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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA - IZTAPALAkA
DMSION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD
INFORME FINAL DE SERVICIO SOCIAL
POSIBLES ALTERACIONES HEMATOLOGICAS ASOCIADAS CON LA ADMINISTRA- CION DE METRONIDAZOL EN RATONES
LLC I 1 3 1 0 L g L A
Alumno : Ricardobcía Mendoza Matrícula: 84237698 Fecha de terminación: Septiembre de 1993. Lugar de realización: Lab. de Hematología Experimental S-254. Asesores: Q.B.P. Rafaela Tapia Aguilar
M. en B.E. Rodolfo Velasco Lezama
1
1 5 3 8 5 9
Agradezco al personal de la UAM por las fkdidades prestadas para realiar el presente
trabajo; a mi fámilia, a mis amigos y en especial al Ing. Gabriel Ramos Cruq al Sr. Jorge Vdlez
Ledesma y al Biol. Exp. H&or Zayaq Pérez quienes amablemente me brindaron su ayuda para
escribir el texto en computadora e imprimirlo.
2
." . ,
INDICE
INTRODUCCION
OBJETIVOS
HIPOTESIS DE TRABAJO
DISEÑO EXPERIMENTAL
MA- Y EQUIPO
METODOS
RESULTADOS Y DISCUSION
CONCLUSIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
................................ 4
............................... 6
................................ 7
................................ 8
................................ 11
................................ 13
................................ 17
................................ 32
................................ 33
3
I
i
1
I
INTRODUCCION
Desde que el Hombre descubrió en los antibióticos un arma poderosa para suprimir el
desarrollo de microorganismos patógenos tambih ha tenido el reto de investigar a fondo los
efectos secundarios de estas sustancias tanto en humanos como en animales.
Durante las tres décadas mas recientes, las grandes cornpaíiías farmacéuticas han sintetizado
químicamente sustancias antimicrobianas que antes solo se podían obtener mediante el cultivo de
actinomicetos, logrando a s í la purificación de tales molthulas de manera que provoquen los
mínimos efectos indeseables en el hombre durante el tratamiento de una infeccón, pero esto ha
sido posible sólo en parte. De hecho, la gran mayoría de antimicrobianos presentan efectos
indeseables importantes, por lo que se debe vidar su administración como fgrmacos de primera
elección.
En diversos estudios clínicos, entre ellos el de Williams [l], se reporta toda una variedad de
antiparasitarios que tienen efectos secundarios a nivel hematológico; uno de los mhs importantes
es la quinina, antipalúdico causante de anemia hemolítica. El paludismo, asi como la oncocercosis
y otras enfermedades parasitarias, son adquiridas en áreas rurales. Sin embargo, existe otro grupo
de parasitosis como la amibiasis, que puede encontrarse tanto en áreas rurales como urbanas,
constituyendo uno de los más graves problemas de salud pública en nuestro país; ya que tiene una
amplia distribución a nivel nacional asociada con ambientes de insalubridad y pobreza en las que
habita una gran parte de la población.
Entre los antimicrobianos de elecci6n para el tratamiento de la amibiasis y otros P*OS
intestinales y en tricomoniasis, el más eficaz es el metronihazol [21; ya que actúa tanto sobre
trofozoítos (formas vegetativas), como sobre los quistes o formas resistentes del parásito.
H - C - N
El metronidazol, 1 -(2-hidroxietil)-2-meti"nitroimidazol, ha sido sintetizado químicamente
por la compania Rhone-Poulenc [3] desde 1960. Sus efectos en el metabolismo y distribución
corporal en el Hombre, heron estudiados por Ings [4] y colaboradores en 1966.
Los microorganismos susceptibles al metronidazol son anaeróbicos o microaerofilicos. Estos
microorganismos han desarrollado un mecanismo de producción de energía y de transporte de
electrones que les permite sobrevivir en ausencia de oxígeno.
El metronidazol inhibe la liberación de hidrógeno al desviar la cadena de transporte de
electrones a nivel de la ferredoxins, cuyo potencial de óxido-reducción es de -450 mV. El
potencial de óxido-reducción del metronidazol es de -560 mV, y por lo tanto actúa extrayendo
electrones de una proteína transportadora de menor potencial. La inhibicibn selectiva del
metronidazol se basa en que únicamente microorganismos anaeróbicos tienen sistemas de
óxido-reducción de potencial negativo compatibles con este
flurnaco.
El metronidazol es el antiparasitario de elección en" el tratamiento de la amibiasis. No
obstante se han reportado casos clínicos de neutropenia y leucopenia transitoria [5]. Debido a
que se trata de casos aislados, no se dispone de información suficiente con respecto a los efectos
tóxicos que se presentan en el sistema hematológico de los pacientes tratados con metronidazol
[6]. En el presente trabajo se tiene como propósito determinar el posible papel tóxico del fiúmaco
sobre la producción de células sanguíneas en ratones tratados con dicho antimicrobiano.
5
OBJETIVO
Objetivo General
Determinar los posibles cambios hematológicos asociados con la administración de
metronidazol en ratones como indicador de su toxicidad.
6
I
I
i
HIPOTESIS
En casos clínicos reportados en la literatura se ha encontrado que la administración de
metronidazol puede provocar la disminución de leucocitos como efecto secundario del
tratamiento.
La administración de este fgnnaco en ratones utilizados como modelo experimental permitiría
conocer si las alteraciones hematológicas son o no atribuibles al metronidazol.
DISEÑO EXPERlMENTAI,
FASE I
Determinación de los valores normales de leucocitos, eritrocitos y plaquetas en 1 O ratones no tratados.
- 1 FASE II
Administración de metronidad en suspensión.
I
Lote Tratado I
Inoculación Intraperitoneal
de suspensi6n de metronidazol
(100 m&).
Días de Inoculación: O, 1,2.
Día de sangrado: 3.
( 10 ratones).
I
Lote Testigo I
Inoculación Intraperitoneal
de solución salina fisiológica.
Días de Inoculación: O, 1,Z.
Día de sangrado: 3.
, , . ( 10 r a t r ).
I I I
1
Cuantificación de leucocitos, eritrocitos, plaquetas y Cuenta Diferencial: día 3.
I 1
8
FASE III
Administración de Metronidazol en solución inyectable.
Lote Tratado 11
ler. Esquema de Tratamiento
Inoculación Intraperitoneal
de solucibn inyectable de
metronidazol(lO0 m-).
Días de inoculación: O, 1,2,
3. Días de sangrado: 3, 10.
(5 ratones).
1
I
Lote Testigo II
1 er . Esquema de Tratamiento
Inoculación Intraperitoneal
de solución salina fisiolb
gica.
Días de inoculación:O, 1 , 2,
3. Días de sangrado: 3, 1 O.
(5 ratones).
Cuanticación de leucocitos, eritrocitos, plaquetas y Cuenta Diferencial: días
3, 10. I
9
20. Esquema de Tratamiento
Inoculación Intraperitoneal
de solucib inyectable de
metronidazol ( 100 mgkg ). Mas de inoculacibn: 0,l ,2,
4,6, 8. Días de descanso:
3, 5, 7. Día de sangrado: 9.
Lote Testigo III
20. Esquema de Tratamiento
Inoculación Intraperitoneal
de solucibn salina fisiológica.
Días de Inoculacibn: O, 1,2,4,6,8.
Días de descanso:
3, 5, 7. Día de.sangrado: 9.
5 ratones).
I L
Cuantificación de leucocitos, eritrocitos, plaquetas y Cuenta
Diferencial: día 9.
MATERIAL. Y EQUIPO
Material de Laboratorio:
Hemocitómetro.
Pipetas de Thoma para glóbulos blancos.
Pipetas de Thoma para glóbulos rojos.
Cajas de Petri.
Estuche de diseccibn.
Jeringas estdriles de 1 d.
Contador manual de células.
Soluciones, Reactivos y Medios de cultivo:
Suspensión de benzoilo de metronidazol
Solución inyectable de metronidazol
Solución saliia fisiológica
Medio de Wsi6n de cerebro-corazón
Etanol
Amortiguador de fosfatos
25 m g / d (Rhone-Poulenc).
200 mg/d (Silanes).
0.85%
(Sioxon).
96% (Merck).
(Beckman).
METODOS
Cuantificación de Leucocitos
Material Biológico:
ratones macho de 8 a 12 semanas, cepa CD-1.
Procedimiento:
l . Se pesa y se sujeta al ratón para hacerle un corte en la punta de la cola.
. 2. Se elimina la primera gota de sangre y se carga la pipeta de Thoma para blancos hasta la marca
de 0.5 .
3. Se diluye la sangre con solución de Turk hasta llegar a la marca de 1 l .
4. Se agita la pipeta manualmente por inversión durante un minuto y en el agitador de pipetas
durante 2 minutos.
5 . Se desechan las primeras 3 gotas de cada pipeta absorbiendo con papel higiénico y se llena una
chara cuenta-glóbulos cubierta con un cubreobjetos.
6. La chara cuenta-glóbulos se coloca en una caja de Petri con papel filtro humedecido y se deja
en reposo durante 10 minutos.
7. Las células se cuentan al microscopio en los cuadros de .los extremos de la cámara con el
objetivo de 40X. J
Cuantiíicación de Eritrocitos y de Plaquetas
Material Biológico:
ratones macho de 8 a 12 semanas, cepa CD-l.
Procedimiento:
1. Se pesa al ratón y se sujeta para hacerle un corte en la cola.
2. Se elímina la primera gota de sangre y se carga la pipeta de Thoma para glbbulos rojos hasta
llegar a la marca de 0.5 .
3. Se diluye la sangre con el líquido de Dacie en el caso de los eritrocitos, o con oxalato de
amonio al 1 % en el caso de plaquetas, hasta llegar a la marca de 101.
4. Se agita cada pipeta manualmente por inversión durante un minuto y em el agitador de pipetas
durante 2 minutos.
5. Se desechan las primeras 3 gotas de cada pipeta absorbiendo con papel higiénico y se llena una
c h a cuenta-glóbulos.
6. La cámara cuenta-glóbulos se coloca en una caja de Petri con papel filtro humedecido y se deja
en reposo durante 10 minutos.
7. Se cuentan al microscopio óptico las células halladas en la cuadrícula central de la cámara . En
el cam de las plaquetas se utiliza contraste de fase.
14
" " ..
Inoculación intraperitoneal de metronidazol
Material biológico:
20 ratones macho de 8 a 12 semanas, cepa CD- 1.
Reactivos y Soluciones:
Suspensión de metronidazol12,8 mg/d esterilizada.
Solución salina fisiolbgica 0.85% esterilizada.
Solución inyectable de metronidazol200 mg/ml.
Procedimiento:
1.- Se sujeta al ratón cabeza abajo con el vientre descubierto y se le inyecta por vía
intraperitoneal 0.25 ml de la suspensión de metronidazol, de acuerdo a la dosis diaria elegida (100
mgflrg) r71.
2.- A un segundo ratón testigo se le inyecta con el mismo volumen de solución salina fisiológica
por la misma vía.
15 1 5 3 8 5 9
I
I
I
t
\
Tinción Diferencial
Reactivos y Soluciones:
colorante de Wright.
agua destilada.
Procedimiento:
1. Con la sangre del ratón se hace un extendido y se deja secar al aire.
2. Se coloca sobre un puente de tinción y se le agrega gota a gota el colorante de Wright
previamente filtrado.
3. Se deja al colorante actuar durante 15 minutos y posteriormente se diluye con agua destilada,
se mezcla y se deja actuar durante 1 O minutos.
4. La laminilla se lava con agua corriente hasta que adquiere un tono metálico.
5. Se deja secar al aire, se observa al microscopio óptico y se cuentan 200 células con el objetivo
de inmersibn.
RESULTADOS Y DISCUSION
Durante la fase I se determinaron las concentraciones sanguíneas de leucocitos, eritrocitos y
plaquetas en ratones que no recibieron tratamiento alguno. Los resultados corresponden con los
valores reportados en la literatura [7], y se muestran en la tercera columna de las grsficas 1, 2 y
3.
Los resultados de la fase I1 se refieren a las concentraciones en sangre de leucocitos,
eritrocitoss y plaquetas de ratones que recibieron tres dosis consecutivas de metronidaml en
suspensión (lote tratado), el lote inoculado con solución salina fisiol6gica (lote testigo) y el lote
sin tratamiento. los resultados se muestran en las gracas 1,2 y 3.
Cuantificación de Eritrocitos Metronidazol en suspensi6n
6
x 10 14 j
"
I 1
I I
M.- metronidazol S.- sol. salina B.- no tratado
cels/mm3 Orhfica 1
17
Cuantificación de Plaquetas Metronidazol en suspensi6n
cels/mm3
QrBfica 2
Cuantificaci6n de Leucocitos Metronidazol en suspensi6n
=M
3 x 10
40
30
20
10 "
0 -
cels/mm3 Grhfica 3
" -
En la Tabla 1 se muestra la cuenta diferencial correspondiente a la fase II del proyecto :
Cuenta Diferencial
Metronidazol Sol. Salina Schermer (1 967)
Linfocito8
Monocitos
Eosindfilos
Bas6IiJos
Meta
Banda
Seymen tados
57 % 28 %
4 % 3 %
1 % 0 %
0 % 0 %
1 % 1 % f
18 % 30 %
19 % 38 %
35-87 %
O - 2 96
o- 7 %
0 %
10-60 96
TABLA 1
FASE II .
La comparación entre los grupos, muestra que la concentraci6n porcentual de leucocitos
corresponde a lo reportado en la literatura (7).
20 153859
Las concentraciones de eritrocitos entre el grupo inoculado con metronidazol y el grupo
testigo muestran muy poca variación entre sí (grsca 1). Lo mismo ocurre con las
concentraciones de plaquetas. No se ha encontrado hasta ahora evidencia en la literatura acerca
de un posible efecto del metronidazol sobre eritrocitos o sus precursores en sangre o en médula
ósea.
Como puede observarse en la gráfica 2, la administración de metronidazol tampoco provocó
alteraciones en la concentración de plaquetas en los ratones que fberon inoculados.
La concentración de leucocitos en el grupo metronidazol es elevada con respecto a su testigo y
al grupo no tratado (gráfica 3). Esta diferencia no es estadísticamente sigdcativa, sin embargo es
contraria a los reportes de algunos autores (S), ya que dstos han encontrado casos clínicos
aislados de neutropenia y leucopenia transitoria.
La dosis empleada en estos experimentos es la reportada por Ings y colaboradores (4) para
estudiar el metabolismo del fhnaco, calculada según el peso corporal del animal.
Es posible que la alta concentración de leucocitos encontrada en la fase II haya sido producto
de la presentación particulada del metronidazol, más que un efecto colateral del mismo. Sin
embargo debido a que no se estudió la presencia de grhulos tóxicos por acumulación de
metronidazol en neutrófilos, puede pensarse en un mecanismo de fagocitosis inespecifica ante
partículas extrailas.
Para determinar si este aumento podía atribuirse a una respuesta inespecífica de la
presentación del fhmaco, en la fase III se empleó un primer esquema de tratamiento, consistente
en un experimento similar al de la fase II, pero esta vez se sustituyó la suspensión de metronidazol
por solución inyectable.
Para conocer si la respuesta al metronidazol era inmediata o posterior al tratamiento, se
realizó una doble cuantificación de leucocitos, eritrocitos, plaquetas y diferencial el día 3 y el día
10 del experimento; esto es, la segunda cuantificación h e llevada a cabo siete días desputs de la
última inoculación. Los resultados se muestran en la Tabla 2 y en las grhficas 4, 5 y 6.
I
21
Cuenta Diferencial .
Metrunidazol Sol. Salina Schermer (1 967)
día 3 día 10 dfa 3 dfa 1 O
Linfocitos 63 96 84 % 61 % 78 % 35-87 96
Mono cito8 3 % 1 % 4 % 3 % o- 2 %
Eosinb~filos 0 % 0 % 1 % 3 % o - 7 %
Das C, f ¡los 1 % 0 % 0 % 0 % 0 %
Meta
Banda 11 9b 6 % 12 9b - 3 % 1 10-60 %
SegmenPados 1 2 % 4 % 1 1 % 7 % i:
i
1 0 % 5 % 1 1 % 0 % :
.
TABLA 2 FASE 111
22
Cuantificación de Leucocitos
=M (dla 3) m 8 (día 3) mM (dla 10) 0 S (día 10) M.- grupo metronidarol S.- grupo soluci6n salina
cels/mm3 Primer Eequema de tratamiento
Gráfica 4
Cuantificación de Eritrocitos metronidazol en solucibn inyectable
6 x 10
~ . . " _ _ _ I
i 12.6
10
7.6
6
2.6
O
cels/mm3
m M (dla 3) S (dla 3) m M (dla 10) S (dla 10) M.- grupo metronidarol S.- grupo solucibn salina
Primer Esquema de Tratamlento
Cuantificacibn de Plaauetas metronidazol en soluci6n lnyectable
6 x 10
. - I I """ - "_
2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . I . . . . . . . . . 1
. . . . . . . . . 1.6 . . . . . . I . . . . . . . .... . . . . . . . . . -. . . . . . 1-
. . . . . . . . ' . . . . . . . . . . . . . . .
0.5 . . . . . . . . . . . .
0 - . . . . .
cels/mm3
m M (dla 3) S (dla 3) m M (día 10) 0 S (dla 10) M.- grupo metronidazol S.- grupo soluci6n salina
Primer Esquema de Tratamiento
Gráfica 6
Los resultados de la fase III confirmaron que después de la administración de metronidazol
en solución inyectable no se obtuvieron concentraciones altas de leucocitos (gdtlca 4) como en la
fase II. Incluso siete días después de la liltima inoculación, la diferencia entre las medias de las
concentraciones respectivas de leucocitos se mantiene muy estrecha, lo que significa que el
&maco no presenta actividad siete días posterior a tres dosis consecutivas, incluyendo a
eritrocitos y plaquetas (gráficas 5 y 6), en las cuales ya se esperaba que las desviaciones con
respecto a sus medias resultaran mínimas.
La distribucibn de leucocitos mostrada en la Tabla 2, muestra un porcentaje n o d de
leucocitos e m la sangre.
Con base en los resultados obtenidos, se decidió llevar a cabo un esquema de tratamiento
diferente para probar el efecto del metronidazol en solución a travbs de la aplicacibn de un mayor
número de inoculaciones, usando la misma dosis en cada una de ellas y siguiendo la misma vía de
administración.
En este esquema, cada ratón fue inoculado con seis dosis aplicadas en días alternados. Se
efectuaron las cuantificaciones correspondientes el día 9 del experimento. Los resultados se
muestran en la Tabla 3 y en las graticas 7,8 y 9.
26
Cuenta Diferencial
Metronidazol Sol. Salina Schermer (1 967)
Linfocitos 70 % 73 36 35- 07 96
Mono ci tos 3 % 5 % o- 2 %
Eosindfilos 3'36
Basbfilas 0 % 0 %
0 %
hie th 8 %
Banda 3 %
Segmen tadas 7 %
u- .7 %I
10-60 70
'FASE 111 TASLA 3
I
i
. Cuantificación de Erittocitos
metronidazoi en solucidn inyectabie
ns m B L"
6
1 4 r - - - -
x 10 - "- .___ ~
1 I 1 12
10
8
6
4
2
O M.- metronldazol S.- sol. salina B.- no tratado
Segundo Esquema de tratamiento cela/mm3 -.
Gráfica 7
m m
m ' :..
O
I
u u
E
.... ... ' a
153859
.
3c
26
* 20
16
10
6
O
Cuantificaci6n de Leucocitos metronidatol en rolucl6n lnyectable
3 x 10
M.- metronidazol S.- 801. salina B.- no tratado
cels/mm3 Segundo Esquema de Tratamiento
Grdfica 9
En la cuenta diferencial de la Tabla 3 se observa que los rangos de leucocitos y neutrbfilos se
mantuvieron constantes, sin mostrar un posible efecto del metronidazol en cuanto a las
concentraciones porcentuales de los mismos.
En las gráficas 7 y 8 se puede observar que no hay respuesta al cambio de tratamiento en las
concentraciones sanguíneas de eritrocitos y plaquetas, ya que se mantienen constantes. Sería
conveniente hacer un estudio acerca de la permeabilidad de la membrana plasmática de estas
líneas celulares en un medio con metronidazol.
En la grhflca 9 se muestran las concentraciones de leucocitos de los p p o s tratado, testigo y
no tratado. Una vez mhs se obtuvieron valores cercanos entre sí y que no sobrepasan los
mostrados en el primer esquema de tratamiento.
Lo que tambidn se observa en esta gráfica es una gran desviación estándar del grupo tratado
con metronidazol, lo que sugiere que hubo muchos tipos de respuesta ante el fkmaco, que la
respuesta no es específica y que es dependiente en gran parte de la susceptibilidad de los sujetos.
CONCLUSIONES
No se encontraron alteraciones sislllficativas en las concentraciones absolutas de eritrocitos,
leucocitos y plaquetas en los sujetos tratados ya sea con metronidazol en suspensión o en solución
inyectable después de la administración de tres a seis dosis del fármaco evaluadas al cuarto y al
dkimo primer día de tratamiento.
No se encontraron alteraciones signdlcativas que sugieran posibles efectos SeCulEdarjos del
metronidazol en suspensión o en soluci6n inyectable sobre la concentración porcentual de
leucocitos en las muestras de los sujetos tratados en comparación con el grupo testigo y con el
grupo no tratado en la dosis y bajo los esquemas de tratamiento mencionados.
Los resultados obtenidos a través de esta investigación son producto de un primer intento
por conocer la capacidad tóxica del metronidazol sobre el sistema hematopoi&ico, por lo que se
sugiere realizar aniilisis morfológicos y bioquímicos más extensos y detallados.
I
32
-
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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Ambrose et al. (1985). Dis Colon Rectum. 28. 81-87.
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(4) Ings et al. (1 966). Biochem Phannacol. 15, 5 15.
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(7) Schemer, S. (1967). The Blood Momholotg of Laborato? Animals. 41-59.
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" "
