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H. Hosseini., 1
UNIVERSITÉ PARIS-EST
ÉCOLE DOCTORALE
Sciences de la Vie et de la Santé
Champ disciplinaire
Neurosciences
Soutenu par
Dr Hassan HOSSEINI
"NEUROPROTECTION ANTIINFLAMMATOIRE ET
ANTIISCHEMIQUE PAR MODULATION DU PROTEASOME"
Thèse dirigée par le Dr Brigitte ONTENIENTE
Soutenue le 14/12/2010
Jury :
Pr Alain Berdeaux Président du Jury
Pr Pierre Cesaro Examinateur
Pr Jean-Louis Mas Rapporteur
Pr Michel Plotkine Rapporteur
Dr Brigitte Onteniente Directrice de thèse
H. Hosseini., 2
H. Hosseini., 3
UNIVERSITÉ PARIS-EST
ÉCOLE DOCTORALE
Sciences de la Vie et de la Santé
Champ disciplinaire
Neurosciences
Soutenu par
Dr Hassan HOSSEINI
"NEUROPROTECTION ANTIINFLAMMATOIRE ET
ANTIISCHEMIQUE PAR MODULATION DU PROTEASOME"
Thèse dirigée par le Dr Brigitte ONTENIENTE
Soutenue le 14/12/2010
Jury :
Pr Alain Berdeaux Président du Jury
Pr Pierre Cesaro Examinateur
Pr Jean-Louis Mas Rapporteur
Pr Michel Plotkine Rapporteur
Dr Brigitte Onteniente Directrice de thèse
H. Hosseini., 4
H. Hosseini., 5
TABLE DES MATIERES
TABLE DES MATIERES 5
ABREVIATIONS 6
RESUME 7
SUMMARY 8
REMERCIEMENTS 9
INTRODUCTION 10
MATERIEL ET METHODES 38
RESULTATS 48
DISCUSSION 61
CONCLUSION 67
REFERENCES 87
H. Hosseini., 6
ABREVIATIONS
AVC : accident vasculaire cérébral
CFA : complete Freund’s adjuvant
EAE : encéphalomyélite autoimmune expérimentale
i.p. : intraperitoneal
i.v. : intravenous
ICAM : intercellular adhesion molecule
IFN-interferon
Iv : indinavir
LFA : lymphocyte function associated antigen
MAO : occlusion de l'artère cérébrale moyenne
MBP : myelin basic protein
MHC : major histocompatibility complex
MS : multiple sclerosis
Nv : nelfinavir
p.i. : post immunization
PBS : phosphate buffered saline
Rv : ritonavir
SEP : sclérose en plaques
Sv : saquinavir
VCAM : vascular cell adhesion molecule
H. Hosseini., 7
RESUME
L'inhibition du protéasome a un effet anti-inflammatoire en bloquant l'activation de NF-B.
Dans ce travail, nous avons étudié cette propriété anti-inflammatoire dans deux modèles
animaux de maladies neurologiques: la sclérose en plaques et l'AVC. Nous avons utilisé le
ritonavir, un antiprotéase du VIH et qui a des effets de modulation sur le protéasome. Ainsi
l'administration du ritonavir a permis d'inhiber l'EAE modèle animal de SEP. D'autre part,
un effet anti-ischémique cérébral a été obtenu chez les animaux ayant subi une occlusion de
l'artère cérébrale moyenne, modèle animal d'AVC. Ces effets neuroprotecteurs ont été
corrélés à une inhibition de la réponse inflammatoire chez les animaux traités.
Dans un deuxième temps, nous avons voulu confirmer la possibilité d'utiliser le ritonavir
dans un autre type de pathologie, l'AVC. Dans un modèle murin d'ischémie cérébrale, nous
avons montré que l'administration de ritonavir pouvait limiter la taille de l'infarctus. La
diminution de l'activité des caspases associée à la réduction du volume d'infarctus suggérait
que l'effet du ritonavir soit prépondérant dans la zone de pénombre, où dominent les
processus apoptotiques.
Ces résultats ouvrent des nouvelles perspectives thérapeutiques dans les maladies
inflammatoires basées sur la modulation du protéasome.
H. Hosseini., 8
SUMMARY
The inhibition of the proteasome has an anti-inflammatory effect by blocking the activation
of NF-B. In this work, we studied this anti-inflammatory property in two animal models
of neurological diseases: the multiple sclerosis and stroke. We used the ritonavir, an
antiprotease of the HIV and which has effects of modulation on the proteasome. The
administration of the ritonavir allowed the inhibition of inflammation and development of
neurological lesions in the EAE of MS. On the other hand, an anti-ischemic effect was
obtained in animal model of stroke. These neuroprotective effects were correlated with an
inhibition of the inflammatory response.
In a second series of experiments, we sought to deptermine the potential of ritonavir in the
treatment of stroke, which also includes a strong inflammatory reaction. We demonstrated
that ritonavir limits the extent of cerebral infarctus in a murine model of stroke. This
limitation is associated with a reduction of some caspases activity, suggesting that ritonavir
neuroprotective effects are mediated by anti-apoptotic affects.
These results open new therapeutic perspectives in the inflammatory diseases based on the
modulation of the proteasome.
H. Hosseini., 9
REMERCIEMENTS
Je tiens à remercier:
Brigitte Onténiente, grâce à qui ce travail a pu voir le jour. Elle m’a aidé à déterrer
un travail vieux de 10 ans,
Pierre Cesaro qui m’a fait confiance et qui m’a chargé de monter une Unité
Neurovasculaire qui accueille actuellement les patients atteints d’AVC 7 jours sur 7
et 24 h sur 24
Les membres du Jury qui ont accepté de juger ce travail dans un délai extrêmement
court. Je leur suis hautement reconnaissant.
Ma famille qui m’a toujours soutenu durant toutes ces années.
Je voudrais dédier ce travail à la mémoire de Monsieur Jean Denis DEGOS qui nous
manque.
H. Hosseini., 10
INTRODUCTION
Comme neurologue clinicien, deux maladies neurologiques m'intéressent tout
particulièrement : l'une inflammatoire, la sclérose en plaques (SEP), l'autre ischémique,
l'accident vasculaire cérébral (AVC). Ces deux maladies ont en commun une réponse
inflammatoire dans le SNC potentiellement délétère quand elle est excessive. Pendant mes
années de recherche je me suis attelé à développer les modèles animaux expérimentaux de
ces deux maladies : l'encéphalomyélite aiguë expérimentale (EAE) pour la première et
l'occlusion de l'artère cérébrale moyenne pour la seconde. Ces modèles animaux ont été
développés pour étudier les possibilités de neuroprotection par modulation du protéasome.
La voie de dégradation des protéines par le protéasome est fortement impliquée dans la
mort cellulaire liée à une ischémie cérébrale ou à l'exacerbation des réactions
inflammatoires. Il me semblait donc important, afin de proposer de nouvelles solutions
thérapeutiques d'analyser le potentiel de molécules déjà utilisées en clinique et pouvant
avoir un effet ubiquiste dans les désordres neurologiques qui impliquent une forte
inflammation. Le travail décrit dans ce mémoire a eu pour objectif de vérifier cette
hypothèse.
H. Hosseini., 11
I. LE PROTEASOME
A. Principes généraux
Le protéasome est un complexe enzymatique multiprotéique présent dans le noyau, le
cytosol et associé au réticulum endoplasmique. Il a une forme de baril et possède une cavité
en son centre, cernée par quatre anneaux (Fig. 1). Chaque anneau est composé de sept
protéines: les deux anneaux intérieurs sont constitués de sept sous-unités β qui contiennent
le site actif de la protéase, tandis que les deux anneaux extérieurs contiennent six sous-
unités α dont le rôle consiste à maintenir l'ouverture par laquelle les protéines à dégrader
pénètrent dans le baril. Ces sous-unités α sont capables de reconnaître les polymères de
polyubiquitine qui régulent le processus de dégradation. L'ensemble est connu sous le
terme de complexe protéasome-ubiquitine (Elliott et al., 2001, Ciechanover., 2006).
Figure 1. Structure du protéasome. (A)
Structure générale. Les 2 feuillets ß et les
2 feuillets alpha adjacent composent la
sous-unité 20S qui constitue de centre
catalytique. Les anneaux alpha extérieurs
effectuent la sélection des protéines entrantes sur la base de leur ubiquitinylation.
A
H. Hosseini., 12
(B) Composition de la particule 20S. Vues frontale et en coupe montrant la chambre
catalytique et les antichambres d'entrée des protéines.
La dégradation protéasomale est un élément essentiel à nombreux processus
cellulaires, notamment le cycle cellulaire, l'expression génétique et la réponse au stress
oxydatif. L'importance de la dégradation protéolytique et du rôle de l'ubiquitine lors de
celle-ci a été officialisée par la remise du Prix Nobel de chimie 2004 à Aaron Ciechanover,
Avram Hershko et Irwin Rose.
Parmi les principales fonctions du protéasome nous pouvons citer :
- Le contrôle du cycle cellulaire
- L'activation de NF-κB
- La présentation des antigènes MHC classe I-dépendante
B
H. Hosseini., 13
- L'activation de certaines caspases.
Ainsi, nous pouvons constater que le protéasome contrôle les mécanismes régulant la
réponse inflammatoire, la croissance et la différentiation cellulaire.
B. Les inhibiteurs du protéasome
Le tableau 1 montre les principaux inhibiteurs du protéasome, naturels ou
synthétiques (Elliott et al., 2003).
Inhibiteurs du protéasome
Naturels
Lactacystine
Epoxomycine
Eponemycine
Aclacinomycine
Synthétiques
Inhibiteur de la calpaine
PS-341, Velcade, inhibiteur de l'acide boronique
PS-519, agent synthétique similaire à la lactacystine
Aldehyde inhibiteurs (CEP-1612, MG132)
Benzamide (CVT-634)
ritonavir (inhibiteur de la protéase rétrovitrale HIV-1)
Tableau 1. Les principaux inhibiteurs du protéasome.
H. Hosseini., 14
Les inhibiteurs protéasome ont été testés dans différentes modèles animaux de
maladies humaines comme les cancers, les maladies inflammatoires (sclérose en plaques,
polyarthrite rhumatoïde, asthme et psoriasis) et les modèles d'ischémie – reperfusion.
Certains inhibiteurs font l'objet d'essais cliniques de phases II et III dans les cancers et le
myélome (Velcade PS-341). La réponse inflammatoire post ischémie d'organe (cerveau ou
moelle) ou liée à une maladie dysimmunitaire comme la SEP ou la polyarthrite rhumatoïde
peut être bloquée par les inhibiteurs de protéasome (Elliott et al., 2003; Nalepa et al.,
2006).
C. Le ritonavir
Le ritonavir (Fig.2) est un médicament antirétroviral utilisé pour le traitement de
l'infection par le VIH-1 pour ses propriétés d’inhibiteur de protéase. Cette molécule est
commercialisée en France sous le nom de Norvir (Abbott Lab.), mais aussi, en association
avec le lopinavir, sous le nom de Kaletra. L'association est commercialisée dans certains
pays sous le nom d'Aluvia.
Figure 2. Formule chimique du
ritonavir.
H. Hosseini., 15
Le ritonavir a différentes modalités d’action :
- une action inhibitrice sur le protéasome in vitro et in vivo (André et al., 1998).
L'action du ritonavir sur le protéasome est plus de modulation que d'inhibition. En
effet, le ritonavir inhibe l'activité chymotrypsine-like du protéasome alors que
l'activité trypsine-like est augmentée (André et al., 1998; Schmidtke et al., 1999).
L’inhibition de l’activité de la sous-unité 20S du protéasome par le ritonavir
supprime l’activation du facteur de transcription NFB (André et al., 1998 ; Pati
et al., 2002).
- une action anti-inflammatoire, décrite dans le cancer du colon (Mühl et al., 2004),
qui est probablement médiée par l’inactivation de NFB, un acteur important de
la machinerie de transduction du signal pro-inflammatoire. Cette observation
corrèle l’efficacité du ritonavir à inhiber la libération de l’IL1ß et du
TNFmontrée sur les cellules mononuclées (Pati et al., 2002).
- une action anti-apoptotique, décrite dans une lignée lymphoblastoide (Dewan et
al., 2009).
II. LA SCLEROSE EN PLAQUES
A. Epidémiologie
La SEP est une maladie inflammatoire démyélinisante du SNC (la myéline du SNC,
y compris celle du nerf optique II, est fabriquée par les oligodendrocytes) touchant donc
H. Hosseini., 16
essentiellement la substance blanche. Elle est associée à un désordre immunitaire qui
affecte le SNC, mais la cause exacte reste inconnue (virus, facteurs génétiques,…). La SEP
est caractérisée par des foyers de démyélinisation disséminés sans ordre dans le SNC,
respectant habituellement la substance grise et le SNP, d’où une symptomatologie très
polymorphe. Elle évolue le plus souvent par poussées plus ou moins régressives. La SEP
est ainsi l'objet d'une double dissémination :
– dans le temps et
– dans l’espace.
Les analyses épidémiologiques donnent les indications suivantes:
. Prévalence dans les pays tempérés: 40/100 000 habitants.
. Rare au Japon et dans les pays tropicaux. Il existe un gradient nord-sud avec une
prévalence plus élevée au nord.
. En France, 50 000 patients atteints de la maladie avec une prévalence plus élevée dans le
nord.
. Première cause de handicap neurologique, non traumatique, du sujet jeune.
. Prédominance féminine (60 %).
. Âge moyen du début : 30 ans
. 70 % entre 20 et 40 ans
. 20 % après 40 ans
. 10 % avant 20 ans.
. Rares formes familiales (6 %).
. Risque multiplié si un proche parent est atteint.
H. Hosseini., 17
. Dans le cas des jumeaux : le risque est de 3 % pour les faux jumeaux, de 30 % pour les
vrais jumeaux.
. Certains groupes HLA ont été incriminés comme facteurs pré-disposants.
. Le risque de développer une SEP dépend de la prévalence de la région où on a passé les
15 premières années de son enfance.
B. Physiopathologie
Sur le plan étiologique, de nombreux facteurs ont été incriminés dans la SEP:
a) Les virus
Plusieurs virus ont été mis en cause, sans toutefois de preuve formelle d'une relation
causale. Citons les virus de la rougeole, l'EBV, l'HHV6 (Herpes Virus Humain 6), les
rétrovirus. Ces suppositions se basent sur le fait que les taux sériques des anticorps
antiviraux sont plus élevés chez les patients atteints de SEP, en particulier ceux de la
rougeole.
b) L'environnement
Les causes environnementales tiennent leur origine dans les différences de
prévalence selon les zones géographiques. Il semble que ce facteur porte un impact durant
les quinze premières années de l’existence.
c) Auto-immunité
La cible primitive contre laquelle serait dirigée la réponse immunitaire de la SEP
n’est pas connue. Cependant, plusieurs observations permettent de poser des corrélats et
d'établir quelques hypothèses:
H. Hosseini., 18
– la SEP est spécifique de la substance blanche, indiquant le complexe myéline-
oligodendrocytes du SNC comme une cible primaire potentielle. La SEP s'accompagne
également d'une production d’auto-anticorps antimyéline, ce qui renforce cette hypothèse.
– La synthèse intrathécale d’immunoglobulines polyclonales suggère un rôle de l’immunité
humorale.
– L'infiltration lymphocytaire des plaques de démyélinisation (cellules T activées) suggère
un rôle de l’immunité cellulaire, en particulier des cellules T CD4 auto-réactives. On note
une réduction des lymphocytes T CD8 (suppresseurs) au moment des poussées, et une
augmentation des CD8 au moment des rémissions.
– Un rôle des cytokines inflammatoires de type TH1, et en particulier un rôle toxique du
TNF et de l’IFNß ont été mentionnés.
Sur la base de ces données, une des théories plausibles est que la SEP serait la
conséquence lointaine d’une agression infectieuse chez un sujet prédisposé et aboutissant à
une destruction immunologique spécifique de la myéline du SNC, alors que l’agent
infectieux a été éliminé. La réactivation du clou lymphocytaire peut se faire après un
contact avec un micro-organisme ayant des antigènes communs avec la myéline
(mimétisme moléculaire).
d) Prédisposition génétique
– Rares formes familiales.
– Le risque est plus élevé en cas de vrais jumeaux.
– Rôle de certains groupes HLA, en particulier de classe II.
H. Hosseini., 19
C. Traitement de la SEP
Le traitement des poussées de SEP repose sur des bolus de corticoïdes qui ont une
action anti-inflammatoire. Le traitement de fond de la SEP est basé sur l'emploi
d'immunomodulateurs comme l'Interféron-ß ou le Copolymère. Ces produits ont un effet
thérapeutique sur la fréquence des poussées et la progression du handicap. Dans les formes
agressives ou rapidement évolutives, des immunosuppresseurs peuvent être utilisés comme
la mitoxantrone ou les inhibiteurs des molécules d'adhérence (natazilumab) (DeAngelis,
2008; Coyle, 2010; Marriott, 2010; Weinstock-Guttman, 2008). Malgré cet arsenal
thérapeutique, de nombreux patients atteints de SEP continuent à faire des poussées et
voient leur handicap neurologique augmenter. L'inhibition du protéasome pourrait être une
nouvelle approche thérapeutique chez ces patients; avec comme objectif recherché la
réduction de la réponse inflammatoire. Nous avons testé cette hypothèse sur le modèle
expérimental de la SEP qui est l'EAE.
D. Les modèles expérimentaux de SEP. L'EAE.
L'EAE est le modèle animal qui se rapproche le plus de la SEP. Ce modèle est obtenu en
immunisant l'animal (souris SJL ou rats Lewis) contre la myéline du SNC ou à un de ses
constituants comme la MBP (myelin basic protein). Cette immunisation s'obtient en
injectant la myéline de façon sous-cutanée, avec adjonction de l'adjuvant de Freund afin
d'augmenter l'immunogénicité. L'animal développe une maladie clinique une dizaine de
jours plus tard avec paralysie des pattes. Histologiquement, cette maladie se caractérise par
une démyélinisation inflammatoire qui prédomine au niveau spinal.
H. Hosseini., 20
III. L'accident vasculaire cérébral
A. Epidémiologie
Les accidents vasculaires cérébraux constituent dans les pays industrialisés la 3e cause de
mortalité (10 à 12%) après les maladies coronariennes et les cancers. Ils représentent la
1ère cause de handicap acquis et la 2ème cause de démence (après la maladie
d’Alzheimer). L'AVC est la plus fréquente des affections neurologiques aiguës et la
première cause neurologique d’hospitalisation. L’incidence est estimée sur une population
de 1 million d’habitants à 500 AIT et 2400 AVC dont 75% sont des premiers AVC. À trois
mois, sur ces 2400 AVC, il y aura 480 (20%) décès et, à 1 an, 700 (29%) décès et 600
(25%) survivants dépendants. La prévalence pour une population occidentale de 1 million
d’habitants est de 12000 patients dont 800 récidives (7%) d’AVC par an.
La mortalité annuelle liée aux AVC est estimée à 5 millions de patients par an dans
le monde. Ces dernières années, une diminution de 30 % de la mortalité précoce a été
constatée. En l'absence de révolution thérapeutique, cette amélioration est due en partie à
une prise en charge médicale et paramédicale active, à l'utilisation de méthodes
diagnostiques précoces, au respect de mesures destinées à éviter toute iatrogénie et à une
meilleure prévention des complications.
Le risque de récidive de l'AVC ischémique est estimé à 30 % dans les cinq années
qui suivent un premier accident, soit en moyenne de 6 % par an avec un risque de 10%
dans la première année.
H. Hosseini., 21
La récupération dépend largement de la gravité initiale. La récupération maximale
est obtenue chez 80 % des patients au cours des trois premières semaines en cas d'infarctus
peu sévère et dans les trois premiers mois en cas d'infarctus sévère d'emblée. Dans ce
dernier cas, elle peut se prolonger jusqu'à un an.
On estime que les AVC totalisent 2 à 4 % du coût global des soins dans les pays
industrialisés et 4 % des coûts. Entre les patients qui survivent à 6 mois, 73% vivent à
domicile et le reste en milieu médicalisé. Parmi les patients qui vivent à domicile, 1/3 sont
aidés pour les tâches quotidiennes et 2/3 retrouvent leur état antérieur (30% environ de
l’ensemble des AVC). L’âge moyen de survenue est de 73 ans, mais les sujets jeunes
peuvent aussi être atteints. Il existe une augmentation significative de l’incidence avec
l’âge.
55 à 64 ans 1,7 à 3,6 / 1000 habitants
65 à 74 ans 4,9 à 8,9 / 1000 habitants
> 75 ans 13,5 à 17,9 / 1000 habitants
Les AVC sont beaucoup moins fréquents chez le sujet jeune que chez le sujet âgé.
Leur incidence est de 10 à 30 pour 100,000 habitants entre 15 et 45 ans. Les AVC
hémorragiques restent beaucoup moins fréquents que les AVC ischémiques. En revanche,
chez le sujet jeune, la proportion d’AVC hémorragiques est un peu plus importante que
dans la population âgée. Les AVC sont très rares chez l’enfant.
Il existe également d’importantes différences selon les pays : les pays de l’Europe
de l’Est et le Japon ont les taux les plus élevés, les pays nordiques, les Pays-Bas, les Etats
Unis, le Canada et la Suisse les taux les plus bas. En Europe, la répartition des pays les
H. Hosseini., 22
plus affectés est inattendue et correspond aux habitudes socio-culturelles en matière de
nutrition et d'importance du réseau de soins spécialisés (Fig. 3). En France, depuis 1985,
l’incidence est de 145 pour 100,000 habitants : 170 pour l’homme et 126 pour la femme.
Figure 3 . Taux de mortalité standardisé en Europe. A. Femmes. B. Hommes.
La mortalité par AVC est plus importante chez l’homme que chez la femme dans
tous les pays (Fig. 3). Elle est supérieure de 2 à 3 fois entre 55 et 64 ans et diminue par la
suite pour s’annuler au-delà de 85 ans.
B. Physiopathologie de l'ischémie cérébrale
H. Hosseini., 23
La destruction du tissu cérébral qui résulte d'un AVC résulte d'une somme d'événements
qui ne seraient pas délétères s'ils n'étaient pas combinés (Fig. 4). Ces événements englobent
une réaction inflammatoire, exacerbée par la reperfusion, la production de radicaux
oxygénés et de cytokines qui activent les récepteurs de mort de la cellule, la déstabilisation
du potentiel de membrane de la cellule qui entraine une hyperexcitabilité des récepteurs du
glutamate, une déstabilisation de la fonction mitochondriale et la formation d'un œdème.
L'importance relative de ces différentes agressions cellulaires délimite deux régions dans le
tissu ischémié, une région appelée "cœur de l'infarctus", dans laquelle la détersion
cellulaire est rapide, et une région périphérique, dite "de pénombre". Les modalités de mort
cellulaire varient dans l'une et l'autre, avec une prédominance de phénomènes nécrotiques
dans le cœur et une prédominance des phénomènes apoptotiques dans l'autre.
H. Hosseini., 24
Figure 4. Représentation schématique des différentes voies physiopathologiques qui
conduisent à la mort cellulaire dans l'ischémie cérébrale.
D'après Gasche et Copin, 2003.
a) La nécrose et l'excitotoxicité
Le coeur de l’ischémie, c’est-à-dire la zone de tissu cérébral où la diminution du
débit sanguin et la privation énergétique sont les plus précoces et le plus sévère, est le siège
d’une nécrose tissulaire. Cette forme particulière de mort cellulaire, aux caractéristiques
anatomopathologiques spécifiques (gonflement des organites intracellulaires et du
H. Hosseini., 25
cytoplasme, lyse osmotique, extrusion du contenu cellulaire dans l’espace extracellulaire),
se développe rapidement au décours de l’ischémie et met en jeu des processus
pathologiques au sein du cytoplasme cellulaire, dont l’excitotoxicité, médiée par les
variations des flux de calcium et de glutamate, et les phénomènes de dépolarisation péri-
infarctus. L'élévation du calcium intracellulaire, facilitée par la libération du glutamate t
lune dysfonction des pompes qui recapturent le glutamate dans l'espace synaptique, va
initier une cascade d’événements délétères pour le tissu cérébral parmi lesquels un
dysfonctionnement des mitochondries (déficit énergétique et synthèse de radicaux libres
toxiques), la mise en jeu de systèmes enzymatiques capables de dégrader différentes
structures de la cellule (lipase, endonucléases et protéases) ou encore l’activation de la NO
synthase de type I (production de NO cytotoxique), autant d’éléments à même de
contribuer directement ou indirectement à la mort neuronale.
2) L'apoptose
Ce type de mort cellulaire, prépondérant dans la zone de pénombre, se différencie de la
nécrose par ses aspects anatomopathologiques (condensation de la chromatine,
fragmentation de l’acide désoxyribonucléique (ADN), convolution des membranes
cytoplasmique et nucléaire, rétraction cellulaire) ainsi que par son mode de développement
(Couzinet et al., 2008). L'apoptose est un mécanisme dynamique, qui nécessite de l'énergie
et qui ne peut donc pas être poursuivi dans le cœur de l'infarctus. Certaines données
montrent cependant que les mécanismes apoptotiques se mettent en place dans le cœur de
l'infarctus dans les minutes qui suivent l'occlusion artérielle chez l'animal (Benchoua et al.,
H. Hosseini., 26
2006). Dans cette zone d'ischémie sévère, le mécanisme apoptotique avorte par manque
d'ATP et la mort cellulaire intervient par nécrose.
Les nouvelles approches thérapeutiques anti-ischémiques en plus de la
revascularisation se sont intéressées à des molécules anti-apoptotiques. L’apoptose
conduisant à la mort cellulaire se déroule en trois phases : l’induction, la propagation et
l’exécution. Elle se caractérise morphologiquement par une condensation et une
fragmentation de la chromatine, une compaction cytoplasmique sans altération des
membranes cytoplasmique et nucléaire. Dans la phase avancée du processus, les altérations
nucléaires sont associées à des clivages internucléosomiques de l’ADN et une prolifération
de vésicules lysosomiales. Sur le plan biochimique, l’apoptose est associée à l’activation de
différents systèmes protéolytiques, dont le plus récemment mis en évidence est celui d'une
famille de protéases à cystéines, les caspases (Fig. 5). Les caspases agissent en cascade et
sont ainsi classées sur la base de leurs positions respectives dans ces cascades, les caspases
inductrices (ex : caspases 1, 2, 8, 9 et 10) se situant en amont des caspases effectrices (ex :
caspases 3, 6, 7). Parmi les principaux signaux de l’activation des caspases figurent
l'activation des récepteurs "de mort", du type de Fas/Apo1 ou du TNFR1 (caspases 8, 10 et
2), les dysfonctions mitochondriales (caspase 9), dont le premier effecteur est la libération
du cytochrome c et les dysfonctions lysosomiales (caspases 11 et 1), dont le premier
effecteur est la cathepsine B.
H. Hosseini., 27
Figure 5. Schéma
d'activation des caspases
dans l'apoptose. La
caspase 3, prinicpale
caspase effectrice, est
activée par la capsase 8,
premier effecteur de la
voie des récepteurs de mort (Death receptor) et par la caspase 9, principal activateur de la
voir mitochondriale (Mitochondrion, ou voie intrinsèque). D'après Andersen et al., 2005.
Parmi les différentes voies qui conduisant à l'apoptose, l'activation du NF-B semble
jouer un rôle primordial. En effet, l’activation de NF-B a été associée à la mort neuronale
dans les maladies neurodégératives comme la maladie d’Alzheimer et de Parkinson. Plus
récemment, le NF-B a été associé à la mort cellulaire par apoptose au cours de l’ischémie
cérébrale expérimentale et chez l’Homme. Ainsi, il a été démontré que les souris dont le
gène de NF-B a été invalidé sont plus résistantes à l’ischémie cérébrale que les souris
sauvages (Mattson, 1997)
H. Hosseini., 28
Les voies de signalisation qui sont activées dans la nécrose et l'apoptose se rejoignent
et ont des effecteurs communs. Comme le montre la figure 6, le déficit énergétique (Energy
deficit) est responsable d'une inversion de la polarité du transporteur du glutamate
(Glutamate transporter) et une augmentation de sa libération dans l'espace extracellulaire
qui conduit à l'excitotoxicité, puis à la nécrose. Comme décrit plus haut, la dysfonction
mitochondriale est également l'un des acteurs majeurs de l'apoptose.
Figure 6. Relations entre mécanismes apoptotiques et nécrotiques dans la cellule.
D'après Lo et al., 2003.
H. Hosseini., 29
3) L'oedème
L’œdème cérébral et la transformation hémorragique sont des complications
potentiellement létales de l’infarctus cérébral. L’ischémie entraîne un dysfonctionnement
des pompes ioniques membranaires et un œdème cytotoxique. Elle active également, de
manière précoce, différentes cascades oxydatives et inflammatoires qui provoquent une
rupture de la barrière hématoencéphalique (BHE) et ses corollaires l’œdème vasogénique et
l’hémorragie intracérébrale. Les mécanismes conduisant à l’augmentation de la
perméabilité de la BHE impliquent l’activation des cellules endothéliales, ainsi que la
digestion de la membrane basale endothéliale par les métalloprotéases de la matrice
extracellulaire. La reperfusion par l’activateur du plasminogène est le seul traitement
améliorant le pronostic des accidents vasculaires cérébraux ischémiques. Malheureusement,
ce traitement aggravant le risque d’hémorragie intracérébrale symptomatique, n’est indiqué
que dans la phase très précoce de l’accident vasculaire et lorsque le territoire ischémique
est de taille modérée. Les données expérimentales suggèrent que l’inhibition des
phénomènes protéolytiques détériorant la structure de la BHE permet de réduire la
progression de l’œdème vasogénique et de diminuer le risque de transformation
hémorragique du tissu cérébral ischémique. Ces derniers développements dans la
compréhension des mécanismes impliqués dans la rupture de la BHE ouvrent la voie à de
nouvelles stratégies thérapeutiques dont l’originalité sera d’associer au traitement de
reperfusion des agents capables d’interrompre certaines cascades biochimiques nocives,
enclenchées par l’ischémie cérébrale. Le prolongement de la fenêtre thérapeutique de la
H. Hosseini., 30
thrombolyse permettrait à de nombreux patients actuellement exclus de bénéficier du
traitement de reperfusion.
C. L'inflammation
L'inflammation est l'une des composantes majeures du développement de la lésion
ischémique. Toute la question est de savoir si la réaction inflammatoire est bénéfique
(élimination des tissus nécrosés et diminution du risque d’infection) ou toxique. La réponse
est loin d’être tranchée, mais l’analyse de la littérature apporte quelques certitudes.
Tout d’abord, les cascades de l’inflammation sont multiples, complexes, et encore
mal connues. Ensuite, des arguments expérimentaux de plus en plus nombreux prouvent
que ces cascades interfèrent entre elles et avec les principaux mécanismes de la mort
neuronale dans l’AIC, qu’il s’agisse de l’excitotoxicité, du stress oxydatif ou de l’apoptose.
L’inflammation microcirculatoire pourrait également aggraver l’ischémie et compromettre
la reperfusion. Elle pourrait favoriser les transformations hémorragiques notamment après
thrombolyse. Mais elle pourrait, à l’inverse, promouvoir certaines formes de résistance à
l’ischémie et de plasticité post-lésionnelle neuronale et vasculaire. La réponse
inflammatoire post AVC se déroule en plusieurs phases.
La première phase, durant les 24 premières heures qui suivent l'AVC, est
caractérisée par un envahissement de la zone infarcie par des polynucléaires neutrophiles.
Cette phase est sous contrôle des cytokines pro-inflammatoires commme le TNF et l’IL-
1ß, qui augmentent l’expression des molécules d’adhérence ou d’adhésion(CAM).
H. Hosseini., 31
La deuxième phase survient entre le second et le troisième jour. Elle correspond à
un envahissement de la zone nécrotique par des macrophages et des lymphocytes T. Elle
correspond également à la sécrétion d’autres cytokines comme le TGFß et les IL-10 et -18
(Stoll et al., 2002).
1) Les molécules d’adhésion cellulaire (CAM)
Les CAM ont été très étudiées dans l’AIC aigu et ont fait l’objet de revues récentes. Ce
sont des protéines trans-membranaires qui jouent un rôle clé dans les interactions entre les
plaquettes, les leucocytes, les lymphocytes et l’endothélium vasculaire. Ce dernier passe,
sous leur influence, d’un état anti-inflammatoire et anti-thrombotique à un état pro-
inflammatoire et pro-thrombotique. On distingue trois grandes familles de CAM : les
sélectines, les membres de la superfamille des immunoglobulines gènes (dont ICAM 1 et 2)
et les intégrines qui contribuent à l’activation des leucocytes et à leur fixation à
l’endothélium.
Les sélectines E et P permettent l’adhésion initiale des leucocytes à l’endothélium
en s’exprimant à la surface de ce dernier. L’expression de la sélectine P est quasi-
instantanée sous l’influence de la thrombine ou de l’histamine, car elle est déjà présente
dans les membranes granuleuses de l’endothélium. Celle de la sélectine E est plus retardée
et dépend de l’induction de sa synthèse sous l’influence des cytokines. Les phases
ultérieures de l’adhésion leucocytaire sont sous la dépendance de l’interaction entre
plusieurs CAM, dont les ICAM 1 et 2, protéines exprimées à la surface de l’endothélium et
H. Hosseini., 32
des secrétines exprimées à la surface des leucocytes. L’expression d’ICAM 1 est également
cytokine-dépendante.
Chez l’animal, de nombreux travaux ont montré que l’ischémie focale augmente
l’expression des CAM, un phénomène dont le rôle pathogène est établi dans les modèles
d’ischémie réversible. En effet, dans ces modèles, le volume de l’infarctus est diminué dans
les souches de souris mutantes dépourvues de CAM ou après injection d’anticorps anti-
ICAM 1 (Frijns et al., 2002). Par contre, le volume de l’infarctus ne diminuerait pas en cas
d’ischémie permanente. Ceci suggère que l’activation des CAM pourrait jouer un rôle dans
les phénomènes de non-reflow et/ou dans les lésions de reperfusion dont la physio-
pathologie reste par ailleurs mal connue. Chez l’homme, l’essai EAST qui a testé
l’enlimomab, un anticorps monoclonal Anti-ICAM-1 d’origine murine chez 625 patients
ayant un AIC de moins de 6 heures a montré une augmentation du degré de handicap et une
surmortalité dans le groupe traité, peut être à cause d’effets immunologiques collatéraux
(Enlimomab Acute Stroke Trial Investigators, 2001). Plus récemment, un anticorps
humanisé anti E/P selectine a donné des résultats encourageants sur un modèle d’ischémie
focale chez le babouin (Mocco et al., 2002).
2) Cytokines et enzymes de l’inflammation (iNOS et COX2)
L’expression de certaines cytokines pro- et anti-inflammatoires est également fortement
augmentée dans l’ischémie focale et leur effet neurotoxique ou neuroprotecteur a fait
l’objet de plusieurs revues (Stoll et al., 2002; Iadecola et al., 2001).
H. Hosseini., 33
a. Les Cytokines pro-inflammatoires
Dans les modèles expérimentaux, la synthèse d’interleukine (IL)-1β et de TNF-α
augmente dès les premières heures suivant l’occlusion artérielle. Leur injection
intraventriculaire aggrave les lésions ischémiques alors que leur neutralisation a l’effet
inverse. La toxicité d’IL-1β pourrait être liée à son effet inducteur sur les CAM, alors que
celle du TNF-α pourrait être liée à son effet inducteur sur l’inductible NO-synthétase
(INOS) qui facilite le stress oxydatif . L’expression d’IL-18 serait plus retardée et corrélée
aux stades plus tardifs de l’inflammation post-ischémique. Il est possible que les cytokines
pro-inflammatoires puissent outre leurs effets neurotoxiques avoir aussi dans certaines
conditions des effets neuro-protecteurs ou de facilitation de la plasticité post-lésionnelle
(Stoll, 2002; Lo, 2003)
b. Les cytokines anti-inflammatoire
L’ischémie focale induit l’expression de IL-10 qui est rapide et celle du TGF-beta 1
qui serait plus lente. Ces deux substances auraient des effets neuroprotecteurs, dont les
mécanismes sont encore mal connus. IL-10 pourrait réduire les phénomènes d’excito-
toxicité.
c. Nitric oxyde synthétase inductible (iNOS) et cyclo-oxygénase-2 (COX-2)
La synthèse d’iNOS et de COX-2, deux enzymes clés de l’inflammation est
également augmentée dans les modèles d’ischémie focale. Le pic de synthèse se produirait
12 à 48 heures après l’ischémie. iNOS catalyse la synthèse de NO, dont la concentration
H. Hosseini., 34
augmente fortement, ce qui, par réaction avec les superoxydes, aboutit à la production de
peroxynitrites, substrats hautement réactifs du stress oxydatif. COX-2 est un enzyme
limitant de la synthèse de prostaglandines et de thromboxanes. Son activité catalytique
s’accompagne de production de radicaux libres susceptibles de réagir avec le NO pour
produire les peroxynitrites. Des études de pharmacologie expérimentale suggèrent que des
inhibiteurs de ces deux enzymes pourraient avoir un effet neuroprotecteur dans l’ischémie
focale. La COX-2 pourrait être l’étape limitante de cette cascade car la toxicité d’iNOS
serait médiée par les produits de réaction de COX-2 (Iadecola, 2001).
3) Leucocytes et microglie
Les leucocytes pourraient jouer un rôle pathogène dans l’AIC par deux grands types de
mécanismes. L’adhésion leucocytaire micro-circulatoire pourrait contribuer à l’occlusion
partielle du lit capillaire et limiter la reperfusion en cas de recanalisation. Par ailleurs,
l’influx leucocytaire dans le tissu ischémié s’accompagne, nous l’avons vu d’une
augmentation du stress oxydatif. Toute la question est de savoir si l’influx intra-cérébral de
polynucléaires est suffisant pour produire des effets délétères (Danton et al., 2003)
La seule certitude actuelle est que l’étude ASTIN qui testait un inhibiteur des
polynucléaires neutrophiles chez 966 patients dont 887 AIC et 204 traités par rt-PA a été
interrompue pour absence d’efficacité (Krams et al., 2003). Néanmoins, comme le
soulignent les auteurs, « l’absence de preuve n’est pas la preuve de l’absence ».
La réaction neuro-inflammatoire intrinsèque à l’AIC est médiée par la microglie et
les cellules peri-vasculaires. L’existence de cette réaction ne fait aucun doute, elle se
H. Hosseini., 35
prolonge pendant plusieurs semaines et mois et s’étend en dehors du territoire ischémié
vers les régions désafférentées (Pappata et al., 2000). Mais son impact sur l’évolution
lésionnelle et la plasticité ultérieure est inconnu.
4) Barrière hémato-encéphalique, metalloprotéases de la matrice (MMP)
et t-PA
La famille des MMP est un des deux grands systèmes de protéolyse de la matrice
neurovasculaire. Ce système qui joue un rôle important dans le développement du système
nerveux, est normalement réprimé chez l’adulte. L’expression des MMP est augmentée
dans les modèles d’ischémie expérimentale et après AVC chez l’homme. Elles sont libérées
précocement par l’endothélium vasculaire et les leucocytes et favorisent la destruction de la
membrane basale (Lo, 2003).
Les MMP sont un des médiateurs de l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique
(BHE) au cours des AIC, mais surtout, l’augmentation de la MMP9 serait un facteur de
risque des hémorragies de la thrombolyse chez l’animal et chez l’homme. Dans une étude
récente de 41 patients thrombolysés (Montaner et al., 2003), on a montré une élévation de
MMP-2 et de MMP-9 qui était maximale avant trois heures. La survenue d’hémorragies
graves était significativement liée à la concentration initiale de MMP-9 et, en analyse
multi-variée, les deux seuls facteurs prédictifs de la survenue d’une hémorragie étaient la
concentration de MMP-9 (OR : 9,62) et l’existence d’une dyslipidémie (OR : 7,85).
L'activateur tissulaire du plasminogène (t-PA) et l’hyperglycémie, qui est un facteur de
risque connu de la survenue d’hémorragies, pourraient favoriser l’activation de MMP-9.
H. Hosseini., 36
Enfin, chez le rat, l’administration d’un inhibiteur des MMP, le BB-94 diminue l’ouverture
de la barrière hémato-encéphalique et diminue le risque d’hémorragie de la thrombolyse
(Pfefferkorn et al., 2003).
La famille PA (urokinase PA et t-PA) est l’autre grand système protéolytique et
joue un rôle important dans la modulation de la matrice au cours du développement. Chez
l’adulte, le t-PA est synthétisé par les neurones, la microglie et les astrocytes. Sa
neurotoxicité reste controversée mais fait l’objet de nombreuses recherches du fait de
l’utilisation du rt-PA comme thrombolytique.
En conclusion, les mécanismes inflammatoires dans l'AVC sont complexes et
offrent différentes cibles moléculaires sur lesquelles agir pour réduire les dommages
cérébraux qui en découlent. Ces cibles sont résumées dans le Tableau 2.
CIBLES ETUDIEES
Molécules d’adhérence
cellulaire
Intégrines
Sélectine P et E
ICAM 1 et 2
Cytokines Pro-inflammatoire :
TNFα
IL1β
Anti-inflammatoire :
TGFβ1
IL10
Leucocytes Stase et diminution du débit sanguin cérébral
Majoration du stress oxydatif
Activation microgliale Cibles peu étudiées actuellement.
Systèmes protéolytiques
de la matrice extra-
cellulaire
Métalloprotéase
:
MMP-9
Plasminogène Activateur :
rt-PA
H. Hosseini., 37
MMP-2
C. Aspects cliniques et objectifs thérapeutiques
Les seuls traitements validés contre l’AVC sont l’hospitalisation dans une unité
neurovasculaire (Stroke Unit) et la thrombolyse intraveineuse (rt-PA, alteplase) dans les
premières heures qui suivent l'AVC. La fenêtre étroite de 3h est actuellement en cours
d'extension jusqu’à 4,5 h (Lees et al., 2010).
La majorité des patients arrive à l’hôpital au-delà de cette fenêtre thérapeutique, ce
qui explique que moins de 5 % des patients seulement sont thrombolysés. D’où la nécessité
de rechercher d’autres alternatives thérapeutiques.
De nombreux essais cliniques de neuroprotection anti-ischémique ont été testés sans
succès significatif (Kidwell et al., 2001 ; Wahlgren et al., 2004).
Les objectifs d'une thérapeutique neuroprotectrice anti-ischémique seraient de:
Limiter la taille de l’infarctus
Limiter les lésions inflammatoires
Limiter les lésions de la reperfusion post-ischémie
Prolonger la fenêtre thérapeutique de la revascularisation
Et surtout cliniquement : améliorer le pronostic vital et fonctionnel, autrement
dit, réduire la mortalité et le handicap.
H. Hosseini., 38
MATERIEL ET METHODES
A. L'EAE, modèle de sclérose en plaques
1) Animaux
Nous avons testé le ritonavir sur l'EAE induite chez les souris SJL et les rats Lewis.
2) Procédure expérimentale
L'EAE a été induite chez ces rongeurs en injectant la MBP associée à l'adjuvant de
Freund de façon à augmenter l'immunogénicité de la molécule active. Les premiers signes
cliniques de la maladie apparaissent au bout d'une dizaine de jours. Ils se manifestent par
une hypotonie de la queue, suivie d'une faiblesse des pattes postérieures avant une
récupération clinique. Le maximum de déficit est atteint vers le 14ème jour post
immunisation et la maladie dure en moyenne 7 jours.
Un score clinique simple de 0 à 5 est calculé pour chaque animal:
0 : pas de signe clinique
1 : paralysie de la queue
2 : faiblesse des pattes postérieures
3 : paralysie complète des pattes postérieures
4 : animal moribond
5 : décès de l'animal
H. Hosseini., 39
B. L'OACM permanente chez la souris
1) Animaux
Les expériences ont été réalisées chez 60 souris mâles, C57Bl/6, âgées de 6 à 8
semaines, soit un poids de 25 à 30 g (Janvier, France).
2) Chirurgie
L’OACM permanente a été réalisée selon l’approche chirurgicale décrite par Gotti et
al. (1990) et en accord avec la législation de l’UE sur l’utilisation d’animaux vivants
(86/609/EEC). Les souris ont été anesthésiées par inhalation d’un mélange d’halothane
(4%), d’oxygène (30%) et de dioxyde d’azote (70%). Durant la procédure chirurgicale, les
souris ont été maintenues sous anesthésie avec 2% d'halothane. Une incision verticale de la
peau, côté gauche, a été réalisée entre l’œil et l’oreille. Le muscle temporal sous-jacent a
été électrocoagulé (pince bipolaire, électrocoagulateur Aesculap® TB 50, I=2,5µA) et
incisé horizontalement, découvrant l’ACM, visible à travers la surface semi-translucide de
l’os. La craniotomie a été effectuée à l’aide d’une fraise dentaire (Technobox 810, Ø 1,9
mm, 21000 rpm), puis la dure-mère a été délicatement enlevée et l’ACM, directement
accessible, a été électrocoagulée (I= 1,8µA). L’artère a ensuite été sectionnée pour éviter
une reperfusion éventuelle dans le cas d’une électrocoagulation imparfaite. Le muscle
temporal a été replacé, en présence de sérum physiologique, et la peau suturée. Après
chirurgie, les animaux ont été placés en enceinte de réveil jusqu'à récupération
H. Hosseini., 40
complète de la motricité, puis replacés dans leur cage où ils reçoivent eau et nourriture
ad libitum.
Les animaux contrôles ont reçu la même procédure sans électrocoagulation et
section de l'artère.
3) Traitement
Les souris ont reçu le ritonavir à la dose de 50 mg/kg dans 100 µl en intrapéritonéal,
deux heures après l'occlusion de l'artère cérébrale moyenne (n=15). Les souris témoins ont
reçu 100 µl de sérum physiologique en intrapéritonéal (n=15).
3) Techniques histologiques et d'immunohistochimie
a. Quantification du volume d'infarctus
Les animaux sont sacrifiés 24 heures après l'occlusion artérielle par injection
intrapéritonéale d’une dose létale de pentobarbital. Les cerveaux sont récupérés et des
coupes coronales de 1 mm sont réalisées à l'aide d'une matrice. La zone infarcie est
identifiée par coloration vitale des coupes par le triphényltétrazolium chloride (TTC). Le
tissu sain, dont les mitochondries sont fonctionnelles, se colore en rouge, alors que le tissu
mort apparaît en blanc. La zone infarcie est délimitée sur chaque coupe et la taille de
l'infarctus est calculée par intégration des différentes mesures (7 par animal) à l'aide du
logiciel d'analyse d’image KS- 400 (Zeiss). Le volume d'infarctus correspond au volume
normal du cortex mesuré du côté contralatéral à l'occlusion soustrait du volume de tissu non
lésé restant du côté ischémié.
b. Immunohistochimie
H. Hosseini., 41
Les animaux ont été sacrifiés aux différents temps par injection de 400 µL d’hydrate
de chloral et ont subit une perfusion intracardiaque de sérum physiologique puis de
paraformaldéhyde (PFA) 4%. Les cerveaux ont été extraits et post-fixés par immersion
dans du PFA 4% puis du sucrose 30 %, puis congelés rapidement dans de l’isopentane à –
40°C. Des coupes de cerveau (20 µm d'épaisseur) ont été effectuées au cryostat et
conservées en milieu cryopréservateur à -20°C.
Pour l’immunohistochimie, les coupes ont été lavées à 3 reprises pendant 5 min dans
du PBS afin d’éliminer le cryoprotecteur (30% sucrose), puis incubées 1 h sous agitation
dans une solution de blocage composée de 5% de sérum de chèvre dans du PBS. Les
coupes ont été incubées sur la nuit à 4°C avec l’anticorps primaire dilué dans un mélange
composé de 3% de sérum et de PBS (anticorps polyclonal (lapin) anti-caspase-9 clivée,
Cell Signaling technology, Inc., MO, 1/250). Après lavage dans du PBS, les coupes ont été
incubées 1 h à température ambiante dans une solution de 3% de sérum et de PBS
contenant l’anticorps secondaire (Fluorescein anti-Rabbit IgG, FI-1000, Vector Labs). Les
coupes ont été à nouveau lavées, puis montées sur lames dans un milieu approprié à la
fluorescence (Vectashield avec DAPI, H-1200, Vector labs). Dans le cas d’une
amplification, le kit TSATM-direct (Tyramide signal amplification, NEL701, NEN life
Science) a été utilisé. Les coupes ont été incubées pendant 1 h avec un anticorps secondaire
biotinylé (anticorps anti- rabbit biotinylé, 1/200), puis après lavages au PBS, a suivi une
incubation avec la streptavidine couplée à la HRP (1/100) pendant 30 min. La révélation de
la réaction a été réalisée par incubation pendant 10 min avec de la fluoresceine (PO397,
H. Hosseini., 42
DakoCytomation, 1/400). Le montage des coupes sur lame a été réalisé avec le même
milieu fluorescent.
b. Mesure de l'activité des caspases
Les protéines totales du cortex infarci et du cortex controlatéral ont été extraites à
l’aide d’un tampon d’extraction (Tris base 0,1M, EDTA 5 mM, MgCl2 5 mM, Triton-X100
0,5%, 5µl/ml d’un cocktail d’inhibiteurs de protéases (Sigma), PMSF 1 mM). Les
homogénats ont été centrifugés 20 minutes à 13 000g (4°C). Le surnageant a été récupéré et
constituait la fraction cellulaire totale, congelées à -80°C. La concentration protéique de
chacune des extractions réalisées est déterminée à l’aide du kit BCA Protein Assay (Pierce,
Rockford) suivant les instructions du fabriquant.
L'activité caspase des différents échantillons a été mesurée par le clivage d'un
substrat synthétique lié à une molécule fluorescente, l’AFC (7-amino-4 trifluorométhyl-
coumaryl). Les protéines (5 µg de protéines totales) ont été incubées pendant 2 h dans le
tampon d’activité composé de 50 mM HEPES ; 100 mM NaCl ; 1 mM EDTA ; 10 mM
DTT (Dithiothreitol). La réaction enzymatique a débuté par l’addition du substrat
fluorescent (2 mM ac-XEXD-AFC). Une gamme AFC a été déposée pour l’analyse de la
fluorescence. Les substrats utilisés étaient respectivement pour les caspases-3, et -1, les ac-
DEVD-AFC, et ac-VEID-AFC. La quantification du clivage de ces substrats marqués a été
réalisée après lecture de la quantité de substrat fluorescent libéré par le clivage par un
spectrofluoromètre Perkin-Elmer et report de ces quantités à une gamme d'AFC.
H. Hosseini., 43
4) Technique de retard sur gel (Electrophoretic Mobility-Shift Assay,
EMSA)
Cette technique a été employée pour étudier l'activité de liaison de NF-κB à l’ADN
afin de montrer une inhibition de cette liaison par le ritonavir .
La sonde marquée a été préparée à partir de 2 µl d’oligonucléotides consensus au
facteur étudié NF-κB (E329A); 1 µl de tampon 5X (y02344, Invitrogen), la T4 Kinase 10
U/µl (18004-010, Invitrogen), 1 µl de [γ-32P] ATP (AA0018, Amersham), 4 µl d’eau pour
atteindre un volume final de 10 µl. Après une incubation de 10 min à 37°C, 1 µl d’EDTA et
19 µl de TE ont été ajoutés, l’EDTA permettant de stopper la réaction. Le tout a alors été
passé sur une colonne G25 (27-5325-01, Amersham) et centrifugé (2 min/ 735 g/ 4°C). La
sonde marquée et purifiée a été récupérée. Les échantillons ont ensuite été préparés et
incubés 10 min à température ambiante avant d’ajouter 2 µl de la sonde radioactive. Après
une incubation de 20 min à température ambiante, 1 µl de tampon de charge (250 mM Tris
HCl pH 7,5 / 40% Glycérol / 0,2% Bleu Bromophénol) a été ajouté. L’électrophorèse a été
effectuée entre 180 V et 200 V pendant 2 h environ à 4°C, après une prémigration d'au
moins 30 min à 80 V du gel non chargé (2,5 ml TBE 10% : 6,7 ml Acrylamide / 1,6 ml
glycérol 80% / 500 µL APS / 80 µl TEMED / H2O pour atteindre 50ml) dans le tampon de
migration (TBE 0 ,5%). Le gel a ensuite été fixé (20% acide acétique / 10% éthanol), séché
et enfin exposé à -80°C (KODAK) pendant la nuit.
H. Hosseini., 44
C. L'OACM transitoire chez le rat
L’OACM a été effectuée chez des rats mâles adultes Sprague-Dawley (210/250g,
Charles River, France) maintenus dans un cycle de lumière 12/12h et qui recevaient nourriture
et eau ad libitum. Les animaux ont été anesthésiés par isoflurane (Centravet, 4% pour
l�induction et 1,5% pendant toute la durée des actes chirurgicaux) dans un mélange O2-N2O
(50%-50%). Le modèle utilisé est celui de l’occlusion transitoire de l'ACM (OACMt)
développé au laboratoire par le Dr. Valérie Itier à partir de la méthode de Longa et al. (1989).
Un filament de nylon (fil de suture Propylène 4-0 recouvert à une extrémité d'un manchon de
colle de 400 µm de diamètre, Fig. 7) a été inséré dans la carotide antérieure par la carotide
externe jusqu’à l'intersection de l'artère cérébrale antérieure et de l’ACM (environ 20mm selon
le poids de l'animal).
H. Hosseini., 45
Figure 7. Description du système artériel du rat et trajet de l’embole lors de l’OACM.
L’embole a été laissé en place pendant 90 min, puis retiré pour permettre la reperfusion
du territoire de l’artère. La circulation dans l’artère antérieure est assurée pendant l’occlusion
par l’artère communicante antérieure du polygone de Willis. La lésion n’affecte que le territoire
de l’ACM occluse. La température corporelle de l'animal est contrôlée et maintenue à 37°C
tout le temps de la chirurgie par une couverture chauffante thermorégulée (Harvard Apparatus).
Avant d’être placés en cage thermostatée pour le réveil, les rats ont reçu une injection
sous-cutanée de 2 mL de glucose 5% (Sigma) et une injection intrapéritonéale (i.p.) de 5 mL de
Ringer Lactate (B. Braun) pour réhydratation.
H. Hosseini., 46
Les animaux ont été transférés en cage individuelle avec un accès facilité à de la
nourriture humidifiée pendant les premières 24 h post-opératoires. Afin d’améliorer le bien-être
de l’animal et de limiter sa souffrance, une dose d�anti-inflammatoire non stéroïdien (Metacam,
Boehringer Ingelheim, 0.2mg/kg, i.p.) a été administrée en per- et post-opératoire à raison de
deux injections le jour de l’ischémie et une à deux le lendemain. Ce traitement permet une
meilleure récupération des animaux en moyen et long terme.
a. Analyses histologiques
Les analyses histologiques ont été effectuées de la même façon que chez la souris. Les
volumes d’infarctus ont été quantifiés par mesure de la surface infarcie (surface de tissu du côté
contralatéral - surface non lésée du côté ipsilatéral à l’occlusion) sur 15 coupes distribuées sur
l’ensemble de la région lésée colorées au Violet de Crésyl (1%, Sigma). Les coupes sont
plongées 3 à 5 min dans le bain de Violet de Crésyl. Elles sont déshydratées à travers des bains
successifs d'alcool avant d'être plongées dans un bain de SafeSolv (Lanonord), un dissolvant
qui permet de nettoyer les coupes des débris restants de crésyl. Ce dernier bain va également
servir à diluer le milieu de montage (Entellan, Merck).
b. Mesure des ARNm des cytokines pro-inflammatoires
Les taux d'ARNm des cytokines pro-inflammatoires IL-1, IL-1β et TNF ont été évalués
par Riboquant à J13, J19 et J40 chez les animaux traités par ritonavir et chez les animaux
témoins.
H. Hosseini., 47
D. Analyses statistiques
Les analyses statistiques ont été réalisées en utilisant le test t de Student, en
comparant les données deux à deux, à savoir animaux contrôle et traités par ritonavir. Les
surfaces de zone infarcies ont été soumises au test de Student en comparant les aires de
chacun des plans de coupes des animaux contrôle avec ceux des animaux traités. Les
données sont présentées sous forme de moyenne ± erreur standard.
H. Hosseini., 48
RESULTATS
A. Modification de l'inflammation dans l'EAE par le ritonavir
Dans cette première partie d'étude, nous avons voulu définir les propriétés anti-
inflammatoires du ritonavir dans un modèle de SEP, l'EAE chez la souris.
a) Modifications comportementales
L'atteinte inflammatoire histologique du SNC a été évaluée post-mortem chez les
animaux injectés par la MBP à J19 post-immunisation. Chez chaque animal, les
observations portent sur 14 niveaux : les secteurs antérieur, postérieur et latéraux de la
moelle (cervicale, thoracique et lombaire), le tronc cérébral et le cervelet.
Nos observations montrent que le ritonavir inhibe l'EAE d'une façon dose et temps
dépendants (Fig. 8). L'effet thérapeutique le plus net s'observe à la dose de 10 mg/j chez les
rats Lewis (50 mg/kg/jour en intrapéritonéal) avec administration de J0 à J10 post-
immunisation. Sous ce régime, le score maximal moyen est réduit de 4 chez les animaux
contrôles à 2 chez les animaux traités (p<0,001; Tableau 3). La durée de la maladie est de 3
j chez les animaux traités versus 7 j chez les animaux contrôles (p<0,001).
H. Hosseini., 49
Figure 8. Représentation du
score de déficit induit par
l'immunisation MBP chez le
rat Lewis. La dégradation
maximale (4) s'observe chez
les animaux contrôle (PBS).
L'administrationde ritonavir
diminue le déficit de façon dose dépendante (doses de 1 à 10 mg/J). Le déficit maximal est
de 2 points pour les rats traités avec 10 mg/j. Chaque ligne représente un animal.
Tableau 3. Tableau récapitulatif des scores journaliers et maximal chez les animaux traités
avec les différentes doses de ritonavir et les animaux contrôle (PBS).
Nous avons vu que l'effet du Rv sur l'EAE est obtenu quand il est administré d'une
façon quotidienne de J0 à J10 post immunisation. Le traitement précoce (J-4 à J-3) ainsi
H. Hosseini., 50
que le traitement tardif (J10 à J14) n'ont pas d'effet sur les signes cliniques (Fig. 9). Un
traitement plus prolongé de J0 à J15 inhibe complètement l'installation des signes cliniques
de l'EAE.
Figure 9. Effets du temps de traitement par
ritonavir chez les animaux EAE (PBS), en
fonction du début de l'immunisation. L'incidence
des déficits est nulle lorsque le ritonavir est
administré de J0 à J10 après l'immunisation.
b) Modifications histologiques
Les animaux EAE témoins présentaient des signes histologiques d'inflammation
intéressant essentiellement la moelle épinière sous forme d'infiltrat mononucléé centré sur
un vaisseau (Fig. 10). Les animaux traités par ritonavir de J0 à J10 présentaient très peu de
cellules inflammatoires dans le SNC.
H. Hosseini., 51
Figure 10. Coupe histologique de la moelle épinière de rats EAE (PBS, A) et EAE traités
par ritonavir (B). Une forte infiltration s'observe chez les animaux contrôles, alors que très
peu d'infiltrats sont visibles chez les animaux traités.
Le score moyen d'inflammation était de 10 chez les animaux témoins et 1 chez les
animaux traités par ritonavir (Fig. 11).
Figure 11. Score moyen
d'inflammation chez les animaux EAE
contrôles (barre noire) et traités par le
ritonavir (barre blanche). p<0.05.
H. Hosseini., 52
c) Modifications biochimiques
Les taux d'ARNm des cytokines pro-inflammatoires IL-1 IL-1β et TNF ont été
évalués par Riboquant à J13, J19 et J40 chez les animaux traités par ritonavir et chez les
animaux témoins (Fig. 12).
Chez les animaux ayant développé l'EAE, une forte expression des ARNm des
cytokines inflammatoires a été observée à J13 post-immunisation. Alors que chez les
animaux traités par ritonavir nous n'avons pas observé d'expression de ces mêmes
cytokines.
Figure 12. Analyse de l'expression des
ARNm de l'IL-1 de l'IL-1β et du
TNFchez les animaux EAE (MBP) et
les animaux EAE traités par le ritonavir,
entre le 13ème et le 40ème jour post-
inoculation. On observe une diminution
significative de l'expression des
cytokines pro-inflammatoires chez les
animaux traités.
H. Hosseini., 53
d) Effet des autres antiprotéases antivirales sur l'EAE
Nous avons testé les autres antiprotéases antivirales (saquinavir, indinavir et nelfinavir) sur
l'EAE sans effet significatif (Tableau 4). Ces autres antiprotéases n'ont pas d'action connue
sur le protéasome. Ce qui indique que l'effet anti EAE du ritonavir passe bel et bien par son
action sur le protéasome et non pas par celle sur les protéases.
Tab
leau 4. Effet comparé des différentes protéases anti-virales sur les déficits locomoteurs
induits par l'EAE chez le rat Lewis. Seul le ritonavir diminue de façon significative le score
moyen. *= p<0.05.
e) Effet du ritonavir sur l'EAE adoptive
Le transfert de lymphocytes T activés d'une souris SJL immunisée contre la MBP à une
autre souris naïve induit une EAE adoptive (ou passive) plus précoce et plus sévère que
l'EAE active. Les souris naïves traitées par Rv de J0 à J10 post transfert de lymphocytes T
encéphalitogènes ne développent pas les signes d'EAE (Fig. 13). Par ailleurs, le transfert
H. Hosseini., 54
des lymphocytes à partir de souris immunisées et traitées par Rv n'induit pas d'EAE chez
des souris naïves.
Figure 13. Effets de
l'immunisation passive sur les
scores locomoteurs de souris
SJL ayant développé l'EAE
(PBS) et réversion par le
traitement par ritonavir. Le
traitement effectué avant le
transfert des lymphocytes est
sans effet (Rv d-6/60). L'effet
est le même que le ritonavir soit administré au moment du transfert (Rv d0/d10) ou avant le
transfert chez les donneurs (Rv in donors).
Il est notable que tous les animaux traités soient devenus résistants à une nouvelle
immunisation contre la MBP à J30 et n'aient pas présenté de rechute de la maladie à
distance. Ceci s'observe même s'ils n'ont pas développé des signes cliniques de la maladie
H. Hosseini., 55
B. Inhibition du protéasome et ischémie cérébrale
Dans cette partie de l'étude, le potentiel neuroprotecteur du ritonavir a été évalué dans
une situation pathologique aiguë, l'AVC, en utilisant deux modèles expérimentaux
d'ischémie focale.
1) Ischémie focale permanente chez la souris
Dans un premier temps, l’efficacité du ritonavir à limiter l’étendue d’une lésion
ischémique cérébrale a été évaluée sur un modèle d’occlusion permanente de l'ACM chez
la souris. Dans ce modèle, l'occlusion permanente de la branche distale de l'ACM induit
une lésion retreinte au cortex, comme le montre la Fig. 14.
Figure 14. Coupe horizontale de
cerveau de souris après occlusion
permanente de la branche distale
de l'ACM gauche. La lésion
corticale est clairement visible à
gauche (flèches) après coloration
au violet de Crésyl.
1) Le ritonavir diminue le volume d'infarctus
H. Hosseini., 56
La taille de l'infarctus a été calculée dans les 2 groupes (MCAO et MCAO+ritonavir)
par coloration au TTC de coupes de cerveau non fixé (Fig. 15).
Figure 15. Diminution de la taille
d’infarctus induit par OACM permanente
chez la souris. L’infarctus est visible après
marquage au TTC. Il apparaît comme une
région blanche (cellules mortes). A. Animal
MCAO. B. Animal MCAO + ritonavir.
La quantification de la taille d’infarctus par intégration des surfaces mesurées sur
chaque coupe a révélé une réduction de la taille de l’infarctus de 30 % chez les animaux
animaux traités par ritonavir par rapport aux souris témoins (Fig. 16).
H. Hosseini., 57
Figure 16. Intégration des surfaces de lésion ischémique chez les souris MCAO
(Témoin) et traitées par le ritonavir (Rv). * = p<0,05.
2) Ischémie focale transitoire chez le rat
2) Le ritonavir diminue le volume d’infarctus
Afin de confirmer ces résultats, nous avons réitéré les tests sur un autre modèle
d’ischémie cérébrale, l’OACM transitoire chez le rat, qui diffère du précédent par une forte
inflammation lors de la reperfusion. Dans le modèle d’ischémie transitoire, les animaux
(rats) traités par ritonavir (50 mg/kg en ip) 2 h après l'ischémie ont développé des infarctus
Effet du Effet du Rv Rv sur la taille de l’infarctussur la taille de l’infarctus
Témoins Rv
*
H. Hosseini., 58
plus petits (153.11 +/- 7.19 mm3) contre 204.62 +/- 5.13 mm3 chez les animaux témoins
(p< 0.0001, test ANOVA) (Fig. 17).
Figure 17. Volume
d’infarctus chez les
animaux MCAO témoins et
traités par le ritonavir.
* = p<0,05.
2) Le ritonavir diminue l'activité des caspases
L'activité des caspase-1 et -3 a été quantifiée dans les différents échantillons par
l’efficacité de clivage de l'ac-DEVD-AFC ou du ac-VEID-AFC sur les extraits protéiques
totaux des cerveaux (cortex et striatum) infarcis traités ou non par le ritonavir.. La
quantification du clivage de ces substrats marqués a été réalisée après lecture de la quantité
de substrat fluorescent libéré par le clivage et report de ces quantités à une gamme d'AFC.
La figure 18 montre une réduction significative de l’activité des deux caspases chez
les animaux traités par ritonavir par rapport aux animaux témoins.
Volume infarctus total (mm3)
0
50
100
150
200
250
Témoins Traités
H. Hosseini., 59
Figure 18. Activité des caspases dans les cerveaux d’animaux MCAO témoins et
traités par le ritonavir. * = p<0,001.
3) Le ritonavir diminue la liaison de NFB à l’ADN
Le NFB est l’un des effecteurs de l’inflammation. Afin de définir si le ritonavir
exerçait son action neuroprotectrice sur l’ischémie cérébrale par une inhibition de l’activité
Activité Activité CaspaseCaspase
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Cas pas e 1 Cas pas e 3
Témoins
Ritonavir* *
H. Hosseini., 60
NFB, nous avons quantifié l’aptitude de ce dernier à se lier à l’ADN. La technique de
EMSA sur des échantillons issus des deux groupes d’animaux a effectivement montré une
diminution de la liaison (Fig. 19). Cependant, ces expériences ont été effectuées sur un petit
nombre d’échantillons, et nous n’avons pas pu réaliser d’analyse statistique.
Figure 19. Analyse par retard sur gel de la liaison de
NFB à l’ADN après MCAO avec ou sans traitement
par le ritonavir (MCAO+Rv). La molécule NFB non
liée à l’ADN migre plus vite sur le gel que celle qui est
liée. On observe une bande plus prononcée de NFB non
lié dans les échantillons issus d’animaux traités par le
ritonavir.
MCAO MCAO+Rv
NFB non liˇ
NFB liˇ
H. Hosseini., 61
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
Cette étude avait pour but de mettre en évidence les propriétés neuroprotectrices d’un
inhibiteur du protéasome, le ritonavir, dans deux types de lésions qui affectent le système
nerveux central, la SEP et l’ischémie. Nous avons utilisé pour cela trois modèles
expérimentaux chez le rongeur, souris et rat, qui reflètent les aspects principaux de ces
deux atteintes. Nous avons mis en œuvre une série de techniques afin de quantifier l’effet
protecteur du ritonavir et, dans une certaine mesure, d’approcher les mécanismes impliqués
dans la protection observée. Nos résultats montrent que le ritonavir possède effectivement
des propriétés neuroprotectrices qui sont médiées par un effet anti-inflammatoire.
A. Ritonavir et SEP
Dans cette première partie, nous avons voulu valider l’utilisation du ritonavir comme agent
anti-inflammatoire dans une affection dont l’inflammation est causale, la SEP. Les
conduites thérapeutiques qui découlent des observations des essais thérapeutiques effectués
sur la SEP englobent actuellement des anti-inflammatoires (corticoïdes), des
immunosuppresseurs, ou encore les immunomodulateurs (comme les interférons β, le
copolymère).
H. Hosseini., 62
Le protéasome joue un rôle important dans les réponses inflammatoire et immune
qui comprennent une présentation de l'antigène-MHC I restreinte, l'activation de NF-B par
la dégradation d'IB et l'expression de molécules d'adhérence.
Afin de vérifier l'hypothèse selon laquelle l'inhibition du protéasome préviendrait le
développement de l'inflammation aiguë chez l'animal, nous avons testé des inhibiteurs de
protéasome dans un modèle monophasique aigu d'EAE dans deux espèces de rongeurs, le
rat Lewis et la souris SJL. Dans cette étude, nous avons montré que l'administration
intrapéritonéale de ritonavir empêche l'apparition des signes cliniques de l'EAE active et
passive chez les 2 espèces de rongeurs, cela d'une manière temps- et dose-dépendante. Ces
animaux traités ne présentent pas de rechute à distance et deviennent résistants à une
nouvelle induction de la maladie. Ces données cliniques étaient corrélées à l'absence
d'infiltration inflammatoire du SNC des animaux traités par le ritonavir, à une inhibition
des cytokines inflammatoires (IL-1α, IL-1β et TNFα) et à l'absence d'infiltration
inflammatoire du SNC des animaux traités. Cet effet n'est pas sans rappeler l'effet de
l'interféron β utilisé comme traitement de fond de la SEP.
Les autres anti-protéases virales, dépourvues d'action sur le protéasome, n'ont pas eu
d'effet sur l'EAE.
L'effet clinique observé chez les animaux traités par le ritonavir était corrélé à une
modification de l'expression cytokinique dans le SNC, avec une augmentation de la
production des cytokines de type Th2 (IL10) et un retard d'expression des cytokines de type
Th1 (IL1). Cette étude montre que l'inhibiteur de protéasome ritonavir pourrait constituer
H. Hosseini., 63
une nouvelle arme thérapeutique contre la SEP, d'autant plus qu'il est déjà utilisé chez
l'Homme.
B. Ritonavir et AVC
Nous avons dans un second temps voulu évaluer le potentiel neuroprotecteur du
ritonavir dans une situation pathologique aiguë, l’AVC, représentée dans un modèle
expérimental d'ischémie focale permanente chez la souris. Dans ce modèle, la lésion
ischémique est principalement corticale et évolue avec une cinétique rapide. La lésion
initiale, que l'on peut assimiler au cœur de l'infarctus sur la base d'analyses du débit sanguin
cérébral est constituée entre 3 et 6 h. La lésion secondaire, par expansion dans la région de
débit sanguin résiduel, est constituée en 24 h. Nous avons voulu analyser dans ce modèle
d'une part, l'efficacité neuroprotectrice du ritonavir, d'autre part, l'éventualité d'un effet sur
les processus apoptotiques, par l'intermédiaire d'un de leurs marqueurs, l'activation des
caspases.
Nos résultats montrent une diminution du volume d’infarctus chez les animaux traités
par le ritonavir en comparaison d’animaux non traités. Ce résultat a été validé dans deux
modèles d’ischémie cérébrale focale, avec ou sans reperfusion. La réduction du volume
d’infarctus était associée à une réduction de l’activité de deux caspases, la caspase-1 et la
caspase-3, qui sont deux effecteurs du programme de mort cellulaire par apoptose, voie
principale de dégénérescence cellulaire dans la pénombre ischémique.
H. Hosseini., 64
La caspase-3 est directement responsable du clivage de substrats cellulaires
correspondant à la plupart des modifications morphologiques et biochimiques de l’apoptose
(Onteniente et al., 2003). Dans l’ischémie cérébrale, il a été montré que la surexpression et
l’activation de la caspase-3 participe à la mort neuronale, en particulier au niveau de
l’hippocampe et du striatum après ischémie focale transitoire (Hermann et al., 2001;
Namura et al., 1998; Ni et al., 1997; Benchoua et al., 2001) et globale (Chen et al., 1998;
Gillardon et al., 1999; Ni et al., 1998). L’injection intra-cérébroventriculaire d’inhibiteurs
sélectifs des caspases est neuroprotectrice dans des modèles d’ischémie transitoire (Chen et
al., 1998; Endres et al., 1998; Fink et al., 1998) et permanente (Krupinski et al., 2000). Ces
différents résultats semblent confirmer la pertinence du contrôle de l’apoptose comme
moyen de réduire les dommages tissulaires et cellulaires consécutifs à un épisode
ischémique. Ce contrôle peut s’exercer à différents niveaux, comme par exemple en
réduisant les voies d’activation des caspases ou en inhibant directement les caspases déjà
activées. Nos résultats montrent que l’inhibition du protéasome et les actions encore non-
identifiées du ritonavir peuvent diminuer significativement l’activation de la caspases et le
volume d’infarctus après occlusion artérielle.
La caspase-1 fait partie, avec la caspase-8, des caspases dites « inflammatoires ». il
existe 7 caspases inflammatoires chez les mammifères. Chez l’homme, les gènes de ces
caspases sont regroupés sur le chromosome 11q22 dans l’ordre suivant, depuis le télomère,
caspase-1, caspase-5, caspase-4 et caspase-11. Trois inhibiteurs de la caspase-1, ICEBERG,
INCA et COP (Druilhe et al., 2001), sont également présents sur le même locus chez
l’homme. Les précurseurs des cytokines pro-inflammatoires, interleukine-1β et
H. Hosseini., 65
interleukine-18, sont stockés dans le cytosol des cellules en attendant leur activation et leur
sécrétion (Martinon et al., 2002). Leur protéolyse est due, au moins en partie, aux caspases
inflammatoires et en particulier à la caspase-1 (Petrilli et al., 2005), ou interleukin-1-ß-
converting enzyme (ICE). Cette activation par protéolyse, événement indépendant d’une
transcription et de traduction, agit vraisemblablement comme une réponse rapide à
l'infection et constitue ainsi une réponse extrêmement avantageuse de l'immunité innée.
Notre étude a montré une inhibition significative de l’activité de la caspase-1 dans le
modèle MCAO transitoire, ce qui suggère une relation avec l’inflammation induite par la
reperfusion.
Nos résultats suggèrent également une diminution de la liaison NF-B à l’ADN. NF-
B existe dans toutes les cellules de mammifère. En conditions physiologiques, NF-B
existe sous forme inactive, liée à un inhibiteur, I-B. La phosphorylation d’I-B et son
ubiquitinylation entraîne la libération de NF-B, qui est transloqué au noyau pour lier ses
cibles dans l’ADN et activer des promoteurs spécifiques. Parmi ces promoteurs se trouvent
des cytokines, comme le TNF ou l’IL-1ß. La séquestration de NF-B dans le cytoplasme
réduit la synthèse et la libération de ces cytokines. L’ischémie cérébrale s’accompagne
d’une forte activation de NF-B et cette activation est inhibée par différents composés,
dont des agents anti-inflammatoires tels que la simvastatine (Cimino et al., 2005). Nos
résultats renforcent la possibilité d’agir de façon bénéfique sur NF-B et l’inflammation
qui résulte de l’ischémie cérébrale avec des agents thérapeutiques. En évitant l'activation de
NF-B et des caspases, l'inhibition du protéasome correspond à cette approche
thérapeutique.
H. Hosseini., 66
De nombreux inhibiteurs de protéasome ont été testés avec succès dans des modèles
animaux d'ischémie (Phillips, 2000, Zhang, 2001; Wojcik, 2004; Williams, 2004). Des
inhibiteurs du protéasome ont montré leur efficacité contre l’ischémie rénale et
myocardique. L'inhibition irréversible du protéasome pourrait avoir un effet
immunosuppresseur favorisant les infections opportunistes et certaines néoplasies.
H. Hosseini., 67
CONCLUSION
Le point commun entre les 2 modèles expérimentaux animaux utilisés dans ce travail
(EAE et ischémie cérébrale focale) est l'existence d'une réponse inflammatoire intéressant
le système nerveux central. L'inhibition du protéasome empêche cette infiltration
inflammatoire, l'expression de cytokines inflammatoires (IL-1α, IL-1β et TNFα) et des
molécules d'adhérence. Dans une perspective d’application clinique du ritonavir à ces deux
types d’atteintes neurologiques (SEP et AVC), nous pouvons mentionner le fait qu’il
possède déjà une AMM, ce qui faciliterait l’élargissement de son application, et qu’il ait un
effet inhibiteur faible et réversible du protéasome ce qui minimise les effets secondaires
dus à l’inactivation de voies intracellulaires vitales.
Ces résultats ouvrent des nouvelles perspectives thérapeutiques dans les maladies
inflammatoires basées sur la modulation du protéasome.
H. Hosseini., 68
Article EAE publié dans Journal of
Neuroimmunology, 2001
H. Hosseini., 69
H. Hosseini., 70
H. Hosseini., 71
H. Hosseini., 72
H. Hosseini., 73
H. Hosseini., 74
H. Hosseini., 75
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H. Hosseini., 77
H. Hosseini., 78
H. Hosseini., 79
H. Hosseini., 80
H. Hosseini., 81
H. Hosseini., 82
H. Hosseini., 83
H. Hosseini., 84
H. Hosseini., 85
H. Hosseini., 86
H. Hosseini., 87
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