Presentazione standard di PowerPoint - UniFI

BACTERIA - General characteristics I Bacteria are microrganisms classified as prokaryotes, i.e. their nuclear material is not separated from the cytoplasm by a nuclear membrane and there is no mitotic apparatus. Most of the genetic information in a bacterial cell is carried on a single chromosome with double-stranded DNA in a closed circular form. In addition, some bacterial cells contain extrachromosomal DNA as plasmids. These are circles of DNA which replicate independently of the chromosomes and are important for several reasons. Genetic material relating to pathogenicity, tumour formation and resistance to chemicals such as antibiotics may be located on the plasmids; plasmids can pass from one bacterial cell to another with ease.

BACTERIA - General characteristics II Bacterial cells have either no organelles or poorly developed organelles, unlike eukaryotic cells of plants and animals. Almost all bacteria are unicellular and one of three shapes; round (coccus, spherical or ovoid); rods (cylinders) or spirals (helices). All plant pathogenic bacteria are rod-shaped, 0.5-3.5 μm in length and 0.3-1.0 μm in diameter. About 200 out of the total 1600 known bacterial species are recognized as plant pathogens. Most of the remaining species are beneficial to man as saprophytic decomposers although some important bacteria are pathogenic to man and other animals.

What about bacteria in Plant Pathology ?

Most of the plant pathogenic bacteria are either Gram-positive, in the Phylum

Actinobacteria, or Gram-negative, in the Phylum Proteobacteria.

Gram-positive and Gram-negative cells appear purple or red, respectively, with

specific stains. The different colors largely reflect differences in stain retention

by the respective cell walls of the bacteria during the staining process.

Gram negative vs Gram positive

Plant- Bacteria relationships and interactions

Plant- Bacteria relationships and interactions

BACTERIA

Epiphytes vs endophytes

I batteri, anche fitopatogeni, che colonizzano le superfici esterne di una pianta

sono definiti epifiti, ma la loro presenza non necessariamente implica che si

svilupperà la malattia, poiché questo evento dipende da una serie di fattori tra

cui la combinazione ospite-patogeno, le condizioni climatico-ambientali, le

condizioni fisiologiche del potenziale ospite, la entità della popolazione del

patogeno e la contemporanea presenza di microflora con le sue specifiche

attività, quali produzione di siderofori, il rilascio di antibiotici e la competizione

per i nutrienti.

Agli epifiti si contrappongono i cosiddetti endofiti, ovvero i batteri che vivono

dentro la pianta, come residenti o in maniera transiente. Anche in questo caso la

condizione di endofitismo non coincide con lo sviluppo della malattia anche se

è ovvio che, rispetto agli epifiti, gli endofiti non hanno bisogno di penetrare

l’ospite.

BACTERIAL PHYTOPATHOGENS PLANTS


Agrobacterium

Arthrobacter

Erwinia

Clavibacter

Pseudomonas

Curtobacterium

Ralstonia

Rhodococcus

Xanthomonas

Streptomyces

Xylella

Bacteria as phytopathogens, plant symbiont and

special wall less bacteria…phytoplasmas


….. with some exceptions….

Some exceptions? those living into vascular tissues, such as Xylella fastidiosa or Phytoplasmas in general

Plant pathogenic bacteria

DISSEMINATION & ENTRY





or injected by several VECTORS….

mainly INSECTS


ENTRY

Plant pathogenic bacteria:

The Symptoms SHOW!!!

Bacterial hyperplastic GALLS or KNOTS

Bacterial hyperplastic GALLS or KNOTS

And now, bacterial WILTS

As an example, several

Ralstonia solanacearum su Pomodoro

And now, bacterial leaves SPOTS

Bacterial blight, cankers, necrosis….

ISOLATION in vitro as a pure culture…

useful for fullfilling Koch’s postulates as well!!!

“Evidence gathered from crime scene”

Bacterial identification by PFLAs

Bacterial identification by several DNA fingerprinting methods

MOLECULAR DIAGNOSTIC IN PLANT PATHOLOGY

Schaad et al. (2002)

Real-time polymerase chain reaction for

one-hour on-site diagnosis of Pierce’s

disease of grape in early season

asymptomatic vines

Phytopathology 92: 721-728

FROM MOLECULAR DIAGNOSTIC to DISEASE CONTROL!!!

…LE OMICHE…

Let’s begin with some characteristic and informative examples

Agrobacterium

Arthrobacter

Erwinia

Clavibacter

Pseudomonas

Curtobacterium

Ralstonia

Rhodococcus

Xanthomonas

Streptomyces

Xylella

Genere Agrobacterium

Agrobacterium agile, Agrobacterium albertimagni,

Agrobacterium aurantiacum, Agrobacterium

larrymoorei, Agrobacterium radiobacter,

Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium rubi,

Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium

vitis....

Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium rhizogenes

Agrobacterium radiobacter


Gram-negativo

non sporulante

mobile per 1-6 flagelli peritrichi

morfologia “a bastoncello”

strettamente correlato al genere Rhizobium 3 biovar....2 + A. vitis


Batterio iperplastico

agente del “tumore del colletto”

o

“crown gall disease”

POMODORO CAROTA

ROSA

VITE



ALCUNI DEGLI OSPITI DI Agrobacterium tumefaciens……..

Abies, Acer, Aesculus, Alnus, Anthirrhinum, Araucaria, Arbutus,

Asparagus, Aster, Begonia, Beta, Brassica, Calendula, Calycanthus,

Cannabis, Carnegiea, Carya, Castanea, Cedrus, Celtis, Chrysanthemum,

Cichorium, Citrullus, Citrus, Clematis, Cornus, Corylus, Crataegus, Cucumis,

Cupressus, Cydonia, Dahlia, Daphne, Datura, Daucus, Dianthus, Diospyros,

Eucalyptus, Ficus, Forsythia, Fraxinus, Fuchsia, Gardenia, Geranium,

Glaeditschia, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hibiscus, Humulus,

Hydrangea, Kalanchoe, Impatiens, Juglans, Juniperus, Larix, Lathyrus,

Ligustrum, Lonicera, Lycopersicum, Maclura, Malus, Malva, Matthiola,

Medicago, Morus, Nerium, Nicotiana, Olea, Opuntia, Oxalis,

Parthenocissus, Passiflora, Pastinaca, Pelargonium, Persea, Petunia,

Phaseolus, Philodendron, Pinus, Pisum, Populus, Primula, Prunus,

Pseudotsuga, Pyrus, Raphanus, Reseda, Rheum, Ricinus, Rosa, Rubus,

Rumex, Saintpaulia, Salix, Salvia, Sequoia, Solanum, Sorbus, Syringa,

Taraxacum, Taxus, Thuja, Trifolium, Tropaeolum, Ulmus, Vaccinium,

Verbena, Viburnum, Vinca, Vitis, Wistaria.


Batterio iperplastico

agente del “tumore del colletto”

o

“crown gall disease”

Agrobacterium tumefaciens:

From Plant Pathology to Biotechnology

Edited by Eugene Nester, Milton P. Gordon, and Allen Kerr

APS Press October 2004

“Crown gall” o tumore del colletto

A. tumefaciens

=

“ingegnere genetico naturale”

A. tumefaciens ceppo C58

Organizzazione del genoma cromosomi 2,0 Mb, lineare 2,8 Mb circolare plasmide 206,479 kbp

PLASMIDE Ti............”Tumor inducing”......

I geni responsabili della formazione del tumore sono per lo più localizzati sul plasmide Ti.

N.B. Se in vitro A. tumefaciens è incubato alla temperatura di 30°C, il plasmide viene perduto, con la capacità del batterio di causare sintomi.

PLASMIDE Ti

T-DNA = “transferred DNA”

Noc = geni per il catabolismo della nopalina

Ori = origine di replicazione del plasmide

Con = regione per il trasferimento coniugativo del plasmide ad altri ceppi

Acc = geni per il catabolismo delle agrocinopine

tzs = geni per la sintesi della transzeatina

Vir = geni associati alla virulenza

PLASMIDE Ti ll plasmide Ti è coniugativo, ovvero può essere trasferito da cellula a cellula sotto

il controllo della regione Con.

In laboratorio, il trasferimento coniugativo è fortemente promosso dalla presenza di nopalina....segreto svelato nella lezione su Quorum Sensing....

Hp: in natura la nopalina prodotta a livello del sito di infezione promuoverebbe il trasferimento del plasmide dai ceppi patogeni a quelli non patogeni presenti nella rizosfera, che in genere sono circa il 90% dei ceppi presenti......e non solo.....vedere ancora QS......

PLASMIDE Ti

Agrobacterium tumefaciens L’”attacco” è a livello delle ferite fresche......attrazione chemiotattica.....

es. acetosiringone (concentrazioni 10-7 M)

A concentrazioni 10-5 - 10-4 M, l’acetosiringone provoca l’attivazione dei geni vir

Arabidopsis thaliana VirE2 Interacting Protein 1 (AtVIP1) si associa al complesso T tramite VirE2 facendo da tramite con gli istoni della cromatina dell’ospite AtVIP1 interagisce con istoni in vivo e in planta.

Basic steps in the transformation of plant cells by Agrobacterium tumefaciens

SUMMARY

•Amino acids, organic acids and sugars released from

wounded plant cells act as chemoattractants to A.t

• Autophosphorylation of the transmembrane receptor

VirA

• Activated VirA transfers its phospate to the cytoplamic

VirG

• VirG binds to the box enhancer elements in the

promoters of the virA, virB, virC, virD, virE and virG

operons, upregulating their transcription

• VirD1 and VirD2 proteins permit the synthesis of a single

strand DNA corresponding to the T-DNA

• VirD2 remains covalently linked to the T-DNA (in „5),

coated by VirE2 protein

• T-DNA + Vir proteins exported by type IV secretion

system encoded by the virB operon and by virD4

Assembly of T-pili in A. tumefaciens. (a) A model for T-pilus assembly in A. tumefaciens

showing the proposed VirB4–VirB8–VirB5–VirB2 interaction sequence leading to the

formation of VirB2–VirB5 complexes followed by T-pilus assembly [39]. (b)

Transmission electron microscopic image showing T-pili and flagella on A. tumefaciens

SISTEMA DI SECREZIONE DI TIPO IV

… in altri batteri patogeni

SISTEMA DI SECREZIONE DI TIPO IV

… in altri batteri patogeni

OPERONE virB TraG

Is TFSS just working for disease?

Genetic organization of the vir gene cluster

on the symbiosis island of Mesorhizobium loti strain R7A

(The locations of various vir gene mutants are indicated by arrows)

Molecular Microbiology (2004) 54, 561-574

Comparison of C-terminal amino acids of putative effector proteins Msi059

and Msi061 and of three translocated effector proteins of A. tumefaciens

strain 15955. Amino acids conserved between the two putative M. loti effector

proteins are shown in bold as are matching residues in the A. tumefaciens

proteins. Accession numbers for VirE2, VirE3 and VirF are CAC15175,

CAC15176 and CAC15183 respectively.

Molecular Microbiology 54 (2), 561-574





Genome: Unlocking Biology's Storehouse

5 October 2001 Volume 294 Number 5540

Special Issue:

Genomics

The Agrobacterium Genome

14 December 2001

Volume 294

Number 5550

The Genome of the Natural Genetic Engineer Agrobacterium tumefaciens C58

Wood et al., (2001) Science 294: 2317-2323

The C58 genome project, initiated in August of 1999, includes:

•The University of Washington Genome Center

•The Bioinformatics laboratory at the University of Campinas (Brazil)

•The Institute for Genomic Research

•SRI International

•The E.I. du Pont de Nemours company

•Pioneer Hi-Bred International

•The University of Washington's Crown Gall group

Agrobacterium tumefaciens C58 Cereon

Cereon Genomics/University of Richmond

Goodner et al., (2001), Science 294: 2323-2328

Cereon Microbial Sequence Database

Cereon Genomics was created in November 1997

as a wholly-owned subsidiary of Monsanto

Esempio di produzione di pianta transgenica resistente al virus del mosaico del tabacco

Esempio di produzione di pianta transgenica resistente al virus del mosaico del tabacco

Organismi geneticamente modificati (OGM)

PIANTE

es. per resistenza a erbicidi

es. per resistenza a stress abiotici

es. per resistenza a virus, batteri, funghi

Some commercial releases of transgenic plants (from Birch, 1997)

Crop and release date

Name Company Novel properties

Tomato (1994) Flavr Savr Calgene Vine-ripened flavour, shelf life

Tomato (1995) Zeneca Consistency of tomato paste

Cotton Potato

Maize (1996-97)

Bollgard NewLeaf

YieldGuard

Monsanto

Bacillus thuringiensis toxin

for insect resistance

Soybean Canola (rape) Cotton (1995-

96)

Roundup Ready Monsanto Glyphosate herbicide

resistance

Il primo biotecnologo!!!!

A. tumefaciens può trasferire qualunque DNA, anche estraneo inserito tra

i due “border repeats” (25 pb ciascuno), che fiancheggiano il T-DNA....

• T-DNA “ingegnerizzato”:

• rimossi i geni per la sintesi di fitormoni

• inserito un marker di selezione (es. gene per resistenza a kanamicina)

La trasformazione della pianta richiede:

Agrobacterium quale veicolo del plasmide trasformante

un plasmide Ti in cui siano funzionanti i geni vir, per il riconoscimento dei

segnali provenienti dalla pianta e per l’excisione del T-DNA

T-DNA ingegnerizzato”

NB il T-DNA non necessita does di essere sullo stesso plasmide dei geni

vir plasmide Ti "disarmato” e vettori binari

http://www.agriculture.purdue.edu/agbiotech

Prima di tutto………………………….





AGROBACTERIUM RADIOBACTER CEPPO K84

INOCULO PER PIANTE FRUTTIFERE E ORNAMENTALI ANTAGONISTA DI

AGROBATTERI TUMORIGENI

Saggio di inibizione da A. radiobacter ceppo K84, inoculato al centro della

piastra e cresciuto per 24 h prima di essere ucciso con vapori di cloroformio.

Sulla coltura e’ stato versato successivamente uno strato di “soft agar”

contenente A. tumefaciens (“overlay plate technique”).

NOTARE: la crescita di A. tumefaciens è inibita all’intorno della colonia di A. radiobacter ceppo K84.

Specificità dell’agente di biocontrollo A. radiobacter ceppo K84

Piante di Pomodoro dopo 3 settimane dall’inoculazione con: A) A. tumefaciens B) A. tumefaciens in miscela 1:1 con A. radiobacter ceppo K84

A.t. 529 e T57: plasmide Ti per produzione nopalina A.t. 8150 e 502: plasmide Ti per produzione altre opine

A

B

Meccanismo di azione dell’agrocina 84

Ceppi patogeni di A. tumefaciens con plasmidi Ti codificanti per la sintesi di nopalina sono in grado di indurre la pianta a produrre anche agrocinopine, che possono entrare nella cellula batterica tramite un’ ”agrocinopina-permeasi” sempre codificata a livello plasmidico e inserita nella mebrana batterica. L’agrocina 84 di A. radiobacter è riconosciuta da questa permeasi, entra nella cellula e blocca la sintesi di DNA, portando la cellula a morte.

Meccanismo di azione dell’agrocina 84: sintesi macromolecole

Meccanismo di azione dell’agrocina 84: su DNA

LE “STRATEGIE” DI A. radiobacter

A. radiobacter K84 contiene il plasmide pAgK84, che codifica per la

produzione di agrocina 84.

Inoltre contiene anche il plasmide pNOC, che codifica per l’ “uptake”

e il catabolismo della nopalina

Quindi in natura A. radiobacter K84 prolifera a livello del tumore

indotto da A tumefaciens, sottraendogli nutrienti (= nopalina) e

uccidendo il patogeno con l’agrocina 84.

Peraltro A. radiobacter K84 è un efficiente colonizzatore delle

radici di piante sane e delle ferite, conferendo una protezione

persistente anche dopo l’applicazione

PNAS June 6, 2006 vol. 103 no. 23

Agrocina 84: geni per biosintesi e immunità su pAgK84 (45 kb) pAgK84 può essere trasferito per coniugazione a: Agrobacterium spp. Rhizobium spp. Sinorhizobium spp. conferendo loro la capacità di produrre Agrocina 84 pAgBo542, in stretta relazione con pAgK84, identificato in un ceppo selvaggio di A.t. in Germania…. … pAgK84 trasmissibile e diffusibile…… - Geni per sintesi/immunità in 5 gruppi di complementazione su un contiguo di 15 kb - Replicazione e trasferimento: 8 kb

PNAS June 6, 2006 vol. 103 no. 23

Agrobacterium radiobacter ceppo K1026

Pesticida microbico per la lotta al “crown gall disease”.

Approvato dall’EPA nel 2001 per l’utilizzazione in serre e vivai.

Sulla base delle informazioni disponibili, il suo uso non presenta

effetti avversi ne’ per la salute umana ne’ per l’ambiente

J Clin Microbiol. 1993 September; 31(9): 2541–2543.

Recovery of a strain of Agrobacterium radiobacter with a mucoid phenotype from an immunocompromised child with bacteremia.

W M Dunne, Jr, J Tillman, and J C Murray

http://www.epa.gov/


è stato il PRIMO microrganismo geneticamente modificato rilasciato nell’ambiente e per uso diffuso

(Allan Kerr, in Australia, dal 1973 è commercializzato con vari nomi es. "Galltrol")

Deriva da A. radiobacter ceppo K84, ubiquitario nei suoli e nella rizosfera. I due ceppi sono identici salvo per…… In A radiobacter ceppo K1026 è stata operata la rimozione di un frammento di DNA che previene il trasferimento a A. tumefaciens del plasmide codificante per l’agrocinopina 84.

http://www.epa.gov/


Applicato su: semi (mandorlo, albicocco, ciliegio, susino, noce, etc)

radici e fusti (mandorlo, albicocco, sambuco, ciliegio,

pesco, susino, noce, e anche ornamentali

quali evonimo e rose)

barbatelle/”cuttings” (mandorlo, albicocco, sambuco,

ciliegio, pesco, susino, noce, e

anche ornamentali quali evonimo

e rose)

http://www.epa.gov/


Fitopatogeni “bersaglio”: A. tumefaciens e A. rhizogenes.

Trattamento: il prodotto è miscelato con acqua a dare una

soluzione, nella quale sono immersi semi, radici, fusti, o che

puo’ essere utilizzata per trattamenti diretti su pianta

http://www.epa.gov/

Agrobacterium radiobacter strain K1026

Registration Number Product Name

062388-00001 NOGALL

Agrobacterium radiobacter strain K1026 (006474) Technical Document

http://www.epa.gov/pesticides/biopesticides/ingredients/tech_docs/tech_006474.htm

Company number Company Name Address

062388 BIO-CARE

TECHNOLOGY PTY.

LTD.

RMB 1084

PACIFIC

HIGHWAY

SOMERSBY, NSW

2250, AUSTRALIA

http://www.epa.gov/pesticides/biopesticides/ingredients/tech_docs/tech_006474.htm

http://www.epa.gov/

APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, May 1999, p. 1936–1940

Il ceppo K84 è stato dimostrato un ottimo colonizzatore dei sistemi radicali degli

ospiti Popolazioni di un mutante di K84 Rif-R e Stp-Rr mantenute nella rizosfera di piante di ciliegio

fino a 2 anni

Colonizzazione e persistenza essenziali nel biocontrollo da K84

Il ceppo K84 produce altre due sostanze antibiotiche * agrocina 434 * antibiotico ALS84

- Geni per agrocina 434 su plasmide pAgK434 - Agrocina 434 efficace solo su A.t. biovar 2 - Geni per ALS84 su cromosoma batterico - ALS84 efficace su tutte le biovar di A.t - Attività inibitoria di ALS84: per produzione di siderofori





L’introduzione di formulati commerciali a base di microrganismi

antagonisti ha sicuramente fornito uno strumento utile per molte

problematiche legate alla difesa delle colture orticole e floricole

in agricoltura biologica.

vantaggi di natura ambientale

sicurezza per l’operatore e il consumatore

aspetti negativi intrinseci ai pesticidi (es. riduzione di

efficacia, fenomeni di resistenza e ridotta selettività, etc)

L’eventuale impiego di formulati commerciali contenenti tali

microrganismi in strategie di lotta integrata con mezzi chimici,

non può prescindere dalla conoscenza della loro sensibilità ai

prodotti di sintesi di possibile utilizzazione sulle colture alle quali

sono destinati.

……….

Tabelle di compatibilità

SILENZIAMENTO GENICO

scoperto per studi su OGM

oggi utilizzato anche per terapia del cancro

DNA

TRENDS in Plant Science vol.8 No.8 August 2003

A. rhizogenes

induzione formazione di radici avventizie (“hairy root”)

Trasferimento di un frammento di DNA (T-DNA) dal plasmide Ri

Il T-DNA di A. rhizogenes, di cui si conosce la sequenza nucleotidica, è

composto di 18 “open reading frames” (= ORFs), cioè presumibilmente di 18

differenti funzioni geniche.

Il fenotipo “hairy root” può essere indotto trasferendo nella pianta solo tre

dei 18 geni presenti nel T-DNA, in particolare le ORF 10,11,12,

rispettivamente indicate come geni rol A.B,C (rol= “root locus”)

http://www.rootec.com

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