Aplicarea metodei ELISA in identificarea alimentelor din organisme modificate genetic

Cuprins1. Descrierea metodei Elisa 2. Tipurile de probe ce pot constituii obiectul testarii OMG 3. Metoda Elisa in identificarea alimentelor din organism modificate genetic

INTRODUCERE Modul de alimentatie s-a schimbat treptat de-a lungul anilor. Daca bunicii nostri consumau cu precadere alimente produse in propria gospodarie in cadrul unei economii rurale, tehnologiile au impus pe o piata libera alimente care solicita din partea consumatorilor informare si educare in vederea unei alegeri corecte. Una din provocarile noului mileniu sunt alimentele obtinute din organisme modificate genetic (OMG) care au la baza folosirea biotehnologiilor.

INTRODUCERE Una dintre abordarile stiintifice, general utilizate, pentru identificarea modificarilor genetice in culturile de soia, porumb, bumbac etc. o reprezinta testul Elisa (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) si implica evidentierea prezentei unei proteine specifice prin exploatarea specificitatii de legare dintre un antigen exprimat si anticorpul tinta. Tehnica Elisa a fost inventata de un grup de cercetatori de la Universitatea din Stokholm condus de Peter Perlmann si Eva Engval, acestia publicand primul articol despre Elisa in 1971. Articolul descria aprecierea cantitativa a IgG in serul de iepure folosind fosfataza alcalina ca enzima de identificare . Avantaje de siguranta crescuta si cele economice, fata de testarea radioimuna (RIA) au facut din tehnica imunoenzimatica Elisa una indinspensabila pentru domeniul medicine clinice, biologiei si al biotehnologiei.

1.Descrierea metodei ELISAPrincipiul metodei Elisa

Principiul metodei, indiferent de tipul de Elisa ales este in esenta acelasi si se bazeaza pe reactia antigen-anticorp. Antigenul sau anticorpul de captura este fixat pe un suport solid dupa care este pus in contact cu o imunoglobulina, un antigen sau respective orice molecula pentru care are specificitate. O enzima cuplata fie direct de imunoglobulina sau de un alt anticorp anti-imunoglobulina degradeaza un substrat cromogen incolor producand un compus colorat ce poate fi detectat

1.Descrierea metodei ELISAIn implementarea oricarei tehnici Elisa intelegerea proceselor de baza si aplicarea corecta a acestora reprezinta un factor esential in atingerea obiectivului propus. Prepararea conjugatului

Puncte critice in protocolul Elisa

Conjugatul este reprezentat de un antigen sau anticorp cu specificitate pentru molecula de determinat cuplat cu o enzima. Cuplarea molecule se realizeaza prin cross-linkare sub actiunea unor agenti favorizanti cum ar fi glutaralaldehida, di-iso-cianat toluene, p-benzochinona, etc. Fixarea anticorpului sau antigenului de captura pe placa.

Majoritatea proteinelor pot fi adsorbite pe suprafetele din plastic datorita interactiunilor hidrofobice intre structurile proteice nepolare si structurile nepolare ale matricei polimerului. Deoarece fixarea anticorpilor de placa nu este una specifica este necesara blocarea situsurilor de legare nespecifica pentru a prevenii fixarea celorlalti reactanti de placa in locul interactiunii acestora cu anticorpul fixat. Blocarea se realizeaza de obicei prin incubarea cu un tampon de blocare, format de obicei dintr-o proteina inerta si un detergent neionic.

1.Descrierea metodei ELISA Incubarea antigenului sau anticorpului de determinat in placa.

Adaugarea dilutiei de antigen sau anticorp in placa de reactie reprezinta prima etapa efectiva a tehnicii Elisa si nu un pas pregatitor. In aceasta etapa moleculele de determinat se ataseaza prin legaturi de hydrogen, ionice, interactiuni hidrofobice si forte de interactiune van der Waals, de anticorpul/antigenul de captura. Indepartarea reactantilor liberi din placa

Un pas foarte important in tehnica Elisa il reprezinta etapele de spalare. Moleculele nefixate fie in timpul aderarii la placa fie in timpul legarilor specifice cu anticorpii de captura trebuiesc eliminate din godeuri pentru a nu inhiba legarea reactantilor ce urmeaza a fi adaugati ceea ce ar conduce la un rezultat eronat. Incubarea conjugatului in placa.

In functie de tipul de Elisa aplicat, adaugarea conjugatului in reactie presupune legarea acestuia de anticorpul de determinat sau de antigenul specific. Ca si in etapa de incubare a anticorpilor sau antigenelor de determinat prelungirea timpului de reactie poate oferii un semnal mai puternic. Adaugarea substratului cromogen

Adaugarea substratului cromogen reprezinta o etapa critica in tehnica Elisa deoarece este etapa in care rezultatul pozitiv sau negativ poate fi apreciat. Este de asemenea prima etapa in care putem semnala daca vreo etapa din protocol a fost executata gresit sau unul dintre reactivi nu functioneaza.

1.Descrierea metodei ELISA Interpretarea rezultatelor Consta in aprecierea culorii probei. Densitatea optica a fiecarei probe se apreciaza la spectrofotometru la o lungime de unda corespunzatoare. Clasificarea tehnicilor Elisa Tehnicile mai des folosite pentru identificarea organismelor modificate genetic sunt Tehnicile Elisa Sandwich. 1. Elisa Sandwich Tehnicile care folosesc principiul anticorpi-sandwich ar putea reprezenta unele din cele mai utile determinari imunoenzimatice pentru determinarea antigenelor deoarece frecvent ofera o sensibilitate de 2-5 ori mai mare decat alte tehnici de determinare a antigenului.

Metoda ELISA de tip sandwich/cu Ag capturat creste specificitatea metodei, necesitand legarea Ac la doi epitopi diferiti (reactiile incrucisate pot avea loc la unul dintre epitopi, dar este putin probabil sa aiba loc la ambii epitopi simultan). Ac monoclonal este legat la suprafata solida si leaga Ag, daca acesta este prezent in proba; materialul nelegat este spalat; un al doilea Ac marcat, care recunoaste un epitop diferit, se leaga la Ag; o noua spalare indeparteaza Ac nelegati, apoi se adauga substratul, care este convertit intr-un produs colorat, proportional cu cantitatea de Ag prezenta in serul testat.

1.Descrierea metodei ELISA

1.Descrierea metodei ELISA 2. Elisa dublu Sandwich Tehnica folosita in special pentru detectarea anticorpilor specifici in cazul in care se dispune de o cantitate mica de anticorp specific si nu se dispune de antigen purificat Suportul solid este acoperit cu anticorpi antiimuunoglobulina (imunoglobulina provenita de la speciile imunizate). Solutiile de anticorpi de testat se incubeaza in placa si la sfarsit anticorpii nelegati sunt inlaturati prin spalare. Se adauga solutia de antigen si se incubeaza. Dupa inca o etapa de spalare se adauga conjugat enzima-antigen specific si se incubeaza din nou. Conjugatul nelegat este indepartat prin spalare si se adauga substratul cromogen.

Clasificarea produselor ce pot fi testate pentru prezen a OMGurilor se poate face dup : - gradul de procesare; - tipul ingredientelor (ex. pe baz de soia sau porumb); - modul de prezentare, existnd produse n vrac (boabe/semin e) i produse ambalate (texturate proteice, tofu, biscui i etc.); - gradul de umiditate, existnd produse uscate (produse de panifica ie, fulgi), produse umede (tofu, creme, nghe at ) i produse lichide (ulei, bere). Aceste aspecte sunt importante deorece o cunoa tere ct mai bun a propriet ilor intrinseci ale probelor ajut la alegerea celor mai potrivite metode de e antionare, preg tire i izolare a analitului (ADN sau protein ). Materialele neprocesate sau cu grad redus de procesare (ex. semin ele sau f ina) sunt u or de testat datorit posibilit ii de ob inere a unor extracte ADN sau proteice cu caracteristici corespunz toare din punct de vedere analitic. O alt categorie de produse care pot con ine material MG sunt cele de origine animal , provenite de la animale hr nite cu furaje pe baz de OMG-uri.

2. Tipurile de probe ce pot constituii obiectul testarii OMG

3.Metoda ELISA in identificarea alimentelor din organism modificate genetic 1. Esantionarea n practica test rilor OMG, opera iunea de e antionare nu revine laboratoarelor, fiind efectuat de personal specializat din cadrul institu iilor abilitate ale statului. De i se desf oar n afara laboratorului, e antionarea poate fi considerat prima etap a procesului analitic, constituind un pas important, complex i obigatoriu pentru testarea tuturor categoriilor de produse comerciale. Din punct de vedere practic, e antionarea produselor neambalate este constituit din urm toarele etape: - prelevarea e antioanelor dintr-un lot, conform schemei utilizate; - evaluarea con inutului de material MG al probei ini iale de laborator;

3.Metoda ELISA in identificarea alimentelor din organism modificate genetic

3.Metoda ELISA in identificarea alimentelor din organism modificate genetic 2. Pregatirea probelor nainte de izolarea analitului este necesar aplicarea anumitor opera iuni de preg tire a probelor (ex. reducerea m rimii, m run ire, umectare sau omogenizare), n func ie de caracteristicile matricii supuse analizelor (Querci et al., 2005). Scopul acestora este de a facilita sau mbun t i izolarea i purificare analitului. 3. Laboratorul de testare Existen a unui spa iu adecvat i cu dotare corespunz toare este esen ial pentru buna desf urare a fluxului analitic i ob inerea unor rezultate de ncredere. Temerea principal n cadrul laboratorului de testare este reprezentat de apari ia contamin rilor ( el et al., 2006; Querci et al., 2005).

3.Metoda ELISA in identificarea alimentelor din organism modificate genetic 4. Detectia propriu-zisa a OMG-urilor prin analiza proteinelor Dintre metodele bazate pe analiza proteinelor, doar cele imunologice sunt folosite n practica test rii OMG. Acestea au la baz interac iunea anticorp-antigen, proteina rezultat n urma expresiei transgenei n organismul gazd reprezentnd antigenul. Teoretic, testele imunologice pot fi utilizate pentru o larg varietate de molecule int . n practic ns , exist trei limite majore ale acestor metode: necesitatea prezen ei n proba analizat a proteinelor cu structuri ter iare i cuaternare intacte; de obicei, n cazul matricilor procesate intervine denaturarea proteinelor, condi ia neputnd fi astfel satisf cut ; disponibilitatea anticorpilor specifici; ace tia sunt mult mai greu de sintetizat comparativ cu primerii utiliza i n cadrul metodelor bazate pe analiza ADN-ului; posibilitatea ca ADN-ul transgenic prezent n prob s nu fie exprimat uniform n timp i n toate organele plantei.

3.Metoda ELISA in identificarea alimentelor din organism modificate genetic Tehnica ELISA este utilizat , n general, pentru detec ie calitativ sau stabilirea nivelului de expresie proteic . Principiul ELISA cu cea mai larg aplicabilitate n testarea OMG, sandwich ELISA (Fig. 3), utilizeaz un anticorp de captur , imobilizat pe o suprafa solid , i un anticorp de detec ie marcat. Dac proteina de interes (antigenul) este prezent n extractul testat, aceasta va fi legat de anticorpii care c ptu esc pere ii godeului de analiz . Urmeaz apoi legarea la protein a celui de-al doilea set de anticorpi. n urma unei reac ii enzimatice de culoare, anticorpii marca i coloreaz mediul de reac ie, fiind astfel indicat i prezen a proteinei transgenice. De i ELISA poate fi utilizat pentru cuantificare (Corbisier et al., 2005; Querci et al., 2005), n practic , aplica iile n aceast direc ie sunt foarte restrnse. Corbisier et al. (2005), Querci et al. (2005) i Eyquem (2004) au descris i demonstrat modul de utilizare a kitului GMO Food Ingredient Testing (noua denumire GMOChek RUR Soya Test) produs de Strategic Diagnostics (http://www.sdix.com) i validat de JRC pentru cuantificarea proteinei EPSPS n diferite frac iuni alimentare de soia (Lipp et al., 2002, n Corbisier et al., 2005, i Strategic Diagnostics, 2004) i alimente u or procesate, dar nerecomndat pentru detec ia proteinei de interes n stare denaturat . Acesta este probail i motivul pentru care rezultatele au fost negative n cazul probelor tratate termic la temperaturi ridicate (Corbisier et al., 2005).

3.Metoda ELISA in identificarea alimentelor din organism modificate genetic

3.Metoda ELISA in identificarea alimentelor din organism modificate genetic 5. Interpretarea si raportarea rezultatelor obtinute in urma testarii OMG. Trebuie n primul rnd avut n vedere c laboratorul recep ioneaz direct proba de laborator, ob inut sau nu printrun proces de e antionare, iar rezultatele produse n urma analizelor se vor referi strict la acest e antion. Modul de utilizare a rezultatelor (i.e.extrapolarea la ntregul lot din care provine proba analizat ) r mne la latitudinea beneficiarului. Conform SR EN ISO 24276:2006, buletinul de analiz trebuie s men ioneze clar cantitatea secven ei transgenice raportat la cea a taxonului, sub forma procentelor. Trebuie de asemenea s se specifice valoarea incertitudinii de m surare, precum i limitele de detec ie i cuantificare absolute i practice.

3.Metoda ELISA in identificarea alimentelor din organism modificate genetic Trapmann et al. (2007) recomand urm torul mod de raportare a rezultatelor test rii OMG cantitative: dac c > LOQ se raporteaz Concentra ia = (c U); c reprezin rezultatulm sur torii; incertitudinea raportat n acest caz este cea extins , calculat cu ajutorul incertitudinii standard i utiliznd un factor de acoperire k = 2 (nivelul de ncredere de aproximativ 95%); n cazul n care LC < c < LOQ se raporteaz Concentra ia = (c U), dac nu este posibil estimarea concentra iilor sub LOQ; dac estimarea esteposibil sub LOQ, se raporteaz Concentra ia (LOQ + ULOQ), ULOQ reprezentnd incertitudinea extins a valorii LOQ; dac c < LC se raporteaz Concentra ia < LC. AND-ul MG nu a fost detectat n aceast prob . Con inutul maxim de OMG prev zut de legisla ia european este de 0,9 %.

V MULTUMESC PENTRU ATEN IE!