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Mutaciones en el citocromo b que modifican la unión del ubiquinol entre el

complejo del citocromo bc1 y confiere resistencia a drogas antimalariales en

Saccharomyces cerevisiae.

Mutaciones en el citocromo b que modifican la unión del ubiquinol entre el

complejo del citocromo bc1 y confiere resistencia a drogas antimalariales en

Saccharomyces cerevisiae.

Fuente: Jacques J. Kessl et al THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. Vol. 280, No. 17, Issue of April 29, pp. 17142–17148, 2005

Biol. Luz Edith Ochoa SánchezIB. Perla Tinoco CarrilloQC. Miguel Ángel Ortiz Gil.

INTRODUCCIÓN.INTRODUCCIÓN.

Es una serie de transportadores de electrones

que se encuentran en la membrana plasmática , en la

membrana interna mitocondrial, que median

reacciones bioquímicas que producen adenosina trifosfato (ATP), que es el compuesto energético que utilizan los

seres vivos.

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CADENA RESPIRATORIA:

El resultado final es la producción de dos donadores de electrones: NADH y FADH2. Los electrones de estos dos donadores son pasados a través de la cadena de electrones hasta el oxígeno, el cual se reduce para formar agua.

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Se han identificado 4 complejos enzimáticos unidos a membrana interna mitocondrial.

Tres de ellos son complejos transmembrana, que están embebidos en la membrana interna,

Mientras que el otro esta asociado a membrana.

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NADH DHSuccinato DH Ubiquinona:

Citocromo c Oxidoreductasa

Citocromo oxidasa

COMPLEJO ICOMPLEJO I

El "complejo I" o NADH deshidrogenasa o NADH:ubiquinona oxidoreductasa (EC 1.6.5.3)

Su función es captar dos electrones del NADH y los transfiere a un transportador liposoluble denominado ubiquinona (Q).

El producto reducido, que se conoce con el nombre de ubiquinol (QH2).

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El flujo de electrones ocurre de la siguiente forma:

El NADH es oxidado a NAD+, reduciendo al FMN a FMNH2 en un único paso que implica a dos electrones.

El siguiente transportador de electrones es una centro Fe-S que sólo puede aceptar un electrón y trasferirlo a la ubiquinona generando una forma reducida denominada semiquinona.

La ATP-sintasa ATP-sintasa es impulsada por la impulsada por la diferencia de potencial diferencia de potencial electroquímico.

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COMPLEJO II.COMPLEJO II.

El "Complejo II o Succinato deshidrogenasa; EC 1.3.5.1. No es un bomba de protones. Además es la unica enzima del ciclo de Krebs asociado a membrana. Este complejo dona electrones a la ubiquinona desde el succinato y los

transfiere vía FAD a la ubiquinona.

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COMPLEJO III.COMPLEJO III.

El complejo III o Complejo citocromo bc1; EC 1.10.2.2.

El Citocromo C es un transportador de electrones hidrosoluble que se encuentra en el espacio intermebrana de la mitocondria.

Obtiene dos electrones desde QH2 y se los transfiere a dos moléculas de citocromo c.

El gradiente electroquímico impulsa a una

segunda ATP sintasa.

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COMPONENTES DEL COMPLEJO III.COMPONENTES DEL COMPLEJO III.

es una bomba de protones. Está formado por numerosas subunidades polipeptídicas una de ellas está

codificada por el genoma mitocondrial.

Las más importantes son:

1.-El citocromo b que tiene dos grupos hemo de tipo b; bL(b566) y bH(b562)

2.-El citocromosc1 que tiene un hemo de tipo c

3.-Fe-S proteína de tipo 2Fe-2S atípica (uno de los átomos de Fe está coordinado con dos residuos de His en lugar de dos de Cys)

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COMPLEJO IV:COMPLEJO IV:

El complejo IV o Citocromo c oxidasa; EC 1.9.3.1

Capta cuatro electrones de la moléculas de citocromo c y se transfieren al oxígeno (O2), para producir dos moléculas de agua (H2O).

Además "desaparecen" de la matriz 4 protones que forman parte del H2O.

Tercera bomba de protones que impulsa a la última ATP sintasa. Inhibida por Monóxido de Carbono.

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FOSFORILIZACIÓN OXIDATIVA.FOSFORILIZACIÓN OXIDATIVA.

C6H12O6  + 6 O2  -->> 6 CO2  +  6 H2O + 36 ATP

Se oxidan el NADH y el FAHD2 transfiriendo sus electrones (cadena de transporte de electrones) y la energía liberada es utilizada para bombear protones generando gradiente electroquímico

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Un gran complejo proteico llamado ATP-sintasa situado en la membrana, permite a los protones pasar a través en ambas direcciones; genera el ATP cuando el protón se mueve a favor de gradiente.

• El transporte al citosol de Pi, ADP y ATP requiere 1 H+

• Rendimiento neto: 4 H+ transportados por cada ATP sintetizado

Para NADH: 10 H+ bombeados (10 H+/ 4 H+) = 2.5 ATP Para FADH2= 6 H+ bombeados (6 H+/ 4 H+) = 1.5 ATP

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VIDEO DE CADENA RESPIRATORIA Y FOSFORILACION OXIDATIVA:VIDEO DE CADENA RESPIRATORIA Y FOSFORILACION OXIDATIVA:

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ANIMACIÓN

PLANTEAMIENTO DE PROBLEMA.PLANTEAMIENTO DE PROBLEMA.

Autovacuna es un nuevo agente antimalarial que ataca específicamente al complejo citocromo bc1 e inhibe la respiración parasitaria. Un creciente número de fracasos de estos medicamentos en el tratamiento de la malaria han tenido genéticamente mutaciones puntuales en la mitocondria en el gen del citocromo b.

¿ La estructura molecular del citocromo b y las uniones de la atovacuona con los complejos bc1 mutados, podrán explicar cuantitativamente las bases moléculas de la resistencia a la atovacuona para parásitos de la malaria?

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ANTECEDENTES:ANTECEDENTES:

La malaria o paludismo es una enfermedad aguda con características clínicas incluyen fiebre, escalofríos, dolor de cabeza, debilidad muscular, vomito, tos, diarrea y dolor abdominal.

Existen cuatro especies de parásitos que causan la malaria, Plasmodium ovale, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum y Plasmodium malariae

Los parásitos se transmiten por mosquitos del género Anopheles

Se establece una infección asintomática en células hepáticas.

Después de incubación, se liberan las formas sanguíneas del parásitos.

El parásito produce proteínas que se transportan y se sitúan en la membrana del eritrocito. Tales proteínas hacen que el eritrocito se pegue a las paredes de los vasos sanguíneos originando la obstrucción de los mismos.

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1. Inoculación de esporozoito

2. Exporozoitos pasan del torrente sanguíneo al hepatocito

3. Esquizoogenesis

4. Esquizonte hepático

5. Merozoito

6. Merozoito penetra a los hematíes7. Trofozoito

8. Esquizonte hematico

9. Gametocitos

10. Gametocitos chupados por el mosquito

11. Fusión de los gametocitos y formación de los huevos

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En los años 90’s, la gran necesidad permitió el desarrollo de:

1. Atovacuona (2-[ trans-4- (4’- clorofenil) ciclohexil] -3- hidroxi-1, 4

hidroxinaftoquinona)

Este compuesto antimalarial tiene una actividad de amplio espectro contra parásitos.

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ATOVACUONA:ATOVACUONA: Es un inhibidor potente y especifico del transporte de electrones en el complejo

citocromo bc1 (complejo III).

Esta toxicidad parece ser selectiva para la mitocondria del parasito, y la función mitocondrial del hospedero no es afectada por la terapia con autovacuona.

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El complejo bc1 de levadura es también inhibida por atovacuona, por lo cual se trabajo con S. cerevisiae como modelo para el estudio de mutaciones en el citocromo b que confieren resistencia a atovacuona en Plasmodium yoelli.

En el presente estudio transfirieron varias mutaciones asociadas con la resistencia a atovacuona en P. yoelii y P. falciparum en el gen del citocromo b de levadura.

Esto nos permitió confirmar la relación entre la resistencia a atovacuona y las mutaciones en el citocromo b, y explicar a nivel molecular el mecanismo por el cual el parasito de la malaria contrarresta la citotoxicidad terapéutica de esta nueva droga.

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VER ANIMACION

ANIMACIÓN

OBJETIVOS.OBJETIVOS.

Realizar el modelaje de la estructura del citocromo b y las uniones de la autovacuna con los complejos bc1 mutados.

Obtener la primera explicación cuantitativa para las bases moleculares de la resistencia a la autovacuna por parásitos de la malaria.

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METODOLOGIA.METODOLOGIA.

Purificación del complejo bc1:

1.La mutación del citocromo b fue inducida dentro de la mitocondria, el gen del citocromo b fue introducido mediante transformación balística.

2.Cepas de tipo silvestre y mutadas fueron crecidas en extracto de levadura/peptona/dextrosa y cosechadas por centrifugación.

3.El complejo de citocromo bc1 fue aislado a partir de la mitocondria.

 

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Medición de consumo de oxigeno y actividad reductasa del ubiquinol-citocromo C:

1.Tasas altas de oxígeno en cultivo intacto de células medidos a 25º C, con un oxigrafo Gilson y un electrodo para oxigeno polarografico .

2.La actividad reductasa de el complejo del citocromo bc1 fue ensayada en 50mM de fosfato de potasio a pH7, 2050mM de sacarosa, 0.2mM de EDTA, 20 y 4 µm de citocromo c a 23º C.

3.El complejo de citocromo bc1 fue diluido a 2.5nM en el buffer de ensayo y la reacción fue iniciada por adicion de 2,3-dimetoxi-5metil-6decil-1,4 benzoninol, un análogo de ubiquinol.

4.La reacción de citocromo C fue monitoreado en un espectrofotómetro.

5.Los datos fueron colectados y procesados con ayuda de una computadora.

 

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Modelado molecular:

1.Se llevo a cabo con ayuda de un software (Accelerys Inc., San Diego CA.),

2.Cada mutación de citocromo b, Y2795, Y279C, I269M, L282V y F2781, fue construido por separado en el centro del sitio P del atovacuone, usando energía mínima manual para cada estructura.

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RESULTADOS.RESULTADOS.

Hay un alto grado de identidad de secuencia (alrededor de 68%) entre S. cerevisiae y Plasmodium citocromo b dentro de la atovacuona-vinculante

Se eligió a la levadura para el estudio de las mutaciones estas pueden afectar a la eficacia de los medicamentos.

5 de estas mutaciones asociadas con resistencia a P. yoelii y P. falciparum fueron trasladados en la S. cerevisiae al gen del citocromo b.

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El modelo de estructura de la levadura vinculado con la atovacuona y ubicación de los residuos de aminoácidos afectados por la resistencia a la atovacuona del citocromo b mutante

Estas cinco mutaciones son I258M, F267I, Y268C, Y268S, y en L271V en la numeración del Plasmodium,

Lo que equivale a I269M, F278I, Y279C, Y279S, y L282V en el sistema de numeración de levadura .

Se usaron la numeración de la S. cerevisiae para el citocromo b en lo sucesivo. Con excepción de I269M.

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Para analizar las mutaciones en la respiración de las células de levadura. Se desarrollo una curvas de crecimiento:

1.Revelan que, en contraste con un tiempo de duplicación de 6 h observado en una cepa natural.

2.Mientras que la cepas mutadas de I269M, F278I y Y279C tuvo un tiempo de duplicación de 9h.

3.En tanto el Y279S y L282V mutantes defectos de crecimiento, con tiempos de duplicación 13 h.

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Las mediciones de consumo de oxígeno de las células de levadura en la fase mid-log de crecimiento se confirmó con una disminución de 60% de la función respiratoria para la Y279C, Y279S, y L282V de las cepas mutantes.

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El complejo citocromo bc1 fue purificado de las mitocondrias de cada cepa Los complejos bc1 de los tres mutantes Y279C, Y279S, y L282V mostraron

pérdidas de actividad 90% en comparación con la cepa de tipo salvaje. La cepa mutante I269M sufrió alguna pérdida de actividad durante el

aislamiento.

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Eficacia relativa de la inhibición de tipo silvestre y complejo mutado bc1 de atovacuona reductasa Ubiquinol-citocromo c.

la actividad de purificado del complejo bc1 se mide en la presencia de el aumento de las concentraciones de atovacuona.

Las actividades se expresan en porcentaje de la actividad de cada complejo bc1 en ausencia de inhibidor

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Los cambios estructurales de citocromo b causado por mutaciones que confiere resistencia a la atovacuona.

Los 5 citocromo b mutados se construyeron en el modelo previamente determinado.

La isoleucina en la posición 269, ubicada en una región hidrofóbica interactuó directamente con el anillo de naftoquinona atovacuona. Modelado de la I269M mutado mostró una disminución del volumen disponible en hidrofóbico, que interfiere con la unión del inhibidor.

La presencia de un grupo compuesto aromático de Phe-121, Phe-278, Tyr-359 en la cepa F278I mutado desestabilizo y por tanto, interfiere con la unión de la droga.

Tirosina 279 contenida en la cepas mutadas Y279C o Y279S, que sustituyen un grupo aromático nucleofílico fuerte, muestran la disminución de atovacuona.

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indican el cambio en el IC50 para la inhibición del complejo BC1 para atovacuona en comparación con inhibición de la enzima de tipo silvestre de levadura.

muestran el calcula en el cambio de la energía vinculante para atovacuona con cada uno de los BC1 mutado frente a los complejos que con la enzima de tipo salvaje.

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DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES:DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES:

Atovacuona es un inhibidor competitivo de la enzima.

La mayor parte de la atovacuona cepas de malaria resistentes a contener mutaciones puntuales en la mitocondria codificada gen citocromo b.

Se demostró bioquímicamente la resistencia que confieren estas mutaciones a la resistencia de la atovacuona.

Esta clasificación resultó en la resistencia moderada de la atovacuona para I269M y F278I y una mayor resistencia para Y279C y L282V.

El modelado de simulaciones moleculares fueron capaces de describir los efectos de cada uno de los puntos de mutación la geometría de la atovacuona molecular.

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El modelado molecular reveló que la mutación I269M, que incluye la inserción de un residuo de mayor tamaño.

El modelado molecular de la mutación L282V puso de manifiesto que la mutación causó la rotación de Tyr-279 y, en consecuencia, una variación de interacción con el atovacuona.

La importancia de Tyr-279 en el citocromo b de la actividad es BC1 apoyado por su conservación entre las especies.

Por lo tanto, la posición 279, a fin de mantener un complejo funcional BC1. Además, cuando esta posición es ocupada por un residuo nucleofílico como cisteína (Y279C) o serina (Y279S), la actividad se ve gravemente comprometida.

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BIBLIOGRAFIA.BIBLIOGRAFIA.

Alberts y col. Molecular Biology of the cell González Pocanowska Dolores. Nuevas dianas terapéuticas para el

tratamiento de la malaria. Enf Emerg. 2005; 7(1): 40-43. Indresh K. Srivastaya, Hagai Rottenberg, Akhil B. Vaidya . Atovaquone, a

Broad Spectrum Antiparasitic Drug, Collapses Mitochondrial Membrane Potential in a Malarial Parasite. Journal of Biological Chemistry. 1997; 272 (7): 3961- 3966.

Cushion Melanie T. Collins Margaret, Hazra Banadri, Kaneshiro Edna S. Effects of Atovaquone and Diospyrin- Based Drugs on the Cellular ATP of Pneumocystis carinii f. sp, carinii. Antimicrob agents and Chemother. 2000; 44 (3): 713- 719.

Malaria. International travel and health, Chapter 7. 2005. 132-151.

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A. Orozco-Barocio. 2005

A. Orozco-Barocio. 2005

GRACIAS POR SU ATENCIÓN.