Manual Laboratorio Genetica

UNIVERSIDAD AUTÓNOMAUNIVERSIDAD AUTÓNOMAUNIVERSIDAD AUTÓNOMAUNIVERSIDAD AUTÓNOMA BENITO JUAREZ DE OAXACABENITO JUAREZ DE OAXACABENITO JUAREZ DE OAXACABENITO JUAREZ DE OAXACA

ESCUELA DE VETERINARIA Y ZOOTECNIAESCUELA DE VETERINARIA Y ZOOTECNIAESCUELA DE VETERINARIA Y ZOOTECNIAESCUELA DE VETERINARIA Y ZOOTECNIA

ASIGNATURA: ASIGNATURA: ASIGNATURA: ASIGNATURA: LABORATORIO DE GENETICA APLICADA Y BIOLOGIA MOLECULAR

RESPONSABLE(S): RESPONSABLE(S): RESPONSABLE(S): RESPONSABLE(S): DR. ALEJANDRO CISNEROS SOLANO

REGLAMENTO

En el laboratorio se maneja materiales potencialmente peligrosos como biológicos

provenientes de muestras de animales y reactivos químicos de diferente naturaleza. La

mayor defensa de nuestra vida depende de nosotros, solo los buenos hábitos, el respeto

por las normas de seguridad y el conocimiento de donde reside el peligro servirán para

apreciar, valorar y disfrutar del enriquecedor trabajo del laboratorio. Para efectuar un

trabajo sin riesgo, así como para lograr una mayor eficiencia posible, es necesario tomar

en cuenta ciertas medidas de seguridad, se recomiendan las siguientes:

1.-Es obligación usar bata blanca debidamente abotonada al estar dentro del laboratorio,

principalmente como medida de seguridad. No se les permitirá el acceso a los alumnos

que no la porten.

2.-Conservar la disciplina y atención durante los trabajos de laboratorio, para evitar

errores así como tomar toda clase de precauciones para impedir accidentes y daños a las

personas o al equipo de laboratorio.

3.- Antes de comenzar los experimentos no debe haber ningún mechero encendido ni

llave de agua abierta.

4.-No deberán efectuarse experimentos que no estén debidamente autorizados por el

profesor titular o auxiliar.

5.-No abandonar el lugar de trabajo, solo se podrá hacerlo una vez terminada la práctica y

con previo aviso.

6.- Atención especial merecerán los experimentos en que se utilicen sustancias

inflamables, toxicas o corrosivas.

7.-Los productos inflamables (alcohol, éter, benceno, entre otros) deben estar lejos de

fuentes de calor. Si hay que calentar estos productos, se hará con baño maría.

8.-Todos los accidentes que resulten en heridas o lesiones, por leves que estas sean,

deben informarse inmediatamente a los profesores responsables de la práctica.

9.-Esta prohibido; fumar, comer o beber, maquillarse así como masticar golosinas (muchas

sustancias son inflamables, volátiles y/o venenosas). Cualquier sustancia colocada sobre la





mesa y posteriormente llevada a la boca, puede ser causante de la transmisión de alguna

enfermedad o intoxicaciones que pueden llevar, incluso a la muerte.

10.-Nunca se debe llevar los productos químicos a la boca para probarlos, ni aun en

pequeñas cantidades. Para oler algo, no hacerlo directamente con la nariz; utilizar la mano

semicerrada para arrastrar los vapores hacia ella.

11.-Los desperdicios tales como: Materiales insolubles, trozos de vidrio y fósforos deben

desecharse en los cestos de basura. En los lavabos y drenajes no deben dejarse desechos

sólidos.

12.-Las sustancias químicas y muestras deben conservarse en frascos bien cerrados,

destinados propiamente para ello.

13.-No dejar caer muestras de ninguna índole al suelo, ni en las manos o la ropa, ni

tampoco en el exterior o interior de los aparatos.

14.-Todas las muestras deben aspirarse Preferentemente con una pipeta provista de una

perrilla de goma o propipeta, pues muchas sustancias pueden introducirse por error en la

boca e infectar o intoxicar al que trabaja en el laboratorio.

15.-Todo recipiente que haya contenido muestras debe desecharse, en caso de querer

reutilizarlo, antes de lavarlo debe ser esterilizado en olla de presión o autoclave. Las

muestras llevan consigo muchos microorganismos peligrosos.

16.- Al desechar productos químicos por el desagüe, dejar que circule abundante agua,

aun cuando ya estén neutralizados.

17.-Tocar únicamente las partes del material que sea necesario evitando aquellas que

puedan contaminarse, conduciendo a resultados erróneos; sobre todo cuando de material

estéril se trate.

18.-Memorizar la localización y el uso de todos los dispositivos de seguridad. Botiquín,

regadera, extinguidor de incendios, teléfonos de emergencia.

19.-Al término de la práctica y antes de salir del laboratorio, lavarse las manos con

suficiente agua y jabón microbicida.





INDICE

1.- DETERMINACIÓN DE GRUPOS SANGUÍNEOS Y TITULACIÓN DE ANTISUEROS

2.- TITULACIÓN DE ANTISUEROS (CONTINUACIÓN DE LA PRACTICA 1).

3.- REGULACIÓN GENÉTICA.

4.- MITOSIS Y MEIOSIS.





5.- INMUNODIFUSIÓN RADIAL.

6.- MANEJO DE METODOLOGÍAS BIOTECNOLOGICAS EXTRACCION DE ADN PLASMIDICO.

- CRECIMIENTO ASINTÓTICO DE POBLACIONES BACTERIANAS.

- EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL ADN PLASMÍDICO.

- USO DE ENDONUCLEASAS PARA CARACTERIZAR ADN PLASMIDICO.

- OBSERVACIÓN DE LA DIGESTION EN GELES DE AGAROSA.

PRACTICA 1

“DETERMINACIÓN DE GRUPOS SANGUÍNEOS Y TITULACIÓN DE ANTISUEROS” 1.- INTRODUCCIÓN La determinación del grupo sanguíneo es una práctica habitual e imprescindible para la transfusión de componente hemáticos. La razón está en que el sistema inmune de algunos individuos rechaza los hematíes de otros. Esta reacción inmunológica está mediada por anticuerpos y es fácilmente visualizable “in vitro” mediante reacciones de aglutinación. Se conocen más de 20 grupos de antígenos eritrocitarios codificados en otros tantos loci génicos, para los cuales existen múltiples variantes alélicas. El resultado son más de 200 antígenos eritrocitarios identificables. Estos antígenos varían en su inmunogenicidad. Los más importantes a efectos transfusionales son los antígenos del sistema H / ABO y los del sistema Rhesus (Rh). Sistemas H y ABO Los epítopos responsables son carbohidratos que aparecen en glicoesfingolípidos y glicoproteínas de membrana. El gen H codifica la enzima fucosil-transferasa, que adiciona fucosa a una cadena oligosacarídica precursora. Los tres últimos azúcares de la cadena se denominan antígeno H (Fig. 1). En otro locus está el sistema ABO, con tres alelos. El alelo A codifica una transferasa que une N-acetil galactosamina a la cadena H, mientras que el





alelo B codifica una transferasa que une una galactosa. El alelo O no produce transferasa y por tanto no modifica la sustancia H. El azúcar unido al carbono 3 de la galactosa determina la actividad antigénica. La galactosa no acepta azúcar en el carbono 3 a no ser que haya fucosa unida al carbono 2.

Fig. 1.- Antígenos que distinguen los grupos sanguíneos (sistema ABO) Es importante destacar que estos genes son codominantes. Los individuos que expresan los alelos A y B tendrán oligosacáridos con los dos tipos de modificaciones. Así, se distinguen 4 grupos: A, B, AB y O. La importancia transfusional de estos antígenos radica en que los individuos de un grupo sintetizan anticuerpos frente a los oligosacáridos que no están en sus hematíes (Tabla 1). Estos anticuerpos, que se denominan isoaglutininas y que suelen ser IgM, aparecen en grandes cantidades en circulación sin necesidad de exposición previa a sangre de otros grupos. La razón parece estar en la reactividad cruzada de sustancias presentes en bacterias de la flora intestinal.

Grupo sanguíneo Genotipo Ag eritrocitarios Ab séricos

A IAIA, IAi A Anti-B

B IBIB, IBi B Anti-A

AB IAIB A y B -

O Ii H Anti-A, Anti-B

Tabla 1.- Grupos sanguíneos, genotipo, antígenos y ab séricos

Sistema Rhesus Se han identificado más de 40 antígenos del sistema Rh aunque no se sabe cuántos genes son responsables de este sistema. Son proteínas integrales de membrana con un contenido lipídico alto. D es el antígeno Rh más inmunogénico y por tanto el más





importante a efectos transfusionales. La presencia de D da lugar al Rh+, mientras que la ausencia (d) da lugar al Rh-. Los anticuerpos anti D, que son IgG, aparecen en la circulación de los individuos Rh- sólo tras una exposición previa a sangre D, por ejemplo por una transfusión de hematíes o tras la gestación de un feto D. Determinación de antígenos eritrocitarios y anticuerpos séricos. Antes de una transfusión se analizan los eritrocitos del receptor para ABO y D mediante antisueros anti-A, anti-B y anti-D. Simultáneamente se analiza el suero para detectar anticuerpos contra antígeno eritrocitarios (isoaglutininas), mediante hematíes A y B previamente tipados. Las reacciones positivas dan lugar a la aglutinación de los hematíes. Para asignar un grupo sanguíneo, ambas pruebas deben dar un resultado coincidente. Los resultados discrepantes deben analizarse cuidadosamente. Un test adicional es la prueba cruzada, que examina la compatibilidad entre suero del receptor con los hematíes del/los donantes. Para ello, hematíes lavados del donante se mezclan con suero del receptor, se incuban, se centrifuga y se examina para hemólisis y aglutinación 2.- OBJETIVOS. Al finalizar la práctica el alumno será capaz de: - Interpretar reacciones de aglutinación. - Determinar los grupos ABO y Rh (D) en hematíes. - Determinar ABO en suero. - Obtener antisueros para tipaje. - Titular un antisuero. 3.- EQUIPAMIENTO. - Centrífuga con rotor para tubos de 12x75 ó 10x70 (alternativamente, con rotor para

placas microtiter) - Centrífuga para tubos Eppendorf (tipo Minifuge) - Microscopio - Transiluminador - Portaobjetos o placa microtiter de fondo en U - Tubos Eppendorf





- Tubos de 10x70 mm

- Pipetas de 5-40, 40-200 y 200-1000µl y puntas - Lancetas de un solo uso. 4.- REACTIVOS Y MUESTRAS - Antisueros anti-A, anti-B y anti-D - Suero salino fisiológico (NaCl 0.85%) - Muestras de sangre anticoagulada con EDTA (tubos de 2 ml descartes rutinarios de los

hemogramas). Se emplearán 5 o más tubos por pareja de alumnos.

- Algodón y alcohol etílico de 70° 5.- PROCEDIMIENTO PRECAUCIÓN: Todas las muestras deben considerarse potencialmente infecciosas 5.1 Determinación de ABO y Rh (D) en hematíes. 1) Preparar un portaobjetos y un tubo Eppendorf rotulado con las iniciales del alumno. En

este último se pipetea 1 ml de suero salino fisiológico. 2) Se limpia un dedo con un algodón humedecido en alcohol y se pincha con la lanceta. 3) Sobre un portaobjetos se depositan 3 gotas de aproximadamente 0.5 cm de diámetro (50

µl) separadas. 4) Tomar 10 µl de sangre y pipetearlos en el tubo Eppendorf. Guardar a temperatura

ambiente, se procesará al final. 5) En cada gota de sangre se pipetean 25 µl de antisuero. El orden recomendable es anti-A,

anti-B, anti-D. 6) Mezclar con una punta de pipeta durante unos segundos. 7) Determinar la aglutinación e interpretar el resultado. Puede visualizarse en el

transiluminador o utilizar un microscopio en caso de reacción muy débil. 8) Determinar la frecuencia de cada grupo en la clase y compararla con las frecuencias

establecidas.

Grupo % en la clase





A

B

AB

O

Rh negativo

5.2 Lavado y preparación de hematíes al 2% 1) Rotular el tubo eppendorf de los 10 µl de sangre con el grupo hemático obtenido (A, B,

AB, O). 2) Centrifugar el tubo 1 minuto en la Minifuge a velocidad alta. 3) Descartar el sobrenadante con bomba de vacío. 4) Resuspender el pellet y añadir 1ml de suero fisiológico. 5) Repetir los pasos 2 y 3. 6) Resuspender en 490 µl de suero fisiológico. A esto se denomina hematíes al 2% (v/v).

Estos hematíes serán compartidos por todos los alumnos del grupo. 5.3 Determinación de ABO en suero o plasma (opcional) 1) Centrifugar la sangre 5 minutos a 400xg. 2) Extraer el suero (o plasma) y depositarlo en un tubo eppendorf. 3) Lavar y diluir hematíes A y B al 2% (v/v) en suero fisiológico (Protocolo 5.2). 4) Pipetear 50 µl de suero en dos tubos de poliestireno de 10x70 o en dos pocillos. Pueden

también prepararse controles negativos (suero fisiológico) y positivos (suero anti-A, B). 5) Pipetear 25 µl de hematíes A en un tubo (o pocillo) y hematíes B en el otro y mezclar. 6) Centrifugar a 400xg 15 segundos. 7) Dispersar el pellet y determinar aglutinación. 5.3 Obtención y titulación de antisueros anti-A, anti-B y anti-A,B a partir de muestras de

plasma. 1) Tomar 5 tubos de sangre anticoagulada con EDTA elegidos al azar.





2) Centrifugar la sangre 5 minutos a 400xg. 3) Extraer cuidadosamente el plasma y depositar en un tubo eppendorf rotulado con el

número de la muestra. El pellet celular se reserva por si fuera necesario posteriormente. 4) En una gradilla colocar 15 tubos de poliestireno de 10x70 (5 filas x 3 columnas) (o utilizar

una microplaca (microtiter de fondo en U) 5) Pipetear 50 µl de cada plasma en los 3 tubos (pocillos) de cada fila (Tabla de resultados). 6) En los 5 tubos de la primera columna pipetear 25 µl de hematíes A. En las columnas 2ª y

3ª pipetear 25 µl de hematíes B y O respectivamente. Puede procesarse una 4ª columna de tubos si se hubieran encontrado hematíes AB (será un control positivo).

7) Incubar 5 minutos. 8) Centrifugar a 400xg 15 segundos. 9) Dispersar el pellet y determinar aglutinación. (Si se ha trabajado en placa, dispersar el

pellet con una pipeta y observar al microscopio invertido, centrándose en el fondo del pocillo). Calificar cada tubo o pocillo con -, + y ++ según la aglutinación observada y anotar en la tabla de resultados.

10) Preparar pools de antisueros anti-A, anti-B y anti-A, B mezclando todos los obtenidos en el grupo de prácticas.

11) Titular los pools de antisueros obtenidos (uno cada pareja de prácticas). Para ello, llevar a cabo una dilución seriada 1/2 y analizar la aglutinación de una cantidad constante de hematíes A o B, tal y como se describe a continuación.

12) Tomar 8 tubos y rotular 1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 y 1/128. 13) Pipetear 50 µl de suero salino fisiológico en todos los tubos excepto en el rotulado 1. 14) Pipetear 50 µl de antisuero en el primer y segundo tubo y mezclar. Del segundo tubo

tomar 50 µl y pasarlos al siguiente, y así sucesivamente. Descartar 50 µl del último tubo. 15) Pipetear 25 µl de hematíes que correspondan y mezclar. 16) Incubar 5 minutos. 17) Centrifugar a 400x g x 15 segundos. 18) Dispersar el pellet y determinar aglutinación. Anotar en la tabla. 19) El título del antisuero será la inversa de la máxima dilución aglutinante. Tabla de resultados

HEMATÍES PLASMA

A B 0





Plasma 1

Plasma 2

Plasma 3

Plasma 4

Plasma 5

Titulación

Dilución: 1 ½ ¼ 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128

Aglutinación (++, +, +/- ,- )

Epítopes ABO se encuentran en muchas otras células aparte de los eritrocitos. Se han descrito 11 subgrupos de A. Los más importantes son A1 y A2. Las diferencias son cuantitativas. Los hematíes A1 tienen en membrana aprox. un millón de copias, mientras que los A2 tienen 250 000. Aproximadamente un 78% de los individuos A son A1 y 22% son A2. La sangre AB también puede dividirse en tipos A1B y A2B. Los A o B débiles darán aglutinación con anti-AB pero no con los otros antisueros. Aproximadamente el 1% de las muestras de sangre elegidas al azar contienen aglutininas que pueden dar anormalidades en la determinación de anticuerpos séricos. Pueden ser anti-A1, anti-H, α-anticuerpos, o sueros de mieloma que producen roleaux o bien anticuerpos adquiridos por transfusiones o de origen materno en niños. En otros casos los anticuerpos pueden no detectarse, por ejemplo en inmunodeficiencias o en ancianos o en recién nacidos. En algunos individuos el gen H está ausente. Este fenotipo h homozigótico se denomina Bombay. Los individuos de fenotipo





Bombay tienen títulos altos de anti-A, anti-B y anti-H en su circulación. Antígeno A: Existen variantes débiles de D denominadas Du que pueden no detectarse en análisis rutinarios, si se identifican con antiglobulina. No hay peligro ya que los individuos Rh- no se sensibilizan con eritrocitos Du positivos. La mayoría de los antígenos sanguíneos restantes raras veces participan en reacciones transfusionales. Los anticuerpos contra los sistemas Kidd, Duffy, Kell y MNS pueden originar hemólisis si un individuo sensibilizado recibe sangre positiva para estos antígenos.

En general, los anticuerpos hemolíticos son IgG y reaccionan a 37 °C. Casi nunca producen hemólisis los anticuerpos IgM o de reacción en frío. Los antígenos Rh están tan separados en la membrana de los RBC que los Ac-IgG anti-Rh no fijan complemento ni aglutinan los eritrocitos Rh (+). Lisan los RBC por opsonización. Para detectarlos se emplea anti-IgG humana (test de Cooms indirecto) si aglutinan los IgM. Estas pruebas de aglutinación se llevan a cabo en solución salina. Se sabe que esto disminuye la sensibilidad a la hora de detectar anticuerpos IgG debido a las fuerzas iónicas de repulsión entre los eritrocitos. Para incrementar la sensibilidad puede añadirse albúmina o solución de baja fuerza iónica o polibreno o tratar a los hematíes con enzimas. La mejor práctica transfusional es dar sangre isogrupo siempre (células, plasma y plaquetas). Cuando esto no se puede, los receptores A o B pueden recibir hematíes O y los AB de cualquier grupo. Los receptores O sólo reciben hematíes O. El plasma con anti-A o anti-B raramente causa problemas salvo en niños muy pequeños. El plasma O es más probable que cause problemas y debe ser la última elección en pacientes de grupo distinto del O. Para concentrado de plaquetas (que tienen ABH y aprox. 50 ml de plasma) se siguen las mismas indicaciones que para hematíes. FRECUENCIAS

Grupo sanguíneo Frecuencia (%) en caucásicos USA

Frecuencia (%) en asiáticos USA

Frecuencia (%) en negros USA

A 40 28 27

B 11 27 20

AB 4 5 4





O 45 40 49

Rh negativo 15% Menor del 15% Menor del 15%

ISOINMUNIZACIÓN Rh La prevalencia de la formación de Ab α-Rh depende de la dosis de células recibidas. 1ml de células sensibiliza al 15% de individuos expuestos, mientras que 250 ml sensibilizan al 60-70%. Después de la exposición, tan pronto como a las 4 semanas, se detectan Ab IgM débiles, seguido de una conversión rápida a IgG. Una segunda exposición a tan solo 0.03 ml de eritrocitos puede desencadenar una formación rápida de IgG. La enfermedad hemolítica del RN ocurre por paso de sangre del feto Rh+ a la madre Rh- (durante el embarazo o durante el parto). Los Ab IgG pueden atravesar la placenta produciendo la hemólisis de los eritrocitos fetales. Inmunización Rh se presenta en el 8-9% (16% según Rosen) de las mujeres Rh- tras el parto del primer hijo Rh+ ABO-compatible y en el 1.5-2% (7% según Rosen) cuando el hijo Rh+ es ABO-incompatible. La inmunización Rh puede evitarse casi totalmente si se administra una dosis alta de anti Rh (Rh Ig) a las 28 semanas de gestación (300 µg, que no elevan el título de anti Rh materno por encima de 1/4 y no daña al feto) y a las 72 horas del parto (o de la dosis potencialmente sensibilizante de células Rh+). Una dosis de 300 µg de Rh Ig intramuscular previene la inmunización por exposición a hasta 30 ml de células Rh+. Puede utilizarse como profilaxis en casos de aborto o amniocentesis. La administración de Rh Ig a mujeres embarazadas no tiene efecto perjudicial para el feto. Una vez que el individuo está inmunizado, la administración de Rh Ig es ineficaz. PREGUNTAS ¿Qué proporción de tipos sanguíneos encontró entre los integrantes del grupo? ¿Cómo explicaría el resultado? ¿Cuáles son títulos promedios para las aglutininas α y β, entre los integrantes del grupo?





PRÁCTICA 2 “PROCESOS GENÉTICOS. EXPRESIÓN GÉNICA EN PROCARIOTAS (OPERÓN)

I.- Introducción

El objetivo de esta práctica es el de observar procesos clave del funcionamiento de

los seres vivos, como son, en primer lugar, respuestas de regulación de la expresión génica frente a estímulos ambientales, concretamente la acción de un inductor sobre una serie de genes bacterianos organizados en un operón. En segundo lugar, se estudiarán los procesos destinados al crecimiento y reproducción asexual (mitosis) o sexual (meiosis), que, en organismos eucariotas conllevan una condensación de los cromosomas y posterior reparto de los mismos, tras un intercambio de material genético en el caso de la meiosis. La evolución de la estructura de los cromosomas se puede seguir mediante tinciones específicas y el uso del microscopio óptico. II.- Inducción de genes nod de Sinorhizobium meliloti por flavonoides exudados por la raíz de alfalfa (Medicago sativa)

Las rizobiáceas (rizobios) son un grupo muy heterogéneo de bacterias que comparten la característica de establecer simbiosis fijadoras de nitrógeno atmosférico con leguminosas. Para establecer esta relación, las bacterias han de encontrarse en las inmediaciones de la raíz de la planta (rizosfera) e interactuar con la misma, originando una serie de reacciones en la planta que desencadenarán la formación de un órgano mixto nuevo, el nódulo simbiótico, en el cual se proporciona un entorno controlado, así como los nutrientes necesarios para que la bacteria pueda efectuar el proceso de fijación de N2.





La capacidad nodulativa de los rizobios deriva de la actividad de los genes nod, organizados en un único operón, incluido en el plásmido simbiótico o pSym. Algunos compuestos exudados por la raíz de las leguminosas, fundamentalmente flavonoides, interaccionan con un receptor en la membrana del rizobio (proteína NodD). La proteína NodD activada por flavonoides actúa como inductor del promotor de los genes nod. La interacción rizobio-leguminosa es en general muy específica entre un género bacteriano y una especie vegetal determinados, entre otras razones, porque flavonoides específicos de una leguminosa y no de otra, inducen de forma específica a su bacteria y no a otras. Así, la luteolina es un flavonoide exudado por la raíz de alfalfa, que induce a los genes nod de Sinorhizobium meliloti, que nodula alfalfa y no otras leguminosas que no secretan estos flavonoides.

Práctica Se observará la inducción por luteolina del promotor de los genes nod de S. meliloti aprovechando una cepa a la que se le ha introducido el gen lacZ, que codifica para la actividad b-galactosidasa, bajo el control de dicho promotor. La β-galactosidasa hidroliza el enlace O-glucosídico de la lactosa, entre b-galactosa y glucosa. En la práctica, como sustrato se utilizará X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil- b-galactosa), que también contiene un enlace O-glucosídico con la b-galactosa. Al separarse de la galactosa, el 5-bromo-4-cloro-3-indol dimeriza espontáneamente

generando un compuesto de color azul (5,5’-dibromo-4,4’-dicloro-índigo). III.- Método

- Tomar dos tubos Eppendorf y añadir a cada uno de ellos 1mL del cultivo de

Sinorhizobium meliloti





- Añadir a uno de los tubos 10 mL de luteolina (que se encuentra disuelta en metanol) y al otro 10 mL de metanol.

- Añadir a ambos tubos 5 mL de X-gal. - Incubar a 28ºC durante media hora.

IV.- Preguntas

1. ¿Qué se observa tras la incubación? 2. ¿Por qué también toma color azul la muestra sin luteolina? 3. ¿Qué tipo de operón es el de los genes nod? Dibuja un esquema





MITOSIS Y MEIOSIS 1. Mitosis en células del meristemo apical de raíz de cebolla: Mediante el proceso de mitosis, el núcleo de las células eucaróticas se divide, repartiendo de forma equitativa el material genético, previamente duplicado; asímismo, el citoplasma también se dividirá, repartiendo los orgánulos celulares en dos células hijas. Habitualmente, la mitosis se estudia en 5 fases, que tienen su reflejo en la observación al microscopio de células mitóticas. En células que no se encuentran en la fase de mitosis del ciclo celular, células en interfase, se puede observar un núcleo muy definido por su membrana nuclear. Cuando estas células entran en mitosis, las distintas fases se diferencian como: - Profase: el material cromosómico se condensa y comienzan a hacerse visibles los

cromosomas. La membrana nuclear y los nucleolos se desorganizan, por lo que el material nuclear ocupa gran parte de la célula.

- Prometafase: los cromosomas están completamente condensados y buscan su ubicación en el plano ecuatorial de la célula.

- Metafase: los cromosomas están situados en el plano ecuatorial de la célula, formando la placa madre.

- Anafase: las cromátidas hermanas se separan, migrando un juego hacia cada polo de la célula.

- Telofase: cada juego de cromosomas, situado en cada polo de la célula se descondesa. Se organiza la membrana nuclear y los nucleolos.





Durante el proceso de final de telofase, se puede observar la citocinesis, por estrangulamiento en células animales o por formación de un tabique en células vegetales.

Práctica

Se observará el proceso de mitosis en células del meristemo apical de la raíz de

cebolla. Este tejido está formado por células indiferenciadas que se dividen activamente. Para la observación del proceso, se realizará una tinción previa del material genético, con orceína acética.

Método

1.- Pretratamiento con HCl (8%) - Cortar 2 cm de los extremos apicales de la raíz - Sumergir por 10 min., en HCl al 8% - Secar los ápices en papel secante

2.- Fijación y tinción de la muestra -cortar el extremo apical de la raíz y colocarlo sobre un vidrio de reloj. - añadir gotas de orceína hasta cubrir la raíz. - calentar el vidrio de reloj hasta observar vapor blanco. Cuidar que nunca se seque la raíz. - dejar enfriar durante 5 min y repetir la operación. - dejar enfriar 10 min. 3.- Preparación de la muestra. - colocar el meristemo teñido sobre un portaobjetos. - cortar en 5-6 trozos con un bisturí. - añadir una gota de orceína fresca y colocar un cubreobjetos.





- colocar una almohadilla de papel de filtro sobre el cubre y realizar el aplastamiento para extender las células, presionando fuertemente con el dedo pulgar. - retirar la almohadilla de papel y observar la preparación.

Preguntas

1. ¿Qué porcentaje de células se encuentra en mitosis? 2. ¿Por qué realiza el pretratamiento con HCl al 8%? 3. ¿Se observa el huso acromático? ¿Por qué? 4. ¿Qué tipo de colorante es la orceína?

2. Meiosis en testículos del saltamontes Corthippus jucundus

El establecimiento de la reproducción sexual llevó implícito el desarrollo de un tipo

de división celular que redujera el número cromosómico de las especies para evitar su poliploidización: la meiosis. Mientras la mitosis ocurre potencialmente en cualquier momento de la vida y en todos los tipos de células, tejidos y órganos de un organismo, la mayoría de los organismos vivos con reproducción sexual utilizan parte de su vida o tejidos especializados, que clásicamente se encuentran en las gónadas, para, mediante la meiosis producir células esencialmente diferentes de las progenitoras en cuanto a las combinaciones posibles de su material hereditario, su número cromosómico y su cantidad de ADN. Este proceso especial de división celular se basa en la sucesión de dos divisiones nucleares precedidas de un único periodo S de duplicación del ADN. Durante la profase de la primera división se establece un proceso de intercambio genético entre cromosomas homólogos y en la segunda división se sigue un proceso mitótico, en el que se reparten las cromátidas hermanas. Profase I: Tras la fase de replicación del ADN, la cromatina se condensa para visualizar los cromosomas. Durante la Profase I tiene lugar el evento clave de la meiosis, como es el





apareamiento de los cromosomas homólogos. Durante ella, pueden reconocerse varios estadios:

• Leptoteno (del griego ‘cintas delgadas’): el núcleo aumenta de tamaño y se comienzan a visualizar los cromosomas

• Zigoteno (del griego ‘cintas unidas’): se produce la unión o sinapsis de los cromosomas homólogos, mediante la formación de un complejo proteico, que actúa a modo de cremallera, o complejo sinaptonémico. El cromosoma resultante se denomina tétrada, por estar formado por 4 cromátidas (dos de cada homólogo) o bivalente (dos cromosomas homólogos).

• Paquiteno (del griego ‘cintas gruesas’): se produce el entrecruzamiento o ‘crossing-over’ de las cromátidas no hermanas en las tétradas. Durante este proceso pueden intercambiarse fragmentos de cromátida La presencia del fenómeno de entrecruzamiento se visualiza en una estructura especial llamada quiasma.

• Diploteno (del griego ‘cintas dobles’): los cromosomas homólogos se separan y permanecen unidos por los quiasmas, que entonces se pueden visualizar.

• Diacinesis: los quiasmas se desplazan hacia los telómeros, a modo de cremallera y se separan totalmente los cromosomas homólogos, cuya condesación ha aumentado. Se forma el huso acromático y se disuelve la membrana nuclear.

Metafase I: las tétradas se alinean en el ecuador de la célula. Las fibras del huso se enlazan al centrómero de cada par homólogo y los eventos subsiguientes son similares a la mitosis. Anafase I: las tétradas se separan y los cromosomas son arrastrados a los polos opuestos por las fibras del huso. Los centrómeros en la Anafase I permanecen intactos. Telofase I: es similar a la de la mitosis, salvo que al final cada célula sólo posee un grupo de cromosomas replicados. Dependiendo de la especie, se puede formar (o no) la nueva membrana nuclear. Algunos animales pueden dividir sus centríolos durante esta fase.





Profase II: la membrana nuclear (si se formó durante la Telofase I) se disuelve, y aparecen las fibras del huso, al igual que en la profase de la mitosis. Metafase II: es similar a la de la mitosis, con los cromosomas en el plano ecuatorial y las fibras del huso uniéndose a las caras opuestas de los centrómeros, en la región del cinetocoro. Anafase II: el centrómero se divide y las cromátidas, ahora cromosomas, son segregadas a los polos opuestos de la célula. Telofase II: es idéntica a la Telofase de la mitosis. La citocinesis separa a las células.

La consecuencia de la meiosis es la formación a partir de una única célula diploide (“2n” cromosomas), de cuatro distintas con un número cromosómico “n” (haploide). Práctica

Se observarán las diferentes fases de la meiosis tras teñir con orceína lacto-propiónica preparaciones obtenidas por aplastamiento a partir de testículos de ortópteros, clásicamente empleados para estudios citogenéticos debido a que estas especies son de fácil adquisición y mantenimiento en el laboratorio. Adicionalmente, poseen un número reducido de cromosomas de gran tamaño y se pueden distinguir con facilidad las diferentes etapas de la meiosis. En el túbulo seminífero de ortópteros las células que cursan la espermatogénesis se encuentran en grupos denominados CISTOS. Todas las células que componen un mismo cisto son sincrónicas, es decir, están en el mismo estadio de la meiosis por lo que resulta relativamente fácil visualizar las distintas etapas meióticas en una misma preparación. Método

1. Tinción de la muestra





- Separar un túbulo seminífero de un testículo de ortóptero fijado en etanol: ácido acético 3:1 y colocarlo sobre un portaobjetos.

- Colocar inmediatamente sobre él una gota de orceína y dejar unos 5 minutos. ¡Cuidado, no dejar secar el material!

2. Preparación de la muestra

- Colocar sobre el túbulo un cubreobjetos y utilizando la punta de un lápiz y con presión muy suave dispersar el material.

- Con un trozo de papel de filtro, eliminar la orceína que ha rebosado por los laterales del cubreobjetos y, con cuidado de no moverlo, realizar el aplastado presionando fuertemente con el dedo pulgar sobre una superficie plana.

- Observar la preparación

Preguntas

1. ¿Por qué no es necesario en este caso calentar la muestra durante la tinción con orceína?

2. ¿Cuántos cromosomas tiene el saltamontes Corthippus jucundus macho? 3. Además de las fases de la meiosis, ¿qué otros procesos se observan? 4. ¿Se aparean todos los cromosomas durante la profase I?

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA “BENITO JUÁREZ” DE OAXACA





ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

LABORATORIO DE GENETICA APLICADA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

“INMUNODIFUSION RADIAL”

I.- INTRODUCCION

Las técnicas de inmunoprecipitación pueden emplearse para la detección de

anticuerpos o antígenos. La inmunodifusión doble de Oüchterlony es la técnica

semicuantitativa más usada para determinar la especificidad de los mismos. A pesar de no

ser una técnica sofisticada y sensible, es la mas popular y se utiliza en ensayos de

producción de anticuerpos contra antígenos solubles en animales como ratón, rata o

conejo.

Las muestras de anticuerpo y antígeno se colocan en dos pocillos separados en una

matriz de agar; siendo la matriz de soporte inerte en donde se difunden ambas muestras.

Cuando el anticuerpo se encuentra con el antígeno estos forman complejos antígeno-

anticuerpo, los cuales son visibles con una línea blanca de precipitación entre los pocillos.

El agar debe tener un pH de 8.0, este favorece la precipitación específica de los complejos

antígeno-anticuerpo, ya que las inmunoglobulinas presentan menos interacciones iónicas

no específicas con el antígeno y menos fuerza de repulsión entre ellas mismas. Si dos

antígenos similares en diferentes pocillos difunden hacia un anticuerpo, el patrón de

precipitación puede llegar a formar espolones, lo cual signifia que el anticuerpo a pesar de

ser específico para un antígeno es capaz de reacciones con otro con las mismas

características estructurales.

II.- MATERIAL

- Portaobjetos

- Agarosa





- Suero hiperinmune

- Gotero

- Antigenos

- Cámara húmeda

- Palillos

- Alcohol al 70%

- Torundas de algodón

III.- PROCEDIMIENTO

1.- En un portaobjetos limpio y desengrasado, caja de Petri o en una placa, se vierte

agarosa al 1.0%.

2.- Una vez solidificado se perforan pequeños pozos en el agra separados algunos

milímetros.

3.- Las muestras que contengan antígeno o anticuerpo se colocan en pozos opuestos.

4.- Color el material que contiene la agarosa en una cámara húmeda durante 24 h.

5.- Observar presencia o ausencia de líneas de precipitación por el complejo Ag-Ab

visiblemente a la luz directa

IV.- PREGUNTAS

1.- Hubo semejanzas entre los 2 antígenos, ¿cómo se infiere esto?

2.- Esquematice los resultados y la forma de interacción al formarse el complejo Ag-Ab.

3.- Existen cambios en los radios de inmunoprecipitación. ¿Por qué?





OBTENCIÓN DE DNA PLASMÍDICO BACTERIANO

OBJETIVO.- Aislar DNA plásmídico de E. coli y realizar los análisis moleculares

correspondientes, e identificarlo como una poderosa herramienta Biotecnologíca.

I.- INTRODUCCIÓN

Los plásmidos son moléculas de DNA circular, doble hebra, extracromosómico, que se replican de forma independiente al genoma y que pueden ser separados fácilmente del DNA cromosómico debido a su pequeño tamaño. La función de muchos de ellos es desconocida, pero algunos de ellos confieren ventajas selectivas al organismo, como la resistencia a agentes antimicrobianos (antibióticos). La presión selectiva que se induce al aplicar un antibiótico no específico para el tratamiento de una infección en particular puede generar un resultado adverso: al aplicar un antibiótico para el cual las bacterias poseen un plásmido que les confiere resistencia al mismo, se está seleccionando precisamente una población bacteriana que sobrevive al tratamiento y que eventualmente puede causar un brote infeccioso difícil de controlar. Los plásmidos son fácilmente transmitidos entre poblaciones de bacterias, de modo que las bacterias resistentes pueden transmitir esta información genética a su progenie o bacterias vecinas.

Debido a algunas características de los plásmidos como su peso molecular (en

comparación con el cromosoma bacteriano), su replicación independiente del cormosoma

y su alto número de copias por célula, los plásmidos han sido modificados en el

laboratorio para su uso como herramientas de la Biología Molecular. Estos plásmidos

modificados son llamados vectores. Los vectores se utilizan como portadores de

información genética exógena que puede ser fácilmente aislada y amplificada en las

bacterias en un procedimiento denominado clonación de genes. El hecho de que la

secuencia de nucleótidos es conocida (en la mayoría de los vectores plasmídicos) lo que

permite su corte específico con enzimas de restricción para la posterior inserción de un

DNA de interés. La bacteria de uso más común para el uso de los plásmidos en el

laboratorio con fines de clonaje es la Escherichia coli. Esta bacteria es un huésped común





del tracto digestivo de mamíferos ya que forma parte de la flora intestinal, por lo que el

riesgo de infección por manipulación de E. coli es muy bajo.

Las técnicas de aislamiento y purificación de plásmidos han tenido gran desarrollo

lo que permite obtener preparaciones de cantidad y calidad adecuadas que son la base de

la mayoría de los protocolos en Biología Molecular. Uno de los métodos más utilizados es

la desnaturalización alcalina en presencia del detergente duodecil sulfato de sodio (SDS),

el cual se basa en las diferencias con respecto a la forma y tiempo de desnaturalización y

renaturalización del DNA de plásmido versus DNA cromosomal.

Los plásmidos al tener un tamaño menor, pueden ser separados fácilmente de las

moléculas de DNA cromosomal que son grandes y precipitan más rápidamente. El primer

paso consiste en crear un ambiente osmótico hostil para la bacteria y lograr así su lisis y

consecuente liberación del material genético. Para ello, las bacterias son puestas en

contacto con una solución de alta concentración de sales, glucosa y ácido etilendiamino

tetracético (EDTA) (solución I). Este último es un agente quelante de calcio (el calcio es un

ión estabilizador de las membranas bacterianas). Posteriormente se agrega una solución

(solución II) con una alta concentración de SDS e hidróxido de sodio: en condiciones

alcalinas (pH 11) el DNA se desnaturaliza. Sin embargo, el DNA cromosomal al no ser tan

compacto se desnaturaliza más rápidamente que el DNA de plásmido. Cuando a esta

solución se le agrega acetato de potasio (solución III), el DNA desnaturalizado

(cromosomal) forma un agregado junto con el SDS y las proteínas bacterianas, el cual

precipita, mientras que el DNA del plásmido se mantiene en solución. La separación de la

fracción soluble se logra mediante centrifugación. Finalmente, el DNA del plásmido es

concentrado por precipitación con etanol. Debido a que este procedimiento no garantiza

una alta pureza, es posible que la muestra final contenga trazas de DNAsas bacterianas

que se acarrean durante el proceso de extracción. Para evitar la degradación de las

moléculas de ADN por estas enzimas, se aconseja trabajar de forma rápida y con

soluciones a baja temperatura. Una persona además también es portador de DNAsas en

sus manos, saliva, lágrimas que pueden contaminar la muestra por lo que se recomienda

mucha atención y cuidado en la extracción.





Para que un plásmido pueda ser utilizado como vector, se le inserta un fragmento

de DNA de interés, para ello primero es digerido con enzimas (endonucleasas) de

restricción, se agrega el fragmento de interés y finalmente es ligado. Las endonucleasas de

restricción son enzimas que reconocen secuencias específicas de DNA de doble cadena y

cortan ambas hebras de la molécula. El corte se produce dentro de la secuencia de

reconocimiento, originando fragmentos con extremos romos o fragmentos con extremos

cohesivos. Esta propiedad es muy importante porque permite unir fácilmente dos

fragmentos de DNA de orígenes distintos, siempre que hayan sido cortados con un mismo

enzima de restricción. Esto se traduce en la formación de moléculas de DNA híbridas, lo

que constituye la base de la Tecnología del DNA Recombinante. El análisis de los

fragmentos de DNA generados por la digestión con enzimas de restricción se realiza en

electroforesis en geles de agarosa. Este análisis se basa en que, a pH neutro o alcalino, los

grupos fosfato del DNA confieren a la molécula carga neta negativa que está

uniformemente distribuida. Para moléculas de DNA de la misma conformación, sometidas

a unas mismas condiciones electroforéticas, la velocidad de migración de los fragmentos

de DNA en el gel depende sólo de su tamaño, puesto que las moléculas mayores tendrán

más dificultad para atravesar los poros del gel que las más pequeñas.

II.- MATERIALES Y REACTIVOS -Medio Luria Bertani. -Bacteria E. coli conteniendo un vector plasmídico. Antibióticos para la selección del

plásmido.

-Ampicilina

-Solución I: 50 mM Tris.Cl, pH 8, 10 mM EDTA, 20 mM glucosa 60

-Solución II: 200 mM NaOH, 1% SDS

-Solución III: 3 M Acetato de potasio

-Etanol al 70% y al 95%

-Buffer TE

-Hielo





-Tubos de 15 ml

-Micropipetas y pipetas.

-Cámara de electroforesis

III.- PROCEDIMIENTO

PARTE I.- Crecimiento asintótico de poblaciones bacterianas.

-Preparar el medio enriquecido Luria Bertani. Para ello, añadir a 950 ml de agua destilada

10 g de bactotriptona, 5 g de extracto de levadura y 10 g de NaCl. Mezclar hasta disolver

los componentes y ajustar el pH a 7 con NaOH 5 N. Ajustar el volumen a 1 l con agua

destilada. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 min. Con la ayuda de un asa de

cultivo esterilizada al calor, tomar de la placa una colonia aislada y sembrarla en un tubo

con 3 ml de medio de cultivo LB conteniendo 100 µg/ml de ampicilina. Incubar a 37 °C

durante 24 horas en agitación.

PARTE II.- Extracción y purificación del ADN plasmídico.

-Poner en un tubo Eppendorf 1,5 ml un cultivo de E. coli que ha sido sembrado el día

anterior. Centrifugar dicho tubo 2 min en una microcentrífuga. A continuación, eliminar el

sobrenadante procurando dejar la pastilla de células lo más seca posible. Con una

micropipeta, resuspender las células en 100 µl de solución I (resuspender pipeteando).

-Añadir al mismo tubo 200 µl de la disolución alcalina de lisis (Solución II). Aquí es

importante no mezclar pipeteando sino mezclar invirtiendo el tubo varias veces. La

muestra debe quedar clara y viscosa. Incubar 2–3 min a temperatura ambiente.

-Neutralizar añadiendo 150 µl de la Solución III. Agitar de nuevo por inversión. Aparecerán

agregados blancos al precipitar el DNA cromosómico. Incubar 2–3 min a temperatura

ambiente.





-Centrifugar durante 5 min a máxima velocidad (de ser posible a 4 °C).

-Pasar cuidadosamente el sobrenadante con una micropipeta (aproximadamente 400 µl) a

otro tubo eppendorf limpio evitando tocar el sedimento. En este sobrenadante se

encuentra el DNA plasmídico.

-Precipitar el DNA añadiendo al sobrenadante 1 ml de etanol absoluto frío (refrigerado a -

20◦ C). Mezclar bien por inversión.

-Centrifugar durante 20 min a máxima velocidad (de preferencia a 4 °C).

-Desechar el sobrenadante utilizando una micropipeta evitando tocar el fondo. Si es

necesario, repetir la centrifugación 1 min para retirar todo el sobrenadante posible. El

plásmido se encuentra en el sedimento junto con RNA fragmentado.

-Evaporar todo el sobrenadante remanente secando los tubos conteniendo el precipitado

de plásmido al vacío o en una estufa a 60 °C durante 15 min.

-Resuspender en 20 µl de buffer TE.

PARTE III.- Uso de endonucleas para caracterizar ADN plasmídico Digestión del ADN con las BamHI, EcoRI y HindIII. La reacción de digestión se lleva a cabo en tubos eppendorf. Para la reacción de digestión seguir el protocolo establecido por la empresa que generalmente es: añadir a un tubo 10 µl de la solución de DNA plasmídico, 10 µl de una mezcla que contiene agua destilada, el buffer respectivo de la enzima y una de los siguientes enzimas de restricción (EcoRI, HindIII o BamHI ) en proporción 7:2:1 (7 µl de agua, 2 µl de buffer y 1 µl de enzima . Agitar suavemente golpeando el tubo con el dedo e incubar en un baño María a 37◦ C durante al menos dos horas (puede hacerse el d ía anterior y dejarse incubando durante la noche).





PARTE IV. Observación de la digestión en gel de agarosa.

-Se utilizará un gel de agarosa al 0.8 % en buffer TBE o TAE (solo se debe usar un buffer,

NO combinaciones). Para preparar 100 ml (preparar lo necesario, p. ej. 300 ml) se deben

pesar 0.8 g de agarosa, colocarla en un matraz Erlenmeyer y añadir 100 ml del buffer TBE

o TAE, luego fundir en un horno microondas evitando que la agarosa hierva y se derrame.

Una vez fundida la agarosa se agrega bromuro de etidio (0,25 µg/ml final) (tener mucho

cuidado ya que esta sustancia es altamente cancerígena). Colocar la mezcla en el carro de

electroforesis y colocar el peine cerca de uno de los bordes de la misma. Dejar que la

agarosa solidifique sin mover el carro. Una vez solidificado el gel, retirar el peine y

observar los pocillos formados. Colocar el carro en al cámara de electroforesis y agregar

buffer TBE o TAE hasta que el gel quede completamente sumergido. Si no se va a utilizar el

gel hasta el día siguiente, envolverlo en un plástico y dejarlo en la nevera hasta entonces.

-La razón por la que se utiliza el bromuro de etidio es porque este se intercala entre las

bases del DNA y emite fluorescencia en el rango visible del espectro electromagnético,

tras ser irradiado con luz ultravioleta, permitiendo visualizar los fragmentos de DNA.

-Tomar 10 µl de la muestra digerida y añadirle, antes de cargarla en el gel, 5 µl del mismo

buffer utilizado para la elaboración de la agarosa (TAE o TBE) y azul de bromofenol (un

colorante de pequeño tamaño molecular que sirve para controlar la migración del frente

de la electroforesis). Colocar cuidadosamente cada muestra en un pozo distinto del gel

con una micropipeta automática. Dejar libre un pozo para colocar un marcador de peso

molecular (contiene fragmentos de DNA de tamaño conocido). Por último, conectar los

electrodos de la cámara de electroforesis a la fuente de alimentación, aplicando un voltaje

constante de 120 V una media hora. Una vez terminada la electroforesis, se coloca el gel

sobre un transiluminador que emite radiación ultravioleta para observar el tamaño de los

fragmentos obtenidos

IV.- PREGUNTAS.- Se contestaran varios reactivos durante transcurso y avance de la

práctica

Documents

Manual Laboratorio Genetica