microbiologia agricola completo.pdf

MICROBIOLOGA AGRCOLA

Leonor Carrillo Dra. en Ciencias Qumicas (Orientacin Biolgica) Profesora Titular en Facultad de Ciencias Agrarias, UNJu y Facultad de Ingeniera, UNSa

Universidad Nacional de Salta ISBN 987-9381-16-5

(http://www.unsa.edu.ar/matbib)

2003

CONTENIDO 1.Microorganismos. Reinos. Organismos procariticos: eubacterias, arqueobacterias, actinomicetos, cianobacterias, mixobacterias. Organismos eucariticos: mohos levaduras, macromicetos, mixomicetos, protozoos, algas, lquenes. Organismos acelulares: virus, viroides, priones. Transferencia gentica en bacterias: conjugacin, transformacin, transduccin, fusin de protoplastos. 2. Vida y muerte de los microorganismos. Crecimiento. Tipo de nutricin. Factores de crecimiento orgnicos y minerales. Transporte de solutos. Factores ambientales: agua y presin osmtica, tensin superficial, pH, oxgeno, potencial redox, temperatura. Medios de cultivo. Esterilizacin. Accin del calor, radiaciones, luz ultravioleta, microondas y ultrasonido. Separacin por filtracin. Desinfeccin. Interacciones microbianas: antibiosis, mutualismo y simbiosis. Fijacin simbitica del nitrgeno. Micorrizas. Biopelculas. Predacin. 3. Actividad microbiana. Suelo. Metabolismo. Degradacin de biopolmeros: celulosa, almidn, levanos, xilanos y otras hemicelulosas, pectinas, quitina, lignina, lpidos, protenas, polinucletidos. Metabolismo productor de energa. Respiracin: degradacin de hexosas, ciclo del cido tricarboxlico, cadena de transporte de electrones, fosforilaciones. Fermentaciones: lcticas, alcohlica, propinicas, frmicas, butrico-butanlica, acticas, de aminocidos. Oxidaciones incompletas. Respiracin anaerbica. Desnitrificacin, reduccin a nitritos, sulfatorreduccin y metanognesis. Bacterias autotrficas. Nitrificacin, sulfooxidacin, ferrooxidacin. Biosntesis. Sntesis de protenas y otros compuestos. 4. Estructuras fngicas. Estructuras somticas. Estructuras reproductoras anamrficas y teleomrficas. 5. Rumen y biogas. Metanognesis, diversidad de las arqueobacterias metanognicas. Rumen, un digestor natural. Caractersticas del biogas. Digestores anaerbicos, materia prima, factores ambientales, criterios de diseo y construccin, operacin, peligros potenciales y seguridad. 6. Micotoxinas. Hongos en el campo y el almacenamiento. Honhos toxignicos y micotoxinas naturales. Produccin de micotoxinas. Peligros. Prevencin. 7. Hongos. Clasificacin. Macromicetos. Ascomycota y Basidiomycota. Hongos micorrizantes, inoculacin de plantines. Cultivo del champin, obtencin del micelio, preparacin del compost, siembra del inculo, produccin. Cultivo de hongos lignvoros, preparacin del substrato, inoculacin y produccin de las setas, cultivo sobre troncos. Apndice Medios de cultivo y esterilizacin. Aislamiento y cultivo de microorganismos. Fijacin simbitica de nitrgeno en leguminosas. Microorganismos del suelo. Inhibidores y desinfectantes. Digestin anaerbica de residuos agrcolas. Morfologa microscpica de hongos. Identificacin de mohos toxignicos. Micorrizas. Microorganismos del agua.

NDICE Actinomicetos 1-8

fijadores de nitrgeno 2-7 Aerobio 2-7 Agua 2-5

actividad 2-5 humedad relativa 2-5 microorganismos A-31 potencial 2-6

Algas 1-13 Amonificacin A-16 Anaerobio 2-7, 3-19 Antibacteriano 2-14, A-21 Antibiosis 2-14 Antifngico 2-14, A-21 Arqueobacterias 1-7, 3-21, 5-2 Autottrofo 2-2, 3-21, A-2 Bacterias butricas 3-19 celulolticas 3-6 eubacterias 1-4 fijadoras simbiticas 2 -16 fijadoras vida libre 3-24 formas 1-7 gram-positivas 1-4 gram-negativas 1-4 halfilas 1-8 lisognicas 1-14 metangenas 1-8, 3-21, 5-1 ruminales 3-21, 5-4 termoacidfilas 1-8 Bactericida 2-14 Bacteriocinas 2-14 Bacterifago 1 -14 Bacteriosttico 2-14 Bacteroide 2-16, 3-25 Biodegradacin 3-5 Biogas 5 -1 caractersticas 5-8 Biopelcula 2-18 Biosntesis 3-20, 3-23 cidos grasos 3-25 aminocidos 3-23 glcidos 3-26 nucletidos 3-25 protenas 3 -23 Cadena respiratoria 3-16, 3 -20 Capacidad de campo 2-6, 3-3 Catabolismo 3-14 Clulas

eucariticas 1-10 procariticas 1-3

Cianobacterias 1-9, 3 -25 Ciclo del

azufre 3-21 citrato 3-16

nitrgeno 3 -21 Colonias de bacterias 1-6 Coloraciones A-10 Crecimiento 2-1 Cultivos bacterias 2-9, A-8 hongos 7-11, 7-12, A-11 medios 2 -9, A-2 Degradacin de almidn 3-8 biopolmeros 3-4 celulosa 3-6, A-18 hemicelulosas 3-9 hexosas 3-15 levanos 3-15 lignina 3-11 lpidos 3-12 pectinas 3-10 polinucletidos 3 -14 protenas 3-13 quitina 3-11 xilanos 3-9 Desinfeccin 2-13, A-21 Desnitrificacin 3-19, A-16 Digestin anaerbica 5-2, A-23 carga 5-13, 5-14 construccin 5-10 criterios de diseo 5-10 digestores rurales 5-5 etapas 5-2 factores ambientales 5-9 microorganismos 5-2 operacin 5 -13 otros digestores 5-6 parmetros 5-7. 5-11 residuos 5-6 seguridad 5 -14 Divisin celular 1-7 Endosporos bacterianos 1-6 termorresistencia 2-11 Esporas fngicas 1-11, 4-2 Esterilizacin calor 2-11, A-3 filtracin 2-13, A-4 presin autoclave 2-11 radiaciones 2-12

Factores de crecimiento 2-3 Factores ambientales 2-5, 3-3, 5-9 actividad agua 2-5 luz ultravioleta 2 -13 microondas 2-13 oxgeno 2-7 pH 2 -6 potencial agua 2-6 potencial de reduccin 2-8 presin osmtica 2-5 radiaciones 2-12 temperatura 2-8, 3-3 tensin superficial 2-6, 2-14 ultrasonido 2-13 Facultativo 2-7 Fermentaciones 3-17 actica 3-19 cida mixta 3-18 aminocidos 3-19

butanodilica 3 -18 butrico-butanlica 3-19 etanlica 3-18 frmicas 3 -18 lcticas 3-17 propinicas 3-18 Ferrooxidacin 3-22 Fijacin del CO2 3-26 Fijacin de nitrgeno vida libre 3-24, A-17 inoculante 2-17, A-13 mecanismo 3 -24 simbitica 2-16, A-13 Flagelos bacterianos 1-5 Fotosntesis bacteriana 3-26 Fottrofo 2-2, 3-26 Gentica bacteriana 1-15 conjugacin 1-16 genoma 1-4 plsmidos 1-6 recombinacin 1-16 replicacin 1-15 transduccin 1-18 transforma cin 1-17 Halfilo 2-6 Hetertrofo 2-2, A-2 Hongos 4-1, 7-1, A-25 ascomicetos 4-4, 7 -3 anamorfos 4-2 basidiomicetos 4-5, 7-4 clasificacin 7-1 champin 7-11 cultivo 7-11, 7-12

deteriorantes 6-1 estructuras somticas 4-1 estruct. reproductoras 4-1 levaduras 1 -12

lignvoros 3 -11, 7 -12 macromicetos 1-12, 7-3 mohos 1-11 micorrizantes 2-18, 7-8, A -29 teleomorfos 4-4 Humedad relativa 2-5 Inoculantes bacterianos 2-17, A-13 fngicos 7-10 Interacciones microbianas 2-15 Levaduras 1-12, 4-1 Lquenes 1-13 Macromicetos 1-12, 7 -3 Medios de cultivo 2-9, A-2 Membranas bacterianas citoplasmtica 1-4 internas 3-22 Mesfilo 2-8 Metabolismo 3-4 bacteroides 3-25 productor de energa 3-14, 3 -20 Metabolitos secundarios 3 -26, 6 -1 Metanognesis 3-21, 5-1 Micorrizas ectomicorriza 2-18, 7-9, A-29 endomicorriza 2-18, 7-9, A-29 inoculacin 7-10. A-29 Micotoxinas 6-1 mohos toxignicos 6-3, A-27 prevencin 6-6 principales toxinas 6-3 produccin 6-2 toxicidad 6-4 Microorganismos 1-1 agua A-31

amilolticos 3-8 celulolticos 3-6 desnitrificantes 3 -19 eucariotas 1-10 lignvoros 3 -11, 7 -12 pectinolticos 3-10 procariotas 1-3 quitinolticos 3-11

suelo 3-1 tamao 1-1, A-12 Micronutrientes 2-3 Mixobacterias 1-9 Mixomicetos 1-12

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 1

Apndice Gua de trabajos prcticos

CONTENIDO 1. Medios de cultivo y esterilizacin

2. Aislamiento y cultivo de microorganismos

3. Fijacin simbitica de N2 en leguminosas

4. Microorganismos del suelo

5. Inhibidores y desinfectantes

6. Digestin anaerbica de residuos agrcolas

7. Morfologa microscpica de hongos

8. Identificacin de mohos toxignicos

9. Micorrizas

10. Microorganismos del agua


TRABAJO N 1. Medios de cultivo y esterilizacin

Objetivo. Preparar los substratos o medios de cultivo, cuya composicin varia segn el tipo de organismos y la selectividad esperada, para estudiar los microorganismos en el laboratorio. Esterilizar estos materiales para eliminar los microorganismos que pudieran alterarlos antes del uso.

Introduccin

Nutricin Los microorganismos toman del ambiente circundante los materiales o nutrientes que son el punto de partida para las reacciones metablicas que los convierten en constituyentes celulares. Hay nutrientes necesarios sin los cuales una clula no puede crecer, y otros tiles pero no indispensables. La primera divisin en las categoras nutricionales tiene en cuenta dos parmetros: la naturaleza de la fuente de energa y la naturaleza de la fuente principal de carbono. Los organismos que usan la luz como fuente de energa se denominan fottrofos y los que utilizan fuentes de energa qumica se denominan quimitrofos. Los que emplean CO2 como principal fuente de carbono se definen como auttrofos, pero los que utilizan compuestos orgnicos para el mismo fin se llaman hetertrofos. Los microorganismos necesitan una diversidad de minerales para su crecimiento, y los ms comunes son el potasio, sodio, magnesio, calcio e hierro. Los factores de crecimiento son compuestos orgnicos especficos requeridos en muy pequeas cantidades y no puede ser sintetizados por la clula.

Diseo de un medio de cultivo En el cuadro siguiente se consideran tres medios de distinta complejidad.

Medio 1 Medio 2 Medio 3 agua 1 L agua 1 L agua 1 L cloruro de amonio 1 g peptona o triptona 5 g peptona de soja 10 g fosfato dipotsico 1 g extracto de carne 3 g glucosa 10 g carbonato de calcio 1 g agar 15 g extracto de levadura 2,5 g sulfato de magnesio 10 mg agar 15 g sulfato ferroso 10 mg cloruro de calcio 10 mg sales inorgnicas de 0,02 mg Mn, Mo, Cu, Co, Zn de cada uno

Al elaborar un medio de cultivo para un organismo cualquiera, el objetivo pricipal consiste en proporcionar una mezcla equilibrada de los nutrientes requeridos, en concentraciones que permitan un buen crecimiento. El punto de arranque es componer una base mineral que proporcione las sales inorgnicas que pueden suministrarse a cualquier organismo. Esta solucin puede suplementarse luego, si es necesario, con una fuente de carbono, una de energa, una de nitrgeno y algn factor de crecimiento requerido. El medio 1 puede permitir el crecimiento de bacterias nitritantes auttrofas que usan el dixido de carbono como fuente de carbono y oxidan amonio para obtener energa. El medio 2 es un medio complejo que favorece el desarrollo de muchas bacterias hetertrofas que obtienen energa y tambin carbono de aminocidos y pptidos, pero no requieren factores de crecimiento. El 3 contiene glucosa, varios constituyentes nitrogenados orgnicos y factores de crecimiento como para cubrir las necesidades nutricionales de mohos y levaduras. Cualquier medio adecuado para el crecimiento de un organismo especfico es, en cierto modo, selectivo para l. Los microorganismos deseados pueden obtenerse de los ambientes naturales


tales como el suelo, empleando medios selectivos. Como agente gelificante de los medios de cultivo se utiliza comnmente el agar que es obtenido de algas pero no es nutriente para la mayora de los microorganismos. El gel de agar es firme a las temperaturas de incubacin pero se convierte en lquido (sol) cuando se calienta a la temperatura de ebullicin del agua, gelificando nuevamente cuando se enfria a 45C. Otra manera de proporcionar una superficie nutritiva es utilizar un filtro de membrana de esteres de celulosa depositado sobre un disco de absorbente embebido con el medio de cultivo. El medio traspasa los poros permitiendo el desarrollo de los microorganismos que estn en la superficie. El extracto de carne es un extracto acuoso de msculo de bovino, concentrado hasta una consistencia pastosa o desecada hasta polvo, que contiene compuestos solubles tales como azcares, aminocidos y sales. El hidrolizado de protena se obtiene por digestin de msculo con pepsina (peptona) o tripsina (triptona) o de casena (casitona, tripticase) o de proteina de soja (peptona de soja). Los medios complejos deshidratados contienen algunos componentes cuya concentracin vara con cada partida y suelen tener una baja capacidad reguladora del pH.

Esterilizacin Esterilizar significa eliminar toda clase de microorganismos. Esto puede realizarse de diferentes modos. Pueden eliminarse las bacterias del aire por filtracin, como en las cmaras de flujo laminar estril, y de los lquido a travs de membranas fltrantes u otro filtro. La destruccin de las bacterias puede hacerse mediante calor seco o hmedo para el tratamiento de la mayora de los materiales, o rayos ultravioletas para el caso de superficies, o con radiaciones

ionizantes para esterilizar plsticos deseartables. El calor seco se utiliza en estufa de aire caliente, pero no es un mtodo eficaz de calentamiento porque el aire es un mal conductor del calor. En ausencia de humedad las formas ms resistentes (endosporos bacterianos) requieren temperaturas por sobre 160C durante una hora y media para morir. El vapor a presin es el procedimiento ms efectivo de esterilizacin por calor hmedo. El vapor a una presin absoluta de 2,066 kg/cm2 proporciona una temperatura de 120,6C que es mortal para los endosporos bacterianos en pocos minutos, pero el tiempo de aplicacin vara segn el tiempo necesario para homogeneizar la temperatura en el material tratado. La presin absoluta a la que est sometido el material dentro del autoclave es igual a la presin leda en el manmetro sumada a la presin atmosfrica del lugar. Como esta ltima varia con la altura sobre el nivel del mar, debe calcularse la presin manomtrica necesaria para llevar a cabo la esterilizacin en cada localidad, haciendo caso omiso de las graduaciones en temperaturas adicionadas al

manmetro por los fabricantes a nivel del mar. En la figura 1 se ven las curvas de temperaturas alcanzadas en funcin del tiempo en un autoclave con distinto grado de purgado del aire. La figura 2 muestra el tiempo requerido para esterilizar distintos volmenes a 120,6C. La temperatura de ebullicin del agua puede ser usada para esterilizar materiales nutritivos que se alteraran a temperaturas mayores, mediante el siguiente artilugio: el material es tratado durante 30 minutos el primer da e incubado a la temperatura ambiente, vuelto a calentar 30 minutos el segundo da y otra vez incubado, para finalmente calentarla otros 30 minutos el tercer da. El tratamiento durante el primer da destruye las formas vegetativas, el perodo de


incubacin permite la germinacin de muchos endosporos y las formas sensibles originadas mueren con el segundo calentamiento. Los endosporos que persistieron germinarn durante el segundo perodo de incubacin y las clulas formadas morirn con el tercer calentamiento. Como se ve, la tindalizacin es efectiva nicamente cuando el medio a esterilizar es favorable para la germinacin de los esporos. No destruir los endosporos de anaerobios si la incubacin no se lleva a cabo en condiciones de anaerobisis y tampoco destruir a los endosporos del grupo termoflico. Teniendo en cuenta la cintica microbiana el fin prctico de la esterilizacin mediante un agente letal es lograr que la probabilidad de que el material tratado contenga tan slo un superviviente, sea muy

pequea. Los procedimientos habituales de esterilizacin se proyectan siempre de forma que proporcionen un amplio margen de seguridad.

Filtracin Los microorganismos quedan retenidos por el pequeo tamao de los poros del filtro y con algunos tipos de materiales filtrantes por adsorcin sobre los mismos, adems de la influencia del pH del lquido sobre las cargas de los microorganismos y el filtro. Comnmente en el laboratorio se usan membranas de esteres de celulosa con porosidades de 0,45 mm 0,2 mm, pero tambin suelen usarse en otros casos unos filtros de porcelana o vidrio fritado (sinterizado).

Procedimiento

Preparacin del material de vidrio Obturar con algodn la extremidad no aguzada de las pipetas con la ayuda de un punzn. Colocar dos o tres de ellas en un sobre de papel y cerrarlo con broches metlicos, o bien envolverlas separadamente en una tira de papel. Envolver con papel cada caja de Petri cerrada. Tapar los tubos de ensayo con algodn prensado de tal modo que, se pueda quitar y colocar el tapn sin deformarlo. Reunir unos diez tubos en un paquete.

Esterilizacin por aire caliente El material limpio y bien seco, una vez tapado con algodn y/o envuelto con papel, se ubica en el interior de la estufa (horno o esterilizador). Luego se calienta hasta que la temperatura alcance 170C y se la mantiene durante 30 a 60 minutos enfriar segn la carga. Se deja enfriar el aparato antes de abrir, para evitar la rotura del vidrio por el contacto brusco con el aire fro. Al


terminar la operacin, el algodn y/o el papel de diario tendrn un color tostado plido. Desde los 150C ambos comienzan a amarillear, pero a los 180C pierden la propiedad de detener las bacterias y se forman residuos carbonosos ms o menos antispticos.

Control de la eficacia de la esterilizacin Se coloca en la estufa, junto con el material de vidrio, un tubo con endosporos bacterianos (cultivo seco o suelo tamizado). Una vez sometido al tratamiento trmico, se le agrega un medio nutritivo lquido y se incuba a 30C durante 48 horas. Si se ha logrado la esterilizacin, no habr desarrollo bacteriano.

Preparacin de medios de cultivo La mayora de las bacterias hetertrafas pueden multiplicarse en el medio 2 denominado " agar nutritivo". Para disolver el agar se calienta el recipiente en un bao de agua hirviente o en el autoclave a vapor fluente. El pH del medio debe estar prximo a 7. Si se prepara sin agar se obtiene el medio llamado "caldo nutritivo". Los hongos suelen crecer ms lento que las bacterias y toleran mejor la acidez, por lo que suele usarse para su cultivo el medio 3 conocido como "agar micolgico" cuyo pH es aproximadamente 5,6, al que se le aadi extracto de levadura para que desarrollen aun los organismos exigentes en vitaminas. Los medios se distribuyen en tubos de ensayo o en matraces de Erlenmeyer ocupando slo un tercio de su capacidad. Tanto los tubos como los matraces llevan tapones de algodn, excepto cuando tienen tapa a rosca esterilizable. Los tubos se renen en cestos y se los cubre con dos o tres hojas de papel poroso donde se escribe con lpiz el nombre del contenido. Se cubren los matraces con un capuchn de papel y un hilo atado de tal forma que pueda quitarse fcilmente. Los medios de cultivo se esterilizan en autoclave.

Esterilizacin por vapor de agua a presin En el autoclave se logra que la temperatura del vapor de agua sea superior a la ebullicin (96C a 1300 m s.n.m.) por medio de un aumento de la presin, luego de la eliminacin del aire por la espita o vlvula de purga. Si funciona a 1,18 kg/cm2 por sobre la presin atmosfrica promedio local (0,88 kg/cm2 = 884 HPa), el agua hervir a 121C. Al mantener esta temperatura durante 15 minutos se logra la destruccin de toda forma de vida en volmenes menores a 100 mL. El mismo resultado se alcanza prcticamente en materiales poco contaminados, calentando a 115C (0,84 kg/cm2 de presin manomtrica) durante 20 minutos. Los slidos o liquidos muy viscosos deben ser calentandos a 121C durante 30 minutos. Si el autoclave est muy cargado, o los volmenes son mayores, es necesario prolongar el tiempo de calentamiento. Con estas condiciones de tratamiento pueden sobrevivir los endosporos de bacterias termoflicas, pero stas no crecen a las temperaturas comunes de incubacin (25 - 37C). Colocar agua hasta la rejilla, ubicar los recipientes y cerrar el autoclave, ajustando las mariposas opuestas para que la tapa quede bien apoyada sobre la junta de goma. Encender el mechero. Cerrar la espita, o vlvula de purga, recin cuando sale un chorro de vapor continuo pues entonces se ha logrado purgar el aparato. A partir de este momento comienza a aumentar la presin, la que se regula y mantiene con la altura de la llama. Vigilar el autoclave durante la esterilizacin. Cumplido el tiempo, cerrar la llave de gas y esperar hasta que la aguja del manmetro vuelva a cero, antes de abrir la espita para igualar las presiones, interna y externa. Luego abrir la tapa. Si se abriera la espita durante el enfriamiento, la brusca descompresin producirla la ebullicin violenta de los lquidos y los proyectarla fuera de los recipientes. Por otra parte si se abre demasido tarde, el vapor se habr condensado sobre los papeles y algodones, y se habr acelerado el deterioro de la junta de goma por el vacio formado.


Control de la temperatura de esterilizacin Se coloca un tubito con cido benzoico en polvo (p.f. 121C) junto al material a esterilizar.. Si se alcanza la temperatura de fusin durante el proceso de esterilizacin, luego del enfriamiento quedar una masa homognea de cido benzoico. Tambin se usan mezclas indicadoras adheridas sobre cartn u otro material, tal como la compuesta por carbonato de plomo + azufre precipitado + carbonato de litio (10 + 1+ 3). Esta mezcla vira al gris despus de 30 minutos a 100C, en 3 4 minutos a 110C y en 30 segundos a

121C. Toma color negro si est expuesta ms de 30 minutos a 110C y en 5 minutos a 121C.

Esterilizacin por filtracin Se eliminan los bacterias de las soluciones que se descomponen o inactivan al someterlas a la temperatura del autoclave, pasndolas a travs de membranas con poros de 0,2 0,45 mm u otros filtros. La membrana o disco filtrante se coloca sobre una superficie porosa rgida, en una suerte de embudo desmontable adaptado a un matraz de Kitasato (ver figura 3) mediante un tapn de goma, para poder hacer un vacio parcial con una bomba o una trompa de agua. La tubuladura lateral del matraz se conecta a un tubo engrosado en su parte media, donde se coloca algodn. Se envuelve el conjunto con papel y se esteriliza en el autoclave. Despus se ubica el disco filtrante en el embudo desmontable cumpliendo con las reglas de asepsia y se conecta el matraz de Kitasato a la trompa de agua o la bomba de vaco.

Control de la eficiencia de la filtracin Dos porciones del material nutritivo filtrado se transfieren en condiciones de asepsia a recipientes estriles y se incuban, uno a 30C y otro a 45C, durante 48 horas. Si se logr la esterilizacin no debe haber desarrollo microbiano.

Bibliografia o Madigan TM et al. Brock- Biologa de los Microorganismos. Prentice Hall, Madrid, 1998 o Stanier RY et al. Microbiologa. Revert, Barcelona, 1984 o Carpenter P, Microbiologa, Interamericana, Mxico, 1979 o Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962


TRABAJO N 2. Aislamiento y cultivo de microorganismos

Objetivo. Separar por mtodos fsicos los microrganismos, provenientes de un ambiente natural, de tal manera que al multiplicarse sobre un substrato nutritivo se obtenga una poblacin (en el caso de bacterias o levaduras) o un individuo (en el caso de un moho). Reconocer al microscopio las caractersticas generales de los microorganismos mediante preparaciones en fresco o coloraciones de extendidos del material.

Introduccin

Microbios uni y pluricelulares Los organismos ms sencillos son aqullos que estn constituidos por una sola clula. Como las clulas se miden en micrmetros (mm) estos organismos unicelulares caen dentro de la categora general de microbios o microorganismos. La organizacin unicelular se observa en protozoos, algunas algas, levaduras y la mayora de las bacterias. Un tipo ms complejo de organizacin biolgica es la de los organismos pluricelulares. Aunque surgen en general a partir de una sola clula, en estado maduro constan de varias clulas permanentemente unidas unas a otras de un modo caracterstico, lo cual le confiere una forma tpica al organismo. As un moho esta compuesto por filamentos ramificados. Cada filamento se denomina hifa y al conjunto de hifas se lo llama micelio.

Aislamiento, cultivo Dos clases de operaciones fundamentales en la microbiologa clsica son el aislamiento o separacin de un microorganismo determinado de las poblaciones mixtas que existen en la naturaleza, y el cultivo o crecimiento del microorganismo en medios artificiales bajo condiciones de laboratorio. Estas operaciones son bsicamente iguales para el estudio de las bacterias, los hongos, las algas, los protozoos y las lineas de clulas vegetales o animales (cultivo de tejidos). Para el aislamiento directo se emplean medios gelificados. Cuando un inoculo mixto que contiene una cierta variedad de organismos diferentes se extiende directamente sobre la superficie de un medio gelificado, todos aqullos que puedan crecer sobre el mismo producirn colonias. La dispersin de los microbios sobre el medio elimina gran parte de la competencia por los nutrientes y por ello algunos que crecen lentamente son capaces de multiplicarse en el mismo ambiente de los que crecen rpidamente. Como consecuencia del aislamiento aparecen luego de la incubacin, poblaciones de bacterias y levaduras e individuos fngicos sobre la placadel medio de cultivo. Se los puede mantener vivos en el laboratorio mediante transplantes a otros medios de cultivo.

Ambiente Los principales ambientes naturales de los microorganismos son el suelo y el agua. Muchos organismos se encuentran en una capa delgada de suelo de algunos decmetros de espesor. Los microrganismos de las masas de agua, por ejemplo lagos, estn concentrados en la superficie y en el fondo por encima del cieno. Los microorganismos transportados por el aire son seres que accidentalmente se encuentran en este medio y provienen del suelo, agua u otros organismos vivos. Es necesario que haya ciertas condiciones en el ambiente para que sirva como reservorio de los microorganismos. El crecimiento depende del abastecimiento adecuado del agua y las substancias nutritivas, el pH conveniente, la tensin de oxigeno suficiente, la temperatura necesaria y otros factores.

Oxgeno Muchos organismos requieren oxigeno molecular pues dependen de la respiracin aerobia para cubrir sus necesidades energticas y se los denomina aerobios obligados. Entre stos,


algunos crecen mejor a presiones parciales de oxigeno menores que la presente en el aire y se los conoce como microaerfilos. Hay microorganismos son anaerobios facultativos, pues pueden crecer tanto en presencia como en ausencia de aire. Comprende dos subgrupos: uno, el de las bacterias que tienen un metabolismo productor de energia exclusivamente fermentativo pero no los afecta la presencia de aire; otro, el de las levaduras o bacterias que pueden pasar del metabolismo respiratorio al fermentativo. En cambio los anaerobios estrictos slo fermentan y son sensibles al oxigeno.

Crecimiento, colonia En cualquier sistema biolgico el crecimiento puede definirse como el aumento ordenado de todos los constituyentes qumicos de un organismo. El crecimiento determina la multiplicacin celular y en los organismos unicelulares motiva un aumento del nmero de individuos,

mientras que en los multicelulares lleva al aumento del tamao del individuo. En el aislamiento se tom una pequea cantidad de clulas microbianas y al deslizar el asa sobre el agar se las distribuy por la superficie. Durante la incubacin la clula aislada se

dividi repetidamente hasta formar una masa visible llamada colonia sobre el medio de cultivo. El crecimiento de las poblaciones bacterianas est normalmente limitado por la desaparicin de los nutrientes accesibles o por la acumulacin de productos metablicos txicos. Al describir una colonia se usan distintos vocablos para describir forma, elevacin y borde de la misma como se muestra en la figura 4.

Bacterias La mayora son organismos unicelulares que se multiplican por escisin binaria transversal. Se distinguen varios tipos respecto a su forma y agrupacin como se esquematiza en la figura 5. Algunas bacterias forman clulas de reposo, conocidas como endosporos, que tienen bajo contenido de agua, son muy refringentes y se tien con dificultad.

Los endosporos soportan el calor, la desecacin y algunas substancias qumicas, muchos resisten a 100.C durante unas 20 horas, otros slo unos minutos a 90C Las bacterias mviles tienen uno o varios flagelos. Para verlos con el microscopio ptico se los debe engrosar mediante un mordiente antes de la coloracin. Suele obs ervarse el movimiento bacteriano cuando se coloca una gota de un cultivo en medio lquido entre cubre y portaobjetos. Los actinomicetos son un grupo de bacterias filamentosas, ramificadas, que forman un micelio delgado y en la mayora de los casos clulas de multiplicacin llamadas esporos.


Coloraciones El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resulta difcil de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es el poco contraste entre la clula y el medio que la rodea, y la manera ms simple de aumentarlo es utilizando colorantes. Las clulas generalmente son tratadas de diversa manera, antes de teirlas, para coagular el protoplasma en un proceso que se llama fijacin. En el caso de las bacterias, la fijacin por calor es lo ms corriente, aunque tambin puede emplearse formaldehido, metanol o cidos. La fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido secadas sobre un portaobjetos. Luego le sigue la tincin. La mayora de los colorantes usados son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especifica con los materiales celulares. El azul de metileno es un buen colorante que acta rpidamente sobre las bacterias y es til para detectar bacterias en medios naturales, puesto que no tie la mayor parte del material extrao.

Tincin de Gram Es un mtodo diferencial de tincin para bacterias. Luego del tratamiento con cristal violeta todas las clulas estn coloreadas. Al agregar iodo se forma un complejo con el colorante en el interior de las mismas. Despus de aadir etanol o acetona algunos organismos se decoloran (Gram-negativos) y otros no (Gram-positivos) segn la estructura fsica de la pared, no por los constituyentes qumicos pues las levaduras son gram-positivas aunque tienen una pared qumicamente distinta a las de las bacterias. Para poner de manifiesto las clulas incoloras se utiliza una coloracin de contraste, tal como safranina o fucsina bsica que tien de rojo a las clulas gram-negativas mientras las gram-positivas permanecen violetas.

Procedimiento

Aislamiento de microorganismos del polvo ambiental La tcnica depende del material a partir del cual se intenta aislar los microorganismos y de las caractersticas de estos ltimos. Vertir unos 15 mL de agar nutritivo, licuado en bao da agua

hirviente, en una caja de Petri e igual cantidad de agar de Sabouraud licuado en otra. Dejar gelificar y luego exponer las placas al aire dejando sedimentar el polvo ambiental durante 30 minutos. Incubar a 2730C durante 48 horas la caja con agar nutritivo y a 25-27C por 5 das la del agar de Sabouraud. Al cabo de ese tiempo examinar las colonias microbianas presentes.

Aislamiento de bacterias esporuladas del suelo Calentar una suspensin de suelo por 10 minutos en un bao de agua a 80C. Flamear el asa hasta que tenga color rojo brillante y dejar que se enfre dentro de la zona de conveccin del mechero. Tomar

una gota de la suspensin y extenderla sobre la superficie de una placa de agar nutritivo haciendo las primeras estras como se muestra en la figura 6. Flamear el asa y hacer la segunda serie de estrias con el asa vacia. Flamear otra vez el asa y hacer la tercera serie de estras con el asa vaca. Incubar las cajas con la tapa hacia abajo (invertidas) a 25-30C durante 48 horas.

Aislamiento de rizobios de ndulos radicales de leguminosas Lavar la raz para quitar el suelo adherido. Elegir los nodulos de mayor tamao, separarlos y colocarlos en un tubo o frasquito. Lavarlos nuevamente, agitando con fuerza para eliminar la


mayor parte de los residuos. Poner los nodulos durante 30 segundos en etanol 95% y luego sumergir en lavandina concentrada diluida al 1/10 durante 3 a 6 minutos. Lavar tres o cuatro veces, agitando enrgicamente, en sendos tubos de agua estril. Para transferir los nodulos de un recipiente a otro usar una pinza con la punta previamente mojada en alcohol y flameada. Tomar un nodulo y colocarlo entre dos portaobjetos cuyas caras enfrentadas haban sido flameadas. Aplastarlo y tomar el material del nodulo con el asa para hacer estras sobre la placa del medio de cultivo especifico como se muestra en la figura 6. Incubar a 25-30C. El medio de cultivo para rizobios contiene manitol 10 g, extracto de levadura 4 g, carbonato de calcio 3 g, fosfato dipotsico 0,5 g, sulfato de magnesio 0,2 g, cloruro de sodio 0,l g, agar 15 g, rojo Congo 25 ppm o verde brillante 125 ppm, agua 1 litro; pH 7,0. Se esteriliza a 115C durante 20 minutos.

Observacin de las placas de aislamiento El inoculo fue diluido progresivamente en cada estra sucesiva de tal manera que, despus de la incubacin en la estufa, el crecimiento es confluente en los trazos iniciales y las colonias estn bien aisladas a lo largo de las ltimas estras. Observar las caractersticas macromorfolgicas de las colonias y registrarlas en la planilla de informes correspondiente. Tomar con un asa material de una colonia y hacer un extendido sobre un portaobjetos. Luego de secar y fijar por calor, hacer una coloracin de Gram para observar las clulas somticas o de Wirtz para ver los endosporos.

Tincin de Gram Poner el portaobjetos sobre un soporte y cubrirlo con una solucin de violeta cristal. Luego de 1 minuto agregar solucin de iodo. Despus de 1 minuto, lavar con agua. Decolorar con alcohol 96. Lavar con agua y cubrir con una solucin de safranina durante 1 minuto. Lavar con agua y secar. Colocar una gota de aceite para inmersin. Llevar el portaobjetos a la platina de un microscopio. Mirar a travs del objetivo de bajo aumento (10x) y una vez enfocado el objeto colocar el objetivo de inmersin en aceite (100x) moviendo el revlver. Levantar el condensador pues la intensidad de la luz debe ser mayor con los objetivos de mayor aumento. Ajustar el enfoque mediante el tornillo micromtrico. Regular la cantidad de luz por medio del diafragma. Las bacterias Gram-negativas se tien de rojo anaranjado y las Gram-positivas adquieren color violeta. Dibujar lo observado manteniendo la proporcin respecto al campo microscpico . La solucin de violeta cristal contiene 1 g de colorante disuelto en 20 mL de alcohol 96 y 80 mL de agua. La de safranina se prepara de igual manera usando 0,25 g de colorante. La solucin de iodo segn Lugol contiene 1 g de iodo y 2 g de ioduro de potasio en 100 mL de agua.

Coloracin de endosporos Cubrir el extendido con solucin de verde de malaquita. Encender un hisopo embebido en alcohol y calentar el portaobjetos por debajo del soporte. Apagar y repetir la operacin luego de

un minuto. Repetir el calentamiento dos veces ms. Lavar con agua. Cubrir con solucin de safranina durante 1 minuto. Lavar con agua y secar. Colocar una gota de aceite para inmersin. Los endosporos se vern verdes y las clulas somticas de color rojo anaranjado. Dibujar lo observado. La solucin de verde de malaquita contiene 2 g de colorante disuelto en 20 mL de alcohol 96 y 80 mL de agua.

Seleccin y transplantes de colonias Elegir colonias de bacterias y hongos en las placas anteriores y repicarlas como se muestra


en la figura 7. Incubar los cultivos de bacterias a 30-35C en la obscuridad, si se trata de hongos colocarlos a 25-27C preferentemente donde reciban una iluminacin diurna difusa para favorecer la esporulacin.

a) cultivo de bacterias en aerobiosis sobre medios gelificados . Flamear el asa hasta que tenga color rojo brillante. Tomar el tubo con la mano izquierda. Quitar el tapn de algodn sostenindolo con el dedo meique de la mano

derecha. Pasar la boca del tubo por la llama del mechero. Introducir el asa, estril y fra, en el tubo y extraer un poco de material microbiano. Volver a flamear la boca del tubo y colocar el tapn. Tomar el tubo con medio estril, destapar y flamear como el anterior. Introducir el asa y depositar los microorganismos rayando en zig-zag la superficie del medio gelificado, con mucha suavidad. Sacar el asa, flamear la boca del tubo y tapar. Flamear el asa. en medios lquidos. Proceder igual que en el

caso anterior y depositar los organismos dentro del medio lquido.

b) cultivo de hongos El procedimiento para sembrar levaduras es similar al empleado para bacterias. Para cultivar hongos se emplea un gancho, inserto en el mango de Kolle, que permite tomar los filamentos para transferirlos al nuevo medio.

microcultivo. Colocar sobre un portaobjetos, previamente flameado y enfriado, un trozo de medio gelificado de 1 cm de lado y 2 a 3 mm de espesor, tomado de una placa estril. Sembrar en los bordes libres del trozo de agar como se muestra en la figura 8. Colocar un cubreobjetos, tambin flameado y enfriado. Incubar los microcultivos en una cmara hmeda, lograda poniendo algodn mojado bajo el soporte de los portaobjetos dentro de un recipiente cerrado.

Observacin de los cultivos en tubos

macroscpica Despus de la incubacin observar los cultivos a simple vista o con ayuda de la lupa y registrar en el informe las caractersticas morfolgicas (ver figura 9). Evitar la agitacin del medio lquido pues si ha crecido una pelcula superficial, esta puede caer confundindose con el sedimento.

microscpica Hacer un preparado de las bacterias (ver figura 10), fijar por calor en la llama o microondas, y colorearlo segn el mtodo de Gram. Suspender los hongos en agua, lquido de Patterson o colorante de Guegun al hacer el preparado en fresco y con ayuda de dos agujas separar los filamentos.


El colorante de Guegun contiene 0,1 g de azul de algodn y 0,1 g de Sudn III en 100 g de cido lctico, adems de 10 gotas de tintura de iodo. El lquido de Patterson se prepara mezclando 50 mL de solucin acuosa de acetato de potasio al 2%, con 20 mL de glicerina y 30 mL de etanol 96 Observar el microcultivo con el objetivo de menor aumento, luego de enfocar un objeto adherido a la cara inferior del cubreobjetos se podr utilizar el siguiente objetivo.

Medida del tamao de los microorganismos El mtodo ms prctico usa un ocular autoenfocable, con una escala arbitraria dividida en cien pequeas partes iguales, a veces numeradas, la que debe calibrarse con la escala de 1 mm con cien divisiones de diez micrmetros cada una, grabada en un portaobjetos llamado micro-mtrico (ver figura 11). Enfocar al portaobjetos y mover ste de modo que su escala quede paralela a la del ocular. Observar cual nmero de las pequeas divisiones de 10 mm grabadas en el portaobjetos coincide con un nmero entero de las contenidas en el ocular. Calcular el valor en micrmetros correspondiente a una divisin pequea de la escala del ocular mediante la regla de tres simple. Calibrar la escala del ocular para cada aumento del microscopio. Tener en cuenta que las rayas del ocular siempre tendrn el mismo espesor mientras que las del portaobjetos irn engrosndose al cambiar los objetivos.

Bibliografia o Hall GS et al. Methods for the Examination of Organismal Diversity in Soils and Sediments. CAB International,

Wallingford, 1996 o Seeley HW & Van Demarck PJ. Microbios en Accin. Blume, Madrid, 1973 o Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962


TRABAJO N 3. Fijacin simbitica de N 2 en leguminosas

Objetivo. Observar las caractersticas macro y micromorfolgicas de los ndulos radicales de leguminosas. Comprobar la capacidad de nodular de la cepa de rizobio aislada.

Introduccin

Fijacin simbitica del nitrgeno molecular Una de las simbiosis ms importantes es la que se da entre leguminosas y bacterias de los gneros Rhizobium y Bradyrhizobium . La infeccin de las races con una cepa adecuada de la bacteria (hay especificidad de husped) conduce a la formacin de ndulos radicales que tienen distinta forma segn la planta hospedadora (figura 12). Los rizobios especficos entran en la raz por el extremo de los pelos absorbentes que se retuercen en forma de bculo. Se forma en el pelo uno o varios tubos de infeccin dentro de los cuales los rizobios se hallan dispuestos en fila. El tubo de infeccin penetra en las clulas del crtex de la raz. Algunas clulas de la raz se dividen activamente produciendo un meristema. Los rizobios contenidos en el tubo de infeccin son liberados en el citoplasma de estas clulas meristemticas donde adquieren una forma distinta al rizobio de vida libre y se los llama bacteroides. stos son capaces de fijar el nitrgeno molecular. En los ndulos la presin parcial de oxgeno es muy baja, si se eleva la enzima

nitrogenasa quedara inhibida y no se producira la fijacin. Sin embargo el ndulo consume oxigeno provisto por la leghemoglobina, una molcula transportadora de O2 que contiene grupo hemo y da a los ndulos color rojizo.

Nodulacin de leguminosas

Ndulos efectivos o pocos y situados sobretodo en la raz primaria o voluminosos, con superficie lisa o rugosa o actividad meristematica y nodular prolongada o infeccin generalizada, zona bacteriana grande con muchos bacteroides o interior pigmentado de rojo por la leghemoglobina.

Nodulos inefectivos o numerosos y repartidos en todo el sistema radicular o pequeos con superficie lisa o actividad meristematica y nodular corta o pocas clulas infectadas, pocos o sin bacteroides y granulos de almidn o interior no coloreado de rojo.

Inoculante para leguminosas La bsqueda y seleccin de buenas cepas de rizobios puede resultar intil si las leguminosas nodulan eficientemente con las cepas nativas, situacin frecuente en especies tropicales. Pero, en muchos suelos el nivel y la eficiencia de las cepas nativas pueden no ser los adecuados y la nodulacin y la fijacin de nitrgeno resultan insuficientes para satisfacer las demandas del cultivo. La inoculacin artificial resulta imprescindible cuando se introducen nuevas leguminosas, sobre todo si son hospedadores de alta especificidad o cuando la deficiencia en nitrgeno limita

Figura 12


el desarrollo vegetal. El mtodo y las condiciones de inoculacin deben permitir la supervivencia de los rizobios, adems la semilla inoculada debe poseer la especie de rizobio adecuada y en nmero suficiente. Las condiciones del suelo prximo a la semilla deben favorecer la colonizacin de la rizsfera por la bacteria para lograr la formacin de los nodulos y su funcionamiento efectivo.

Para determinar la necesidad de inoculacin se suele emplear un ensayo simple de tres tratamientos: - la inoculacin con una cepa de rizobio conocida para saber si es efectiva en el hospedador, - la fertilizacin para asegurar un buen desarrollo del hospedador si no hay inhibidores en el suelo, - el control no inoculado para observar la presencia o ausencia de rizobios nativos y su efectividad. Las cepas usadas en los inoculantes deben ser cuidadosamente seleccionadas y mantenidas, y probarse anualmente para minimizar la posibilidad de cambio en las propiedades simbiticas. La eficencia de la fijacin se evala por el nmero de ndulos, la masa nodular,

el peso seco de la planta y el contenido de nitrgeno de la parte area. Son bacterias eficaces las que, por intermedio de los ndulos radicales, aportan nitrgeno reducido a la planta hospedadora produciendo un aumento de peso de la misma.

Procedimiento

Examen de los ndulos y bacteroides Tomar un ndulo de la raz de una leguminosa, medirlo y dibujar su forma. Cortarlo y observar el color. Si la fijacin de nitrgeno era efectiva se lo ver rosado o rojo, a veces pardo. Aplastarlo entre dos portaobjetos. Extender el material interno mezclado con una gota de agua, haciendo movimientos circulares con el asa. Secar cerca de una llama. Fijar pasando tres veces el portaobjetos por dentro de la llama. Colocar el portaobjetos sobre un soporte colocado en una bandeja o la pileta. Cubrirlo la solucin colorante (fucsina bsica 0,3 g, etanol 96 10 mL, fenol 5 g, agua destilada 90 mL). Luego de un minuto lavar con agua. Secar cerca de una llama. Depositar una gota de aceite de inmersin, apoyar un cubreobjetos y sobre ste poner otra gota de ese aceite. Observar al microscopio los bacteroides coloreados y dibujarlos tratando de mantener la proporcin respecto al campo microscpico. Anotar el aumento.

Germinacin de semillas de leguminosas Colocar las semillas necesarias, de buen poder germinativo, en un matraz de Erlemeyer con etanol al 70% v/v y agitar durante 3 a 5 minutos. Volcar y aadir agua lavandina al 10% v/v, agitando por igual tiempo. Lavar varias veces con agua destilada estril. Depositarlas sobre agar-agua estril y dejar germinar.

Preparacin del inoculante Sembrar en matraces con 50 mL de medio de cultivo con la cepa aislada de ndulos durante el desarrollo del trabajo n2. El medio de cultivo contiene: fosfato monopotsico 0,5 g, fosfato

Testigo

Ensayo

Figura 13


dipotsico 0,5 g, cloruro de sodio 0,1 g, nitrato de potasio 0,8 g, sulfato de magnesio 0,2 g, extracto de levadura 4 g, fosfato diamnico 0,3 g, glicerol 10 g, agua 1 L, pH 6,8. Esterilizar a 121C durante 15 minutos.

Inoculacin de leguminosas Escoger de las placas de germinacin las dieciseis plntulas de mejor aspecto y trasladarlas al medio mineral inclinado en tubos grandes. Dejar en lugar iluminado y ventilado. Uno o dos das despus verter 1 mL del cultivo homogeneizado de rizobio sobre la radcula de ocho plntulas cultivadas. El medio mineral contiene: fosfato dipotsico 0,5 g, sulfato de magnesio 0,2 g, cloruro de sodio 0,1 g, cloruro frrico 0,01 g, fosfato triclcico 2 g, agua 1 L, agar 15 g, pH 7. Esterilizar a 110C durante 20 minutos.

Control de las leguminosas inoculadas Medir la longitud de las plantas inoculadas y las testigo. Observar y registrar la ubicacin, tamao y forma de los ndulos. Controlar la humedad del substrato.

Bibliografa o Balatti AP & Jardim Freire JR. Legume Inoculants. Selection and Characterization of Strains. Production, Use and

Management. Kingraf, La Plata, 1996 o Frioni L. Ecologa Microbiana del Suelo. Universidad de la Repblica, Montevideo, 1990 o Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962


TRABAJO N 4. Microorganismos del suelo

Objetivo. Demostrar la biodiversidad de los grupos fisiolgicos de microorganismos del suelo mediante cultivos selectivos que provean las condiciones ambientales y disponibilidad de nutrientes adecuadas.

Introduccin

Los microoganismos juegan un papel significativo en la mayora de los procesos naturales que afectan al ambiente. Un ejemplo es la fijacin del nitrgeno molecular por los organismos de vida libre y los simbiticos, otro es el reciclado de materiales orgnicos. La materia orgnica que llega al suelo a travs de residuos de cosechas, la cada del follaje, las races y sus productos de descamacin y exudacin, los restos animales y microbianos sufren una serie de procesos de degradacin que asegura la continuidad de los ciclos biogeoqumicos. Empleando medios selectivos se puede lograr cultivos enriquecidos en microorganismos con una caracterstica fisiolgica determinada, por ejemplo si carece de una fuente de nitrgeno soluble slo crecern las bacterias capaces de reducir el nitrgeno gaseoso disuelto, procedente de la atmsfera.

Amonificacin El nitrgeno orgnico de los productos de hidrlisis de protenas y polinucletidos, se convierte en amonaco por el proceso de desaminacin. La urea se hidroliza rpidamente a amonaco y dixido de carbono por la enzima ureasa producida por muchos microorganismos. La evolucin de la microbiota vara segn la materia nitrogenada transformada. En general, primero aparecen bacilos, esporulados o no, y cocos. Despus se observan actinomicetos y ms tarde mohos. La demostracin de la amonificacin se basa en investigar amonaco mediante el reactivo de Nessler en el medio acuoso con aminocidos (peptona, etc). La solucin de yodo-mercuriato potsico alcalinizada origina desde un color amarillo hasta un precipitado rojo ladrillo segn la cantidad de amoniaco presente. El amoniaco formado puede ser asimilado directamente por otros microrganismos o ser convertido en nitrato por las bacterias especficas. Si se aade a un suelo materiales tales como estircol, aumenta en consecuencia la velocidad de nitrificacin.

Nitrificacin El nitrgeno tiene tres formas estables de oxidacin en la naturaleza (nitrgeno molecular, amonaco, nitrato) cuya interconversin est dada casi exclusivamente por bacterias. Algunos organismos pueden usar directamente amonio para sintetizar sus aminocidos y otras molculas nitrogenadas de la clula, pero otros, incluyendo las plantas, prefieren nitrato. La oxidacin del amonio a nitrato se denomina nitrificacin y unas bacterias auttrofas aerobias las llevan a cabo en dos etapas:

1) oxidacin del amonio por Nitrosomonas, Nitrosococcus 2) oxidacin del nitrito por Nitrobacter, Nitrococcus

Tanto la formacin de nitrito como la de nitrato por los microorganismos quimioauttrofos constituyen procesos metablicos aerbicos generadores de energa. Ocurre rpidamente en suelos bien drenados a pH neutro. Aunque el nitrato es fcilmente asimilado por las plantas, como es muy soluble en agua resulta rpidamente lavado de los suelos que reciben una gran cantidad de lluvia. Por el contrario, el amonio queda fuertemente adsorbido a las arcillas.

Desnitrificacin Es el proceso en el cual algunos organismos que pueden usar el nitrato como aceptor final de electrones durante la respiracin anaerbica producen molculas reducidas gaseosas (xido de dinitrgeno, nitrgeno molecular) que desaparecen del ecosistema. Existen otros


microorganismos que pueden reducir nitrato hasta amonio, manteniendo el nitrgeno en el ecosistema (reduccin asimilatoria del nitrato). Si un suelo queda anegado se producen condiciones anaerbicas y ocurre la desnitrificacin, principalmente si es rico en materia orgnica. Tambin sucede cuando se originan puntos de anaerobiosis por otras causas. Como los productos de la desnitrificacin son gaseosos se escapan del suelo disminuyendo el contenido en nitrgeno del mismo. En el laboratorio tales gases quedan atrapados en la campanita del medio de cultivo.

Fijacin de nitrgeno molecular La utilizacin de este como fuente de nitrgeno es una propiedad que poseen ciertas bacterias y cianobacteras. A continuacin se da una lista abreviada de organismos fijadores de nitrgeno de vida libre.

Algunos gneros de bacterias con especies fijadoras de nitrgeno Aerobios Anaerobios

Heterotrficos Fotosintetizadores Heterotrficos Fotosintetizadores Azotobacter cianobacterias Clostridium Chromatium Klebsiella Chlorobium Beijerinckia Rhodospirillum Bacillus Heliobacterium Azomonas Azospirillum (microaerfilo)

El nitrgeno es reducido a amonio en el proceso de fijacin catalizado por el complejo nitrogenasa, uno de cuyos componentes protenicos contiene molibdeno, los otros hierro. La enzima es inactivada por el oxgeno. El nitrgeno molecular es muy inerte y su reduccin requiere mucha energa. Azotobacter crece en un medio liquido sin agitacin, en forma de una pelcula superficial. Es bastante sensible a la acidez pues no suele crecer por debajo de pH 6. Al microscopio se observan bacilos gram-negativos, grandes, de 4 a 6 mm de largo, acompaados de clulas de mayor tamao con paredes gruesas y apariencia de levadura, conocidas como cistos. Esta bacteria tiene una gran capacidad respiratoria, medida como velocidad de consumo de oxigeno, para proveer la energa requerida por la fijacin. Los clostridios fijadores no slo son incapaces de crecer en presencia de aire sino que generalmente son muertos por el oxgeno, a menos que se encuentren en forma de endosporos, pero pueden crecer por debajo de la pelcula de Azotobacter, generando burbujas de gas por la fermentacin de azcares.

Sulfo-oxidacin El sulfuro de hidrgeno, el azufre elemental y el ion sulfato son tres formas estables importantes del azufre. El sulfuro de hidrgeno es txico para la mayora de los organismos y los sulfuros son oxidados a sulfato por bacterias aerobias del gnero Thiobacillus y azufre elemental por bacterias fotosintetizadoras anaerobias de ambientes acuticos, el que se acumula en la clula, sufriendo una posterior oxidacin en algunos casos. La mayora de los microorganismos oxidantes del azufre son auttrofos obligados.

Sulfato-reduccin El sulfato y otros compuestos oxigenados del azufre, pueden ser reducidos a sulfuro de hidrgeno por bacterias heterotrficas anaerobias. Esta actividad microbiana es muy evidente en los barros del fondo de estanques y lagos. Suelen usar hexosas, alcoholes o cidos orgnicos como fuente de carbono, pero algunas especies crecen autotrficamente con hidrgeno molecular y tiosulfato, por ej. Desulfovibrio.


Celulolisis, amilolisis El almidn y la celulosa estn compuestos por unidades de glucosa, pero conectadas de diferente manera: uniones 1,4 a- y 1,4 b-glucosidicas respectivamente, lo que afecta a sus propiedades. La celulosa es insoluble y se digiere a mucho menor velocidad que el almidn soluble. La celulosa forma largas fibrillas a las que se encuentran intimamente asociados los microorganismos que la degradan. Muchos hongos son celulolticos, pero entre las bacterias esta propiedad est restringida a unos pocos grupos: mixobacterias, clostridios y actinomicetos. El almidn, en cambio, es hidrolizado por muchos hongos y bacterias. Las bacterias celulolticas predominan en la zona radicular y su densidad decrece en muestras tomadas a cierta distancia de la planta. Por otra parte, es el proceso fundamental que ocurre durante el compostaje de residuos agrcolas, donde predominan los microorganismos termfilos.

Solubilizacin de fosfatos Algunos mohos comunes, por ej. Penicillium, Aspergillus, Fusarium, pueden solubilizar fosfatos insolubles como polvo de huesos y apatita. Aproximadamente un dcimo de las bacterias del suelo tambin los solubilizan. La solubilizacin de fosfato de calcio se aprecia como zonas claras que rodean las colonias y generalmente se produce cuando los microorganismos forman cidos orgnicos tales como cido 2-ceto-glucnico (bacterias), c. citrico u oxlico (hongos), pero stos son rpidamente degradados por otros organismos del suelo. Los fosfatos de hierro y aluminio pueden ser solubilizados por los microorganismos productores de sulfuro de hidrgeno.

Procedimiento

Fijacin de nitrgeno molecular El medio contiene: manitol 10 g, carbonato de calcio 0,5 g, solucin salina 50 mL, solucin de oigoelementos 1 mL, agua 1 L. Se distribuye en matraces de Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, a razn de 50 mL en cada uno y se esteriliza a 110C durante 20 minutos. Sembrar unos granulos de suelo e incubar a 25-27C durante 7 das. La solucin salina contiene: fosfato dipotsico 5 g, sulfato de magnesio heptahidrato 2,5 g, cloruro de sodio 2,5 g, sulfato ferroso heptahidrato 0,05 g, agua 1 L, pH 7 - 7,5. La solucin de oigoelementos contiene 0,05 g/L de las sales siguientes: molibdato de potasio, borato de sodio, nitrato de cobalto, sulfato de cadmio, sulfato de cobre, sulfato de zinc, sulfato de manganeso, cloruro frrico. Hacia el tercer da el medio se enturbia ligeramente y en la superfiie aparece un velo grisceo. Los das siguientes el velo se pliega, dando una superficie rugosa y mamelonada que se vuelve parduzca. Finalmente caen trozos de velo dentro del liquido. A su vez el liquido se enturbia cada vez ms y suelen aparecer burbujas en el fondo. La observacin microscpica del velo muestra clulas bacilares, ovales, cocoides y a veces cistos esfricos, mientras que el material tomado del fondo permite ver bacilos esporulados Gram-positivo o variable. Medio para Azotobacter: sacarosa 20 g, fosfato dipotsico 0,05 g, fosfato monopotsico 0,15 g, cloruro de calcio 0,01 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,2 g, molibdato de sodio 0,002 g, cloruro frrico 0,01 g, azul de bromotimol (al 0,5% p/v en etanol) 2 mL, carbonato de calcio 1 g, agua 1 L, pH 6,8. Esterilizar a 110C durante 20 minutos. Medio para Derxia: Reemplazar la sacarosa por almidn o glucosa y omitir el carbonato de calcio. Medio para Azospirillum: cido mlico 5 g, fosfato dipotsico 0,5 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,2 g, cloruro de sodio 0,1 g, cloruro de calcio 0,02 g, molibdato de sodio 0,002 g, sulfato de manganeso 0,01 g, etiln -diamino-tetra-acetato frrico (al 1,64% p/v) 4 mL, azul de bromotimol (al 0,5% p/v en etanol) 3 mL, biotina 0,1 mg, agua 1 L, p H 6,8. Medio para Clostridium pasteurianum : glucosa 10 g, fosfato monopotsico 0,75 g, solucin


salina 50 mL, solucin de oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Distribuir en tubos con campanita de Durham. Luego de sembrar cubrir con agar al 1,5% fundido o vaselina estril.

Desnitrificacin El medio de cultivo contiene: nitrato de potasio 2 g, carbonato de calcio 5 g, glucosa 10 g, solucin salina 50 mL, solucin de oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Los tubos llevan dentro una campanita de vidrio y se esterilizan a 110C durante 20 minutos. Inocular unos grnulos de suelo sin agitar e incubar una semana a 25-27C. Si se ha reducido el nitrato hasta el estado de nitrgeno molecular u xido de nitrgeno quedarn retenidos en la campanita inmersa en el tubo. La formacin de nitritos se comprueba agregando 1 mL del reactivo de Griess al tubo de cultivo. Aparecer un color rosado si hay nitritos. Preparar el reactivo de Griess en el momento de usarlo, mezclando partes iguales de las soluciones siguientes:

o Disolver 0,05 g de naftilamina en 100 mL de cido actico al 30% (v/v) en agua. o Disolver 0,32 g de cido sulfanilico en 100 mL de cido actico al 30% (v/v) en agua.

Nitrificacin El medio de cultivo para formadores de nitritos contiene: sulfato de amonio 0,5 g, carbonato de calcio 1 g, solucin salina 50 mL, agua 1 L. Se distribuye en matraces de Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, a razn de 50 mL en cada uno. El medio para productores de nitratos contiene 1 g de nitrito de sodio en lugar del sulfato de amonio. Esterilizar a 110C durante 20 minutos. Sembrar unos grnulos de suelo en ambos matraces e incubar a 25-27C durante dos semanas. Formadores de nitritos. Volcar 5 mL del cultivo en un tubo de ensayo y agregar 1 mL del reactivo de Griess recien preparado. Aparecer un color rosado si se han formado nitritos por accin microbiana. Formadores de nitratos. Transferir unos 5 mL del cultivo a un tubo de ensayo y agregar 1 mL del reactivo de Griess. Si esta reaccin da negativa los microorganismos han oxidado los nitritos a nitratos. Colocar otros 5 mL de cultivo en un tubo, agregar unos 50 mg de urea y 10 gotas de acido sulfrico. Calentar para eliminar los nitritos. Luego aadir 1 mL de reactivo difenilamina por las paredes del tubo. Si en la zona de contacto aparece un color azul hay nitratos formados por accin microbiana. El reactivo difenilamina contiene: difenilamina 1 g, agua destilada 20 mL, cido sulfrico 100 mL. Colocar en frasco obscuro.

Amonificacin El medio de cultivo contiene peptona 0,2 g, solucin salina 50 mL, solucin de oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Se distribuye en tubos y se esteriliza a 110C durante 20 minutos. Sembrar unos grnulos de suelo e incubar una semana a 25-27C. Despus agregar 1 mL de reactivo de Nessler a cada tubo a ensayar. La aparicin de un color ladrillo indica la presencia de amoniaco. El reactivo de Nessler consta de dos soluciones que se mezclan en partes iguales en el momento de usar.

o Colocar en un mortero 5 g de ioduro mercrico y 3,65 g de ioduro de potasio, aadir un poco de agua destilada y triturar hasta disolver. Completar a 100 mL con agua.

o Disolver 15 g de hidroxido de potasio en lentejas en 100 mL de agua destilada.

Celulolisis El medio de cultivo contiene: nitrato de amonio 1 g, solucin salina 50 mL, solucin de oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Se distribuye en tubos con tiras de papel de 1 x 10 cm y esteriliza a 110C durante 20 minutos. Sembrar unas gotas de una suspensin de suelo, que haya sido abonado con estircol, e incubar dos a tres semanas a 25-27C.


Donde el papel sobresale del lquido se acumulan las bacterias celulolticas aerobias y suelen colorearlo. Sacar la tira de papel y colocarla en un portaobjetos para observar el ataque de las fibras bajo la lupa. Comp robar si se disgrega con facilidad al tocarla con el asa. Medio para clostridios : sulfato de amonio 0,5 g, cloruro de sodio 0,1 g, fosfato dipotsico 0,7 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,05 g, cloruro de calcio 0,05 g, celulosa en polvo 3 g, carboximetilcelulosa 1 g, extracto de levadura 1 g, azul de metileno (0,005% p/v) 1 mL, agar 15 g, agua 1 L, pH 7,0; esterilizar a 121C durante 15 minutos. Agregar 0,5 mL de clorhidrato de cistena (al 1% p/v) a cada tubo con 10 mL de medio estril fundido, sembrar de inmediato con unas gotas de la suspensin de suelo y colocar en agua fra para una rpida gelificacin.

Amilolisis El medio de cultivo contiene: almidn soluble 2 g, nitrato de amonio 1 g, solucin salina 50 mL, solucin de oligoelementos 1 mL, agar 15 g, agua 1 L. Esterilizar a 110C durante 20 minutos. Distribuir en cajas de Petri. Sembrar con unos grnulos de suelo e incubar a 25-27C. Cubrir la superficie con solucin acuosa de yodo, por ejemplo la de Lugol. La zona de hidrlisis alrededor del crecimiento microbiano aparece clara sobre un fondo azul.

Sulfato-reduccin El medio de cultivo contiene: cloruro de amonio 1 g, fosfato dipotsico 0,5 g, sulfato de magnesio heptahidrato 2 g, sulfato de sodio 0,5 g, cloruro de calcio 0,1 g, lactato de sodio (al 60% p/v) 6 mL, extracto de levadura 1 g, tioglicolato de sodio 1 g, agua 1 L. Repartir en tubos colocando 10 mL en cada uno. Esterilizar a 110C durante 20 minutos. Sembrar con unos grnulos de suelo e introducir un clavo previamente pasado por la llama y enfriado. Cubrir con agar al 1,5% fundido o vaselina. Incubar dos o tres semanas a 25-27C. Ver si el clavo se ha ennegrecido por la formacin de sulfuro de hierro debido a los microorganismos.

Sulfo-oxidacin El medio de cultivo contiene: fosfato dipotsico 0,25 g, cloruro de magnesio 0,1 g, cloruro de sodio 0, 1 g, nitrato de amonio 2 g, carbonato de calcio 5 g, agua destilada 1 L. Repartir en tubos a razn de 5 mL en cada uno y esterilizar 20 minutos a 110C. Agregar a cada tubo 1 mL de una solucin a 10% de monosulfuro de sodio y sembrar unos grnulos de suelo. Incubar a 25-27C durante dos a tres semanas. Volcar 2 mL del cultivo en otro tubo, acidificar con dos gotas de cido clorhdrico concentrado y aadir 5 gotas de solucin acuosa de cloruro de bario al 5%. p/v. La aparicin de una opalescencia indica que se han formado sulfatos por la actividad microbiana.

Solubilizacin de fosfatos El medio de cultivo contiene: extracto de levadura 2 g, glucosa 20 g, agar 15 g, agua 1 L, fosfato triclcico 2 g. Se esteriliza a 110C durante 20 minutos y se distribuye en caja de Petri. Sembrar unos grnulos e incubar a 25-27C. Observar la formacin de una zona transparente alrededor de las colonias.

Bibliografa o Fenchel T et al. Bacterial Biogeochemistry: The Ecophysiology of Mineral Cycling. Academic Press, San Diego,

1998. o Alef K & Nannipieri P. Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry. Academic Press, London, 1995. o Frioni L. Ecologa Microbiana del Suelo. Universidad de la Repblica, Montevideo, 1990.


TRABAJO N 5. Inhibidores y desinfectantes

Objetivo. Determinar la concentracin inhibitoria mnima y la concentracin letal mnima de productos comerciales usados en el campo.

Introduccin

Los agentes que producen efectos reversibles causan inhibicin sin accin mortal inmediata. Los bacteriostticos actan sobre las bacterias y los fungistticos sobre los hongos. Los compuestos de accin irreversible causan la muerte rpida. Los bactericidas y fungicidas matan bacterias y hongos, respectivamente (figura 14). La diferencia es cuantitativa ms que cualitativa. La adicin de 0,3% de fenol impide el crecimiento de Escherichia coli, pero no mata las clulas en varias horas mientras que 1% las elimina en minutos (figura 15).

La palabra desinfeccin se emple para expresar la eliminacin de cualquier agente que pudiera causar infeccin o enfermedad. Los desinfectantes son agentes de esterilizacin. Las clulas activas jvenes tienen una notable sensibilidad a estas substancias. La desinfeccin es ms rpida al aumentar la temperatura del sistema. El medio en que se encuentran los microrganismos puede alterar la eficacia de la desinfeccin, por combinacin del material orgnico con el agente activo. Tambin el pH modifica los mecanismos de desinfeccin. Los endosporos bacterianos son ms difciles de destruir que las clulas vegetativas. Tambin presentan cierta resistencia los organismos encapsulados. Otro factor que posibilita la desinfeccin es un contacto eficaz. La humedad es esencial y los agentes tensoactivos mejoran dicho contacto.

Las pruebas de la concentracin inhibitoria mnima (CIM) y la concentracin letal mnima (CLM) son tiles para comparar la eficacia de diversos productos qumicos contra un organismo determinado, o la sensibilidad de diferentes organismos a un mismo producto. Los microorganismos comnmente usados son cepas de coleccin de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, para establecer la accin frente a organismos coliformes, seudomnadas, clostridios y otros aerobios, respectivamente. El tamao del inculo suele ser de 104 a 10 6/mL, segn el microorganismo y la substancia estudiada.

Procedimiento

Concentracin inhibitoria mnima Preparar una solucin al 1/10 p/v v/v del compuesto en agua destilada estril. Si se trata de un curasemillas con un principio activo poco soluble, usar alcohol o acetona al 1/2 v/v en esta primera dilucin. Poner 1 mL de la solucin 1/10 en cada uno de los 9 tubos de ensayo estriles. Aadir al primer tubo 1 mL de agua destilada estril, al segundo 2 mL, al tercero 3 mL y as sucesivamente hasta agregar al noveno 9 mL, obteniendo diluciones que van desde 1/20 a 1/100. Transferir 1 mL de la dilucin original al 1/10, y 1 mL de cada una de las otras diluciones a sendos tubos con 9 mL de caldo nutritivo (en el caso del desinfectante) o agua estril (en caso del curasemillas), comenzando por la ms diluida.. Las diluciones obtenidas van de 1/100 a 1/1000.

Figura 15

Figura 14


Bacterias Aadir 0,1 a 0,2 mL de un cultivo de 24 hs en caldo, de Staphylococcus aureus o Escherichia coli, a un tubo con 9 mL de caldo nutritivo de tal manera que se obtenga un suspensin de turbiedad poco apreciable a simple vista. Luego transferir 0,2 mL de esta suspensin bacteriana a cada uno de los tubos con diluciones de desinfectante en caldo. Incubar a 35C durante 48 hs.

Hongos Agregar agua estril (con 0,05% v/v de Tween 80) al tubo de cultivo de 5 das a 25C en medio de Czapek o Sabouraud, de Penicillium expansum, Aspergillus flavus o Cladosporium cladosporioides , agitando para suspender los esporos. Aadir 0,5 a 1 mL de la suspensin de esporos a un matraz con 50 mL de agar de Sabouraud, fundido y enfriado a 45-50C. Mezclar y volcar en cuatro cajas de Petri estriles. Una vez gelificado, se depositan discos de papel de filtro de 4 mm de dimetro previamente humedecidos con las diluciones del producto, a razn de tres discos por placa. Se incuba a 25-28C durante 5 das.

Concentracin letal mnima Preparar, como se indic arriba, una serie de tubos con 10 mL de cada una de las diluciones del compuesto, que van desde 1/100 a 1/1000, utilizando agua estril en lugar de caldo. Adicionar a cada dilucin 0,2 mL de una suspensin bacteriana preparada como se describi arriba. Anotar la hora a la cual se agreg al primer tubo, y a intervalos de 2, 5, 10 y 15 minutos cargar un asa (con un dimetro interno de 4 mm) de cada dilucin y llevar a un tubo de caldo nutritivo que contiene 0,1 % p/v de cido tiogliclico para neutralizar la accin del desinfectante remanente. Incubar a 35C durante 48 hs.

Bibliografa o Collins CH, Lyne PM, Grange JM. Collins and Lynes Microbiological Methods. 7 ed. Butterworth Heinemann,

Oxford, 1999 o Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962


TRABAJO N 6. Digestin anaerbica de residuos agrcolas

Objetivo. Transformar los residuos agrcolas en biogas y un lodo til como fertilizante.

Introduccin

Se emplea estircol, paja y lodo procedente de otro digestor. El gas formado en la fermentacin metanica es una mezcla de metano y dixido de carbono. Las denominadas bacterias metnicas implicadas pertenecen a los gneros Methanococcus, Methanobacterium, Methanosarcina y otros. Dependiendo de la composicin del material de partida, se puede producir biogas con alrededor de 70%. de metano. Estas bacterias son anaerobias estrictas y reducen al dixido de carbono. Las bacterias metnicas se diferencian de las dems debido a su peculiar estructura de la pared y la membrana celular, y forman parte de las arqueobacterias junto a las termfilas y las halfilas. Se encuentran en el rumen, los sedimentos de aguas estancadas y en los digestores de las depuradoras de aguas residuales. Las metanobacterias slo podrn desarrollarse cuando por accin de las bacterias facultativas se haya consumido todo el oxgeno, y las fermentadoras hayan producido suficiente dixido de carbono e hidrgeno a partir de almidn, celulosa o aminocidos. Las bacterias metnicas son sensibles al descenso del pH producido por los cidos orgnicos formados por los clostridios. Pero en un sistema en equilibrio consumen los cidos a medida que aparecen manteniendo un ambiente neutro. Las instalaciones pequeas de biogs permiten la obtencin de energa en zonas rurales.

Procedimiento

Equipo de digestin: 1 fermentador, 2 mecanismo de agitacin con varilla, 3 material a fermentar, 4 bao de agua, 5 acuario, 6 calentador conectado a una bomba de circulacin, 7 termmetro y termostato, 8 depsito de gas (neumtico de bicicleta), 9 frasco lavador (indicador de gas y lavado de CO2), 10 frasco lavador abierto (para equilibrar la presin), 11 llave de triple va, 12 tubo de vidrio con virutas de hierro (arrestallamas), 13 mechero. Colocar en un frasco de 1 L, unos 200 g de estircol fresco de vaca, 25 g de paja cortada en trozos pequeos y agua hasta unos 5 cm de la boca. Poner un tapn atravesado por un agitador y un tubo para la salida de los gases. Instalar el fermentador en un bao de agua a 37C. Unir la salida a un frasco lavador y ste a otro frasco abierto para equilibrar la presin, y a una llave de triple via que est conectada al

Figura 16


depsito de gas y al mechero. Entre el mechero y la llave de triple via se coloca un tubo de vidrio lleno con virutas de hierro para evitar el retroceso de la llama. Controlar la hermeticidad de todos los cierres. Agitar diariamente la mezcla en descomposicin. Luego de uno o dos das vaciar la cmara para eliminar la mezcla explosiva de biogs y aire. Dejar hasta que se llene nuevamente el depsito y comprobar cmo arde el biogs a la salida del mechero. Controlar diariamente el nivel de agua del bao, la temperatura y la cantidad de gas.

Bibliografa o Madigan TM et al. Brock- Biologa de los Microorganismos. Prentice Hall, Madrid, 1998 o Jagnow G, Dawid W. Biotecnologa. Acribia, Zaragoza, 1991


TRABAJO N 7. Morfologa microscpica de hongos

Objetivo. Conocer las estructuras microscpicas de mohos, levaduras y setas.

Introduccin

Micelio es el cuerpo filamentoso de un hongo y un trozo del mismo se denomina hifa. Las hifas pueden presentar septos y entonces el micelio est tabicado. Si los tabiques estn ausentes es un micelio contnuo. Rizoides son las hifas de succin que penetran en el substrato. Apresorios son unas hifas achatadas de sostn que se adhieren al hospedador o substrato. Cuando el cuerpo del hongo es una sola clula se lo llama levadura. Los cortos filamentos formados por las clulas brotantes de la levadura se conocen como pseudomicelio. Plectnquima es un conjunto de hifas que se asemeja a un tejido. Esclerocio es un plectnquima generalmente macroscpico que puede permanecer largo tiempo con vida latente. Clamidospora es una clula de resistencia, terminal o intehifal, con pared gruesa y substancias de reserva. Las esporas son los elementos de multiplicacin de los hongos. De acuerdo a su forma y origen reciben distinto nombre como se observa en la figura 17 . Anamorfo es el hongo con reproduccin asexuada o mitosprica. Los conidios son mitosporas

que se hallan ssiles o sobre un conidiforo (simple o ramificado), o dentro del plectnquima de un picnidio. Un esporangio contiene numerosos mitosporas dentro de una membrana peridial simple. Teleomorfo es el hongo con reproduccin sexuada o meiosprica. Las ascosporas son meiosporas que se encuentran dentro de los ascos libres de las levaduras, o los ascos encerrados en el plectnquima de un ascoma o sobre el mismo. Las basidiosporas surgen de los esterigmas del basidio donde ocurri la meiosis. Los basidios generalmente se encuentran sobre laminillas, tubos o espinas del basidioma. Las figuras 17 y 18a muestran esquemas de diversas estructuras

fngicas. Los conidiforos simples son cortos filamentos que generalmente nacen perpendiculares a la hifa y originan en su extremo el o los conidios. Los ramificados suelen terminar en ramas con forma de botelln (filides) de donde surgen los conidios. Algunas estructuras son tpicas de gneros comunes y llevan su nombre: cabeza aspergilar, penicilio. Tambin los conidiforos simples o ramificados suelen estar reunidos en: coremio (como un fsforo), esporodoquio (como una almohadilla), picnidio (dentro de un plectnquima con forma de pera). Un esporangio contiene innumerables esporas, pero un esporangiolo slo contiene tres o cuatro y se encuentra en el pice de una rama lateral del esporangiforo. La columela es la punta dilatada del esporangiforo y est dentro de la esfera del esporangio. En algunos casos, unas pocas esporas estn reunidas en merosporangios (bolsitas como dedos de guante) que se asientan sobre la columela. Los ascomas tienen distinta forma: cleistotecio (cerrado) que se rompe al madurar las esporas, peritecio (forma de pera) con abertura u ostolo por donde salen las esporas maduras, apotecio (forma de copa) con los ascos expuestos.

Figura 17


Los basidiomas ms conocidos son: el champin con laminillas en la parte inferior del sombrero donde se originan las esporas, el boleto con poros en vez de laminillas, la bola de nieve que al romperse libera las esporas maduras (figura 18b). Hay otras formas como el basidioma excntrico de los pleurotos, los estantes rgidos que crecen sobre troncos, las formas gelatinosas.

Procedimiento

Microcultivos Observar los microcultivos con el objetivo 4x y una vez enfocada una estructura prxima al cubreobjetos o adherida al mismo, pasar al objetivo 10x. Luego para ver detalles se puede pasar al objetivo seco de mayor aumento, si la distancia focal de la lente lo permite.

Preparaciones Hacer preparaciones en fresco colocando un trozo de micelio en una gota de lactofenol, o colorante de Guegun, y desagregar con ayuda de dos agujas, montadas en sendos mangos . Poner un cubreobjetos y observar al microscopio. Dibujar las estructuras vistas. El lactofenol contiene: cido lctico 100 mL, fenol 20 g, glicerol 50 mL, agua 40 mL.

Bibliografa o Deacon JW . Introduccin a la Micologa Moderna. Limusa-Noriega, Mxico, 1993 o Alexopoulos CJ. Introduccin a la Micologa. EUDEBA, Buenos Aires, 1966

Figura 18a


TRABAJO N 8. Mohos toxignicos

Objetivo. Reconocer los mohos comunes que deterioran los granos y forrajes almacenados pues suelen producir toxinas que afectan al hombre y los animales.

Introduccin

Los problemas causados por los hongos en alimentos y forrajes son numerosos. Los causados por micotoxinas son, con frecuencia, costosos debido a que se descubren muy tarde para prevenir las prdidas econmicas. Una herramienta importante en el control micolgico de cereales y especias, es el uso de mtodos simples de identificacin especfica que se realiza en base al aspecto de las colonias y la micromorfologa en varios medios de cultivo a distintas condiciones de incubacin.

Procedimiento

Hacer repiques de un cultivo puro en tres puntos equidistantes de cada placa con los medios: agar malta, agar Czapeck, agar Czapeck glicerol, agar papa sacarosa, e incubar a 25C durante 7


dias. Adems repicar en estras sobre dos tubos de agar malta o Czapeck e incubar uno a 5C y el otro a 37C. El cultivo en agar papa sacarosa se incuba a la temperatura ambiente con luz solar indirecta. La composicin de los medios de cultivo es la siguiente: Agar malta: extracto de malta 20 g, peptona 1 g, glucosa 20 g, agar 20 g, agua destilada 1 litro; esterilzar a 121C durante 15 minutos. Solucin concentrada de Czapeck: nitrato de sodio 30 g, cloruro de potasio 5 g, sulfato de magnesio 5 g, sulfato ferroso 0 , l g, agua destilada 100 mL; mantener a la temperatura ambiente. Agar Czapeck: fosfato dipotasico 1 g, solucin de Czapeck 10 mL, extracto de levadura 5 g, sacarosa 30 g, agar 15 g, agua destilada 1 litro; esterilizar a 121C durante 15 minutos. Agar Czapeck glicerol: disolver las sales y extracto, como el anterior, en una mezcla de 250 mL de glicerol y 750 mL de agua destilada; esterilizar de igual manera. Agar papa sacarosa: hervir 200g de papa rallada en 1 L de agua, durante media hora, y completar el volumen a un litro, aadir 10 g de sacarosa y 15 g de agar, esterilizar a 110C durante 20 minutos. Observar y registrar el aspecto macromorfolgico de las colonias. Hacer preparaciones en fresco con lquido de Patterson o colorante de Guegun. Observar al microscopio y dibujar las estructuras. Si es necesario prolongar la incubacin. Consultar las claves de la bibliografa para identificar el gnero (si es posible la especie) y cules son las micotoxinas que producen.

Bibliografa o Pitt JI, Hocking AD. Fungi and food spoilage. Blackie A&P, London, 1997 o Carrillo L. Los hongos de los Alimentos y Forrajes. 2002 http://www.unsa.edu.ar (material

bibliogrfico)


TRABAJO N 9. Micorrizas

Objetivo. Observar los hongos asociados con plantas herbceas y rboles constituyendo las micorrizas. Preparar un inoculante para ectomicorrizas.

Introduccin

Las plantas parecen totalmente autnomas, pero la mayora estn asociadas con hongos, en sus races formando micorrizas o, endfitos dentro del tallo.

Endomicorrizas Cuando el hongo penetra en el interior de las clulas de la raz, formando minsculas arborescencia y vesculas, se las llama endomicorrizas vesculo - arbusculares. Los arbsculos suelen tener una vida efmera, de algunos das a pocas semanas, siendo luego digeridos por el hospedador. Los hongos de este tipo de micorrizas, generalmente presente en la vegetacin herbcea, pertenecen a la familia de la endogonceas. Hay otros tipos de endomicorrizas como las que forman ovillos intracelulares en las orqudeas Cada una de las diferentes especies de orqudeas tiene una alta especificidad por un hongo particular que generalmente es un zigomiceto. El grado de interdependencia es tal que en muchos casos ninguno de los asociados puede ser cultivado sin el otro, pues forman una verdadera simbiosis. Las races se infectan con hongos de las micorrizas vesculo-arbusculares por las hifas desarrolladas a partir de propgulos presentes en el suelo, los que pueden ser esporos o estructuras de resistencia presentes en las races muertas.

Ectomicorrizas En ellas el hongo rodea la raz con un manto de filamentos y una red miceliar penetra entre las clulas radicales pero no dentro de ellas. Los hongos que forman ectomicorrizas en rboles son macrocrpicos y tpicamente basidiomicetos superiores, por ejemplo Amanita, Boletus, Pisolithus, Suillus. Ms raramente los ascomicetos forman micorrizas, por ejemplo Tuber. Es poca la especificidad de estas asociaciones ya que varios rboles pueden formar micorrizas con un hongo dado y viceversa. Algunas especies de rboles, por ej. los eucaliptos, poseen a la vez ecto- y endo-micorrizas.

Inoculacin La falta de micorrizacin acarrea problemas en el transplante de las plntulas de rboles y plantas ornamentales, excepto en los casos en que el suelo contenga especies fngicas. Para inocular con cultivos puros, el substrato (suelo, turba) debe ser previamente pasterizado con el fin de disminuir la poblacin fngica nativa competitiva. Los hongos son incorporados al substrato de siembra como trozos de races micorrizadas, pedazos de ascoma o basidioma, o micelio obtenido in vitro. El agregado de micelio ofrece mayores garantas en el caso de hongos que se desarrollan bien en cultivo axnico. El primer paso de toda inoculacin consiste en la seleccin del hongo. Los siguientes obtener el cultivo y multiplicarlo para aadirlo al suelo donde se coloca la plntula crecida en condiciones aspticas.

Procedimiento

Observacin de micorrizas Lavar la raz con agua corriente. Observar su aspecto y seleccionar un trozo. Cortar en porciones de un centmetro de largo y colocarlos en solucin de hidrxido de sodio o potasio al 10% p/v. Calentar a 90C durante 30 minutos o ms si es necesario. Cuando el material es obscuro sumergirlo en agua oxigenada de 10 volmenes durante 15 minutos, sino omitir este paso. Lavar 4 veces con agua corriente. Poner los trozos en solucin de cido clorhdrico 0,1 N


durante 10 minutos. Colorear con azul-lactofenol a 90C por 5 minutos. Pasar a lactofenol. Colocar un trozo de la raz tratada entre dos portaobjetos y aplastarla. Observar al microscopio entre porta y cubreobjetos. El lactofenol contiene: cido lctico 100 ml, fenol 20 g, glicerol 50 mL, agua 40 ml. La solucin colorante se prepara mezclando 5 mL de solucin acuosa de azul de algodn o azul tripn o azul de metilo al 1% p/v, con 95 mL de lactofenol.

Preparacin del inoculante para ectomicorrizas Cortar el basidioma con un instrumento previamente mojado en alcohol y encendido. Con un gancho o pinza estril tomar porciones del interior del sombrero y depositarlas sobre la superficie de una placa de agar malta levadura. Incubar a 25-27C, dos o ms semanas en la obscuridad. El agar malta levadura contiene: extracto de malta 20 g, extracto de levadura 2 g, agar 20 g, agua 1 L. Se esteriliza a 121C durante 15 minutos. Repicar en 50 ml de medio lquido de Melin Norkrins modificado en un matraz de Erlenmeyer de 250 mL e incubar a 25-27C con una agitacin de 100 rpm y en la obscuridad, el tiempo requerido para un buen crecimiento. El medio lquido de Melin Norkins modificado contiene cloruro de calcio 0,05 g, cloruro de sodio 0,025 g, fosfato monopotsico 0,5 g, fosfato diamnico 0,25 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,15 g, cloruro frrico (al 1% p/v) 1,2 mL, extracto de malta 1,5 g, sacarosa 10 g, agua 1 litro. Esterilizar a 110C durante 20 minutos. Homogeinizar el cultivo, mezclar con suelo pasterizado previamente con vapor de agua a 60C. Llenar unas macetas pequeas y colocar los plantines. Llevarlos al invernculo.

Bibliografa o Deacon JW Introduccin a la Micologa Moderna. Limusa-Noriega, Mxico, 1993 o Frioni L. Ecologa Microbiana del Suelo. Universidad de la Repblica, Montevideo, 1990


TRABAJO N 10. Microorganismos del agua

Objetivo. Conocer la probable contaminacin del agua con patgenos, a travs de la bsqueda de microorganismos indicadores y otros.

Introduccin

El agua es un sistema ecolgico en equilibrio que constituye la base de todas las comunidades vivas. Como es indispensable se procura aumentar sus recursos, especialmente almacenndola, y mejorar su calidad mediante purificacin. El anlisis biolgico del agua para determinar la calidad sanitaria utiliza mtodos que indican el grado de contaminacin con excrementos. Se emplean tcnicas para la deteccin y recuento de organismos indicadores, porque principalmente interesa conocer el peligro potencial de la transmisin de patgenos a travs del agua, antes que la bsqueda de stos.

Coliformes Los coliformes son bacterias de origen entrico que son capaces de fermentar la lactosa con produccin de gas. Los gneros de enterobacterias incluidos en el grupo de los coliformes a efectos de anlisis de aguas son Citrobacter, Enterobacter, Escherichia y Klebsiella . Este grupo es el principal indicador de la conveniencia del agua para uso domstico, industrial u otro. La prueba de fermentacin en una serie de tubos (caldo bilis lactosa verde brillante, caldo McConkey, etc.) con determinacin del nmero ms probable (NMP) fue la primera usada, luego se incorpor la tcnica de filtracin por membrana que, con algunas limitaciones, es comparable a la anterior, y finalmente se introdujo el substrato cromognico ONPG (o- nitrofenil-b-D- galactopiransido) al medio liquido para NMP. Comnmente para determinar el NMP se realiza una prueba presuntiva basada en la fermentacin de la lactosa con produccin de gas que queda atrapado en la campanita. La ausencia de gas se interpreta como ausencia de coliformes, pero su presencia es una posibilidad de presuncin pero no de seguridad puesto que algunas bacterias lcticas suelen producir gas. El medio de cultivo liquido lleva un indicador de pH para facilitar la lectura y sales biliares para inhibir el desarrollo de las bacterias no entricas. Los coliformes presentes en el intestino y las heces de animales de sangre caliente, incluido el hombre, son capaces de producir gas al fermentar lactosa a 44,5C. Ms especifica es la bsqueda de Escherichia coli por cultivo sobre placas de medios que permiten la deteccin en 7 horas (m-7hFC) o en 2448 horas (EMB, Endo y otros), o bien un medio liquido con el substrato fluorognico MUG (4-metilumberiferil-b-D-glucurnido) especifico para bacterias con la enzima b-glucuronidasa (24 hs a 44,5C). En los casos que se requiere confirmar la presencia de E. coli se emplean las pruebas de: fermentacin de lactos

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