MANUAL DE AULAS PRTICAS DE MICROBIOLOGIA
Ana Mendes Ferreira, Antnio Ins, Maria Jos Saavedra, Arlete Mendes Faia
Universidade de Trs-os-Montes e Alto Douro
2009
Manual de aulas prticas de Microbiologia
Universidade de Trs-os-Montes e Alto Douro Pgina 2
1 - NORMAS A ATENDER NUM LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA
As aulas prticas visam ensinar aos alunos as metodologias utilizadas num laboratrio de
Microbiologia. Nessas aulas sero utilizados vrios grupos de microrganismos, bactrias e fungos,
alguns dos quais podero ser patognicos pelo que os alunos devem seguir um conjunto de regras
de modo a evitar qualquer tipo de contaminaes.
1 - A roupa deve ser sempre protegida por uma bata ;
2- No fumar nem comer no laboratrio. No levar boca qualquer objecto nomeadamente lpis,
canetas, etc. No humedecer etiquetas com a boca;
3 - Manter a superfcie da bancada livre de todo o material que no for utilizar durante a
experincia;
4 - Antes de iniciar qualquer trabalho bem como ao termin-lo lavar e desinfectar as mos;
5 - Desinfectar a superfcie da bancada que ir utilizar com lcool a 70%, antes e aps a execuo
do trabalho;
6 - Evitar que objectos ou produtos inflamveis fiquem prximos da chama;
7 - Todo o material usado (pipetas, lminas, lamelas, etc...) deve ser colocado dentro do
recipiente com desinfectante colocado na bancada para o efeito. As placas de Petri sero
colocadas dentro do balde para posterior inactivao;
8 - O estudante com cabelos longos deve apanh-los, sobretudo quando o trabalho exige a
utilizao do bico de Bunsen, de forma a no os queimar.
9 - Comunicar imediatamente ao professor caso entorne alguma cultura ou efectue aspiraes
indevidas ;
10 - Comunicar imediatamente qualquer acidente do gnero corte, queimadura, etc.
11 - Nunca esquecer de flamejar as ansas antes de as guardar no suporte.
12- Antes de utilizar qualquer aparelho deve ler as normas de utilizao;
13 - O microscpio deve ser manuseado com cuidado :
a) Guardar a capa debaixo da bancada e voltar a coloc-la no final;
b) As lminas j observadas devem ser colocadas dentro do recipiente que est em cima da
bancada para o efeito;
c) S dever remover a lmina da platina, depois deslocao da objectiva;
Manual de aulas prticas de Microbiologia
Universidade de Trs-os-Montes e Alto Douro Pgina 3
d) Nunca deixar a lente de imerso suja de leo, limpando-a com o leno de papel seco,
depois com o leno embebido em xilol e novamente com o leno seco.
14 - No misturar material conspurcado com o material esterilizado.
15 - Durante os trabalhos prticos evitar falar e deslocar-se desnecessariamente.
16 - Etiquetar cuidadosamente as culturas antes de as colocar na estufa.
2- MATERIAL UTILIZADO NUM LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA
Microscpio- amplifica e ilumina objectos tal como bactrias e outros microrganismos que de outro
modo seriam invisveis;
Autoclave - equipamento destinado esterilizao de materiais e meios de cultura utilizados em
Microbiologia, por vapor de gua sob presso;
Estufas- equipamento para esterilizar material de vidro (forno de Pasteur), com temperaturas
mximas at 180-200C; para incubaes, 5C acima da temperatura ambiente, com temperaturas
mximas de 70-100C;
Incubadora- equipamento de temperatura controlada (0 a 50C) para cultivo de microrganismos;
Jarra de anaerobiose- cmara que permite remover o oxignio do ar, substituindo-o por outro gs,
para crescimento de microrganismos anaerbios;
Caixas de Petri- caixas de vidro com tampa rasa, onde se colocam os meios de cultura slidos
(Placa de Petri) para o crescimento dos microrganismos;
Tubos de cultura- tubos de vidro para o cultivo dos microrganismos em meios lquidos e slidos;
Tubos Durham- tubos de vidro de dimenses reduzidas utilizados para o aprisionamento do gs
produzido pelos microrganismos, em meios lquidos;
Pipetas- utilizadas para transferncias de lquidos, inoculaes, etc. Devem ter um tampo de
algodo na extremidade superior;
Micropipetas- utilizadas para transferncias de lquidos, inoculaes, quando se pretendem
volumes muito reduzidos;
Lminas e lamelas- para observaes ao microscpio;
Cmaras de contagem- lminas de vidro padronizadas e desenhadas para permitirem a contagem
de microrganismos totais numa suspenso;
Manual de aulas prticas de Microbiologia
Universidade de Trs-os-Montes e Alto Douro Pgina 4
Ansas e agulhas instrumento com um fio de platina, enrolado ou recto, esterilizvel chama
antes e aps utilizao, usado para transferir culturas de microrganismos;
Para alm deste material, h outro tipo de equipamento que necessrio ter num laboratrio de
Microbiologia nomeadamente frigorfico, balana, aparelho de destilao e desionizao de gua,
banho-maria, centrfuga, agitadores magnticos, filtros de esterilizao.
3- LIMPEZA E PREPARAO DE MATERIAL
Num laboratrio de Microbiologia devem ser mantidas condies de higiene apropriadas na medida
em que se trabalha com uma grande variedade de microrganismos, alguns dos quais podero ser
patognicos.
O cho deve ser lavado e desinfectado diariamente;
As bancadas e todas as superfcies devem ser convenientemente desinfectadas com lcool a 70%;
As placas de Petri com culturas devem ser previamente esterilizadas (121C durante 20-25 min.)
para inactivao das culturas. Aps a esterilizao o meio de cultura escorrido e as caixas so
lavadas com gua e detergente e posteriormente mantidas algumas horas nesta soluo. Depois
so escorridas, passadas por gua da torneira, e no fim por gua destilada. As caixas so
embrulhadas em papel e esterilizadas a 180C durante 2 horas num forno de Pasteur;
Os tubos com culturas so submetidos ao procedimento descrito anteriormente. So esterilizados
a 180C durante 2 horas num forno de Pasteur. Quando contm meios de cultura so esterilizados
em autoclave a 121C durante 15 min.
As pipetas so lavadas com gua corrente e posteriormente mantidas algumas horas numa
soluo com detergente. Depois so escorridas, passadas por gua da torneira, e no fim por gua
destilada. Depois de secas, coloca-se um tampo de algodo na parte superior. So colocadas em
caixas apropriadas ou embrulhadas em papel antes da esterilizao a 180C durante 2 horas num
forno de Pasteur;
As lminas e lamelas utilizadas nas observaes ao microscpio so colocadas numa soluo com
detergente. Depois de lavadas devem ser colocadas numa mistura cromo-sulfrica durante a noite
e posteriormente lavadas.
Notas importantes:
Flamejar as ansas antes e depois do contacto com as culturas. Deixar arrefecer a ansa antes de
tocar na colnia da cultura;
Manual de aulas prticas de Microbiologia
Universidade de Trs-os-Montes e Alto Douro Pgina 5
Flamejar as aberturas dos tubos de ensaio, aps a abertura e antes da colocao da tampa.
Manter a tampa na mo por presso do dedo mnimo;
A abertura da tampa da placa de Petri deve ser cuidadosa, devendo ser manuseada junto
chama.
4 - PREPARAO DE MEIOS DE CULTURA
O crescimento microbiano est dependente da presena de gua e de nutrientes indispensveis
biossntese de material celular e obteno de energia. As exigncias nutritivas e as condies
ambientais que asseguram o crescimento so dependentes do tipo de microrganismo. No cultivo
de microrganismos so utilizadas solues de substncias que funcionam como nutrientes
necessrios ao seu crescimento e multiplicao celular. Estas solues designadas por meios de
cultura tm uma composio varivel com as exigncias nutricionais de cada espcie. Os meios de
cultura podem ser lquidos (caldo), semi-slidos ou slidos (1,5 a 2% de agar). O agar um
agente gelificante, de baixo valor nutritivo, extrado de algas marinhas, que se liquefaz a 100C e
solidifica a 40C. Quanto composio qumica, so designados por meios sintticos quando
quimicamente definidos; e complexos - com composio qumica desconhecida (com extracto de
levedura, extracto de carne, extracto de malte, peptona, ou triptona, por exemplo). Quanto
funo, os meios de cultura podem ser: meios de enriquecimento formulados para permitirem o
crescimento de microrganismos mais exigentes; meios selectivos formulados para o crescimento
de uns em detrimento de outros; e meios diferenciais formulados para distinguir microrganismos
que possuam determinada caracterstica bioqumica.
Material necessrio: Erlenmeyer; Balana; gua destilada; Peptona; extracto de carne; Tubos
de ensaio
Preparao de agar nutritivo (Como exemplo)
1- Pesar individualmente 5 g de peptona e 3 g de extracto de carne (usar esptulas bem limpas e
limpar entre pesagens). No voltar a introduzir o excesso no frasco.
2- Adicionar os ingredientes a 500 ml de gua destilada colocada num Erlenmeyer de 2000 ml.
3- Homogeneizar cada um deles em separado e agitar a mistura at que se verifique a dissoluo
completa dos ingredientes.
4- Adicionar 15 a 20 g de agar aos outros componentes e homogeneizar.
5- Adicionar gua destilada de modo a perfazer o volume de 1000 ml.
6- Acertar a pH 7.0 com hidrxido de sdio ou cido clordrico 1N, a uma temperatura de 60 C.
Lavar rapidamente os elctrodos do potencimetro.
Manual de aulas prticas de Microbiologia
Universidade de Trs-os-Montes e Alto Douro Pgina 6
7- Repartir o
