antamanid in Dioxan bei

T = 300 K. Zum Vergleich sind auch die Meßwerte in Chloroform [40] bei

T = 320 K angegeben. Die großen Werte in Dioxan deuten auf eine bevorzugteAusrichtung des dihedralen Winkels in der eis (0=0°) oder trans (0=180°) Kon¬

formation hin.

wiedergegeben ist. Bei der Verwendung von J-Kopplungskonstantenals strukturelle Parameter ergeben sich zwei Probleme. Zum einen

sind die Karplusbeziehungen (Abbildung 3.4) nicht eineindeutig,d.h. es gibt zu fast allen Werten der J-Kopplung mehr als einen dihe¬

dralen Winkel. Zum anderen ist die Parametrisierung der Karplusbe¬

ziehungen nicht sehr genau und es existieren in der Literatur für die

NH-Ha-Kopplung mehrere unterschiedliche Beziehungen [17], die

sich vor allem in den Extremwerten für die J-Kopplungen stark

unterscheiden. Die Uneindeutigkeit der Karplus-Beziehungen zwi¬

schen der J-Kopplungskonstanten und dem dihedralen Winkel kann

zu Problemen bei der Benutzung von J-Kopplungen als „constraints"

für die Berechnung einer Struktur führen.

3.4 Strukturberechnung in Dioxan

3.4.1 Implementierung der MEDUSA-Prozedur

Bei der MEDUSA Prozedur wird die Berechnung der Struktur in

zwei Schritte aufgeteilt. In einem ersten Schritt werden einzelne

Strukturen mit Hilfe der vorhandenen NOE „distance constraints"

(DC) und „anti distance constraints" (ADC) erzeugt, die als einzelne

Struktur nur einen Teil der NOE-DC erfüllen müssen. Ein NOE-DC

(im weiteren wird immer der Begriff NOE-DC gebraucht, auch wenn

Strukturberechnung in Dioxan 79

die Daten aus ROESY-Spektren erhalten wurden) ist der berechnete

Abstand zweier Protonen aus den NOE/ROE-Daten, der als zusätz¬

liches virtuelles Energiepotential in die Energieminimierung eingeht.Dies bedeutet, daß es bei einer Kombination mehrerer Strukturen in

einem dynamischen Gleichgewicht mindestens eine Struktur mit

einen Abstand r(k t)< r(e^} geben muß. Daher wählt man für das

NOE-Energiepotential eine Funktion der Form

(lr. (r -rexP)2

r >rexP

E(rttn)=f((M) r*I),,r*,) *«»

, (3.12)0 r <rexP

*'(*,/) (k,l)

die nur für zu große Abstände eine quadratische Form besitzt und

für zu kleine Abstände Null ist. Ein ADC dagegen zeigt an, daß

keine der Strukturen im dynamischen Gleichgewicht einen Abstand

r (ki)<r (TT)' P1/6 nat' WODeir (H) durch das Signal zu Rauschen der

NOE/ROE-Spektren gegeben ist und p die Population der betrachte¬

ten Struktur ist. Das Vorgehen zur Erzeugung der einzelnen Struktu¬

ren ist im einzelnen wie folgt [39,40] (siehe auch Anhang 7.2 zur

Implementierung des Suchprotokolls im Detail):

(l)Eine zufällige Struktur wird aus einem Satz von möglichen

Anfangsstrukturen ausgewählt.

(2) Eine Permutation der Liste der DC wird erzeugt.

(3) Ein zufälliger Grenzwert für die maximale Energie wird aus dem

Intervall [Emin, E^J ausgewählt.

(4) Der erste DC wird aus der permutierten Liste der DC ausgewähltund als zusätzliches Potential auf das CHARMM-Kraftfeld aufad¬

diert. Die Struktur wird energieminimiert und ergibt so eine neue

Struktur. Falls die Energie dieser neuen Struktur größer ist als der

gewählte Grenzwert aus (3), so wird der entsprechende DC von

der Liste gestrichen und die neue Struktur verworfen. Liegt die

Energie unterhalb des Energiegrenzwertes, so wird die neue

Struktur als Ausgangsstruktur für den nächsten Schritt verwen-

80 Kapitel 3.4

det und der entsprechende DC wird bei allen weiteren Schritten

beibehalten.

(5) Der nächste DC wird aus der permutierten Liste genommen und

die Energieminimierung aus Schritt (4) wiederholt, bis alle DC

aus der Liste abgearbeitet sind. Danach wird die Endstruktur mit

allen akzeptierten DC und allen ADC ein letztes Mal energiemini¬miert und die Koordinaten sowie weitere wichtige Parameter

abgespeichert.

(6) Die Prozedur wird erneut bei (2) oder bei (1) gestartet, bis genü¬

gend Strukturen erzeugt sind.

Die so erzeugten Konformationen erfüllen im allgemeinen aufgrunddes gewählten Protokolls nur einen Teil der experimentellen „con¬

straints", aber man erhält mit diesem Vorgehen eine bessere Abdek-

kung des vollen Konformationsraumes des Moleküls. Daher werden

die so erhaltenen Konformationen in einem zweiten Schritt zu Paa¬

ren kombiniert, die dann sämtliche experimentellen Daten besser

erfüllen sollen als die einzelnen Strukturen. Realisiert wird dieser

zweite Schritt, indem man alle möglichen Paare bildet und die Popu¬lationen so optimiert, daß der Gütefaktor Q minimal wird. Dieser

Gütefaktor beschreibt die Abweichung des dynamischen Mittelwer¬

tes der J-Kopplungen und der Protonenabstände von den experi¬mentellen Daten. Blackledge et al. [40] schlugen die Funktion

ö = AI[lpa4/)-/(^)l2+ßl[(^f/))_6-^(T5)r6]2(3-i3)(M) L a (k,D

mit den Normierungs- und Gewichtungsfaktoren

L(M)

-i-i

(3.14)

und


-\ 5>(KD

exp

(M)

-12-1

(3.15)

vor. Diese beiden Faktoren A und B wurden so gewählt, daß die

Mehrzahl aller Werte von Q im Bereich zwischen null und eins liegt.Der effektive wirksame Abstand des Protonenpaares (k, l) ist defi¬

niert als:

,eff(U) 5A(ri:u)>

-1/6

(3.16)

Die Berechnung der Q-Werte beruht auf der Basis der Kreuzpeakvo-lumina (V« 1/r ) und der J-Kopplungen, da die experimentellenFehler auf diesen Skalen homogen sind. Die Gewichtung der J-Kopp¬

lungen gegenüber den NOE-Beiträge erfolgt bei Blackledge [40] über

die Summe der experimentellen Beiträge. In einem letzten Schritt

wurden Paare eliminiert, die für einzelne Parameter zu große Abwei¬

chungen von den experimentellen Werten aufweisen, aber dennoch

einen niedrigen Q-Wert besitzen.

In der Untersuchung von Antamanid in Dioxan soll eine modifizier¬

ter Gütefaktor Qm verwendet werden, der durch eine normierte Feh¬

lerfunktion beschrieben wird. Diese berücksichtigt die experimentel¬len Fehler der beiden Größen und hat die Form:

Q" X(U)

5>«/ft _rexP

D Uk,l)

A7exP*> (KD (M)

.eil -rexP(U) '(Kl)

Ar(M)(3.17)

Die beiden Größen AJ,.exp und Ar£xp sind die experimentellen Fehler,

die mittels Fehlerfortpflanzung aus den Meßwerten berechnet wer¬

den. Die Fehler der J-Kopplungen wurden auf A/exp = 0.5 Hz

geschätzt, und die Fehler in den Abständen berechnen sich zu:

82 Kapitel 3.4

Ar^ = 9.40 • 10~5 • (r (exp;))? + 0.05 • r^ (3.18)

Dabei wurde ein konstanter Fehler der integrierten Volumina ange¬

nommen und eine Ungenauigkeit des geminalen Eichabstandes von

5%. Dieser modifizierte Qm-Wert ist eine normierte Fehlerfunktion,

so daß eine Standardabweichung in einem beliebigen Datenwert

eine Änderung des Qm-Wertes um eine Einheit bewirkt. Damit kann

man die Signifikanz einer Änderung des Qm-Wertes für unterschied¬

liche Paare von Konformationen abschätzen.

3.4.2 Charakterisierung des Konformationsensembles

Sämtliche in Tabelle 3.3 angegebenen 21 NOE-DC's und 80 ADC's

des Peptidgerüstes wurden für die Berechnung der Strukturen in

Dioxan verwendet. Mit der in Anhang 7.2 abgedruckten Implemen¬

tierung der MEDUSA-Prozedur wurden 1181 Strukturen berechnet.

Ausgangspunkt waren fünf verschiedene Strukturen, nämlich die

Röntgenstruktur [27] nach einer Energieminimierung und vier End¬

strukturen aus der Strukturbestimmung in Chloroform [40] (eine

sogenannte (+,+), eine (-,-), eine (+,-) und eine (-,+) Struktur). Die

Energieminimierung nach dem ABNR-Algorithmus [128] wurde mit

dem Molekulardynamikprogramm CHARMM22 [127] unter Ver¬

wendung des Standardparametersatzes für Proteine [128] durchge¬führt. Für jede der erzeugten Konformationen wurden die <|>.- und

y-Winkel der zehn Aminosäuren, die Protonenabstände sämtlicher

DC's und ADC's und ausgehend von den dihedralen Winkeln HN-

N-Ca-Ha die 3J-Kopplungskonstanten nach der Parametrisierung

der Karpluskurve von Bystrov et al. [17]

3/(0) = 9.4cos20 - l.lcose + 0.4 (3.19)

berechnet.

Um das Ensemble von Konformationen zu charakterisieren, wurden

die Standardabweichungen der strukturbestimmenden Winkelpaare


<|)i und \|/ des Peptidgerüstes für die zehn Aminosäuren des Peptid¬

gerüstes berechnet (Abbildung 3.5). Es fällt auf, daß ty5 und <t>10,sowie y4 und t/9 eine hohe Standardabweichung besitzen. Dies deu¬

tet darauf hin, daß das Ensemble der Strukturen in diesen vier Win¬

keln eine breite Streuung aufweist. Betrachtet man die Histogramme

(Abbildung 3.6) der repräsentativ ausgewählten Winkel <|>3, <|>5 und

\|r3, \|/4 so zeigt sich, daß die Verteilung in diesen Winkeln inhomo¬

gen ist. Die beiden dihedralen Winkel <|>3 und \|A3, die eine kleine

Standardabweichung über das Ensemble aufweisen, besitzen eine

scharfe monomodale Verteilung. Demgegenüber weisen die beiden

anderen Winkel <|>5 und \|r4 eine breite bimodale Verteilung auf, mit

einer Differenz der beiden Schwerpunkte von ca. 100°. Dies ist ein

Hinweis, daß auch Antamanid in Dioxan in einem dynamisches

Gleichgewicht zwischen verschiedenen Konformationen vorliegenkönnte.

123456789 10

Aminosäure i

Abbildung 3.5: Standardabweichungen der beiden strukturbestimmenden dihe¬

dralen Winkel <|»1 und i|f( für das erzeugte Ensemble von Konformarionen als

Funktion der Aminosäuresequenz in Antamanid. Auffällig sind die hohen Werte

an den Positionen 4,5 und 9,10.

84 Kapitel 3.4

Sowohl das Winkelpaar \|/4, (|>5 als auch das Paar \j/9, §w sind sehr

stark antikorreliert mit einen Korrelationskoeffizienten von jeweilskleiner als -0.95. Dies zeigt, daß die Bewegungen welche die konfor-

mationellen Änderungen an den zwei Stellen des Peptidgerüstes

bewirken, immer den <t>; und den \|f._ a

Winkel gleichzeitig beeinflus¬

sen. Der Korrelationskoeffizient zwischen den beiden Winkeln <|>5und $10 ist jedoch klein (-0.32), so daß man davon ausgehen kann,

daß diese beiden Bewegungen unabhängig sind. Nimmt man das

Vorzeichen dieser beiden Winkel als ein Maß zur Einteilung der

Strukturen in vier Klassen, so findet man in dem Ensemble 480 (-,-)

Strukturen, 424 (-,+) Strukturen, 252 (+,-) Strukturen und 25 (+,+)

Strukturen. Diese Verteilung ist sehr stark von den gewählten

Anfangsstrukturen abhängig.

120 180

600-

400

200

n- , , , i p r,

-180 -120 -60 0

V3[°]60 120 180

m 180

-120 -60 0

V4fi120 180

Abbildung 3.6: Histogramme je zweier repräsentativer § und \|f Winkel des

generierten Ensembles von Strukturen. Es ist gut erkennbar, daß die zwei dihe¬

dralen Winkel Q3 und y3 eine monomodale Verteilung besitzen, während die

beiden anderen Winkel <)»5 und \|f. eine bimodale Verteilung aufweisen. Dies ist

ein Hinweis auf eine interne Dynamik des Peptidgerüstes.


Die J-Kopplungskonstanten und die gemessenen Abstände des

Ensembles weisen ebenfalls große Streuungen auf und zeigen, daß

der Konformationsraum des Peptids mit der MEDUSA-Prozedur

relativ gut abgesucht wird. Die J-Kopplungskonstanten variieren fast

über den gesamten mögUchen Bereich von ca. 0.5 Hz bis 10.5 Hz mit

dem Schwerpunkt der Verteilungen bei 9 bis 11 Hz. Lediglich für

Phe6 findet man eine abweichende Verteilung mit einem deutlich zu

kleineren Kopplungen verschobenen Zentrum der Verteilung.

Die Verteilung der Qm-Werte für dieses Ensemble von Einzelstruktu¬

ren ist in Abbildung 3.7 wiedergegeben, der beste Qm-Wert ist 9.6,

der schlechteste 26.3. Nur zwei weitere Strukturen mit einem Q1"-

Wert von 10.8 und 11.5 liegen in einem Bereichvon zwei Standardab¬

weichungen oberhalb demjenigen der besten Struktur. Alle anderen

berechneten Strukturen kann man unter der Annahme einer Gauss¬

verteilung der experimentellen Fehler mit einer Wahrscheinlichkeit

von über 95% als nicht signifikant ausschließen. Tabelle 3.5 zeigt die

experimentellen Werte und die berechneten Werte für die drei besten

300

200

100

4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

Qm

Abbildung 3.7: Histogramm der (^-Werte für das Ensemble von 1181 Einzel¬

strukturen. Der niedrigste Wert ist 9.6, der höchste 26.3.

86 Kapitel 3.4

„distance

constraint"Experi¬ment

Struktur Nr.

51018

Struktur Nr.

56025

Struktur Nr.

50270

Nr. NOE-DC r[Ä] r[Ä] Ar[Ä] r[A] Ar[Ä] r[Ä] Ar[Ä]

1 4NH-2Ha 2.57 2.67 0.10 2.64 0.07 2.64 0.07

2 9NH-7Ha 2.55 2.23 -0.32 2.25 -0.30 2.66 0.11

3 6NH-10Ha 3.17 2.81 -0.36 2.79 -0.38 3.29 0.12

4 10NH-7Ha 3.48 4.04 0.56 4.05 0.57 4.59 1.11

5 1NH-5H„ 3.11 3.21 0.10 3.44 0.33 3.22 0.11

6 5NH-2Ha 3.28 4.35 1.07 3.65 0.37 5.72 2.44

7 10NH-6HN 2.80 2.95 0.15 2.95 0.15 4.60 1.80

8 4NH-3Ha 3.25 3.33 0.08 3.35 0.10 3.36 0.11

9 9NH-8Ha 3.15 2.96 -0.19 2.97 -0.18 3.26 0.11

10 6NH-5Ha 2.25 2.36 0.11 2.60 0.35 2.32 0.07

11 10NH-9Ha 2.37 2.73 0.36 2.73 0.36 2.41 0.04

12 lNH-10Ha 2.20 2.32 0.12 2.32 0.12 2.32 0.12

13 5NH-4Ha 2.33 2.35 0.02 2.44 0.10 2.51 0.18

14 5NH-4HN 3.21 4.04 0.83 3.69 0.48 3.42 0.21

15 2Ha-3Ha 2.06 2.19 0.13 2.22 0.16 2.19 0.13

16 öHd-THn 2.04 2.15 0.11 2.15 0.11 2.16 0.12

17 6NH-7Ha 4.66 4.76 0.10 4.76 0.10 4.33 -0.33

18 4NH-4Ha 3.09 2.95 -0.14 2.93 -0.16 2.89 -0.20

19 10NH-10Ha 2.51 2.53 0.02 2.53 0.02 2.72 0.21

20 1NH-4HN 4.09 3.87 -0.22 3.92 -0.17 4.05 -0.04

21 5NH-3Ha 4.75 4.63 -0.12 4.20 -0.55 6.36 1.61

Nr. J-DC JIHz] JIHz] AJ [Hz] JIHz] AJ [Hz] JIHz] AJ [Hz]

1 J(aVal) 8.27 9.32 1.05 9.47 1.20 7.80 -0.47

2 J(4Ala) 8.44 9.28 0.84 8.77 0.33 8.85 0.41

3 J(5Phe) 8.10 9.79 1.69 5.14 -2.96 7.37 -0.73

4 J(6Phe) 7.48 10.82 3.34 10.86 3.38 10.88 3.40

5 J(9Phe) 8.36 9.73 1.37 9.74 1.38 8.89 0.53

6 J(10Phe) 7.90 8.17 0.27 8.18 0.28 6.61 -1.29

Tabelle 3.5: Vergleich der experimentellen und berechneten NOE- und J-DC für

die drei Strukturen mit dem kleinsten Qm-Wert. Die experimentellen und

berechneten Werte sowie die Differenzen dieser Werte sind für alle Abstände

und ^(NH-Hd) Kopplungen gegeben.


Strukturen (Struktur Nr. 51018, 56025 und 50270) für alle NOE-DC

und 3J(NH-Ha)-Kopplungskonstanten. Die Differenzen zwischen

den experimentellen und den berechneten Werten zeigen bei allen

drei Strukturen große Abweichungen in den J-Kopplungen von über

3 Hz. Fast alle J-Kopplungen weisen eine Abweichung von den expe¬

rimentellen Daten auf, die größer ist als der experimentelle Fehler.

Die Übereinstimmung der Abstände mit den experimentellen Wer¬

ten ist besser, aber man findet auch hier Abweichungen bis zu 2.4 Ä.

3.4.3 Charakterisierung der Konformationspaare

Die Suche nach Konformationen im dynamischen Gleichgewicht, die

eine bessere Beschreibung der experimentellen Daten liefern können,

wurde auf Paare von Strukturen beschränkt und der Qm-Wert für

alle möglichen Paare als Funktion der Population minimiert. Dies

führte zu einem Ensemble von 696790 Strukturpaaren mit einem

minimalen C^-Wert von 4.82 (gegenüber 9.56 für die beste Einzel-

struktur) und einem Maximum von 25.03 (schlechteste Einzelstruk-

*1051.5

1.0

0.5-

Qm

Abbildung 3.8: Histogramm der Q"1-Werte für das Ensemble von 696790 Paar¬

strukturen. Der niedrigste C^-Wert ist 4.82, der höchste ist 25.03.

88 Kapitel 3.4

tur 26.28). Die Verbesserung des kleinsten Qm-Wertes gegenüber der

besten Einzelstruktur beträgt damit fast einen Faktor zwei. Die Ver¬

teilung der Qm-Werte für das Ensemble von Paarstrukturen ist in

Abbildung 3.7 als Histogramm wiedergegeben. Im Bereich von zwei

Standardabweichungen um den kleinsten O^-Wert liegen 75 Paare

von Strukturen. Alle anderen Strukturpaare mit einem Qm-Wert grö¬ßer 6.82 können mit einer Wahrscheinlichkeit von über 95% als nicht

relevant ausgeschlossen werden. Die 75 relevanten Strukturpaarekönnen nach den Vorzeichen der vier Winkel W5^\0/ ^5t^10) klassifi¬

ziert werden, wie dies auch bei der Untersuchung in Chloroform [40]

durchgeführt wurde. Diese Klassifizierung führt zu 28 Strukturpaa¬ren des Typs (+,-/-,+), 19 Paaren des Typs (-,-/+,+), einem Paar des

Typs (-,+/+,+) und zu 27 Strukturpaaren des Typs (-,+/-,-). Die Qm-

Werte und die Populationen des jeweils besten Strukturpaares als

Vertreter dieser vier Strukturtypen sind in Tabelle 3.6 zusammenge-

Strukturpaare Qm-Werte

Typ I II Anteil I Anzahl I II Paar

1 (+,-/-,+) 51018 55014 56% 28 9.56 13.50 4.82

2 (-,-/+,+) 50101 53086 62% 19 12.83 21.33 4.93

3 (-,+/+,+) 51018 53086 68% 1 9.56 21.3 5.82

4 (-,+/-,-) 55036 57022 41% 27 15.48 13.94 6.40

Tabelle 3.6: Die O^-Werte und die Populationen des jeweils besten Strukturpaa¬res der vier verschiedenen Strukturklassen.

stellt. Die berechneten Abstände und J-Kopplungskonstanten dieser

vier Strukturpaare finden sich zusammen mit den experimentellenWerten in Tabelle 3.7. In der Nomenklatur von Referenz [40] ist das

beste Strukturpaar (51018/55014) ein anti-Paar, da die beiden Winkel

<|>5 und <|)10 ihr Vorzeichen antikorreliert von (-97°,62°) auf (82\-84°)

ändern. Die Populationen sind fast ausgeglichen und betragen 56%

für die (-,+) und 44% für die (+,-) Struktur. Die Verbesserung des Qm-

Wertes gegenüber den beiden einzelnen Strukturen, aus denen die-


„distance

constraint"Exp.

Strukturpaar51018/55014




Nr. NOE-DC r[A] r[Ä] Ar[Ä] r[Ä] Ar[Ä] r[Ä] Ar[Ä] r[Ä] Ar[Ä]

1 4NH-2Ha 2.57 2.41 -0.16 2.65 0.08 2.67 0.10 2.64 0.07

2 9NH-7Ha 2.55 2.44 -0.11 2.66 0.11 2.32 -0.23 2.47 -0.08

3 6NH-10H„ 3.17 2.87 -0.30 3.18 0.01 2.87 -0.30 3.12 -0.05

4 10NH-7HO 3.48 4.29 0.81 3.67 0.19 3.63 0.15 4.72 1.24

5 1NH-5H„ 3.11 3.10 -0.01 3.46 0.35 3.39 0.28 3.18 0.07

6 5NH-2Ha 3.28 3.94 0.66 3.64 0.36 3.66 0.38 4.06 0.78

7 10NH-6HN 2.80 3.19 0.39 3.03 0.23 2.80 0.00 3.39 0.59

8 4NH-3Ha 3.25 3.30 0.05 3.28 0.03 3.31 0.06 3.34 0.09

9 9NH-8H,! 3.15 3.08 -0.07 3.23 0.08 3.03 -0.12 3.20 0.05

10 6NH-5Ha 2.25 2.35 0.10 2.37 0.12 2.37 0.12 2.41 0.16

11 10NH-9Ha 2.37 2.60 0.23 2.64 0.27 2.87 0.50 2.39 0.02

12 1NH-10H„ 2.20 2.40 0.20 2.50 0.30 2.46 0.26 2.26 0.06

13 5NH-4H„ 2.33 2.45 0.12 2.43 0.10 2.49 0.16 2.31 -0.02

14 5NH-4HN 3.21 3.21 0.00 3.25 0.04 3.31 0.10 3.64 0.43

15 2Ha-3Ha 2.06 2.33 0.27 2.18 0.12 2.19 0.13 2.29 0.23

16 8Ha-7Ha 2.04 2.13 0.09 2.16 0.12 2.16 0.12 2.28 0.24

17 6NH-7Ha 4.66 4.58 -0.08 4.53 -0.13 4.71 0.05 4.47 -0.19

18 4NH-4H0t 3.09 2.93 -0.16 2.91 -0.18 2.92 -0.17 2.94 -0.15

19 lONH-lO^ 2.51 2.65 0.14 2.46 -0.05 2.41 -0.10 2.68 0.17

20 1NH-4HN 4.09 4.00 -0.09 4.34 0.25 4.09 0.00 4.04 -0.05

21 öNH^Ha 4.75 4.90 0.15 4.73 -0.02 4.61 -0.14 4.64 -0.11

Nr. J-DC JIHz] JIHz] AJIHz] JIHz] AJIHz] JIHz] AJIHz] IIHzl AJ [Hz]

1 J^Val) 8.27 9.01 0.74 8.47 0.20 7.77 -0.50 7.28 -0.99

2 J(4Ala) 8.44 8.79 0.35 8.06 -0.38 8.15 -0.29 9.76 1.32

3 J(5Phe) 8.10 8.67 0.57 7.27 -0.83 7.90 -0.20 7.76 -0.34

4 J(6Phe) 7.48 7.60 0.12 8.42 0.94 8.83 1.35 8.69 1.21

5 J(9Phe) 8.36 8.51 0.15 8.76 0.40 9.23 0.87 8.96 0.60

6 J(10Phe) 7.90 7.55 -0.35 7.09 -0.81 8.24 0.34 8.33 0.43

Tabelle 3.7: Abstände und J-Kopplungskonstanten der jeweils besten Struktur¬

paare der vier verschiedenen Strukturklassen im Vergleich zu den experimentel¬len Werten. Die Abweichungen der einzelnen Parameter Ar und AJ ist gegenüberden einzelnen Strukturen (Tabelle 3.5) stark reduziert.

90 Kapitel 3.5

ses Paar gebildet wird, beträgt fast einen Faktor zwei und auch die

maximalen Abweichungen in den einzelnen Parametern reduzieren

sich auf 0.8 Ä in den Distanzen und 0.7 Hz in den J-Kopplungen.Nur zwei der insgesamt 27 „constraints" liegen knapp außerhalb der

experimentellen Fehlergrenzen. Das zweitbeste Strukturpaar, mit

einem minimal größeren Qm-Wert, ist ein syn-Paar, da die Vorzei¬

chen der Winkel sich hier korreliert von (-102°,-87°) nach (26°,66°)

ändern. Hierbei sind die Populationen mit 62% der (-,-) Konforma¬

tion etwas weniger ausgeglichen als bei dem anti-Paar. Auch bei die¬

sem Paar findet man eine gute Übereinstimmung der Abstände

(maximale Abweichung 0.4 Ä) und der J-Kopplungen (maximale

Abweichung 0.9 Hz) mit den experimentellen Werten. Diese beiden

Strukturpaare sind in Abbildung 3.9 als Stereobilder wiedergegeben.Neben diesen beiden Typen findet man in dem Ensemble von 75 Paa¬

ren auch noch die Strukturpaare (51018/53086) und (55036/57022)

bei denen nur einer der beiden Winkel sein Vorzeichen nach dem

Schema (-,+) «-» (+,+) bzw. (-,+) <-» (-,-) ändert. Diese beiden Paare

weisen einen deutlich schlechteren Qm-Wert von 5.8 bzw. 6.4 auf, als

das syn- und das anti-Paar und sie weisen größere Differenzen zu

den experimentellen Daten auf.

3.5 Diskussion der Ergebnisse

Die von Blackledge et al. [40] vorgeschlagene MEDUSA-Prozedur

wurde in der Bewertung der Strukturpaare (Qm-Wert) so modifiziert,

daß eine Gewichtung der Abstände und J-Kopplungskonstanten mit

ihrem berechneten experimentellen Fehler erfolgt. Dadurch wird die

Abschätzung der Signifikanz einer Änderung des Qm-Wertes mög¬

lich und erlaubt es, ein Ensemble von relevanten Strukturpaaren aus¬

zuwählen. Auf die Benutzung eines Kriteriums der maximalen

Abweichungen für einzelne Abstände und J-Kopplungen wurde ver¬

zichtet, da die Fehler auf der Skala der Abstände nicht linear sind.

Trotzdem sind die maximalen Abweichungen der besten erzeugten

Strukturpaare fast alle in den Grenzen der experimentellen Fehlerin-

Diskussion der Ergebnisse 91

Abbildung 3.9: Stereobilder der beiden besten Strukturpaare. Das Paar (51018/

55014) ist ein anti-Paar, d.h. die beiden dihedralen Winkel <|>5 und tyw ändern

sich antikorreliert. Das Paar (50101/53086) ist ein syn-Paar, bei dem sich die bei¬

den dihedralen Winkel korreliert ändern.

92 Kapitel 3.5

tervalle. Dies zeigt, daß man bei Verwendung einer sinnvoll gewich¬teten Fehlerfunktion auf dieses Kriterium verzichten kann.

Ein Vergleich der Ergebnisse aus Kapitel 3.4.3 mit den Ergebnissender Studie an Antamanid in Chloroform [40] zeigt, daß das Verhalten

von Antamanid in beiden Lösungsmitteln ähnlich ist. In Dioxan muß

die Interkonversion zwischen den beteiligten Konformationen

schneller sein als in Chloroform, da keine Feldstärkeabhängigkeitder Tlp-Messungen der NH-Protonen gefunden wurde. Eine

Abschätzung der Austauschkonstanten ergibt xex « 10 |xs (T=300K).

Sowohl in Dioxan als auch in Chloroform sind die beiden besten

Strukturpaare ein syn-Paar, bei dem die beiden Winkel ty5 und <t>10ihr Vorzeichen gleichzeitig und in der gleichen Richtung ändern,

und ein anti-Paar, bei dem der Vorzeichenwechsel antikorreliert ist.

Darüber hinaus wurden in Dioxan weitere Typen von Strukturpaa¬ren gefunden, bei denen sich nur einer der beiden Winkel ändert.

Diese weisen zwar einen größeren Qm-Wert als das syn- und das

anti-Paar auf, liegen aber immer noch innerhalb eines Bereiches von

zwei Standardabweichungen um den niedrigsten Wert. Eine zusätz¬

liche Klassifizierung der Strukturen nach den Wasserstoffbrücken¬

bindungen ist im Falle des Dioxans nicht möglich, da über die Tlp-Zeiten der Amidprotonen keine weitere Informationen über die Art

dieser Bewegung erhalten wurde.

Die zusätzlichen Strukturpaare in Dioxan, bei denen sich nur einer

der beiden Winkel ändert, sind ein Hinweis, daß die Bewegungenbei \|r4, <|)5 und y9, <t>10 unabhängig voneinander ablaufen können.

Die Abweichung der berechneten Parameter für die besten Struktur¬

paare von den experimentellen Werten liegen fast alle innerhalb der

Fehlerbereiche der experimentellen Daten. Daher ist eine Erweite¬

rung des dynamischen Gleichgewichts auf vier Strukturen in diesem

Fall nur sinnvoll, wenn sich hierdurch die Anzahl der freien Parame¬

ter nicht vergrößert.

Bewegung von Phenylalaninseitenketten 93

4 Bewegung von Phenylalaninseitenketten

4.1 Einleitung

An einem einfachen Beispiel sollen die Grenzen einer Charakterisie¬

rung der Seitenkettenbewegung in Peptiden und Proteinen durch

NMR-Relaxationsmethoden getestet werden. Als Testsystem wurden

die vier Phenylalaninseitenketten in Antamanid benutzt, deren

Bewegung durch verschiedene Bewegungsmodelle mit zwei inter¬

nen Freiheitsgraden beschrieben wird. Die beiden Freiheitsgrade

(siehe Abbildung 4.1) sind die Rotation um den Winkel %v d.h. um

die Ca-Cß-Bindung, und die Rotation um den Winkel %2, d.h. die

Rotation des Phenylringes um die Cß-Cy-Bindung. Die physikali¬schen Modelle zur Beschreibung der Bewegung der Seitenkette um

die beiden Rotationsachsen sollen mit Hilfe experimenteller Relaxa¬

tionsdaten analysiert werden, die für alle Kohlenstoffatome der

Phenylalaninseitenketten außer dem quartären Cy gemessen wur¬

den. Hierzu wurden die analytischen Lösungen für die Relaxations-

Abbildung 4.1: Definition der zwei Bewegungsfreiheitsgrade für die Rotation

der Phenylalaninseitenkette. x, markiert die Rotation um die erste, x2 die Rota¬

tion um die zweite Bindung der Seitenkette, ß ist der Winkel zwischen den bei¬

den Rotationsachsen und wurde bei allen Berechnungen als 109.5° (idealer Tetra¬

ederwinkel) angenommen.

94 Kapitel 4.2

ratenkonstanten numerisch an die gemessenen Daten angepaßt und

so die unterschiedlichen Parameter zur Beschreibung der Bewegun¬

gen für jedes Modell optimiert. Die wichtigste Fragestellung bei die¬

ser Untersuchung ist, ob sich die unterschiedlichen theoretischen

Modelle signifikant unterscheiden lassen, d.h. ob die gemessenen,

fehlerbehafteten Daten eine Aussage über die Art der Seitenketten¬

bewegung erlauben. Um eine sinnvolle Auswertung der Daten zu

ermöglichen, dürfen die verwendeten Modelle nicht zu komplex

sein, da sonst die Anzahl der freien Parameter schnell ansteigt. Es

muß außerdem beachtet werden, daß die Relaxationsratenkonstan¬

ten nur in einem relativ engen Bereich

10 -xc > x > t/10 (4.1)

empfindlich auf die interne Bewegung sind, wobei x. die Korrelati¬

onszeit der internen Bewegung und xc die Korrelationszeit des „rota¬

tional tumbling" ist.

4.2 Einfluß der internen Bewegung auf die Relaxation

Die allgemeinen Formeln für die Berechnung der Relaxationsraten¬

konstanten aus Kapitel 2 sollen in diesem Abschnitt für den speziel¬len Fall der Phenylalaninseitenketten vereinfacht werden. Wir neh¬

men im weiteren an, daß die Kohlenstoffatome nur durch die dipo-lare Wechselwirkung mit den direkt gebundenen Protonen und

durch die chemische Verschiebungsanisotropie relaxiert werden, d.h.

daß der Einfluß anderer Protonen auf die Relaxation der Kohlen¬

stoffatome vernachlässigt werden kann. Berechnet man den Einfluß

der nächsten nicht direkt gebundenen Protonen auf die dipolare

Relaxation der Kohlenstoffatome, so findet man pro Proton einen

Beitrag zur Relaxationsratenkonstanten von ca. 1.5% des Beitrages

eines direkt gebundenen Protons. Diese Vernachlässigung führt

daher zu einem Fehler von ca. 1-5% in den berechneten Relaxations¬

zeiten, abhängig von der Anzahl der direkt gebundenen Protonen

und der Anzahl nächster Nachbarn. Die chemische Verschiebungs-

Einfluß der internen Bewegung auf die Relaxation 95

anisotropie der Protonen und auch der aliphatischen Kohlenstoff¬

atome wird vernachlässigt. Eine Abschätzung der Größe dieses

Effektes wird am Ende dieses Kapitels gegeben.

Unter der Annahme eines isotropen „rotational tumbling" kann man

sämtliche autokorrelierten spektralen Leistungsdichtefunktionen in

der Form einer verallgemeinerten spektralen Leistungsdichtefunk¬tion

oo

/ffi^>W<«) = 4* / *<rl>) rJS'W)*-*" (4.2)

—oo

schreiben, da die beiden Wechselwirkungen dipolare Kopplung und

chemische Verschiebungsanisotropie mit Hilfe von Tensoren vom

Rang zwei beschrieben werden können. Nimmt man zusätzlich an,

daß die beiden Wechselwirkungen eine starre relative Orientierungzueinander besitzen, so kann man auch die kreuzkorrelierten spek¬tralen Leistungsdichtefunktionen durch die verallgemeinerte spek¬trale Leistungsdichtefunktion (4.2) ausdrücken [84]. In diesem Fall

berücksichtigt man die Koordinatentransformation zwischen den

Hauptachsensystemen der beiden Tensoren nicht in der Korrelati¬

onsfunktion, sondern durch einen konstanten Faktor in den kreuz¬

korrelierten Kreuzrelaxationsratenkonstanten des Relaxationssuper¬

operators.

Für den numerischen Fit der Modelle zur Analyse der Seitenketten¬

bewegungen wurden folgende Relaxationsratenkonstanten verwen¬

det:

- Die longitudinale Autorelaxationsratenkonstante der Kohlenstoff¬

atome (Ti-Zeit).

- Die Kreuzrelaxationsratenkonstanten zwischen Protonen und Koh¬

lenstoffatomen (heteronuklearer statischer NOE).

96 Kapitel 4.2

- Die Kreuzrelaxationsratenkonstante zwischen S2-Polarisation und

dem Zweispinterm 2SZIZ, die durch die Kreuzkorrelation von

dipolarer Kopplung und der chemischen Verschiebungsanisotro-

pie der Kohlenstoffatome erzeugt wird.

Die analytischen Ausdrücke für diese Relaxationsratenkonstanten in

den betrachteten Zwei- und Dreispinsystemen findet man in der

Literatur [73,84] und sind in der hier verwendeten Notation zur bes¬

seren Übersichtlichkeit wiedergegeben:

r = n.rD-D +rc'c32,»2 52,32 s2,ä2

2 2

r£s2 = gjßi) -^^[3/(cos) + /(a)7-a>s) + 67(co/ + cos)]ris

r^c. = _L(Yß )2[G2 +a2 +o2S

.S 1C v 's Uy L

xx vv 2:^\1SU0' l"«T"yyT"2z

vxx yy xx zz yy zz' J 'v S'

Tis

v '> i'IS

c2r+(o„-<0(3cosi9 -1) ]-J(wJ

(4.3)

Hierbei bedeutet der Index 'D' rechts oben dipolare Kopplung und

der Index 'C chemische Verschiebungsanisotropie. aü sind die

Hauptachsenwerte des chemischen Verschiebungstensors und 0( r

ist der Winkel zwischen dem C-H-Bindungsvektor f und der Haupt¬

achse i des CSA-Tensors.

Wie man in den Gleichungen (4.3) sieht, sind die Relaxationsraten¬

konstanten im allgemeinen Linearkombinationen der spektralen Lei-


stungsdichte der Frequenzen 0, (ös, o^-toj, to^ u)z + cos und 2(örUm unabhängige Werte von /(w) an diesen Frequenzen zu erhalten,

muß man so viele Relaxationsratenkonstanten mit einer unterschied¬

lichen Abhängigkeit von /(co) messen, wie unterschiedliche Frequen¬

zen in diesen vorkommen. Peng und Wagner [129] haben als erste

versucht, die numerischen Werte für die spektrale Leistungsdichtean den verschiedenen Frequenzen zu bestimmen, indem sie einen

ausreichend großen Satz linear unabhängiger Relaxationsdaten

maßen und das dazugehörende lineare Gleichungssystem (analog zu

Gleichung (4.3)) nach den spektralen Leistungsdichten an den

benutzten Frequenzen auflösten. Bei diesem Ansatz muß man die

numerischen Werte für /((o) mit unterschiedlichen physikalischenModellen vergleichen, um Aussagen über die interne Dynamik eines

Moleküls machen zu können.

Eine weitere Möglichkeit, um mehrere unabhängige Meßwerte für

die spektralen Leistungsdichtefunktionen zu erhalten, besteht darin,

die gleichen Experimente bei unterschiedlichen Spektrometerfre-

quenzen durchzuführen. Die Variation der Spektrometerfrequenz ist

allerdings durch die erforderliche Auflösung und Empfindlichkeitder gemessenen Spektren in der Frequenz nach unten und durch die

Verfügbarkeit homogener supraleitender NMR-Magneten nach oben

begrenzt (die maximale Protonenresonanzfrequenz ist zur Zeit

750 MHz). Beide Möglichkeiten, die Messung bei unterschiedlichen

Resonanzfrequenzen und die Messung mehrerer unabhängiger Rela¬

xationsratenkonstanten, wurden bei der Analyse der Seitenkettenbe¬

wegung der Phenylalaninreste ausgenutzt, indem drei Relaxations-

ratenkonstanten bei den Spektrometerfrequenzen 200.13 MHz,

400.13 MHz und 600.13 MHz gemessen wurden, soweit dies die

Empfindlichkeit des Experimentes und die Auflösung der Spektrenerlaubte.

Ein sinnvoller Vergleich der unterschiedlichen Bewegungsmodelleist nur möglich, wenn man die Genauigkeit der verwendeten Meß-

98 Kapitel 4.2

daten berücksichtigt und für die verwendeten Parameter, wie Bin¬

dungslängen, Bindungswinkel oder CSA-Tensoren, die in die Simu¬

lation der gemessenen Geschwindigkeitskonstanten eingehen, mög¬lichst exakte Literaturwerte verwendet. Daher wird in diesem Kapi¬

tel die Wahl der wichtigsten Parameter diskutiert. Auf das Problem

der Meßfehler wird in Kapitel 4.6 im Rahmen der Fehlerbetrachtung

genauer eingegangen werden.

Einer der wichtigsten Parameter für die Berechnung der Relaxations¬

ratenkonstanten ist die Bindungslänge der C-H-Bindung. Da die

Geschwindigkeitskonstante mit 1/r von der Bindungslänge

abhängt, führt bereits ein Fehler von nur 2% in der Bindungslänge zu

einem Fehler von ca. 13% in der Relaxationsratenkonstanten. Daher

ist es wichtig, daß die verwendeten Bindungslängen mit einer mög¬

lichst exakten Methode bestimmt wurden und für die drei Arten von

C-H-Bindungen spezifische Werte verwendet werden. Die Bindungs¬

längen können z.B. mit Hilfe der Mikrowellenspektroskopie, mit

NMR-Spektroskopie in flüssigen Kristallen oder mit Hilfe der Neu¬

tronenbeugung bestimmt werden.

Für Phenylalanin gibt es in der Literatur nur C-H-Abstände aus Neu¬

tronenbeugungen. Allerdings weisen die verfügbaren Daten für Phe¬

nylalanin [130] für die C-H-Bindungen einen berechneten Fehler von

bis zu 3% auf und sind daher für unsere Zwecke nicht genau genug

und ungeeignet. Daher wurden für die Ca-Ha und Cß-Hß Bindungendie genaueren Bindungslängen aus einer Neutronenbeugung von

Tyrosinhydrochlorid [131] (gemessene Abstände: ra a

=

1.094 ± 0.003 Ä, r,)p= 1.094 ± 0.004 Ä; thermisch korrigierteC H

o o

Abstände: ra„

= 1.097 A, rp ß

= 1.098 A) und für die aromatischenC fi C H

Bindungen die Bindungslängen aus einer Neutronenmessung an

Benzamid [132] (gemessener Abstand: rCH = 1.094 + 0.003 Ä; ther¬

misch korrigierter Abstand: rCH = 1.097 Ä) verwendet. Diese Meß¬

werte aus der Neutronenbeugung kann man aufgrund der unter¬

schiedlichen Schwingungsmittelung der Bindungslängen in der


Neutronenbeugung (hier erfolgt eine lineare Mittelung (rik)) und in

der NMR-Spektroskopie (durch die dipolare Kopplung werden die—%

Bindungen nach (rik) gemittelt) nicht direkt verwenden. Man muß

die Werte aus der Neutronenbeugung für die Verwendung in der

Auswertung von NMR-Daten korrigieren. Szabo und Henry [133]

zeigten, daß der Einfluß der Schwingungsmittelung auf die dipolare

Kopplungskonstante praktisch unabhängig von der Umgebung und

von der Art der Bindung ist. Daher kann man die Bindungslängen,

die mit der Neutronenstreuung ermittelt wurden, in einer guten

Näherung mit einem konstanten Faktor skalieren, um den NMR-

aktiven Abstand zu erhalten. Dieser Faktor wurde von Henry und

Szabo bestimmt [133] und hat den Wert 1.010. Die für die thermische

Bewegung korrigierten Daten der Neutronenbeugung wurden mit

diesem Faktor skaliert und für sämtliche Berechnungen verwendet.

Die Bindungslängen für Ca-Ha beträgt damit 1.108 Ä, für Cß-Hß1.109 Ä und für die aromatischen C-H-Bindungen 1.101 Ä.

Ein zweiter ebenfalls wichtiger Parameter für die Berechnung der

Relaxationsratenkonstanten ist die Anisotropie der chemischen Ver¬

schiebungstensoren. Die Anisotropie der chemischen Verschiebung

aller Protonen wurde als Null angenommen, obwohl Kreuzrelaxa¬

tion aufgrund der chemischen Verschiebungsanisotropie von Proto¬

nen in der Literatur bereits beschrieben wurden [87,134]. Die Grö¬

ßenordnung der Anisotropie des CSA-Tensors für Protonen wurde

von Kutzelnigg et al. auf ca. 10 ppm abgeschätzt [135]. Auch für die

aliphatischen Kohlenstoffatome wurde der Einfluß der CSA-Aniso-

tropie vernachlässigt, da auch hier die Anisotropie des Tensors in der

Größenordnung von nur ca. 20 ppm liegt. Der Fehler der durch diese

Vernachlässigungen erzeugt wird beträgt für das betrachtete Mole¬

kül und eine Protonenresonanzfrequenz von 600 MHz ca. 1% und

liegt damit deutlich unter der Meßgenauigkeit der Geschwindig¬

keitskonstanten. Für die aromatischen Kohlenstoffatome wurde der

volle Tensor verwendet, der aus Festkörpermessungen an Benzol

[136] bekannt ist. Die erste Hauptachse des Tensors (azz = 118 ppm)

100 Kapitel 4.3

liegt parallel zu der C-H-Bindung, die zweite Hauptachse (o -

-97 ppm) steht senkrecht auf der Ebene des aromatischen Ringes und

die dritte (oyy = -21 ppm) liegt senkrecht zu den ersten beiden

Hauptachsen tangential zum Phenylring.

4.3 Bewegungsmodelle für die Phenylalaninseitenkette

Um die Korrelationsfunktionen und damit die spektralen Leistungs¬dichtefunktionen zu berechnen, werden folgende Annahmen für die

untersuchten Modelle gemacht:

- Das Molekül hat ein starres Peptidgerüst und führt eine isotrope

Rotationsbewegung (isotropes „rotational tumbling") im Lösungs¬mittel aus.

- Es gibt keine weiteren internen Bewegungen des Peptidgerüstes.

- Die internen Rotationsbewegungen und das „rotational tumbling"sind nicht korreliert.

- Die beiden internen Bewegungen sind unkorreliert.

Die Kohlenstoffatome der Phenylalaninseitenkette kann man bezüg¬lich ihrer Empfindlichkeit auf die drei betrachteten Bewegungen

(Abbildung 4.1) in drei Klassen einteilen:

- Ca wird nur vom „rotational tumbling" des gesamten Moleküls

und nicht von den Rotationen um die beiden Achsen der Seiten¬

kette beeinflußt.

- Cß und C^ werden durch die Rotation um %1 und durch das „rota¬

tional tumbling" beeinflußt.

- Cg und CE werden durch beide interne Bewegungen, d.h. durch die

Rotation um %j und um %2, und durch das „rotational tumbling"beeinflußt.

In den folgenden drei Unterkapiteln werden acht Bewegungsmo¬delle für die Rotation um die beiden Achsen und der Einfluß der

Bewegungsmodelle für die Phenylalaninseitenkette 101

Modelle auf die drei Klassen von Kohlenstoffatomen kurz beschrie¬

ben. Die dazugehörigen analytischen Formeln für die spektralen

Leistungsdichtefunktionen J(u)) aus Gleichung (4.3) sind in Anhang

7.3 gesammelt für alle Modelle wiedergegeben.

4.3.1 Bewegungsmodell für das Ca-Atom

Unter der Annahme eines starren Peptidgerüstes wird der C-H dipo¬

lare Vektor der a-Kohlenstoffatome nur durch das isotrope „rotatio¬

nal tumbling" des gesamten Moleküls beeinflußt. Daher ist hier die

spektrale Leistungsdichtefunktion für alle Bewegungsmodelle (A-H)

durch Gleichung (7.3) beschrieben.

4.3.2 Bewegungsmodelle für Cß und C^Die Relaxation der beiden Kohlenstoffatome Cß und C^ wird durch

die Bewegung um %y und durch das „rotational tumbling" beein¬

flußt, nicht jedoch durch die Bewegung um %r Die dipolaren Vekto¬

ren der drei C-H Bindungen nehmen den gleichen Winkel mit der

Rotationsachse der Bewegung um %1 von 70.5" ein. Daher ist der Ein¬

fluß der Bewegung um %x auf die beiden Kohlenstoffatome gleich,

und die Formeln zur Berechnung der Relaxationsratenkonstanten

unterscheiden sich nur in der Anzahl der direkt gebundenen Proto¬

nen, in der Bindungslänge der CH-Bindung und in der Größe der

Anisotropie des CSA-Tensors. Wie bereits in Kapitel 2.6 diskutiert

wurde, kann man die Modelle in zwei Klassen einteilen, die sich im

Ansatz zur Beschreibung der Rotationsbewegung unterscheiden.

Auf der einen Seite kann man die Bewegung um xa durch Diffusi¬

onsmodelle beschreiben, wobei der erlaubte Winkelbereich entweder

in der Amplitude beschränkt oder unbeschränkt sein kann. Auf der

anderen Seite kann man die Bewegung durch Sprungmodelle mit

einer unterschiedlichen Anzahl diskreter Positionen und mit unter¬

schiedlichen Populationen beschreiben. Die Zahl und die Position

der Minima sollte die Symmetrie des betrachteten Fragmentes

berücksichtigen. Im Falle der Rotation um den Xj-Winkels wird die

102 Kapitel 4.3

Bewegung im einfachsten Modell durch Sprünge zwischen drei

unterschiedlich besetzten Positionen beschrieben, die um jeweils120° auseinander liegen. Aufgrund der hohen Komplexität des allge¬meinen Dreisprungmodells mit zwei Populationen und drei Über¬

gangsraten, wurde nur ein vereinfachtes symmetrisches Dreisprung¬modell verwendet, bei dem zwei der drei Populationen gleich sind.

Wie sich im Verlauf der Untersuchung herausstellte, war selbst die¬

ses Modell immer noch zu komplex und mußte weiter vereinfacht

werden.

Im weiteren sollen für die Bewegung um %1 die folgenden vier

Modelle berücksichtigt werden, für die die analytischen Ausdrücke

der spektralen Leistungsdichtefunktionen im Anhang wiedergege¬ben sind:

- Freie Diffusion um %1 (Gleichung (7.4), Modell A und B).

- Dreisprungmodell mit gleichen Populationen (Gleichung (7.5),

Modell C und D).

- Symmetrisches Dreisprungmodell (siehe Kapitel 2.6.3) mit unter¬

schiedlichen Populationen (Gleichung (7.6), Modell E und F).

- Auf den Winkelbereich [-<p0, +<p0] beschränkte Diffusion um %j

(Gleichung {7.7), Modell G und H).

4.3.3 Bewegungsmodelle für C5 und Ce

Die Relaxationsratenkonstanten der beiden Kohlenstoffatome C8

und Ce werden durch beide internen Rotationen und durch das

„rotational tumbling" des Moleküls beeinflußt. Aufgrund der Sym¬metrie des Phenylringes (Planarität) müssen die Modelle zur

Beschreibung der Bewegung um %2 symmetrisch bezüglich einer

Drehung um 180° sein. Die wahrscheinlichsten Modelle, die diese

Bedingung erfüllen, sind ein Zweisprungmodell mit gleichen Popu¬lationen und die freie Diffusion um %r Kompliziertere Sprungmo¬delle mit mehr als zwei Positionen sind möglich, aber unwahrschein-

Bewegungsmodelle für die Phenylalaninseitenkette 103

licher, da sie weitere Minima im Rotationspotential des Phenylringesvoraussetzen. Ein anderes geeignetes Modell für die Bewegung um

X2, das ebenfalls im weiteren nicht berücksichtigt werden soll, ist die

Kombination des Zweisprungmodells mit gleichen Populationenund einer beschränkten Diffusion um die beiden Gleichgewichtsla¬

gen des Sprungmodells. Aufgrund der zu langen Rechenzeiten war

eine numerische Auswertung dieses Modells nicht möglich.

Die acht Modelle entstehen durch die Kombination der vier Modelle

für die Bewegung um xx mit den zwei Modellen für die Bewegungum Xr Auch hier sind die analytischen Ausdrücke für die acht

Modelle gesammelt in Kapitel 7.3 wiedergegeben:

- Freie Diffusion um xx und um x2 (Gleichung (7.9), Modell A).

- Freie Diffusion um Xj und Zweisprungmodell mit gleichen Popu¬lationen um x2 (Gleichung (7.10), Modell B).

- Dreisprungmodell mit gleichen Populationen um x1 und freie Dif¬

fusion um x2 (Gleichung (7.11), Modell C).

- Dreisprungmodell mit gleichen Populationen um X\ und Zwei¬

sprungmodell mit gleichen Populationen um %2 (Gleichung (7.12),

Modell D).

- Symmetrisches Dreisprungmodell mit unterschiedlichen Popula¬tionen um X\ un£* freie Diffusion um x2 (Gleichung (7.13), Modell

E).

- Symmetrisches Dreisprungmodell mit unterschiedlichen Popula¬tionen um X\ ""d Zweisprungmodell mit gleichen Populationenum x2 (Gleichung (7.14), Modell F).

- Beschränkte Diffusion um Xj und freie Diffusion um x2 (Gleichung(7.15), Modell G).

- Beschränkte Diffusion um Xj und Zweisprungmodell mit gleichen

Populationen um x2 (Gleichung (7.17), Modell H).

104 Kapitel 4.4

4.4 Messung der Relaxationsdaten

Alle Messungen für diese Untersuchung wurden auf AC-200F, MSL-

400 und AMX-600 Spektrometern der Fa. Bruker durchgeführt. Die

entsprechenden Protonenresonanzfrequenzen sind 200.13, 400.13

und 600.13 MHz. Für die Messungen wurden zwei unterschiedliche

Proben von Antamanid in 99.9% deuteriertem Chloroform verwen¬

det, eine 34.9 mM Lösung in einem 5 mm Probenröhrchen bei 600.13

MHz und eine 15.5 mM Lösung in einem 10 mm Probenröhrchen bei

200.13 und 400.13 MHz. Die Temperatur betrug bei allen Messungen320 K. Die Zuordnung der chemischen Verschiebungen aller Kohlen¬

stoffatome in Antamanid basierte auf den veröffentlichten Daten von

Müller bei 300 K [36-38] und auf HMQC- [114,115] und HMBC-Spek¬tren [116]. Die chemischen Verschiebungen sind auf deuteriertes

Chloroform (8 = 77.0 ppm) bezogen und finden sich in Tabelle 7.4

(siehe Anhang 7.4).

4.4.1 Kohlenstoff TrZeiten

Alle ^C-Tj-Zeiten wurden als lD-Spektren unter Protonenentkopp¬

lung und 13C-Detektion mit Hilfe der „Inversion Recovery" Methode

[124] bestimmt. 17 Spektren mit unterschiedlichen Mischzeiten xmzwischen 4us und 4 s wurden bei den drei Protonenresonanz¬

frequenzen von 200.13, 400.13 und 600.13 MHz gemessen. Nach der

Fouriertransformation wurde eine Basislinienkorrektur mit einem

Polynom fünfter Ordnung durchgeführt und die Zeitkonstante des

Zerfalls der einzelnen Linien mit Hilfe einer exponentiellen Funktion

der Form

I(xm) = I0{l-a.e'Xm/Tl) (4.4)

an die experimentellen Daten angepaßt. Die Optimierung wurde mit

Hilfe des Nelder-Mead [137] Simplex-Algorithmus, implementiertim Programmpacket MATLAB [138], durchgeführt. Unter der

Annahme unabhängiger und gleichgewichteter Meßwerte wurde die

Messung der Relaxationsdaten 105

Kovarianzmatrix der Fitparameter berechnet [139]. Die aus dem Fit

resultierenden Tj-Zeiten bei den unterschiedlichen Protonenreso¬

nanzfrequenzen und die berechneten Fehler sind in Tabelle 7.4 (siehe

Anhang 7.4) zusammengestellt. Betrachtet man die Tj-Relaxations-

zeiten der Ca-Kohlenstoffatome, so sieht man daß diese deutliche

Variationen aufweisen. Dies ist ein Hinweis, daß die Annahme eines

vollständig starren Peptidgerüstes nicht zutrifft, sondern sehr wohl

zusätzliche interne Bewegungen auch die Ca-Atome beeinflussen.

Diese zusätzlichen Bewegungen werden im Abschnitt 4.6 kurz dis¬

kutiert.

4.4.2 Kern-Overhauser-Effekt (NOE)

Der Kern-Overhauser-Effekt (NOE) wurde nach einer Methode von

Kay et al. [140] gemessen. Dabei wird die Vorsättigung durch eine

Serie von 120° Pulsen mit einem Pulsabstand von 20 ms erreicht. Um

eine statistische Abschätzung der Fehler zu erhalten, wurden drei

Spektren mit und drei ohne Vorsättigung unter identischen Bedin¬

gungen bei den Protonenresonanzfrequenzen von 400.13 und 600.13

MHz aufgenommen. Nach der Fouriertransformation und Basis¬

linienkorrektur wurden alle Peaks integriert und der Mittelwert und

die Standardabweichungen für die beiden Sets mit und ohne Vorsät¬

tigung berechnet. Die NOE-Faktoren sind das Verhältnis der Intensi¬

täten mit und ohne Vörsättigung und finden sich zusammen mit den

berechneten Fehlern in Tabelle 7.5 (siehe Anhang 7.4). Die heteronu¬

kleare Kreuzrelaxationsratenkonstante rq , kann man aus den stati-

sehen heteronuklearen NOE-Werten und den Tj-Zeiten der Kohlen¬

stoffatome berechnen [141]:

rs i

=?•—^-'(NOE-1) (4.5)** 7; Ti(13C)

106 Kapitel 4.4

Diese Formel folgt aus den gekoppelten Differentialgleichungen für

die Beschreibung der Relaxation im Zweispinsystem, wenn man die

Stationaritätsbedingung

jj (Sz)(t) = 0 (4.6)

und zusätzlich (lz)(t = °o) = 0 annimmt. Eine exakte Herleitungdieser Formel, die auch die Umwandlung der longitudinalen Terme

in transversale Terme berücksichtigt, findet man in einem Artikel

von Boulat und Bodenhausen [142].

4.4.3 Heteronukleare kreuzkorrelierte Kreuzrelaxation

Die Kreuzrelaxationsratenkonstante F7c , , wird durch die Kreuz-

korrelation der dipolaren Kopplung und der chemischen Verschie¬

bungsanisotropie des Kohlenstoffatoms erzeugt. Daher kann sie

auch nur für Kohlenstoffatome gemessen werden, die eine große

Anisotropie des chemischen Verschiebungstensors aufweisen. Im

Falle der Phenylalaninreste sind dies nur die aromatischen 13C-

Kerne. Experimentell wurde auch bei einer Protonenresonanzfre¬

quenz von 600.13 MHz keine Kreuzrelaxation von 2SZIZ nach S2 für

die aliphatischen Kohlenstoffatome gefunden. Dies stützt die in

Kapitel 4.2 gemachte Annahme, daß die Anisotropie der chemischen

Verschiebung für die aliphatischen Kohlenstoffatome vernachlässigtwerden kann.

Um einen möglichst genauen Wert für die Kreuzrelaxationsraten¬

konstante zu erhalten, wurde das volle System von gekoppelten Dif¬

ferentialgleichungen in einem AX-Spinsystem [84] berücksichtigt,wie es in Kapitel 2.7 kurz diskutiert wurde. Das Differentialglei¬

chungssystem besteht im Falle des AX-Spinsystems aus drei gekop¬

pelten Basisoperatoren:


d_dt

<w V T<A °"

<wn

<s2X0 = - r r rVz Sz'Sz 2Sz'z>Sz <s2X0

<2S2i2X0 o r r

2^,5/25^25^<2SZ/Z)(0

(4.7)

Hierbei wurde bereits die chemische Verschiebungsanisotropie der

Protonen vernachlässigt, was zu einer Null in den Matrixelementen

F2SzVZUndr/z'2VzfÜhrt"Damit bleiben fünf Elemente der Relaxationsmatrix, die alle in die

Zeitevolution der drei Operatoren eingehen. Die Werte für Ts s=

1/T1(13C) sind bereits aus den Kohlenstoff-Tj-Messungen aus Kapi¬tel 4.4.1 und die Werte für Ts 7

aus den NOE-Messungen aus Kapi¬tel 4.4.2 bekannt und können direkt als feste Parameter in Gleichung(4.7) eingesetzt werden. Die T1-Relaxationszeit der Protonen wurde

mit Hilfe einer „Inversion recovery" Pulssequenz unter Entkopplungder Kohlenstoffatome während der Mischzeit und anschließendem

Transfer der Polarisation mit einer INEPT-Sequenz [143,144] auf die

direkt gebundenen Kohlenstoffatome (Abbildung 4.2) gemessen.

Durch diesen zusätzlichen Transfer kann man die bessere spektrale

(f)xMy(f)x (f)» W« (f)y Wx

I |aiäJAJAc

(«)x (f)x («)x

Abbildung 4.2: Pulssequenz zur Messung der Protonen Tj-Relaxationszeit mit

anschließendem Transfer der Polarisation mit Hilfe einer INEPT-Sequenz auf die

direkt gebundenen Kohlenstoffatome. Die Inversion der Protonen erfolgte mit

einem „composite" 180° Puls.

108 Kapitel 4.4

Auflösung der aromatischen Kohlenstoffatome ausnützen. Die

Inversion der Protonenmagnetisierung am Anfang der Pulssequenzwurde mit einem „composite" 180° Puls [145-147] durchgeführt. Die

Auswertung des Relaxationszerfalls erfolgte gleich wie die Auswer¬

tung der ^C-Tj-Zeiten mit einem Dreiparameterfit einer monoexpo-

nentiellen Funktion. Die berechneten Werte für T7 ; zusammen mit

den Fehlern finden sich in Tabelle 7.6 (siehe Anhang 7.4).

Damit sind außer zwei Elementen der Relaxationsmatrix alle Para¬

meter der Differentialgleichung (4.7) bekannt, und es müssen nur

noch die beiden Ratenkonstanten T2S j 2S fund r2S; s

bestimmt

werden. Hierzu wurde die Zeitevolution der beiden Terme 2SJZund Sz ausgehend von den Anfangsbedingungen <2SZIZ)(0) = 1

und (S2)(0) = (Zz)(0) = 0 experimentell gemessen. Um die Kreuzre¬

laxation des Zweispinterms 2SZI2 zu S2-Polarisation zu messen,

wurde mit Hilfe der Pulssequenz in Abbildung 4.3 ein Anfangsdich¬

teoperator erzeugt, der proportional zum Term 2S2I2 ist und danach

die Zeitentwicklung der kreuzrelaxierten Sz-Polarisation unter Ent¬

kopplung der Protonen beobachtet. Die Selektion des Zweispintermszu Beginn der Mischzeit erfolgt durch einen Phasenzyklus, der in

(f)x («), (f)y(K)x

h H(i)x (f)x

*m 1 | IIImAA AAAAaaaa/1UyVvv»''vv

Abbildung 4.3: Pulssequenz für die Messung der Kreuzrelaxation von 2SZ72nach Sz. Mit Hilfe eines nicht refokussierten INEPT wird ein Anfangsdichteope¬rator proportional zu 2S2I2 erzeugt und die Zeitevolution der transferierten

Polarisation auf dem S-Spin gemessen. Das Delay A1 wurde auf 1/ (4/CH) ein¬

gestellt. Der Pulswinkel k ist ein 0° bzw. 180° Puls in alternierenden Experimen¬ten und dient der Selektion des gewünschten Terms im Dichteoperator.


alternierenden Experimenten einen k = 0° bzw. einen k = 180°

Puls erzeugt. Aufgrund des schlechten Signal zu Rauschverhältnis¬

ses der Kreuzrelaxationsspektren wurden die einzelnen Linien über

einen Fit mit einer Lorentzkurve integriert.

Die Zeitevolution des Zweispinterms wurde mit der in Abbildung4.4 gezeigten Pulssequenz gemessen. Auch hier wurde wieder ein

Anfangsdichteoperator proportional zu 2S2J2 erzeugt. Nach der

Mischzeit xm wird der noch vorhandene Anteil des Zweispintermsdurch einen Phasenzyklus selektiert, indem die Länge des Pulses k

wieder alternierend 0° und 180° beträgt. Nach Refokussierung zu SzPolarisation wird unter Protonenentkopplung auf dem S-Spin detek-

tiert.

Die numerische Lösung der Differentialgleichung (4.7) wurde mit

den Randbedingungen <2SZI2>(0) = 1 und <S2)(0) = <I2>(0) = 0

berechnet und an die beiden Zeitevolutionen (2S2I2)(f) und (Sz)(t)angepaßt. Die beiden noch unbekannten Ratenkonstanten der Diffe¬

rentialgleichung (4.7) (r2S jt2s iunc* r2S j ys ) wurden in einem

nichtiinearen Zweiparameterfit simultan optimiert. Die numerischen

(|)x Wx (f)yMx Mx Wx

Abbildung 4.4: Pulssequenz zur Messung des Zerfalls von 2SZIZ. Durch einen

einfachen INEPT-Transfer wird ein Anfangsdichteoperator proportional zu

2S2J2 erzeugt und dessen Zerfall nach einer Refokussierung zu S2 Polarisation

auf dem S-Spin detektiert. Der Pulswinkel k ist ein 0" bzw. 180° Puls in alternie¬

renden Experimenten und dient der Selektion des gewünschten Terms.

110 Kapitel 4.4

Werte und die berechneten Fehler sind in Tabelle 7.7 (siehe Anhang7.4) wiedergegeben. Die so bestimmten Werte für T2S j t2s i entspre¬

chen nicht den theoretischen Werten für ein isoliertes Zweispinsy¬stem, da dieses für Protonen fast nie eine gute Näherung darstellt.

Die Protonen und auch der Zweispinterm werden zu einem nicht

unerheblichen Anteil durch andere Protonen in der Umgebung rela¬

xiert und weisen daher eine viel kürzere Relaxationszeit auf, als man

dies aus der theoretischen Berechnung für ein isoliertes Zweispinsy¬stem erwarten würde.

Bei den experimentellen Messungen der Zeitevolution des Zweispin¬terms sieht man die Auswirkungen der starken Kopplung unter den

aromatischen Protonen in den Oszillationen, die dem eigentlichen

exponentiellen Zerfall überlagert sind. Diese Oszillationen entstehen

durch die Evolution des Zweispinterms 2S2J2 zu Protonen Null-

Abbildung 4.5: Zerfall des 2SJZ-Terms für das Phe9-8 System bei 400.13 MHz

Protonenresonanzfrequenz. Neben den experimentellen Punkten ist auch der

beste Fit eines monoexponentiellen Zerfalls gezeigt. Besonders für kurze Misch¬

zeiten sieht man zusätzliche Oszillationen.

Simulation der Energiepotentiale 111

quantentermen unter dem starken homonuklearen Kopplungshamil-

tonoperator. Abbildung 4.5 zeigt als Beispiel die gemessenen Daten

und den besten Fit für das Phe9-8 System bei 400.13 MHz Protonen¬

resonanzfrequenz.

4.5 Simulation der Energiepotentiale

Um die Auswertung der NMR-Relaxationsdaten mit zusätzlichen

Daten zu ergänzen, wurden die Energiepotentiale der Seitenketten

simuliert. Die potentielle Energie einer Phenylalaninseitenkette kann

als eine Funktion der beiden Rotationswinkel X\ uno^ X2 beschrieben

werden. Diese Energiehyperfläche E(xv X2) wurde durch ein „rigid

geometry energy mapping" [127] berechnet, indem die Gesamtener¬

gie des Systems für die verschiedenen Werte der beiden Winkel

berechnet wurden. Hierzu wurden die beiden Winkel unabhängigvoneinander in 5° Schritten varüert und der Rest des Moleküls nicht

verändert. Alle Berechnungen erfolgten mit dem Programm

CHARMM22 unter Benutzung der Standard Kraftfeldparameter für

Proteine mit allen Protonen [128]. Als Startstruktur für diese Berech¬

nungen wurde eine der mit Hilfe der MEDUSA-Prozedur [40]

erzeugten Strukturen (G129) von Antamanid in Chloroform benutzt.

Alle Berechnungen erfolgten im Vakuum ohne Berücksichtigungeines Lösungsmittels.

Der aussagekräftige Teil der berechneten Energiehyperflächen um

die Gleichgewichtsposition der beiden Torsionswinkel ist für alle

vier Phenylalaninreste in Antamanid in Abbildung 4.6 wiedergege¬ben. Aufgrund der starren Geometrie des Moleküls dominieren die

Beiträge der van-der-Waals Wechselwirkungen [127] bei dieser Art

der Berechnung der Energiehyperfläche und erzeugen so unnatür¬

lich hohe Energiebarrieren zwischen den Minima. Man kann daher

aus den so berechneten Energiehyperflächen keine quantitativeInformation über die Höhe der Energiebarrieren erhalten, sondern

nur eine qualitative Aussage über den Verlauf der Energiepotential-

112 Kapitel 4.5

funktion in der direkten Umgebung des Minimums. Man darf sie

daher auch nicht zur Berechnung von Populationen und Übergangs¬raten zwischen den verschiedenen Positionen benutzen. Es ist aber

möglich, den Bereich einer beschränkten Diffusion um die Gleichge¬

wichtslage herum abzuschätzen.

a) Phenylalanin 5 b) Phenylalanin 6

260'

220° 260° 300° 340° 380°

X1

c) Phenylalanin 9

200° 240° 280° 320° 340°

X1

d) Phenylalanin 10

Abbildung 4.6: Zweidimensionale Energiehyperflächen für die Rotation der

Phenylalaninseitenketteum die beiden Winkel %l und X2 Die Energien wurden

mit dem Programm CHARMM22 unter Benutzung des Standard Kraftfeldes für

Proteine mit Hilfe des „rigid energy mappings" berechnet. Die Werte der beiden

Winkel in der Ausgangskonformation sind mit einem Punkt markiert.

Simulation der Energiepotentiale 113

Phenylalanin 5 und 10 zeigen sowohl in der Xj als auch in der x2-Dimension relativ steile Potentialbarrieren um das Minimum. Daher

sollte auch der Winkelbereich einer beschränkten Diffusion um X\oder x2 für diese beiden Phenylalanine klein sein. Phenylalanin 6

und 9 zeigen flachere Potentiale in beiden Dimensionen, und man

erwartet daher für diese eine größere Amplitude als bei Phenylala¬nin 5 und 10 für eine beschränkte Diffusion um %j oder x2-

Um einen sinnvolle Aussage über die Aktivierungsenergien und die

Populationen mit Hilfe von MD-Berechnungen machen zu können,

muß man das „Umbrella sampling" anwenden. Hierbei wird wäh¬

rend einer MD-Simulation ein zusätzliches Potential entlang der

Reaktionskoordinate auf die potentielle Energie des Systems aufad¬

diert, um die Potentialbarrieren entlang der Reaktionskoordinate zu

verringern. Während der MD-Trajektorie wird so der gesamte

Bereich der Reaktionskoordinate überstrichen, da keine großen Ener¬

giebarrieren zu überwinden sind. Während der MD-Trajektorieerstellt man eine Statistik für die Besetzung der einzelnen Positionen

entlang der Reaktionskoordinate. Ohne dieses zusätzliche

„Umbrella"-Potential überstreicht die MD-Simulation unter Umstän¬

den nur einen kleinen Bereich um die Startposition und man erhält

nur für einen eingeschränkten Bereich der Reaktionskoordinate eine

aussagekräftige Statistik. Diese Verteilung der Populationen entlangder Reaktionskoordinate kann man mit Hilfe der Boltzmannvertei-

lung und unter Berücksichtigung des zusätzlichen Umbrellapoten-tial in eine potentielle Energie entlang der Reaktionskoordinaten

umrechnen.

114 Kapitel 4.6

4.6 Anpassung der Bewegungsmodelle an die Meßwerte

Um die gemessenen Daten für die in Kapitel 4.3 beschriebenen phy¬sikalischen Modelle auszuwerten, wurden die unterschiedlichen

Modelle an die 13C-TrZeiten bei 200.13,400.13 und 600.13 MHz, die

NOE-Faktorenbei 400.13 und 600.13 MHz und die Kreuzrelaxations¬

raten bei 400.13 und 600.13 MHz angepaßt. Der Fitfehler

(T?*(i)-T^(i,p))2f(P) = £-

(Airp(0)2

| y(NOE exP (Q - NOEcalc (t, p))'

i (ANOEexP(i))2

(r2SXP;.sW-r2Csal/,s(^))2^

z z' z z z' z

T (Ar-p (i))2(4.8)

wurde für die Optimierung verwendet, wobei p den Satz der ver¬

wendeten modellabhängigen Parameter beschreibt, und der Index i

läuft über sämtliche Meßwerte, d.h. über sämtliche unterschiedli¬

chen Kohlenstoffatome bei allen drei Spektrometerfrequenzen.

Araexp, ANOE exP und Arf^ps

sind die berechneten Fehler der 13C-

Tj-Zeiten, der NOE-Faktoren bzw. der Kreuzrelaxationsratenkon-

stanten zwischen 2S2J2 und S2. Die Minimierung dieses Fitfehlers

erfolgte mit dem Nelder-Mead Simplexalgorithmus [137] des Pro¬

grammpaketes MATLAB [138].

Eine genauere Betrachtung der 13C-TrZeiten (Tabelle 7.4) zeigt, daß

für alle vier Phenylalaninreste in Antamanid die Relaxationsraten¬

konstanten durch die interne Bewegung der Seitenkette beeinflußt

werden. Da Antamanid sich bei allen gemessenen Feldstärken links

des TrMinimums befindet (Abbildung 4.7) werden die 13C-T1-Zei-ten durch interne Bewegungen immer verlängert. Bei allen vier Phe¬

nylalaninen sieht man, daß die a-Kohlenstoffatome die kürzesten, ß-

Anpassung der Bewegungsmodelle an die Meßwerte 115

und £,- mittlere und 8- und e-Kohlenstoffatome die längsten ^-Zei¬

ten besitzen. Daraus folgt, daß die Relaxationsratenkonstanten durch

eine interne Bewegung um Xj und x2 beeinflußt werden, die im Zeit¬

bereich

10-t > t > T/10 (4.9)

liegen. Dieser Bereich entspricht einer Änderung der effektiven Kor¬

relationszeit

\ =

1 1- +- (4.10)

von mindestens 10% gegenüber den beiden asymptotischen Werten

für schnelle (xe - xt) und langsame (xe = xc) interne Bewegung. Bei

einer Genauigkeit der Meßwerte zwischen ca. 3% und 10% sollten

die experimentellen Daten eine Unterscheidung der Modelle in die¬

sem Bereich erlauben.

Abbildung 4.7: Verlauf der 13C-T1-Zeit als Funktion der Korrelationszeit des

„rotational tumbling" für drei Spektrometerfrequenzen. Die Korrelationszeit des

Antamanids von xc = 152 ps ist markiert. Man sieht, daß Antamanid bei allen

drei Frequenzen links des Tj-Minimums ist.

116 Kapitel 4.6

Die Diffusion um Xj mit einer Beschränkung des Winkelbereiches

zeigt eine hohe Korrelation (mit einem Korrelationskoeffizienten von

über 0.98) zwischen den beiden Parametern D1 und (p0 des Modells.

Diese Korrelation bewirkt, daß der Fit nicht richtig konvergiert und

keine konsistenten Ergebnisse liefert. Um das Modell trotzdem ver¬

wenden zu können, wurde der Restriktionswinkel cp0 als externer

Parameter auf numerische Werte fixiert, die aus den Simulationen

der Energiepotentiale in Kapitel 4.5 genommen wurden. Der Winkel

(p0 wurde für Phenylalanin 6 und 9 auf einen Wert von ±60°, auf ±50°

für Phenylalanin 5 und ±40° für Phenylalanin 10 festgelegt. Auf¬

grund der hohen Korrelation zwischen den beiden Parametern

ändert sich die Qualität f(p) des Fits mit einer Änderung des Restrik¬

tionswinkels cp0 nur wenig, aber der Wert der Diffusionskonstanten

Dj wird stark durch die Wahl von cp0 beeinflußt.

Das symmetrische Dreisprungmodell um xa mit unterschiedlichen

Populationen ergab bei der Fitprozedur ähnliche Probleme. Die Kor¬

relation zwischen den verschiedenen Übergangswahrscheinlichkei¬ten war ebenfalls hoch und erreichte in vielen Fällen Werte von über

0.95. Daher mußte das Modell vereinfacht werden, um eine sinnvolle

Konvergenz des Fits zu erreichen. Es wurden mehrere Stufen der

Vereinfachung getestet, aber alle Modelle mit variablen Populatio¬nen zeigten Korrelationskoeffizienten von ebenfalls über 0.95 zwi¬

schen den verschiedenen Populationen. Daher wurden alle Popula¬tionen gleich groß gewählt und eine der Übergangswahrscheinlich¬keiten Null gesetzt, d.h. man erhält ein Dreisprungmodell mit glei¬chen Populationen, bei dem einer der drei Übergänge verboten ist.

Damit besitzen alle acht Modelle drei variable Parameter, in der

Form einer Korrelationszeit für jede der drei Bewegungen. Man kann

daher die Qualität der Anpassung der unterschiedlichen Modelle an

die gemessenen Relaxationsdaten direkt aus den Fitfehlern f(p) able¬

sen. f(p) ist ein normiertes Maß des Fitfehlers, da eine Änderung voneiner Standardabweichung in den gemessenen Daten oder in den


optimierten Parametern eine Änderung von einer Einheit in f(p)bewirkt. Nimmt man eine Gaussverteilung der Fehler an, so ent¬

spricht eine Verringerung des Fitfehlers f(p) um eine Einheit einer

Wahrscheinlichkeit von 68%, eine Verringerung um zwei Einheiten

einer Wahrscheinlichkeit von 94%, daß die Verbesserung des Fits

wirklich signifikant ist und nicht nur Variationen im Rahmen der

Meßfehler sind.

Generell kann man zwei Beiträge zu f(p) unterscheiden:

- Systematische, modellabhängige Beiträge zu f(p), die durch die

Differenzen zwischen dem gewählten Modell und der tatsächli¬

chen Bewegung entstehen.

- Statistische, modellunabhängige Beiträge zum Fitfehler fip), die

durch die fehlerbehafteten experimentellen Daten entstehen. Die¬

ser Teil kann durch die Wahl des Modells nicht beeinflußt werden.

Die optimierten Parameter und die berechneten Werte des Fitfehlers

f(popt) für die acht untersuchten Modelle und vier Phenylalaninresterinden sich in den Tabellen 4.1 - 4.4. Die Fehler der Parameter wur¬

den nach Referenz [139] berechnet und geben das Vertrauensinter¬

vall einer Standardabweichung an.

Die Ergebnisse für die Korrelationszeit xc des „rotational tumbling"stimmen für die unterschiedlichen Modelle und die vier Phenylala¬ninreste gut überein. Die Werte für die Korrelationszeit xc liegen zwi¬

schen 145 ps und 166 ps und die berechneten Fehlerintervalle über¬

decken sich gegenseitig fast vollständig. Der gemittelte Wert der

Korrelationszeit über alle Fits ist t = 152 ps. Die Unterschiede zwi¬

schen den Phenylalaninresten können durch zusätzliche interne

Bewegungen des Peptidgerüstes erklärt werden, die in den Model¬

len nicht berücksichtigt wurden und daher durch eine Variation von

xc kompensiert werden. Die deutlich kürzeren Werte für Phenylala¬nin 5,6 und 10 zeigen, daß zumindest für diese drei Aminosäuren die

Annahme eines starren Peptidgerüstes nicht vollständig gerechtfer-

Modells.

ents

prec

hend

endes

Qualität

die

für

Maß

ein

ist

Spalte

letzten

der

in

0opt)

Fitfehler

Der

angegeben.

Standardabweichung)

(eine

Fehlern

berechneten

den

mit

zusammen

Spalten

drei

nächsten

den

in

sind

gen

Bewegun¬

verschiedenen

drei

die

für

Korrelationszeiten

Die

x2-

und

x,

Winkel

die

um

Bewegungen

beiden

die

rakterisieren

cha¬

Spalten

drei

ersten

Die

5.

Phenylalanin

für

Daten

experimentellen

die

an

Modelle

acht

der

Fits

der

Erge

bnisse

4.1:

Tabelle

14.5

14.9

10.1

109.21

78.4

±845.4

446.6

±903.9

401.1

±777.4

5.0

±148.4

5.4

±149.4

Zweisprungmodell

Diffusion

freie

+50°

=(Po

mit

Diffusion

beschränkte

±50°

=(p0

mit

Diffusion

beschränkte

HG

15.1

16.2

12.8

122.3+

113.6

±913.3

41.1

±239.4

45.4

±241.8

5.5

±148.6

6.1

±147.9

Zweisprungmodell

Diffusion

freie

Dreisprungmo

dell

gehindertes

Dreisprungmodell

gehindertes

FE

15.2

16.3

12.8

121.8+

112.5

±903.6

62.8

±383.5

71.1

±391.2

5.6

±148.5

6.1

±147.5

Zweisprungmodell

Diffusion

freie

Popu

lati

onen

gleichen

mit

Dreisprungmodell

Popu

lati

onen

glei

chen

mit

Dreisprungmodell

DC

15.1

16.2

10.6

±105.4

78.1

±790.1

184.9

±1079.7

206.8

±1093.8

5.5

±148.6

6.1

±147.8

Zweisprungmodell

Diffusion

freie

Diffusion

freie

Diffusion

freie

BA

fäopt)

1/(2«;)

1/D2

l/(3Wj)

1/D!

1/(6D)

X2

Winkel

den

um

Xi

Winkel

den

um

Nr.

Fitfehler

[ps]

Korrelationszeiten

Bewegungsmodelle

vo

nn3wro

ft>&3CO'S$fDCO

i-l

fDCL

093CCO

to

a>>

Modells.

entsprechenden

des

Qualität

die

für

Maß

ein

ist

Spalte

letzten

der

in

f(popt)

Fitfehler

Der

angegeben.

Standardabweichung)

(eine

Fehlern

berechneten

den

mit

zusammen

Spal

ten

drei

nächsten

den

in

sind

gen

Bewegun¬

verschiedenen

drei

die

für

Korrelationszeiten

Die

x2-

und

%.

Winkel

die

um

Bewegungen

beiden

die

rakterisieren

cha¬

Spal

ten

drei

ersten

Die

6.Phenylalanin

für

Daten

experimentellen

die

an

Modelle

acht

der

Fits

der

Ergebnisse

4.2:

Tabelle

20.6

23.6

5.3

33.2+

42.4

±436.7

242.1

±558.3

258.9

±495.3

6.4

±149.9

7.9

149.9+

Zweisprungmodell

Diffusion

freie

±60°

=<p0

mit

Diffusion

beschränkte

±60°

=<p0

mit

Diffusion

beschränkte

HG

22.0

25.7

6.2

±36.8

51.8

±434.1

24.9

±150.8

32.0

157.3+

7.2

±149.6

8.6

±146.2

Zweisprungmodell

Diffusion

freie

Dreisprungmodell

gehindertes

Dreisprungmodell

gehinderte

s

FE

22.2

26.0

6.3

±36.7

50.7

±427.4

38.6

248.7+

50.5

261.0+

7.3

±149.4

8.7

145.7+

Zweisprungmodell

Diffusion

freie

Populationen

glei

chen

mit

Dreisprungmodell

Populationen

glei

chen

mit

Dreisprungmodell

DC

21.8

25.7

5.6

+32.1

38.9

±390.3

111.8

±677.8

145.4

±708.2

7.2

±149.5

8.6

±146.3

Zweisprungmodell

Diffusion

freie

Diffusion

freie

Diffusion

freie

BA

f(Po

pt)

l/(2u>)

1/D2

1/(3»!)

1/Dj

1/(6D)

Xi

Winkel

den

um

Xi

Winkel

den

um

Nr.

Fitfehler

[ps]

Korrelationszeiten

Bewegungsmodelle

Modells.

ents

prec

hend

endes

Qualität

die

für

Maß

ein

ist

Spalte

letzten

der

in

f(popt)

Fitfehler

Der

angegeben.

Standardabweichung)

(eine

Fehlern

berechneten

den

mit

zusammen

Spal

ten

drei

nächsten

den

in

sind

gen

Bewegun¬

verschiedenen

drei

die

für

Korrelationszeiten

Die

x2-

und

Xj

Winkel

die

um

Bewegungen

beiden

die

rakterisieren

cha¬

Spal

ten

drei

ersten

Die

9.

Phen

ylal

anin

für

Daten

experimentellen

die

an

Modelle

acht

der

Fits

der

Erge

bnis

se4.3:

Tabelle

24.4

28.6

8.8

±55.5

66.9

±562.1

760.7

±1463.2

±1034.8

1589.7

8.2

±166.5

10.2

±162.1

Zweisprungmodell

Diffusion

freie

±60°

=(p0

mit

Diffusion

beschränkte

±60°

=<p0

mit

Diffusion

beschränkte

HG

25.7

30.6

10.1

±60.2

85.6

±568.1

58.5

239.9+

88.2

±269.4

9.0

166.2+±10.7

159.0

Zweisprungmodell

Diffusion

freie

Dreisprungmodell

gehindertes

Dreisprungmodell

gehindertes

FE

25.9

30.8

10.1

±60.1

83.8

560.3+

90.8

389.1+

444.5+143.1

9.1

±165.9

10.7

±158.1

Zweisprungmodell

Diffusion

freie

Popu

lati

onen

gleichen

mit

Dreisprungmodell

Populationen

gleichen

mit

Dreisprungmodell

DC

25.4

30.6

8.9

±53.6

66.6

±521.1

257.3

1073.8+

402.5

1220.8+

8.8

166.4+

158.8+10.6

Zweisprungmodell

Diffusion

freie

Diffusion

freie

Diffusion

freie

BA

KPop

t)l/(2a>)

1/D2

1/(31^)

1/Dt

1/(6D)

Xi

Winkel

den

um

Xi

Winkel

den

um

Nr.

Fitfehler

[ps]

Korrelationszeiten

Bewegungsmodelle

N>

fD

fDsfS'

SUST

o&'SfD

fDCO

11

fD

CO

CO

U>>

Modelle.

entsprechenden

des

Qualität

die

für

Maß

ein

ist

Spalte

letzten

der

in

f(ßot,t)

Fitfehler

Der

angegeben.

Standardabweichung)

(eine

Fehlern

berechneten

den

mit

zusammen

Spalten

drei

nächsten

den

in

sind

gungen

Bewe¬

verschiedenen

drei

die

für

Korrelationszeiten

Die

x2-

und

xxWinkel

die

um

Bewegungen

beiden

die

charakterisieren

Spal

ten

drei

ersten

Die

10.

Phen

ylal

anin

für

Daten

experimentellen

die

an

Modelle

acht

der

Fits

der

Ergebnisse

4.4:

Tabelle

20.4

20.7

27.2

178.6+

261.8

±1316.2

1464.6+1741.1

880.8

±452.6

6.7

±149.8

6.8

151.7+

Zweisprungmodell

Diffusion

freie

±40°

=<p0

mit

Diffusion

beschränkte

±40°

=<p0

mit

Diffusion

beschränkte

HG

21.0

22.1

33.9

±197.7

266.5

±1192.9

±207.1

487.9

±262.7

537.4

7.0

±148.0

7.2

±145.4

Zweisprungmodell

Diffusion

freie

Dreisprungmodell

gehi

nder

tes

Dreisprungmodell

gehi

nder

tes

FE

21.1

22.2

33.8

±197.2

260.2

±1177.8

769.5+321.0

426.1

±864.7

7.0

±147.9

7.2

±145.0

Zweisprungmodell

Diffusion

freie

Populationen

gleichen

mit

Dreisprungmodell

Populationen

gleichen

mit

Dreisprungmodell

DC

20.9

22.1

28.4

±175.5

200.8

±1086.5

919.0

±2186.3

±1207.5

2448.4

6.9

±148.2

7.2

±145.3

Zweisprungmodell

Diffusion

freie

Diffusion

freie

Diffusion

freie

BA

f(Popt)

1/(2»)

1/D2

1/(3»!)

1/DX

1/(6D)

Xi

Winkel

den

um

%\

Winkel

den

um

Nr.

Fitfehler

[ps]

Korrelationszeiten

Bewegungsmodelle

122 Kapitel 4.6

tigt ist. Dieses Verhalten kann man auch bei einer qualitativen Ana¬

lyse der 13C-T1-Zeiten in Tabelle 7.4 sehen, da die Relaxationszeiten

eine nicht unerhebliche Variationsbreite aufweisen. Diese zusätzliche

Bewegung des Peptidgerüstes muß ebenfalls eine Zeitkonstante in

der Größenordnung der Korrelationszeit des „rotational tumbling"besitzen. Die von Blackledge et al. [40] untersuchte langsame Inter¬

konversion zwischen zwei Gleichgewichtskonformationen kommt

hierfür nicht in Frage, da sie eine zu lange Korrelationszeit besitzt

(x;» 43 us). Es besteht auch keine direkte Korrelation zwischen den

Bereichen (\|r4, $5, \\r9 und fyw), in denen diese Interkonversion statt¬

findet und der Größe der 13C-T1-Zeiten. Bei 600 MHz Protonenreso¬

nanzfrequenz besitzt Alanin-4 die längste und Phenylalanin-9 die

kürzeste Ca-Tj-Relaxationszeit. Eine genaue Charakterisierung die¬

ser Bewegungen ist nicht möglich. Vermutlich handelt es sich um

schnelle Fluktuationen des Peptidgerüstes, wie sie auch bei der

Untersuchung von größeren Proteinen [10-14] gefunden wurden. Ein

physikalisches Modell basierend auf der Auswertung von Festkör-

per-NMR-Spektren wurde von North und Cross [148] vorgeschla¬

gen.

Für die Bewegung um x2 ergibt die Annahme eines Zweisprungmo¬

dells für alle betrachteten Bewegungsmodelle um X\ uno^ für alle

vier Phenylalaninseitenketten immer einen kleineren Fehler als die

freie Diffusion um x2- Dies ist ein Hinweis, daß die Bewegung um %2

durch Sprünge zwischen zwei um 180° getrennte Gleichgewichtspo¬sitionen besser beschrieben wird als durch eine Diffusionsbewegung,bei der alle Orientierungen des Ringes gleich wahrscheinlich sind.

Dieser Befund stimmt mit den Ergebnissen von Festkörpermessun¬

gen an polykristallinem Phenylalanin und an Phenylalanin und

Tyrosin in Proteinen überein [149-152], die auf einer Linienformana-

lyse der Deuteriumresonanzen beruhen. Man kann jedoch eine

zusätzliche eingeschränkte Diffusionsbewegung um die beiden

Gleichgewichtslagen nicht ausschließen. In der Signifikanz der Ver¬

besserung A/(p0 f) der Fitfehler gibt es jedoch Unterschiede zwischen


den vier Phenylalaninresten. Im Falle des Phenylalanin 6

(A/(p f) « 3-3.9) und 9 (A/(pop() » 4.2-5.2) kann man das Modell einer

freien Diffusion um x2 nüt einer Wahrscheinlichkeit von über 99%

ausschließen und das Zweisprungmodell als das beste Modell

bezeichnen. Für die beiden anderen Phenylalanine ist der Unter¬

schied nicht so groß (Phenylalanin 5 A/(popf)»0.4-1.1 und 10

A/(p0 t) ~ 0.3-1.2) und man kann in diesem Fall das Diffusionsmodell

nicht ausschließen, da die Wahrscheinlichkeit, daß das Zweisprung¬modell signifikant besser ist, nur ca. 50% beträgt.

Die Ergebnisse für die Bewegung um %x können nicht so eindeutigklassifiziert werden. Vergleicht man die unterschiedlichen Modelle

für eine Bewegung um xr wobei die Bewegung um x2 durch ein

Diffusionsmodell beschrieben wird (Zeilen A, C, E und G in den

Tabellen 4.1 - 4.4), so findet man nur eine nicht signifikante Ände¬

rung von f{popt) um maximal 0.3 Einheiten für alle Modelle außer der

beschränkten Diffusion um %v Lediglich die eingeschränkte Diffu¬

sion um X\ weist in Kombination mit der freien Diffusion um x2 eine

deutliche Verbesserung des Fitfehlers fipopt) auf. Aufgrund der

Ergebnisse der Analyse für die Bewegung um %2 im letzten

Abschnitt, wird im weiteren die Diskussion der verschiedenen

Modelle für die Bewegung um X\ auf die Modelle mit einem Zwei¬

sprungmodell um x2 (Zeilen B, D, F und H in den Tabellen 4.1 - 4.4)

beschränkt. Für alle vier betrachteten Phenylalaninseitenketten

ergibt die beschränkte Diffusion den kleinsten Fitfehler f(popt). Der

Fit ist aufgrund der hohen Korrelation zwischen dem Winkel cp0 und

der Diffusionskonstante D, unempfindlich gegen eine Variation von

(p0. Daher wurde der Winkel für die Phenylalaninreste auf die bereits

weiter oben diskutierten Werte fixiert.

Phenylalanin 6 und 9 zeigen einen relativ großen Unterschied im Fit¬

fehler zwischen dem schlechtesten und dem besten Modell von

A/(pop() = 1.6 bzw. 1.5. Sogar die Differenz zwischen dem besten

Modell geschränkte Diffusion) und dem zweitbesten Modell (freie

124 Kapitel 4.6

Diffusion) beträgt immer noch A/(p0 () = 1.2 bzw. 1.0. Daher sind die

Unterschiede zwischen den untersuchten Modellen in diesem Fall

mit einer Wahrscheinlichkeit von ca. 72% signifikant, und man kann

alle Modelle außer der beschränkten Diffusion mit dieser Wahr¬

scheinlichkeit für die relaxationsaktive Bewegung ausschließen.

Aufgrund der hier diskutierten experimentellen Ergebnisse kann

man nicht ausschließen, daß es auch noch andere langsamere Bewe¬

gungen gibt, die keinen direkten Einfluß auf die Relaxationsraten¬

konstanten haben. Die experimentell beobachteten gemittelten

3J(Ha-Hp)-Kopplungskonstanten der Phenylalaninreste 5 und 6 in

Antamanid [54] wurden mittels Sprüngen zwischen drei gestaffeltenPositionen erklärt. Diese Sprünge müssen somit eine deutlich län¬

gere Korrelationszeit als das „rotational tumbling" besitzen.

Die beiden anderen Phenylalaninseitenketten (5 und 10) weisen klei¬

nere Unterschiede zwischen dem besten und dem schlechtesten

Modell (A/(p ,) = 0.6 bzw. 0.7) für die Bewegung um Xj auf. Die Dif¬

ferenzen zwischen dem besten (beschränkte Diffusion) und dem

zweitbesten Modell (freie Diffusion) sind noch kleiner mit

Af(p ,) = 0.5. Daher kann man für diese beiden Seitenketten keine

eindeutigen Schlußfolgerungen für die Bewegung um xx ziehen. Die

relative Reihenfolge der verschiedenen Modelle ist jedoch gleich wie

für die beiden anderen Phenylalanine.

Die Zeitkonstanten für die Bewegung um die x2_Achse zeigen deut¬

liche Unterschiede. Phenylalanin 10 zeigt die langsamsten Sprüngemit einer Korrelationszeit x2 «175-200 ps. Die Bewegung des Phe¬

nylalanin 5 ist etwas schneller mit Korrelationszeiten x2 «100-125 ps,

während die beiden Phenylalanine 6 und 9 eine deutlich schnellere

Bewegung um x2 mit Korrelationszeiten x2 ~ 30-40 ps bzw. x2 « 50-

60 ps zeigen.

Um die relative Beweglichkeit der Seitenketten für die Bewegung

um X\ zu vergleichen, wurden die Werte für die Korrelationszeiten

Tj der vier Phenylalaninreste in Abbildung 4.8 gegen die Modellbe-


Zeichnungen aufgetragen. Für alle Modelle, außer der beschränkten

Diffusion (G und H), ist die Reihenfolge der relativen Beweglichkeit

unabhängig von dem gewählten Modell. Bei der winkelbeschränk-

ten Diffusion um X\ ze%t insbesondere Phenylalanin 10 große Feh¬

ler, die auf ein breites und flaches Potential des Fitfehlers hindeuten

und die Änderung der Reihenfolge der relativen Beweglichkeit

erklären können. Phenylalanin 6 zeigt immer die schnellste Bewe¬

gung, gefolgt von Phenylalanin 5 und 9, während Phenylalanin 10

immer die langsamste Bewegung aufweist. Die numerischen Werte

der Korrelationszeiten sind von dem gewählten physikalischenModell abhängig und können nicht direkt miteinander verglichenwerden. Für die beschränkte Diffusion um Xj (G und H) hängt der

Wert der Korrelationszeit wegen der hohen Korrelation zwischen

A

.O Phenylalanin 5

A D Phenylalanin 6

2000-C> Phenylalanin 9

A Phenylalanin 10

O

*i [ps]; ö

O

O O1000-

AO

"

A oD D

8 O

AA

a

A

"

D G ö OD

D D

0- I, 1 1 i 1— 1 1

B D E

Modell

H

Abbildung 4.8: Die Korrelationszeiten tj der vier Phenylalaninreste für die acht

unterschiedlichen Bewegungsmodelle A bis H (siehe Tabelle 4.1 bis 4.4 für die

Definition der Modelle).

126 Kapitel 4.7

den beiden Parametern stark von dem gewählten Restriktionswinkel

<p0 ab. Da für die vier Phenylalaninreste unterschiedliche Werte für

diesen Winkel gewählt wurden, ist hier ein Vergleich der Diffusions¬

konstanten nicht aussagekräftig.


In dieser Untersuchung konnte gezeigt werden, daß man auch

Systeme mit mehreren internen Freiheitsgraden mit NMR-Relaxati-

onsparametern charakterisieren kann. Dabei ist es wichtig, einen

möglichst großen Satz von experimentellen Daten mit einer mög¬lichst hohen Genauigkeit zu messen. Die normalerweise erreichbare

Genauigkeit begrenzt jedoch die Unterscheidbarkeit unterschiedli¬

cher physikalischer Modelle und man findet teilweise mehrere

Modelle, welche die experimentellen Daten gleich gut beschreiben.

Die hier untersuchten Seitenketten der vier Phenylalaninreste in

Antamanid bilden ein gutes Testsystem. Alle 13C-Resonanzen sind

bei drei Feldstärken gut aufgelöst und können zur Messung der

dynamischen Prozesse benutzt werden. Für jede der vier Seitenket¬

ten konnten daher 28 unabhängige experimentelle Werte gemessen

werden. Trotzdem war es nicht in allen vier Fällen möglich, eindeu¬

tig zwischen den unterschiedlichen physikalischen Modellen zu

unterscheiden. Nur für zwei Phenylalaninreste (Phe6 und Phe9)

waren die Unterschiede in den Modellen groß genug, um eindeutigein bestes Modell auszuwählen.

Die Korrelationszeit des „rotational tumbling" von Antamanid in

Chloroform bei T = 320 K beträgt x »150 ps und führt daher zu

einem Beobachtungsfenster für die interne Korrelationszeit von tj =

15-1500 ps. Die bestimmten Korrelationszeiten der internen Bewe¬

gung liegen fast alle in diesem Bereich. Die Bewegung um den Win¬

kel x2 wird für alle vier Phenylalaninreste am besten durch ein Zwei¬

sprungmodell beschrieben, in dem der Phenylring 180° Sprünge aus¬

führt. Die Korrelationszeiten für diese Sprünge des Phenylringes lie-


gen für Phenylalanin 6 und 9 im Bereich von x2 » 30-60 ps und für

Phenylalanin 5 und 10 im Bereich von x2 «100-200 ps. Die Bewe¬

gung um den Winkel xa wird für Phenylalanin 6 und 9 am besten

durch eine beschränkte Diffusion mit einer Korrelationszeit Tj « 500-

1500 ps beschrieben.

Eine interessante Möglichkeit zur Erweiterung dieser Untersuchungbietet eine Verschiebung des sensitiven Zeitfensters der internen

Bewegung durch eine Variation des Lösungsmittels und damit der

Viskosität. Man kann erwarten, daß die Korrelationszeit xc des „rota¬

tional tumbling" durch die Änderung der Viskosität viel stärker

beeinflußt wird als die interne Dynamik, solange die Änderung der

Viskosität nicht eine starke Konformationsänderung des gesamten

Moleküls bewirkt. Eine andere Möglichkeit um die Viskosität zu

variieren, ist die Variation der Temperatur. Allerdings muß man in

diesem Fall die Aktivierungsenergie der internen Bewegung kennen,

um die Änderung der Temperatur in die theoretischen Modelle ein¬

beziehen zu können.

Eine genauere Analyse der Seitenkettenbewegungen erfordert ent¬

weder ein genaueres Messen der Relaxationsdaten oder die Einbe¬

ziehung weiterer Relaxationsparameter. Die erreichbare Meßgenau¬

igkeit ist eine Funktion der Meßzeit und der Empfindlichkeit des

verwendeten Spektrometers und kann daher direkt über die Wahl

der Resonanzfrequenz oder die Anzahl der aufaddierten Experi¬mente beeinflußt werden. Ein weiterer Faktor, der die Genauigkeitder Auswertung beeinflußt, ist die Vernachlässigung einzelner Rela¬

xationsbeiträge in der Analyse der experimentellen Daten. Insbeson¬

dere die Annahme isolierter Spinsysteme, die nur durch die direkt

gebundenen Protonen relaxiert werden, kann die Genauigkeit einer

solchen Analyse beeinträchtigen. Die Beiträge der nächsten nicht

gebundenen Protonen führt zu einem Fehler (siehe Kapitel 4.2), der

in der selben Größenordnung ist wie die in dieser Arbeit erreichte

Meßgenauigkeit.

128 Kapitel 4.7

Kreuzkorrelierte SIIS-Kreuzrelaxation 129

5 Kreuzkorrelierte SIIS-Kreuzrelaxation

5.1 Einleitung

Wie die Untersuchung der Bewegung der Phenylalaninseitenkettenin Antamanid im letzten Kapitel zeigte, erlaubt die numerische Ana¬

lyse von Relaxationsdaten nicht immer eindeutige Aussagen über

die Art einer internen Bewegung. Die Genauigkeit der gemessenen

Relaxationsdaten läßt häufig keine Unterscheidung der verschiede¬

nen Modelle zu. Es ist daher sinnvoll, mit geeigneten Experimentenzusätzliche Informationen über die Art der internen Bewegungen zu

erhalten, um so verschiedenartige Seitenkettenbewegungen zu

unterscheiden. Das hier vorgeschlagene Experiment nutzt die kreuz¬

korrelierte Kreuzrelaxation von Einspin Sz- zu Dreispin 4S2Il2I22-Polarisation in CH2- und CH3-Systemen aus und wird im weiteren

als SIIS-Kreuzrelaxation bezeichnet.

Kreuzkorrelation zwischen zwei unterschiedlichen Wechselwirkun¬

gen wurde schon für mehrere Experimente verwendet. Die Kreuz¬

korrelation zwischen dipolarer Kopplung und der Anisotropie der

chemischen Verschiebung wurde von Goldman [84] theoretisch

beschrieben und experimentell beobachtet. Sie erzeugt eine Kreuzre¬

laxation, bei der sich die Spinordnung um eins ändert, d.h. man

erhält z.B. eine Kreuzrelaxation zwischen den Termen Sz und 2S2I2.Dipol-Dipol-Kreuzkorrelation wurde zuerst von Hubbard [99] bei

der Relaxation von Protonen in Methylgruppen theoretisch gefun¬den und später mit Hilfe der ungleichen Zerfälle der verschiedenen

Multiplettlinien in heteronuklearen AX3-Spinsystemen auch experi¬mentell nachgewiesen. Bodenhausen et al. maßen als erste die homo¬

nukleare Kreuzrelaxation von Il2 nach 4JlzJ22I32 (TQF-NOESY) [93-

95], die durch die Kreuzkorrelation der beiden homonuklearen dipo¬laren Kopplungen (1,2) und (1,3) entsteht. Brüschweiler et al. [96]

führten dasselbe Experiment in einem gekippten rotierenden Koor¬

dinatensystem durch (T-ROESY) und benutzten es zur Analyse der

130 Kapitel 5.2

Populationen des ersten Rotationswinkels in der Seitenkette von

Proteinen. Man beobachtet dabei den Relaxationstransfer Lz, ->

47azJo2,7ß2,. Im ortho-ROESY Experiment [153] benutzt man die

Kreuzkorrelation zwischen einer Modulation der isotropen chemi¬

schen Verschiebung und der skalaren J-Kopplung zur Beobachtunglokaler interner Bewegungen.

Die SIIS-Kreuzrelaxation kann ebenfalls zur Charakterisierung der

Bewegung um den xx -Winkel in Seitenketten von Peptiden und Pro¬

teinen benutzt werden und erlaubt es unter gewissen Bedingungen,zwischen unbeschränkten und winkelbeschränkten Bewegungen zu

unterscheiden. Die unbeschränkte Bewegung kann z.B. durch ein

Dreisprungmodell mit gleichen Populationen oder durch eine freie

Diffusion um die Ca-Cß-Bindung realisiert werden, während die

winkelbeschränkte Bewegung durch ein Zweisprungmodell oder

durch eine beschränkte Diffusion beschrieben werden kann. Diese

beiden Klassen von Modellen können mit der vorgeschlagenenMethode aufgrund des Vorzeichens der Kreuzpeaks in einem 2D-

Spektrum unterschieden werden.

5.2 Theorie der SIIS-Kreuzrelaxation

Bei dem betrachteten Relaxationsprozeß handelt es sich um die

kreuzkorrelierte Kreuzrelaxation

°z "viz^ (5.1)

in einem CH2-Dreispinsystem. Diese Art der Kreuzrelaxation wird

durch die Kreuzkorrelation der beiden dipolaren Vektoren Slx und

Sl2 erzeugt, die durch einen stochastischen Prozeß korreliert modu¬

liert werden. Berechnet man die Kreuzrelaxationsratenkonstante für

diesen Prozeß nach Gleichung (2.22) so erhält man

Theorie der SIIS-Kreuzrelaxation 131

3 (Hof (TSV/*)2. r(SV.(«2)rn. ,„.

rS!x'

rSI2

mit der spektralen Leistungsdichtefunktion definiert gemäß Glei¬

chung (2.21). Diese spezielle spektrale Leistungsdichtefunktion ent¬

steht durch die Fouriertransformation einer Kreuzkorrelationsfunk¬

tion der beiden verschiedenen C-H Bindungsvektoren. Die Eigen¬schaften der Kreuzrelaxationsratenkonstanten aus Gleichung (5.2)

sollen für unterschiedliche Modelle berechnet und diskutiert wer¬

den. Im folgenden werden vier Modelle für die interne Bewegung

untersucht, zwei Sprungmodelle und zwei Diffusionsmodelle.

An dieser Stelle ist es wichtig darauf hinzuweisen, daß die Kreuzre¬

laxationsratenkonstante für starre Moleküle und nicht isotropem

„rotational tumbling" von der Orientierung der Rotationsachse zu

den Hauptachsen des Diffusionstensors abhängig ist. In diesem Fall

kann sie sowohl positive als auch negative Werte annehmen. Da die

Auswertung dieses Experimentes auf dem Vorzeichen der Kreuzre¬

laxationsratenkonstante beruht, kann sie nur auf Moleküle angewen¬

det werden, die sich in guter Näherung durch ein isotropes „rotatio¬

nal tumbling" beschreiben lassen.

5.2.1 Sprungmodelle

Die Bewegung der Seitenkette wird auf Sprünge zwischen den drei

gestaffelten Konformationen (Abbildung 5.1) beschränkt und es sol¬

len zwei Fälle betrachtet werden: Im ersten Fall, der eine ungehin¬derte Bewegung beschreibt, sind alle drei gestaffelten Konformatio¬

nen mit gleicher Wahrscheinlichkeit besetzt. Im zweite Fall, der eine

im Winkelbereich beschränkte Bewegung darstellt, sind nur zwei der

drei möglichen Konformationen mit unterschiedlichen Populationenbesetzt. Man kann die Kreuzkorrelationsfunktionen für diese beiden

Modelle in der allgemeine Form

132 Kapitel 5.2

c'äir^-î^B.e t/x.

4rc(5.3)

darstellen. Die beiden Modelle unterscheiden sich in den Konstanten

A und B, sowie in der internen Korrelationszeit x., die im Zwei¬

sprungmodell als

xf = l/(w1 + w2) (5.4)

und im Dreisprungmodell als

x;. = l/(3w) (5.5)

gegeben ist. Hierbei ist w die Übergangswahrscheinlichkeit zwi¬

schen den diskreten Positionen im gleichbesetzten Dreisprungmo¬dell während w1 und w2 die beiden Übergangswahrscheinlichkeitenim Zweisprungmodell mit verschiedenen Populationen sind. Die

Korrelationsfunktion ist dann

/:(S/,), (S/2) 1

2,2,1,1 (W)=4^-2x

+ B-2x.

l+(COTc)2 l+«0Te)2(5.6)

mit der effektiven Korrelationszeit

N H,

Hßl H

C N

% Hh

X, = 180°

Abbildung 5.1: Die drei gestaffelten Konformationen einer Aminosäureseiten¬

kette mit der Definition des zugehörigen Xj -Winkels.


ri 11X = — + —e X X.

.

c 1.

(5.7)

Mit einem idealen Bindungswinkel von 109.5° erhält man für die bei¬

den Konstanten A und B folgende Werte:

Zweisprungmodell Dreisprungmodell

A -0.3329 +1.3329-p^l-pj) 0.1114

B -1.3329-Pl(l-Pl) -0.4443

Für den Fall einer langsamen internen Bewegung, d.h. mit x.» x,

erhält man als Grenzwert in beiden Fällen wieder das Resultat eines

starren Moleküls:

72,2,1,1 («)1 2'\-=-

• (-0.3329) —.

471 l+(u)xj2(5.8)

5.2.2 Diffusionsmodelle

Für den Fall einer freien rotatorischen Diffusion erhält man für die

Winkelkorrelationsfunktion nach Gleichung (2.51):

2

Ca /a —m Dt £

m.mM = e -8 (5.9)

Eingesetzt in die gesamte Korrelationsfunktion und unter Berück¬

sichtigung der idealen tetraedrischen Geometrie des Kohlenstoff¬

atoms erhält man

CS;^ - r//Xc- [0.1108-0.1485e-'/T'-0.2961e-4f/T'] .(5.10)

Die interne Korrelationszeit x. ist hier der Kehrwert der Diffusions¬

konstanten D, der internen Rotation. Dies führt zu einer Kreuzrelax¬

ationsratenkonstante

134 Kapitel 5.2

3 fM2 (YsY,fc)2"4W2*S, 10 Uit

-0.1485-

rs/j" rsi2

0.1108-2-t.

2-t.

1+ (u)cx)

v S e'

0.2961-

l+((osxc)

2-x'

l+«V'e), (5.11)

wobei die Korrelationszeit x durch Gleichung (5.7) definiert ist. Die

zweite effektive Korrelationszeit ist

(5.12)

Für den Fall einer auf das Intervall [-<p0, <p0] beschränkten Diffusi¬

onsbewegung, muß die Korrelationsfunktion wie in Abschnitt 2.6.2

als eine unendliche Reihe geschrieben werden:

- ri ie

~

X X_

c i

(SIj), (SJ2)_

-t/z,

L2,2,1,1~~ e

fc = 0

-f/x,(5.13)

Hierbei sind die Konstanten

2

4t = SKo(ß)| -£m,^0) •*2 1 m(2rt/3)

(5.14)

m = -2

und die Korrelationszeiten

(5.15)

ß ist der Winkel zwischen der Rotationsachse und dem dipolarenVektor und die Funktionen Em k((p0) sind in Gleichung (2.55) defi¬

niert. Die Kreuzrelaxationsratenkonstante hat dann die Form


^W^z 10

3 fM2 (V/^)2 ~.

2-T*

3 3^4n

mit den effektiven Korrelationszeiten

5> C—2' (5.16)

rS/j-rS/2 * = 0 l+(WsTe)

< =

n i— + — (5.17)

Für die Grenzfälle <p0 -> 0 und D, -» 0 erhält man das gleiche Ergeb¬nis wie im Falle des starren Moleküls (Gleichung (5.2) und (5.8)). Auf

der anderen Seite erhält man für cp0 = n nicht das Resultat einer

unbeschränkten Rotation, was bereits in Referenz [78] erwähnt

wurde. Dieser Unterschied kann durch die Tatsache erklärt werden,

daß auch bei einem Restriktionswinkel von 180° eine Bewegung über

die Grenze von +180° nach -180° hinweg, im Gegensatz zur unbe¬

schränkten internen Bewegung, verboten ist.

5.2.3 Beschreibung im rotierenden KoordinatensystemDa die Geschwindigkeitskonstante für die SIIS-Kreuzrelaxation im

Laborkoordinatensystem (Gleichung (5.2)) nur eine Funktion der

spektralen Leistungsdichte der Frequenz a>s ist, strebt sie für großeMoleküle, d.h. für große Werte von xc gegen Null. Dies hat zur Folge,daß der Kreuzrelaxationsprozeß langsam wird. Legt man ein Spin¬lockfeld der rf-Amplitude y&B1 auf den S-Spins mit einer Offsetfre¬

quenz A(ös an (Abbildung 5.2), so erhält man im rotierenden Koordi¬

natensystem einen effektiven Neigungswinkel der neuen quantisier-ten z-Achse von

@s = ^{^) <5-18>

gegen die z-Achse des statischen B0-Feldes. In diesem Koordinaten¬

system ist die Geschwindigkeitskonstante der SIIS-Kreuzrelaxation

136 Kapitel 5.2

*Sz>U>2?Sz3_20 4n

47t-

rsi1' rsi2

4 ,

3Sin20s

(S7j),(S7) 2 (S7j),(SJ2) -l

x h, 2, o, o (0) + (1 + cos2Os)•

]% 2]h 1 (ws) J (5.19)

eine Funktion der spektralen Leistungsdichte der Frequenzen Null

und u)s. Es ist daher von Vorteil das Experiment für große Moleküle

im rotierenden Koordinatensystem durchzuführen, da die Kreuzre¬

laxationsratenkonstante auch für große Moleküle mit einer langenKorrelationszeit xc nicht verschwindet. Für ©s = 0 reduziert sich

Gleichung (5.19) auf Gleichung (5.2) und für den Fall eines „on-reso-

nance" Spinlockfeldes mit 0g = rc/2 erhält man

rR _320 I4n

l*of (VsY,ft)23 3

rcr * rq.

47t

4 (S7]),(S72)m.. T(S/,).(S/2)

3/2,2,0,0(°) + /2,2,l,l («V

(5.20)

Au)s = W-u)n

Abbildung 5.2: Effektive Richtung der Quantisierungsachse in einem rotieren¬

den gekippten Koordinatensystem. 7 ßj ist die rf-Amplitude des Spinlockfeldesund A(ö. die Offsetfrequenz des betrachteten Kernes.

Berechnung der Kreuzrelaxationsratenkonstante 137

Für den Fall ©s = rc/2 erhält man, wie bereits von Bull [83,102]

erwähnt wurde, eine teilweise Entkopplung der Basisoperatoren. Die

beiden Kreuzrelaxationsratenkonstanten

TS1

= r4S7 7 7

= ° <5-21>32'JJt2 *Sz'lz'2z'lkz

werden null, und das System wird auf zwei gekoppelte Differential¬

gleichungen reduziert. Dies erleichtert eine quantitative Messungder Geschwindigkeitskonstanten.

5.2.4 SIIS-Kreuzrelaxation in Methylgruppen

Aufgrund der C3-Symmetrie der CH3-Gruppe sind die drei Protonen

in einer CH3-Gruppe magnetisch äquivalent. Daher sind die symme¬

trieangepaßten Basisoperatoren in einem AX3-System verschieden

von den Basisoperatoren in einem AMX-System (CH2-Gruppe). In

der symmetrieadaptierten Basis [73] der CH3-Gruppe ist der für die¬

ses Experiment relevante Kreuzrelaxationsweg

*z > ^S2 (IlzI2z + IlzI3z +122732) (5.22)

mit einer Geschwindigkeitskonstanten

rr

=4=r,c,

, c• (5-23)

4/75S2(7l272z + 7l2732 + 72273z),S2 ß 4S27l2722,S2

Diese Beziehung gilt unabhängig vom Modell der internen Bewe¬

gung, aber aufgrund der C3-Symmetrie sind nicht alle Modelle

gleich wahrscheinlich, die für die CH2-Gruppe beschrieben wurden.

5.3 Berechnung der Kreuzrelaxationsratenkonstante

Um das unterschiedliche Verhalten der Kreuzrelaxationsratenkon¬

stante im Rahmen der vier diskutierten Modelle zu vergleichen, wer¬

den in diesem Abschnitt numerische Berechnungen der Geschwin¬

digkeitskonstanten gemacht. Unter der Annahme einer idealen

138 Kapitel 5.3

Tetraedergeometrie (alle Bindungswinkel 109.5°) und einer C-H-Bin-

dungslänge von rCH - 1.09 Ä wurde rs;jS für drei unterschiedliche

Korrelationszeiten xc des isotropen „rotational tumbling" als Funk¬

tion der internen Korrelationszeit x. berechnet. Die Resonanzfre¬

quenz des Kohlenstoffes betrug a>s/27t = 150.8 MHz und für die

Korrelationszeiten des „rotational tumbling" wurde x = 0.106 ns,

1.06 ns und 10.6 ns gewählt, entsprechend den Werten usxc = 0.1, 1

und 10. Diese Werte stehen für ein kleines, ein mittleres und ein gro¬

ßes Molekül und sollen die Unterschiede und Gemeinsamkeiten im

Verhalten der verschiedenen Molekülklassen illustrieren. Die beiden

Abbildungen 5.3 und 5.4 zeigen rs//s als Funktion der internen Kor¬

relationszeit x{ für die vier diskutierten Modelle. Die Geschwindig¬keitskonstante ändert ihr Vorzeichen nur für den Fall des Drei¬

sprungmodells (Abb. 5.3 a) und der freien Diffusion (Abb. 5.4 a),

nicht aber für die Modelle mit einem eingeschränkten Winkelbe¬

reich. Da die Differentialgleichung (2.80) zur Beschreibung der Zeit¬

evolution der gekoppelten Basisoperatoren ein zusätzliches Minus¬

zeichen vor dem Superoperator f enthält, führt eine negative Kreuz¬

relaxationsratenkonstante zu einer positiven kreuzrelaxierten

Magnetisierung und umgekehrt. In einem zweidimensionalen

Kreuzrelaxationsspektrum sind daher negative Kreuzpeaks

(rs//s > 0) ein Hinweis auf eine interne Bewegung, die in ihrem Win¬

kelbereich nicht beschränkt ist und daher gut durch ein Dreisprung¬modell oder durch eine freie interne Diffusion beschrieben werden

kann. Das Zweisprungmodell (Abb. 5.3 b) mit einer Winkeldifferenz

von 120° zwischen den beiden Positionen und das Diffusionsmodell

mit einem auf das Intervall [-60°, 60°] beschränkten Winkelbereich

(Abb. 5.4 b) ergeben für alle Werte der internen Korrelationszeit t.

positive Kreuzpeaks (rsjJS < 0). Vergrößert man den Winkel q>0 so

steigt das Maximum von rs/;s bis man den Wert einer freien Diffu¬

sion erreicht. Eine quantitative Analyse der experimentellen Daten

kann in günstigen Fällen eine Unterscheidung aller vier Modelle auf¬

grund der unterschiedlichen Abhängigkeit von der internen Korrela-


a)

0.5-

— 0

co

N-0.5

co

N

CM -1N

N -1hCOTt

U -2

-2.5

-3

10'12

Dreisprungmodelli riiir" i i i i mim

CöeTr, = 1

10"<

b)1

0.5

—1 n1

N

co

-0.5

N

_C\IN

~NCO

r-T

-1

-1.5

-2

-2.5

-3

Zweisprungmodell

-

•

"^ST—-._____ tösXc = 0.1

\\ /tösTc=10

\yC____ cosxc=i

•

--

ri-11 m-10 -tn-910"^ 10"11 10"lu 10"s 10"0 10

X,[S]

i-7 io-<

Abbildung 5.3: Verhalten der SIIS-Kreuzrelaxationsratenkonstanten als Funk¬

tion der internen Korrelationszeit x für Sprungmodelle, (a) zeigt ein symmetri¬sches Dreisprungmodell mit gleichen Populationen, (b) ein Zweisprungmodellmit einem Winkelabstand von 120°.

140 Kapitel 5.3

a) freie Diffusion

0.5

r"~i 0

CO

-0.5co

NCM -1NT—

co-1.5

•*

U-2

-2.5

-3

10"12 10- 11 1Q-10 10-9 10-8 1Q-7 1Q-6

X,[S]

b) winkelbeschränkte Diffusion

0.5

'co

"n -0.5CO

_£M -1 .

N

~n.15

co '°h

-2.51-

-3

10-12 1Q-11 1Q-10 10"9 10"8 10"7 10"6

x,[s]

Abbildung 5.4: Verhalten der SIIS-Kreuzrelaxationsratenkonstanten als Funk¬

tion der internen Korrelationszeit x für Diffusionsmodelle, (a) zeigt eine freie

interne Diffusion und (b) eine beschränkte interne Diffusion auf das Intervall

cpfl = ±60°.


tionszeit erlauben. Für den Fall eines kleinen Moleküls oder niedri¬

ger Felder (wsxc < 1) ist rs/;s streng monoton fallend mit steigenderinterner Korrelationszeit x.. Für große Moleküle und hohe Felder

(u>sxc>l) ist die Abhängigkeit der Geschwindigkeitskonstanten

rsj/s von der internen Korrelationszeit nicht mehr monoton, und die

Kreuzrelaxationsratenkonstante wird durch die interne Bewegung

verringert bis die Geschwindigkeitskonstante ein Minimum erreicht.

Bei noch schnellerer Bewegung ist sie dann wieder streng monoton

steigend für zunehmende interne Bewegung.

Die beiden Klassen von Modellen können nur unterschieden wer¬

den, wenn die interne Bewegung relativ zum „rotational tumbling"des Moleküls schnell ist. Der kritische Wert von cosx. für den Null¬

durchgang von rsns ist eine Funktion des gewählten Modells und

von cocx.Die untere Schranke für x, für die man die beiden Modell-

b c t

klassen gerade noch unterscheiden kann, berechnet sich nach der

Gleichung

cöst. = /(cösxc)| . (5.24)

Für das Dreisprungmodell ist die Abhängigkeit der internen Korre¬

lationszeit x. von der Korrelationszeit x des „rotational tumbling" in

Abbildung 5.5 gezeigt. Die Bereiche mit einer positiven Geschwin¬

digkeitskonstanten sind mit einem '+', die Bereiche mit einer negati¬ven Geschwindigkeitskonstanten mit einem '-' gekennzeichnet. Für

niedrige Werte von cosxc geben die Experimente im Laborkoordina¬

tensystem und im rotierenden Koordinatensystem die gleichen Ein¬

schränkungen, während für große Werte von cosxc, d.h. große Mole¬

küle und hohe Magnetfelder, das Experiment im rotierenden Koordi¬

natensystem eine Unterscheidung der beiden Modellklassen bereits

für eine viel langsamere interne Bewegung erlaubt.

Abbildung 5.6 zeigt das Verhalten der Kreuzrelaxationsratenkon¬

stante für ein hypothetisches Molekül mit einer Korrelationszeit

xc = 10.6 ns für verschiedene Neigungswinkel ©s des rotierenden

142 Kapitel 5.3

Koordinatensystems. ©s = 0 entspricht dem Experiment im Labor¬

system, d.h. es ist kein Spinlockfeld auf dem Spin S angelegt, wäh¬

rend @s = 90° ein starkes Spinlockfeld oder einem geringen Reso¬

nanzoffset beschreibt. Der Winkel 0S = 45° repräsentiert einen Fall

zwischen den beiden Extremen, bei dem Resonanzoffsets wichtigwerden. Auch hier sieht man, daß für das Experiment im rotierenden

Koordinatensystem der Nulldurchgang von rsj/s bereits für einen

10 ;

10

10

10

(OsTj

10

-210

10

Tm 1—I I I I im 1—I I I I I III

.rotating frameV

10

0>s*c

Abbildung 5.5: Abhängigkeit der internen Korrelationszeit x. von der Korrelati¬

onszeit x des „rotational tumbling" für die Bedingung rs;/s = 0 berechnet für

das Dreisprungmodell (Abb. 5.3). Die Bereiche positiver und negativer Kreuzre-

laxationsratenkonstanten sind mit einem '+' und einem '-' gekennzeichnet.


viel größeren Wert von x erfolgt als für das Experiment im Laborko¬

ordinatensystem. Außerdem ist gut erkennbar, daß der Betrag der

Kreuzrelaxationsratenkonstantenim rotierenden Koordinatensystemviel größer ist als im Laborkoordinatensystem. Daher und aufgrunddes nach rechts verschobenen Nulldurchganges im rotierenden

Koordinatensystem ist für große Moleküle das Experiment im rotie¬

renden Koordinatensystem demjenigen im Laborkoordinatensystemvorzuziehen.

15

10

5

"

0

N -5

-S-10

Jp -15

U-20

-25

-30

-3510'12 10"11 10"10 10"9

X,[s]

' im

lO"1

0S=45'

' '' •

10'1 10"1

Abbildung 5.6: Abhängigkeit der Kreuzrelaxationsratenkonstanten für ein Drei¬

sprungmodell mit unterschiedlichen Werten für den Neigungswinkel 0S des

rotierenden Koordinatensystems von der internen Korrelationszeit x .

144 Kapitel 5.4

5.4 Numerische Simulation des AMX-Spinsystems

Nur für kurze Zeiten t ist der Relaxationstransfer 4S2/l2J22 -> Szdirekt proportional zur Kreuzrelaxationsratenkonstanten rs//s(„initial rate" Näherung). Ist man an der vollen Zeitentwicklung des

Relaxationstransfers interessiert, so muß man sämtliche Operatoren

berücksichtigen, die über Kreuzrelaxation mit einem der beiden

Operatorterme Sz oder 4S2Jl2J2_ verknüpft sind und das System von

gekoppelten Differentialgleichungen (2.80) lösen. Unter dipolarer

Relaxation erhält man in einem AMX-Spinsystem nur Kreuzrelaxa¬

tion zwischen den asymmetrischen Operatoren 7lz, I2z, Sz und

4S_JlzJ-2. Die Beiträge weiterer Protonen zu den Autorelaxationsra¬

ten wurden in der Form eines „random field" Beitrages berücksich¬

tigt. Dieser Beitrag wurde so groß gewählt, daß die Autorelaxations¬

rate eines I-Spins gegenüber dem isolierten System verdoppelt

wurde, was in der Größenordnung dem von Peng und Wagner [129]

experimentell bestimmten Beitrag anderer Protonen entspricht. Das

Differentialgleichungssystem, das die vier asymmetrischen Basis¬

operatoren verknüpft, ist in der Literatur ausführlich diskutiert und

man findet die Ausdrücke für die Geschwindigkeitskonstanten in

den Referenzen [73] und [83]. Die numerische Lösung unter den

Anfangsbedingungen <4S2Il272z)(0) = 1 und <Sz>(f) = (Ilz)(t) =

(I2z)(t) = 0 für ein Dreisprungmodell mit gleichen Populationen und

langen bzw. kurzen internen Korrelationszeiten x( finden sich in

Abbildung 5.7 für ein kleines Molekül mit einer Korrelationszeit

cosxc = 0.1. Die Zeitevolution der vier Operatoren ist für langsame

interne Bewegung (linke Hälfte, x = 10+12 s) und für eine schnelle

interne Bewegung (rechte Hälfte der Abbildung 5.7, x; = 10"12 s)

berechnet und wiedergegeben. Die beiden Operatoren Jl2 und l2zevolvieren identisch, solange die Relaxationsraten der beiden I2-Terme identisch sind. In einem isolierten Dreispinsystem ist daher

die Kreuzrelaxationsrate zwischen den beiden Termen nicht sichtbar.

Sobald die beiden Terme durch Wechselwirkungen mit anderen

Spins außerhalb des Dreispinsystems unterschiedlich relaxiert wer-

Numerische Simulation des AMX-Spinsystems 145

Tj « Tc

0.4 0.8 1.2 1.6 2 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2

Abbildung 5.7: Zeitevolution der vier gekoppelten Basisoperatoren eines AMX-

Spinsystems berechnet für ein Dreisprungmodell mit einer Korrelationszeit von

xc = 106 ps und einer Spektrometerfrequenz von as/2n = 150.8 MHz. (a)-(c)

zeigt den Fall eines starren Moleküls ohne interne Bewegung, während (d)-(f)

eine schnelle interne Bewegung mit einer Korrelationszeit von x = 10"12 s zeigt.

146 Kapitel 5.4

Xj « Tc

0 0.04 0.08 0.12 0.16 0.2 0 0.04 0.08 0.12 0.16 0.2

t [S] t [S]

b)0.2 r

0 0.04 0.08 0.12 0.16 0.2 0 0.04 0.08 0.12 0.16 0.2

t [S] t [S]

0 0.04 0.08 0.12 0.16 0.2 0 0.04 0.08 0.12 0.16 0.2

t [S] t [S]

Abbildung 5.8: Zeitevolution der vier gekoppelten Basisoperatoren eines AMX-

Spinsystems im rotierenden Koordinatensystem (selektiver Spinlock auf dem S-

Spin) berechnet für ein Dreisprungmodell mit einer Korrelationszeit von

%c = 4.2 ns und einer Spektrometerfrequenz von u>s/2n = 150.8 MHz. (a)-(c)

zeigt den Fall eines starren Moleküls ohne interne Bewegung, während (d)-(f)

eine schnelle interne Bewegung mit einer Korrelationszeit von x = 10 s zeigt.

Numerische Simulation des AMX-Spinsystems 147

den, wird diese Symmetrie gebrochen und die beiden Operatorenentwickeln sich verschieden. Man sieht in Abbildung 5.7, daß die

kreuzrelaxierte Polarisation auf dem S-Spin gering ist und immer

unter sechs Prozent bleibt. Daher ist eine geringe EmpfindUchkeitdes Experiments zu erwarten. Trotzdem ist der Vorzeichenwechsel in

der Kreuzrelaxationsratenkonstante beim Übergang von einer lang¬samen zu einer schnellen internen Bewegung direkt am Vorzeichen

der kreuzrelaxierten Polarisation ersichtlich (Abb. 5.7 b und e). Für

eine langsame interne Bewegung ist das Vorzeichen von (Sz)(f) posi¬tiv (Abb. 5.7 b), was einer negativen Geschwindigkeitskonstanten

entspricht, während für die schnelle interne Bewegung das Vorzei¬

chen negativ (Abb. 5.7 e) wird, da rs//s jetzt im positiven Bereich ist.

Führt man das Experiment im rotierenden Koordinatensystemdurch, so vereinfacht sich das System der gekoppelten Differential¬

gleichungen. Auch hier wurde wieder die numerische Lösung der

gekoppelten Differentialgleichungen mit den Parametern xc = 4.1 ns

(d.h. für ein mittelgroßes Molekül) und tos/2n = 150.8 MHz berech¬

net. Die Beiträge anderer Protonen zur Relaxation der verschiedenen

Operatoren wurden wie im Falle der Beschreibung im Laborkoordi¬

natensystems durch einen „random field" Term berücksichtigt, der

die Geschwindigkeitskonstante der Protonen gegenüber einem iso¬

lierten Dreispinsystem verdoppelt. In Abbildung 5.8 ist die Lösungdes Differentialgleichungssystems für die Anfangsbedingungen<4SzIlzI2z>(0) = 1 und <Sz>(f) = (Ilz)(t) = (I2z)(t) = 0 dargestellt. Auch

hier zeigt die linke Seite (Abb. 5.8 a-c) die Lösung für ein Systemohne interne Bewegung (x; = 10+12 s) und die rechte Seite (Abb. 5.8

d-f) für ein System mit schneller interner Bewegung (x. = 10"12 s).

Der Wechsel des Vorzeichens für die nach Sz kreuzrelaxierte Magne¬tisierung ist wiederum klar in Abbildung 5.8 b und 5.8 e zu sehen.

148 Kapitel 5.5

5.5 Experimentelle Realisierung der SIIS-Kreuzrelaxation

Aufgrund der Symmetrie des Relaxationssuperoperators kann man

entweder einen Anfangsdichteoperator erzeugen, der proportionalzu S2 ist und die Zeitevolution des 4S2/lzI2z Operators detektieren,

oder den umgekehrten Weg benutzen. Für den Fall der SIIS-Kreuzre¬

laxation ist es experimentell besser, den Relaxationsweg

o(xm= 0) ~ 4S2Il2I22 -> o(xm) - S2 (5.25)

zu wählen, da es dabei einfacher ist, die unerwünschten Terme durch

geeignete Phasenzyklen zu eliminieren. Diese Variante soll im weite¬

ren mit SII-S-Kreuzrelaxation bezeichnet werden, der umgekehrte

Weg mit S-SII-Kreuzrelaxation. Die Unterdrückung von uner¬

wünschten Termen im Dichteoperator zu Beginn und am Ende der

Mischzeit ist für dieses Experiment kritisch, da die Kreuzrelaxations¬

ratenkonstante klein ist und die Simulationen (Kapitel 5.4) Effekte in

der Größenordnung von ca. 5% erwarten lassen.

Der gewünschte Anfangsdichteoperator kann durch einen INEPT-

Polarisationstransfer [143,144] ausgehend von den I-Spins erzeugt

werden. Durch einen Doppelquantenfilter auf den I-Spins und einen

Phasenzyklus auf den S-Spin Pulsen können alle Operatoren außer

dem Dreispinterm am Anfang der Mischzeit eliminiert werden. Die

Amplitude des Dreispinterms ist eine Funktion der beiden Intervalle

Aj und A2 (Abb. 5.9) und hat für CH2- und CH3-Gruppen folgendeForm [154]:

flC«2i (ArA2) = -sin(2Ä/CHA.) • sin(4ti/chA2) (5.26)

und

fl4S>iA. + V3. + 'n'32>(Ai'A2) = -(2"/chA,)

1x - [3sin (6nJCHA2) - sin

(2nJCHA2)}4 2 CH 2

Experimentelle Realisierung der SIIS-Kreuzrelaxation 149

Man kann die Amplituden der beiden Gruppen nicht gleichzeitig

optimieren, da die Maxima für eine CH2-Gruppe (Aj = 1/ (4/CH)und A2 = l/(8/CH)) und für eine CH3-Gruppe (Aa = A. =

1/ (4/CH)) verschieden sind. Es gibt aber einige Punkte, bei denen

beide Amplituden gleichzeitig groß sind. Sie besitzen zum Beispiel

für A2 = 0.196//CH ein unterschiedliches Vorzeichen aber den glei¬

chen Betrag von 0.63. Eine günstigere Wahl ist A2 = 1/ (12/CH), weil

damit zusätzlich die Gesamtzeit des Experimentes verkürzt wird. An

diesem Punkt haben die beiden Amplituden gleiches Vorzeichen

und nehmen den Wert 0.87 für eine CH2-Gruppe und 0.63 für eine

CH3-Gruppe an.

Die Selektion des S2-Terms nach der Mischzeit erfolgt durch die

Detektion auf dem S-Spin und die gleichzeitige Entkopplung der

Protonen. Hierdurch werden alle unerwünschten Terme im Dichte¬

operator unterdrückt. Aus Empfindlichkeitsgründen wäre es wün¬

schenswert, die S2-Polarisation nach der Mischzeit wieder auf die

Protonen zurückzutransferieren und die Detektion auf den Protonen

auszuführen. Dies würde die Empfindlichkeit des Experimentes

maximal um einen Faktor (Y7/Ys) steigern, d.h. für Protonen und

Kohlenstoff um einen Faktor acht. Dieser zweite Polarisationstrans-

(f)x W, (f)y («)» DQF

Abbildung 5.9: Pulssequenz für die Messung der kreuzkorrelierten SII-S-Kreuz-

relaxation. Die hier gezeigte 1D-Version mit einer normalen INEPT-Sequenz zur

Erzeugung des Anfangsdichteoperators, kann sowohl zur Beobachtung von

CH2- als auch von CH3-Gruppen benutzt werden.

150 Kapitel 5.5

fer erfordert aber nach der Mischzeit eine gute Unterdrückung aller

Terme im Dichteoperator außer dem gewünschten S2-Term, was

experimentell schwierig zu realisieren ist.

Der maximal erreichbare Transfer von F2-Polarisation nach Dreispin¬

ordnung berechnet sich nach einem Theorem von Sorensen [155] für

eine CH2-Gruppe als

"mfl*('l2 + J22^4S27lzi-22) = l (5.28)

und für eine CH3-Gruppe als

«m"(Ilz + I2z + I3z -> 4SZ (Ilzl2z + I2zI3z + llz732)) = 1. (5.29)

Die Maxima des INEPT-Transfers nach Gleichung (5.26) und (5.27)

sind ebenfalls 1 für die CH2- und CH3-Gruppen und erreichen somit

das theoretische Maximum. Durch den Zweiquantenfilter auf den

Protonen wird die Amplitude des Dreispinterms um einen Faktor

zwei reduziert. Für die CH2-Gruppe kann man diesen Verlust mit

einer modifizierten Präparationssequenz verhindern. In Abbüdung5.10 ist eine 2D-Version der modifizierten Pulssequenz gezeigt, bei

der die Kreuzpeakintensität ein direktes Maß für die Kreuzrelaxati-

(f)x Wx Wx (f)yDQF

1 | t1+A! Ai A1 nhWx (|)x Wx

(I):2>*

(spinlock)x|

Abbildung 5.10:2D-"rotating-frame"-Version einer modifizierten Präparations¬

sequenz für das SII-S-Kreuzrelaxationsexperiment, die für CH2-Gruppen eine

um einen Faktor zwei bessere Empfindlichkeit als die INEPT-Sequenz aus Abb.

5.9 ergibt.

Experimentelle Ergebnisse 151

onsratenkonstante rs//s ist. Der maximale Transfer für CH2-Grup-

pen wird für Aj = 1/ (4/CH) erreicht, wobei die Intensität der CH3-

Gruppen Null wird.

Neben der bisher beschriebenen Durchführung des Experimentes,könnte man es auch in der S-SII-Variante durchführen, indem man

die Kreuzrelaxation mit dem Term Sz startet und die Zeitevolution

des 4SzIl2I2z-Terms beobachtet. Um einen Beitrag des Dreispinterms

zum Anfangsdichteoperator zu vermeiden, sollte man in diesem

Experiment von der Gleichgewichtspolarisierung der S-Spins ausge¬

hen und keinen Polarisationstransfer zur Steigerung der Empfind¬lichkeit verwenden. Nach der Mischzeit kann dann der Dreispintermmit einem Doppelquantenfilter auf den I-Spins selektiert und nach

einem Polarisationstransferschritt und Refokussierung auf den

I-Spins detektiert werden.

5.6 Experimentelle Ergebnisse

Um die praktische Anwendung der Sü-S-Kreuzrelaxation zu erpro¬

ben wurden zwei Testsysteme untersucht. In dem zyklische Deka-

peptid Antamanid wurde die Zeitevolution der Sü-S-Kreuzrelaxa¬

tion in zwei Lösungsmitteln gemessen, um den Vorzeichenwechsel

der Kreuzrelaxationsratenkonstante an den CH3-Gruppen zu

demonstrieren. Ubiquitin, ein Protein mit 76 Aminosäuren, diente als

ein Testbeispiel für ein größeres Molekül. Alle Messungen wurden

auf einem Bruker AMX-600 Spektrometer mit einem BB-aH Proben¬

kopf durchgeführt, der für die Detektion des X-Kernes optimiert ist.

5.6.1 Messungen an Antamanid

Da die Änderung des Vorzeichens der Kreuzrelaxationsratenkon¬

stante rsns von dem Verhältnis der internen Korrelationszeit x. und

der Korrelationszeit für das „rotational tumbling" x abhängt, kann

die eine oder andere Größe varüert werden, um experimentell den

Nulldurchgang der Kreuzrelaxationsratenkonstanten zu beobachten.

152 Kapitel 5.6

Hierzu wurde die Zeitevolution der Sü-S-Kreuzrelaxation an voll¬

ständig 13C-markiertem Antamanid in zwei Lösungsmitteln mit der

in Abbildung 5.9 gezeigten Pulssequenz an einer 17.5 mM Lösung in

Chloroform bei 280 K und in Aceton bei 310 K gemessen. Die beiden

Zeitintervalle wurden auf Aj = 1.666 ms und A2 = 1/(12.8/CH) =

0.521 ms eingestellt, so daß sowohl für die CH2- als auch für die

CH3-Gruppen eine effiziente Erzeugung des Dreispinterms durch

die INEPT-Sequenz sichergestellt ist. Sechs Mischzeiten mit jeweils2048 aufaddierten Experimenten wurden für die beiden Lösungsmit¬tel aufgenommen. Die prozessierten Spektren sind in Abbildung 5.11

und 5.12 dargestellt.

Aceton wurde aufgrund seiner niedrigen Viskosität (n. = 0.285 cp bei

T = 310 K) gewählt, während Chloroform bei einer Temperatur von

280 K eine hohe Viskosität (n = 0.651 cp) besitzt. Durch die Wahl der

Temperaturen wurde der Unterschied in der Viskosität der beiden

Lösungsmittel noch verstärkt. Mit Hilfe der Stokesschen Beziehung

xc = -gIL- (5.30)

erhält man für das Verhältnis der Korrelationszeiten

X (Chloroform, 280K)=.2.61 . (5.31)

X (Aceton, 310K)

Für die Auswertung wird angenommen, daß der Einfluß des

Lösungsmittels auf die internen Bewegungen vernachlässigt werden

kann. Der Einfluß der Temperatur auf die interne Bewegung kann

dagegen nicht vernachlässigt werden. Unter der Annahme einer

Arrheniusbeziehung für die Aktivierungsenergien des Prozesses

kann man die internen Korrelationszeiten x für die Temperaturdiffe¬

renz korrigieren.

Ein Vergleich der beiden Serien von lD-Spektren in den unterschied¬

lichen Lösungsmitteln zeigt drei Klassen von Linien:

Magnetisierung.

kreuzrelaxiertenpositiveneinerzuführenundnegativCH3-Gruppendreidie

fürKreuzrelaxationsratenkonstantendiesindLösungsmitteldieseminbling"

tum-„rotationalschnellenBewegunginternenzurVergleichimdesAufgrund

Kohlenstoffatome.verschiedenenderMagnetisierungkreuzrelaxiertendertion

Zeitevolu¬diezeigenMischzeitenverschiedeneSechsK.310=TbeiAcetonin

Antamanids13C-markiertendesSIIS-Kreuzrelaxationsspektren5.11:Abbildung

ppm208[13C]304050

I—i—i—i—i—|—i—i—i—i—|—i—i—i—i—|—i—i—i—i—|—i—i—i—i—|—i—i—i—i—|—i—i—i—i—

xm=1.5s

S1=xm

Val-yAla-ßPrcvyPro-ßPhe-ßPro-8

lfVVy'

yy1

msou=

Jxmms750

=

xm

ms500=xm

ms250=xm

153ErgebnisseExperimentelle

154 Kapitel 5.6

tm = 3 US

lll % = 50 ms

xm = 100 ms

Prcvy Val^y Ala-ß

v*»^^VL»vY>*«vvW^**»wd'%^^

xm = 800 ms

I—\—I I I—I—I—1—I ]—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—1—1—1—I—I—I—I—1—I—I—[—I—I—I—I—I—

40 30 8[13C] 20 ppm

Abbildung 5.12: SIIS-Kreuzrelaxationsspektren des 13C-markierten Antamanids

in Chloroform bei T = 280 K. Sechs verschiedene Mischzeiten zeigen die Zeit¬

evolution der kreuzrelaxierten Magnetisierung für die verschiedenen Kohlen¬

stoffatome. Da die interne Bewegung der CH3-Gruppen in diesem Lösungsmit¬

tel schnell im Vergleich zum „rotational tumbling" des Moleküls ist, sind die

Kreuzrelaxationsratenkonstanten für die drei CH3-Gruppen positiv und führen

zu einer negativen kreuzrelaxierten Magnetisierung.


- Die drei Linien der Methylgruppen von *Val und 4Ala sind in

Chloroform (T = 280 K) negativ und in Aceton (T = 310 K) positiv.

- Die Linien der CyH2-Protonen von 2Pro und 7Pro sind in beiden

Lösungsmitteln negativ.

- Alle anderen CH2-Gruppen sind sowohl in Aceton, als auch in

Chloroform positiv und die Amplituden der Signale variieren nur

wenig.

Für die Methylgruppen kann man mit Hilfe der gemessenen Daten

und der Beziehung zwischen den beiden Korrelationszeiten x; und

x aus Abbildung 5.5 eine obere und untere Schranke für die

Geschwindigkeitskonstante der internen Rotation angeben. Die Kor¬

relationszeit für das „rotational tumbling" in den beiden Lösungs¬

mitteln und bei den zwei Temperaturen wurde aus den TrRelaxati-onszeiten (Tabelle 5.1) der Ca-Kohlenstoffatome berechnet und

beträgt:

xc(Aceton, 310K) = 95 ps

x/Chloroform, 280K) = 250 ps

Aufgrund des beobachteten Vbrzeichenwechsels der SII-S-Kreuzrela-

xation kann man aus diesen beiden Korrelationszeiten einen Bereich

für die möglichen internen Korrelationszeiten x. abschätzen:

30 ps < x; < 85 ps (5.33)

Berücksichtigt man die Temperaturabhängigkeit der internen Bewe¬

gung, so wird der Bereich der möglichen Korrelationszeit weiter ein¬

geschränkt. Mit Hilfe der Aktivierungsenergien für die Methylgrup¬

penrotation, die mittels Festkörper-NMR-Spektroskopie gemessen

wurden, kann man die Änderung der Korrelationszeit x. auf dem

betrachteten Temperaturintervall von 40° abschätzen. Für Valin, mit

einer Aktivierungsenergie Efl» 7.7 kj/mol in festem poly-Valin,erhält man einen Faktor 1.38 und für Alanin, mit einer Aktivierungs-

156 Kapitel 5.6

13C-AtomTjls]

Chloroform, 280 K Aceton, 310 K

aVal-a 277 ± 8 ms 580 ± 10 ms

2Pro-a 261 ± 12 ms 570 ± 11ms

3Pro-a 280 ± 6 ms 622 ± 12 ms

4Ala-a 285 ± 16 ms 613 ± 17 ms

5Phe-a 260 ± 10 ms 561 ± 14 ms

6Phe-a 269 ± 8 ms 574 ± 11ms

7Pro-a 265 ± 8 ms 571 ± 13 ms

8Pro-a 268 ± 6 ms 565 ± 13 ms

9Phe-a 262 ± 8 ms 565 ± 12 ms

10Phe-a 267 ± 8 ms 558 ± 10 ms

JVal-Y 282 ± 10 ms 594 ± 14 ms

Val-f 399 ± 12 ms 757 ± 14 ms

4Ala-ß 266 ± 12 ms 582 ± 11 ms

Tabelle 5.1: JC-Tj-Zeiten der a-Kohlenstoffatome und der drei Methylgruppendes Antamanids in Chloroform bei T = 280 K und in Aceton bei T = 310 K. Beide

Messungen wurden bei einer Protonenresonanzfrequenz von 400 MHz durchge¬führt. Die berechneten Fehler geben das Vertrauensintervall einer Standardab¬

weichung an.

energie Ea=10 kj/mol [156] in festem poly-Alanin, einen Faktor

1.51 zwischen den beiden Temperaturen. Damit ergeben sich die fol¬

genden Bereiche für die Korrelationszeiten der beiden Methylgrup¬

pen bei den beiden unterschiedlichen Temperaturen:

Aminosäure X. (280K,CDC13) X. (310 K, Aceton)

Valin 40 ps... 85 ps 30 ps ...60 ps

Alanin 45 ps ...85 ps 30 ps ...

55 ps

Diese Werte kann man mit einer unabhängigen Berechnung der Kor¬

relationszeiten aus den gemessenen 13C-T1-Relaxationszeiten(Tabelle 5.1) bei den beiden Temperaturen vergleichen. Unter Benut-


zung der in Gleichung (5.32) angegebenen Korrelationszeiten für das

„rotational tumbling" und unter Annahme eines Dreisprungmodellserhält man die folgenden Werte für x.:

Methylgruppe X!.(280K,CDC13) X; (310 K, Aceton)

aVal-v 50 ps 25 ps

:Val-Y 25 ps 15 ps

4Ala-ß 55 ps 25 ps

Die Korrelationszeiten, die aus den Tj-Zeiten der Kohlenstoffatome

berechnet wurden, sind alle kleiner oder liegen am unteren Rand der

oben abgeschätzten Bereiche. Dies kann dadurch erklärt werden, daß

in beiden Methoden zur Bestimmung der internen Korrelationszeit

zusätzliche Bewegungen vernachlässigt wurden. Betrachtet man die

^-Zeiten der verschiedenen a-Kohlenstoffatome genauer, so sieht

man, daß 4Ala-Ca eine um 10 Prozent längere Relaxationszeit hat, als

das a-Kohlenstoffatom mit der kürzesten Relaxationszeit. Diese län¬

gere TrZeit kann auf eine zusätzliche Bewegung des Peptidgerüstes

zurückgeführt werden. Bei Valin gibt es die Möglichkeit einer

zusätzlichen Bewegung um die Ca-Cp-Bindung, welche bei der Aus¬

wertung der Tj-Zeiten ebenfalls nicht berücksichtigt wurde und

daher eine scheinbar zu schnelle Bewegung der Methylgruppe zur

Folge hat. Diese zusätzlichen Bewegungen können die I3C-TrZeitenund die SIIS-Kreuzrelaxationsratenkonstante unterschiedlich beein¬

flussen und so die leicht verschiedenen Resultate erklären.

Die negativen Kreuzpeaks der Cy-Atome von 2Pro und 7Pro werden

durch das schnelle „Ringpuckering" des Fünfringes mit einer Korre¬

lationszeit von ca. 30 ps bewirkt [157]. Diese Bewegung entsprichteinem rotatorischen Sprungmodell mit zwei Gleichgewichtspositio¬nen und einem Winkel zwischen den beiden Positionen von ca. 70°.

Allerdings ist der Winkel zwischen der Rotationsachse und dem

dipolaren Vektor für das „Ringpuckering" 90° und nicht 70.5° wie für

die bisher betrachteten Seitenkettenbewegungen. Dadurch ändern

158 Kapitel 5.6

sich die Eigenschaften der SÜS-Kreuzrelaxationsratenkonstante, ins¬

besondere verschiebt sich der Nulldurchgang. Eine quantitative

Analyse der Daten wurde nicht durchgeführt, doch stimmen die

beobachteten Effekte qualitativ mit den theoretischen Voraussagenüberein. Die anderen Kohlenstoffatome der beiden Aminosäuren

2Prolin und 7Prolin zeigen alle positive Kreuzpeaks, da hier die

Amplitude der Rotationsbewegung, die durch das „Ringpuckering"des Fünfringes erzeugt wird, viel kleiner ist [157].

5.6.2 Messungen an Ubiquitin

Als Beispiel für die Anwendbarkeit der SIIS-Kreuzrelaxation auf grö¬ßere Moleküle wurde ein 2D-SII-S-Kreuzrelaxationsspektrum einer

3.2 mM Lösung von vollständig 13C-markiertem Ubiquitin in Wasser

aufgenommen. Ubiquitin hat ein Molekulargewicht von 8.57 kDa

und besitzt bei der gemessenen Temperatur von T = 310 K eine Kor¬

relationszeit von xc - 4.1 ns [158]. Die chemische Verschiebung der

Protonen wurde aus den beiden Arbeiten von Weber und Mueller

[159] und DiStefano und Wand [160] übernommen, während die che¬

mischen Verschiebungen der Kohlenstoffatome, basierend auf einer

partiellen Zuordnung der a-Kohlenstoffresonanzen von Domaille

[161], mit Hilfe von Standard 2D-Spektren verifiziert und erweitert

wurde. Das Spektrum (Abb. 5.13) zur Messung der Kreuzrelaxation

im rotierenden Koordinatensystem wurde mit der in Abbildung 5.10

gezeigten Pulssequenz aufgenommen. Die Mischzeit betrug für die¬

ses Molekül xm = 25 ms und die Wartezeit A, wurde auf 1.666 msm 1

eingestellt, um einen optimalen Transfer für CH2-Gruppen zu erhal¬

ten. Die Feldstärke des Spinlockfeldes betrug ysB1/2n = 4000 Hz.

512 tj-Zeiten mit jeweils 512 Scans und 4096 komplexen Datenpunk¬ten wurden aufaddiert. Die Unterscheidung der positiven und nega¬

tiven Frequenzen in der ti-Domäne erfolgte mit Hilfe der TPPI-

Methode [113]. Nach einem „zerofilling" auf 2048 mal 2048 kom¬

plexe Datenpunkte wurde das Spektrum Fouriertransformiert.


i l ' i ' i ' i i i ' i ' i ' i

65 64 63 62 8C [ppm]

| I ' | i I i | ' I i | i I ' | ' I

30 29 28 27 8c[ppm]

Asp^ß

ATsP's f « iLys33*^

r 5H![ppm]

2.6

2.8

-3.0

3.2

1 I > | i l ' | ' l ' | ' I ' | ' i

43 42 41 40 8c[ppm]

Abbildung 5.13: Die relevanten Ausschnitte aus dem 2D-SII-S Kreuzrelaxati¬

onsspektrum von vollständig 13C-markiertem Ubiquitin gemessen mit der Puls¬

sequenz aus Abbildung 5.10. Negative Konturen sind gestrichelt gezeichnet. Die

Meßzeit betrug ca. 24 Stunden, die Mischzeit 25 ms.

160 Kapitel 5.6

Die meisten der 13CH2-Kreuzpeaks im Ubiquitin SII-S-Kreuzrelaxati-

onsspektrum zeigen ein positives Vorzeichen mit Ausnahme von

37Pro-Y, 57Ser-ß und den y-, 5- und e-CH2-Gruppen von Lysin. Der

negative Kreuzpeak von Prolin 37 ist ein Hinweis auf ein schnelles

„Ringpuckering" mit großer Amplitude des Fünfringes, wie es

bereits beim Antamanid kurz beschrieben wurde. Die beiden ande¬

ren Proline in Ubiquitin, Pro und 38Pro, zeigen keine Kreuzpeaksim SÜS-Kreuzrelaxationsspektrum.

Die CßH2-Gruppe von 57Ser zeigt als einzige ß-CH2-Gruppe in Ubi¬

quitin einem negativen Kreuzpeak. Daher kann für die Bewegungder Serinseitenkette eine freie Rotation angenommen werden. Für

die Korrelationszeit der internen Bewegung erhält man als untere

Grenze

x, < 0.335 • xc» 1.37 ns . (5.34)

Die beiden anderen Serine zeigen beide intensive positive Kreuz¬

peaks. Daraus kann man schließen, daß die Bewegung um den Win¬

kel Xj entweder langsam und in der Amplitude unbeschränkt mit

einer Korrelationszeit x größer als 1.37 ns ist oder daß die Bewegungin ihrer Amplitude beschränkt mit einem Winkelbereich kleiner als

±60° ist. Diese beiden Fälle können mit der SIIS-Kreuzrelaxation

nicht unterschieden werden.

Die negativen Kreuzpeaks der Lysine in Ubiquitin zeigen, daß die

Lysinseitenketten sich rasch und mit einer großen Amplitude bewe¬

gen. Aufgrund der Überlagerung verschiedener Bewegungsfreiheits¬

grade kann man keine Aussagen über die effektiven Rotationsachsen

der einzelnen CH-Bindungsvektoren machen. Es ist anzunehmen,

daß die NH3-Gruppen sich frei in der Lösung bewegen und die

Bewegungen um die x2/ X3 und x4 Winkel relativ schnell sind, wäh¬

rend die Bewegung um den x1 Winkel entweder langsam oder stark

beschränkt ist.



In diesem Kapitel wurde gezeigt, daß die SIIS-Kreuzrelaxation

zusätzliche Informationen über die Art einer internen Bewegung lie¬

fern kann. Für den Fall einer schnellen internen Bewegung kann man

aufgrund des Vorzeichens der Kreuzrelaxationsratenkonstante

T4s/ ; s zwischen unbeschränkten und im Winkelbereich

^z'uhz' äZ

beschränkten Bewegungsmodellen unterscheiden. Diese Aussage ist

bereits aufgrund der qualitativen Analyse der Vorzeichen in einem

1D- oder 2D-Spektrum möglich und benötigt keine komplizierte

quantitative Analyse.

Eine quantitative Auswertung der SIIS-Kreuzrelaxation ist prinzipi¬ell möglich, wird aber durch die Einflüsse der benachbarten Proto¬

nen auf die Relaxationszeiten der betrachteten Protonen und des

Dreispinterms erschwert. Dies hat zur Folge, daß das Modell eines

isolierten Dreispinsystems oft nicht angemessen ist und durch das

Modell eines erweiterten Systems oder durch ein offenes System (mit

„random field" Beiträgen) ersetzt werden muß.

Aufgrund der geringen Empfindlichkeit des SüS-Experimentes muß

man für dieses Experiment 13C-markierte Substanzen verwenden.

Dies ist heute keine starke Einschränkung der Verwendbarkeit einer

Methode, da auch für die Zuordnung und Strukturbestimmung von

Proteinen routinemäßig gleichförmig markierte Verbindungen Ver¬

wendung finden. Wie am Beispiel des Ubiquitin gezeigt wurde, sind

vollständig markierte Substanzen für diese Methode ausreichend.

Selektiv (z.B. ß-) 13C-markierte Verbindungen hätten den Vorteil

eines besseren Signal zu Rausch Verhältnis, da bei diesen Verbindun¬

gen die Verbreiterung der Multipletts durch die zahlreichen 13C-13C-

Kopplungen entfällt.

Die Verwendung dieser neuen Relaxationsmethode sollte immer im

Zusammenhang mit anderen Methoden gesehen werden, die eben¬

falls Informationen über die Seitenkettenbewegung von Proteinen

und Peptiden liefern können. Als erstes ist hier die Analyse von

162 Kapitel 5.7

dihedralen J-Kopplungen zu erwähnen, die über die Karplusbezie¬

hungen [15-17] Informationen über die Populationen der Konforma¬

tionen liefern können. Die Kreuzrelaxation zwischen dem Ca-Proton

und den beiden Cß-Protonen in der Seitenkette der Aminosäuren

sind ebenfalls ein Maß für den mittleren Abstand und können

zusätzliche Informationen über die Bewegungumden Winkel X-, lie¬

fern. Eine weitere wichtige Quelle der Information über Seitenket¬

tenbewegungen sind die Relaxationsratenkonstanten der Kohlen¬

stoffatome in der Seitenkette, wie sie in Kapitel 4 für die Analyse der

Bewegung von Phenylalaninseitenketten in Antamanid benutzt

wurden. Das T-ROESY-Experiment [96] liefert ebenfalls Informatio¬

nen über die bevorzugten Konformationen des X\-Winkels. Auf¬

grund der Komplexität des Problems der Beschreibung von internen

Bewegungen ist es wichtig, Informationen aus möglichst vielen

unabhängigen Experimenten zu einem kohärenten theoretischen

Modell zu vereinen.

Zusammenfassung und Ausblick 163

6 Zusammenfassung und Ausblick

In dieser Arbeit wurden zwei unterschiedliche Arten von interner

Bewegung in Peptiden und Proteinen untersucht. Die Bewegung des

Peptidgerüstes in Antamanid wurde mit Hilfe des MEDUSA-Ansat¬

zes bestimmt. Hierbei interpretiert man die gemessenen gemittelten

Strukturparameter mit Hilfe eines dynamischen Gleichgewichts zwi¬

schen zwei unterschiedlichen Konformationen. Um den Konformati¬

onsraum möglichst gut abzudecken, werden die einzelnen Struktu¬

ren so berechnet, daß nur ein Teil der experimentellen „constraints"

durch die einzelnen Strukturen erfüllt sein muß und erst die Konfor¬

mationspaare alle „constraints" erfüllen. Beim Vergleich von Anta¬

manid in Dioxan mit der bekannten Struktur in Chloroform zeigtsich, daß auch in Dioxan ein dynamisches Gleichgewicht zwischen

zwei Konformationen vorliegt. Allerdings ist der Zeitbereich des

Austausches schneller, da in den Tlp-Messungen keine starke

Abhängigkeit von der rf-Feldstärke festgestellt werden konnte.

Die Bewegung von Seitenketten in Peptiden und Protonen ist die

zweite Art der internen Bewegung, die in der vorliegenden Arbeit

untersucht wurde. An einem Modellsystem (Phenylalaninseitenket¬ten in Antamanid) wurde die Realisierbarkeit einer Charakterisie¬

rung der Seitenkettenbewegung mittels Relaxationsmethoden gete¬stet. Hierbei zeigte sich, daß die Genauigkeit der gemessenen Daten

bei zwei der vier Phenylalaninreste eine Unterscheidung der geteste¬ten physikalischen Modelle erlaubte, während bei den anderen bei¬

den keine eindeutigen Aussagen über die Art der Bewegung mög¬lich waren. Eine Erweiterung einer solchen Untersuchung ist mög¬lich, indem man weitere Relaxationsratenkonstanten mißt und so

einen größeren Satz experimenteller Daten zur Verfügung hat. Ein

kritischer und wichtiger Punkt hierbei ist die korrekte Gewichtungder einzelnen Messungen in Abhängigkeit ihrer Genauigkeit. Eine

genaue Fehlerbestimmung ist für diese Art von Untersuchungen

164 Kapitel 6

unerläßlich, da eine falsche Gewichtung der Daten das Ergebnis ver¬

fälschen kann.

Eine weitere Möglichkeit, zusätzliche Informationen über die Art der

internen Bewegung zu erhalten, ist die Benutzung spezieller Experi¬

mente, die eine Unterscheidung verschiedener Modellklassen erlau¬

ben. Im Falle der SIIS-Kreuzrelaxation ist dies die Unterscheidung

einer beschränkten und einer unbeschränkten Bewegung um die

erste Bindung der Seitenkette in Aminosäuren. Aufgrund der großenZahl von Parametern, die man zur Beschreibung der vollen Dynamikin größeren Molekülen benötigt, wird man immer auf Informationen

aus unterschiedlichen Quellen angewiesen sein. Nur so ist es mög¬

lich die Dynamik eines Moleküls im Rahmen unterschiedlicher

Modelle zu charakterisieren.

Anhang 165

7 Anhang

7.1 Meßwerte in Dioxan

ROE-Ratenkonstanten und Protonenabstände

Kreuzpeak R12 [s"1] r12 [Ä] Kreuzpeak R12 [s"1] r12 [Ä]

lHct-lHv 0.843 2.227 8Hß'-8Hß 2.889 1.813

lHa-2H5 0.736 2.278 8Hß'-8H7 0.426 2.495

lHa-2H8' 0.791 2.250 8Hß'-8HY 0.357 2.570

lHy-lHa 0.929 2.191 8Hv-8Hß' 0.469 2.455

IHy-INH 0.273 2.687 8H7-8HY 3.387 1.766

1HY-2H8' 0.105 3.151 3Hß'-3Hß 1.735 1.974

1HY-3H88' 0.189 2.857 3Hß'-3HY 0.258 2.712

lHY-9Ha 0.049 3.578 3Hv-3Hß' 0.553 2.389

INH-lHß 0.182 2.875 3HY-3Hß' 0.460 2.463

INH-IH7 0.286 2.666 3HS8'-1HY 0.198 2.835

lNH-4Hß 0.036 3.766 3H88'-4NH 0.120 3.082

1NH-4NH 0.022 4.088 4Ha-4Hß 0.628 2.339

lNH-5Ha 0.116 3.099 4Ha-4NH 0.100 3.117

INH-lOHa 0.935 2.189 4Ha-5NH 0.634 2.335

2Ha-2H7 0.155 2.953 4Hß-lNH 0.069 3.379

2Ha-2HY 0.704 2.295 4Hß-4Ha 0.713 2.290

2Ha-3Ha 1.375 2.052 4Hß-4NH 0.395 2.527

2Ha-4NH 0.340 2.591 4Hß-9Ha 0.021 4.120

2Ha-5Hß 0.062 3.440 4NH-2Ha 0.383 2.540

2Ha-5NH 0.049 3.578 4NH-3Ha 0.089 3.239

2Hy-2Hci 0.125 3.061 4NH-3H88' 0.168 2.913

2HY-2Ha 0.531 2.405 4NH-4Ha 0.138 3.011

2H8-lHa 0.811 2.241 4NH-4Hß 0.452 2.470

2H8'-lHa 0.969 2.176 4NH-5NH 0.099 3.182

2H8'-1H7 0.139 3.007 5Ha-lNH 0.111 3.122

3Ha-2Ha 1.295 2.073 5Ha-6NH 0.748 2.272

Tabelle 7.1:NOE-Kreuzrelaxationsratenkonstanten und berechnete Abstände

für die aufgelösten und integrierbaren Protonenpaare von Antamanid in

Dioxan.

166 Kapitel 7.1

Kreuzpeak R12 [s1] r12 [Ä] Kreuzpeak R12 Is'1] r12 [A]

3Ha-3Hß 0.764 2.264 5Hß-2Ha 0.065 3.413

3Ha-4NH 0.085 3.264 5NH-2Ha 0.069 3.379

3Hß-3Ha 0.653 2.324 5NH-3Ha 0.009 4.745

3Hß-3Hß' 2.035 1.923 5NH-4aH 0.662 2.318

5Ho-7Ha 0.058 3.479 5NH-4NH 0.090 3.233

6Ha-7H8 0.686 2.304 5NH-5Hß 0.204 2.821

6Ha-7H8' 0.529 2.407 5Ho-2Ha 0.031 3.861

6Hß-6NH 0.150 2.969 5Ho-3Ha 0.056 3.499

6Hß'-6NH 0.124 3.065 5Ho-5Ha 0.306 2.636

6NH-5Ha 0.830 2.232 8H7-8H8 0.423 2.498

6NH-6Hß 0.152 2.962 8HY-8Hß' 0.484 2.442

6NH-6Hß' 0.113 3.113 8HY-8H7 3.234 1.780

6NH-7Ha 0.012 4.523 8H8-8H7 0.526 2.409

6NH-10Ha 0.115 3.103 8H8-9NH 0.053 3.531

6H0-6NH 0.051 3.554 8H8'-9NH 0.062 3.440

7Ha-6NH 0.010 4.663 9Ha-4Hß 0.052 3.542

7Ha-8Ha 1.456 2.033 9Ha-10NH 0.544 2.395

7Ha-9NH 0.353 2.574 9NH-7Ha 0.399 2.522

7Ha-10NH 0.067 3.396 9NH-8Ha 0.112 3.117

7H8-6Ha 0.745 2.273 9NH-8H8 0.055 3.509

7H8-7H7 0.294 2.654 9Ho-4Hß 0.100 3.177

7H8'-6Ha 0.600 2.357 9H0-8H7 0.038 3.733

8Ha-7Ha 1.405 2.045 9Ho-9NH 0.095 3.204

8Ha-7Hß' 0.212 2.803 9Hm-8H7 0.029 3.904

8Ha-7H7od.3H7 0.169 2.911 lOHa-lNH 0.866 2.217

8Ha-8Hß 0.677 2.310 10Ha-6NH 0.089 3.239

8Ha-8Hß' 0.404 2.517 lOHa-lONH 0.380 2.543

8Ha-9NH 0.100 3.177 10NH-6NH 0.214 2.798

8Hß-8Ha 0.701 2.296 10NH-7Ha 0.051 3.554

8Hß-8Hß' 3.454 1.760 10NH-9Ha 0.606 2.353

8Hß'-8Ha 0.352 2.576 lONH-lOa 0.436 2.485

Tabelle 7.1: (Fortsetzung) NOE-Kreuzrelaxationsratenkonstanten und berech¬

nete Abstände für die aufgelösten und integrierbaren Protonenpaare von Anta¬

manid in Dioxan.

Meßwerte in Dioxan

NH-Tlp-Relaxationsratenkonstanten

Tip.sl2n

[kHz]

1.20

2.16

2.84

2.84

2.94

4.03

5.43

6.76

8.47

9.43

10.33

1NH

0.171

0.168

0.186

0.197

0.165

0.165

0.156

0.159

0.168

0.161

0.163

4NH

0.136

0.130

0.132

0.132

0.151

0.128

0.127

0.129

0.133

0.135

0.139

5NH

0.175

0.173

0.241

0.256

0.164

0.169

0.154

0.156

0.167

0.161

0.161

6NH

0.122

0.114

0.105

0.107

0.129

0.111

0.116

0.119

0.121

0.127

0.130

9NH

0.115

0.110

0.120

0.111

0.122

0.108

0.109

0.110

0.112

0.115

0.117

10 NH

0.135

0.123

0.098

0.109

0.135

0.117

0.118

0.118

0.119

0.124

0.125

Tabelle 7.2: Tjp-Relaxationszeiten der Amidprotonen von Antamanid in Dioxan

bei 400 MHz Protonenresonanzfrequenz. Diese wurden bei 11 verschiedenen

Feldstärken 7ßj/2jt von 1.2 bis 10.33 kHz für alle sechs NH-Protonen gemessen.

168 Kapitel 7.1

Kohlenstoff Tj-Relaxationszeiten

8

[ppm]

13c

Zuord¬

nung

Tjls]600 MHz

T-(C) 8

[ppm]

13C

Zuord¬

nung

Tits]600 MHz

r.(C)

TJD) Tt(D)

18.7 Ala4-ß 0.379 + 0.018 1.375 53.6 Phe6 -a 0.291 ±0.013 1.488

19.5 Val1^ 0.451 ±0.016 1.517 56.1 Phe5-a 0.287 ± 0.017 1.551

20.3 Val1^ 0.427 ±0.010 1.335 57.4 Phe10-a 0.308 ± 0.015 1.506

22.9 Pro8-7 0.193 ± 0.008 1.487 57.5 Phe9-a 0.274 ± 0.010 1.507

23.6 Pro3-7 0.233 ± 0.012 1.408 57.8 Valâ 0.311 ± 0.009 1.511

26.4 Pro7-7 0.340 ±0.010 1.668 60.3 Pro7-a 0.294 ± 0.005 1.524

26.4 Pro2-7 0.341 ±0.010 1.513 60.4 Pro2-a 0.311 ±0.006 1.473

29.7 Pro7-ß 0.264 ± 0.006 1.496 62.5 Pro8-a 0.299 ±0.007 1.542

29.8 Pro2-ß 0.271 ± 0.017 1.450 62.6 Pro3-a 0.309 ±0.009 1.495

32.5 VaP-ß 0.345 ± 0.013 1.400 127.2 Phe10-^ 0.229 ±0.003 1.568

32.6 Pro8-ß 0.201 ±0.008 1.373 127.7 Phe5-C 0.243 ±0.012 1.724

33.0 Pro3-ß 0.205 ± 0.011 1.420 127.9 Phe6-C 0.253 ± 0.007 1.866

37.9 Phe10-ß 0.206 ± 0.011 1.330 128.0 Phe9-C 0.222 ± 0.006 1.743

38.2 Phe6-ß 0.203 ± 0.009 1.498 129.3 Phe10-e 0.305 ± 0.003 1.443

38.6 Phe5-ß 0.189 ±0.008 1.603 129.5 Phe6-e 0.358 ±0.002 1.732

39.6 Phe9-ß 0.202 ± 0.011 1.411 129.6 Phe5-e 0.320 ± 0.002 1.547

47.7 Pro8-8 0.185 ± 0.006 1.395 129.8 Phe9-e 0.291 ± 0.002 1.763

47.8 Pro3-8 0.206 ±0.009 1.379 130.8 Phe9-8 0.293 ± 0.003 1.768

48.5 Pro7-8 0.224 ±0.011 1.478 131.0 Phe5-8 0.335 ±0.003 1.501

48.8 Pro2-8 0.224 ±0.008 1.482 131.1 Phe10-8 0.324 + 0.014 1.401

50.6 Ala4-a 0.313 ±0.012 1.511 131.5 Phe6-8 0.375 ±0.004 1.701

Tabelle 7.3:13C-T1-Relaxationszeiten von Antamanid in Dioxan bei T = 300 K

und einer Protoneneresonanzfrequenz von 600 MHz. Die vierte Spalte ist jeweilsdas Verhältnis der Relaxationszeiten bei 600 MHz Protonenresonanzfrequenz in

Chloroform und in Dioxan. Die Fehler geben das Vertrauensintervall einer Stan¬

dardabweichung an.

Implementierung der MEDUSA-Prozedur 169

7.2 Implementierung der MEDUSA-Prozedur

Die MEDUSA-Prozedur besteht aus mehreren Teilen. Zentraler Teil

ist ein C-Programm (medusa_search.c), das die verschiedenen

CHARMM-Makros (streaml.inp, stream2.inp und stream3.inp) auf¬

ruft und die Selektion der NOE's und Anti-NOE's durchführt. Das

Resultat einer solchen Suche ist ein Satz von Atomkoordinaten in der

Datei final_xxxxx.crd und ein Satz von dihedralen Winkeln und

NOE-Abständen in der Datei final_xxxxx.out. In einer Datei mit dem

Namen logfile.out werden alle wichtigen Schritte protokolliert. Als

Eingabe dienen zwei Dateien mit den NOE's (constraints_noe.inp)und den Anti-NOE's (constraints_anti.inp). Sämtliche Namen der

verschiedenen Dateien können am Anfang des Programms einfach

geändert werden.

Die relevanten Daten werden aus den Dateien final_xxxxx.out mit

Hilfe eines Bourne Shellscripts (make_lists) und verschiedenen Pro¬

zeduren (awknoe.inp, awkphLinp, awkpsiinp und awktheta.inp) für

das Programm awk (ein „Patternrecognition" Programm unter Unix)

extrahiert und in eine für die Weiterverarbeitung mit MATLAB

geeignete Form gebracht. Hierdurch verringert sich die Datenmengebeträchtlich.

C-Programm: medusa_search.c

This program implements the search part of the MEDUSA approach as described in

R BrUschweiler, M Blackledge and R R Ernst, j Bio NMR 1, 3 (1991)

(c) 1993 by Matthias Ernst, Laboratorium fuer Physikalische Chemie, ETH-Zuerich,

ETH-Zentrum, CH-8092 Zuerich, Switzerland

Compile the program with the command

ycc -o medusa_search medusa_search c -D(sun,sgi,aix,convex} -Im'

to get an executable for the chosen architecture You probably have to adjust

at least the pathnames of the CHARMM22 command at the beginning of the program

There is a c-program called medusa_search c and three macros for CHARMM22 which

are very closely connected If you make changes in one of these programs, you

have to change the other ones, too

The general outline of the MEDUSA procedures is the following

1 Check how many NOE's are in the file NAME_NOE

2 check how many antinoe's are in the file name_anti

170 Kapitel 7.2

3 The startmg structure is in the file "antainit crd" in CHARMM22 mput format

This name can be changed in the macro NAME„MACR01

4 Generate a random permutation of the NOE's

5 Select a random energy threshhold between the values ENERGY_MIN and ENERGY_MAX

(I don't understand how one should choose these two values This is never

described and not obvious how to do )

6 Start CHARMM22 with the first NOE constraint (macro NAME_MACR01) and do an

energy minimization for the startmg structure

7 Add one distance constraint (=noe) at a time and run CHARMM22 each time

(macro NAME_MACR02) to do an energy minimization If the final energy is

higher than the chosen threshhold, discard this constraint and take the

next one from the list If the constraint is not discarded, use the new

final structure for the next run, otherwise keep the old one

8 Repeat step 7 tili the last distance constraint (-NOE) is used

9 Run a final CHARMM22 (macro NAME_MACR03) energy minimization with all accepteddistance constraints (NOE's) and all ANTINOE's The final coordinate set

"final_%05d crd" is stored and the Output of the CHARMM run "final_%05d out" is

also stored It contams the dihedral angles as defined in NAME_MACR03 and

all the values for the NOE s and ANTINOE s The numbering of the coordinate sets

Starts with NUMBER_START

10 Start over at point 4 tili NUMBER_RUNS structures are generated

/* some mclude files */

»include <stdio h>

#include <strings h>

»include <math h>

#ifndef convex

#include <malloc h>

tendif

»include <sys/time h>

/*

This is the defimtion of the CHARMM22 command it should contain the füll path

name in order to make execution independent of the path settings

#ifdef convex

#define CHARMM

#endif

»lfdef sgi

»define CHARMM

tendif

#ifdef aix

»define CHARMM

»endif

#lfdef sun

»define CHARMM

»endif

"/scr/chem/maer/charmm/exec/convex/charmm22"

"/nmrnet/var/charmm/exec/sgi/charmm22"

"/nmrnet/var/charmm/exec/ibmrs/charmm22"

/nmrnet/var/charmm/exec/sun/charmm22"

These are some global definitions, which can be changed to tailor the use of the

program They define some variable numbers as well as the names for files used

in the program if you change any of the filenames, make sure that you change

them in the CHARMM macros, too Otherwise the program will no longer run

*********************#**********+****************+**#•*****•***#******#*+*+******

1 /* Number to start the numbering

/* of the final structures

300 /*

350 /*

380 /*

"constraints_noe inp" /*

"constraints_anti inp" /*

constraints mp" /*

"constraints_all inp" /*

»define NUMBER_START

»define NUMBER_RUNS

»define ENER_MIN

»define ENER_MAX

»define name_N0E

»define NAME_ANTI

»define NAME_CONS

»define name_C0nsa

Number of runs

lower bound of the energy

threshhold and upper bound

name of the NOE file

name of the ANTINOE file

name of the selected NOE file

name of the file with all NOE

V

V

*/

*/

*/

*/

*/

*/

*/

V


»define NAME_LOG "logfile out" /*

»define NAME_MACR01 "streaml inp" /*

»define NAME_MACR02 "stream2 inp" /*

#define NAME_MACR03 "stream3 inp' Z1

»define NAME_ENERGY "energy min" /'

»define NAME_CRD1 "antaold crd" /'

»define NAME_CRD2 "antanew crd" /•

name of the logfile

name of the 1 CHARMM macro



name of the energy file

name of the first and second

temporary coordinate file

static long statel[32]

*****************************************************************

The following is needed for the random number generator random()

see random(3) in the unix man pages

****************************************************************************

[ 3, 0x9a319039, 0x32d9c024, 0x9b663182,

0x5dalf342, 0x7449e56b, OxbebldbbO, 0xab5c5918,

0x946554fd, 0x8c2e680f, 0xeb3d799f, 0xbllee0b7,

0x2d436b86, 0xda672e2a, 0xl588ca88, 0xe369735d,

0x904f35f7, 0xd7158fd6, 0x6fa6f051, 0x616e6b96,

0xac94efdc, 0xde3b81e0, 0xdf0a6fb5, 0xfl03bc02,

0x48f340fb, 0x36413f93, 0xc622c298, 0xf5a42ab8,

0x8a88d77b, 0xf5ad9d0e, 0x8999220b, 0x27fb47b9],

For more Information

»define MAX_RAND 2147483647L /* this is 2"31-1 the highest number returned */

/***********+****+***************************************************************+*•****

Some global variables which are needed in more than one subroutine They make life

easier and avoid too many parameters in the subroutines

***************************************************************************************/

FILE *fp_anti, *fp_noe, *fp_log, /* global filepointers for NAME_NOE */

/* NAME_ANTI and NAME_LOG */

int n_noe, n_anti, /* number of NOE's and ANTI_NOE's */

int *perm, /* variable size array for the permutations */

/* of the distance constraints */

MAIN PROGRAM Starts here

n(>

{ FILE *fopen(),

FILE *fp_tempint i,],k,

char *c,

char line[1024],

double energylim,

double *energy_old, *energy_new,

struct timeval tp,

struct timezone tzp.

/* temporary file pointer

/* ûst some counters

/* line to störe system commands

/* variable size arrays to störe energy values

/* needed for initialization of random number

/* generator with current time

extern void generate_permutation(),

extern void generate_noe_table(),

extern char *setstate(),

extern char *initstate{),

extern double select_limit{),

/* some function definitions to make lint happy */

(void)gettimeofday(&tp,&tzp),

(void)initstate((unsigned)tp tv_sec, (char *)statel,

/* initialize random

128),/* number generator

initialize the file pointers for the three global files Abort if there is an error

condition during opening with a short message on stderr

fp_log-fopen{NAME_LOG,

if(fp_log — 0)

'w").

172 Kapitel 7.2

( (void)fprintf(stderr,"cannot open file %s \n",NAME_LOG),

(void)fpnntf (stderr,"aborting \n"),

exit(-l),

1

fp_anti=fopen(NAME_ANTI,"r"),

if(fp_anti == 0)

[ (void)fprintf(stderr,"cannot open file %s \n",NAME_ANTI),

(void)fpnntf(stderr,"aborting \n"),

exit(-l),

J

fp_noe=*fopen(NAME_NOE, "r"),

if(fp_noe == 0)

{ (void)fprintf(stderr,"cannot open file %s \n",NAME_NOE),

(void)fprintf(stderr,"aborting \n"),

exit(-l),

}

Check how many NOE's and ANTINOE's are available, and allocate memory for the variable

size arrays perm, energy_new and energy_old Create a file NAME_CONSA, which contains

all the NOE's and all the ANTINOE's for the calculation of distance constraint devi-

ations in CHARMM

*/

(void)fseek(fp_anti,OL,0),

(void)fseek(fp_noe, OL,0),

n_anti=0,

n_noe=0,

do

{ c=fgets(line,1024,fp_anti),

++n_anti,

} while(c = NULL),

do

[ c=fgets(line,1024,fp_noe),

++n_noe,

) while(c = NULL),

--n_noe, /*

--n_anti, /*

(void)fseek(fp_anti,0L,0), /*

(void)fseek(fp_noe, 0L,0), /'

fp_temp=fopen(NAME_CONSA,"w"), /<

if(fp_temp ==0) />

( (void)fprintf(stderr,"cannot open file %s \n",NAME_CONSA),


exit(-l),

)

(void)fputs("NOE\n' These are the NOE's \n",fp_temp),

for(i=0,i<n_noe,++i)

{ {void)fgets(line,1024,fp_noe),

(void)fputs(line,fp_temp),

)

(void)fputs("' and these are now the ANTINOE's\n",fp_temp),

for(i=0, i<n__anti,++i)

[ (void)fgets(line,1024,fp_anti),

(void)fputs(line,fp_temp),

)

(void)fputs("END\n",fp_temp),

(void)fseek(fp_anti,OL,0), /*

(void)fseek(fp_noe, 0L,0), /*

(void)fclose(fp_temp),

perm - (int *)malloc( (unsigned) (sizeof (mt)*n_noe)),

energy_new - (double *)malloc((unsigned)(sizeof(double)*(n_noe+l))),

energy_old - (double *)malloc((unsigned)(sizeof(double)*(n_noe+l))),

n_noe is 1 too large

n_anti is 1 too large

rewind file to Start


open file for list

of all NOE's

rewind file to start


This is the main loop, which controls the number of structures generated The numbering

of the structures Starts with NUMBER_START and NUMBER_RUNS will be executed


******+********************************************************************************/

for(]=NUMBER_START,]<-NUMBER_START+NUMBER_RUNS,++T)

l generate_permutation(),

energylim=select_limit(ENER_MIN,ENER_MAX),

(void)fprmtf (stdout, "Run Number %3d - Energylimit %6 21f\n\n" ,3,energylim),

(void)fprintf(stdout,"Permutationtable for this run\n"),

for(i=0,i<n_noe,++i)

(void)fpnntf (stdout, "%2d perm = %3d\n", i+l,perm[i]),

/*********************+*****************************************************************

This is the second loop going through the permuted NOE list and adding one distance

constraint at a time to the CHARMM input If the final energy is higher than the

current limit, this NOE will be discarded for the rest of this Iteration by settmg

the corresponding number in the perm vector negative****************************•*****#****************************************************/

for(k-0,k<n_noe,++k)

( generate_noe_table(k),

if(k==0)

(void)sprintf(line,"%s < %s > /dev/null \n",CHARMM,NAME_MACR01),

eise

(void)sprintf(line,"%s < %s > /dev/null \n",CHARMM,NAME_MACR02),

(void)system(line),

fp_temp=fopen(NAME_ENERGY,"r"),

if(fp_temp == 0)

{ (void)fprintf(stderr,"cannot open file %s \n*,NAME_ENERGY),

(void) fprmtf (stderr, "aborting \n"),

exit(-l),

)

(void)fscanf(fp_temp,"%lf",&energy_old[k]),

(void)fscanf(fp_temp,"%lf",&energy_new[k]),

(void)fclose(fp_temp),

(void)fprintf(stdout,"Energy %6 21f (old) %6 21f (new)\n",

energy_old[k],energy_new[k]),

if((k — 0) | (energy_new[k] < energylim))

{ (void)sprintf(line,"/bin/cp %s %s\n",NAME_CRD2,NAME_CRD1),

(void) System (1 me) ,

J

eise

( perm[k]=-perm[k]

]

}

/***********************************************************************+***************

Now all NOE's are covered and we will do a final round by including all the ANTINOE's

Run CHARMM with the macro NAME_MACR03 and set the list of distance constraints to all

ANTINOE and all (not rejected) NOE Copy the final structure as well as the Output of

the final CHARMM run to final_%05d {crd,out} and update the file NAME_LOG with the

results of the last run

*************************************************************************************** /

generate_noe_table(n_noe+l),

(void)sprintf (lme,"%s < fts > final out \n", CHARMM, NAME_MACR03),

(void)system(line),

fp_temp=fopen(NAME_ENERGY,"r"),

if(fp_temp == 0)

[ (void)fprintf(stderr,"cannot open file %s \n",NAME_ENERGY),


exit(-l),

}

(void)fscanf(fp_temp,"%lf",&energy_old[n_noe]),

(void)fscanf(fp_temp,"%lf",&energy_new[n_noe]),

(voidjfcloseffp^temp),

(void)fprintf(stdout,"Energy %6 21f (old) %6 21f <new)\n",

energy_old[n_noe],energy_new[n_noe]),

(void)sprintf(line,"/bin/mv %s final_%05d crd\n",NAME_CRD2,j),

(void)system(line),

(void)sprintf(line,"/bin/mv final out final_%05d out\n",]),

174 Kapitel 7.2

(void)System(line),

(void)fprintf(fp_log,"Run %3d, CRD-file final_%05d crd, OUT-file final_%05d out\n",

(void)fprintf(fp_log,"Energylimit %6 21f\n",energylim),

for(i*=0, i<n_noe,++i)

(void)fprintf(fp_log,"%2d perm - %3d, Eold = %6 21f, Enew - %6 21f\n",

i+l,perm[1],energy_old[i],energy_new[i]),

(void)fprintf (fp_log, "Final Values Eold - %6 21f, Enew = %6 21f\n",

energy_old[n_noe],energy_new[n_noe])

(void)fflush(fp_log),

}

(void)fclose{fp_noe),

(void)fclose(fp_anti),

(void)fclose(fp_log>,

return(O),

}

/*****************#**********************#*****#****************************************

This subroutine generates a permuted list of NOE's The array perm contains the numbers

1 to n_noe in a (hopefully) random sequence Note that the indices run from 0 to

n_noe-l, which might lead to confusion1 Since perm is a global array, no value is

returned random(3) is documented in the unix man pages It is supposed to be the best

random number generator, which returns values between 0 and 2"31-1

*******************************************#*******************************************/

void generate_permutation()

{ int i,j,number, no,

extern long random(),

for(1=0,i<n_noe,++1)

{ do

{ number - (int)((double)(random())/((double)(MAX_RAND)+1 0)*n_noe+l),

no-0,

for(]=0,j<i,++])

{ if(number « permtll)no=l

}

} while(no—1),

perm[1]-number,

}

]

/***************************************************************************************

select a random energy limit between emin and emax

************************************************************************************** */

double select_limit(emin,emax)

mt emin, emax,

[ extern long random(),

return((double)(random())/((double)(Mäx_rand)+1 0)*(emax-emin)+emin),

}

/***************************************************************************************

This subroutine generates the permuted list of NOE's and writes them out into the

file NAME_CONS The Implementation is not very efficient, because for each NOE 1 the

first permfi] lines of the file are read in to generate the correct ordering of the

NOE's in the output file It would be much more efficient to read all the NOE's and

störe them in an array Then one could use perm as an index into the NOE table This

would imply to make perm run from 0 to n_noe-l and not from 1 to n_noe


number" is the number of NOE's which should be used If "number" is larger or equal

n_noe all the ANTINOE's are written out first and then all the NOE if perm is

negative this indicates, that this NOE has been reiected in one of the selection Steps

and should not be used It will be skipped in the generation of the constraints file

***************************************************************************************/

void generate_noe_table(number)

int number,

{ FILE *fopen(),

FILE *fp_out,

int l,],

char line[1024],

/***************************************************************************************

file handling rewind mput files and open Output file

***************************************************************************************/

(void)fseek(fp_noe ,0L,0), /* rewind file to start */

(void)fseek(fp_anti,OL,0), /* rewind file to start */

fp_out=fopen(NAME_C0NS,"w"), /* open output file */

if(fp_out == 0)

{ (void)fpnntf (stderr, "cannot open file %s \n",NAME_CONS),


exit(-l),

}

/******************+*+**+***************************************************************

Write the first line <"NOE\n") to start the NOE facility m CHARMM

If number >= n_noe copy all the ANTINOE's first and then all the NOE's which have not

been reiected by a previous run, otherwise lust copy the first number NOE's (depending

on the ordering vector perm) if they have not been reiected by a previous run This

is reflected by a negative sign of perm

***************************************************************************************/

(void)fputs("NOE\n",fp_out),

if(number >= n_noe) /* check if ANTINOE's are needed */

{ for(i-0,i<n_anti,++i) /* loop through all ANTINOE's */

( (void)fgets(line,1024,fp_anti),

(void) fputs (1 me, fp_out) ,

}

number=n_noe-l /* set number to all NOE's */

)

for(i-0,i<=number,++i) /* loop through the first number NOE */

{ if(perm[i] > 0) /* check if constraint is marked as */

{ for(i-l,]<-perm[i],++]) /* rejected, otherwise copy it */

(void)fgets(line, 1024,fp_noe),

(void)fputs(1ine,fp_out),

}

(void)fseek(fp_noe,OL,0), /* rewind file to start »/

J

(void)fseek(fp_anti,0L,0), /* rewind file to start */

(void)fputs("END\n",fp_out), /* close output file */

(void)fclose(fp_out),

176 Kapitel 7.2

Erstes CHARMM Macro: streaml.inp* First macro for the MEDUSA search

* generated by Matthias Ernst, 20 6 1993


ETH-Zentrum, CH-8092 Zuerich, Switzerland

This is the first of three macros used for the MEDUSA search It reads m a

startmg structure ANTAINIT CRD and does a 1000 step abnr energy minimization

on this structure The NOE constraints contained in the file CONSTRAINTS INP

are used The fmal structure is written out to the file ANTANEW CRD

BOMB -1

define molecular topology and parameters

' get Residue Topologies from File (RTF)

open read card unit 10 name TOP_ALL22_PROT_B3 INP

read rtf card unit 10

close unit 10

' get force field parameters from Parameter File

open read card unit 11 name PAR_ALL22_PROT_B3 INP

read param card unit 11

close unit 11

1 get Protein Structure File (PSF)

open read unit 12 file name ANTAMANIDE PSF

read psf unit 12 file

close unit 12

1 define a startmg conformation

1 get initial coordinates

open read card unit 20 name ANTAINIT CRD

read coor card unit 20

close unit 20

The calculations are starting here First the energy of the starting structure

is written to the file ENERGY MIN The NOE constraints are read in from the file

CONSTRAINTS INP and then a 1000 step abnr energy minimization is done The fmal

energy is also written out to the file ENERGY MIN and the final structure is

written to the file ANTANEW CRD

' calculate energy and write it to file

ENERGY

OPEN WRITE CARD UNIT 88 NAME ENERGY MIN

WRITE TITLE UNIT 88

* ?ENER

' read in the NOE's, set SCALE to 2

stream CONSTRAINTS INP

Implementierung der MEDUSA-Prozedur

NOE

SCALE 2 0

END

start energy minimization with the abnr algorithm

mini abnr nstep 1000 nprmt 1000

calculate energy and write it to file

ENERGY

WRITE TITLE UNIT 88

* ?ENER

1 save final structure to file

open write formatted unit 13 name ANTANEW CRD

write coord card unit 13

* ABNR mmimized structure of antamanid with various

* NOE constraints

* Energy 'ENER

stop

Zweites CHARMM Macro: stream2.inp* Second macro for the MEDUSA search



ETH-Zentrum, CH-8092 ZUerich, Switzerland

This is the second of three macros used for the MEDUSA search It reads in a

starting structure ANTAOLD CRD and does a 500 step abnr energy minimization


are used The final structure is written out to the file ANTANEW CRD

bomb -1

define molecular topology and parameters

1 get Residue Topologies from File (RTF)

open read card unit 10 name T0P_ALL22_PR0T_B3 INP


close unit 10

1 get force field parameters from Parameter File

open read card unit 11 name PAR_ALL22_PROT_B3 INP


close unit 11

• get Protein Structure File (PSF)



close unit 12

1 define a starting conformation

178 Kapitel 7.2

get initial coordinates

open read card unit 20 name ANTAOLD CRD


close unit 20

The calculations are starting here First the energy of the starting structure


CONSTRAINTS INP and then a 500 step abnr energy minimization is done The final

energy is also written out to the file ENERGY MIN and the final structure is

written to the file antanew CRD


ENERGY


WRITE TITLE UNIT 88

* ?ENER

read in the NOE's, set SCALE to 2


NOE

SCALE 2 0

END

1 start energy minimization with the abnr algorithm

mini abnr nstep 500 nprint 500


ENERGY

WRITE TITLE UNIT 8B

* 'ENER

save final structure to file

open write formatted unit 13 name ANTANEW CRD


* ABNR minimized structure of antamanid with various

* NOE constraints

* Energy 'ENER

stop

Drittes CHARMM Macro: stream3.inp* Third macro for the MEDUSA search



ETH-Zentrum, CH-8092 ZUerich, Switzerland

This is the third of three macros used for the MEDUSA search. It reads in a

starting structure ANTAOLD CRD and does a 2000 step abnr energy minimization


are used The final structure is written out to the file ANTANEW CRD and the

internal coordinates (dihedral angles) for calculation of j coupling constants

as well as violation of the NOE distance constraints are printed for further

analysis

Implementierung der MEDUSA-Prozedur

BOMB -1

1 define molecular topology and parameters

1 get Residue Topologies from File (RTF)

open read card unit 10 name TOP_ALL22_PROT_B3 INP


close unit 10

' get force field parameters from Parameter File

open read card unit 11 name PAR_ALL22_PROT_B3 inp


close unit ll

get Protein Structure File (PSF)



close unit 12

define a starting conformation

get initial coordinates

open read card unit 20 name ANTAOLD CRD


close unit 20

' The calculations are starting here First the energy of the starting structure


CONSTRAINTS INP and the internal coordinate table is generated It should contain

' all interesting dihedral angles used for the calculation of J coupling constants

1 Then a 2000 step abnr energy minimization is done The final energy is also

1 written out to the file energy min


ENERGY


WRITE TITLE UNIT 88

* ->ENER

1 delete all internal coordinates and define the dihedrals we want

' this depends on the available experimental J coupling constants

ic delete

ic edit

dihe 1N1CA1C2N0

dihe 2N2CA2C3N0

dihe 3N3CA3C4N0

dihe 4N4CA4C5N0

dihe 5N5CA5C6N0

dihe 6N6CA6C7N0

dihe 7N7CA7C8N0

dihe 8N8CA8C9N0

dihe 9N9CA9C10N0

dihe 10 N 10 CA 10 C 1 N 0

dihe 10C1N1CA1C0

180 Kapitel 7.2

dihe 1C2N2CA2C0

dihe 2C3N3CA3C0

dihe 3C4N4CA4C0

dihe 4C5N5CA5C0

dihe 5C6N6CA6C0

dihe 6C7N7CA7CO

dihe 7C8N8CA8C0

dihe 8C9N9CA9CO

dihe 9 C 10 N 10 CA 10 C 0

dihe 1 HN 1 N 1 CA 1 HA 0




dihe 9KN9N9CA9HA0

dihe 10 HN 10 N 10 CA 10 HA 0

dihe 1CA1C2N2CA0

dihe 2CA2C3N3CA0

dihe 3CA3C4N4CA0

dihe 4CA4C5N5CA0

dihe 5CA5C6N6CA0

dihe 6CA6C7N7CA0

dihe 7CA7C8N8CA0

dihe 8CA8C9N9CA0

dihe 9 CA 9 C 10 N 10 CA 0

dihe 10 CA 10 C 1 N 1 CA 0

END

calculate energy and write it to file

ENERGY


WRITE TITLE UNIT 88

* ?ENER

read in the NOE's, set SCALE to 2


NOE

SCALE 2 0

END

start energy minimization with the abnr algorithm

mini abnr nstep 2000 nprint 2000


ENERGY

WRITE TITLE UNIT 88

* 'ENER

Fill the internal coordinate tables and print them all out for further use

Check the violation of the NOE distance constraints First reset the NOE facility

and read in all NOE and ANTINOE distance constraints from the file

CONSTRAINTS_ALL INP Do a füll printout for all these distance constraints for

a later analysis

' calculate internal coordinates and print them all

ic fill

print ic

NOE

RESET

END

stream CONSTRAINTS_ALL INP

NOE


SCALE 2 0

PRINT ANALYZE CUT 0 0

END

save final structure to file

Open write formatted unit 13 name ANTANEW CRD


* ABNR minimized structure of antamanid with vanous

* NOE constraints

* Energy 'ENER

Shell und awk Skripts zur Erzeugung der MATLAB

Dateien

make lists:

# /bin/csh

# generate the lists of NOE's, PHI-

# for the evaluation inside MATLAB

# The output files are

PSI- and THETA-angles needed

number dat

t noe dat

# psi dat

# phi dat

# theta dat

*

# This script calls the following awk-Scripts# awknoe inp, awkphi inp, awkpsi inp and awktheta inp

structure number

H-H distances

psi angle

phi angle

theta angle

DO NOT RUN THIS SCRIPT OVER NFS

WITH THE PHYSICAL DISCS *

RUN IT ONLY ON THE MACHINE

unalias ls

/bin/rm -f psi dat phi dat noe dat theta dat number dat

touch psi dat phi dat noe dat theta dat number dat

ls final_* out | sed -e 's/final.//' -e *s/_//'

foreach file ('ls final_* out*)

s/ out//' » number dat

awk -f awknoe inp

awk -f awkphi inp

awk -f awkpsi inp

awk -f awktheta inp

end

< $file » noe dat

< $file » phi dat

< $file » psi dat

< $file » theta dat

awknoe.inp:# This is a command file for awk It extracts the distances from

# the Output file of the CHARMM run for MEDUSA

BEGIN { )

/~[0-9 ]»ANTA «ANTA/ t hope - NR.COunt - $1 )

NR == hope+2 { distance[count]=$l ]

END [ for( 1-1, i<-count,l-i+l)(printf("%8 4f,distance[i])),

printf("\n') ,)

182 Kapitel 7.2

awkphi.inp# This is a command file for awk It extracts the phi-angles from

# the output file of the CHARMM run for MEDUSA

BEGIN ( )

/-[0-9 ]*C *N *CA «C/ [ resldue-$4, phi[residue]-$12 )

END t for( l-l, K-10,i-i+l)(pnntf ("%8 2f",phi[i])J,

print£("\n") ,)

awk_psi.dat# This is a command file for awk It extracts the psi-angles from

# the output file of the CHARMM run for MEDUSA

BEGIN { ]

/"[0-9 ]*N »CA *c *N/ { residue-S4, psi[residue]-$12 )

END l fort i-l, K-10,i-i+l)[printf("%8 2f",psi[i))),

printf C\n") ,)

awk_theta.inp:# This is a command file for awk It extracts the theta-angles from

# the Output file of the CHARMM run for MEDUSA

BEGIN t )

/~[0-9 ]*HN *N *CA *HA/ { residue-$2, theta[residue]-S12 }

END [ fort 1=1, K-10,1-1+1) {

printf("%B 2f",theta[i])),

printf C\n") ,)

Spektrale Leistungsdichtefunktionen 183

7.3 Spektrale Leistungsdichtefunktionen

In diesem Teil sind die analytischen Ausdrücke für die spektralen

Leistungsdichtefunktionen /(co) der unterschiedlichen Modelle wie¬

dergegeben, die in Kapitel 4 zur Beschreibung der Bewegung der

Kohlenstoffatome in der Phenylalaninseitenketten benutzt wurden.

In den folgenden Formeln ist D die Diffusionskonstante für das

„rotational tumbling" und Dx bzw. D2 sind die Diffusionskonstan¬

ten für eine Bewegung um X\ bzw. x2- wv w2 und w3 sind die Über¬

gangswahrscheinlichkeiten für das Dreisprungmodell mit verschie¬

denen Populationen um %x, während w die Übergangswahrschein¬lichkeit für die Bewegung um %2 ist. Zur Vereinfachung der Notation

wird die Lorentzfunktion durch

/(co, x) = -I-—= (7.1)1+ (cot)2

beschrieben, und die Korrelationszeit des „rotational tumbling" ist

xc = 1/(6D) . (7.2)

Isotropes „rotational tumbling" (Modell A-H, Ca):

7((ü) = /(co, xc) (7.3)

Freie Diffusion um xx (Modell A und B, Cr und Cr):

/(to) = 0.1108 • /(co, t£) + 0.2970 • /(co, xcl) + 0.5922 • /(co, xcl) (7.4)

mitxcl = (öD + D^ûndx^ = (6D + 4Dj)_1.

Dreisprungmodell mit gleichen Populationen um %j(Modell C und D, Cß und C^):

/(co) = 0.1108 • /(co, xc) + 0.8892 • /(co, tcl) (7.5)

mit tj= (6D + 3WJ)- .

184 Kapitel 7.3

Dreisprungmodell um Xj mit unterschiedlichen Populatio¬nen (Modell E und F, Cß und C^):

/(co) = 0.1108 + 0.8892 l—2 • /(co, t£)v (2w1 + w2) )

mitx.j = (6D + 2wl + w2)~l undxc2 = {6D + 2w3 + w2)~l.

Beschränkte Diffusion um xa auf dem Intervall [-cp0, +cp0](Modell G und FL Cß und C^):

2

/«» = X X«m-(Em,*(<P0))2-/(^) (7-7)

m = -2 it = 0

mit Em j.(cp0) definiert nach Gleichung (2.55) und

4cp0x = 2—5 2

(7.8)24Dq>2 + Dr (Ifcjc)

Die Konstanten sind: a±2 = 0.2961, a±1 = 0.1486 und a0 = 0.1107.

Freie Diffusion um %1 und x2 (Modell A, Cg und C£):

/(co) = 0.0017 • /(co, tc) + 0.0835 • /(co, tc1) + 0.1249 • /(co, xc2)

+ 0.0046 • /(co, xc3) + 0.2021 • /(co, xc4) + 0.2083 • /(co, xc5)

+ 0.0093 • /(co, xc6) + 0.2770 • /(co, xc7) + 0.0886 • /(co, xc8)

mitxcl = (6D + D2)~\ tc2 = (6D + 4D2)_1,

xc3 = (6D + D,)"1, tc4 = (6D + Dj + D2)_1,xc5 = (ÖD + D^D^""1, xc6 = (6D + 4DJ-1,

xc7= (6D + 4D1 + D2)"1und xc8 = (eD + W^ +W^


Freie Diffusion um xa und Zweisprungmodell um x2(Modell B, C5 und Ce):

/(co) = 0.2931 • /(co, xc) + 0.1671 • /(co, tc1) + 0.0743 /(co, xc2)

+ 0.0701 • /(co, xc3) + 0.3397 • /(co, xc4) + 0.0557 • /(co, xc5)

mitxcl = (6D + 2w)~\ xc2 - (ÖD + Dj)"1,

xc3 = (6D + 4D,)"1, xc4 = (6D + D1 + 2w)_1 und

xc5 = (6D + 4D1 + 2w)~1.

Dreisprungmodell um %i und freie Diffusion um x2(Modell C, Cg und Ce):

/(co) = 0.0017 • /(co, xc) + 0.0835 • /(co, xcl) + 0.1249 • /(co, xc2)

+ 0.0139 • /(co, xc3) + 0.4790 • /(co, xc4) + 0.2970 • /(co, xc5)

mitxcl = (6D + D2)~\ xc2 = (6D + 4D2)~\

xc3 = (6D + 3WJ'1 tc4 = (6D + D2 + 3w1)~1vmd

xc5 = (6D + 4D2 + 3w1)'"1.

Dreisprungmodell um %1 und Zweisprungmodell um x2(Modell D, C5 und Ce):

/(co) = 0.2931 • /(co, xc) + 0.1671 • j(u>, tc1) + 0.1444 • /(co, xc2)

+ 0.3954- /(co, xc3)(

mitx£l = (6D + 2w)~\ xc2 = (6D + 31ÜJ)"1,

xc3 = {6D + 2w + 3w1)~1.

m;2)+2iü3+D2+(6D1undxc8=w>2)+2^+D2+(6D

t7= tc8undw>2r+2w;1+D2+(6D

=cc7

1^2)"++2^34D2(6D+=\6W2)1/+21ÜJ+4D2+(6D=xc5

u)2)_1'+2xü3+(6D=Tc4w2)'+2iüj+(6D=tc3

4Ü2)-1,+(6D=xc2D2)~\+(6D=mitTd

(7.13)

•0.4790+

zv2+*wlw2)+2(2w1

3iüj9wjW2

H^+«tîü2)+U(2w1

2>wx9w,w2/

0.2970+

tc4);(co,•

77r-qji-+xr3);(co,•

7

2

[0.0139+

3w,9w,u>.,

/21^)+(^2Vxc2);(co,•^-0.2970+0.1249+

/2Wj)+(iü2Vxcl)/(co,—2

0.4786+0.0835+

\(w2-w,)(

)2wx)+(w2Vtc);(co,•

—20.0134+0.0017=7(co)

\(ro.-Wj)/

Ce):undC5E,(Modell%2umDiffusionfreieundnen

Populatio¬unterschiedlichenmit%xumDreisprungmodell

7.3Kapitel186


Dreisprungmodell um xa mit unterschiedlichen Populatio¬nen und Zweisprungmodell um x2 (Modell F, Cg und Ce):

/ (10,-10,) N

/(co) = [ 0.2931 + 0.14442

• /(co, x£)

/(ü),xcl)

3w,

+ 0.1671 + 0.3954 •

(i02 + 2z0j)

(w2-w1y

(i02 + 2i0j)zV

+al444 • L, '/(w' ^+i^r • **'To)U(2i01 + w2) *wi w2

9wxw2 3i0j

(2iüj+Z02) 4i0a + w2+ 0.3954

(7.14)

mitxcl (6D + 2i0) , xc2 = (60 + 2^ + 102)"

xc3 = (6D + 2w>3 +102) \ xci- (6D + 2w + 2w1 + w2)

undxc5 = (6D + 2z0 + 2i03 + i02)" .

Beschränkte Diffusion um Xj und freie Diffusion um x2(Modell G, Cg und Ce):

m= X X(Em>*«p0))2m = -2 k = 0

X [«« • /(W, T^fc) + bw •M ik) + Cm /(CO, X^)](7.15)

mit Em j.((p0) definiert nach Gleichung (2.55), mit den Konstanten

m am K c,cIm

±2 0.0046 0.1389 0.0443

±1 0.0023 0.1006 0.1042

0 0.0018 0.0835 0.1249

und mit den Korrelationszeiten

188 Kapitel 7.3

4<Po%ck

24Dq>5 + Dr (ätjt)2

49

ck

24Dcp2i + D1.(tot)2 + 4D2cp2

xc =

4<Po

240cp2 + Di- (fcit)2 + 16D2cp2(7.16)

Beschränkte Diffusion um x: und Zweisprungmodell um

X2 (Modell H,C8 und Ce):

2

/(«)= X S(£m,M))2K-y(^^) + ^-;(co,xc\)] (7.17)

m = -2 it = 0

mit Em k(q>0) definiert nach Gleichung (2.55), mit den Konstanten

m am K

±2 0.0350 0.0278

±1 0.0371 0.1698

0 0.2931 0.1670

und mit den Korrelationszeiten

ra4<P0

c*

240^0 + 0! • (ibt)2

lk =

4<Pn

24Dcp2 + D1- (fc7t)2 + 8i0cp2(7.18)

Relaxationszeiten von Antamanid in Chloroform 189

7.4 Relaxationszeiten von Antamanid in Chloroform

13C-TrZeiten

5

[ppm]

13C

Zuordnung

Ti[s]

200 MHz 400 MHz 600 MHz

130.1 Phe6-5 0.683 ± 0.006 0.684 ±0.006 0.638 ±0.010

130.0 Phe10-6 0.464 ± 0.006 0.461 ±0.004 0.454 ± 0.005

129.8 Phe5-S 0.524 ±0.006 0.526 ±0.004 0.503 ±0.006

129.0 Phe9-8 0.565 + 0.004 0.554 ±0.006 0.518 ±0.009

128.7 Phe9-e 0.565 + 0.004 0.547 ±0.005 0.513 ±0.006

128.4 Phe5-e 0.531 ±0.004 0.517 ±0.006 0.495 ±0.003

128.3 Phe6-e 0.674 ±0.007 0.678 ±0.007 0.620 ±0.005

128.0 Phe10-e 0.460 ± 0.005 0.454 ±0.005 0.440 ± 0.004

126.9 Phe9-? 0.390 ± 0.007 0.391 ±0.007 0.387 ± 0.007

126.8 Phe6-? 0.473 ±0.008 0.491 ± 0.010 0.472 ±0.006

126.4 Phe5-? 0.416 ±0.013 0.425 ± 0.007 0.419 ± 0.006

125.7 Phe10-? 0.360 ±0.008 0.381 ±0.007 0.359 ±0.009

61.1 Pro3-a 0.393 ± 0.006 0.417 ±0.004 0.462 ± 0.007

60.9 Pro8-a 0.377 ±0.008 0.411 ±0.006 0.461 ± 0.008

58.9 Phe10-a 0.361 ± 0.005 0.409 ±0.007 0.464 ± 0.014

58.8 Pro2-a 0.339 ± 0.007 0.389 + 0.006 0.458 ±0.008

58.5 Pro7-a 0.360 ±0.009 0.382 ± 0.005 0.448 ± 0.007

57.3 Phe9-a 0.335 ±0.005 0.391 ± 0.006 0.413 ± 0.007

57.0 Phe5-a 0.366 ± 0.007 0.393 ±0.007 0.445 ±0.008

56.6 Va^-a 0.373 ±0.008 0.400 ±0.006 0.470 ±0.012

52.4 Phe6-a 0.377 ±0.006 0.397 ±0.007 0.433 ± 0.007

49.9 Ala4-a 0.365 ±0.007 0.415 ±0.006 0.473 ±0.016

47.9 Pro2-6 0.257 ±0.005 0.284 ±0.005 0.332 ±0.006

47.6 Pro7-8 0.276 ±0.007 0.290 ±0.005 0.331 ±0.007

Tabelle 7.4: Zuordnung der C-Resonanzen von Antamanid in Chloroform bei

320 K und TrReIaxationszeiten bei 200,400 und 600 MHz Protonenresonanzfre¬

quenz. Die Fehler geben das Vertrauensintervall einer Standardabweichung an.

190 Kapitel 7.4

6

[ppm]

13C

Zuordnung

Tj[s]

200 MHz 400 MHz 600 MHz

46.7 Pro3-8 0.230 ±0.006 0.251 ±0.005 0.284 ±0.005

46.5 Pro8-5 0.214 ± 0.007 0.238 ± 0.003 0.258 ±0.005

38.0 Phe9-ß 0.230 ±0.004 0.231 ±0.004 0.285 ±0.006

36.6 Phe6-ß 0.271 ±0.008 0.277 ±0.006 0.304 ±0.009

35.9 Phe5-ß 0.239 ± 0.006 0.252 ± 0.006 0.303 ±0.009

35.3 Phe10-ß 0.220 ±0.006 0.242 ±0.005 0.274 ±0.012

31.6 Pro3-ß 0.236 ±0.003 0.253 ±0.005 0.291 ± 0.007

31.3 Pro8-ß 0.207 ±0.006 0.218 ±0.004 0.276 ±0.006

31.1 ValJ-ß 0.398 ±0.010 0.450 ±0.009 0.483 ± 0.011

28.6 Pro2-ß 0.317 ± 0.007 0.332 + 0.005 0.393 ±0.007

28.3 Pro7-ß 0.313 ± 0.007 0.352 ± 0.005 0.395 ±0.004

25.2 Pro2-7 0.390 ±0.013 0.454 ± 0.006 0.516 ±0.011

25.0 Pro7-^y 0.443 ± 0.010 0.509 ± 0.009 0.567 ± 0.012

22.2 Pro3jy 0.267 ± 0.009 0.293 ± 0.007 0.328 ±0.007

21.2 Pro8^y 0.215 ± 0.008 0.244 + 0.004 0.287 ± 0.012

19.4 Val1^ 0.534 + 0.010 0.542 + 0.011 0.570 ± 0.012

18.0 Val1^ 0.622 + 0.014 0.667 ± 0.011 0.684 ± 0.015

16.6 Ala4-ß 0.436 ± 0.007 0.463 ± 0.006 0.521 + 0.015

Tabelle 7.4: (Fortsetzung) Zuordnung der 13C-Resonanzen von Antamanid in

Chloroform bei 320 K und Tj-Relaxationszeiten bei 200,400 und 600 MHz Proto¬

nenresonanzfrequenz. Die Fehler geben das Vertrauensintervall einer Standard¬

abweichung an.


NOE-Faktoren

8

[ppm]

13C-

Zuordnung

NOE

400 MHz 600 MHz

130.1 Phe6-8 2.412 ±0.107 2.072 ±0.063

130.0 Phe10-5 2.533 ±0.117 2.110 ±0.064

129.8 Phe5-5 2.675 ±0.093 2.043 ±0.044

129.0 Phe9-8 2.488 ±0.073 2.087 ±0.020

128.7 Phe9-e 2.610 ±0.122 1.956 ±0.027

128.4 Phe5-e 2.534 ± 0.073 2.038 ±0.051

128.3 Phe6-e 2.548 ±0.036 1.908 ±0.030

128.0 Phe10-e 2.608 ±0.105 2.035 ±0.022

126.9 Phe9-? 2.578 ±0.080 1.974 ±0.117

126.8 Phe6-? 2.569 ±0.101 2.121 + 0.046

126.4 Phe5-? 2.605 ±0.083 2.050 ±0.124

125.7 Phe10-? 2.461 ±0.173 2.014 ±0.157

61.1 Pro3-a 2.619 ±0.108 2.444 ±0.125

60.9 Pro8-a 2.771 ±0.241 2.539 ±0.091

58.9 Phe10-cc 2.592 ±0.497 2.706 ± 0.228

58.8 Pro2-a 2.817 ±0.067 2.408 ± 0.111

58.5 Pro7-a 2.859 ±0.205 2.531 ± 0.079

57.3 Phe9-a 2.496 ± 0.147 2.302 ±0.143

57.0 Phe5-a 2.715 ± 0.163 2.477 ±0.086

56.6 Vala-a 2.738 ±0.203 2.260 ± 0.180

52.4 Phe6-a 2.774 ±0.183 2.346 ± 0.277

49.9 Ala4-a 2.584 ±0.093 2.398 ±0.152

47.9 Pro2-8 2.628 ±0.395 2.408 ±0.078

47.6 Pro7-8 2.630 ±0.240 2.541 ±0.084

46.7 Pro3-8 2.662 ±0.127 2.640 ±0.142

46.5 Pro8-8 2.670 ±0.265 2.349 ± 0.105

Tabelle 7.5: Statische heteronukleare NOE Werte für 400 und 600 MHz Proto¬

nenresonanzfrequenz für alle nicht quartären Kohlenstoffatome in Antamanid

bei 320 K. Die Fehler geben das Vertrauensintervall einer Standardabweichungan.

192 Kapitel 7.4

8

[ppm]

13C-

Zuordnung

NOE

400 MHz 600 MHz

38.0 Phe9-ß 2.807 + 0.099 2.548 ±0.075

36.6 Phe6-ß 2.604 + 0.288 2.665 ±0.260

35.9 Phe5-ß 2.682 ±0.206 2.612 ±0.307

35.3 Phe10-ß 2.667 + 0.392 2.582 ±0.244

31.6 Pro3-ß 2.680 ± 0.205 2.864 ±0.222

31.3 Pro8-ß 2.535 + 0.264 2.637 ±0.406

31.1 ValJ-ß 2.599 + 0.220 2.273 ±0.203

28.6 Pro2-ß 2.696 + 0.216 2.618 ±0.154

28.3 Pro7-ß 2.618 ± 0.204 2.403 ± 0.177

25.2 Pro2-v 2.471 ± 0.080 2.475 ± 0.073

25.0 Pro7-^y 2.949 ± 0.141 2.276 ±0.218

22.2 Pro3^y 2.685 ± 0.093 2.463 ±0.061

21.2 Pro8^ 2.795 ± 0.125 2.446 ± 0.263

19.4 VaP-y 2.897 ±0.183 2.669 ±0.155

18.0 Val1-? 2.678 ± 0.203 2.537 ± 0.124

16.6 Ala4-ß 2.585 ± 0.127 2.643 ± 0.068

Tabelle 7.5: (Fortsetzung) Statische heteronukleare NOE Werte für 400 und 600

MHz Protonenresonanzfrequenz für alle nicht quartären Kohlenstoffatome in

Antamanid bei 320 K. Die Fehler geben das Vertrauensintervall einer Standard¬

abweichung an.


Protonen Tj-Zeiten

8

[ppm]

13C-

Zuordnung

Tibi

400 MHz 600 MHz

130.1 Phe6-8 0.471 ±0.023 0.545 ±0.031

130.0 Phe10-5 0.357 ±0.014 0.412 ±0.020

129.8 Phe5-8 0.348 ±0.011 0.434 ±0.025

129.0 Phe9-S 0.361 ±0.012 0.465 ±0.019

128.7 Phe9-e 0.405 ±0.013 0.501 ±0.026

128.4 Phe5-e 0.368 ±0.010 0.452 ±0.018

128.3 Phe6-e 0.485 ±0.014 0.570 ± 0.031

128.0 Phe10-e 0.379 ±0.010 0.437 ±0.015

126.9 Phe9-? 0.367 ±0.014 0.455 ±0.015

126.8 Phe6-? 0.445 ± 0.023 0.573 ± 0.029

126.4 Phe5-? 0.370 ±0.015 0.474 ± 0.021

125.7 Phe10-? 0.307 ±0.008 0.440 + 0.021

Tabelle 7.6: Protonen Tj-Relaxationszeiten der aromatischen Protonen von

Antamanid bei 400 und 600 MHz Resonanzfrequenz. Die Werte wurden mit der

Pulssequenz aus Abbildung 4.2 gemessen. Die Fehler geben das Vertrauensin¬

tervall einer Standardabweichung an.

194 Kapitel 7.4

Kreuz- und Autorelaxationsratenkonstanten

8

[ppm]

13C-

Zuord-

nung

r rs"1!

2S2Jz,2S2/2l& J T Ts"1!

400 MHz 600 MHz 400 MHz 600 MHz

130.1 Phe6-8 1.675 ± 0.051 1.661 ±0.041 -0.425 ± 0.017 -0.572 ± 0.029

130.0 Phe10-8 2.509 ± 0.065 2.237 ±0.060 -0.638 ±0.021 -0.771 ± 0.046

129.8 Phe5-8 2.300 ±0.057 2.070 ± 0.051 -0.559 ±0.018 -0.729 ±0.040

129.0 Phe9-8 2.488 ± 0.081 2.112 + 0.058 -0.554 ±0.024 -0.740 ±0.043

128.7 Phe9-e 2.217 ±0.052 1.972 ±0.042 -0.417 + 0.016 -0.718 ±0.033

128.4 Phe5-e 2.222 ± 0.033 2.087 ±0.057 -0.532 ±0.011 -0.723 ±0.043

128.3 Phe6-e 1.669 ±0.034 1.630 ±0.043 -0.421 + 0.011 -0.516 ± 0.032

128.0 Phe10-e 2.552 ± 0.071 2.319 + 0.069 -0.549 ±0.022 -0.768 + 0.052

126.9 Phe9-? 2.402 ± 0.088 2.251 ±0.081 -0.876 ± 0.054 -1.091 ±0.090

126.8 Phe6-? 1.994 ±0.069 1.866 ±0.067 -0.681 ± 0.043 -0.821 ± 0.079

126.4 Phe5-? 2.423 ± 0.058 2.138 ±0.082 -0.714 ±0.034 -0.904 ±0.096

125.7 Phe10-? 2.722 ± 0.050 2.585 ± 0.121 -0.735 ± 0.031 -1.142 ± 0.132

Tabelle 7.7: Autorelaxationsratenkonstanten des Zweispinterms 2SZ72 und

Kreuzrelaxationsratenkonstanten für den Prozeß 2S27Z —> Sz bei 400 und 600

MHz Protonenresonanzfrequenz. Die Fehler geben das Vertrauensintervall einer

Standardabweichung an.

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[161] P. Domaille, private Mitteilung.

202 Kapitel 8

Danksagungen 203

Danksagungen

Meinem Doktorvater Prof. Richard Ernst danke ich, daß er mir nach meiner

Diplomarbeit die Gelegenheit zur Promotion in seiner Arbeitsgruppe gegebenhat. Er hat mir während meiner ganzen Dissertation immer viel Verständnis ent¬

gegengebracht, auch wenn die Arbeit gerade während der ersten beiden Jahre

nicht immer zufriedenstellend verlief.

Prof. Christian Griesinger danke ich für die gute Zusammenarbeit während der

ersten Zeit meiner Dissertation und für die Bereitschaft das Korreferat zu über¬

nehmen.

Irene Schlönvogt und Tobias Bremi haben während ihrer Diplomarbeiten viel

zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen. Durch ihren Einsatz, ihr Interesse und

durch das Hinterfragen vieler Aussagen haben sie auch mein Verständnis der

Kernresonanzspektroskopie ein gutes Stück weitergebracht.

Im Bereich der verschiedenen Computersysteme habe ich von Dr. Beat H. Meier

vieles gelernt und auch viel von seinem breiten Wissen auf dem Gebiet der Fest¬

körper NMR-Spektroskopie profitiert. Wenn wir auch öfters unterschiedliche

Ansichten über Computerfragen hatten, so konnten wir doch immer einen

gemeinsamen besseren Weg finden und so die anstehenden Probleme lösen.

Meinen Laborkollegen während der fünf Jahre, Dr. Roland Kreis, Dr. Armin

Stöckli, Dr. Benoit Roux, Dr. Ole Serensen, Dr. Jürgen Schmidt und Tobias Bremi

danke ich für die vielen Diskussionen über wissenschaftliche und allgemeineThemen. Ich habe die freundschaftliche Atmosphäre im „F-34" stets zu schätzen

gewußt.

Dr. Thomas Schulte-Herbrüggen bin ich für seinen Einsatz für das 600 MHz

Spektrometer, an dem viele der in dieser Arbeit enthaltenen Messungen durch¬

geführt wurden, zu Dank verpflichtet. Außerdem hat er zusammen mit Tobias

Bremi verschiedene Versionen meiner Dissertation korrekturgelesen und dabei

viele Schwachstellen aufgedeckt und Verbesserungen vorgeschlagen.

Der „Computer Gruppe" mit Serge Boentges, Tilo Levante, Zoltan Mädi und Dr.

Scott Smith danke ich für die (hoffentlich beiderseits) fruchtbare Zusammenar¬

beit. Die Zusammenarbeit mit Dr. Dieter Suter, Institut für Quantenelektronik,führte zu einem interessanten Projekt über die „Time Translation Machine", das

in der voriiegenden Arbeit nicht enthalten ist.

Allen anderen momentanen und früheren Mitgliedern der Arbeitsgruppe mit

denen ich während meiner Zeit an der ETH zusammengearbeitet habe, Gabriele

Aebli, Marc Baldus, Dr. Martin Blackledge, Dr. Jacques Briand, Dr. RaphaelBrüschweiler, Dr. Marc Chiu, Sabine Hediger, Eric Hoffmann, Jürg Leuthold, Dr.

204

Mark McCoy, Dr. Peter Meier, Dr. Rolf Meyer, Dr. Jeff Peng, Dr. Alessandro

Ponti, Dr. Christian Radioff, Pierre Robyr, Martin Schick, Dr. Christian Schönen-

berger, Paul Schosseier, Prof. Arthur Schweiger, Dr. Jochen Sebbach, Gustavo

Sierra, Suzana Straus, Marco Tomaselli, Dr. Thomas Wacker, Michael Willer, Dr.

Shanmin Zhang und Dr. Ping Xu, danke ich für die schöne Zeit, die ich hier

gemeinsam mit ihnen verbringen konnte. Frau Irene Müller hat die vielen Ver¬

sionen der Publikationen immer wieder geduldig neu geschrieben.

Die mechanische Werkstatt, mit Josef Eisenegger, und die Elektronikwerkstatt,

mit Martin Neukomm und Paul Signer, haben auch die ausgefallensten Wün¬

sche schnell und funktionstüchtig in die Praxis umgesetzt. Der Unterhalt der

elektronischen Geräte durch Walter Jäggi, Konrad Boss und Karl Burkhalter

funktionierte immer gut und hat viel zum effizienten Arbeiten beigetragen.Herrn W. Jäggi danke ich auch für seinen Einsatz um die Computersysteme.Auch wenn unsere Meinungen hier manchmal differierten, so war die Zusam¬

menarbeit doch immer hervorragend. Walter Lämmler und Guido Grassi küm¬

merten sich um die Vorbereitung der verschiedenen Proben.

Die Versorgung der Experimente und supraleitenden Magnete mit flüssigemStickstoff und Helium wurde durch Erwin Pleisch, Hansruedi Hager und Bruno

Lambillotte gesichert, die sich auch durch kurzfristige und überraschende

Bestellungen nicht aus der Ruhe bringen ließen. Die Verwaltung der Physikali¬schen Chemie mit Heinrich Willi, Marie-Therese Werder, Verena Baumann,

Sonja Steiger und Doris Kaufmann sorgte stets für einen problemlosen Betrieb

der unterschiedlichen Dienste.

Den anderen Mitarbeitern des Praktikums Physikalische Chemie II, Dr. Erich

Meister, Dr. Alois Renn, Dr. Georg Seyfang und Dr. Rene Spycher, danke ich für

die reibungsfreie Zusammenarbeit während der gemeinsamen Zeit.

Vielen Mitarbeiter der Firmen Bruker, Karlsruhe, und Spektrospin, Fällanden,

bin ich für die große Hilfsbereitschaft bei Problemen mit der Hard- und Software

der unterschiedlichen Spektrometer und für die großzügige Überlassung von

Meßzeit dankbar. Besonders erwähnen möchte ich Dr. Wolfgang Bermel und Dr.

Rainer Kerssebaum (Applikationslabor Karlsruhe) für die Hilfe bei den manch¬

mal langen Messungen am Freitag abend. Herr Franz Meier, Dr. Hans Förster

und Dr. Stefan Steuernagel (Bruker Karlsruhe) halfen mir bei der nicht immer

ganz einfachen Betreuung unseres MSL-400 Spektrometers. Dr. Detlev Moskau

(Applikationslabor Fällanden) und Herr Daniel Baumann (NMR-Service Fällan¬

den) hatten immer ein offenes Ohr für die unterschiedlichsten Probleme und

fanden meistens auch eine schnelle provisorische Lösung. Dr. Beat U. Meier

(Softwareentwicklung Fällanden) stellte uns immer die neueste Version der

NMR-Software Uxnmr/P zur Verfügung und bemühte sich, die gefundenen

Danksagungen 205

Fehler so rasch als möglich zu beheben. Ich hoffe, daß diese Zusammenarbeit

beiden Seiten Nutzen gebracht hat.

Die Informatikdienste der ETH bemühten sich immer um einen sicheren Betrieb

der verschiedenen Computernetze, ohne die heute eine wissenschaftliche For¬

schung fast nicht mehr denkbar ist. Besonders möchte ich mich bei Dr. Andreas

Karrer (Kommunikationssysteme) und bei den Mitarbeitern der VPP-Gruppefür ihre Hilfsbereitschaft bedanken, die weit über das Normale hinausging.

Zum Schluß gilt mein Dank allen denen, die häufig vergessen werden, aber hin¬

ter den Kulissen für den Betrieb der ETH unentbehrlich sind: den Mitarbeitern

des Hausdienstes, dem Reinigungspersonal, den Mitarbeitern der Telefonzen¬

trale und allen anderen Mitarbeitern der ETH mit denen ich in der einen oder

anderen Weise Kontakt hatte.

206

Lebenslauf 207

Lebenslauf

Persönliche Daten

Name

Geburtsdatum

Geburtsort

Staatsbürgerschaft

Eltern

Matthias Christoph Ernst

2. Februar 1964

Stuttgart-Bad Canstatt, Bundesrepublik Deutschland

Deutscher

Hans-Jürgen und Ilse Ernst

Ausbildung

1970-1974 Schneeburg Grundschule in Freiburg i. Brsg.

1974-1983 Theodor-Heuss-Gymnasium Freiburg i.Brsg., Abitur.

1983-1984 Wehrdienst bei der Deutschen Bundeswehr.

1984-1987 Chemiestudium an der Universität Freiburg.

1987-1988 Chemiestudium an der ETH Zürich.

1988 Diplomarbeit bei Prof. Richard R. Ernst, Laboratorium für

Physikalische Chemie, ETH Zürich.

Oktober 1988 Diplom mit Auszeichnung der ETH Zürich.

1989-1993 Dissertation bei Prof. Richard R. Ernst, Laboratorium für

Physikalische Chemie, ETH Zürich.

Auszeichnungen

1982 und 1983

1984-1988

1988

1989

Teilnehmer an den Internationalen Schülerolympiaden für

Chemie in Stockholm und Timisoara.

Stipendiat der Studienstiftung des Deutschen Volkes.

Silbermedaille der ETH Zürich für die Diplomarbeit.

Preis der „Vereinigung Ehemaliger Chemiestudierender an

der ETH Zürich" für die beste Diplomprüfung des Jahres

1988.

Berufliche Erfahrungen

1989-1990 Assistent in der Vorlesung Physikalische Chemie I.

1990-1993 Betreuung des FortgeschrittenenPraktikums PhysikalischeChemie (PCPII).

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Documents

Rights / License: Research Collection In Copyright - Non ...22360/eth-22360-02.pdfInhaltsverzeichnis 7 5.2 TheoriederSIIS-Kreuzrelaxation 130 5.2.1 Sprungmodelle 131 5.2.2 Diffusionsmodelle