Manual de Tcnicas Microbiolgicas

Para la Evaluacin de la Calidad Ambiental de Ecosistemas Marino costeros

HONORABLE AYUNTAMIENTO DE SOLIDARIDAD 2008-2011

CRDITOS COMIT EDITORIAL

Honorable Ayuntamiento del Municipio de SolidaridadC. Eduardo Romn Quian Alcocer Presidente Direccin General de Ordenamiento Ambiental y Urbano Arq. Jorge Alonso Durn Rodrguez Director General Direccin de Medio Ambiente M. en C. Gladys Prez de la Fuente Directora MANUAL DE TCNICAS MICROBIOLGICAS PARA EVALUACIN DE LA CALIDAD AMBIENTAL DE ECOSISTEMAS MARINO COSTEROS Ministerio de Ciencia, Tecnologa y Medio Ambiente Instituto de Oceanologa, Cuba Departamento de Microbiologa-Necton Dra. Mara Elena Miravet Regalado M. en C. Diana Iris Enrquez Lavandera Dra. Margarita Lugioyo Gallardo Universidad Nacional Autnoma de Mxico Instituto de Biologa Departamento de Botnica Dra. Mara del Carmen Gonzlez Villaseor Colaboradores Direccin de Medio Ambiente M. en C. Gladys Prez de la Fuente Directora M. en C. Nuria Joseph Montero Lic. Mara Cristina Cap de Paz Tcnico Francisca Rodrguez Acosta

PREFACIOEstamos conscientes de la importancia de este libro para los especialistas de habla hispana que se desenvuelven en el tema del medio ambiente e incluso, para los estudiantes que se inician en esta lnea, ya que brindan los detalles necesarios para determinar la calidad ambiental del ecosistema marino a partir de diferentes indicadores microbiolgicos, que como es conocido, permite tomar medidas inmediatas para la proteccin y/o recuperacin de las condiciones naturales. El presente Manual, resume las tcnicas y metodologas de microbiologa marinas ms utilizadas para abordar los aspectos siguientes: evaluacin de la calidad del agua de uso recreativo, desde el punto de vista higinico sanitario, evaluacin de la calidad ambiental de las aguas y sedimentos en los diferentes ecosistemas marinos (arrecifes, manglares, pastos marinos, playas), determinacin de microorganismos indicadores del grado de contaminacin tanto orgnica, como por la presencia hidrocarburos, en la zona costera marina, velocidad de autodepuracin de las aguas marinas (importante para inferir la capacidad de recuperacin), parmetros microbiolgicos tiles en estudios de factibilidad para situar granjas para cultivo de organismos marinos, indicadores microbiolgicos necesarios para hacer lneas bases en sitios de desarrollo turstico, en aquellos donde se siten plataformas petroleras u otras industrias.

Adems de los indicadores de calidad ambiental, se incluyen tcnicas para aislar microorganismos de peces, crustceos, algas y otros organismos marinos con diversos fines, y de inters biotecnolgico como:

tcnicas para aislar microorganismos marinos productores de sustancias biolgicamente activas (tensoactivos, polisacridos y luciferasa), tcnicas para estudiar la diversidad de hongos marinos en playas, manglares, y arrecifes.

El Manual ofrece tambin detalles explcitos y recomendaciones prcticas para facilitar el montaje de las tcnicas e interpretacin de los resultados, y constituye un basamento adecuado para estudios de pre y postgrado de microbilogos y bilogos marinos. Se merece destacar que es una importante contribucin para el Programa Integral de Playas Limpias en Mxico, en el cual participa el H. Ayuntamiento del Municipio de Solidaridad, a travs del Comit Local de Playas Limpias de la Zona Norte del Estado de Quintana Roo.

Editores

PRLOGOLa historia evolutiva de los microorganismos se remonta a ms de 3 mil 500 millones de aos y una parte importante de sta ha ocurrido en el medio marino. Desde entonces, los microorganismos constituyen un componente esencial de las redes trficas de los ecosistemas marinos, con una gran abundancia y biomasa, contribuyendo a la regeneracin de nutrientes e interactuando con una amplia gama de organismos. Los microorganismos marinos juegan un papel importante en los ciclos biogeoqumicos de carbono, el nitrgeno, el azufre, el fsforo, el hierro y los metales trazas, pero adems constituyen nuevas fuentes de produccin de sustancias biolgicamente activas de inters para las industrias mdico-farmacutica, petrolera, alimenticia, etc. Este Manual de Tcnicas de Microbiologa Marina, est dirigido a estudiantes, docentes y especialistas de Amrica Latina que se proponen a estudiar e investigar diferentes aspectos relacionados con las bacterias y los hongos que habitan en el ecosistema marino. Su principal ventaja es que en l se han recopilado tcnicas y metodologas de trabajo muy utilizadas en esta especialidad, que se encuentran dispersas en diferentes publicaciones en otros idiomas, lo que facilita al usuario de habla hispana su consulta en un nico documento. Otro aspecto importante de este documento, es que sirve de apoyo a los profesores en la preparacin y desarrollo de los programas dre educacin superior relacionados con las ciencias marinas, y a los jvenes graduados que se inician en los trabajos de ecologa microbiana marina. El manual se ha conformado dividido en seis captulos. En el primero se abordan aspectos tericos generales sobre la distribucin e importancia de los microorganismos marinos en el ecosistema y algunas generalidades de los principales biotopos que caracterizan nuestra regin. El segundo captulo reune algunas de las tcnicas ms utilizadas de enumeracin de bacterias hetertrofas, sulfatoreductoras y coliformes, de suma importancia en estudios de contaminacin orgnica y fecal en aguas marino costeras, as como las tcnicas de aislamiento de bacterias degradadoras de hidrocarburos y productoras de tensioactivos, productoras de polisacridos, bacterias luminicentes, bacterias asociadas a peces invertebrados marinos, y bacterias asociadas a macroalgas y fanergamas marinas. En el tercer captulo se describen tcnicas y metodologas de aislamiento de hongos marinos de playas, pastos marinos, manglares, y hongos asociados a gorgnidos, hacindose referencia a las claves ms actualizadas de identeificacin de estos microorganismos. El cuarto captulo explica los mtodos que se utilizan para la conservacin de bacterias y hongos en el laboratorio, brindando referencias que permiten profundizar en detalles especficos para cada caso. En el captulo quinto se describen las tcnicas de conteo total de mecroorganismos empleando microscopa de epifluorescencia, la determinacin de bimasa a partir del

volumen celular y el conteo total y varios mtodos para determinar la productividad bacteriana. Tambin, se presentan las tcnicas para determinar la productividad bacteriana. Tambin, se presentan las tcnicas para determ,inar la fotosntesis, produccin primaria y respiracin, aspectos sumamente importantes en los estudios sobre el funcionamiento del medio marino, y por ltimo, se describen las tcnicas para determinar la intensidad de los procesos de descomposicin aerobia y anaerobia de la materia orgnica, respectivamente, empleando mtodos que no requieren de una infraestructura compleja y recursos sofisticados. El captulo sexto y final, brinda la composicin de los medios de cultivo que se han citado en los captulos dos y tres, lo que permite disponer de toda la informacin tcnica necesaria para realizar las tcnicas descritas. Las tcnicas que se describen en este manual han sido probadas con xito en el Laboratorio de Microbiologa Marina del Instituto de Oceana de Cuba y en el Laboratorio de Ascomicetos del Instituto de Biologa de la Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Resulta meritorio el empeo colectivo de las autoras de poner a disponer del alumnos y profesores el resultado de sus experiencias para contribuir al conocimiento del mundo marino. Esperamos que el noble propsito de las autoras les permita a los lectores seguir los caminos de los nuevos conocimientos para habitar un mundo ms sano y mejor.

Dra. Lina Domnguez Acosta Viceministro Ministerio de Ciencia , Tecnologa y Medio Ambiente de Cuba

Hay ms microorganismos en el mar que estrellas en el universo Copley, J. 2002. All at sea. Nature 415: 572-574.

NDICEPREFACIO PRLOGO CAPTULO 1. Introduccin. 1.1. Distribucin de los microorganismos en el mar ........................................................ 4 1.2. Importancia de los microorganismos marinos ............................................................ 6 1.3. Caractersticas de los Ecosistemas marinos ............................................................... 9 CAPTULO 2. Tcnicas de Bacteriologa. 2.1. Enumeracin de bacterias hetertrofas aerobias mesfilas ........................................ 2.2. Enumeracin de bacterias sulfatoreductoras .............................................................. 2.3. Enumeracin de Coliformes totales y fecales ............................................................ 2.4. Enumeracin de Estreptococos fecales ...................................................................... 2.5. Aislamiento de bacterias degradadoras de hidrocarburos .......................................... 2.6. Aislamiento de bacterias productoras de sustancias tensioactivas ............................. 2.7. Aislamiento de bacterias productoras de polisacridos extracelulares ....................... 2.8. Aislamiento de bacterias luminiscentes ...................................................................... 2.9. Aislamiento de bacterias asociadas a organismos marinos ........................................ 2.10. Aislamiento de bacterias asociadas a macroalgas y fanergamas marinas............... CAPTULO 3. Tcnicas Micolgicas. 3.1. Aislamiento de hongos en las playas .......................................................................... 3.2. Aislamiento de hongos de los pastos marinos ............................................................ 3.3. Aislamiento de hongos asociados al mangle .............................................................. 3.4. Aislamiento de hongos asociados a organismos marinos ........................................... 21 28 32 40 46 51 56 60 64 73 79 84 88 92

CAPTULO 4. Mtodos de Conservacin. 4.1. Bacterias ..................................................................................................................... 99 4.2. Hongos ........................................................................................................................ 405 CAPTULO 5. Tcnicas y Mtodos en Ecologa microbiana. 5.1. Conteo Directo del Nmero Total de microorganismos ............................................. 5.2. Determinacin de biomasa ......................................................................................... 5.3. Determinacin de la Productividad bacteriana ........................................................... 5.4. Determinacin de la Fotosntesis, la Produccin primaria y la Respiracin ............... 5.5. Determinacin de la intensidad del proceso de mineralizacin aerobia de la materia orgnica ..................................................................................................... 5.6. Determinacin de la intensidad del proceso de mineralizacin anaerobia de la materia orgnica en los sedimentos ................................................................... 111 117 123 131 137 142

CAPTULO 6. Medios de Cultivo. 6.1. Bacterias ..................................................................................................................... 147 6.2. Hongos ........................................................................................................................ 160

Captulo 1 Introduccin

INTRODUCCIN Microorganismo es un trmino que incluye distintas formas de vida que comparten la caracterstica comn de tener un tamao menor de 200 m (Tabla 1). Estas formas de vida pueden pertenecer a cualquiera de los tres dominios de la vida que existen en nuestro planeta, Archaea, Bacteria y Eukarya (Woese et al. 1990), e incluye desde procariotas (bacterias y arqueas) hasta eucariotas (algas y protistas fagotrofos), tanto auttrofos como hetertrofos. Asimismo, dentro del mbito de estudio de la Microbiologa se incluyen los virus y otros agentes subvricos que no presentan estructura celular (Lpez y Zaballos, 2005). Recientemente, se ha propuesto un nuevo dominio biolgico denominado Akamara para incluir estas formas de vida (Hurst, 2000). Dentro de este nuevo dominio se propone incluir dos reinos, Euviria (virus verdaderos) y Viroidia (viroides y virusoides), y una organizacin en phyla, clases, rdenes, gneros y especies similar a la del resto de seres vivos (Hurst, 2000). Tabla 1. Diferentes categoras en que se agrupan los microorganismos de acuerdo a su tamao (Tomado de Sherr, E. y Sherr, B. 2000. Marine microbes: an overview. En: Microbial Ecology of the Oceans. Ed. D.L. Kirchman, Wiley-Liss, New York. 13-46).

CategoraFemtoplancton Picoplancton

Grupo MicrobianoViruses Procariotes Bacterias Fotoauttrofos Proclorofitas Cianobacterias cocoides Cianobacteriasfilamentosas Quimioauttrofas Hetertrofas Archaea Picoalgas Flagelados picohetertrofos

Tamao (m)0.01-0.2

0.5 1.0 0.5 2.0 1.0 2.0 7-10 ancho 2mM SO42-), por tanto, predomina la respiracin anaerobia mediante sulfatos como aceptor de electrones, pudiendo llegar a representar el 50% de la mineralizacin de carbono orgnico. Las BSR juegan un papel importante en el ciclo del azufre en el ocano removiendo la mayor parte del sulfato (aproximadamente 1011 kg) que llega al mar cada ao por el aporte de los ros debido al escurrimiento terrgeno (Battersby, 1988). Objetivo: Determinar el nmero de bacterias sulfatoreductoras en muestras de aguas y sedimentos marinos por el mtodo de Nmero Ms Probable. Materiales, reactivos, medio de cultivo y equipos empleados. Materiales. Frascos de vidrio de 150 mL de capacidad. Frascos de vidrio de 50 mL de capacidad. Pipetas estriles de 10 y 1 mL. Tubos con tapas de rosca.

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA Reactivos y medio de cultivo. Buffer Fosfato. Medio API (Overzil, 1970). Equipos. Incubadora bacteriolgica. Jarra mezcladora estril. Zaranda. Detalles experimentales. La mayora de las BSR crece bien a temperaturas entre 25 y 35C, aunque usualmente se cultivan a una temperatura de incubacin de 30C. El sustrato es el factor selectivo determinante para el crecimiento de un tipo u otro de BSR procedente de aguas marinas o de otro medio en particular, por tanto, existen varios medios de cultivos recomendados para los diferentes tipos de BSR. En este acpite se utiliza el medio API (American Petroleum Institute) recomendado por Overzil, (1970), y se emplea la metodologa de diluciones seriadas en tubos mltiples para determinar el Nmero Mas Probable (NMP). Procedimiento. Se inoculan 10, 1 y 0.1 mL de la muestra de agua de mar en series de cinco tubos estriles y posteriormente, se le aade 10 mL de medio API a la primera serie de cinco tubos (muestra sin diluir) y 9 mL a las series siguientes de tubos (diluciones 1/10 y 1/100, respectivamente). Se cierra cada tubo con tapa de rosca y despus de rotularlos convenientemente, se incuban a 30C de 2 a 4 semanas. Debe prepararse un tubo control sin inculo. Se consideran positivos aquellos tubos donde ocurre un cambio de color de rojo a negro. En el caso de que sean muestras de sedimento, se toman 50g de muestra del horizonte seleccionado, y se suspenden en 450 mL de agua de mar estril o en Buffer Fosfato. Se homogenizan en una jarra mezcladora estril por 1 a 2 min, o en zaranda por 15 min, obtenindose de esta forma la dilucin 1:10. A partir de esta dilucin, se preparan las restantes diluciones decimales: se toma 1 mL de la dilucin 1:10 y se lleva a un tubo que contiene 9 mL de agua de mar estril o Buffer Fosfato, se homogeniza el contenido obtenindose as la dilucin 1:100. Si se requiere mayor nmero de diluciones se seguir el mismo procedimiento siempre utilizando una pipeta estril para cada dilucin. Posteriormente, se inoculan series de 5 tubos y se rellenan con medio API. Los primeros 5 tubos inoculados con 10 mL de la dilucin 1:10 se les aaden 10 mL de medio API y constituyen las porciones de 1g. Se tomarn 5 alcuotas de 1 mL cada una de la dilucin 1:10 y se inocularan en 5 tubos a los cuales se les aaden 10 mL de medio API, stos constituyen las porciones de 0.1g. Se tomarn 5 alcuotas de 1 mL cada una de la dilucin 1:100, 1:1000, 1:10000, as sucesivamente, hasta la ltima dilucin empleada y se inocularn en tubos que se llenan con el medio API, stos constituyen las porciones de 0.01g, 0.001g, 0.0001g y dems respectivamente. Se incuban los tubos a 30C Pgina 29

TCNICAS DE BACTERIOLOGA de 2 a 4 semanas y al igual que en el caso de las muestras de agua, un cambio de coloracin del medio de rojo a negro se considera positivo. Conteo y clculos La densidad de bacterias sulfatoreductoras en las muestras de agua se expresa como el NMP de BSR por 100 mL de muestra, y en el caso de los sedimentos, se puede expresar NMP de BSR/ 100g de peso seco o por gramo de peso hmedo. La Tabla de NMP tambin puede ser utilizada cuando volmenes mayores y menores de la muestra son inoculados. En este caso se procesa un cdigo formado por los nmeros de tubos con resultados positivos para BSR obtenidos en las tres series consecutivas inoculadas, verificndose el valor de NMP correspondiente a el. Para el clculo del NMP de bacterias sulfatoreductoras en los sedimentos, el NMP/100g ser dada a travs de la siguiente frmula: NMP correspondiente al cdigo x 10 NMP/100g (peso seco)= ----------------------------------------------------Mayor vol. inoculado seleccionado para conformar el cdigo Ejemplo: Porciones en los tubos inoculados NMP del Cdigo 530 80

A B C D E

Clculo NMP/100g

1g + + + + + 5 0.1g + + + - 3 0.01g - - - - - 0

80x10/1 = 800

+ : tubos con cambio de color de rojo a negro - : tubos que no muestran cambio de color del medio NMP/100g (peso hmedo) = 800. NMP/ g (peso hmedo) = 8. Resultado del peso seco obtenido = 0.4g 1g (peso seco) NMP/g (peso seco) = NMP/g (peso hmedo) x ----------------------Peso seco (g) Por tanto: NMP/g (peso seco) = 8 x 1g/ 0.4 = 20 NMP/g En los casos considerados como negativos (cdigo 000) el resultado se expresar como