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A preparação deste manual foi realizada com base no manual de segurança do Centers for Disease Control and Prevention, e Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (5ª edição)
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Instituto de Higiene e Medicina TropicalUniversidade NOVA de Lisboa
Manual de Segurança Biológica
Lisboa, 2014
2
Autores
Ana Armada
Diana Machado
Elisabete Junqueira
Isabel Couto
Jorge Ramos
José Marcelino
Miguel Viveiros
Ricardo Parreira
Sofia Costa
3
ÍNDICE
1. Notas introdutórias ............................................................................................................... 4
2. Determinação dos níveis de contenção laboratorial com base em critérios de risco ............ 6
3. Avaliação dos riscos biológicos ........................................................................................... 8
4. Laboratório de microbiologia ............................................................................................... 10
4.1. Laboratório de base – Nível 1 e 2 de segurança biológica ........................................ 12
4.1.1. Instalações do laboratório de microbiologia geral .......................................... 10
4.1.2. Boas práticas laboratoriais .............................................................................. 12
4.2. Laboratório de confinamento – Nível 2+ e 3 de segurança biológica ....................... 17
4.2.1. Instalações do laboratório de segurança de micobactérias.............................. 17
4.2.2. Boas práticas laboratoriais .............................................................................. 20
5. Laboratório de virologia ....................................................................................................... 22
6. Sistema AVAC ..................................................................................................................... 25
7. Boas práticas laboratoriais na câmara de segurança biológica ............................................. 26
8. Limpeza, descontaminação e tratamento do material contaminado ..................................... 28
9. Manutenção do equipamento laboratorial ............................................................................ 31
10. Atitudes perante o acidente ................................................................................................ 31
10.1. Atitude após exposição acidental por Mycobacterium tuberculosis ........................ 35
11. Vigilância do pessoal ......................................................................................................... 36
12. Manipulação, transporte e envio à distância de produtos potencialmente infeciosos ........ 38
13. Laboratório de Bioquímica ................................................................................................. 40
Bibliografia .............................................................................................................................. 44
Anexo I ..................................................................................................................................... 46
Anexo II ................................................................................................................................... 47
Anexo III .................................................................................................................................. 48
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1. Notas introdutórias
A preparação deste manual foi realizada com base no manual de segurança do Centers for
Disease Control and Prevention, e Biosafety in Microbiological and Biomedical
Laboratories (5ª edição), uma vez que este é a referência para os códigos de práticas
laboratoriais e a autoridade competente para o seu estabelecimento; e no “Manual de
Segurança Biológica em Laboratório” da Organização Mundial de Saúde (OMS), 3ªedição.
Este manual de biossegurança pretende ser um documento sintético, abordando conceitos,
procedimentos e normas gerais, e foi elaborado tendo em consideração as instalações e
recursos humanos existentes. Por estas razões ele não dispensa a consulta dos dois manuais
referidos anteriormente. A classificação dos agentes biológicos manipulados nos
laboratórios de microbiologia bem como dos níveis de segurança biológica corresponde à
apresentada quer no manual de segurança editado por ambas as instituições acima
referidas, a qual é aceite internacionalmente.
Este manual pretende fornecer os princípios gerais da segurança nos laboratórios, do
IHMT onde se manipulem microrganismos ou produtos biológicos que os contenham, e
quais as normas a aplicar no manuseamento de organismos específicos cuja manipulação
exige a aplicação de normas de contensão biológica mais restritas, como são os casos de
Mycobacterium tuberculosis e Vírus da Imunodeficiência Humana (VIH).
O termo “Segurança biológica” é utilizado para descrever os princípios de confinamento,
as tecnologias e as práticas que são implementadas de modo a evitar exposição não
intencional a agentes patogénicos e toxinas, ou a sua fuga acidental. O termo “Proteção
biológica” em laboratório refere-se a medidas de proteção estabelecidas e pessoais
concebidas para evitar perda, roubo, utilização indevida, desvio ou fuga intencional de
agentes patogénicos e toxinas. Tanto quanto possível, cada grupo de trabalho, deverá
preparar e implementar um programa específico de proteção biológica em laboratório,
segundo as exigências do mesmo, o tipo de trabalho realizado, e as condições logísticas
existentes. É indispensável que todos os laboratórios tenham uma política de segurança
global, um manual de segurança e programas para a sua implementação. A
responsabilidade da implementação, manutenção e cumprimento de boas práticas
laboratoriais cabe ao Diretor da Unidade de Ensino e Investigação (UEI), caso se aplique.
Em alternativa, esta responsabilidade deverá ser imputada ao seu membro mais sénior.
5
Também é da responsabilidade do Diretor da UEI garantir que TODOS os funcionários,
recebem treino e orientação específica sobre boas práticas laboratoriais e princípios de
biossegurança aplicados ao agente patogénico e ao trabalho que irão desenvolver. O
Diretor da UEI deve assegurar que o equipamento adequado está disponível para a
realização dos trabalhos e da sua boa utilização. Por outro lado, cada funcionário é
responsável pela sua própria segurança e pela segurança dos seus colegas. Espera-se que
os funcionários desempenhem o seu trabalho segundo as regras de segurança e que
comuniquem qualquer ato, condição ou incidente que comportem riscos.
A segurança no trabalho é um assunto que diz respeito a todo o pessoal de laboratório de
análise ou investigação. Práticas de laboratório inadequadas e desconhecimento das
normas de segurança podem estar na origem de acidentes que, nalguns casos, colocam em
risco as suas vidas e as dos outros. Precauções de segurança devem fazer parte do trabalho
de rotina e laboratório, incluindo-se a utilização de técnicas de assepsia e descontaminação
adequadas e a implementação de práticas microbiológicas seguras. Os procedimentos
devem ser cuidadosamente planeados, todo o material necessário deverá ser reunido antes
de iniciar o trabalho, sendo novamente armazenado no seu local respetivo após a
finalização do mesmo.
É de extrema importância ter em conta que não existem sistemas de segurança e/ou
barreiras de proteção 100% eficazes. Só uma boa prática laboratorial associada ao correto
uso das normas e equipamentos pode prevenir o acidente e a infeção acidental.
Existe um exemplar do manual de segurança no laboratório, disponível para consulta. Este
manual deve ser lido por todos os funcionários e visitantes que realizem trabalho
temporário nos nossos laboratórios e assinado no final (o original) assumindo que as regras
nele contidas foram aceites e compreendidas.
Distrações e desleixos são a principal causa de acidentes em laboratório.
De modo a evitar acidentes, e uma vez que a prevenção é o melhor remédio, todo o
trabalho em laboratório deverá ser previamente planeado e organizado.
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2. Determinação dos níveis de contenção laboratorial com base em critérios de risco
A tabela 1, faz referência aos perigos relativos a microrganismos infeciosos, por Grupos de
Risco (GR) 1, 2, 3 e 4. Esta classificação só deve ser utilizada em contexto laboratorial.
Tabela 1. Classificação de microrganismos infeciosos por grupo de risco
GR 1 - Nenhum ou baixo risco individual e coletivo. Um agente biológico que provavelmente não causa
doença no homem ou num animal.
GR 2 - Risco individual moderado, risco coletivo baixo. Um agente biológico patogénico que pode causar
doença no homem ou no animal, mas que é improvável que constitua um perigo grave para os
funcionários do laboratório, a comunidade, o gado ou o ambiente. A exposição a agentes infeciosos no
laboratório pode causar uma infeção grave, sendo que esta pode ser debelada por recurso a tratamento
eficaz, ou para as quais existem medidas de prevenção. O risco de propagação de infeção é limitado.
GR 3 - Elevado risco individual, risco coletivo baixo. Um agente biológico que causa geralmente doença
grave no homem ou no animal, mas que não se propaga habitualmente entre indivíduos infetados e não-
infetados. As infeções causadas por estes microrganismos podem ser debeladas com tratamento eficaz, ou
prevenidas pela aplicação de medidas de prevenção adequadas.
GR 4 - Elevado risco individual e coletivo. Um agente biológico que causa geralmente doença grave no
homem ou no animal e que se pode transmitir facilmente de uma pessoa para outra, direta ou
indiretamente. Nem sempre está disponível um tratamento eficaz ou medidas de prevenção.
As instalações laboratoriais designam-se por laboratório de base, laboratório de
confinamento, e laboratório de confinamento máximo. A cada um destes é atribuído um
nível de segurança biológica (BSL, do inglês Biosafety Laboratory). Aos laboratórios de
base são atribuídos os níveis BSL-1 e BSL-2 de segurança biológica (respetivamente),
enquanto aos laboratórios de confinamento e confinamento máximo são atribuídos os
níveis BSL-3 e BSL-4, respetivamente.
Estas designações baseiam-se num conjunto de características de estruturas de
confinamento, equipamento, práticas e normas operacionais necessárias para trabalhar com
agentes de diversos grupos de risco. Na tabela 2 relacionam-se os grupos de risco com
níveis de segurança biológica, práticas e equipamento. A tabela 3 resume as instalações e
equipamentos necessários para os 4 níveis de segurança biológica.
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Tabela 2. Relação dos grupos de risco com níveis de segurança biológica, práticas e
equipamento.
Grupo
de Risco
Nível de
Segurança
Biológica
Tipo de
laboratório
Práticas de
Laboratório
Equipamento de
Proteção
1 Básico – Nível 1 de
segurança biológica
Ensino básico;
pesquisa
BPM Nenhum; mesa/bancada
de trabalho
2 Básico – Nível 2 de
segurança biológica
Serviços básicos de
saúde; serviços de
diagnóstico, de
pesquisa
BPM e vestuário de
proteção pessoal
adequado, sinal de
perigo biológico à
porta do laboratório
Bancada de trabalho e
CSB para potenciais
aerossóis
3 Confinamento –
Nível 3 de
segurança biológica
Serviços especiais
de diagnóstico;
pesquisa
Como Nível 2, mais
vestuário protetor
especial, acesso
controlado,
ventilação dirigida
CSB e/ou outros
dispositivos primários
para todas as atividades
4 Confinamento
máximo – Nível 4
de segurança
biológica
Serviço de
manipulação de
agentes patogénicos
perigosos
Como Nível 3, mais
entrada hermética,
saída com duche,
eliminação especial
de resíduos
CSB classe III ou fatos de
pressão positiva em
conjunto com CSB classe
II, autoclave duas portas
(através da parede), ar
filtrado
CSB – Câmaras de segurança biológica (ver anexo 1 e seções seguintes); BPM – Boas práticas de Microbiologia.
Tabela 3. Resumo dos requisitos para os diversos níveis de segurança biológica
Nível de Segurança Biológica
1 2 3 4
Isolamento a do laboratório N N S S
Sala selada para descontaminação N N S S
Ventilação
Adução do ar N Desejável S S
Sistema Ventilação controlada N Desejável S S
Exaustor com filtro HEPA* N N S/N b S
Entrada com porta dupla N N S S
Câmara de vácuo N N N S
Câmara de vácuo com duche N N N S
Antecâmara N N S -
Antecâmara com duche N N S/N c N
Tratamento dos efluentes N N S/N c S
Autoclave
no mesmo edifício N Desejável S S
numa sala do laboratório N N Desejável S
de duas portas N N Desejável S
Câmaras de segurança biológica N Desejável S S
Meio de monitorização da proteção do pessoal d N N Desejável S
a) Isolamento ambiental e funcional do trânsito em geral; b) Segundo a localização do exaustor; c) Dependente dos agentes
utilizados no laboratório; d) Ex. Circuito fechado de televisão, comunicação em dois sentidos; *Ar particulado de alta
eficiência; (S) Sim; (N) Não
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A atribuição do nível de segurança biológica tem em consideração o agente patogénico
utilizado, as instalações disponíveis, bem como o equipamento, práticas e normas
necessárias para trabalhar, com segurança, no laboratório.
3. Avaliação dos riscos biológicos
A avaliação dos riscos deve ser efetuada por pessoas com formação na área, i.e., por
pessoas experientes e familiarizadas com as características específicas dos
microrganismos, normas, equipamento e modelos animais a utilizar, bem como do
equipamento de confinamento e instalações disponíveis. Um dos instrumentos disponíveis
mais uteis para efetuar uma avaliação dos riscos microbiológicos é a elaboração de uma
lista dos grupos de risco por agentes microbiológicos. Uma listagem atualizada destes
agentes pode ser encontrada, por exemplo, em http://www.hse.gov.uk/pubns/misc208.pdf.
Na tabela 4 descreve-se os agentes patogénicos mais frequentemente manipulados nos
laboratórios do IHMT.
Tabela 4. Microrganismos mais frequentemente manipulados nos laboratórios do IHMT.
Agentes microbianos Nível de risco Local de manipulação Escherichia coli AG100 (K12)* 1 BSL-1
Bacillus subtilis 168 1 BSL-1
Lactobacillus plantarum 1 BSL-1
Enterobacter aerogenes 1 BSL-1
Enterobacter cloacae 1 BSL-1
Mycobacterium smegmatis** 1 BSL-1
Rhodococcus erythropolis DCL14 1 BSL-1
Serratia marcescens 1 BSL-1
Sphingomonas wittichii 1 BSL-1
Sphingomonas pruni 1 BSL-1
Sphingomonas spp 1 BSL-1
Acinetobacter baumannii 2 BSL-1
Escherichia coli (estirpes veterinárias-MDR) 2 BSL-1
Enterococcus spp (MDR) 2 BSL-1
Enterococcus faecalis ATCC29212 2 BSL-1
Klebsiella pneumonia 2 BSL-1
Morganella morganii 2 BSL-1
Neisseria gonorrhoeae 2 BSL-1
Plasmodium spp (humano*** e roedor) 2 BSL-1
Pseudomonas aeruginosa 2 BSL-1
Salmonella enterica NCTC13349 2 BSL-1
Salmonella spp 2 BSL-1
Staphylococcus aureus subsp. aureus (MSSA) 2 BSL-1
Staphylococcus aureus subsp. aureus
(MRSA-HPV107) ATCC BAA-44™ 2
BSL-1
Staphylococcus aureus subsp. aureus (MRSA-COL) 2 BSL-1
Staphylococcus aureus subsp. aureus RN4220 2 BSL-1
Staphylococcus coagulase negativos (CoNS) 2 BSL-1
Trichomonas vaginalis 2 BSL-1
Treponema palidum 2 BSL-1
Mycobacterium spp other than tuberculosis and M. leprae (MOTT) 2 BSL-2+
Mycobacterium tuberculosis complex 3 BSL-3
Vírus da Imunodeficiência Humana 3 Lab2.BSL-3
Vírus da Imunodeficiência Símia 3 Lab2.BSL-3
Vírus da dengue 3 Lab2.BSL-3
Vírus Chikungunya 3 Lab2.BSL-3
Vírus do Nilo Ocidental 3 Lab2.BSL-3
*ou qualquer outra estirpe utilizada como vetor de clonagem molecular ou expressão heteróloga de proteínas; **Única
espécie micobacteriana não patogénica manipulada fora do laboratório de micobactérias devido a elevada probabilidade
de contaminação com micobactérias de crescimento lento; *** Exceto P. falciparum, cuja manipulação deve ser feita em
contexto BSL-3
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Considerações especiais para a manipulação de micobactérias: o aspeto mais
importante é conhecer o seu modo de transmissão.
1) M. tuberculosis complex: as partículas infeciosas produzidas por tosse e espirros são a
principal causa de disseminação do bacilo. Em termos laboratoriais, a exposição a
aerossóis infeciosos é a principal situação de perigo encontrada. Deste modo, todo o
trabalho tem ser realizado em câmaras de segurança biológica (CSB) em BSL-3.
Manipulação de pequenas quantidades da estirpe vacinal M. bovis BCG pode ser efetuada
em BSL-2 por decisão do responsável pelo laboratório em questão. A seleção do
desinfetante tuberculocida apropriado é um aspeto crucial em laboratórios que trabalham
com micobactérias.
2) Mycobacterium spp. other than M. tuberculosis complex (MOTT) e M. leprae: a
maioria das espécies de micobactérias são espécies ambientais comuns das quais
aproximadamente 30 estão associadas a infeções humanas. Todas estas espécies são
consideradas patogéneos oportunistas de humanos e nenhuma é considerada comunicável.
As micobactérias são frequentemente isoladas em amostras clinicas mas na maioria das
vezes não estão associadas a doença. A transmissão de pessoa para pessoa ainda não foi
demonstrada. A principal causa de infeções pulmonares causada por MOTT supõe-se que
seja resultado de bacilos aerossolizados de água contaminada. As micobactérias estão
amplamente distribuídas no ambiente e nos animais. Elas são também comuns em
reservatórios de água potável, provavelmente como resultado da formação de bio filmes.
Práticas de BSL-2, equipamento de proteção e instalações são recomendadas para trabalho
com amostras clínicas e culturas.
No entanto, a simples referência a um grupo de risco não é suficiente para realizar uma
avaliação de riscos correta. Outros fatores devem ser considerados, tais como:
1. Patogenicidade do agente e a dose infeciosa.
2. Resultado potencial da exposição.
3. Via natural da infeção.
4. Outras vias de infeção, resultantes de manipulações laboratoriais (parentéricas,
aerossóis, ingestão).
5. Estabilidade do agente no ambiente.
6. Concentração do agente e volume do material concentrado a manipular.
7. Presença de um hospedeiro apropriado (humano ou animal).
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8. Informação disponível de estudos sobre animais e relatórios de infeções adquiridas em
laboratórios ou relatórios clínicos.
9. Atividade laboratorial planeada (geração de ultrassons, produção de aerossóis,
centrifugação, etc.).
10. Qualquer manipulação genética do organismo que possa alargar o raio de ação do
agente ou alterar a sensibilidade do agente a regimes de tratamentos eficazes
conhecidos.
11. Disponibilidade local de profilaxia eficaz ou intervenções terapêuticas.
De acordo com a informação obtida durante a avaliação dos riscos, é atribuído um nível de
segurança biológica à atividade planeada, selecionado o equipamento de proteção pessoal
apropriado e concebidas normas-padrão de procedimento englobando outras intervenções
de segurança, a fim de assegurar a realização mais segura possível da referida atividade.
4. Laboratório de Microbiologia
Neste manual, as orientações e recomendações são apresentadas como requisitos mínimos
para os laboratórios de segurança biológica que visam microrganismos dos grupos de risco
1 a 3. Os laboratórios de diagnóstico e cuidados de saúde (saúde pública, clínicos ou
hospitalares) devem ser concebidos, no mínimo, para o Nível 2 de segurança biológica.
Chama-se a atenção para duas situações particulares. O laboratório de Micobactérias do
IHMT é constituído por um laboratório de Microbiologia Geral (BSL-1) e por um
laboratório de contenção para Micobactérias de níveis BSL-2+ e BSL-3. Adicionalmente,
se bem que maioria dos laboratórios de virologia correspondem a instalações de nível de
segurança básico (BLS-1) onde são manipulados ácidos nucleicos ou proteínas virais, a
manipulação de VIH é realizada num laboratório de contensão (BSL-3).
4.1. Laboratório de base: Níveis 1 e 2 de segurança biológica
4.1.1 Instalações do laboratório de microbiologia geral (LMG)
Laboratório sem comunicação direta com as áreas de acesso comum do IHMT. A
entrada faz-se através de corredor com acesso restrito.
A porta que dá acesso ao laboratório abre para o corredor.
É um espaço amplo de modo a empreender as atividades de forma segura, bem
como para a sua limpeza e manutenção.
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As paredes, o teto e o chão são lisos, fáceis de limpar, impermeáveis e resistentes
aos produtos químicos e desinfetantes normalmente utilizados em laboratórios.
O chão deverá ser antiderrapante.
As bancadas são impermeáveis e resistentes a desinfetantes, ácidos, álcoois,
solventes orgânicos e a calor moderado.
A iluminação é adequada a todas as atividades neles levadas a cabo.
As janelas deverão dar para o exterior do edifício e estão seladas.
O mobiliário deve ser robusto e o espaço entre e debaixo das bancadas e
equipamentos está acessível para a limpeza.
O espaço de armazenamento é apropriado para guardar o material de uso corrente.
Existe um espaço para armazenagem a longo prazo, localizado fora da área de
trabalho do laboratório.
Existe um espaço e meios para manuseamento seguro e armazenagem de solventes.
Existem instalações, fora da área de trabalho do laboratório, para guardar roupas e
objetos pessoais (gabinetes e cacifos).
Existem lavatórios com água corrente, idealmente colocados perto da porta de
saída do laboratório.
A porta não deverá ter janela mas existe uma janela que permite a visualização do
interior do laboratório.
O autoclave não está localizado no laboratório (ainda que no mesmo edifício).
Existe uma caixa de primeiros socorros convenientemente equipada e facilmente
acessível.
Deverá existir ventilação mecânica que injeta um fluxo de ar sem recirculação. O
ar que entra não é filtrado pelo que é considerado não estéril e fonte de
contaminação.
O símbolo internacional de risco biológico está exposto nas portas das salas onde
se estão a manusear microrganismos do Grupo de Risco 2 ou acima. Este deve
indicar o nome do responsável do laboratório e o (s) número (s) de telefone de
contacto em caso de acidente.
Existe um extintor de incêndios.
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4.1.2. Boas práticas laboratoriais
O código de boas práticas é uma lista de procedimentos e normas laboratoriais essenciais
para quem trabalha em laboratórios de microbiologia/se manipulam produtos biológicos.
Chama-se a atenção de que as boas práticas laboratoriais são fundamentais não só para a
segurança de quem trabalha no ambiente laboratorial, mas também para garantir que os
estes não se tornem em fonte de contaminação ambiental. O equipamento laboratorial
especializado é um suplemento dessa segurança, mas não pode substituir as normas
apropriadas. As noções expostas neste capítulo são normas gerais que se aplicam a quem
trabalha num laboratório, independentemente do seu nível de segurança. A seguir
descrevem-se os conceitos mais importantes.
O acesso à zona de trabalho é condicionado ao pessoal autorizado.
Não é permitido utilizar qualquer dependência que não seja a do laboratório em que
se encontra a trabalhar, sem autorização do Diretor da UEI.
Não é permitida a entrada a crianças nas áreas de trabalho do laboratório.
É expressamente proibido comer, beber, fumar, maquilhar, guardar alimentos,
bebidas ou objetos pessoais em qualquer parte do laboratório.
Não é permitido beber água da canalização do laboratório.
No interior do laboratório deve ser utilizado equipamento de proteção pessoal
adequado, o qual deve ser removido antes de sair do laboratório. No mínimo, é
obrigatório o uso de bata branca no laboratório.
O equipamento de proteção pessoal (incluindo a bata) deve permanecer no interior
do laboratório.
Não é permitido levar batas sujas para lavar em casa. Existe um local apropriado
para depositá-las. Estas serão recolhidas e processadas por pessoal designado para o
efeito.
Não é permitido o uso de sandálias ou sapatos abertos no laboratório.
O cabelo deve estar preso.
Usar respiradores de partículas (máscaras) com filtros sempre que sejam manuseadas
produtos tóxicos ou irritantes e gases nocivos. Os filtros devem ser adequados ao
tipo de material manuseado. Manusear estes produtos, sempre que possível, em hotte
química.
Usar máscara sempre que haja o perigo de contaminação por aerossóis infeciosos
produzidos durante o trabalho.
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Sempre que haja potencial formação de aerossóis infeciosos, trabalhar num espaço
contido (p.e. CSB).
Usar óculos, viseiras ou outros dispositivos de proteção sempre que execute um
trabalho potencialmente perigoso e for necessário proteger os olhos e a cara de
salpicos, impactos de objetos e raios ultravioleta (UV).
Usar, preferencialmente, óculos e evitar lentes de contacto se precisa regularmente
de auxiliares de visão: uma deslocação ocasional da lente pode ofuscar a visão no
decorrer de uma manipulação de risco.
Mudar de luvas de forma asséptica: sempre que inicia e finaliza o trabalho, sempre
que exista troca de material e sempre que estas se rompam.
Não deve reciclar as luvas. Estas são de um só uso!
“Lavar” luvas com etanol não é boa prática laboratorial. O etanol dilata os poros das
luvas e estas deixam de ter uma função protetora. Se necessitar de trabalhar culturas
celulares limpas utilizar luvas descartáveis estéreis.
Não deve soprar luvas. Estas não são balões!
Não andar de luvas com as mãos transpiradas. Deve trocar mais vezes de luvas ou
substituir por luvas anti-transpirantes. Andar com as mãos transpiradas dentro das
luvas é uma das principais causas de infeções de pele a nível laboratorial,
principalmente fungos nas unhas.
Não ir a casa de banho com a bata do laboratório.
Não deixar gavetas abertas e cadeiras fora do lugar. São situações que podem causar
acidentes graves.
Deve usar, se possível, luvas de nitrilo para trabalho com brometo de etídio (EtBr, do
Inglês ethidium bromide, ou BE, em Português). Após o seu uso, estas deverão ser
descartadas para o contentor de resíduos contendo EtBr.
Todo o produto biológico deverá ser considerado como potencialmente infetante e
manipulado como tal.
Rotular sempre todos os recipientes indicando claramente o seu conteúdo. Se for
caso disso, indicar se o produto é infecioso, mutagénico, carcinogénico ou
radioativo.
Não lamber as etiquetas.
14
A grande maioria dos acidentes no laboratório deve-se ao manuseamento descuidado
do material de vidro. Deve-se evitar que o material se parta ao abrir ou fechar
armários ou gavetas, acomodando-o corretamente.
Evitar o uso de material danificado/partido.
Material de vidro partido deve ser recolhido rapidamente, protegendo as mãos com
luvas, podendo os fragmentos mais pequenos ser apanhados com um algodão
humedecido ou com um pedaço de plasticina.
Colocar o vidro partido (não contaminado) em contentor próprio: “vidro partido”.
Se usar o micro-ondas para fundir meios ou produtos amorfos, não esquecer que
estão envolvidas elevadas pressões e temperaturas pelo que não deve fechar o frasco
totalmente e depois de aquecido abrir sempre cuidadosamente, de modo a evitar
explosões.
Antes de iniciar o trabalho verificar se tem todo o material necessário.
Usar centrífuga com tampa ou copos de segurança.
Todo o material que entra na CSB tem de ser devidamente limpo com uma solução
desinfetante (glutaraldeído a 6% ou soluções comerciais adequadas adquiridas para o
efeito). Do mesmo modo todo o material tem de ser limpo depois de usado na CSB.
Não deixar frascos abertos e recolocá-los no seu devido lugar após a utilização.
Não deixar tesouras com os bicos abertos em cima das bancas, prateleiras, etc. Estas
devem ser colocadas em recipientes resistentes e apropriados e com os bicos
voltados para baixo. Pode causar acidentes graves.
Não deixar lápis com os bicos afiados para cima, pois pode causar acidentes graves.
Pipetar com a boca é estritamente proibido, nem mesmo água destilada. Usar
pompete ou pipetadores automáticos.
Proceder de modo a evitar a formação de aerossóis (não despejar rapidamente o
conteúdo da pipeta, nem elimine a última gota) ou o derrame de produtos infeciosos.
Manter o laboratório limpo e arrumado; deve evitar o armazenamento de material
que não é necessário para o trabalho.
Não é permitido varrer o chão do laboratório. Este deve ser aspirado.
Evitar, sempre que possível, utilizar agulhas e material cortante. Se o seu uso for
necessário, colocá-los, depois de usados, num recipiente resistente, próprio (cor
amarela) para descontaminação.
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Durante o trabalho, não tocar com as luvas no rosto, cabelo, boca, olhos, nariz,
outras superfícies cutâneo-mucosas ou em superfícies que não as de trabalho.
Utilizar sempre que possível isqueiros eletrónicos (tipo de cozinha) em vez de
fósforos.
Não deixar os bicos de Bunsen ligados e abandonados.
Vigiar as destilações, evaporações e manipulações explosivas.
Movimentos bruscos deverão ser evitados. Planear de maneira disciplinada todo o
trabalho de rotina.
A saída da área de trabalho, mesmo que temporariamente, usando luvas (mesmo
tendo a certeza que não estão contaminadas), é estritamente proibida.
Não se deve tocar com as luvas em maçanetas, interruptores, telefones, etc. Só se
deve tocar com as luvas o material estritamente necessário ao trabalho.
Descontaminar o local de trabalho após cada operação, quando houver salpicos ou
derrames e no final de cada dia de trabalho.
Não deve acumular material sujo, partido ou defeituoso no laboratório.
As mãos devem ser lavadas com água e sabão ou solução desinfetante no início e
final de cada trabalho e antes de deixar o laboratório.
Não usar qualquer aparelho/equipamento sem antes ter lido as instruções. Em caso
de dúvida procurar alguém que possa ajudar.
Material cortante não deve ser deixado ao acaso nas bancadas/prateleiras; devem ser
colocados em recipientes apropriados.
As agulhas hipodérmicas, uma vez utilizadas, não devem ser reintroduzidas nos seus
invólucros, partidas ou retiradas das seringas descartáveis. Todo o conjunto deve ser
colocado num recipiente para cortantes. Os recipientes para agulhas descartáveis
devem ser resistentes/antiperfurantes e não devem ser totalmente cheios; quando
estiverem quase a 3/4 da sua capacidade devem ser postos em contentores para
«resíduos infeciosos» e incinerados, após descontaminação em autoclave no caso dos
contentores do laboratório de segurança.
Usar sempre que possível material descartável, principalmente pipetas volumétricas
e pipetas de Pasteur.
Usar apenas ansas descartáveis. A descontaminação de ansas metálicas é uma fonte
de aerossóis.
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As CSB existentes no laboratório são do tipo II-A1. Estas não devem ser utilizadas
para técnicas que envolvam grandes quantidades de produtos tóxicos ou compostos
carcinogénicos. Nestes casos utilizar as hottes químicas existentes.
No caso de detetar equipamento com problemas técnicos, comunicar imediatamente
ao responsável para que a intervenção técnica seja providenciada.
Para sua segurança, deve conhecer os perigos associados aos produtos químicos
utilizados no seu trabalho.
Descontaminar produtos clínicos, culturas e todo o lixo potencialmente contaminado
antes de ser eliminado.
Evitar o uso de anéis e pulseiras que possam impedir uma boa limpeza das mãos e
braços.
Se reparar em algo fora do lugar, arrume.
Se entornar líquidos no chão, nem que seja apenas água…limpe.
Se for o último a sair do laboratório faça sempre uma vistoria geral ao local antes de
o abandonar.
Evite circular pelos corredores com agentes patogénicos nas mãos.
Descontaminar os equipamentos antes de qualquer serviço de manutenção.
Se tiver corte recente, lesão na pele ou com ferida aberta (mesmo uma extração de
dente), deve abster-se de trabalhar com material potencialmente infecioso.
Indivíduos imunocomprometidos e grávidas não podem desempenhar funções
laboratoriais de alto risco.
Não abrir os contentores de amostras ou culturas se não tiverem a superfície exterior
seca. Este procedimento evita o derramamento por falta de aderência.
Material para escrever deve ser mantido ao mínimo dentro do laboratório; evitar
levar cadernos grandes para o laboratório. Poupa espaço de bancada e evita que se
contamine.
Evitar a sobrelotação do laboratório. Excesso de pessoal pode causar acidentes.
Evitar ter excesso de material e equipamento na área de trabalho.
Não é permitido trazer os meios e soluções da central de lavagens sem dar
conhecimento aos funcionários.
Não deve correr no laboratório e corredores de acesso.
Não se deve usar telemóvel ou tablets dentro do laboratório.
Não usar óculos de sol no laboratório.
17
4.2. Laboratório de confinamento – Níveis 2+ e 3 de segurança biológica
4.2.1 Instalações do laboratório de confinamento para manipulação de
micobactérias
O laboratório de confinamento para manipulação de micobactérias compreende dois
laboratórios – um laboratório BSL-3 e um laboratório BSL-2+. Um laboratório BSL-2+
rege-se pelas mesmas normas de segurança e procedimentos do BSL-3. O laboratório de
segurança biológica foi concebido e equipado para trabalhar com micobactérias do GR 3 e
com grandes quantidades ou altas concentrações de micobactérias do GR 2, que
constituem um risco acrescido de propagação de aerossóis. Estes níveis de confinamento
exigem um reforço dos programas operacionais e de segurança superior ao dos
laboratórios básicos – Níveis 1 e 2 de segurança biológica. Esta categoria de laboratórios
está registada junto (ou na lista) das autoridades nacionais competentes. No IHMT, o
responsável por estes laboratórios é o Professor Doutor Miguel Viveiros.
As diretivas aqui apresentadas são de facto suplementos às diretivas para laboratórios de
base – Níveis 1 e 2 de segurança biológica, e devem, portanto, ser aplicadas antes de
aplicar as diretivas para os laboratórios de confinamento – Nível 3 de segurança biológica.
O principal objetivo deste nível de contenção é minimizar ou eliminar a exposição do
pessoal de laboratório e do ambiente exterior dos perigos associados a agentes patogénicos
de Risco 2 e 3. As instalações foram concebidas para trabalhar apenas com um grupo de
agentes patogénicos (Micobactérias) devido à probabilidade de contaminação cruzada
entre microrganismos de crescimento lento com microrganismos de crescimento rápido.
Deste modo, pretende-se assegurar a qualidade do serviço prestado no diagnóstico
laboratorial de tuberculose e outras micobacterioses. Assim, ao nível de segurança BSL-2+
e 3 aplicam-se todas as normas acima referidas (ver ponto 4.1.2) mais as seguintes:
A conceção e instalações para os laboratórios de base – Níveis 1 e 2 de segurança
biológica são aplicáveis, exceto nas situações abaixo descritas, particularizadas
relativamente às instalações laboratoriais em que se manipulam micobactérias:
O acesso é restrito.
O laboratório deverá estar totalmente separado das áreas de passagem livre, dentro
do edifício. A entrada para o laboratório de segurança é feita exclusivamente através
do laboratório BSL-2 com entrada de porta dupla.
18
Deverá existir uma antecâmara entre o laboratório BSL-2 e BSL-2+ e entre o
laboratório BSL-2+ e BSL-3, quando estes comunicam.
A existência de janelas no laboratório de segurança não é recomendada uma vez que
põe em risco a segurança (nível de contenção) das instalações devendo deste modo
ser evitadas.
O laboratório BSL-2+ deverá possui uma janela dirigida para um corredor de acesso.
Esta janela deve ser inquebrável.
As janelas, dirigidas para o exterior do edifício, deverão ser de vidro duplo e deverão
estar seladas. Se necessário, poderão estar revestidas por película de modo a evitar
reflexos e brilho indesejáveis.
As janelas exteriores deverão ser inquebráveis de modo a garantir o nível de
contenção biológica.
As estufas, frigorífico, CSB e BACTEC deverão estar ligadas ao gerador de
eletricidade de emergência.
Deverão existir contentores para luvas, máscaras e peseiras na antecâmara entre os
laboratórios BSL-2+ e o BSL-2. Ao abandonar o laboratório BSL-2+, deve deixar as
luvas nesse mesmo caixote.
As superfícies das paredes, tetos e pavimentos deverão ser resistentes à água e fáceis
de lavar. As perfurações nestas superfícies (ex. passagens de cabos e canalizações)
estão seladas para facilitar a descontaminação do local.
A sala dos laboratórios pode ser selada para descontaminação. Os sistemas de
adução de ar foram construídos de modo a permitir a descontaminação por meio de
gases.
Cada laboratório possui um lavatório operado por pedal.
Deverá existir um sistema de monitorização visual, sem alarme, para que o pessoal
possa sempre assegurar-se do bom funcionamento da ventilação/pressão negativa.
De modo a evitar pressurização positiva contínua do laboratório, a circulação de ar
no laboratório deve ser controlada por um sistema de tipo AVAC (Aquecimento,
Ventilação e Ar Condicionado) com alarme audível.
Terá de existir um sistema de ventilação que garanta a pressão negativa no espaço
laboratorial (ver ponto 5).
O ar do laboratório de segurança biológica terá de ser extraído para o exterior do
edifício (cobertura), através de filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air).
19
O ar extraído para o exterior deverá ser expelido para longe do edifício e das
entradas de ar.
Todos os filtros HEPA estão instalados de forma a permitir descontaminação por
meio de gases e verificação.
As câmaras de segurança biológica estão situadas, tanto quanto possível, longe das
zonas de passagem e das correntes de ar provenientes das portas e sistemas de
ventilação.
O ar expelido das câmaras de segurança biológica (classe 2) e que passou através dos
filtros HEPA, é expelido de forma a evitar interferência com o equilíbrio do ar da
câmara ou com o exaustor do edifício.
O laboratório de segurança tem um autoclave de dupla entrada para
descontaminação de resíduos contaminados.
A entrada do material para descontaminação é realizada através do laboratório BSL-
3 designado como “Zona suja” e a saída faz-se através do laboratório BSL-2+
designado por “Zona limpa”.
A transferência de materiais entre o laboratório BSL-2+ para o BSL-3, para
descontaminação, é feita exclusivamente pelo cesto ou carrinho que se encontra na
caixa de dupla entrada por baixo da centrífuga.
Não encher o autoclave, deixar pelo menos 2/3 do espaço livre.
O material deve ser colocado em panelas inox sem tampa. Não encher a panela.
Estas são posteriormente colocadas dentro de sacos de autoclave. O saco de
autoclave deve ser colocado aberto para descontaminação e fechado após a
descontaminação.
Colocar sempre fita de autoclave no material a descontaminar e verificar a cor no
final do processo. O material só pode sair do laboratório após verificar se a
esterilização foi validada pelo próprio equipamento.
Culturas de elevada densidade de M. tuberculosis (MDR/XDR) têm de ser
descontaminadas por duas vezes.
Não é permitida passagem de material para descontaminar através da antecâmara.
Se for necessário remover resíduos infeciosos do laboratório de confinamento para
descontaminação e eliminação, é preciso fazê-los transportar em recipientes selados,
inquebráveis e herméticos, segundo os regulamentos nacionais ou internacionais
pertinentes.
20
Em caso de acidente, o principal objetivo é a contenção do agente patogénico
pelo que não deve entrar em pânico, não deve correr e nunca deve tentar partir
as janelas. Ao faze-lo vai colocar em perigo todas as pessoas que se encontram nas
imediações. Deve avisar os colegas que se encontram na área, abandonar o local e
chamar as autoridades competentes.
4.2.2. Boas práticas laboratoriais
O código de práticas para os laboratórios de base – Níveis 1 e 2 de segurança biológica é
aplicável, mais as seguintes:
É obrigatório o uso de respiradores de partículas (máscara). As máscaras utilizadas
no laboratório BSL-2+ e BSL-3 são máscaras P1 (“bico de pato”) para manipulação
com agentes do GR 2 e 3, uma vez que todo o trabalho é realizado em nível de
contenção 3, isto é, com pressão negativa e CSB.
Uma vez que o laboratório não possui uma CSB tipo III, são usadas máscaras P2
(“bico de pato”) exclusivamente para manipulação de M. tuberculosis
extensivamente resistente (XDRTB). Nestas ocasiões, o acesso ao laboratório
durante a manipulação está restrito ao absolutamente necessário.
É obrigatório o uso de bata descartável com mangas e região frontal reforçadas,
impermeáveis e de material não inflamável. As batas devem apertar atrás.
É obrigatório o uso de peseiras ou sapatos de laboratório dedicados. Deve-se evitar
sapatos com solas escorregadias.
As máscaras e peseiras devem ser colocadas na antecâmara BSL-2+ antes de entrar
nas instalações. Ao sair são deixadas na antecâmara.
Deve ser usado dois pares de luvas.
As batas descartáveis, máscaras, peseiras e luvas não podem sair do laboratório.
O símbolo internacional de risco biológico está colocado nas portas de acesso ao
laboratório e indica o nível de segurança biológica.
Não é permitida a entrada com batas normais de laboratório de apertar à frente, bem
como mangas curtas ou arregaçadas.
A manipulação de qualquer material é realizada na CSB tipo II. É estritamente
proibido manipular recipientes abertos com material infecioso fora da CSB.
Apenas abrir os contentores com produtos biológicos dentro das CSB. Deve
trabalhar-se sobre papel absorvente embebido em solução de glutaraldeído a 6%
21
(nome comercial: Neodisher). A superfície exterior dos mesmos deve ser limpa com
a mesma solução.
O uso de material de vidro deve ser mantido no mínimo.
É proibido usar pipetas de vidro e ansas metálicas.
Os esfregaços só podem sair da CSB depois de fixados. Todas as lâminas após
observadas devem ser colocadas em solução desinfetante (glutaraldeído a 6%)
durante 18h antes de serem destruídas.
Não é permitida a entrada dos sacos de plásticos usados para incubação de placas de
Petri (culturas) dentro da CSB.
Não é permitido guardar culturas no frigorífico (placas de Petri, etc.).
Não é permitido guardar meio de cultura líquido em frascos Shott no frigorífico por
mais do que uma semana.
Não é permitido deixar culturas em cima das bancadas (exceto rotina laboratorial).
Todas as culturas para trabalhos de investigação devem ser devidamente
identificadas, guardadas em caixas e preferencialmente dentro de um armário. Não é
permitido guardar culturas em tubos de ensaio.
Tubos de ensaio com culturas têm de ser colocados no contentor dentro do armário
do lixo.
Pontas e pipetas descartáveis têm de ser colocadas no copo com glutaraldeído a 6%
(para desperdícios).
A quantidade de material dentro da camara deve estar limitada apenas ao material
estritamente necessário à realização do trabalho de modo a não perturbar o fluxo de
ar.
Não se deve colocar papel dentro do contentor da camara exceto se estiver
contaminado. Invólucros de seringas, pipetas, tubos Falcon, placas, etc., devem ser
colocados no caixote do lixo fora da camara.
Antes de iniciar o trabalho verificar se tem todo o material necessário. Esta norma é
de especial interesse uma vez que se deve minimizar as entradas e saídas por
esquecimento.
O equipamento/aparelhos deve ser de uso dedicado.
Não é permitido trocar micropipetas entre os laboratórios.
Não é permitido estar mais do que duas horas seguidas dentro do laboratório de
segurança. Deve fazer intervalos nem que seja de apenas 5 min.
22
Os recipientes para resíduos/desperdícios que estão dentro da CSB devem conter
solução tuberculocida (glutaraldeído a 6%).
Os recipientes para resíduos/desperdícios que estão dentro da CSB devem ser
retirados da CSB no final do trabalho.
A descontaminação química é realizada com solução tuberculocida (glutaraldeído a
6%). A desinfeção de mãos e bancadas é feita com desinfetantes (ex. etanol 70%).
Não é permitido usar lixívia uma vez que esta é incompatível com a maioria dos
reagentes usados no laboratório (ex., extração de DNA e RNA) e com metais.
A manutenção da incubadora de CO2 é obrigatoriamente realizada todas as semanas
com substituição da água e solução de glutaraldeído a 0.5% e verificação de
presença/ausência de microrganismos contaminantes. Em alternativa pode ser usado
sulfato de cobre.
A manutenção do banho de água é realizada uma vez por mês e sempre que seja
necessário.
As centrífugas são limpas e desinfetadas pelo menos uma vez por mês.
A manutenção dos microscópios é efetuada diariamente.
O frigorífico é descongelado e limpo uma vez por ano.
Não é permitido encher as estufas e o material deve ser posicionado de modo a
respeitar as normas de circulação do ar.
Não é permitida a coloração de lâminas no BL-3. Esta deve ser realizada no local
destinado para o efeito no BL-2+.
Não é permitido deixar o termociclador em tempo real (Rotor-Gene) a funcionar fora das
horas de trabalho.
5. Laboratório 2 de Segurança Biológica de Nível 3 (Lab2.BSL-3)
Nesta seção são definidos um conjunto de procedimentos de segurança a serem aplicados
na manipulação de vírus, a qual é levada a cabo no designado Laboratório 2 de Segurança
Biológica de Nível 3 (Lab2.BSL-3). As regras definidas são um complemento às definidas
no manual Portuguese BSL-3 Facilities: Rules and Guidelines (em elaboração pelo
Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge, para mais informações consultar
http://www.insa.pt).
A segurança dos utilizadores que trabalhem com agentes infeciosos no Lab2.BSL-3
depende do correto cumprimento das regras estipulados para o devido efeito, de modo a
23
proteger os utilizadores contra possíveis riscos para a sua saúde e segurança provenientes
da exposição a agentes infeciosos. O acesso ao Lab2.BSL-3 só será concedido aos
utilizadores que demonstrem ter conhecimentos sobre os princípios básicos para trabalhar
com microrganismos infeciosos. Os utilizadores deverão também ter formação e treino
adequada para trabalhar no Lab2.BSL-3. Todos os procedimentos a serem realizados no
Lab2.BSL-3 carecem de aprovação pelos responsáveis pela biossegurança no IHMT.
5.1 Regras de acesso e entrada no Lab2.BSL-3
Deverá ser preenchido um Formulário de Acesso de Utilizador, o qual será
submetido à apreciação dos responsáveis da biossegurança no IHMT. O acesso ao
Lab2.BSL-3 é condicionado pela obtenção de uma autorização emitida pelos
responsáveis da biossegurança.
Deverá ser fornecida uma amostra de sangue que será registada e guardada. Será
mantida a sua privacidade, não sendo realizado qualquer teste desde que não seja
necessário.
Deverá ser mostrado conhecimento das boas práticas microbiológicas, para além de
formação específica na manipulação de agentes patogénicos.
Deverão ser realizadas três sessões de trabalho no Lab2.BSL-3 acompanhado por
outro utilizador credenciado, que informará os responsáveis da biossegurança sobre a
aptidão para utilizar o Lab2.BSL-3 A entrada no laboratório 2 do BSL-3 deverá ser
feita com um cartão de acesso pessoal. Os utilizadores do Lab2.BSL-3 que não
sejam funcionários do IHMT, ou estudantes matriculados no IHMT, devem requerer
autorização previamente.
O cartão de acesso é pessoal e intransmissível. Isto implica que, o empréstimo do
cartão a outro utilizador para entrar no Lab2.BSL-3 é da responsabilidade do titular
do cartão. Perante um qualquer acidente que ocorra dentro do BSL-3 a
responsabilização será imputada ao titular do cartão em causa.
Ao entrar na antecâmara do Lab2.BSL-3, o utilizador deve registar a data, hora
entrada e saída, nome e a tarefa no livro de registo de utilização do BSL-3. Deve
verificar sempre se a pressão no interior da sala está negativa. Caso isso não
aconteça, ou existam outros alarmes de aviso ativados, não deve entrar na sala e deve
contactar imediatamente os responsáveis da biossegurança no IHMT.
24
Antes de entrar na sala 2 o utilizador deve remover o relógio, braceletes, anéis,
chaves e outros acessórios (casacos) que possam interferir com a segurança do
trabalhador. Deve também colocar o seguinte equipamento de proteção pessoal: bata,
luvas (2 pares), cobertura de calçado, óculos de segurança (quando necessário),
máscara e touca (quando necessário).
Não é permitido comer, beber ou fumar dentro do Lab2.BSL-3, e não deve ser
colocada comida ou bebida no interior dos frigoríficos que nele possam existir.
Não são permitidos animais e plantas dentro do Lab2.BSL-3.
5.2 Área de trabalho (sala 2) no interior do Lab2.BSL-3
Todas as amostras de sangue ou fluidos biológicos manipulados no interior do
Lab2.BSL-3 devem ser tratadas como estando potencialmente contaminadas.
Todo o material, infecioso, ou não, conservado no frigorífico, ou mantido a -20ºC,
deve estar devidamente identificado. O material não identificado será destruído por
autoclavagem.
O transporte de material infecioso no interior do Lab2.BSL-2 deve ser realizado
dentro de um recipiente inquebrável.
A câmara de segurança biológica (CSB) é um equipamento fundamental ao trabalho
efetuado no espaço do Lab2.BSL-3, uma vez protege o utilizador dos eventuais agentes
infeciosos durante a sua manipulação, e evita também a contaminação do material
biológico (ex. cultura de células e suspensões virais) manipulado no seu interior.
Contudo, não protege o utilizador do derrame, quebra ou técnica deficiente. A
utilização incorreta da CSB aumenta, assim o risco de exposição do utilizador a agentes
infeciosos. Neste sentido, antes de utilizar a CSB deverá ter-se em atenção aos
seguintes procedimentos:
Desligar a lâmpada de UV e acender a luz.
Ligar a câmara 5-10 antes de iniciar o trabalho (i.e. lâmpada fluorescente e o fluxo
de ar).
Desinfetar a superfície de trabalho com etanol a 70%.
Colocar dentro da CSB apenas o material essencial às manipulações previamente
planeadas, para permitir uma boa circulação do ar no interior da CSB.
Os bicos de Bunsen não devem ser utilizados dentro da CSB.
Nunca colocar documentos dentro da CSB.
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Quando terminar o seu trabalho deve:
Deixar a câmara ligada durante 5-10 minutos.
Remover o equipamento e material utilizado.
Desinfetar as superfícies da câmara com etanol a 70%.
Colocar o material contaminado nos recipientes próprios.
Desligar a câmara e ligar a lâmpada de UV.
5.3 Agentes infeciosos
No Lab2.BSL-3 são manipulados os seguintes agentes infeciosos: Vírus da
Imunodeficiência Humana (VIH), Vírus da Imunodeficiência Símia (VIS), Vírus
Chikungunya (CHIKV), Vírus do Nilo Ocidental (WNV) e Vírus da dengue
(DENV). A sua manipulação implica claros riscos para o operador (tratam-se de
agentes virais do grupo de risco 3, tal como descrito na tabela 4.
O VIH é o agente etiológico da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA), o
qual se traduz num quadro clínico complexo, do qual fazem parte uma série de
patologias causadas, por agentes patogénicos oportunistas
O VIH pode ser transmitido pelo contacto com sangue humano infetado ou por
outros fluidos corporais como: sémen, secreções vaginais, líquido cefalorraquidiano,
sinovial, pleural, peritoneal e amniótico, saliva (procedimentos odontológicos) ou
qualquer fluido corporal contaminado com sangue.
A prestação de primeiros socorros (ex. aluno na sala de aula), a manipulação de
amostras de sangue em laboratório e a limpeza de sangue são outras vias de
exposição e transmissão do VIH.
Os demais vírus manipulados em ambiente Lab2.BSL-3 são todos eles normalmente
transmitidos ao Homem na sequência de uma picada por um mosquito hematófago.
As infeções dão origem a quadros febris agudos, na maioria das vezes, benignos.
6. Sistema AVAC (Aquecimento, ventilação e ar-condicionado)
O laboratório BSL-2 possui um fluxo direcionado de ar que se inicia na porta que o liga ao
corredor e no ventilador - insuflador acima desta. O ar é aspirado direccionalmente para as
zonas de maior segurança. O laboratório BSL-2+ tem pressão negativa e fluxo direcionado
do ar num mínimo de 8-10 trocas de ar por hora. O BSL-3 tem um mínimo de 12 trocas de
26
ar/hora. O volume de ar a circular obtém-se pelo produto do volume da sala pelo número
de trocas de ar desejado. A circulação direcionada e forçada do ar obtém-se através de um
insuflador na parte superior da parede da sala junto à porta de entrada, direcionando o ar
para o extrator que está colocado no extremo oposto da sala e na parte inferior da parede, o
qual deve estar equipado com filtros absolutos esterilizantes que retêm 99,90 % de
partículas de dimensões superiores a 0,3 µm de aerossol, denominados filtros HEPA.
Assim garante-se um fluxo de ar direcionado, do local de entrada dos operadores para o
local de manipulação e ainda um fluxo direcionado do ar no sentido do teto para o chão, o
que impede a inalação de eventuais aerossóis infeciosos que se produzam por acidente.
A aerodinâmica dos laboratórios de confinamento foi estudada de modo a garantir que em
nenhuma situação haja refluxos de ar ou outras saídas de ar da sala por outro local que não
o extrator equipado com filtros HEPA. Estes garantem a esterilidade do ar que é removido
da sala não oferecendo, desta forma, perigo para o ambiente. A capacidade do insuflador e
do extrator e o respetivo balanço deve ser calculado em função da ventilação desejada. A
porta tem na sua parte mais baixa uma abertura com um filtro que retém poeiras mas que
permite a tomada de ar, o qual irá ser direcionado para o ventilador juntamente com o ar
insuflado e nestas condições a pressão no interior da secção de manipulação é negativa
relativamente à secção do laboratório geral. Os três laboratórios encontram-se em
depressão em relação ao exterior: a sala BSL-2 está em depressão em relação ao corredor;
a sala BSL-2+ está em depressão em relação à sala BSL-2, e o BSL-3 está em depressão
em relação à sala BSL-2+.
7. Boas práticas laboratoriais na utilização de câmara de segurança biológica (CSB)
As CSB das classes I, II e III (Anexo I), possuem fluxo de ar forçado, por compressores,
sobre o campo de trabalho e são providas de filtros HEPA com poros de cerca de 0,3 µm,
por onde é filtrado o ar antes de ser lançado no exterior.
As câmaras de classe I são atravessadas por um fluxo de ar aspirado, não-filtrado, através
da janela frontal, promovendo assim a proteção do operador, mas não a do material
manipulado no seu interior, o qual pode ser contaminado pelo operador ou pelo ar
ambiente.
As câmaras de classe II estão sujeitas, na área de trabalho, a um fluxo de ar vertical
previamente filtrado num filtro HEPA e, na região anterior da câmara, a um fluxo de ar
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aspirado através da janela frontal, protegendo assim, quer o operador, quer o material
trabalhado. Podem ser de recirculação (tipo IIA) ou de extração total (tipo IIB).
As câmaras de classe III possuem contenção e extração total e o operador trabalha através
de luvas de borracha incorporadas na janela frontal completamente fechada.
O trabalho nas câmaras de segurança biológica deve obedecer às seguintes normas:
Se é o primeiro do dia a ligar e utilizar a CSB deve ligá-la e esperar 10 minutos antes
de a usar. Verificar sempre se todos os manómetros apresentam os valores
esperados.
Parar imediatamente qualquer manipulação se o exaustor ou a ventoinha falharem.
Na câmara trabalhar a cerca de 10 cm, para dentro, da janela frontal; ou seja
trabalhar para lá da grelha do exaustor.
Nunca colocar nada na câmara que possa obstruir as grelhas dos exaustores. Evite,
igualmente, tapar a grelha com os seus braços.
Minimizar/evitar a utilização de instrumentos que produzam calor dentro das
câmaras.
Não deve usar bicos de Bunsen de chama alta. Usar bicos de Bunsen apenas para
fixar lâminas. Fechar o bico de Bunsen logo após o seu uso.
Descontaminar todo o material antes de o retirar da câmara.
Limpar a câmara com solução de glutaraldeído a 6% (ou hipoclorito a 10%) no final
do trabalho e sempre que exista necessidade, mesmo durante o trabalho.
Na ocorrência de salpicos e pingos deve-se colocar imediatamente algodão ou papel
absorvente embebido em etanol (96%) por cima. De seguida, colocar papel
absorvente embebido em solução de glutaraldeído a 6% (ou hipoclorito a 10%) por
cima e deixar atuar durante 30 minutos. Após este tempo retirar o papel e algodão,
colocar dentro do contentor na câmara e limpar a câmara novamente com solução de
glutaraldeído a 6%.
Desligar a CSB apenas quando tiver a certeza que não irá ser necessária. Se for o
ultimo a utilizar a CSB deve deixar a câmara ligada 5 a 10 min depois desligue-a.
Lâmpadas de luz ultravioleta não são absolutamente necessárias nas CSB. Se forem
utilizadas, devem ser limpas todas as semanas, para retirar o pó e sujidade que
podem bloquear a eficácia germicida dos raios. A intensidade destes deve ser
28
verificada por técnicos qualificados a fim de assegurar que a emissão de luz é
apropriada.
Lâmpadas UV têm de estar desligadas sempre que a sala estiver ocupada de modo a
proteger os olhos e pele da exposição aos raios UV, que podem causar danos sérios
na córnea e cancro de pele.
No caso de utilização de lâmpadas ultravioleta, deve irradiar o interior da câmara
fora do período de trabalho. As lâmpadas devem estar ligadas apenas por períodos de
durante 30 minutos. O tempo excessivo reduz o tempo de vida da lâmpada e após 30
minutos a atividade bactericida decai. As portas da CSB devem estar completamente
fechadas de modo a que não haja exposição a radiações. Se a porta da câmara não
fechar totalmente deve ser vedada.
A CSB pode ser descontaminada/fumigada, periodicamente, com paraformaldeído,
de acordo com as instruções do fabricante. O período mínimo entre
descontaminações é de 6 a 8 meses de modo a não colapsar os filtros.
8. Limpeza, descontaminação e tratamento do material contaminado.
Para a segurança biológica do laboratório é crucial um conhecimento básico de desinfeção
e esterilização. Como os artigos muito contaminados não podem ser desinfetados nem
esterilizados prontamente, é igualmente importante compreender os fundamentos da
limpeza antes da desinfeção (limpeza prévia).
As exigências específicas de descontaminação dependerão do tipo de experiência e da
natureza do agente ou agentes infeciosos manipulados.
O tempo de aplicação de desinfetantes é específico para cada material e fabricante. Assim,
todas as recomendações para a utilização de desinfetantes devem seguir as especificações
dos fabricantes.
Desinfeção – Meio físico ou químico para eliminar microrganismos, exceto esporos
bacterianos ou fúngicos (ex. etanol).
Descontaminação – Qualquer processo de remoção e/ou eliminação de microrganismos.
O mesmo termo é também utilizado para remoção ou neutralização de produtos químicos
perigosos e materiais radioativos.
Esterilização – Processo que elimina e/ou remove todas as classes de microrganismos
incluindo esporos. Pode ser físico (ex. autoclave) ou químico (ex. glutaraldeído a 6%).
29
Depois de terminado o trabalho, e no final do dia, proceder à limpeza e
descontaminação da bancada e à descontaminação/esterilização do material
utilizado.
O material de uso único é rejeitado para sacos de autoclave colocados em
contentores amarelos sendo enviados para inceneração no final do dia. A
inceneração é o melhor método de eliminação do material contaminado de uso único
(desde que não reativo).
O material reutilizável é colocado em contentores resistentes ao autoclave para ser
descontaminado e só depois lavado e novamente esterilizado. Colocar sempre todo o
material num contentor plástico, metálico ou vidro, próprio para a
descontaminação/esterilização química (glutaraldeído a 6% ou solução de
hipoclorito de sódio a 1g/l) e física (autoclave a 121ºC, 30 minutos ou forno de
Pasteur a 170ºC, 1 hora).
Para descontaminação de material contaminado com ADN (ex. pontas de
micropipeta) utiliza-se soluções de hipoclorito de sódio.
Para procedimentos que envolvam extração de ácidos nucleicos/proteínas não usar
hipoclorito de sódio uma vez que os reagentes presentes nos Kits são incompatíveis
com hipoclorito de sódio.
As bancadas devem ser descontaminadas com uma solução de hipoclorito de sódio
(1g/l, 1000ppm) ou com álcool a 70% ou preferencialmente com o detergente
bactericida (glutaraldeído a 2%) ou tuberculocida (glutaraldeído a 6%) fornecido.
O hipoclorito de sódio tem um efeito corrosivo sobre os metais pelo que deve ser
substituído por outro desinfetante (glutaraldeído, por exemplo), sempre que a
bancada seja metálica.
Para a desinfeção das superfícies de trabalho, balanças, suportes de centrífuga, pode
usar-se apenas álcool a 70%.
O glutaraldeído a 6% é a solução utilizada para esterilizar, por imersão durante 30
minutos, rotores de centrífuga ou sistemas óticos de lentes.
A tabela 6 apresenta as características dos principais grupos de desinfetantes utilizados.
30
Tabela 6: Propriedades de alguns desinfetantes a
a +++, Bom; ++, Razoável; +, Fraco; -, Nulo; v, depende do vírus; C, catiónico; A, aniónico; NA, não aplicável. b cerca de 40ºC. c cerca de 20ºC.
Ativo contra
Inativado por Toxicidade
Bactérias
Fungos Gram-
positivas
Gram-
negativas Micobactérias Esporos
Vírus
lipídicos
Vírus não
lipídicos Proteínas
Materiais
naturais
Materiais
sintéticos Água dura Detergentes Pele Olhos Pulmões
Compostos
fenólicos +++ +++ +++ ++ - + v + ++ ++ + C + + -
Hipocloritos + +++ +++ ++ ++ + + +++ + + + C + + +
Álcoois - +++ +++ +++ - + v + + + + - - + -
Formaldeído +++ +++ +++ +++ +++b + + + + + + - + + +
Glutaraldeído +++ +++ +++ +++ +++c + + NA + + + - + + +
Iodóforos +++ +++ +++ +++ + + + +++ + + + A + + -
30
31
9. Manutenção de equipamento laboratorial
Os autoclaves e as CSB precisam de ser validados com métodos apropriados, antes de
serem utilizados. A manutenção deve ser feita com intervalos periódicos, segundo as
instruções do fabricante. Deve pedir-se a revisão periódica (semestral ou pelo menos
anual) do funcionamento das CSB, estufas, autoclaves e sistemas de AVAC por pessoal
qualificado. Os filtros devem ser mudados e a circulação do ar monitorizada, sempre que
seja necessário.
10. Atitudes perante o acidente
Numa tentativa de permitir uma resposta rápida e eficaz perante situações de acidente
laboratorial, em todos os laboratórios (ou pelo menos acessível a quem neles trabalha)
deverá existir um kit para emergências, designado vulgarmente por spill kit. Este deve
integrar, tanto quanto possível:
• Lixívia concentrada ou qualquer outro composto eficaz contra M. tuberculosis
• Um aspersor (pulverizador) com uma solução a lixívia a 10% ou com as diluições
indicadas dos bactericidas /virucidas disponíveis
• Pinças (longas), forceps, vassouras e pás, ou qualquer outros instrumentos para
remoção mecânica de fragmentos de vidros, ou outros recipientes contendo agentes
infeciosos/químicos. Todos estes materiais devem ser passíveis de descontaminação
(ex. por autoclavagem)
• Papel ou qualquer outro material absorvente, descartável
• Vestuário de proteção pessoal, idealmente descartável
• Sacos para transporte/eliminação de material biológico (autoclaváveis)
É importante não minimizar o problema. Deve manter a calma e agir serena mas
conscientemente. Não minimize, no entanto, o problema, nem impute a resolução do
mesmo a outro operador.
Caso ocorra picada, corte, contaminação da pele por projeção ou derrame de material
infecioso deve:
Fazer sangrar a ferida, se existir, e lavar a região afetada com água e sabão.
Caso ocorra derrame de material infecioso numa superfície deve:
32
Parar imediatamente o trabalho e alertar os colegas que se encontrem dentro do
laboratório.
Cobrir o produto derramado com papel ou pano absorvente. Verter sobre o papel, ou
sobre o pano lixivia ou glutaraldeído a 6% (ou hipoclorito a 10%) e deixar atuar,
pelo menos, durante 30 minutos.
Recolher o papel ou o pano com a ajuda de outro papel ou pano (com as mãos
protegidas com luvas) para um contentor de material contaminado.
Se o derrame contaminou folhas de registo, colocá-las também no contentor de
contaminados depois de copiar os dados para nova folha.
Caso ocorra derrame de material infecioso no interior de uma CSB deve:
Parar de trabalhar, manter a CSB ligada.
Cobrir o derrame com papel absorvente embebido em desinfetante (conforme
descrito anteriormente) e deixar atuar durante 30 minutos. O saco do contentor deve
ser fechado e autoclavado.
Relatar o acidente ao Diretor da UEI, assim como aos responsáveis pela
Biossegurança no IHMT e registar no livro de ocorrências.
Caso ocorra produção de aerossol em espaço não confinado deve:
Conter a respiração por breves instantes, durante os quais deve abandonar a sala e
avisar o responsável. As batas que se encontram próximas do acidente devem ser
retiradas para descontaminação posterior.
Durante l hora ninguém deve entrar na sala.
Depois 1 hora de intervalo, uma pessoa protegida com bata, máscara, óculos e luvas
deverá proceder à descontaminação das superfícies contaminadas com solução
desinfetante adequada (hipoclorito a 10% ou glutaraldeído a 6%) e à recolha do
material (frasco partido, papéis contaminados, batas e luvas de quem estava
próximo) com pinças ou pás, que deve ser colocado num saco ou contentor
específico e submetido depois a autoclavagem.
Caso ocorra quebra de tubos durante a centrifugação deve:
Esperar, pelo menos, 30 minutos após a paragem da centrífuga, para a abrir. A
abertura deve ser feita dentro da CSB, com máscara e luvas colocadas.
33
Recolher o tubo partido com a ajuda de uma pinça, evitando assim, cortes acidentais.
Descontaminar o tambor da centrífuga com glutaraldeído a 6% e imergir o rotor da
centrífuga nessa solução durante 30 minutos.
Por fim, fazer uma lavagem final de todo o material só com água destilada.
Colocar os restos do tubo partido num contentor para descontaminação.
Caso ocorra derrame ou ingestão de produtos químicos deve:
Lavar abundantemente a área afetada com água corrente, para diluir a concentração
do agente, em particular se o acidente se der ao nível dos olhos.
Se o acidente se der ao nível dos olhos, não os deve esfregar.
Em casos graves consultar por via telefónica o serviço de emergência da sua área
(Intoxicações: tel. 808 250 143) e seguir as instruções recebidas. Em alternativa
contacte o Instituto Nacional de Emergência Médica (213 508 100) ou ligue 112
(emergências).
Caso ocorra inflamação (fogo) do vestuário pessoal ou de terceiros deve:
Impedir que o sinistrado corra ou sopre as chamas para não atear o incêndio no local
de trabalho.
Fazer com que o indivíduo se deite no chão e recorrer a um cobertor ou qualquer
peça de vestuário próxima, para o envolver, o mais rapidamente possível.
Na impossibilidade de recurso à manta ou ao cobertor usar o extintor ou o chuveiro
mais próximos, com o cuidado de não direcionar o extintor para os olhos do
indivíduo.
Consultar, por via telefónica, o serviço de emergência da sua área (Bombeiros tel. 21
342 22 22/21 392 47 00 ou 112 que liga aos bombeiros), e seguir as instruções com
recurso, se necessário, à caixa de primeiros socorros.
Caso ocorra um incêndio declarado no local de trabalho deve:
Alertar rapidamente o pessoal e usar sempre os extintores portáteis de pó químico
seco, evitando o recurso à água para que o impacto desta no foco não o espalhe,
sobretudo em casos que envolvam líquidos imiscíveis com a água e aparelhos
elétricos.
34
Tomar as medidas adequadas no combate rápido às chamas: delimitar a área de fogo
e desligar o quadro elétrico principal.
Se não for possível circunscrever e apagar o incêndio com os meios disponíveis,
prevenir os bombeiros (21 342 22 22/21 392 47 00 ou 112 que liga aos bombeiros) e
organizar a evacuação calma e ordenada do edifício.
Tendo em consideração que, hoje em dia, as abordagens que impliquem a extração e
amplificação de ácidos nucleicos são cada vez mais utilizadas nos laboratórios em que se
manipulam microrganismos, é frequente que nestes, ou em laboratórios contíguos, existem
espaços dedicados às manipulações que impliquem a utilização de EtBr.
O EtBr é um agente intercalante, o qual, uma vez irradiado com luz UV, emite
fluorescência vermelho-alaranjada, o que permite a identificação, por exemplo, a
visualização dos ácidos nucleicos enquanto “bandas” num gel de agarose. Embora, hoje
em dia, na maioria das manipulações em que tem vindo a ser utilizado, possa ser
substituído por outros compostos menos tóxicos, certo é que ainda é comummente
utilizado. Porém, o EtBr é tóxico e carcinogénico, pelo que deve ser manipulado com
cuidado. A sua utilização exige a proteção obrigatória do operador com bata e luvas.
Caso o EtBr entre em contacto com os olhos deve:
Lavá-los imediatamente, durante pelo menos 15 minutos, com quantidade abundante
de água.
Caso o brometo de etídeo entre em contacto com a pele deve:
Lavar a zona afetada com água e sabão abundante. Não use solventes orgânicos (ex.
isopropanol) pois desidratam a pela e permitem uma absorção mais rápida do EtBr
remanescente.
Caso ocorra um derrame de soluções contendo EtBr sobre uma superfície deve:
Absorver o excesso de líquido com material absorvente (ex. papel).
Absorver o restante derrame com papel embebido em etanol/isopropanol ou/e cubra
a superfície contaminada com carvão ativado em pó.
Usar papel absorvente para remover a maior parte do derrame restante.
Lave com água abundante.
Coloque o lixo num contentor para incineração (não autoclave).
35
10.1. Procedimentos a adotar perante exposição acidental a Mycobacterium
tuberculosis
Sempre que aconteça um acidente no laboratório capaz de originar a infeção do técnico
pelo produto manipulado, através da produção de aerossóis, da contaminação da pele e
mucosas ou da produção de soluções de continuidade na pele e mucosas:
Conter a respiração mesmo com máscara.
Isolar a zona afetada tapando com papel absorvente e cobrir com detergente
tuberculocida (glutaraldeído a 6%).
Abandonar o local.
Deixar que o sistema de exaustão de ar retire todos os aerossóis por pelo menos 1
hora (8 a 12 renovações de ar).
Quebra de tubos na centrífuga. Deixar repousar 30 minutos antes de abrir a tampa
sempre equipada com luvas, máscara e óculos. Descontaminar a centrífuga e o rotor
com detergente tuberculocida (glutaraldeído a 6%).
O indivíduo afetado deve receber os cuidados médicos necessários e deverá ficar sob
observação cuidada. Deve ser colhido soro nesse dia e cerca de 15 dias depois (período
variável com o agente suspeito em causa) para que seja possível detetar a seroconversão,
em caso de infeção.
Se o indivíduo for tuberculina-negativo:
1) Fazer um teste de tuberculina após o acidente.
2) Repetir o teste, pelo menos 15 dias depois, se o resultado for negativo.
3) Se houver conversão, i.e., se o teste for positivo, é necessária avaliação médica e
eventual tratamento.
Se o indivíduo for tuberculina-positivo, a atitude terapêutica dependerá do resultado da
avaliação clínica apoiada nos exames complementares de diagnóstico.
10.2. Procedimentos a adotar perante exposição acidental a vírus patogénicos
Os procedimentos de emergência, traduzido por um contacto acidental entre sangue ou
material potencialmente infetado por vírus patogénicos e os olhos ou boca devem ser os
seguintes:
Lavar várias vezes abundantemente com soro fisiológico durante 5 minutos.
Contactar o Serviço de Doenças Infeciosas do Hospital Egas Moniz e solicitar
informações sobre o como proceder.
36
Contactar os responsáveis da biossegurança no IHMT (em particular o Doutor José
Marcelino, responsável direto pelo Lab2.BSL-3, a quem o incidente em questão
deverá ser reportado como acidente de trabalho.
No caso de efetuar um corte ou picada deve proceder-se da seguinte forma:
Não apertar o local da picada ou corte.
Lavar com sabão e água.
Passar com etanol a 70%.
Contactar o Serviço de Doenças Infeciosas do Hospital Egas Moniz para solicitar
informação sobre como atuar.
Contactar o responsável de biossegurança do Lab2.BSL3 (José Marcelino).
Elaborar um relatório sobre o acidente de trabalho.
Todos os acidentes e procedimentos de risco inscritos (ou não) neste manual devem ser
registados no livro de registos (está no laboratório) e comunicados ao Diretor da UEI e aos
responsáveis pela Biossegurança no IHMT.
11. Vigilância da saúde de quem trabalha em ambiente laboratorial
A entidade empregadora, através do Diretor da UEI (ou do(s) responsável(eis) pela
Biossegurança no IHMT), tem de assegurar uma vigilância apropriada da saúde do pessoal
do laboratório. O objetivo desta vigilância é controlar o aparecimento de doenças do
trabalho.
Para o efeito deve:
1. Proceder à vacinação ativa ou passiva, sempre que pertinente;
2. Facilitar a deteção precoce das infeções adquiridas no laboratório;
3. Excluir as pessoas altamente suscetíveis (grávidas e imunocomprometidos) de trabalhos
laboratoriais de alto risco;
4. Fornecer equipamento e meios de proteção pessoal eficazes.
Diretivas para a vigilância do pessoal de laboratório que manuseia microrganismos de
Nível 1 de segurança biológica:
A experiência mostra que não é provável que os microrganismos manuseados a este nível
causem doença no Homem ou doença animal de importância veterinária. Contudo, todo o
pessoal de laboratório deve ser submetido a um controlo de saúde antes de assumir as suas
funções, onde se regista a sua história médica. É aconselhável a notificação imediata de
37
doenças ou acidentes laboratoriais e deve chamar-se a atenção de todo o pessoal para a
importância de manter boas técnicas de microbiologia.
Diretivas para a vigilância do pessoal de laboratório que manuseia microrganismos de
Nível 2 de segurança biológica:
1. É necessário um controlo de saúde antes de assumir as suas funções. Deve registar-se a
história médica da pessoa e efetuar-se uma avaliação centrada na saúde ocupacional.
2. A administração do laboratório deve manter registo de doenças e ausências.
3. Os objetivos dos programas de vigilância médica do pessoal para os laboratórios de base
– Nível 1 e 2 de segurança biológica também se aplicam aos laboratórios de confinamento
– Nível 3 de segurança biológica, exceto nos seguintes casos:
4. O exame médico de todo o pessoal de laboratório, que trabalha em laboratórios de
confinamento – Nível 3 de segurança biológica, é obrigatório. Este exame deve incluir o
registo da história clínica detalhada e um exame físico centrado na profissão.
5. Após um exame clínico satisfatório, o agente recebe um cartão de contacto médico
mencionando que o portador trabalha numa unidade equipada com um laboratório de
confinamento – Nível 3 de segurança biológica. Este cartão deve conter uma fotografia do
portador, ter formato de bolso/carteira e estar sempre na posse do portador. O nome da
pessoa a contactar tem de ser definido no laboratório, e deve incluir o(s) responsável(eis)
pala Biossegurança, o Diretor de UEI, e o médico assistente.
Deve-se proceder conforme especificado abaixo:
É obrigatório a apresentação de um atestado de robustez física e psíquica adequada
ao exercício das funções a desempenhar.
O pessoal do laboratório deve ser sujeito no início a um exame clínico, a uma
radiografia do tórax e Prova de Mantoux (teste de tuberculina).
Todo o pessoal deve ser sujeito a um teste de tuberculina antes de começar a
trabalhar no laboratório de micobactérias. Os indivíduos tuberculina-positivos,
devem ser submetidos a exame médico.
Nenhum técnico deste laboratório deverá sofrer de doenças imunodepressoras ou
estar sujeito a terapêutica imunodepressora.
Anualmente deve ser feita uma revisão do estado de saúde com radiografia do tórax
e exame médico. O teste de tuberculina deve ser repetido todos os 6 meses no
pessoal tuberculina-negativo.
38
Para além das vacinas consideradas obrigatórias pelo Serviço Nacional de Saúde, o
pessoal do laboratório deve ser protegido com a vacina contra a hepatite B.
Fique atento a qualquer alteração no seu quadro de saúde dos seus colegas, tais
como: gripes, alergias, diarreias, dores de cabeça, enxaquecas, tonturas, mal-estar em
geral, etc…. comunique imediatamente ao(s) responsável(eis) pela Biossegurança
e/ou ao Diretor de UEI.
12. Transporte à distância (avião) de produtos potencialmente infeciosos
O transporte de materiais infeciosos e potencialmente infeciosos está sujeito a
regulamentação nacional e internacional. Esta regulamentação descreve a utilização
apropriada de materiais de acondicionamento, assim como outros requisitos de expedição.
Todos os funcionários envolvidos em atividades de índole laboratorial e aos quais seja
solicitado o envio de amostras biológicas contendo agentes infeciosos deve fazê-lo
obedecendo segundo os regulamentos aplicáveis a transporte. Assim deve-se garantir a
redução da probabilidade das embalagens sofrerem danos e deixarem escapar algum
conteúdo, o que leva a uma redução de exposições que resultem em infeções possíveis e
uma melhor eficiência no transporte de embalagens.
O envio à distância dos produtos pelo correio, por avião ou por outros meios de transporte
deverá obedecer às normas estabelecidas pela Comissão de Especialistas no Transporte de
Mercadorias Perigosas da ONU, pela Associação de Transportes Aéreos Internacionais,
pela União Postal Universal, pela Organização da Aviação Civil Internacional e pela OMS.
Atenção que:
Os contentores destinados ao transporte dos produtos devem ser estanques e
inquebráveis.
A sua superfície externa deve ser limpa com um desinfetante, como por exemplo,
hipoclorito de sódio a 0,1%, após o seu fecho e antes da sua abertura, já no
laboratório e se possível dentro da CSB.
A amostra deve ser colocada num recipiente estanque (embalagem primária), bem
fechado. Este deve ser à prova de fuga e devidamente selado. Neste deve estar
indicado o nome da substância a transportar. Caixas de Petri não servem de
recetáculos primários. Culturas (ex. bacterianas) ou stocks virais (suspensões virias)
devem ser enviadas dentro de recetáculos primários em ampolas seladas.
39
O recetáculo primário deve ser envolvido por material absorvente (algodão, papel ou
outro), capaz de reter a totalidade do líquido derramado em caso de acidente com
quebra do recipiente, deve ser colocado num segundo contentor (embalagem
secundária), resistente e estanque.
O transporte do contentor secundário deve ser feito dentro de uma embalagem sólida
que proteja o conteúdo de danos físicos, durante o transporte. Esta barreira (terciária)
deve ser rígida (resistente a um diferencial de 95kPa entre o exterior e o interior)
com pelo menos uma face com superfície superior a 100x100 mm. Deve ser incluída
uma descrição por item dos materiais a transportar entre a barreira secundária e
terciária. Nesta última devem ser devidamente colocados os símbolos indicados ao
tipo de material a transportar. Quando usado, o gelo seco deve encontrar-se entre a
barreira secundária e terciária, a qual deve permitir a saída de vapor de CO2.
A identificação da amostra enviada deve figurar no exterior dos recipientes primário
e secundário (Anexo II). Para além desta identificação, toda a embalagem contendo
material biológico potencialmente infecioso deverá ser obrigatoriamente etiquetada
com o símbolo específico internacionalmente definido (símbolo de perigo biológico,
Figura 1).
Figura 1. Símbolo internacional para substâncias infeciosas ou agentes patogénicos.
As amostras biológicas contendo microrganismos patogénicos devem,
adicionalmente, ser identificadas com a respetiva categoria UN (United Nations)
correspondente.
São substâncias Infeciosas da classe A aquelas que contêm agentes biológicos
suscetíveis de causar debilitação permanente ou morte de Humanos e outros animais
saudáveis que a eles venham a ser expostos acidentalmente. São incluídas nas
categorias UN 2814 se esses agentes patogénicos afetarem o Homem (possivelmente
outros animais) ou UN 2900 se o Homem não for afetado.
40
Substâncias Infeciosas da classe B todas as que contêm agentes biológicos
infeciosos que não causam doença debilitante ou fatal nos humanos ou animais a eles
expostos. Incluem a maior parte dos espécimes para diagnóstico e são incluídas na
categoria UN 3373.
O gelo seco, frequentemente utilizado para garantir a viabilidade dos agentes
biológicos presentes numa dada amostra deve ser identificado, na embalagem de
transporte, com o código UN 1845.
As quantidades máximas de materiais contendo agentes infeciosos que podem ser
transportados por via aérea são 50 ml ou 50 g (substâncias infeciosas da classe A em
avião de passageiros), 4 L ou 4 kg (substâncias infeciosas da classe A em avião de
carga), 4 L ou 4 kg (substâncias infeciosas da classe B em avião de passageiros ou
carga). A quantidade máxima de gelo seco que pode ser utilizada deverá ser inferior
a 200 kg.
13. Laboratório de Bioquímica
O laboratório de Bioquímica deve ser entendido num contexto vasto que englobe todos os
manuseamentos e operações a efetuar no âmbito de trabalhos de Genética, Bioquímica e
Química. Em qualquer dos casos, seja qual for o microrganismo ou extrato deste com que
se trabalhe, o material deve ser tratado como contaminado e todo o produto biológico deve
ser considerado potencialmente infecioso e manipulado como tal.
Ao iniciar o trabalho no laboratório de Bioquímica devem ser avaliados os riscos
potenciais para a segurança pessoal, de terceiros e do laboratório. Toda a operação
que ofereça perigo de libertação de vapores tóxicos ou de poeiras irritantes deve ser
efetuada na hotte química.
Avaliar sempre a necessidade de uso de óculos de proteção e de luvas.
Todos os recipientes do laboratório, incluindo as tinas, balões, tabuleiros e outros,
devem estar rotulados. No caso de conterem líquidos corrosivos,
inflamáveis/explosivos, radioativos ou tóxicos/carcinogéneos, estes recipientes
devem estar assinalados com o símbolo próprio (ver lista de símbolos, no final do
capítulo).
A forma mais expedita de diminuir o risco de acidente com um produto químico
consiste no recurso à sua solubilização/diluição. Assim, devem lavar-se os
recipientes ou eventuais derrames, com água abundante, exceto no caso de produtos
41
químicos incompatíveis com a água, como o sódio e o potássio elementares, bem
como os hidretos metálicos que reagem com a água libertando hidrogénio que pode
entrar em ignição e explodir.
Nunca deixar os frascos abertos; recolocá-los no seu devido local após a utilização e
nunca colocar recipientes pesados ou com líquidos inflamáveis ou corrosivos a
níveis elevados.
Não deixar os bicos de Bunsen, as bombas de vácuo ou as garrafas de gás em
utilização abandonados durante longos períodos de tempo. Fazer vistorias regulares
ao material em utilização.
Resíduos de fenol e halogéneos devem ser colocados no contentor próprio localizado
na hotte química.
Desocupar a área de trabalho de material desnecessário, efetuar montagens seguras e
estáveis e recorrer à hotte sempre que se avalie necessário. A área de trabalho deve
ser coberta com papel absorvente sobre papel de alumínio e limpa sempre que
houver um derrame.
Se o trabalho envolver materiais altamente inflamáveis verificar se não existem nas
proximidades fontes de ignição ou de eletricidade estática.
Armazenar os reagentes segundo um esquema prévio, de modo a evitar
incompatibilidades explosivas.
Deverá haver um armazém central, dotado de um ficheiro alfabético, onde os
reagentes inflamáveis, tóxicos, explosivos, oxidantes, corrosivos, sensíveis à água,
gases e substâncias radioativas estejam separados e identificados. O armazenamento
no mesmo local de líquidos inflamáveis e de outros produtos (sobretudo agentes
oxidantes como os óxidos, peróxidos e cloratos que podem iniciar reações de
combustão) é desaconselhado devendo estes ser isolados num armário ou armazém à
prova de fogo, longe de fontes de ignição, bem ventilado e dotado de equipamento
de emergência.
Tomar cuidados especiais no manuseamento de soluções contendo EtBr o,
grandemente utilizado em genética e que é um potente carcinogéneo/mutagéneo.
Deve haver um locar próprio para o seu manuseamento, devidamente referenciado e
revestido de papel absorvente, tal como todos os materiais que entrem em contacto
com soluções desta substância devem ser assinalados com a abreviatura EtBr (ou
BE), bem visível.
42
Soluções com brometo de etídio não devem ser deitadas diretamente na canalização.
Este deve ser inativado com carvão ativado e só depois descartado.
Estes materiais e soluções só podem ser manuseados com luvas. A descontaminação
dos locais onde ocorram derrames extensos deve ser efetuada de acordo com
protocolos específicos referenciados nos manuais da especialidade, devendo por isso
qualquer acidente ser comunicado ao responsável pelo laboratório para que aquela se
inicie de imediato.
Instruções importantes:
Ter cuidado redobrado com a utilização dos éteres, dioxano e tetrahidrofurano, e
outras substâncias com o grupo éter, pois são muito suscetíveis à oxidação pelo ar,
com formação de peróxidos instáveis que podem detonar com enorme violência.
Os produtos oxidantes como os óxidos, os peróxidos, nitratos e nitritos, dicromatos,
cloratos, percloratos e permanganatos podem iniciar reações de combustão e
portanto não devem ser guardados juntamente com produtos explosivos,
combustíveis, redutores e desidratantes.
Na pág. 43 é apresentada uma lista de produtos químicos incompatíveis mais utilizados
nos nossos laboratórios (NOTA: A lista não é completa e não exclui a consulta de outros
manuais e/ou o índex MERCK-QUIMICA para os restantes casos de produtos
incompatíveis.). No final apresenta-se os símbolos de perigo associados aos diversos
produtos químicos.
43
LISTA DE PRODUTOS QUIMICOS MAIS UTILIZADOS NOS LABORATÓRIOS DO
IHMT
PRODUTO PRODUTO INCOMPATÍVEL
Acetona Ácido nítrico e sulfúrico.
Ácido acético Ácido crómico, nítrico, hidróxidos, polietilenoglicois,
peróxidos, permanganatos e percloratos.
Ácido nítrico Ácido acético, acetona, álcool, anilina, todos os
produtos hidrogenados, inflamáveis, nitráveis, cobre,
latão e metais pesados.
Ácido sulfúrico Água, cloratos, percloratos, permanganatos e
carbonatos.
Anilina Ácido nítrico, peróxidos.
Carvão activado Hipocloritos e todos os agentes oxidantes.
Cobre Acetileno, peróxido de hidrogénio.
Flúor Isolar de todas as outras substâncias.
Hidrocarbonetos e solventes
orgânicos
Flúor, cloro, ácido crómico e peróxidos.
Hidróxido de sódio ou potássio Água e ácidos.
Líquidos inflamáveis Nitrato de amónio, peróxidos, ácido nítrico e
halogéneos.
Metais alcalinos Água, dióxido de carbono, hidrocarbonetos clorados.
Percloratos Ácidos e materiais combustíveis.
Peróxido de sódio Todas as substâncias oxidáveis, solventes orgânicos,
ácidos e acetatos.
*NOTA: Muitos detergentes comerciais possuem percentagens elevadas de amoníaco,
de modo que nunca devem ser misturados com lixívia (hipoclorito de sódio).
Nota: Uma vez que o trabalho com produtos radioativos foi descontinuado, este não irá ser
abordado nesta edição, pelo que caso seja necessário deverá consultar a 1ª edição deste
manual que contínua disponível no laboratório.
44
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45
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46
Anexo I
Esquema das Câmaras de Segurança Biológica de Fluxo Laminar Vertical
CSB –
Classe
e tipo
Tipo de protecção
microbiológica
Ar
recirculado/
expelido
Esquema Legenda
I
- Operador
-Microrganismos
do grupo de risco
1 e 2
0/100
A – Abertura frontal
B – Painel em vidro para
observação
C – Filtro HEPA de exaustão
D – Filtro HEPA de insuflação
E – Ventoinha
Ar esteril
Ar contaminado
IIA1
IIA2
- Operador e
produtos
- Microrganismos
do grupo de risco
1 a 3
70/30
IIB1
IIB2
- Operador e
produtos
- Microrganismos
do grupo de risco 1-
3
30/70
0/100
III
-Operador e
produto
-Microrganismos
do grupo de risco 4
0/100
47
Anexo II
Esquema da embalagem e etiquetagem para o envio de agentes patogénicos
48
Anexo III
SÍMBOLOS DE PERIGO
PERIGO! PRODUTO RADIOACTIVO!
PERIGO! PRODUTO TÓXICO!
PERIGO! PRODUTO EXPLOSIVO!
PERIGO! PRODUTO INFLAMÁVEL!
49
PERIGO! PRODUTO CORROSIVO!
50
Instituto de Higiene e Medicina TropicalUniversidade NOVA de Lisboa
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