MercodiaIso-Insulin ELISA

Instrucciones para el uso

10-1128-01REACTIVOS PARA 96 DETERMINACIONES

Para uso diagnóstico in vitro

Fabricado por

Mercodia ABSylveniusgatan 8ASE-754 50 UppsalaSuecia

EXPLICACIÓN DE LOS SÍMBOLOS UTILIZADOS EN LAS ETIQUETAS

∑ = 96

Reactivos para 96 determinaciones

Fecha de caducidad

Conservar a entre 2–8°C

Nº lote

Para uso diagnóstico in vitro

© Mercodia 2008-2019

UTILIZACIÓN PREVISTAMercodia Iso-Insulin ELISA es un método para la determinación cuantitativa de insulina humana en suero o plasma.

RESUMEN Y EXPLICACIÓN DE LA PRUEBALa insulina es la principal hormona encargada del control del metabolismo de la glucosa. Es sintetizada por las células ß de los islotes de Langerhans como el precursor proinsulina que se procesa para formar péptido C e insulina. Ambos se secretan en cantidades equimolares a la circulación portal. La molécula de insulina madura consta de dos cadenas polipeptídicas, la cadena A y la cadena B (21 y 30 aminoácidos, respectivamente). Las dos cadenas están unidas por dos puentes disulfuro intercatenarios. En la cadena A también hay un puente disulfuro intracatenario. La secreción de insulina se controla principalmente mediante la concentración plasmática de glucosa, y la hormona tiene diversas e importantes acciones metabólicas. Su función principal es controlar la captación y utilización de glucosa en los tejidos periféricos por medio de la glucosa. Esta y otras acciones hipoglucémicas, como la inhibición de la neoglucogenesis y la gluco-genolisis hepática, están contrarrestadas por las hormonas hiperglucémicas, como glucagon, adrenalina, hormona del crecimiento y cortisol. Las concentraciones de insulina están reducidas de forma importante en la diabetes mel-litus insulinodependiente (DMID) y en otras patologías como el hipopituitarismo. Los niveles de insulina están aumentados en la diabetes mellitus no insulinodependiente (DMNID), obesidad, insulinoma y algunas disfunciones endocrinas como el síndrome de Cushing y la acromegalia.

PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTOMercodia Iso-Insulin ELISA es un inmunoensayo de fase sólida de dos puntos. Se basa en la técnica de sandwich directo según la que dos anticuerpos monoclonales se dirigen contra deter-minantes antigénicos separados de la molécula de insulina. Durante la incubación, la insulina de la muestra reacciona con los anticuerpos anti-insulina conjugados en peroxidasa y anticuerpos anti-insulina ligados con los pocillos de microtitración. El anticuerpo marcado con enzima no unido se elimina con un simple lavado. El Enzyme Conjugate unido se detecta por reacción con 3,3’,5,5’-tetrametilbencidina (TMB). La reacción se para añadiendo ácido para dar un punto final colorimétrico que se lee por espectrofotometría.

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ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES• Para uso diagnóstico in vitro. No para uso interno o externo en humanes o animales.• El contenido de este kit y sus residuos no deben dejarse entrar en contacto con animales

rumiantes o cerdos.• Las muestras deben manipularse como si fueran capaces de transmitir infecciones.• Cada pocillo sólo puede ser usado una vez.• La Stop Solution contiene <5% de ácido sulfúrico. La Stop Solution está etiquetada:

Peligro H318 – Provoca lesiones oculares graves. H315 – Provoca irritación cutánea. P280 – Llevar guantes/prendas/gafas/máscara de protección. P264 – Lavarse manos concienzudamente tras la manipulación. P302 + P352 + P362 + P364 – EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL: Lavar con agua y jabón abundantes. Quitarse las prendas contaminadas y lavarlas an- tes de volver a usarlas. P332 + P313 – En caso de irritación cutánea: Consultar a un médico. P305 + P351 + P338 + P310 – EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Acla- rar cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quitar las lentes de con- tacto, si lleva y resulta fácil. Seguir aclarando. Llamar inmediatamente a un CENTRO DE INFORMACION TOXICOLOGICA o a un médico.• El Enzyme Conjugate Buffer, Cal 0, 1, 2, 3, 4 y el Wash Buffer contienen <0.06% 5-cloro-

2-metil-4-isothiazolin-3-ona y 2-metil-2H-isotiazol-3-ona (3:1). El Enzyme Conjugate Buffer, los Calibrators y el Wash Buffer están etiquetados:

Advertencia H317 – Puede provocar una reacción alérgica en la piel. P280 – Use guantes de protección. P261 – Evite respirar los vapores. P272 – Las prendas de trabajo contaminadas no podrán sacarse del lugar de trabajo. P302 + P352 – EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL: Lavar con agua y jabón abundantes. P333 + P313 – En caso de irritación o erupción cutánea: Consultar a un médico. P501 – Disponga del contenido y envase de acuerdo a las regulaciones locales, regionales, nacionales e internacionales.

MATERIAL REQUERIDO PERO NO SUMINISTRADO• Pipetas de volumen adecuado (para añadir la solución de la enzyme conjugate 1X, Substrate TMB y Stop Solution se prefieren las pipetas de repetición)• Tubos, Cubetas y probetas para preparar los reactivos• Agua bidestilada• Agitador magnético • Mezclador de vórtice• Lector de microplacas (filtro de 450 nm)• Agitador de placas (700-900 vueltas por minuto, movimimento orbital)• Aparato para lavador de microplaca con función de sobre-flujo de lavado (recomendado pero no obligatorio)

REACTIVOSCada kit de Mercodia Iso-Insulin ELISA (10-1128-01) contiene reactivos para 96 pocillos, sufi-cientes para 43 muestra y una curva de calibración por duplicado. Para series de ensayos más amplias, mezclar reactivos de paquetes de número de lote idéntico. La fecha de caducidad del kit completo está en el exterior identificada en una etiqueta. La temperatura de conservación recomendada es 2–8 ºC.

Coated Plate 1 placa 96 pocillos Listor para usarAnticuerpo monoclonal de ratón anti-insulina. 8 tiras de pocillos Para cintas de microtitración sin utilizar, cerrar la bolsa con cinta adhesiva y conservar a 2–8°C durante 2 meses.

Calibrators 1, 2, 3, 4 4 viales 1000 µL Listor para usarInsulina humana recombinanteCodificado en amarilloConcentratión declaró la etiqueta del vial.

Calibrator 0 1 vial 5 mL Listo para usarCodificado en amarillo

Enzyme Conjugate 11X 1 vial 600 µL Preparación, Monoclonal de ratón Enzyme Conjugate ver abajocon peroxidasa anti-insulina

Enzyme Conjugate Buffer 1 vial 6 mL Listo para usarCodificado en azul

Wash Buffer 21X 1 botella 50 mL Diluir con 1000 mLAlmacenaje después de diluir: agua bidestilada 2-8°C durante 2 meses. para preparar la solución de wash buffer 1X.

Substrate TMB 1 botella 22 mL Listo para usarSolución incoloraAtención! Es sensible a la luz!

Stop Solution 1 vial 7 mL Listo para usar0.5 M H2SO4

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Preparación de solución de la enzyme conjugate 1XPreparar el volumen necesario de solución de la enzyme conjugate 1X por dilución del Enzyme Conjugate 11X (1+10) en Enzyme Conjugate Buffer según la siguiente tabla. Si se usa toda la placa, verter comletamente el tampón Emzyme Conjugate Buffer al vial Enzyme Conjugate 11X. Mezclar suavemente.

Número de tirasEnzymeConjugate 11X

EnzymeConjugate Buffer

12 tiras 8 tiras 4 tiras

1 vial350 μL200 μL

1 vial3.5 mL2.0 mL

Conservación después de la dilutión: 2-8°C durante 2 meses.

OBTENCIÓN Y MANIPULACIÓN DE MUESTRASSueroRecoger la sangre por venipunción, dejar coagular y separar el suero por centrifugación. Las muestras pueden conservarse a 2–8°C hasta 24 horas. Para periodos más largos, conservar las muestras a –20°C. Evitar la congelación y descongelación de forma repetida.

PlasmaRecoger la sangre por venipunción en tubos que contienen heparina o EDTA como anticoa-gulante y separar la fracción de plasma por centrifugación. Las muestras pueden conservarse a 2–8°C hasta 24 horas. Para periodos más largos, conservar las muestras a –20°C. Evitar la congelación y descongelación de forma repetida.

Preparación de las muestrasNormalmente no es necesaria la dilución, sin embargo, las muestras por encima del valor ob-tenido del Calibrator 4 deberían diluirse con el Calibrator 0 (o Mercodia Diabetes Sample Buffer 10-1195-01).

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PROCEDIMIENTO DE EVALUACIÓNTodos los reactivos y muestras deben estar a temperatura ambiente antes de su uso. Praparar una curva calibración para cada ensayo. El producto ha sido validado y optimado sin sellador de placa.

1. Preparar solución de la enzyme conjugate 1X y solución de wash buffer 1X.2. Preparar suficientes pocillos de microplaca para los Calibrators, controles y muestras por

duplicado.3. Pipetear 25 μL de cada Calibrator, controles y muestra en los pocillos correspondientes.4. Añadir 50 μL solución de la enzyme conjugate 1X a cada pocillo.5. Incubar en un agitador de placas (700-900 rpm) durante 1 hora a temperatura ambiente

(18–25°C).6. Lavar 6 veces con 700 µL solución de wash buffer 1X por pocillo mediante Lavador de

placas automático con función de sobre-flujo de lavado. Después del lavado final, inverti la placa y golpearla firmemente contra papel absorbente. No usar el paso de remojo durante el proceso. O manualmente: Verter el líquido invirtiendo la microplaca en una pila. Añadir 350 µL de solución de wash buffer 1X, golpeando firmemente la placa contra papel absorbente para eliminar todo el líquido en exceso. Repetir 5 veces. Evitar remojo prolongado durante el proceso

7. Añadir 200 μL de Substrate TMB.8. Incubar durante 15 minutos en el banco a temperatura ambiente (18–25°C).9. Añadir 50 μL de Stop Solution de parada a cada pocillo.

Colocar la placa en un agitador durante aproximadamente 5 segundos para asegurar el mezclado.

10. Leer la densidad óptica a 450 nm y calcular los resultados. Leer en 30 minutos.

Aviso! Actuar con especial cuidado de no contaminar el sustrato TMB con la solución del conjugado enzimático.

CONTROL DE CALIDAD INTERNALos controles comerciales como Mercodia Diabetes Antigen Control (10-1134-01/10-1164-01) y/o mezclas de sueros internas con concentraciones de insulina bajas, medias y altas, se ana-lizarán de forma rutinaria como muestras y los resultados se representarán día a día. Es una buena práctica de laboratorio registrar los siguientes datos en cada ensayo: número de lote del kit, fechas de preparación de los componentes del kit, valores de DO de blanco, Calibrators y controles. Los laboratorios deben seguir las normativas gubernamentales o requisitos de Acreditación para el control de calidad periódico.

CÁLCULO DE RESULTADOSPara obtener la concentración de insulina realize la reducción de datos computarizados del a absorbancia para los Calibrators, sin Calibrator 0, frente a la concentración utilizando una regresión spline cúbica.

Ejemplo de resultados

Pocillos Identidad A450 Conc. media mU/L

1A–B1C–D1E–F1G–H2A–B2C–D2E–F2G–H

Calibrator 0Calibrator 1*Calibrator 2*Calibrator 3*Calibrator 4*Muestra 1Muestra 2Muestra 3

0.066/0.0670.084/0.0870.161/0.1650.595/0.5992.377/2.3470.270/0.2721.146/1.1922.044/2.150

16.453.692.7

*Concentración declaró en la etiqueta del vial.

Ejemplo de curva de calibraciónAquí se presenta una curva de calibración típica. Esta curva no debe utilizarse para verificar resultados de un ensayo.

8

0,01

0,1

1

10

1 10 100

O.D

. (45

0 nm

)

Insulina (mU/L)

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LÍMITES DEL PROCEDIMIENTOIgual que todas las pruebas diagnósticas, un diagnóstico clínico definitivo no debe estar basado únicamente en los resultados de una sola prueba, sino que el médico debe hacerlo sólo después de haber evaluado todos los datos clínicos. Es complicado realizar esta prueba en individuos que están sometidos a insulinoterapia, por la formación de anticuerpos anti-insulina que pueden interferir en el ensayo. Las muestras lipémicas, ictéricas o hemolizadas no interfieren en el ensayo. Sin embargo, la hemólisis en muestras de suero o plasma puede producir degradación de la insulina, lo cual produce falsos valores bajos y contribuye a una mayor variación inter-ensayo. La degradación depende del tiempo, temperatura y la concentración de hemoglobina. Conserve las muestras hemolizadas en frío o con hielo para evitar que se degrade la insulina.

VALORES ESPERADOSUna buena práctica de laboratorio dicta que cada laboratorio establezca su propio rango de valores. Los siguientes resultados pueden servir de guía hasta que el laboratorio haya reunido suficientes datos por su cuenta. Los niveles medios en ayunas de 137 individuos estudiados, aparentemente sanos, fueron de 10 mU/L, una mediana de 7 mU/L y un rango – correspondiente al 95% central de las observaciones, de 2–25 mU/L.

CARACTERÍSTICAS DEL RENDIMIENTOLímite de detecciónEl límite de detección es 2 mU/L conforme a lo determinado por la metodología descrita en la norma ISO11843-Parte 4. La Capacidad de Detección deberá considerarse parte de la validación de un método en lugar de tomar la concentración más baja que pueda medirse. La concentra-ción de muestras con una absorbencia por debajo del Calibrator 1 no debería calcularse, sino que deberá expresarse como inferior o igual a (≤) la concentración indicada en el frasco del Calibrator 1.

RecuperaciónLa recuperación tras la incorporación es del 92-97% (94% de media).La recuperación tras la dilución es del 96-114% (103% de media).

Efecto ganchoLas muestras con una concentración superior a 2000 mU/L pueden medirse sin obtener resul-tados falsamente bajos.

Precisión:Cada muestra se analizó en 4 replicados en 25 ocasiones diferentes.

Valor mediomU/L

Coeficiente de variación

Muestra Repetibilidad%* Intra laboratorio %**

123

10.337.670.0

2.2 2.9 1.7

4.3 2.3 2.2

*Dentro de la variabilidad de la prueba **La variabilidad total de la prueba

EspecificidadInsulin 100%Insulin lispro 112%Insulin aspart 100%Insulin detemir 28%Insulin glargine 58%Insulin glargine M1 47%Insulin glargine M2 32%Insulin glulisine 123%C-peptide < 0.1%Proinsulin 54%Proinsulin des (31-32) 58%Proinsulin split (32-33) 56%Proinsulin des (64-65) 66%Proinsulin split (65-66) 78%IGF-I < 0.02%IGF-II < 0.02%Rat insulin 71%Mouse insulin 49%Porcine insulin 76%Ovine insulin 131%Bovine insulin 58%

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CALIBRACIÓNMercodia Iso-Insulin ELISA se calibra contra el reactivo de 1st International Reference Prepara-tion 66/304 for human insulin.

FACTOR DE CONVERSIÓN1 μg/L = 23 mU/L; 1 mU/L = 6 pmol/L

GARANTÍALos datos de rendimiento presentados aquí se obtuvieron usando el procedimiento indicado. Cualquier cambio o modificación en el procedimiento, no recomendado por Mercodia AB, puede afectar los resultados, en cuyo caso Mercodia AB declina cualquier responsabilidad y garantía acordada, implícita o explícita, incluso la garantía implícita sobre la comerciabilidad e idoneidad para su uso. Mercodia AB y sus distribuidores autorizados, en tal caso, no asumirán responsabilidades por daños y perjuicios indirectos o consiguientes.

REFERENCIASHedman CA, Lindstrom T, Arnqvist HJ (2001) Direct comparison of insulin lispro and aspart shows small differences in plasma insulin profiles after subcutaneous injection in type 1 diabetes. Diabetes Care 24:1120-1121.

Heise T, Nosek L, Biilmann Ronn B, Endahl L, Heinemann L, Kapitza C, Draeger E (2004) Lower Within-Subject Variability of Insulin Detemir in Comparison to NPH Insulin and Insulin Glargine in People With Type 1 Diabetes. Diabetes 53:1614-1620.

Lindstrom T, Hedman CA, Arnqvist HJ (2002) Use of a novel double-antibody technique to describe the pharmacokinetics of rapid-acting insulin analogs. Diabetes Care 25:1049-1054.

En nuestra web podrá encontrar más referencias: www.mercodia.com

31-3112Version 16.02019-06-25

HOJA DE RESUMEN DEL PROTOCOLO

Mercodia Iso-Insulin ELISA

Añadir Calibrators, controles* y muestras 25 µL

Añadir de solución de enzyme conjugate 1X 50 µL

Incubar1 hora a 18–25°C en un agitador

de placas 700-900 rpm

Lavar con solución de wash buffer 1X 700 µL, 6 veces

Ajout de Substrate TMB 200 µL

Incubar 15 minutos (18-25°C)

Añadir Stop Solution50 μL

Agitar durante 5 segundos para asegu-rar el mezclado

Medir A450 Evaluar los resultados

*No suministrado Ver página 7 para detalles

Para el contacto de soporte técnico: support@mercodia.com