Misure con biomarcatori I. Generalità Prof. Giorgio Sartor Corso di Laurea Specialistica in Scienze per lAmbiente e il Territorio Copyright © 2001-2006

Misure con biomarcatoriI. Generalità

Prof. Giorgio SartorCorso di Laurea Specialistica in Scienze per l’Ambiente e il Territorio

Copyright © 2001-2006 by Giorgio Sartor.

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Versione 3.0 - gennaio 2006

gs © 2001-2006 ver 3.0 Misure con biomarcatori I 2

Indice

• Generalità• Enzimologia• Tecniche analitiche• Biomarkers di genotossicità • Markers enzimatici e loro significato• Markers di funzionalità cellulare


Biomonitoraggio

La regolare e sistematica valutazione delle condizioni dell’ambiente mediante un insieme di metodiche che utilizzano specie animali o vegetali per misurare l’impatto degli agenti inquinanti sull’ambiente.


Biomarcatori di inquinamento

• Le risposte che un organismo genera nei confronti dei composti inquinanti rappresentano potenziali

Biomarkers

• Variazione indotta da un contaminante a livello di componenti biochimiche o cellulari di un processo, di una struttura o di una funzione.


Biomarkers

Misura funzionale dell’esposizione ad agenti

stressori espressa a livello sub-organismico, fisiologico,

comportamentale.

(McCarthy and Munkittrick, 1996)


Perché i biomarkers

• Rapporto costo-risultato• Rapidi• Robusti• Informativi• Rappresentano differenti livelli biologici• Generali/specifici• (Semplici)


Biomarkers

• Biomarkers generali– Sono indice di una alterazione generale

dell’ambiente.

• Biomarkers specifici– Sono la risposta ad uno specifico inquinante.

• Batteria di biomarkers– Insieme di biomarcatori in grado di dare

risposte integrate.


Biomonitoraggio mediante biomarkers

• VANTAGGI

– Precocità della risposa

– Rivela l’effetto sinergico degli inquinanti

– Rivela l’inquinamento anche quando la causa è scomparsa

• SVANTAGGI

– Influenza delle condizioni chimico-fisiche ambientali sugli organismi

– Variabilità biologica• Età• Genere• Stato riproduttivo• Stadio di sviluppo• Dieta • Isoenzimi


Inquinante o xenobiotico

ASSORBIMENTO

Distribuzione (sangue, tessuti)

Biotrasformazione

Metabolitiattivi

Metabolitiinattivi

Distribuzione (sangue, tessuti)

ESC

REZ

ION

E

Legame a siti critici Legame a siti non critici

Prodotti di degradazione

Effetti non tossici

Danni reversibili

Lesioni precliniche Lesioni cliniche

MONITORAGGIOAMBIENTALE

MONITORAGGIOdell’esposizione

biologica

MONITORAGGIOdell’effetto biologico

Meccanismi di riparo

DIAGNOSI


Organismo sano

Effetto sub-letale

Danno all’organismo

Danno alla popolazione

OrganismoBio-accumulatore

Alta tolleranza agli inquinantiCapacità di bio-accumulo

OrganismoBio-indicatore

Sensibilità agli inquinantiTolleranza allo stress

INQUINANTE

BIOMARKERS

CONTROLLO


Metabolismodegli xenobiotici

MetabolitiMECCANISMI DI SCAVENGING

Il monitoraggio biologico e l’utilizzo di biomarcatori

METALLOTIONEINE

O2

ROS DANNI CELLULARI

InquinamentoMetalli Xenobiotici

ROS


Effetto sinergico di inquinanti

Danno perossidativoalle membrane lisomiali

Danno perossidativo

alle membrane lisosomiali

IDROLASI

lipofuscine

DNA

LISOSOMI

Alterazionidel DNA

Riparate Non riparate

Mutazioni

Tumori e carcinogenesi

Aberrazioni aicromosomi

Apo-tioneine

metallotioneine

CytP450

Stimolazionesintesi mRNA

Stimolazionesintesi mRNA

ESCREZIONE

Biotrasformazione

Metaboliti

METALLIPESANTI

XENOBIOTICIORGANICI

METALLIPESANTI

ORGANOMETALLI(Sn)

INDUZIONE dellaSINTESI PROTEICA

HSP


Schema generale del metabolismo degli xenobiotici

Lipofilo Idrofilo

Xenobiotico Metabolita MetabolitaFase I

(ossidazione)Fase II

(sintesi)

• Variazione di polarità• Variazione di funzionalità

• Variazione di dimensioni• Variazione di carica• Variazione di solubilità

• Diminuzione dell’attività biologica• Aumentata escrezione


OH

OSO3H

O

OH

OH

OHO

COOH

Per esempio…

P450 idrossilazione

Benzene

Fase I

Aggiunta di un gruppo funzionale

Fenolo

Coniugazione con il solfato

Fase II

Coniugazione con l’acido glucuronico

Fenilsolfato

Fenilglucoronide

Maggiori dimensioni e aumentata idrofilia


Biomonitoraggio mediante biomarkers

• Effetti sub-letali– Alterazioni del DNA– Alterazione del sistema immunitario– Alterazioni biochimiche – Alterazioni morfologiche


Biomonitoraggio mediante biomarkers• Alterazioni del DNA (genotossicità)

– Addotti al DNA– Danni al DNA– Test dei micronuclei

• Alterazione del sistema immunitario– Fagocitosi– Conteggio degli emociti– Ossido di azoto– Linfociti– Saggi batterici

• Alterazioni morfologiche– Stabilità lisosomale– Modifica della struttura dei lisosomi– Proliferazione dei perossisomi– Accumulazione dei lipidi neutri– Accumulazione di lipofuscine


Biomonitoraggio mediante biomarkers• Alterazioni biochimiche

– Stress ossidativo• Catalasi (CAT) • Superossido dismutasi (SOD)• Glutatione perossidasi (GPX e Se-GPX), Glutatione reduttasi (GR), Stato

redox del glutatione, Glutatione totale (GSH)• Perossidazione lipidica

– malondialdeide (MDA), Sostanze reattive all’acido tiobarbiturico (TBARS)

– Biotransformazione e trasporto• Enzimi di fase I

– Ossidasi a funzione mista • Enzimi di fase II

– Sistemi di protezione cellulare• Metallotioneine (MT)• Heat-shock proteins (HSP)

– Neurotossicità• Inibizione della acetilcolinesterasi (AChE)

– Metabolismo energetico


Utilizzo di risposte sub-letali come biomarcatori

• Organismi sentinella– Scelta in funzione dell’ambiente da monitorare

• Controllo– In siti di controllo– Stabulazione

• Prelievi– Georeferenziazione– Assenza di stress

• Analisi– Enzimologia– Tecniche di analisi


Grazie a…

• … Bruna Gravina, Irene Tamburin, Christian Asirelli, Federico Caselli, Francesco Ferretti, Giuseppe Giammanco che, nell’ambito delle loro tesi di laurea in Scienze Ambientali, hanno prodotto testi, immagini, figure e diapositive, utilizzate in questa presentazione.

Giorgio Sartor


Referenze sul WEB• Vie metaboliche

– KEGG: http://www.genome.ad.jp/kegg/• Degradazione degli xenobiotici:

http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway/map/map01196.html• Struttura delle proteine:

– Protein data bank (Brookhaven): http://www.rcsb.org/pdb/– Hexpasy

• Expert Protein Analysis System: http://us.expasy.org/sprot/• Prosite (protein families and domains): http://www.expasy.org/prosite/• Enzyme (Enzyme nomenclature database):

http://www.expasy.org/enzyme/– Scop (famiglie strutturali): http://scop.berkeley.edu/

• Enzimi: – Nomenclatura - IUBMB: http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/– Proprietà - Brenda: http://www.brenda.uni-koeln.de/– Expasy (Enzyme nomenclature database): http://www.expasy.org/enzyme/

• Database di biocatalisi e biodegradazione: http://umbbd.ahc.umn.edu/• Citocromo P450: http://www.icgeb.org/~p450srv/• Metallotioneine: http://www.unizh.ch/~mtpage/MT.html• Tossicità degli xenobiotici: Agency for Toxic Substances and Disease Registry

http://www.atsdr.cdc.gov

http://www.genome.ad.jp/kegg/

http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway/map/map01196.html

http://www.rcsb.org/pdb/

http://us.expasy.org/sprot/

http://www.expasy.org/prosite/

Crediti e autorizzazioni all’utilizzo

• Questo ed altro materiale può essere reperito a partire da:http://www1.ambra.unibo.it/giorgio.sartor/

• Il materiale di questa presentazione è di libero uso per didattica e ricerca e può essere usato senza limitazione, purché venga riconosciuto l’autore usando questa frase:

Materiale ottenuto dal Prof. Giorgio SartorUniversità di Bologna a Ravenna

Giorgio Sartor - [email protected]

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