LV 207 AHA L2-S4, 2012-2013 - abiens.snv.jussieu.frabiens.snv.jussieu.fr/AHA/docs/LV207/Cours1 Endocrino 5-4-13.pdf · 1.3- Boucles de régulation 1.4- Transport et dégradation

ENDOCRINOLOGIE :

1. Introduction à l’Endocrinologie (5/04/13), Mme K. El Hadri (MCU, UPMC)

2. Régulation de la glycémie/TD (12/04/13), Mme A. Grosfeld (MCU, UPMC)

3. Régulation de la prise alimentaire par la leptine/TD/CC

(19/04/13), Mme K. El Hadri

Mme Khadija EL HADRI-ZEGOUAGH

[email protected]

Mme Alexandra Grosfeld

[email protected]

LV 207 – AHA

L2-S4, 2012-2013

I/ Le système Endocrinien: 1. Références historiques 2. Définitions 3. Mode des communications hormonales

XIXe siècle

Nature et action physiologique des principales glandes endocrines

Période de la physiologie endocrinienne classique (ablation)

Références historiques

Arnold Adolf Berthold est un médecin, physiologiste et anatomiste allemand, né à Soest le 26 février 1803, mort le 3 janvier 1861 à Göttingen. Les expériences de Berthold remontent à 1849:

Berthold supposait que les testicules secrétaient une substance qui allait dans le sang et agissait pour donner les caractères mâles au coq. Les expériences de Berthold ont ouvert la voie à l’endocrinologie. L’ablation d’une glande endocrine puis sa réinsertion permettait d’évaluer le rôle de cette glande au niveau de l’organisme.

• Castration de jeunes coqs crêtes de petite taille, chantent peu, ne s’intérèssent pas aux poules, ne se battent pas. • Les testicules sont replacés au niveau de la cavité abdominale les caractères sexuels secondaires se développent.

E.H. Starling

William Bayliss was a British physiologist who, with Ernest Starling, discovered the first hormone. They discovered a chemical compound that stimulates the secretion of pancreatic digestive juice when food enters the intestines. They called this chemical secretin and called this type of chemical a hormone

William Bayliss

Première moitié du XXe siècle

• Création du terme « hormone » par Bayliss et Starling (1905)

• Dominée par la biochimie endocrinienne

Mise en évidence, isolement et détermination de la structure de la plupart des

hormones

Ex: identification de la séquence peptidique de l’insuline – Sanger - Prix Nobel 1958


Deuxième moitié du XXe siècle

• Recherche du mode d’action des hormones

Ex: Shuterland - Prix Nobel 1971 – adrénaline et glucagon / AMPcyclique

• Mise au point du dosage radioimmunologique des hormones (RIA).

Ex: RosalynYallow –Prix Nobel 1977 – RIA insuline

• Naissance de l’endocrinologie moléculaire :

hormones peptidiques et hormones stéroïdes

liaison hormone récepteur (liaison d’un radioligand à l’équilibre)

• Développement de la neuroendocrinologie


Earl Wilbur Sutherland jr. "For his discoveries concerning the mechanisms of the action of hormones"

Rosalyn Yalow

From the University of Illinois. She developed the technique of radioimmunoassay (RIA) by combining techniques from radioisotope tracing and immunology.

Le système Endocrinien

• Tout organe qui sécrète une hormone dans le sang fait partie du système endocrinien

• Hormone: messager sécrété dans le sang par une glande endocrine ou un organe/tissu exerçant une fonction endocrine

• L’hormone agit, à distance ou à proximité, sur un tissu cible

• L’action de l’hormone passe par un récepteur spécifique

• Les hormones peuvent appartenir à divers catégories de substances chimiques

Définitions

Les glandes endocrines, de petites dimensions, sont disséminées dans tous l’organisme

PRINCIPALES GLANDES ENDOCRINES

Sécrètent des substances à l’ extérieur de l’organisme, souvent

par l’intermédiaire d’un canal excréteur

• glandes sudoripares

• glandes salivaires

• glandes sébacées

• le pancréas exocrine

• glandes mammaires

GLANDES EXOCRINES

ENDOCRINE

cellules endocrines

courant sanguin

cellules cibles

hormone

- Sécrétion dans le courant sanguin

- Cellule cible à grande distance

- Mode de communication répandu

Mode d’action des hormones

PARACRINE

cellule envoyant le signal cellule cible

médiateur local

- Sécrétion dans le milieu extracellulaire

- Cellule cible en voisinage

- Médiateur chimique local (prostaglandines…)


AUTOCRINE

- Agit sur la cellule elle-même

- Médiateur local via le milieu extracellulaire (facteurs de croissance…)


synapse

neurone

corps

cellulaire

axone

neurotransmetteur

cellule cible

Mode d’action des neurotransmetteurs

- Neuromédiateur: molécule régulatrice libérée par des axones dans une synapse - Concentration haute

NEURONALE

Caractéristiques Système endocrine Système nerveux

Anatomie dispersion des organes endocrines "câblé"; lien fonctionnel entre les neurones

pas de lien anatomique avec cellules

cibles et les cellules cibles; continuité fonctionnelle

Messager chimique Hormone sécrétée dans le sang

Neurotransmetteur libéré dans la fente

synaptique

Diffusion longue; transportées par le sang très court; diffusion dans la fente synaptique

Spécificité d'action

récepteurs spécifiques au niveau de

cellules cibles

récepteurs spécifiques au niveau de cellules

cibles

Vitesse de réponse lente - minutes à heures rapide - millisecondes

Durée d'action longue-minutes à jours brève (millisecondes)

Fonctions Contrôles inscrits dans la durée Coordination de réponses rapides et précises

Comparaison des systèmes endocrine et nerveux

Taux Hormonal

Réceptivité tissulaire

Régulation du métabolisme énergétique

Régulation des grandes fonctions

Biosynthèse Sécrétion Dégradation

Nombre de récepteurs

Capacité de liaison

Capacité de transduction

La base des régulations Endocriniennes

II/ La base des régulations endocriniennes 1. Régulation du taux hormonal:

1.1- Biosynthèse des hormones

• Hormones peptidiques, polypeptidiques, protéiques ou glycoprotéiques

• Hormones aminées

• Hormones stéroïdes

1.2- Sécrétion des hormones

1.3- Boucles de régulation

1.4- Transport et dégradation

Biosynthèse des hormones

H. Peptidiques/Protéiques 1

H. Stéroïdiennes 2 H. Amines:

• Catécholamines

• Thyroïdiennes

• Mélatonine

3

Le taux circulant des hormones

• Constituent la majorité des hormones et de NT

• Peptidiques: courte chaîne d’AA Ocytocine = 9AA ou encore la TRH = 3AA • Protéiques ou polypeptidiques: longue chaîne d’AA

ou association d’au moins deux peptides (INS) • Codées par le génome • Le premier transcrit correspond à une pré-hormone

Biosynthèse des hormones peptidiques/protéiques

Clivage,Glycocosylation…

(1)

(2)

(3)

(4)

Niveau d’expression

Transcriptionnel

Post-transcriptionnel

traductionnel

Post-traductionnel

Biosynthèse des hormones stéroïdes

Etape

mitochodriale

Cholestérol

Néosynthèse hépatique

Origine alimentaire

Desmolase

Gonades (testicules/ovaires)

Glande surrénale (Cortex/Médulla)

Biosynthèse des hormones amines

Cathécholamines:

Noyau catéchol + une amine

3

Médullo-surrénale

Système nerveux

sympathique

Mélatonine:

Dérivée du tryptophane

Glande pinéale (épiphyse)

Biosynthèse des hormones amines H. thyroïdiennes

Les cellules sécrétant les hormones thyroïdes forment des follicules sphériques contenant une substance colloïde.

Cellule C

La cellule folliculaire produit 2 hormones dérivées de la tyrosine: La tétraiodothyronine, T4 ou thyroxine La triiodothyronine ou T3 Le principal constituant du colloïde est la thyroglobuline.

Les cellules C sécrètent une hormone peptidique, la calcitonine métabolisme du calcium

Anatomie de la glande thyroïde

21

Synthèse et stockage des hormones thyroïdiennes

exocytose

endocytose

extracellulaire

tyrosine

Na+

Iode alimentaire

(30 µg:J)

• Stockage (2-3 mois) sous forme de thyroglobuline (colloïde) • Par jour: 80 µg de T4 et 4 µg de T3

Désiodation de la T4 en T3 au niveau des cellules cibles

Biosynthèse des amines H. thyroïdiennes

1/ la thyroglobuline (600KDa) contenant la tyrosine est synthétisée dans la cellule folliculaire et exportée par exocytose dans le colloïde 2/ l’iode d’origine alimentaire est transporté du sang vers le colloïde grâce à un transport actif via une pompe Iode/Na+-ATPase 3/ dans le colloïde l’iode réagit avec la tyrosine de la thyroglobuline. La liaison d’un atome d’iode donne la monoiodotyrosine (MIT) Celle de deux atomes d’iode donne la diiodotyrosine (DIT). 4/ le couplage des tyrosines iodées donne naissance aux hormones thyroïdiennes. DIT + MIT triiodothyronine ou T3 DIT + DIT tétraiodothyronine ou T4 ou thyroxine









Sécrétion des hormones

H. Peptidiques/Protéiques; Catécholamines 1

H. Stéroïdiennes 2

Exocytose Diffusion

membranaire

Régulation du taux hormonal

5/ En cas de stimulation appropriée, les cellules folliculaires captent par endocytose une portion de colloïde contenant de la thyroglobuline. 6/ La protéolyse enzymatique libère des hormones, T3 et T4 ainsi que les iodotyrosines inactives MIT et DIT 7/ Les T3 et T4 sont liposolubles ou lipophiles et traversent la membrane des cellules folliculaires pour gagner la circulation sanguine. 8/ L’iode est détaché des MIT et DIT et l’iode libre est réutilisé pour la synthèse d’hormone.

Sécrétion des H. Thyroïdiennes 3









les hormone thyroïdiennes

TRH: Thyrotropin Releasing Hormone

TSH: Thyroïd Stimulating Hormone

Hypophyse

Hypothalamus

Thyroïde

Régulation du taux hormonal Boucles de régulation: mise en jeu d’une hormone

Cellules b pancréatiques

+

Glucose

INS

Boucles de régulation

Mise en jeu d’un métabolite, le glucose

Apport alimentaire

Tissu adipeux

+

Muscle

+ Utilisation du glucose

Hyperglycémie

Normalisation de la glycémie (1g/L)

2h









30

Transport dans le sang

Les différentes familles d’hormones

Peptides

Stéroïdes

Solubles dans le plasma (ou liées)

catécholamines

Hormones thyroïdes

Liées à des protéines plasmatiques ou à des protéines transporteur spécifique

Circulation et métabolisme des hormones

Régulation du taux hormonal









2. Récepteurs hormonaux

1. Récepteurs des hormones lipophiles

2. Récepteurs des hormones hydrophiles

Taux Hormonal





Régulations Endocriniennes

?

Événements intracellulaires:

1. Modification de la perméabilité de canaux

2. Action par l’intermédiaire d’un second messager qui modifie l’activité de protéines préexistantes

3. Modification d’expression génique de protéines cibles

Récepteurs hormonaux

Glande endocrine

H

R *

H. Lipophiles: récepteur nucléaire

Événement cellulaire: 3

H. Hydrophiles: récepteur membranaire

Événements cellulaires: 1, 2et 3

Réponse cellulaire

• Prolifération

• Différenciation

• Apoptose….

Mode d’action des hormones lipophiles H. thyroïdiennes

Mode d’action des hormones lipophiles

H. Stéroïdes

III/ Récepteurs membranaires et signalisation intracellulaire

3.1. Régulation du nombre de récepteurs

3.2. Capacité de liaison, récepteur/hormone

3.3. Cascade de signalisation et seconds messagers intracellulaires

3.4. Signalisation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG)

Taux Hormonal





Régulations Endocriniennes




Arrêt de la transduction du signal

• Nombre de récepteurs (500 à 500 000/cellule) • Nombre régulé par: endocytose

expression génique

• Si taux d’hormone anormalement élevé: désensibilisation (adaptation) • Les cellules doivent être capables de mettre un terme aux voies de signalisation activées



[H] + [R] [HR]

« EXPERIENCE DE LIAISON D’UN RADIOLIGAND A L’EQUILIBRE » Mise au point au début des années 1970

k1

k2 4 critères:

Haute affinité Saturabilité Spécificité Réversibilité

Capacité de liaison:

Principe : Pour quantifier le nombre de récepteurs présents dans une quantité fixe d’extrait protéique tissulaire ou cellulaire (protéines membranaires pour quantifier des récepteurs membranaires), l’idée est d’utiliser deux propriétés du récepteur hormonal (R) : ‘’R’’ reconnaît et lie une molécule avec une grande spécificité et une forte affinité. ‘’R’’ est une molécule rare dans la cellule. Selon ces deux critères, l’utilisation de doses croissantes de l’hormone avec une quantité fixe d’extrait protéique permet de saturer les ‘’R’’ et de pouvoir les quantifier à saturation.

On utilise une hormone ou ligand (L) marqué à l’aide d’un radioélément (3H ou 125I), le marquage radioactif permet de pouvoir quantifier la proportion d’hormone liée à l’extrait. Expérimentalement, on va donc quantifier de la radioactivité (*) liée à l’extrait membranaire -> B (Bound, radioactivité liée).

Bmax

Bmax/2

KD

« EXPERIENCE DE LIAISON D’UN RADIOLIGAND A L’EQUILIBRE »


KD: constante de dissociation, reflète l’affinité du récepteur pour l’hormone

Bo

un

d (

fmo

l/m

g d

e p

roté

ines

)

Récepteurs membranaires: les seconds messagers intracellulaires

AMPc GMPc DAG IP3

Second messager Amplification du signal

hormonal Cascade

Réponse cellulaire

• Liaison de l’hormone disposition des hélices transmembranaires modifiée interaction du récepteur avec les protéines G • Il existe plusieurs familles de RCPG, regroupés selon leurs analogies de structure primaire et les sites d’interaction avec les hormones

RCPG

Couplage des RCPG

Diversité des protéines G hétérotrimériques

• La sélectivité de couplage d’un récepteur à une protéine G dépend de la structure du récepteur. • La plupart des récepteurs peuvent interagir avec plusieurs protéines G différentes. • La stimulation d’un seul type de protéine G hétérotrimérique peut initier plusieurs voies de signalisation par les sous unités a, et par les sous-unités b/g

RCPG

Cycle d’activation des protéines G

Échange Hydrolyse

activité GTPasique

IP3

DAG PLC

PIP2

Action des RCPG via la phospholipase C (PLC)

Ca+

PKC

Ca2+

Réponse cellulaire

R

Gq

PIP2

ligand

Action des RCPG via la phospholipase Cß (PLCß)

Hormone

Action des RCPG via l’adénylate cyclase (AC) et l’AMPc

PDE: phosphodiestérase

Gs: protéine G hétérotrimérique de type stimulateur

PKA: protéine Kinase AMPc-dépendante

5’AMP

PDE

Gs

Cascade de phosphorylations

H H

Adrénaline Rc. ß-adrénergiques Rc a-adrénergiques

Earl Wilbur Sutherland 1960

Noradrénaline

Effets post-traductionnels de la PKA

Gs

PKA

Phosphorylation de protéines cytosoliques

Activation

Inactivation

R: Sous unité régulatrice C: Sous unité catalytique

Effet court terme

Gs

CREB: cAMP Response Element Binding protein, un facteur de transcription.

Effets transcriptionnels de la PKA Effet long terme

IV/ Exemples de méthodes utilisées en

Endocrinologie

Taux Hormonal





Méthodes d’exploration du système endocrinien

ELISA

Western-blot, PCR…

Liaison d’un radioligand à l’équilibre

En réponse à l’hormone:

Evaluation de l’activation de partenaires de signalisation (TD)

Mesure de production d’un Sc. Messager

Effet cellulaire (prolifération, contraction…)

IHC

Dosage d’une hormone par ELISA

ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay

déterminer des concentrations sériques d'anticorps (comme pour le test HIV …)

déterminer des concentrations sériques d'antigènes comme les hormones

Détecter des allergènes alimentaires, dans l'industrie alimentaire, comme le lait, les cacahuètes, les noix et les œufs.

Applications:

Cette technique simple et facile d'emploi est cependant, limitée par la disponibilité d’anticorps spécifique

Limites:

Kit ELISA

Principe:

Dosage d’une hormone par ELISA

Substrat

Substrat coloré

Substrat coloré, dosable au spectrophotomètre

Taux circulant

L'immunohistochimique (IHC) consiste à révéler sur coupe histologique, par réaction antigène-anticorps, la présence de l’antigène d’intérêt (hormone…) de localisation intranucléaires, membranaires ou cytoplasmiques.

Immunohistochimie: Détecter l’hormone au niveau tissulaire

Principe:

Coupe de tissu

Anticorps Ire

Anticorps IIre

Système de révélation

fluorophores ou fluorochromes

permettent d'observer des immunoreactions a l'aide de microscopes à fluorescence ou confocal (1939-1941 par Coons)

Systèmes de révélation

Enzymes

permettent d'observer des immunoreactions a l'aide de microscopes optique (1966 par Nakane & Pierce) ou électronique (1971 par Avrameas et Ternynck)

Exemple d’Enzymes les plus utilisées en IHC: Enzyme Origine Substrats Chromogène Couleur Utilisations ________________________________________________________________ Peroxydase Raifort H2O2 DAB Brun ME, MO, IB 4-Cl-1-Naphtol Bleu MO, IB O-dianisidine Brun ELISA OPD Brun ELISA ABTS Vert ELISA Phosphatase E.Coli NABP/NF Rouge MO, IB alcaline

La peroxydase est généralement préférée pour les tissus animaux car ceux-ci contiennent beaucoup de phosphatases endogènes. A l'inverse, la phosphatase alcaline est utilisée de préférence avec les tissus végétaux qui contiennent très souvent de grandes quantités de peroxydase.

MO: Microscopie Optique; ME: Microscopie Electronique; IB: Immun oBlots.

Raifort est une plante vivace de la famille des Brassicacées.

Ac anti-insuline (produit chez le cobaye)

Ac anti-IgG de cobaye (produit chez le lapin)

H2O H2O2

1/2 O2

DAB réduit

(incolore)

DAB oxydé (brun)

Réaction de visualisation de la

peroxydase

Immunohistochimie: Détecter l’insuline au niveau du pancréas

peroxydase

Insuline

Îlots de Langerhans (106 chez l’Homme adulte)

Acini

ENDOCRINE (1-2%)

EXOCRINE (98-99%)

Le pancréas – immunohistochimie

Canal pancréatique

Marquage de l’insuline Taux de production

Taux Hormonal


Expression du récepteurs



Méthodes d’exploration du système endocrinien

ELISA

Western-blot, PCR…

Liaison d’un radioligand à l’équilibre (voir TD)

En réponse à l’hormone:

Activation de partenaires de signalisation

Mesure de production d’un Sc. Messager

Effet cellulaire (prolifération, contraction…)

IHC

Expression du récepteurs

Western-blot

Méthode semi-quantitative. Niveau d’expression relatif de la protéine d’intérêt.

Basée sur une détection du complexe antigène-anticorps

Trois principales étapes expérimentales:

1. Séparation des protéines en fonction du PM sur gel de polyacrylamide (conditions dénaturantes ou pas).

2. Transfert des protéines sur une membrane souple (Nitrocellulose ou Nylon).

3. Immuno-marquage et détection.

1. Séparation des protéines sur gel de polyacrylamide (SDSPAGE)

Préparation d’extraits protéiques, tissulaires ou cellulaires

Séparation des protéines en fonction de leur PM

2. Transfert des protéines sur une membrane

3. Immono-marquage et détection

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Western_blot_transfer.png

Fluorescence

Chimioluminescence

3. Immono-marquage et détection

Colorimétrie

Luminol+H2O2

Luminol oxydé

Autoradiographie (Film photo-sensible)

Traitement de l’image

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Western_blot_chemiluminescent_detection.png

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Blotautoradiogram.png

Documents

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