ire/,, So(. Cat. Biol., Vol , 40 (1989) 47-70

POTENCIAL BIOTECNOLOGIC DEL CULTIU DE CEL•LULESVEGETALS PER A L'OBTENCIO DE PRODUCTES FARMACEUTICS

CARLES CODINA, FRANCESC VILADOMAT, JAUME BASTIDAl JOSEP MANEL LLABRES

Departament de Fisiologia Vegetal. Facultat de Farmacia.L'nirersitat de Barcelona.

Rebut 17 goner 1986

SUMMIART

Plants produce a peculiar group of natural products, particular to the plant kingdom, thesecondary metabolites, which are very numerous and structurally diverse. Provided that plant cellscan grow "in vitro", their culture offers the possibility of producing some of these compounds ofpharmaceutical interest in large quantities. Alkaloids, steroids, cardiotonic glycosides, quinonesand terpens, for example. are produced by either cell suspension cultures or immobilized cells;somctines at a higher rate than in the whole plant. These systems are also used to yield severalsubstances by means of a given biotransformation reaction which cannot be achieved in any otherway. The use of cell cultures in pharmaceutical industry is just one of the many sides of plantbiotechnology, which is proving to become an indispensable technique soon in the future.

INTRODUCCIO

Les plantes superiors, a mes de consti-tuir una font abundant de productes natu-rals indispensables per ]'home. corn araadditius alimentaris, fustes, fibres i olis,son tambe els productors mes importantsde productes farmaceutics i de materialsde diagnosi. Aixo no obstant, l'augment de

les dificultats per a aconseguir un submi-nistrament eficac de plantes medicinals,degut en molts casos a la seva localitzaciogeografica, al baix rendiment del principiactiu, subjecte a variacions estacionals, ala drastica disminucio dels recursos vege-tals corn a consequencia del trastocamentde I'entorn natural per part de ]'home, i a]'augment dels problemes tecnics i/o

48 (ARLES CODLVA. FR1NCESC' l7LADO,ifAT. JAL'ME BASTIDA I JOSEP .MANEL LL.1 BRES

TAULA IEnzims del metabolisme secundari aillats i purificats a partir de cultius de cel • lules vegetals

En_im Font Reterrncia

cafeoil-Coa: quinat cafeoil transferasa Stevia rebaudiana 202

calcona isomerasa Phaseolus vulgaris 45

calcona sintasa Petroselinum hortense 98

cinamoil CoA reductasa i cinamil alcohol:NADP' deshidrogenasa Glvcine max 112

fenilalanina amoni liasa Petroselinum hortense 225

hidroxicinamoil CoA ligasa Petroselinum hortense 92

strictosidina glucosidasa Catharanthus roseus 75

strictosidina sintasa Catharanthus roseus 198

economics en el conreu de les plantes sil-vestres, ha induit nombrosos laboratoris autilitzar d'altres fonts alternatives a la pro-duccio agricola, essent una d'elles el cultiu

de teixits i cel•lules en suspensio d'origen

vegetal (35).La metodologia dels cultius de cel•lules

vegetals actualment s'esta desenvolupant aun nivell que permet considerar seriosa-

ment llur potencial per 1'aplicaci6 biotec-

nologica i la produccio farmaceutica, i sonnombrosos els treballs que s'han publicat

al respecte (4, 13, 17, 21, 37, 56, 58, 116,

166, 167, 194), alguns dels quals han mos-trat que un ampli espectre de models ci-

tologics i bioquimics de diferenciacio po-

den expressar-se a nivell de cel • lules indife-renciades en cultius en suspensio (218,219).

D'entre les principals avantatges que

ofereixen els sistemes de cultius de cel.lu-

les vegetals respecte als cultius convencio-

nals de plantes senceres , poden destacar-

se: 1) la produccio dels compostos d'inte-

res medicinal sota condicions ambientals

controlades, i per tant reproduibles, inde-

pendentment dels canvis climatics i esta-

cionals o de les conditions del sol ; 2) l'a-

septicitat d'aquests sistemes experimen-

tals, Mures de microorganismes i/o insec-

tes; 3 ) la facil multiplicacio de les cel•lules

de qualsevol tipus de planta, tropical o

alpina , per produir els seus metabolits es-

pecifics, i 4) la reduccio del cost i augment

de la productivitat deguts al control auto-

matitzat del creixement cel•lular i a la re-

gulacio racional dels processos metabolics

(184).

Degut a aquestes avantatges , durant la

darrera decada han estat estudiades les ca-

pacitats biosintetiques de diversos cultius

de cel • lules i teixits vegetals , tot obtenint-

se uns resultats que si be no son sempre

satisfactoris quant als nivells de productes

obtinguts, ofereixen una possibilitat unica

per a la detecci6 de nous compostos d'inte-

res medicinal no trobats anteriorment en

les plantes intactes , alguns dels quals es

podran produir en un futur proxim a nivell

industrial (59. 70, 74, 104, 138, 158). Aixi

mateix, aquests sistemes experimentals

tambe son de gran utilitat a l'hora d'efec-

tuar estudis metabolics , ja que s'evita la

possible manca d'uniformitat entre els in-

dividus quan les experiencies es realitzen

amb plantes senceres (52, 102, 177). A

mes, amb aquesta metodologia son diver-

sos els enzims aillats fins ara implicats en

la biosintesi de diferents grups de metabo-

lits secundaris (taula i ).

Es ben sabut que els microorganismes

han permes la produccio a gran escala de

POIENCIAL BIOTECNOLOGIC DEL CL LTIC DE CEL-LLLES VEGETALSPER.4 L'OBTENCIO DE PRODI'CTES E4RAfACEL TICS 49

productes farmaceutics i d'altres productesnaturals d'interes. No obstant aixo, les in-vestigacions dels darrers anys mitjancantcultius de cel • lules vegetals han posat derelleu les diferencies fonamentals entreaquests cultius i els microbians , les qualsradiquen en el creixement molt mes rapiddels microorganismes i en medis de cultiumenys costosos , la menor sensibilitat d'a-quests essers vius at stress de cisallamentproduIt pets sistemes de fermentaci6 d'agi-taci6 mecanica , i la major facilitat per laselecci6 de les soques interessants (200).

Considerant aquests factors , i en vistade la gran eficacia biotecnoldgica basadaen tongs i bacteris, aixi com del paperdecisiu que els factors economics juguenen tot proces industrial (57, 69), els cultiusde cel•lules vegetals tan sots poden ser co-mercialment competitius quan s'utilitzinper a la producci6 de compostos especificsd'origen vegetal els quals no es poden ob-tenir per altres procediments ( 90, 129). Peraixo, els cultius de cel • lules vegetals deu-rien aplicar-se en algun dels seguents as-pectes: 1) per a la producci6 de productesnaturals d'interes medicinal si el cultiu cel-lular proporciona una quantitat significati-vament major que la planta intacta, o be sino es disposa de suficient quantitat de ma-terial vegetal ; 2) per a la producci6 deconstituents vegetals interessants per bio-transformaciO a partir de precursors debaix cost els quals no poden ser eficacmenttransformats per metodes quimics o mi-crobians: 3 ) per a la producci6 de nouscompostos , com ara intermediaris biosin-tetics, si mostren noves propietats biol6gi-ques, i 4) per a la produccio de compostosvegetals especifics, com ara enzims o lecti-nes, que tan sols poden aillar-se a partir decel•lules vives i no de material vegetal in-tacte.

D'altra banda, el cultiu de teixits, em-prat ja des de fa una trentena d'anys ambla finalitat d'aplicar-ho a la producci6 desubstancies medicinals ( 29, 31), actual-

ment esta augmentant en importancia comun instrument per a la propagaci6 a granescala de plantes individuals previamentseleccionades, la recuperaci6 a gran escalade plantes individuals previament selec-cionades, la recuperaci6 de plantes exemp-tes de malalties especifiques, i la producci6d'hibrids somatics (11). Aixi, la recercasobre la formaci6 de protoplasts, la recupe-raci6 de cel•lules vegetals haploides, i Ilurmanipulacid genetica son, juntament ambla producci6 de substancies d'interes me-dicinal, arees fructiferes en l'aplicacid delcultiu de teixits i cel•lules en suspen-sid (68).En el present treball s'ha estimat mes

adient exposar alguns temes de recent ac-tualitat, com ara la producci6 de metabd-lits secundaris mitjancant cel•lules immo-bilitzades, o la biotransformacid de subs-trats en compostos d'interes medicinal encultius de cel•lules en suspens16, entre d'al-tres, en detriment de la descripcid, per raOde la seva extensi6, dell factors tant ex-terns (llum, temperatura, condicions nutri-tives, fitohormones, etc.) com interns (es-tats de desenvolupament i diferenciaciO,estabilitat genetica, etc.), que influeixen enla produccio i/o acumulaci6 de consti-tuents secundaris en aquests sistemes ex-perimentals, descrits prou ampliament endiverses publicacions (18, 54, 67, 72, 117,142, 157).

ALGUNS ASPECTES DE LATECNICA DEL CULTIU DECEL•LULES

El primer pas en 1'establiment dels cul-tius de cel•lules vegetals es I'obtenciO delscultius de call en un medi nutritiu solid, elqual cal que contingui tots els nutrientsessencials per tal de mantenir el creixe-ment i la divisid cel•lulars, necessitats quepoden variar substancialment d'una espe-cie a una altra.

50 (•IRLLS CODI1, FRI:y(I.S( I/1..MDOSI.IT,JIt.1ILBISIIDI1JOSLP 11IvF LI_1IIRL.

Un call es caracteritza per ser una asso-

ciaci6 mes o menys lliure de cel • lules en la

qual no s'observa teixit diferenciat, pero

degut fonamentalment at sell creixement

lent, la naturalesa relativament homogenia

de les cel • lules cultivades i la possible for-

maci6 de centres de diferenciacio , com ara

traqueides , aquests cultius no poden ser

utilitzats directament amb finalitats bio-

tecnologiques (91, 217). Aixo no obstant,

tambe han estat descrits nombrosos tre-

balls amb cultius de call respecte a 1'a-

cumulaci6 de constituents vegetals molt

diversos com , per exemple, acids

grasos ( 164), alcaloides ( 136), amino-

acids ( 1 10), diosgenina (165), L-DOPA

(22), ginsenosids ( 64), glicirricina (1 90),

oils volatils ( 39), proteines ( 138), etc. Tots

aquests compostos son d'us medicinal i/o

farmaceutic , encara que la produccio,

igualment mitjancant la tecnica del cultiu

de teixits , d'insenticides, condiments, per-

fums i agents colorants , tambe han estat

objecte d'una atencio especial.

Els cultius de cel•lules en suspensio re-

presenten 1'aplicaci6 biotecnol6gica mes

avantatjosa dels cultius cel • lulars d'origen

vegetal . Consisteixen en cel • lules aillades,

o petits agregats de 2 a 20 cel • lules, que

poden considerar- se relativament homoge-

nies respecte at creixement i a la diferen-

ciacio, havent-se comprovat , a mes, que

son les millors adaptades tant per la selec-

ci6 de cel•lules de rapid creixement com

per 1'expressi6 de diversos programes de

diferenciacio bioquimica ( ex: acumulacio

de pigments , formaci6 d ' enzims , etc.).

Les cel • lules vegetals , en comparaci6

amb la majoria de microorganismes, re-

quereixen un medi de creixement mes

complexe , en el qual , a mes d'altres sals

inorganiques i elements traca, i l'adminis-

traci6 del nitrogen en forma d ' ions nitrat i

amoni , rutinariament se suministren tres

vitamines: tiamina , piridoxina i acid nico-

tinic, encara que la seva necessitat absolu-

ta tan sols ha estat comprovada en alguns

casos. D'altra banda, quant a la font prin-

cipal de carboni i energia, la qual general-

ment consisteix en un 2-3 % de sacarosa,

glucosa o fructosa, tambe ban estat em-

prats amb exit pel creixement de cultius

cel•lulars d'altres sucres, com ara la malto-

sa, trealosa, rafinosa o estaquiosa, i fns i

tot s'han assajat substrats mes barats com,

per exemple, molases o d'altres residus del

processament de la bledarave o de la canya

de sucre (187).

Aixo no obstant, per tat d'aconseguir

una adequada combinacio de maxim crei-

xement i optima expressi6 de models par-

ticulars de diferenciacio citologics o bio-

quimics, dos tipus de fitohormones, fona-

mentalment auxines i citoquinines, son de

gran importancia per als cultius en suspen-

sio de cel•lules vegetals, si be no n'han

establert normes definitives quant a la

composicio qualitativa i quantitativa en

que han d'esser presents en el medi. Degut

a que la promoc16 de creixement i 1'acu-

mulaci6 de productes secundaris poden re-

querir diferents dosis de fitohormones, al-

guns autors suggereixen de fer creixer pre-

viament la biomassa necessaria en un

medi de creixement apropiat i transferir

despres les cel•lules a un medi diferent per

tat de provocar la maxima acumulacio del

producte (220, 223).En l'actualitat, doncs, es poden dur a

terme cultius de cel•lules vegetals en sus-

pensio que mostrin un ampli espectre de

models de diferenciacio citologics i bioqui-

mics. i que puguin cultivar-se en serie en

medis standard completament definits,

amb una gran probabilitat d'exit.

D'altra banda, per tat que un cultiu de

cel•lules vegetals en suspensio assoleixi un

nivell de produccio biotecnologicament

rendible, cal augmentar at maxim la velo-

citat de biosintesi en la poblaci6 de cel.lu-

les cultivades, molt heterogenies respecte

a] metabolisms secundari. Amb aquesta fi-

nalitat, previament s'ha d'obtenir una po-

blaci6 de cel•lules de gran capacitat biosin-

POT7,9N7.IL B/OTF__CNOLOGIC DEL CULTIU DE CELLULES i'7.Y;ET4LSPER A L'OB7'ENCIO DE PRODUCTES FARA7A(,F.UT/CS 51

tetica mitjancant un programa de selecci6eficac el qual deu complir, segons Tabata icol. (185), les seguents condicions: a) granvariabilitat en la poblaci6 cellular inicialper tal de disposar d'un bon material departida per a la seleccio; b) utilitzaci6 delclonatge de cel•lules individuals mitjan-cant plaques com a metode d'aillament, ic) utilitzacio d'un metode senzill, i alhorasensible, de "screening" per tal de detectarels productes secundaris en els diferentsdons.

Aixi, la primera etapa d'aquest procedi-ment seguit en alguns laboratoris consis-teix en seleccionar plantes altament pro-ductives d'entre una poblacio d'individusd'una mateixa especie, ja que es pot trobaruna gran diversitat quan a l'acumulaci6 deconstituents secundaris. Amb I'inici delscultius de call a partir d'aquestes plantes esd'esperar que els factors genetics, respon-sables en la planta intacta d'aquesta granproductivitat, es preservaran en el cultiucellular i influenciaran acumulant els me-tab6lits secundaris en una gran proporci6.L'estudi comparatiu dels resultats fins araobtinguts demostren que aquesta estrate-gia d6na com a resultat una major proba-bilitat de trobar una coca de cel•lules ambun gran contingut de productes secundaris(147, 222).

Els cultius de cel•lules en suspensi6 deri-vats d'aquestes soques de gran productivi-tat, via cultiu de call, es depositen damuntdiscs d'agar en un medi adequat i poste-riorment s'analitzen les microcol6nies ocalls desenrotllats respecte a llur contingutde compost secundari. D'aquesta maneraes poden seleccionar aquelles soques alta-ment productives i de rapid creixement lesquals posteriorment seran utilitzades perl'establiment dels cultius de cel•lules ensuspensi6 (213). Aquest tipus de metodo-logia ha estar aplicat amb exit durant laselccci6 de soques de Lithosperinum e/.rth-rorhizon 1 Nicotiana tabacuin de gran pro-ductivitat en shikonina i nicotina, respec-

tivament (185), i en el cas dels alcaloidesserpentina i ajmalicina en Catharanthusroseus (222, 223).

L'eficacia d'aquest proces de selecci6 de-pen en gran mesura de la sensibilitat irapidesa del metode analitic aplicat per adeterminar el metab6lit secundari. Enaquest sentit, el radioimmunoassaig esconsiderat actualment el metode mes pre-cis i sensible, ates que un gran nombre demostres es poden analitzar quantitativa-ment a nivell de nano- i picomol de formatotalment automatitzada (106, 127, 145,207, 209). No obstant aix6, tambe podenaplicar-se d'altres metodes alternatius, en-cara que mes molestos, especialment quans'han d'analitzar mescles de compostos du-rant un proces de seleccio de soques decultius cel•lulars. Un exemple d'aix6 elconstitueix I'anomenat "cell squash met-hod", procediment molt versatil i econ6-mic descrit per Tabata i col. (185) i consis-tent en pressionar el material soluble pro-vinent de petits fragments de call entrelamines de paper de filtre, les quals poste-riorment poden ser ruixades amb reactiusespecifics per tal de detectar la presenciade metab6lits secundaris (ex: reactiu deDragendorff per alcaloides). Aquest meto-de, encara que tan sols dona una estimaci6aproximada del contingut del producte se-cundari dels calls, s'ha comprovat que essuficientment segur, per exemple, pel"screening" de calls de Nicotiana tabacumaltament productius en nicotina (130).Un requeriment previ per l'aplJcac16

biotecnol6gica dels cultius en suspensi6 decel•lules vegetals es aconseguir una granestabilitat de les soques quant al creixe-ment 1 a la capacitat de biosintesi. Aixi,mentre que el creixement ha estat conside-rat fins ara com un factor molt estable,s'ha observat una marcada variabilitat res-pecte al potencial bioquimic per acumularcompostos secundaris• desconeixent-se demoment les causes d'aquesta inestabilitatbioquimica (42).

52 C.iRLLS COUIN 1, FR.9.M1'CE;SC {'tL 1DOi/.97, J.I L'.1tF, B.IS77D.1 l JOSI'P .t1AA'Ft_ LL.1BRI:S

TAULA 2Exemples de productes naturals aillats de cultius de call

Compost Classe de compost Planta Rendiment(% PS)

Relcrcncto

shikonina naftoquinona Lithospermum ervthrorhi:on 12,0 184

solasonina alcaloide Solanum laciniatum 3,3 223

glicirricina saponina Glvcvrrhi:a glabra 3,0 190

cafeina purina Coffea arabica 1,6 61

paniculida C sesquiterpc Andrographis paniculata 0,9 28

efedrina fenetilamina Ephedra gerardiana 0,6 140

visnagina furocrom Ammi visnaga 03 87

ACUMULACIO DE METABOLITSSECUNDARIS

Els cultius de teixits i cel•lules vegetals,

ja des de la seva relativament curta aplica-

cio, han estat contemplats com a fonts po-

tencials de constituents secundaris de di-

versa utilitat, i especialment de substan-

cies medicinals. Ates que les plantes supe-

riors son els productors mes importants de

productes naturals d'interes farmaceutic,

una de les principals avantatges que poten-

cialment podria esperar-se dels cultius de

cel•lules i teixits vegetals seria l'acumu-

lacio de grans concentracions d'aquests

compostos i el descobriment de rutes alter-

natives per a la produccio d'aquestes subs-tancies medicinals. Aixi mateix, tot sovint

s'ha relacionat aquest potential amb el re-

cent i impressionant progres en l'inere-

ment de 1'acumulaci6 de compostos secun-

daris d'interes farmaceutic mitjancant sis-

temes microbians (90). Aixo no obstant,

degut als factors economics abans esmen-

tats, la produccio industrial d'aquest tipus

de compostos mitjancant el cultiu de cel-

lules i teixits vegetals tan sols podra tenir

exit si els esforcos es concentren en pro-

ductes vegetals especifics farmacologica-

ment actius, a partir de plantes rares i/o de

dificil adquisicio.En la darrera decada s'han publicat

nombrosos estudis amb calls i cultius cel-lulars en suspensio de diverses plantes, enels quals s'ha descrit la formacio, i a vega-des acumulacio en concentracions eleva-des, de molts constituents secundaris defe-rents, havent-se comprovat la influenciadel medi, en especial la font de nitrogen ila presencia de fitohormones, sobre la pro-duccio d'aquests compostos (2, 9, 100,212).A la taula 2 es relacionen diversos pro-

ductes naturals aIllats de cultius de call

altament productius. Aquests exemples, i

els de la figura 1, indiquen que en els cul-

tius cel•lulars poden acumular-se compos-

tos derivats de rutes biosintetiques molt

distintes. No obstant aixo, encara que en

els cultius de call pot assolir-se una gran

acumulacio de compostos, com ja ha estat

indicat anteriorment, aquests sistemes no

tenen aplicacio biotecnologica. En alguns

casos, pero, 1'elevada acumulacio de cons-

tituents secundaris en cultius de call o de

cel•lules en suspensio probablement esta

relacionada amb la presencia de models de

diferenciacio, essent un exemple d'aixo la

produccio de glicoalcaloides esteroidics de

Solanurn khasianum (95), o l'acumulacio

d'alcaloides en cultius de Papav-er soinnil --

rum quan hi ha present un gran nombre de

cel•lules laticiferes especialitzades (125).

Encara que alguns metabolits secundaris

POTENCIAL BIOTECNOLOGIC DEL CULTIC' DE. CEL L L LES L'EGEIALSPER A L'OBTENCIO DE PRODCCTES FARM.9CEUTics 53

H

IV

VII

HO

L

GHa

VIII

V

COO

xII

Ix

H3H

VI

XIII

Compost Classc de compost Planta Rendiment(% PS)

Reterencia

verbacosid glucosid polifenolic Svringa vulgaris 16 51I alizarina antraquinona Morinda citrifolia 15-18 220II acid rosmarinic ester cafeoil Coleus blumei 15 141V shikonina naftoquinona Lithospertnum erythrorhizon 12 183V diosgenina triterpe Dioscorea deltoidea 7,2 146VI jatrorricina alcaloide Berheris stolonifera 7 77V11 cafeoil putrescina ester cafeoil Nicotiana tahacum 6 15V111 trigonelina alcaloide Trigonella,foenungraecum 5 139IX nicotina alcaloide Nicotiana tahacum 1-3,4 130X ajmalicina alcaloide Catharanthus roseus 1 223XI serpentina alcaloide Catharanthus roseus 0,8 223XI1 ubiquinona-10 benzoquinona Nicotiana tahacum 0,5 79XI11 glutatio peptid Nicotiana tahacum 0,2 14

Fig. I. C'ultius de ccl•lules vegetals en suspensio de gran rendiment en la produccio de diversos productes na-turals.

54 ('.IRLF.'S COD/N.1. FR.W('F.S(' L"IL.ID0tI.-I T. J1 L MF_ BASTID.•1 t JOSE!' .1! l.V L 1.1 INKIiS

es produeixen en menor proporcio en els

cultius de c6lules en suspensio que en

els de call, s'han descrit alguns casos en els

quals s'han assolit concentracions molt

elevades. En la figura l es mostren alguns

exemples de productes naturals aillats de

cultius de c6lules en suspensio de gran

productivitat, destacant-ne pel seu elevat

rendiment, considerablement mes gran

que en la planta intacta, l'acumulacio

d'antraquinones i verbascosid en cultius

cel•lulars de Morinda citrifolia (220) i

Svringa vwlgaris (50), respectivament, i

d'acid rosmarfnic en Coleus blurnei (141,

221), i mes recentment en Anchusa o//ici-

nalis (41) i diverses especies de Rosmari-

nus i Salvia (211). D'especial interes tam-

be, degut al procediment amb el qual s'han

obtingut les soques, es la considerada acu-

mulacio de cafeoil-putrescina i feruoil-

putrescina en cultius de c6lules en sus-

pensio de Nicotiana tabacum (15).

Dels altres compostos que son represen-

tants a la figura 1, la ubiquinona, consti-

tuent de la cadena respiratoria mitocon-

drial, s'acumula en cultius cel•lulars en

suspensio de Nicotiana tabacuni en un ni-

veil molt mes gran que no pas en la planta

sencera (79). L'elevada produccio del tri-

peptid glutatio en cultius de c6lules foto-

mixotrofiques en suspensio d'aquesta ma-

teixa especie es particularment interessant

ates que aquest compost es excretat al

medi de cultiu (14). El triterpe diosgenina

es d'especial interes per a la sfntesi parcial

d'esteroides i fitosterols (188). Els alcaloi-

des indolics ajmalicina i serpentina, d'apli-

cacio actual en el tractament de malalties

circulatories, han estat aillats en cultius de

c6lules en suspensio de C'atharanthus ro-

seus, encara que en aquest cas ha estat

necessari un procediment riguros de selec-

cio de soques altament productives per tal

d'assolir una acumulacio elevada d'aquests

metabolits secundaris (222. 223). Els gin-

senosids s'acumulen tambe en gran pro-

porcio en cultius de cel•lules de Panax gin-

seng (64, 154) i de P. quinquefolium (82),havent-se comprovat farmacologicamentque 1'extracte de call es gairebe tan actiucom el d'arrel de ginseng, la qual to unIlarg perfode de formacio.

D'altra banda, els cultius de cel•lules ve-getals poden formar diversos tipus de qui-nones en quantitat relativament elevades.Es el cas, per exemple, de les especies Cas-sia angustifblia, els cultius de call de laqual produeixen antraquinones i diantro-nes, amb una notable activitat laxant (60),i de C. tora, usada al Japo tambe com alaxant, la qual acumula antraquinones,com ara el crisofanol o 1'emodina, en unaproporcio deu vegades superior a la de laplanta intacta (181). Aixo no obstant, es dedestacar la famflia de les Rubiacies comuna de les mes estudiades actualment enrelacio a la produccio d'aquest tipus demetabolits secundaris (80, 81, 155, 214).Un altre grup de compostos d'interes

farmaceutic i produits tambe per cultius

cel•lulars son els pigments del tipus nafto-quinona, emprats en alguns paisos peltractament de cremades i malalties de la

pell. Aixf, en cultius de c6lules en suspen-

sio de Lithospermuin ervthrorhi_on s'ha

obtingut un nivell de pigments de gairebc

vuit vegades superior al de 1'arrel usada

com a droga crua (183• 199), havent-se

comprovat aixf mateix quc aquests pig-

ments, derivats de la shikonina, son simi-

lars als de 1'arrell (180, 183). D'altra Ban-

da, els extractes cloroformics dels cultius

de call han mostrat una activitat antimi-

crobiana davant germens gram-positius

semblant a la de 1'extracte cloroformic deI'arrell (182).

Els alcaloides, en general, son especial-

ment dificils de produir mitjancant els cul-

tius cel•lulars. La rao per la qual aixo suc-

ceeix no es prou clara, pero s'ha suggerit,

almenys pel que fa a alguns alcaloides• que

la disminucio de la seva biosintesi podria

ser deguda a un bloqueig metabolic d'una

reaccio especifica en la ruta biosintetica.

POTL'A'(1 1, BIOTECNOLOGIC DEL. Cl LHt' DL CEL L('LES 17:GET.1LSPER A L'oBTL',vC16 DEPRODC-CTES LAR,tIAC'EUM's 55

Aixi, per exemple, en cultius de cel•lulesindiferenciades de Datura i Scopolia s'hademostrat que els baixos nivells alcaloidicsson causats principalment per la suprensiode la formacio d'acid tropic , la meitat aci-da de la hiosciamina ( 179). D'altra banda,en cultius cel • lulars de Stephania cepha-rantha s'ha observat que la reacc16 de me-tilacio i la formacio del grup metilendioxidno tenon lloc en les etapes finals de la rutabiosintetica que condueix a la formaciodels alcaloides cefarantina i isotetrandrina,acumulant - se en el seu Ilocels alcaloidesintermediaris aromalina 1 berbamina (1).S1 fos possible d'eliminar aquesta mantade metilacio, els cultius cel • lulars de S.cepharantha serien capacos de produir 1'al-caloide d'interes medicinal, cefarantina. Avegades tambe s'han observat resultats ne-gatius en la produccio d'alcaloides en cul-tius cel•lulars de C'atharanthus roseus (152,156); aixo no obstant , amb aquesta matei-xa planta, 1 d'altres com Stemmadenia to-mc'ntosa . i 1 •oacanga a/i•icana ( I 74), Berhe-ris u ilsoniae (23 ), Solanum dulcalna-ra (49 ), Coptis japonica ( 151), Duhoisialeichhardtii (215), Ochrosia clliptica (97), 1diverses especies de Ruta ( 53), s'han dut aterme amb exit experiencies relatives a laproduccio i/o acumulaci6 d'aquests tipusde metabolits secundaris.

En qualsevol cas, pero, una de les plan-tes mes estudiades des del punt de vista dela seva possible aplicacio biotecnologicaper a l'obtencio de productes farmaceuticses Catharanthus roseus , amb la qual s'hanrealitzat nombrosos estudis, alguns d'ellsja esmentats , dirigits els uns al coneixe-ment del metabolisme de Ilurs alcaloides.principals compostos farmacologicamentactius d'aquesta especie, alguns dels qualsson emprats clinicament en l'actualitat, icis altres a determinar els factors internsi externs que influeixen en una major acu-mulacio d'aquests metabolits secundarisen aquests sisternes experimentals (38, 46,47, 101, 103, 114, 120, 133, 163, 193).

Tots aquests exemples poscn de mani-fest que existeix una serie important d'es-tructures quirniques molt diferents i que,obviament, poden expressar-se moltes ru-tes biosintetiques distintes a nivell de cul-tius de teixits i cel•lules en suspensio d'ori-gen vegetal. Aixi, doncs, si es considers elnotable progres dels darrers anys en elcamp de ]a produccio de metabolits secun-daris en cultius de cel•lules en suspensio,sembla raonable pensar que alguns d'a-quests compostos en el futur es podranacumular en grans quantitats mitjancantl'aplicacio biotecnologica d'aquests siste-mes (195, 204). A mes, no tan sols calaplicar aquesta biotecnologia als cultiusque en 1'actualitat ofereixen un baix rendi-ment, sing que existeixen encara nombro-ses plantes d'interes medicinal de les qualsIlurs capacitate de biosintesi han d'esserinvestigades.

ELS CULTIUS DE CEL•LULES COMA FONT DE NOUS PRODUCTES

Si 1'espectre de constituents secundarisen els cultius de cel•lules vegetals es com-para amb el de la planta intacta 1 Ilursdiferents organs, s'observa que la planta,en la majoria dels casos, conte un espectremes ampli que les cel•lules derivades d'e-Ila, observant-se tambe una diferencia enles quantitate relatives d'aquests compos-tos (20, 185). No obstant aixo, sorprenent-ment, en repetides ocasions alguns me-tabolits secundaris no trobats en la plantaoriginal s'han alilat dels cultius cel•lularsderivats d'elles. A la taula 3 es relacionenalguns exemples de productes secundaris,entre els quals hi ha diverses classes d'alca-loides, cumarines, antraquinones i sesqui-terpens, que es produeixen predominant-ment en cultius de cel•lules en suspensiomes que en la planta sencera, o fins i tot demancra exclusiva en aquests sistemes ex-perimentals.

56 ('ARLES CODINA, FRANCESC 17LADOMAT, JAUME BASTIDA I JOSEP MANEL LLABRFS

TAULA 3Exemples de metabolits secundaris produits en major proporcio , o exclusivament, en cultius de

cehlules en suspensio que no pas en la planta sencera

Compost (7asse do compost Mania Reterencia

edulina alcaloide Ruta graveolens 169

isopimpinelina furanocumarina Ruta graveolens 169

rutacultina furanocumarina Ruta graveolens 169

armoring alcaloide Stephania cepharantha 165

norsanguinarina alcaloide Papaver somnilerurrt 63

3-metilpurpurina antraquinona Digitalis lanata 62

5-hidroxidigitoluteina antraquinona Tectona grandis 43

lucidina antraquinona Morinda citrifolia 107

paniculides sesquiterpens .-indrographis paniculata 132

pericina, pericalina alcaloides Picralima nitida 8

hinokiol , ferruginol diterpens Thuja occidentalis 16

vomilenina alcaloide Rawawolfa serpentina 173

tarennosid iridoide glucosid Gardenia jasininoides 201

En els darrers anys, 1'equip d'investiga-

dors encapcalat pel Prof. Zenk, ha aconse-

guit d'elucidar la sequencia biosintetica

dels alcaloides heteroyohimbinics ajmali-

cina i els seus isomers utilitzant cultius de

cel•lules en suspensio de Catharanthus ro-

seus (75, 149, 171, 197, 224). Els estudis

amb material de planta intacta no propor-

cionaren la determinacio d'una sequencia

biosintetica tan complexa, i ha estat tan

sols mitjancant 1'aplicaci6 de la tecnica de

cultius cel•lulars que s'han pogut aIllar en

quantitat suficient els enzims implicats, al-

hora que s'han pogut elucidar estructural-

ment per primera vegada diversos inter-

mediaris (84). Aixi mateix, una altra plan-

ta estudiada en aquest sentit es Dioscorea

deltoidea, els cultius cel•lulars de la qual

han permes d'identificar nous intermedia-

ris de la biosintesi del seu metabolit d'inte-

res farmaceutic, el triterpe diosgeni-

na (189). Aquests fets, logicament, ressal-

ten el valor potencial dels sistemes de

cultius de cel•lules en suspensio com a

fonts d'enzims intermediaris i/o especifics,

aixi com de nous productes vegetals que

no s'acumulen en la planta intacta o ho fan

en quantitats insuficients.Estudis realitzats recentment en diver-

sos laboratoris han comprovat 1'enormevariabilitat bioquimica de diferents soques

de cultius de cel•lules en suspensio de Ca-tharanthus roseus, les quals acumulen di-

versos intermediaris i alcaloides en quanti-

tats molt diferents (93, 94, 99, 134, 172).

Ates que aquests noun compostos secun-

daris que es vagin descobrint en els cultius

eel•lulars probablement tindran propietats

quimiques i biologiques desconegudes, se-

ria molt interessant si les diferents soques

de cultius cel•lulars en les quals s'acumu-

len aquests productes naturals fossin sot-

meses a bioassaigs convenientment disse-

nyats. Puix que algunes de les noves subs-

POILACIAL BIOTECA0LOGIC DEL CLL77C DE CELLCLES I h.'GET.4LSPER A L'OBI'EVCIO DE PRODL'CTES F.4R.AMACEL'TICS 57

tancies tindran tambe noves i interessantspropietats fisiologiques, aquests bioassaigsdeurien incloure analisis per a la determi-nacio d'activitat antimicrobiana, antiinfla-matoria, antiviral, antihemorragica, an-tiartritica, anticancerigena i d'altres activi-tats farmacologicament importants. Peraixo, el "screening" dels cultius de cel•lulesi teixits vegetals mitjancant bioassaigsd'activitats farmacologiques pot esser unmetode eficac per a 1'explotaci6 de princi-pis actius products per aquests sistemes ex-perimentals.De fet, aquesta metodologia ha propor-

cionat ja alguns fruits en el descobrimentde substancies insospitades de possible usmedicinal. Aixi, per exemple, Veliky i Lat-ta (205) trobaren una certa activitat anti-microbiana en alguns teixits de call acllatsde diverses plantes. En cultius d'Emblicaof/icinalis s'ha comprovat que I'activitatantimicrobiana era deguda a la presenciade galat d'etil, format per les cel•lules enuna quantitat forca considerable (89). Aiximateix, s'ha observat inhibicio de la secre-cio del suc gastric en ratas i millora de lesulceres pectiques inducdes per l'adminis-tracio oral d'acid acetic, com a efecte delsextractes aquosos preparats a partir de cul-tius de call o de cel•lules en suspensio d'I-sodon japonicus, havent-se comprovat, ames, que aquesta activitat era gairebe lamateixa que la de 1'extracte elaborat a par-tir de la planta intacta (128). A mes delsexemples exposats, s'han dut a terme ambexit diversos "screenings" farmacologicsde nombrosos cultius de cel•lules els qualsban permes d'aillar diverses substanciesamb activitat antitumoral i antiviral (121,122). Tenint en compte la impressionantvarietal de compostos secundaris exis-tents, alguns tan complexes com alcaloideso terpenoids, sembla probable que els cul-tius de cel•lules constituiran sistemes efica-cos per I'acllament d'intermediaris fins aradesconeguts, o be de nous productes natu-rals.

ESTUDIS AMB CEL•LULESIMMOBILITZADES

Un proces molt prometedor i fructiferen els darrers anys ha estat la immobilitza-cio d'enzims i de cel•lules bacterianes ofungiques, tecnica mitjancant la qual lescel•lules o els enzims son atrapats en elsenreixats de polimers, com ara membranesde colagen, poliacrilamida, alginat calcic,poliestire, gel d'agar, derivats de cel•lulosa,poliureta o d'altres suports (34, 48, 109,118, 206). Les cel•lules immobilitzades res-ten viables durant un cert temps (diversessetmanes) i els enzims actius, degut a quesegueixen estant en el seu entorn natural.Aquests biocatalitzadors atrapats son espe-cialment utils perque es poden utilitzar deforma continuada per a la produccio dediversos constituents, havent-se trobataplicacions d'aquesta tecnica en campscom ara la sintesi organica, analisis clini-ques i quimiques, industria, medicina id'altres (26, 27, 33, 73, 108, 161).En contrast amb les reaccions enzimati-

ques tradicionals, les quals es duen a termeen processos en serie, aquestes cel•lules im-mobilitzades es disposen en columnes, onla solucio nutritiva i els substrats a trans-formar son bombejats a traves de la capade cel•lules de forma que els productes, enla majoria dels casos, s'alliberen dels bio-catalitzadors immobilitzats a la soluciocirculant, i poden, aixi, separar-se conti-nuament de 1'eluat. A mes, les avantatgesd'aquests sistemes son multiples degut, en-tre d'altres raons, a que els processos d'ex-traccio i/o purificacio dels enzims no sonnecessaris, l'activitat enzimatica despresde la immobilitzacio i I'estabilitat opera-cional de les cel•lules immobilitzades sonelevades, el cost de 1'enzim o del biocata-litzador es baix degut al seu us prolongat i,finalment, a que poden dur-se a termereaccions multienzimatiques.

La immobilitzacio de cel•lules, a mesd'haver-se emprat en experiencies amb mi-

58 (IRLLES (01)/V I, I R I V(I:5C [/1 l1)O.IL IT..lU %1l: B IS17D I 1 J)SFL' SLI of 1. LL IBRL.:S

croorganismes, tambe ha estat aplicadaamb exit a cel•lules vegetals. Aixi, perexemple, s'ha obtingut una considerableproductivitat d'antraquinones i d'alcaloi-des del grup de l'ajmalicina en sisternes decel•lules immobilitzades de Morinda citri-folia (24) i Catharanthus roseus (25), res-pectivament, aixi com la producc16 d'unacitoquinina en cel•lules immobilitzades detabac (203) i la modificacio de diversesprote'fnes vegetals (105). D'altra Banda,mitjancant aquesta tecnica s'han assolitreaccions de biotransformacio com, perexemple, la conversio de codeinona en co-de'fna amb cel•lules de Papaver somnife-rum (66) i la 12 (3-hidroxilaci6 de glicosidscardiacs de Digitalis lanata (24, 123, 124).Aixi, doncs, degut als prometedors resul-

tats obtinguts fins ara amb sistemes micro-bians, i ates que les cel•lules vegetals, com-parativament mes sensibles, romanen en-zimaticament actives durant la immobi-litzacio, estudis d'aquest tipus fan moltatractives aplicacions similars amb cel•lu-les vegetals, en especial si s'utilitzen so-ques adequadament seleccionades.

BIOTRANSFORMACIO DESUBSTRATS

Els cultius de cel•lules en suspens16s'han investigat intensament en els darrersanys respecte a Ilur capacitat per efectuarla transformacio parcial de compostos or-ganics, naturals o sintetics, i d'estructuresmolt diverses i complexes, aplicats de for-ma exogena (5, 100, 143, 144, 148).Aquestes investigations han demostratque les cel•lules vegetals posseeixen ungran potencial bioquimic per a efectuartransformacions especifiques de compos-

tos organics que donen lloc tot sovint acompostos mes complexes i. des del punt

de vista farmaceutic, de major utilitat.

Els principals tipus de reaccions que esprodueixen durant els processor de bio-

transformacio en cultius cel•lulars son oxi-dations, reductions, hidroxilacions, meti-lacions, demetilacions, glicosilacions, iso-meritzacions, etc., les quals mostren unasemblanca molt considerable amb les reac-cions de transformacio microbianes, estu-diades i aplicades biotecnologicament ambexit durant mes de 50 anys. Aixo no obs-tant, les cel•lules vegetals tenen la capacitataddicional de catalitzar diverses reaccionsde conjugacio en les quals residus glicosil,acil o aminoacil, compostos amino o es-tructures peptidil, son afegits a grups fun-cionals dels substrats. Algunes d'aquestesreaccions caracteristiques de les planter,corn ara la glicosilacio en un lloc especificd'un substrat multifuncional, semblenconstituir un potencial de gran interes peral desenvolupament biotecnologic, ja queen molts casos aquests glicosids o be nopoden sintetitzar-se per procediments qui-mics, o tan sols amb la complexa implica-cio de grups protectors. L'aplicacio biotec-nologica d'aquest potencial, pero, reque-reix una rigurosa selecci6 de soquesadients ates que en la majoria dels casosles cel•lules vegetals duen a terme mes d'u-na reacc16 de biotransformacio amb unsubstrat determinat (9, 10, 12, 170).En els darrers anys s'ha prestat una con-

siderable atencio a les reaccions de bio-transformacio utilitzant diversos compos-tos esteroidics, corn ara el 5a-pregnan,5(3-pregnan, testosterona, progesterona,5(3-pregnan-3,20-d iona i d'altres andro-gens, aixi com sapogenines 1 fitosterols (5,65, 175, 176). D'entre els nombrosos estu-dis realitzats recentment cal destacar-neles transformacions de la testosterone a4-androsten-3,17-diona, 5a-androstan-17(3-ol-3-ona, 5a-androstan-3(3, 1713-diol, llurdipalmitat i 3- i 17-f3monogluc6sids,epiandrosterona, els seus palmitat i gluco-sid, i testosterona glucosid, en cultius decel•lules de Nicotiana tahacum (65). Al-guns d'aquests compostos com, per exem-ple, 1'epiandrosterona plarnitat, epiandros-

I'M ES'CIIL BIOTECNOLOGIC DEL ('C'L77C' DE CEL LCLI:S J i (1E ALSPER A L'OBTEJ'CIO DEPRODCCTES fARSIACEL'77CS 59

terona glucosid i testosterona glucosid,han estat trobats per primer cop com ametabolits de la testosterona en cultius dec6lules vegetals.

D'altra banda , tambe els alcaloides hanestat recentment objecte de diversos estu-dis de blot ransformacio , com ara la con-versio d'elipticina en 5-formileliptici-na (96 ), de tetrahidroberberina en berberi-na (216 ), d'anhidrovinblastina en vinblas-tina (1 13) 1 de loganina en secologani-na (191), realitzats , respectivament, encultius de c6lules en suspensio de Choisvaternata, Coptis japonica, i de Catharanthusroseus en els darrers dos casos.Un camp d 'excepcional interes per a l'a-

plicacio farmaeeutica dels cultius de cel.lu-les vegetals es el relatiu als cardenolids,ates que aquests compostos son amplia-ment emprats en medicina . Aixi, la digoxi-na, constituent natural en les plantes deDigitalis lanata, es el compost mes interes-sant d'aquest tipus de productes naturalsdegut a Ilurs propietats farm acologiques.Aixo no obstant, durant el proces d'ailla-ment es forma un subproducte altamenttoxic, la digitoxina; per aixo , en aquestexemple la finalitat basica de la biotrans-formacio consisteix en la conversio de di-gitoxina en digoxina per una 1213-hidroxi-laci6. Tant els aglicons com els glicosidscardiacs han estat intensament estudiatsrespecte a Ilur transformacio per cultius dec6lules vegetals (6, 78, 83, 111, 135,176).

OH HO-D-D-O

D = digitoxosa R = H digitoxina

R = OH digoxina

Com ja ha estat indicat anteriorment,aquesta gran varietat de reaccions detransformacio representen un gran poten-cial, la realitzacio del qual requereix ]aseleccio de soques adequades en les qualsuna d'aquestes reactions alternatives s'ha-gi incrementat a compte de les altres. Elprincipal interes en aquest camp. doncs.implica la 12(3-hidroxilaci6 estereoespeci-fica de la digitoxina i del derivat semisin-tetic (3-metildigitoxina per tal de produir ladroga terapeuticament activa. No obstantaixo, estudis amb cultius de c6lules ensuspensio de Digitalis lanata han demos-trat que en la transformacio de la (3-metil-digitoxina, a mes de la reaccio de 12(3-hidroxilaci6, tenen hoc tambe diversesreaccions alternatives (3, 7). Per aixo, elprocediment biotecnologic ideal hauria deconsistir exclusivament en la 12(3-hidroxi-laci6 directa de la (3-metildigitoxina i evi-tar totes les altres reaccions, per a la qualcosa cal seleccionar una coca que catalitzitan sols aquesta reaccio de biotransforma-cio. Aquest proces sembla ser fins ara elproces de biotransformacio mes altamentdesenvolupat en cultius de c6lules vege-tals i ha assolit un nivell el qual permet deconsiderar seriosament llur aplicacio co-mercial.Un altre aspecte important de I'aplicacio

biotecnologica de les reactions de bio-transformacio es el fet que una reacciobioquimica particular no necessariamenttindra lloc durant totes les fases de la corbade creixement cel•lular. Ates que els cons-tants canvis en la composicio quimica delmedi nutritiu durant un title de creixe-ment condueix a canvis substancials en lafisiologia de la cel•lula (55, 71), pot trobar-se, en principi, un punt optim per a I'ex-pressio dels enzims. Aixi, per exemple, enla produccio d'esculina en cultius cel•lularsde Lithospertnuin ervthrorhizon s'ha obser-vat que la velocitat maxima de glucosilacioto lloc a la fase de creixement exponencialde les cel•Iules (186). Aquest fenomen tam-

60 (IRLL.(O1)IA I.1RIy(L.'(17LIDOIfIT.JII I1ERI.SIH)IIJO.SL1 tIIvILLLL. IIiRIi.S

be ha estat verificat en estudis sobre la

glucosilacio d'acids aromatics i l'acumula-

cio de compostos fen6lics, respectivament,

en cultius de cel•lules en suspensi6 de Ni-

cotina svlrestris (153) i d'Acer pseudoplata-nus (208).

Totes aquestes dades indiquen el gran

potencial dels cultius de cel•lules vegetals

per l'aplicacio biotecnologica, pero eviden-

cien tambe que son necessaris els comple-

xes procediments de selecc16 per tal d'ob-

tenir aquelles cel•lules que tenen la maxi-ma capacitat per a catalitzar una reacci6

especifica d'entre una gran xarxa metaboli-

ca. A mes, els resultats obtinguts fins ara

indiquen que en l'optimitzaci6 dels pro-

cessos biotecnologics cal prestar una gran

atencio a la condicio fisiologica de les cel-

lules, ja que pot influir en gran mesura

sobre el nivell de 1'enzim responsable.

PERSPECTIVES

Una avaluaci6 critica de factual situaci6

de la tecnologia dels cultius de cel•lules i

teixits vegetals revela que una gran varie-

tat de reaccions bioquimiques especifiques

de les plantes poden expressar-se a nivell

de cel•lules indiferenciades. Aixi mateix,

una comparaci6 amb els processos biotec-

nol6gics microbians permet de contemplar

els cultius de cel•lules vegetals en suspen-

sio corn a fructifers en aquells casos en els

quals son requerides reaccions caracteristi-

ques dels vegetals (162, 200).

Aixo no obstant, per l'aplicacio indus-

trial dels cultius cel•lulars en la producc16

de compostos medicinals cal que s'acom-

pleixin, corn a minim, els seguents requi-

sits: 1) que la velocitat de creixement cel-

lular i de la biosintesi siguin prou elevades

per tal d'obtenir un rendiment considera-

ble del producte final en un periode curt

de temps; 2) que les cel•lules cultivades

siguin geneticament estables per a propor-

cionar una quantitat constant del produc-

te; 3) que els metabolits s'acumulin en les

cel•lules sense que siguin rapidament cata-

bolitzats o, a ser possible, que s'alliberin al

medi liquid, i 4) que els costos de produc-

cio, inclosos els medis de cultiu, precursors

i extracci6 quimica, siguin suficientment

baixos per tal que el proces esdevingui ren-

dible.

Respecte al primer requeriment, en ge-

neral es pensa que les cel•lules vegetals

proliferen massa lentament per fer-les crei-

xer en fermentadors a gran escala. Aixo no

obstant, diverses experiencies amb cultius

cel•lulars han suggerit que la velocitat de

creixement pot accelerar-se considerable-

ment millorant les condicions de cultiu 1

seleccionant les soques cultivades (86,

159). Encara que ja s'han obtingut algunes

dades prometedores, caldran mes esforcos

en la millora o aprofitament de la velocitat

biosintetica de compostos medicinals en

cultius de c6lules en suspensio mitjancant

la regulaci6 bioquimica i genetica del me-

tabolisme secundari.

En relac16 amb el segon requisit, el de

1'estabilitat genetica de les cel•lules cultiva-

des, el metode d'emmagatzematge per con-

gelacio, segons els estudis de diferents au-

tors, podria utilitzar-se per a la conserva-

cio de valuosos estocs de cultius (32, 44,

85, 126). Aixo no obstant, cal destacar la

importancia del control de les variacions

nuclears o citoplasmatiques que poden te-

nir floc en les cel•lules cultivades en el pas

del cultiu en laboratori al processament

industrial (119, 178), motiu pel qual son

necessaris, a mes a mes, estudis citogenics

i fisiol6gics dirigits a aconseguir el control

de 1'estabilitat biosintetica.

L'estudi del tercer problema, relatiu a

l'alliberament de metabolits cel•lulars al

medi de cultiu, pot ser important per tal

d'evitar possibles repressions metab6li-

ques o controls "feedback" negatius, de-

guts a 1'exces d'acumulacio del producte

final a la cel•lula. Ates que les cel•lules

vegetals en general tendeixen a acumular

POIT''NCLIL BIOTF,CNOLOGIC DEL CL'LTIL DE CEL LLLES l'EGETALSPER A L'OBTENC16 DE PRODLCTES FARMACELT/CS 61

Ilurs metabolits secundaris en vacuols o enel citoplasma , caldria idear un metode peralterar la permeabilitat de la membranacellular. En aquest sentit, s'ha obtingutalgun resultat positiu amb cultius de cel.lu-les de Si'mpht'tuin officinale que acumulenfins un 20 % del pes sec de glutamina(I 92), pero la seva aplicacio generalitzadarequercix encara un nombre mes elevatd'experiencies.

Finalment, el quart requeriment esta re-lacionat amb els complexes problemeseconomics de la produccio industrial, elsquals dependen basicament del cost deproduccio i de la demanda del compost.Una part considerable del cost de produc-cio hauria de correspondre a la font decarboni organic i a I'electricitat necessariapets processor d'aireacio , agitacio , regula-cio de la temperatura , etc. D'altra banda,I'us del cultiu continu o semicontinu enIloc del sistema de cultiu en serie no tansols pot reduir els costos de produccio perla reesterilitzacio del fermentador i la ne-cessitat de propagac16 de les cel • lules apartir del stock original , sing tambe potpermetre un canvi programat de la compo-sicio del medi i regular aixi t'activitat bio-sintetica de les cel • lules (30).

Aixi, doncs, els principals i mes recentsavencos en la recerca experimental sobrela produccio de substancies d'interes me-dicinal mitjancant sistemes de cultius decel•lules vegetals son, entre d'altres: 1) eldescobriment de diversos cultius cel•lularscapacos de produir compostos medicinalsespecffics a una velocitat igual o superior ala de les plantes intactes, 2 ) la troballa,mitjancant bioassaigs , de noves substan-cies fisiologicament actives d'aplicacio te-rapeutica ; 3) el coneixement dels factorsde control involucrats en el metabolismesecundari ; 4) la demostraci6 que I'activitatbiosintetica de cel•lules cultivades pot aug-mentar-se regulant els factors ambientalsi/o condicions de cultiu , o be mitjancant laselecc16 o induccio artificial de clons mu-

tants ; 5) la produccio d'alguns dels com-postos medicinals localitzats en teixits oorgans morfologicament especialitzats, ensisternes de cultius no tan sols per inducciod'estructures organitzades especifiquessing tambe per algunes soques de cultiusen absencia d'organitzacio , i 6) la demos-tracio de 1'6s dels cultius de cel • lules vege-tals per a la biotransformacio especffica deproductes naturals.

Ates que les planter posseeixen un grannombre de propietats bioquimiques queson especifiques dels vegetals , i que enca-ra son absolutament indispensables per aI'obtencio de productes farmaceutics, llurscel•lules ofereixen un potencial extremada-ment interessant per a les aplicacions bio-tecnologiques dirigides a aquells proble-mes que no es poden resoldre amb capaltre tipus de cel•lules vives o per medicestrictament qufmics.Aixo no obstant , a mes de i'obtencio de

productes d'interes farmaceutic i/o medi-cinal mitjancant els cultius de cel • lules ve-getals, l'aplicacio biotecnologica d'aquestssistemes experimentals tambe va dirigidaenvers la millora de plantes d'interes agrf-cola (19, 40 , 76, 210) i forestal (137, 196),a I'obtencio de soques resistents a herbici-des o antibiotics ( 1 15), a 1'estudi del meta-bolisme de pesticides i d'altres compostosqufmics presents en i'ambient ( 150), etc.Finalment , la biotecnologia marina, enca-ra que en alguns casos no tingui el seuorigen en cel • lules vegetals, actualment esobjecte d'intensos estudis per la seva pos-sible aplicacio a l'obtencio d ' antibiotics,agents anticancerigens , toxines i productesnaturals en general amb activitat farma-cologica i/o terapeutica (36, 88 , 131, 160).

Encara que els avencos abans esmentatshan confirmat l'esperanca d'aconseguir enun futur proxim I ' optimitzacio d'algunssistemes experimentals en la produccio in-dustrial dels compostos d'interes farma-ceutic , resten encara molts problemes, tantteorics com practics, que haurien de solu-

62 CIRLESCODLS.I, FR-L\YLS( IIL.IDO.MI.11, 11t.tIE B.ISIID.A I .IOSE[' t1A.SLL LL.IBRLS

cionar-se previament. Aixi, d'entre elsprincipals desafiaments amb els quals en-cara s'han d'afrontar els cientifics enaquest camp pot citar-se la desrepressio deles cel•lules, determinar la interdependen-cia de les cel•lules entre si, aconseguir 1'es-tabilitzaci6 dell genotips, i de fer creixer labiomassa uniforme de cel•lules a baixcost (168). Per aixo, les activitats de recer-ca, taut individuals corn col•lectives, hau-rien de comprendre tots els aspectes d'a-quests sistemes de cultius per a una millorcomprensio del metabolisme secundari i laseva aplicaci6 biotecnologica.

BIBLIOGRAFIA

I. AKASU, M., ITOKAWA I FUJITA, M. (1976) Bisco-

claurine alkaloids in callus tissues of Stephania

cepharantha. Phrtochemistr1,, 15:471-473.

2. ALFERMANN, A.W., MERZ, D. I REINHARD, E.(1975) Induction of anthocyanin biosynthesis in

tissue cultures of Daucus carota. Planta 11ed.,

suppl.: 70-78.

3. ALFERMANN, A.W. Boy, H.M., DOLLER, P.C.,

HAGEDORN, W., HEINS, M., WAHL, J. i REIN-

HARD, E. (1977) Biotransformation of cardiac

glycosides by plant cell cultures. En: Plant Tis-

sue Culture and its Bio-technological.-lpplicalion

(Barz , W., Reinhard, E. and Zenk. M.H., eds.)Springer. Berlin . pp. 125-141.

4. ALFERMANN, A.W. i REINHARD, E. (1976) Pro-

duction of Natural Compounds hr Cell Culture

Methods. Ges. Strahlen and Umwltforshg. Mun-

chen.

5. ALFERMANN, A.W., i REINHARD, E. (1980) Bio-

transformation by plant tissue cultures. Bull.

Soc. Chim. France, part 11: 35-45.

6. ALFERMANN, A.W., SCHULLER, I. i REINHARD, E.

(1980) Biotransformation of cardiac glycosides

by immobilized cells of Digitalis lanata . Planta

Med., 40:218-223.

7. ALFERMANN, A.W„ BERGMAN, W., FIGUR, C.,

HELMBOLD, U. SCHAWANTAG, D. SCHULLER, 1. i

REINHARD, E. (1983) Biotransformation of

(3-methyldigitoxin to J3-methyldigoxin by cell

cultures of Digital lanata. En: Plant Biotechno-

logy (Mantell, S.H. and Smith, H., eds.) Cam-

bridge Univ. Press. Cambridge. pp. 67-74.

8. ARENS, H., BORBE , H.O., ULBRICH, B. i

STOCKIGT, J. (1982) Detection of pericine, a

new CNS-active indole alkaloid from Picralima

nitida cell suspension culture by opiate receptorbinding studies. Planta Med., 46:210-214.

9. BARZ, W. (1977a) Catabolism of endogenous

and exogenous compounds by plant cell cultu-res. En: Plant Tissue Culture and its Bio-

technological Application (Barz, W., Reinhard,

E. and Zenk, M.H., eds.) Springer. Berlin. pp.

153-171.

10. BARZ, W. (1977b) Degradation of polyphenolsin plants and plant cell suspension cultures.Phrsiol. Veg., 15:261-277.

II. BARZ , W., REINHARD, E. I ZENK, M.H. (1977)

Plant Tissue Culture and its Bio-technological

.Application. Springer. Berlin.

12. BARZ, i HOSEL, W. (1979). Metabolism and de-gradation of phenolic compounds in plants.Rec. Adv. Phrtochem.. 12:339-369.

13. BARZ, W. i ELLIS, B.E. (1980) Potential of plantcell cultures for pharmaceutical production. En:Natural Products as .tledicinal Agents (Beal, J.L.and Reinhard, E., eds.) Hippokrates Verlag.Stuttgart. pp. 471-507.

14. BERGMAN, L. I RENNENBERG, H. (1978). Efflux

and production of glutathione in suspension

cultures of Nicotiana tahacum. 1. PIlan_enpiir-

siol.. 88:175-186.

15. BERLIN, J. i KNOBLOCH, K.H. (1980) Biochemi-cal characterization of a variant tobacco cellline accumulating high levels of cinnamoyl pu-trescine derivatives. Iloppe Seller's Z. Phrsiol.Chem.. 361:219-220.

16. BERLIN, J. (1983) Naturstoffe aus pflanzlichenZellkulturen. Chenne in. Zeit, 17:77-84.

17. BERLIN, J. (1984) Plant cell cultures - a futuresource of natural products. Endeavour, 8:5-8.

18. BHUJwAN1, S.S. i R.AZDAN, M.K. (1983) Develop-ments in Crop Science. Vol. 5. Plant Tissue Cul-ture: Theort' and Practice. Elsevier. Amsterdam.

19. Buss, F.A. (1984) The application of new plantbiotechnology to crop improvement. HortScien-

ce. 19:43-48.

20. BOHM, H. (1978) Regulation of alkaloid produc-tion in plant cell cultures. En: Frontier of PlantTissue Culture (Thorpe, T.A., ed.) Univ. Cal-gary. Calgary, Canada. pp. 201-2 12.

21. BOHM, H. (1980) The formation of secondarymetabolites in plant tissue and cell cultures. Int.Rev. ('r/o/., suppl. JIB:183-208.

22. BRAIN, K.R. (1974) Accumulation of L-DOPAin cultures from .tlucuna pruriens. 3rd Int.Congr. Plant tissue and Cell Culture. Leicester.Abstr. 73.

23. BREULING , M., ROTHENBERGER , S., ALFERMANN,

A.W. i REINHARD, E. (1984) Production of pro-

toberberine alkaloids by suspension cultures of

Berheris nilsoniae. Farm. Tijd. voor Belgic,

61:334.

POTE.NCIAL BIOTECNOLOGIC DE.L ('17,111 'W" ('FZ L('LES L'EGET.4LSPER .4 L'OBJEN('IO DE PRODCCTES FAR.LIACE(`T/CS 63

24. BRODELIUS , P.. DEUS . B., MOSBACH , K. i ZENZ,M.H. (1979 ) Immobilized plant cells for theproduction and transformation of natural pro-ducts . FEBS Lett., 103:93-97.

25. BRODELIUS , P. i NILSSON , K. (1980 ) Entrapmentof plant cells in different matrices . FIBS Lett.,122:312-316.

26. BRODELIUs , P. (1983 ) Production of biochemi-cals with immobilized plant cells : Possibilitiesand problems ..-Inn. .VYAcad. Sci.. 413 : 383-393.

27. BRODELtus , P. (1984 ) Immobilized viable plantcells.:inn . NY.4cad. Sci., 434 : 382-393.

28. BIIT (' HER, D .N. i CONNOLLY, J.D. (1971) Aninvestigation of factors which influence the pro-duction of abnormal terpenoids by callus cultu-res of . 4ndrographis paniculata Nees . J. L'xp.Bot., 22 :314-322.

29. BUTENKO , R.G. (1967 ) Tissue culture of medici-nal plants and prospective of its usage in medi-cine. Prohl . Pharmacolog., 21:184-191.

30. CALCOTT. P.H. (1981 ) Continuous Cultures ofCells. CRC Press. Florida.

31. CAREw . D.P. i STABA , E.J. (1965 ). Plant tissueculture: its fundamentals , application and rela-tionship to medicinal plant studies . Llordia,28:1-26.

32. CHEN , T.H.H., KARTHA , K.K., LEUNG, N.L.,KIIRZ. W.G.W., CHATSON. K.B. i CONSTABEL, F.(1984) Cryopreservation of alkaloid-producingcell cultures of periwinkle (Catharanthus ro-selcs). Plant Phisiol.. 75:726-731.

33. CHIBATA, 1. i ToS.A, T. (1980 ) Immobilized mi-crobial cells and their applications. Trends Bio-chenr . 5:88-90.

34. CHIBAT.A, 1. i TOSA, T. (1981) Use of immobili-zed cells . Ann. Rev . Biophrs. Bioeng., 10:197-216.

35. COLMAN, R. (1984 ) Biotechnology demands aspecial strategy . Nest- Sci., 1396:26-27.

36. COLWELL. R.R. (1983 ) Biotechnology in the ma-rine sciences . Science , 222:19-23.

37. CONSTABEL , F., GAMBORG, O.L., KURZ. W.G.W.i STECK, W. (1974) Production of secondarymetabolites in plant cell cultures . Planta Med.,25:158-165.

38. CONSTABEL . F.. GAUDET-LA PRAIRIE, P., KURZ,W.G.W. i KUTNEY , J.P. (1982 ) Alkaloid produc-tion in Catharanthus roseus cell cultures. X11.Biosynthetic capacity of callus from original ex-plants and regenerated shoots . Plant ('ell Re-ports. 1:139-142.

39. CORDUAN, G. i REINHARD, E. 1972 Synthesis ofvolatile oils in tissue cultures of Ruta grareo-lens. I'hrtochernistrl '. 11:917-922.

40. DALE , P.J. (1984 ) Tissue culture and forage cropimprovement. Span , 27:55-57.

41. DE-EKNAMKUL , W. i ELLIS, B.E. (1984 ) Rosma-

rime acid production and growth characteristicsof .lnchusa oflicinalis cell suspension cultures.Planta .lied., 50:346-350.

42. DEUS-NEUMANN, B. 1 ZENK, M.H. (1984) Insta-bility, of indole alkaloid production in Catha-ranthus roseus cell suspension cultures. Planiatiled.. 50:427-433.

43. DHRUVA, B.R., RAMA RAO, A.V., SRINIV.AS.AN,R. 1 VENKAT.ARAMAN, K. (1972) Structure of aquinone from teak tissue culture. Ind. J. Chem.,10:683-685.

44. DIETTRICH, B.. NEUMANN, D., SCHINDLER, U. iLUCKNER, M. (1982) Crvopreservation of Digi-talis lanata cells cultivated in vitro. Plania

Med., 45:154.45. DIXON. R.A., DEY, P.M. i WHITEHEAD, I.M.

(1982) Purification and properties of chalconeisomerase from cell suspension cultures of Pha-seolus vrdgaris. Biochinr. Biophrs..-1cia. 715:25-33.

46. DOLLER, G., ALFERMANN, A.W. i REINHARD, E.(1976) Production of indole alkaloids in tissuecultures of Catharanthus roseus. Planta .'Lied.,30:14-20.

47. DOLLER, G. (1978) Influence of the medium onthe production of serpentine by suspension cul-tures of Catharanthus roseus (L.) G. Don. En:Production of Natural Compounds bP Cell C'ut-ture,ilethods (Alfermann. A.W. and Reinhard,Ed., eds.) Ges. Strahlen and Umweltforschg.Munchen. pp. 109-116.

48. DURAND, G. i NAVARRO, J.M. (1978) Immobili-zed microbial cells. Process Biochenr.. 13:14-23.

49. EHMKE, A. i EILERT. (1984) Steroid alkaloids intissue cultures of Solanum dulcanrara. Farrar.Tijd. voor Belgie, 61:333.

50. ELLIS, BE. (1980) Accumulation of hydroxy-plenylethanol glucosides in cultures cells ofSt'ringa vulgaris. Z. Pht'siol. Chem., 361:242.

51. ELLIS, BE. (1983) Production of hydroxyphenyl-ethanol glycosides in suspension cultures ofSrringa Izdgaris. Phrtochenustrr, 22:1941-1943.

52. ELLIS, BE. (1984) Probing secondary metabo-lism in plant cell cultures. Can. J. Bot., 62:2912-2917.

53. ENGEL, B. i REINHARD, E. (1984). Acridone-alkaloid formation in suspension cultures ofRuta species. Farrar. Tijd. voor Belgii;, 61:335.

54. EVANS, D.A. i SHARP, W.R. (1983) Handbook ofPlant Cell Culture. Macmillan. London.

55. EVERETT, N.P., WANG, T.L., Got LD, A.R. iSTREET, H.E. (1981) Studies on the control ofthe cell cycle in cultured plant cells. 2. Effect of2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Proto-plasma. 106:15-22.

56. FOWLER, M.W. (1981) Plant cell biotechnologyto produce desirable substances. ('here. Ind.,7:229-233.

64 ('ARLES CODINA, FRANCES(' IJLADO.tL4T, J.IC7IE B.ISI7DA 1 JOSF_P.t1ANEL LLABRLS

57. FOWLER, M.W. (1983) Commercial applicationand economic aspects of mass plant cell culture.En: Plant Biotechnology (Mantell, S.H. andSmith, H., eds.) Soc. Exp. Biol., Sem. Series 18.Cambridge Univ. Press. Cambridge. pp. 3-37.

58. FOWLER, M.W. (1984a) Time for plant cell cul-ture'? Nature 307:504.

59. FOWLER, M.W. (1984b) Plant-cell cultures: Na-tural products and industrial application. Bio-technol. Genet. Eng. Rev., 2:41-68.

60. FRIEDRICH, H. and BAIER, S. (1973) Anthracen-

Derivated in Kalluskulturen aus Cassia angus7i-

lolia. Phvtocheinistry, 12:1459-1462.

61. FRISCHKNECHT, P.M., BAUMANN, T.W. I WAN-

NER, H. (1977) Tissue culture of Cgffea arahica

growth and caffeine formation. Planta Afed.,

31:344-350.

62. FURUTA, T., KOJIMA, H. i KATSUTA, T. (1972a)

3-methylpurpurin and other anthraquinones

from callus tissue of Digitalis lanata. Phttoche-

mistry, 11:1073-1076.

63. FURUYA, T., IKUTA, A. i SYONO, K. (1972b)Alkaloids from callus tissue of Papaver sonuufe-runt. Phvtochemistry, 11:3041-4044.

64. FURUYA, T. i ISHII, T. (1973) The manufactu-ring of Panax plant tissue culture containing

crude saponins and crude sapogenins which areidentical with those of natural Panax roots. Jap.Patent N.° 48-31917.

65. FURUYA, T. (1978) Biotransformation by plant

cell cultures. En: Frontiers of Plant Tissue Cultu-re (Thorpe, T.A., ed.) Univ. Calgary. Calgary,Canada. pp. 191-200.

66. FURUYA, T., YOSHIKAW.A, T. i T.AIRA, M. (1984)

Biotransformation of codeinone to codeine by

immobilized cells of Papaver .somniferum.

Phytochemistry, 23: 999-1001.

67. GAUTHERET, R.J. (1977) La Culture des Tissus

et des Cellules des Vegetau.v. Masson. Paris.

68. GAUTHERET, R.J. (1983) Plant tissue culture: a

history. Bot. AIag., 96:393-410.69. GOLDSTEIN, WE.. INGLE, M.B. i LASURE, L.

(1980) Product cost analysis. En: Plant Tissue

Culture as a Source of Biochemicals (Staba, E.J.,

ed.). CRC Press. Florida. pp. 191-234.

70. GOLDSTEIN, W.E. (1983) Large-scale processing

of plant cell culture. Ann. NY Acad. Sci.,

413:394-408.71. GOULD, A.R. (1984) Control of the cell cycle in

cultured plant cells. Crit. Rev. Plant Sc,.. 1:315-

344.72. GRESSHOFF, P.M. (1978) Phytohormones and

growth and differentiation of cells and tissues

cultured in vitro. En: Plnvtnhormones and Rela-

ted Compunds.. Comprehensive Treatise (Le-

tham, D.S., Goodwin, P.B. and Higgins, T.J.V.,

eds.) Elsevier. Amsterdam, pp. 1-29.

73. HAMILTON, R.. PEDERSEN, H. i CHIN, C.K.

(1984) Immobilized plant cells for the produc-

tion of biochemicals. Biotechnol. Bioeng.

Symp., 14:383-396.

74. HEINSTEIN, P.F. (1985) Future approaches tothe formation of secondary natural products inplant cell suspension cultures. J. Nat. Prod.,

48:1-9.75. HEMSCHEIDT, T. i ZENK, M.H. (1980) Glucosi-

dases involved in indole alkaloid biosysnthesis

of ('atharanthus cell cultures. FFBS Lett.,

110:187-191.

76. HESS, C.E. (1984) Biotechnology: Implications

for horticulture and society. IlortScience,19:620-623.

77. HINZ, H. i ZENK, M.H. (1981) Production ofprotoberberine alkaloids by cell suspension cul-

tures of Berheris species. Naturlviss., 68:620-621.

78. HIROTANI, M. i FURUYA, T. (1980) Biotransfor-mation of digitoxigenin by cells suspension cul-tures of Digitalis purpurea. Phttochemistry,19:531-534.

79. IKEDA, T., MATSUMOTO, T. i NOGUCHI, M.

(1976) Formation of ubiquinone by tobacco

plant cells in suspension culture. Phvtoche-

mistrv, 15:568-569.

80. INOUE, K., SHIOB.AR.A, Y., NAYESHIRO, H., INOU-

YE, H., WILSON, G. 1 ZENK, M.H. (1984a)

Biosynthesis of anthraquinones and related

compounds in Galium mollugo cell suspension

cultures. Phvtochemistrt. 23:307-311.

81. INOUE, K., UEDA, S.. NAYESHIRO, H.. MORITO-

ME, H. i INOUYE, H. (1984a) Biosynthesis of

naphtoquinones and anthraquinones in Strepto-

carpus dunnii cells cultures. Phytochemistry,

23:313-318.

82. JHANG, J.J., STABA, E.J. i KIM, J.K. (1974) Ame-rican and Korean ginseng tissue cultures:growth, chemical analysis and plantlet forma-

tion. In vitro, 9:253-259.83. JONES, A., VELIKY, I.A. i OZUBKO, R.S. (1978)

Biotransformation of cardenolidcs by plant cell

suspension cultures. I. Isolation and identifica-

tion of periplogenin from cultures of Daucus

carota Ca68 incubated with digitoxigenin. Lloy-

dia, 41:476-487.

84. K.AN-FAN, CH, i HUSSON, H.-P. (1979) Isolation

and biomimetic conversion of 4,21 dehydro-

geissoschizine. J.C.S. Chem. Comm., 1015-

1016.

85. KARTHA. K.K. (1985) Crvopreservation of'Plant

Cells and Organs. CRC Press. Florida.

86. KATO, K., SHIOZAWA, Y., Y.AMAD.A, A., NISHIDA,

K. i NOGUCHI, M. (1972) A jar fermentor cultu-

re of Nicotiana tabacuin L. cell suspensions. Agr

Biol. Chem., 36:899-902.

POTENCIAL B1OTECNOLOGIC DEL CUL NU DL CELLULES I'EGET I LSPER A L 'OBTENCIO DE PRODL 'CTES Ft R ,MACEL 'TICS 65

87.

88.

89.

90.

91.

92.

93.

94.

95.

96.

97.

98.

99.

100.

101.

KAUL, B. i STABA , E. J. (1967 ) Ammi visnagatissue cultures . Multi-liter suspension growthand examination for furanochromes . PlantaMed.. 15:145-156.KAUL , P.N. (1982 ) Biomedical potential of thesea. Pure.1 ppl . Chem., 54:1963-1972.KHANNA , P. i NAG, T.N. (1973) Isolation, iden-tification and screening of phyllemblin fromF_mhlica olftcinalis Gaertn tissue culture. IndianJ. I'harmac1, , 35:23-24.KIESUCH , K. (1980 ) New examples of microbialtransformations in pharmaceutical industry.Bull. Soc. C'him. Franc . Panic 11.:9-17.KING. P . J. (1980 ) Cell proliferation and growthin suspension cultures. Int. Rev . Ct'tol., supp.11.1:25-24.KNOBLOCH, K.H., HAHLBROCK . K. (1977)

4-Coumarate : CoA ligase from cell suspension

cultures of Petroselinum hortense Hoffm. Arch.

Biochem . Biophps., 184:237-248.

KHOL , W., VOGELMANN . H. 1 HOFLE , G. (1980)

Alkaloids from Catharanthus roseus tissue cul-

tures . Planta Med., 39 : 283-284.

KOHL , W., WITTE , B., SHELDRICK , W.S. i HOFLE,

G. (1984 ) Indolealkaloid aus Catharanthus ro-

seus Zellkulturen . IV. 16R- 19,20-E-Isositsirikin,

16R-19,20-Z-Isositsirikin and 21-Hydroxycy-

clolochnerin. Planta Med., 50:242-244.

KORATE , CH. K. i RADWAN , S.S. (1979) Enrich-

ment of Solanum khasianum callus generatingrootlets with steroidal glycoalkaloids . Z. Natur-

forschg., 34c:636-636.

KOUADIO, K., RIDE.AU, M., GANSER , G.. CHE-NIEUX , J.C. i VIEL, C. (1984) Biotransformation

of ellipticine into 5-formyl ellipticine by Chois-va ternata strains . Plant Cell Rep., 3:203-205.KOUADIO, K., CRECHE , J., CHENIEUX, J.C., Ri-DEAU, M. i VIEL, C. (1985) Alkaloid productionby Ochrosia elliptica cell suspension cultures. J.Plant Phi'siol., 118:277-283.

KREUZALER, F. i HAHLBROCK , K. (1975) Enzy-mic synthesis of an aromatic ring from acetateunits . Partial purification and some propertiesof flavonone synthase from cell suspension cul-tures of Petroselinum hortense. Fur. J. Bio-chem., 56:205-2 13.KURZ, W.G.W., CHATSON , K.B. CONSTABEL, F.,KUTNEY , J.P., CHOI, L.S.L., KOLODZIEJCZYK, P.,SLEIGH . S.K. i STUART . K.L. (1980 ) The produc-tion of catharanthine and other indole alkaloidsby cell suspension cultures of Catharanthus ro-seus. Planta . tied., 39:284.

KURZ, W.G.W. i CON5TABEL, F. (1985) Aspectsaffecting biosynthesis and biotransformation ofsecondary metabolites in plant cell cultures.CRC Crit. Rev. Biotechnol., 2:105-118.KUTNEY, J . P. (1982 ) Studies in plant tissue cul-

ture: potential sources of clinically important

anti-tumor agents. Pure .-ippl. Cheri., 54:2523-

2536.

102. KUTNEY, J.P., AWERYN, B., CHOI, L.S.L., HON-

DA, T., KOLODZIEJCZYK, P.. LEWIS, N.G., SATO,

T., SLEIGH, S.K., STUART, K.L., WORTH, B.R.,

KURZ, W.G.W., CHATSON, K.B. i CONSTABEL, F.

(1983) Studies in plant tissue culture. The

synthesis and biosynthesis of indole alkaloids.

Tetrahedron, 39:3781-3795.

103. KUTNEY, J.P. (1984) Studies in plant tissue cul-ture. Synthesis and biosynthesis of clinically im-portant anti-tumor agents. Pure Appl. Chem.,56:1011-1024.

104. LECLERQ, J. (1984) Plant cells and tissues cultu-res in vitro and pharmaceutical industry. J.Pharm. BeIg., 39:401-408.

105. LEE, J.W. i LoPEz, A. (1984) Modification ofplant proteins by immobilized proteases. C'rit.Rev. Food Sci. Nutr., 21:289-322.

106. LEHTOLA, T., HUHTIKANG.AS, A., LUNDELL, J. iVALLANEN, T. (1982) Radioimmunoassay oflysergic acid derivatives from Claviceps paspalifermentation cultures. Planta tfed., 45:161.

107. LEISTNER, E. (1975) Isolierung. Identifizierungand Biosynthese von Anthrachiponen in Zell-suspensiomkulturen von .tforinda citri_folia.Planta .11ed., suppl: 214-224.

108. LINDSEY, K. I YEOMAN, M.M. (1983) Novel ex-perimental systems for studying the productionof secondary metabolites by plant tissue cultu-res. En: Plant Biotechnology (Mansell, S.H. andSmith, H., eds.) Soc. Exp. Biol., Sem. Series 18.Cambridge Univ. Press. Cambridge. pp. 39-66.

109. LINDSEY, K. i YEOMAN, M.M. (1984) The viabi-lity and biosynthetic activity of cells of Capsi-cum frutescens Mill. cv. annuurn immobilizedin reticulate polyurethane. J. E.rp. Bot.,35:1684-1696.

110. Liu, M.-C. (1974) A post-seminar report to theUS-ROC cooperative science program on planttissue and cell cultures. Taman sugar. 21:1-6.

111. LUCKNER, M., KUBERSKI, C., SCHEIHNER, H.,SCHW1EBODE, C. i DIETTRICH, B. (1982) Princi-ples regulating cardenolide formation in cellcultures of Digitalis lanata. Planta .tied.,45:134.

112. LUDERITZ, T. I GRISEBACH. H. (1981) Enzymicsynthesis of lignin precursors. Comparison ofcinnamoyl-CoA reductase and cinnamyl alco-hol: NADP'dehydrogenase from spruce (Piceaahies L.) and soybean (Glycine max L.). Eur. J.Biochem., 119:115-124.

113. M(' LAUCHL.AN, W.R., H.ASAN, M.. BAXTER, R.L.i SCOTT, A.I. (1983) Conversion of anhydrovin-blastine to vinblastine by cell-free homogenatesof Catharanthus roseus cell suspension cultures.

66 CARLES COD/NA, FRANCESC tILADO.t/A7', JAL'ME BASTIDA I JOSEP SIANEL LLABRT,S

Tetrahedron 39:3777-3780.114. MC CARTHY, J.J., RATCHIFFE, D. i STRETT, H.E.

(1980) The effect of nutrient medium composi-

tion on the growth cycle of Catharanthus roseus

(L.) G. Don cells grown in batch culture. J. Exp.

Bot., 31:1315-1325.

115. MALIGA, P. (1984) Isolation characterization ofmutants in plant cell culture. Annu. Rev. PlantPhvsiol., 35:519-542.

116. MANTELL, S.H. i SMITH, H. (1983) Plant Bio-technology. Soc. Exp. Biol., Sem. Series 18.Cambridge Univ. Press. Cambridge.

117. MARTIN, S.M. (1980) Environmental factors: B.Temperature, aeration and pH. En: Plant TissueCulture as a Source of Biochemicals (Staba, E.J.,eds.) CRC Press. Florida. pp. 143-148.

118. MATTIASSON, B. (1983) immobilized Cells andOrganells. CRC Press. Florida.

119. MEANS, F. Jr. (1983) Heritable variation in plantcell culture. Annu. Rev. Plant Phvsiol., 34:327-346.

120. MERILLON, J.M., RIDEAU, M. I CHENIEUX, J.C.

(1984) Influence of sucrose on levels of ajmalici-

ne, serpentine , and tryptamine in C'atharanihus

roseus cells in vitro. Planta .11ed., 50:497-501.

121. MISAWA, M., SAKATO, K., TANAKA, H., HAYASHI,

M. i SAMEJIMA, H. (1974) Production of physio-

logically active substances by plant cell suspen-

sion cultures. En: Tissue Culture and Plant

Science (Street, HE., ed.) Academic Press. Lon-

don. pp. 405-432.

122. MISAWA, M., TANAKA, H., CHIYO, O. i MUKAI,

M. (1975) Production of a plasmin inhibitory

substance by Scopolia japonica suspension cul-

tures. Biotech. Bioeng., 17:305-314.

123. MORITZ, S., ALFERMAANN, A.W. i REINHARD, E.

(1982) Continuous biotransformation by immo-

bilized cells in bioreactors. Planta Med., 45:154.

124. MORITZ, S., ALFERM.ANN, A.W. i REINHARD, E.

(1984) Biotransformation of cardenolids by im-

mobilized cells of Digitalis lanata. Farm. Tijd.

roar Belgie, 61:321.

125. MORRIS, P. i FOWLER, M.W. (1980) Growth andalkaloid content of cell suspension cultures ofPapaver sominierum. Planta Med., 39:284-285.

126. NAG, K.K. i STREET. H.E. (1975) Freeze preser-vation of cultured plant cells. Phvsiol. Plant.,34:254-265.

127. NICKEL, S. I STABA, E.J. (1977) RIA-test of Digi-

talis plants and tissue cultures. En: Plant Tissue

('ulture and its Bio-technological . Ipplication

(Bari, W., Reinhard, E. and Zenk, M.H., eds.)

Springer. Berlin . pp. 278-286.

128. NISHI, I. I MITSUOKA, S. (1975) Production of

anti-pectic ulcer substance by tissue cultures of

Isodon plants. Japan Patent Appl. N.° 50-

12288.

129. NOMINE, G. (1980) La place des bioconversionsdans l 'acces industriel aux steroides . Bull. Soc.Chim. France. Partie 11: 18-23.

130. OGINO, T., HIRAOKA, N. i TABATA, M. (1978)Selection of high nicotine-producing cells linesof tobacco callus by single cell cloning . Phvto-chemistrv, 17:1907-1910.

131. OKAMI, Y. (1982) Potential use of marine mi-croorganisms for antibiotics and enzym produc-tion. Pure Appl. ('hem., 54:1951-1962.

132. OVERTON, K.H. (1977) Biosynthesis of mevalo-

noid-derived compounds in cell cultures. En:

Plant Tissue Culture and its Bio-technological

Application ( Barz , W., Reinhard, E. and Zenk,

M.H., eds.) Springer. Berlin . pp. 66-75.

133. PAREILLEUx, A. i VINAS, R. (1983) Influence ofaeration rate on the growth yield in suspensioncultures of Caiharanthus roseus (L.) G. Don. J.Ferment. Technol., 6:429-433.

134. PETIARD, V. (1980) Antimitotic activities ofCatharanthus roseus tissue cultures . En: NaturalProducts as .1ledicinal Agents (Beal. J.L. andReinhard, E., eds.) Hippokrates Verlag. Stutt-gart. pp. 447-469.

135. PFEIFFER. B., Roos, W. i LUCKNER, M. (1982)

Accumulation of purpureaglycoside A in vacuo-

les of Digitalis lanata cells cultivated in vitro.

Planta .11ed., 45:154.

136. PINOL, M.T., PALAZON, J. I SERRANO, M. (1984)

Growth and nicotine content of tobacco callus

cultures wihtout organogenesis . Plant Sci. Lett.,

35:219-223.

137. POWLEDGE, T.M. (1984) Biotechnology touchesthe forest. Bio/technology 2:763-772.

138. PUHAN, Z. i MARTIN, S.M. (1971) The industrialpotential of plant cell culture. Prog. Ind. Micro-hiol.. 9:13-29.

139. RADWAN, S.S., I KOKATE, CH. K. (1979) Produc-

tion of higher levels of trigonelline by cell cultu-

res of Trigonella jbenum-graecum than by the

differentiated plant . Planta, 147:340-344.

140. RAMAWAT, K.G. i ARYA, H.C. (1979) Effect ofamino acids on ephedrine production in F.phe-dra gerardiana callus cultures. Phvtochemistrv,18:484-485.

141. RAZZAQUE, A. i ELLIS, B.E. (1977 ) Rosmarinicacid production in Coleus cells cultures. Planta,137:287-291.

142. REINERT, J. I BAJAJ, Y.P.S. (1977) Applied and

Fundamental Aspects of Plant Cell, Tissue and

Organ Culture. Springer. Berlin.

143. REINHARD, E. (1974) Biotransformation byplant tissue cultures . En: Tissue Culture andPlant Science (Street, HE.. ed.) Academic Press.London. pp. 433-459.

144. REINHARD, E. i ALFERMANN, A.W. (1980) Bio-

transformation by plant cell cultures. Adv. Bio-

POTF.NC I4L BIOTEC'NOLOGIC DEL CULTIC DE CEL-LULES VEGETALSPER .4 L'OBTENCIO DEPRODUCTES FARMACEUTICS 67

chem. Eng., 16:49-83.145. ROBINS, R.J., WEBB , A.J.. RHODES , M.J.C., PAY-

146.

147.

148.

149.

150.

151.

152.

153.

154.

155.

156.

157.

158.

NE, i MORGAN , M.R.A. (1984 ) Radioimmunoas-

say for the quantitative determination of quini-

ne in cultured plant tissues . Planta ,%Ied.,

50:235-238.

ROKEM , J.S., T.AL, B. 1 GOLDBERG , I. (1985)

Methods for increasing diosgenin production byDioscorea cells in suspension cultures . J. Nat.

Prod., 48:210-222.

ROLLER , U. (1978) Selection of plants and planttissue cultures of ('atharanthus roseus with highcontent of serpentine and ajmalicine. En: Pro-duction of Natural Compounds by Cell CultureMethods ( Alfermann , A.W. and Reinhard, E.,eds.) Ges . Strahlen and tlmweltforschg. Mun-chen . pp. 95-108.ROSAZZA, J.P. (1982 ) Micorbial Transforma-tions cif Bioactive Compounds . CRC Press. Flo-rida.

RUEFFER , M., KAN-FAN , C., HUSSON, H.-P.,

STOCKIGT, J. i ZENZ, M.H. (1979 ) 4,21-dehydro-

geissoschizine , an intermediate in heteroyohim-

hine alkaloid biosynthesis . J.C.S. Chem.Comm., 1016-1018.

SANDERMANN , H. Jr., SCHEEL , D. i TRENCK,

T.V.D. (1984) Use of plant cell cultures to studythe metabolism of environmental chemicals.Ecotoxicol. Environ. Safety. 8:167-182.SATO, F. i YAMADA, Y. (1984) High berberine-producing cultures of ('opus japonica cells.Phvtochemistr1,, 23:281-285.SCHALLENBERG, J. i BERLIN, J. (1979) 5-Methyl-triptophan resistant cells of Catharanthus ro-seus. Z. Naturforschg., 34c:541-545.SCHLEPPHORST, R. i BARZ, W. (1979) Metabo-lism of aromatic acids in plant cell suspensioncultures. Planta .11ed., 36:333-342.SCHONBERGER, G. i REINHARD, E. (1984) Pro-

duction of saponins in cell cultures of Panaxginseng C.A. Meyer. Farm. Tijd. voor Belgic,61:329.SCHULTE, U., EL-SHAGI, H. i ZENK , M.H. (1984)Optimization of 19 Rubiaceae species in cellculture for the production of anthraquinones.Plant Cell Rep., 3:5 1-54.SCOTT, Al.,.MIZUKAMI, H. i LEE, S.-L. (1979)Characterization of a 5-methyltryptophan resis-tant strain of Catharanthus roseus cultured cells.Phviochemistr1,, 18:795-798.SEIBER , M. i KADKADE, P.G. (1980) Environ-mental factors : A. Light. En: Plant Tissue Cultu-re as a Source of Biochemicals ( Staba , E.J., ed.)CRC Press. Florida. pp. 123-142.

SAHARGOOL, P.D. (1985) Future uses of plantcell culture techniques . Biochem. Educ.. 13:50-54.

159. SHIMIZU, Y. i NOGUCHI, M. (1973) Tank cultureof tobacco cells. Kagaku To Kogvo 26:231-234.

160. SHIMIZU, Y. (1985) Bioactive marine naturalproducts, with emphasis on hadling of water-soluble compounds. /. Nat. Prod., 48:223-235.

161. SHULER, M.L., SAHAI, O.P., i HALLSBY, G.A.(1983) Entrapped plant cell tissue cultures. Ann.NY Acad. Sci., 413:373-382.

162. SHULER, M.L., PYNE, J.W. i HALLSBY, G.A.(1984) Prospects and problems in the large scaleproduction of metabolites from plant cell tissuecultures. J. Am. Oil. Chem. Soc., 61:1724-1727.

163. SMART, N.J. i FOWLER, M.W. (1984) Mass culti-vation of Catharanthus roseus cells using a non-mechanically agitated bioreactor. Appl. Bio-chem. Biotechnol., 9:209-216.

164. SENER, F., STABA, E.J. i MANGOLD, H.K. (1974)Lipids in plant tissue cultures. 11. Unusual fattyacids in lipids of Hvdnocarpus anthehninthicacultures. Chem. Phys. Lipids, 12:344-350.

165. STABA, E.J. i KAUL, B. (1971) Production ofdiosgenin by plant tissue culture technique.U.S. Patent N.° 3.628. 287.

166. STABA, E.J. (1977) Tissue culture and phar-macy. En: Applied and Fundamental Aspects ofPlant Cell, Tissue and Organ Culture (Reinert,J. and Bajaj, Y.P.S., eds.) Springer. Berlin. pp.694-702.

167. STABA, E.J. (1980) Plant Tissue Culture as aSource of Biochemicals. CRC Press. Florida.

168. STABA, E.J. (1985) Milestones in plant tissueculture systems for the production of secondaryproducts. J. Nat. Prod., 48:203-209.

169. STECK, W., BAILEY, B.K., SHYLUK, J.P. 1 GAM-

BORG, O.L. (1971) Coumarins and alkaloids

from cell cultures of Ruta graveolens. Phvtoche-

mistr1,, 10:191-194.

170. STECK, W. i CONSTABEL, F. (1974) Biotransfor-

mation in plant cell cultures. Llovdia, 37:185-

191.

171. STOCKIGT, J. (1980) Enzymatic formation of in-termediates in the biosynthesis of ajmalicine:strictosidine and cathenamine. Phvtochemistrv,18:965-971.

172. STOCKIGT, J. (1980) Indole alkaloids from cellsuspension cultures of C'atharanthus roseus andC'atharanihus ovalis. Planta Med., 39:285-286.

173. STOCKIGT, J., PFITZNER, A. 1 FIRL. J. (1981)Indole alkaloids from cell suspension cultures ofRaun'olha serpentina Benth. Plant Cell Rep.,1:36-39.

174. STOCKIGT, J. i PAWELKA, K.-H. (1982) Indolealkaloids from cell suspension cultures of Stem-madenia tomentosa and t'oacanga africana.Planta Med., 45:155.

175. STOHS, S.J. i ROSENBERG. (1976) Steroids andsteroid metabolism in plant tissue cultures. Lot'-

68 CARLES CODL\A. I-RA.ACESC I IL•IDO.tI.II JAL.tiL B.4S17DA I JOSEP.tl.1SEL LLIBRES

dia, 38:181-194.176. STOHS, S.J. (1977) Metabolism of steroids in

plant tissue cultures. En: Plant Tissue Cultureand its Bio-technological Application (Barz. W.,Reinhard, E. and Zenk, M.H., eds.) Springer.Berlin. pp. 142-152.

177. STREET, H.E. (1973) Plant cell cultures: theirpotential for metabolic studies. En: Biosynthesisand its Control in Plants (Milborrow, By., ed.).Academic Press. London. pp. 93-125.

178. STREET, H.E. (1977) Applications of cell suspen-

sion cultures. En: Applied and Fundamental As-

pects of Plant Cell. Tissue and Organ Culture

(Reinert, J. and Bajaj, Y.P.S., eds.) Springer.

Berlin. pp. 649-667.

179. TATABA, M., YAMAMOTO, H., i HIR.AOK.A, N.

(1971) Alkaloid production in the tissue cultu-

res of some solanaceous plants. En: Les Cultures

de Tissue des Plantes. C.R.N.S. Paris. pp. 389-

402.

180. TABATA, M., MIZUK.AMI, H., HIRAOKA. N. i Ko-NOSHIMA, M. (1974) Pigment formation in ca-llus cultures of Lithosperrnum ervthrorhizon.Phvtochernistr1-, 13:927-932.

181. TABATA, M., HIRAOKA, N., IKENOUE, M., SANO,

Y. i KONOSHIMA. M. (1975a) The production of

anthraquinones in callus cultures of Cassia tora.

Lloydia, 38:131-134.

182. TABATA, M., MizLr MI, H., NODE, i KONOSHI-

MA, M. (1975b) Antimicrobial activity of Lit-

hosperrnum erythrorhi_on callus cultures. Yaku-

gaku Zasshi, 95:1376-1379.

183. TABATA, M., MIZUKAMI, H., HIRAOKA, N. i Ko-

NOSHIMA, M. (1976) The production and regula-

tion of shikonine derivatives in cultured cells.

Abstr. 12th. Phytochem. Symp. Japan. Kyoto.

pp. 1-8.

184. TABATA, M. (1977) Recent advances in the pro-

duction of medicinal substances by plant cell

cultures. En: Plant Tissue Culture and its Bio-

technological Application (Barz, W., Reinhard,

E. and Zenk, M.H., eds.) Springer. Berlin. pp.

3- 1 6.

185. TABATA, M., OGINO, T., YOSHIOKA, K., YOSHI-

KAWA, N. i HIRAOKA. (1978) Selection of cells

lines with higher yield of secondary products.

En: Frontiers of Plant Tissue Culture (Thorpe,

T.A., ed.) Univ. Calgary. Calgary, Canada. pp.

213-222.

186. TABATA. M., UMETANI, Y., SHIMA, K. i TANAKA,

S. (1984) Glucosylation of esculetin by plant

cell suspension cultures. Plant Cell Tissue Or-

gan Cult., 3:3-10.

187. TAK.AYAM.A, S., MISAWA, M.. Ko. K. i MISATO, T.

(1977) Effect of cultural conditions on the

growth of .9grosternma githago cells in suspen-

sion culture and the concomitant production of

an anti-plant virus substance. Phtsiol. Plant.,41:313-320.

188. TAL, B., ROKEM, J.S. i GOLDBERG, I. (1984a)

Timing of diosgenin appearance in suspension

cultures of Dioscorea deltoidea. Planta .fled.,

50:239-241.

189. TAL, B., T.AMIR, 1., ROKEM, J.S. I GOLDBERG, 1.

(1984b) Isolation and characterization of an in-

termediate steroid metabolite in diogenin

biosynthesis in suspension cultures of Dioscorea

deltoidea cells. Biochern. J. Mol. .-Ispects,

219:619-624.

190. TAMAKI, E., MORISHLIA, 1., NISHII>A, K., K.ATO,K. i MATSUMOTO, T. (1973) Process for prepa-ring licorice extract-like material for tobaccoflavouring. U.S. Patent N.° 3.710.512.

191. TAN.AHASHI, T., N.AGAKURA, N., INOUYE. H. i

ZENK, M.H. (1984) Radioimmunoassay for the

determination of loganin and the biotransfor-

mation of loganin to secologanin by plant cell

cultures. Pln-tochemistrr, 23:1917-1922.

192. TANAKA, H., MACHIDA, Y., MUKAI, N. i MIS.A-

WA. M. (1974) Accumulation of glutamine by

suspension cultures of Symphynnn o(frcinale.

.-igr. Biol. C'hern., 38:987-992.

193. TAYLOR, W.I. I F.ARNSWORTH, N.R. (1975) The

Catharanthus .Alkaloids. Marcel Dekker. New

York.

194. TEUSCHER. E. (1973) Probleme der Sekundarstoffbildung in pflanzlichen Zellkulturen. Phar-mazie, 28:6-18.

195. THORPE. T.A. (1978) Frontiers of Plant TissueCulture. Univ. Calgary. Calgary, Canada.

196. THORPE, T.A. (1983) Biotechnological applica-tion of tissue cultures to forest-tree improve-ment. Biotechnol..,ldv., 1:263-278.

197. TREIMER, J.F. i ZENK, M.H. (1979a) Purifica-

tion and properties of strictosidine synthasc, the

key enzyme in indole alkaloid formation. Etc.

J. Biochern., 101:225-233.

198. TREIMER, J.F. i ZENK, M.H. (I979b) Strictosidi-

ne synthase from cell cultures of Apocynaceae

plants. FEBS Lett., 97:159-162.

199. TSUKAD.A, M. i TABATA, M. (1984) Intracellularlocalization and secretion of naphtoquinonepigments in cell cultures of Lithosperniumerythrorhi=on. Planta ;fled., 51:338-341.

200. TUDGE, C. (1984) Drugs and dyes from plantcell cultures. New Sci., 101:25.

201. UEDA, S., KOBAYASHI, K., MURAMATSU, T. I

iNOUYE, H. (1981) Studies on monotcrpene glu-

cosides and related natural product. Part XL.

Iridoid glucosides of cultured cells of Gardenia

jasminoides f. grandiflora. Planta .sled., 41:I86-

191.

202. ULBRICH, B. i ZENK, M.H. (1979) Partial purifi-cation and properties of hydrox}cinnamo%l-

POTENCIAL BIOTECNOLOGIC DEL CULTIU DE CPL-LULES VEGET.4LSPER A L'OBTENCIO DE PROD UCTES F.4RMACEUTIC'S 69

Coa: quinate hydroxycinnamoyl transferasefrom higher plants. Phvtocheruistrv, 18:929-933.

203. VANKOVA, R., VANEK, T., MACEK, T., JIRKU, V. iKAMINEK, M. (1983) Production of a cytokinin(trans-zeatin) by cytokinin-dependent and cyto-kinin-autonomous tobacco cells immobilized onpolyhenyleneoxide. Abstr. 2nd. Int. Conf.Chem. Biotechnol. Biol. Active Nat. Prod. Bu-dapest. pp. 2I8.

204. VASIL. I.K. (1980) Perspectives in Plant Cell and

205.

206.

207.

208.

209.

210.

211.

212.

213 .

214.

Tissue Culture. Academic Press. London.VEUKY, I.A. i LATTA, R.K. (1974) Antimicrobialactivity of cultured plant cells and tissues. Llov-dia, 37:611-620.VENKATSUBRAMANIAN, K. (1979) Immohih:edMicrobial (ells. ACS Symp. Series N.° 106. Am.Chem. Soc. Washington.WEILER, E.W. (1977) Radioimmuno-screeningmethods for secondary plant products. En:Plant Tissue Culture and its Bio-technologicalApplication ( Barz, W., Reinhard , E. and Zenk,M.H., eds .) Springer . Berlin . pp. 266-277.WESTCOTT, R.J. i HENSHAw . G.C. (1976) Pheno-lic synthesis and phenylalanine ammonia lyaseactivity in suspension cultures of .-leer pseudo-platanus L. Planta, 131:67-73.WESTEKEMPER , P., WIF.(ZOREK, U., GtJERITTE,F., L.ANGLOIS, N., L.ANGLOIs, N., POTTIER, P. iZENK, M.H. (1980 ) Radioimmunoassay for thedetermination of the indole alkaloid vindolinein Catharanthus. Planta .filed., 39:24-37.WET, J. M.J. de ( 1983) Biotechnology and thefuture of agriculture . Ill. Res., 25:3-5.WHITAKER, R.J., HASHIMOTO , T. i EVANS, D.A.(1984) Production of the secondary metaboliterosmarinic acid, by plant cell suspension cultu-res..4nn . N)'.-tcad. Sci.. 435 :364-366.WI('HERS , H.J., WIJNSMA , R., VISSER , J.F., MA-LINGRE, T.M. i HtUING, H.J. (1985 ) Productionof L-DOPA by cell suspension cultures of .ilacu-na pruriens . 11. Effect of environmental parame-ters on the production of L-DOPA. Plant CellTissue Organ Cult., 4:75-82.WIDHOLM , J.M. (1980 ) Selection of plant celllines which accumulate compounds . En: P/antTissue Culture as a Source of Biochemicals (Sta-ba. E.J ., ed.) (R( Press . Florida. pp. 99-114.WIJNSMA, R., VERPOORTE , R., HARKES , P.A.A. iBAERHPIM -SVENDSEN , A. ( 1984 ) The productionof secondary metabolites in callus cultures of(inchona ledgeriana Moens. Farm. Tujd. voorBelgic, 61:328.

215. YAMADA, Y. i ENDO, T. (1984) Tropane alka-loid production in cultured cells of Duhoisialeichhardtii. Plant Cell Rep., 3:186-188.

216. YAMADA, Y. i OKADA. N. (1985) Biotransforma-tion of tetrahydroberberine to berberine byenzyms prepared from cultured Coptis japonicacells. Phvtochemistrv, 24:63-65.

217. YEOMAN, M.M. i FORCHE, E. (1980) Cell prolife-ration and growth in callus cultures. Int. Rev.C't'tol.. suppl. 11.-1:1-24.

218. YEOMAN, M.M., MIEDZYBRODZCA, M.B., LIND-SEY. K. i Mc LAUCHLAN, W.R. (1980) Thesynthetic potential of cultured plant cells. En:P/ant Cell Cultures: Results and Perspectives(Sala, F., Parisi, B., Cella, R. and Ciferri, 0.,eds.) Elsevier. Amsterdam. pp. 327-343.

219. YEOMAN, M.M., LINDSEY, K., MIEDZYBRODZKA,M.B. i Mc LAUCHLAN, W.R. (1982) Accumula-tion of secondary products as a facet of differen-tiation in plant cell and tissue cultures. En: Dirferentiation In Vitro (Yeoman, M.M. and Tru-man, D.E.S., eds.) Cambridge Univ. Press.Cambridge. pp. 65-82.

220. ZENK, M.H., EL-SHAGI, H. i SCHULTE, U. (1975)Anthraquinone production by cell suspensioncultures of Morinda citritblia. Planta Med.,suppl.: 79-101.

221. ZENK, M.H., EL-SHAGI, H.. UBRICH, B. (1977a)Production of rosmarinic acid by cell-suspen-sion cultures of Coleus h/umei. Naturwiss.,64:585-586.

222. ZENK, M.H., EL-SHAGI, H., ARENS, H.,STOCKIGT, J., WEILER, E.W. i DEUS, B. (1977b)Formation of the indole alkaloids serpentineand ajmalicine in cell suspension cultures ofCatharanthus roseus. En: Plant Tissue Cultureand its Biotech nologicalApplication (Barz, W.,Reinhard, E. and Zenk, M.H. eds.) Springer.Berlin. pp. 27-43.

223. ZENK. M.H. (1978) The impact of plant cellculture on industry. En: Frontiers of Plant Tis-sue Culture (Thorpe, T.A., ed.) Univ. Calgary.Calgary, Canada. pp. 1-13.

224. ZENK, M.H. (1980) Enzymologie and Metabo-lismus von Alkaloiden in Catharanthus roseusZellkulturen. Iloppe Set'ler's Z. Phvsio/. ('hem.,361:354-355.

225. ZIMMERMANN, A. 1 HAHLBROCK, K. (1975)Light-induced changes of enzyme activities inparsley cell suspension cultures. Purificationand some properties of phenylalanine ammonialyase. .Arch. Biochem. Bioph vs.. 166:54-62.