Katarzyna Polska1, Jan Fiedurek2, Stanisław Radzki1

Bioenkapsulacja zwi¹zków aktywnychbiologicznie w matrycachotrzymanych metod¹ zol-¿eli jej zastosowanie

Katarzyna Polska1, Jan Fiedurek2, Stanis³aw Radzki1

1Wydzia³ Chemii, Uniwersytet Marii Curie-Sk³odowskiej, Lublin2Zak³ad Mikrobiologii Przemys³owej,Uniwersytet Marii Curie-Sk³odowskiej, Lublin

Bioencapsulation of biologically active compounds in matrices ob-tained by sol-gel metod and its application

S u m m a r y

The encapsulation of biomolecules, e.g. enzymes, whole living cells or mi-croorganisms in sol-gel derived monolithic silica, has been widely studied in re-cent years. Upon encapsulation, biomolecules retain their spectroscopic prop-erties and biological activity. Sol-gel matrices are thermally and chemically sta-ble and can be obtained in a variety of forms, such as optically transparentmonoliths, granulates, microparticles or thin films. Sol-gel immobilization ischaracterized by physical entrapment without chemical modification. Immobi-lizing substances by physically trapping in individual pore of a matrix permitstheir molecules to be isolated and stabilized. The advantages of sol-gel encap-sulated biologicals might give them applications such as optical and electro-chemical sensors, diagnostic devices, catalysts, and even bioartificial organs.While the relatively large biomolecules are immobilized within the silica net-work, small ions or molecules are transported into the interior of the matrix.

Key words:

sol-gel, catalysis, sensors, enzymes, bioencapsulation.

1. Wprowadzenie

W ostatnich dwóch dekadach roœnie zainteresowanie unieru-chamianymi enzymami w wielu dziedzinach przemys³u chemicz-nego, farmaceutycznego i spo¿ywczego. W przemyœle spo¿yw-

P R A C E P R Z E G L ¥ D O W E

Adres do korespondencji

Stanis³aw Radzki,Wydzia³ Chemii,UniwersytetMarii Curie-Sk³odowskiej,Pl. M.Curie-Sk³odowskiej 5,20-031 Lublin;e-mail:[email protected]

1 (76) 77–95 2007

czym zastosowanie takich biokatalizatorów zale¿y od rodzaju procesów technolo-gicznych stosowanych przy produkcji i przetwarzaniu ¿ywnoœci, które w wiêkszoœciprzypadków z natury maj¹ charakter enzymatyczny. Istotny wp³yw na rozwój wspó³-czesnej biotechnologii ma immobilizacja biokatalizatorów. Pierwsz¹ technologi¹przemys³ow¹ biotransformacji mikrobiologicznej, w której wykorzystano unieru-chomiony biokatalizator, by³a produkcja octu. Polega³a ona na konwersji etanolu dokwasu octowego przy udziale komórek bakterii z rodzaju Acetobacter immobilizowa-nych na wiórach bukowych. Z³o¿a biologiczne z unieruchomion¹ biomas¹ od ponadstu lat wykorzystywane s¹ równie¿ w technologii oczyszczania œcieków.

Unieruchomione enzymy wykorzystuje siê w przemyœle farmaceutycznym doprodukcji antybiotyków, hormonów, niektórych witamin oraz kwasów organicznychs³u¿¹cych do produkcji leków (1-3). Poszukiwanie coraz to nowszych technologiimaj¹cych na celu zmniejszenie zanieczyszczeñ doprowadzi³o do wykorzystania im-mobilizowanej peroksydazy do degradacji odpadów fenolowych, powstaj¹cych w fa-brykach celulozy (4,5).

Chibata i Tosa w roku 1967 (6) opisali technologiê produkcji L-aminokwasówz odpowiednich racematów przy zastosowaniu aminoacylazy z grzybów nitkowa-tych osadzonej na DEAE-Sephadex metod¹ adsorpcji. Za pomoc¹ ró¿nych technikimmobilizacji, oprócz enzymów, z powodzeniem unieruchamiano komórki bakteryj-ne, grzybowe, roœlinne i zwierzêce lub protoplasty roœlinne czy te¿ organelle ko-mórkowe, wykorzystuj¹c do tego modyfikacje metod opracowanych pierwotnie doimmobilizacji enzymów (7).

Techniczne wykorzystanie biokatalizatorów w natywnej formie jest ograniczo-ne, zarówno poprzez koszty ich otrzymywania, jak te¿ przez niemo¿liwoœæ ich wie-lokrotnego zastosowania. Ponadto labilnoœæ struktury molekularnej enzymówutrudnia i znacznie podwy¿sza koszty zastosowania wielu enzymów w przemyœle.Biokatalizatory unieruchomione na hydrofobowych lub hydrofilowych matrycachuzyskuj¹ w³aœciwoœci podobne do enzymów zwi¹zanych z b³onami lipidowo-bia³ko-wymi w komórkach. Przez ³¹czenie grup funkcyjnych bia³ek enzymatycznych z po-wierzchni¹ matrycy z grupami czynnymi, znajduj¹cymi siê wewn¹trz noœnika, po-wstaj¹ uk³ady przestrzenne zbli¿one w swojej konformacji do uk³adu przestrzenne-go bia³ek w b³onach bia³kowo-lipidowych.

Enkapsulacja w matrycach otrzymywanych metod¹ zol-¿el nale¿y obecnie do naj-prê¿niej rozwijaj¹cych siê metod unieruchamiania cz¹steczek aktywnych biologicz-nie. Pod pojêciem enkapsulacji nale¿y rozumieæ wed³ug terminologii zalecanej przezIUPAC (Interantional Union of Pure and Applied Chemistry) zamykanie, stosuje siêrównie¿ termin „pu³apkowanie” (ang. entrappment), du¿ych cz¹steczek w pó³prze-puszczalnej b³onie, zwykle okr¹g³ego kszta³tu. Z kolei zamkniêcie biomoleku³ w la-biryncie polimerycznej trójwymiarowej sieci (¿elu) definiuje siê jako immobilizacjêprzez inkluzjê, a przy³¹czenie za pomoc¹ wy³¹cznie si³ adsorpcji, jako immobilizacjêadsorpcyjn¹ (8). Poniewa¿ w metodach opartych na ró¿nych odmianach technikzol-¿el, procesy te mog¹ wystêpowaæ równoczeœnie, a nawet konkurowaæ ze sob¹

Katarzyna Polska, Jan Fiedurek, Stanis³aw Radzki

78 PRACE PRZEGL¥DOWE

na ró¿nych etapach tworzenia siê i póŸniejszego starzenia ¿elu, w obecnym artykuleprzyjêto termin enkapsulacja. Za pomoc¹ metod zol-¿el mo¿na immobilizowaæw ¿elu moleku³y aktywne biologicznie, to znaczy maj¹ce wp³yw na ¿ywe organizmy(enzymatyczny, toksyczny, farmaceutyczny, etc.). Mog¹ to byæ cz¹steczki zarównonieorganiczne jak i organiczne. W przypadku immobilizacji du¿ych cz¹steczek orga-nicznych w literaturze przyj¹³ siê termin bioenkapsulacja.

Szerokie wykorzystanie bioenkapsulacji wi¹¿e siê g³ównie z tym, ¿e du¿e bio-moleku³y w matrycy krzemionkowej s¹ zatrzymane fizycznie, b¹dŸ te¿ za pomoc¹na tyle s³abych oddzia³ywañ chemicznych, ¿e nie ulegaj¹ zmianie ich zasadniczew³aœciwoœci (na przyk³ad aktywnoœæ enzymu, albo obecnoœæ pasma Soreta w wid-mach porfiryn i pasma tryptofanu w widmach bia³ek). Jednoczeœnie w materia³achotrzymanych metod¹ zol-¿el, do du¿ej cz¹steczki zatrzymanej w „pu³apce”, do-chodz¹ otwarte pory pe³ni¹ce funkcjê kana³ów, przez które ma³e cz¹steczki mog¹siê dostaæ do biomoleku³. Tym samym du¿e cz¹steczki organiczne wchodz¹ w reak-cje z ma³ymi i dzia³aj¹ jako, na przyk³ad, odwracalny katalizator lub odczynnik anali-tyczny. Jednoczeœnie wzrasta ich odpornoœæ na degradacjê chemiczn¹, biologiczn¹,i termiczn¹. Ponadto mo¿na kontrolowaæ, co prawda w ograniczony sposób, selek-tywnoœæ takiego uk³adu poprzez kontrolê porowatoœci matryc otrzymanych metod¹zol-¿el. Uzyskuje siê to poprzez dobór odpowiedniego prekursora lub domieszek.Ró¿norodnoœæ form i kszta³tów otrzymanego materia³u jest praktycznie nieograni-czona. Mog¹ to byæ zarówno transparentne monolity, jak i cienkie filmy, czy te¿ gra-nulaty. Wszystko to stanowi o szeregu mo¿liwych zastosowañ tego rodzaju uk³a-dów. Mo¿na je wykorzystaæ do konstrukcji czujników optycznych i elektrochemicz-nych, w katalizie, a tak¿e w medycynie do kontrolowanego uwalniania leków, a na-wet do budowy sztucznych organów.

2. Metoda zol-¿el

Technologia zol-¿el polega na otrzymywaniu substancji szklistych z roztworówi opiera siê na procesie przechodzenia roztworu koloidalnego (zolu) w ¿el. Po utwo-rzeniu ¿elu poddaje siê go najpierw dojrzewaniu (ang. ageing), podczas którego do-chodzi do wyrzucania cieczy z wnêtrza ¿elu (synerezy). W ten sposób mo¿na otrzy-maæ alko¿ele, w których powstaj¹ce pory s¹ pocz¹tkowo nape³nione g³ównie alko-holami z dodatkiem wody, w nastêpnym etapie mamy do czynienia z hydro¿elami(pory nape³nione s¹ wod¹ z dodatkiem alkoholi). Dalszym etapem jest suszeniew celu otrzymania ksero¿elu i ca³kowite usuniêcie z porów rozpuszczalników,w wyniku czego otrzymuje siê materia³ o niespotykanie ma³ej gêstoœci zwany ae-ro¿elem, czy te¿ wypalanie ksero¿elu w wysokich temperaturach w wyniku któregopowstaje normalne szk³o (9). Nale¿y podkreœliæ, ¿e o ile ³atwo jest okreœliæ skrajneetapy procesu zol-¿el, to rozstrzygniêcie czy mamy do czynienia z czystym alko-albo hydro¿elem, lub ksero- albo aero¿elem nie jest proste. Ogólny schemat otrzy-

Bioenkapsulacja zwi¹zków aktywnych biologicznie w matrycach otrzymanych metod¹ zol-¿el

BIOTECHNOLOGIA 1 (76) 77-95 2007 79

mywania ró¿nego typu materia³ów za pomoc¹ technologii zol-¿el przedstawiono narysunku 1.

Substancjami wyjœciowymi (tak zwanymi prekursorami), stosowanymi w proce-sie zol-¿el s¹ alkoholany o ogólnym wzorze M(OR)n, gdzie: M oznacza pierwiastekprzejœciowy lub metal, (przy czym otrzymano ¿ele dla nastêpuj¹cych pierwiastków:Si, Ti, Al, B, Ge, Zr, Y i Ca); R w grupie alkoholanowej -OR, to rodnik alkilowy;n = wartoœciowoœæ metalu. Do najczêœciej stosowanych prekursorów nale¿¹ alko-holany krzemu: tetrametoksy- i tertraetoksysilan o wzorach Si(OCH3)4i Si(OC2H5OH)4, w skrócie TMOS i TEOS. Tertraetoksysilan, którego wzór i strukturêprzestrzenn¹ przedstawiono na rysunku 2, ma tê przewagê, ¿e w procesach hydroli-zy i kondensacji uwalnia etanol, który jest mniej toksyczny ani¿eli inne alkohole.Mniejsze znaczenie praktyczne maj¹ alkoholany krzemu bêd¹ce pochodnymi wy¿-szych alkoholi, jak równie¿ alkoholany innych pierwiastków. Wynika to po pierwszez ceny tych zwi¹zków, a po drugie z faktu, ¿e w³aœciwoœci ich ¿eli s¹ analogiczne do¿eli krzemionkowych. TMOS i TEOS wystêpuj¹ w warunkach normalnych w postacicieczy, wy¿sze alkoholany mog¹ byæ cia³ami sta³ymi, jednak zarówno ciek³e jaki sta³e alkoholany u¿ywa siê w postaci roztworów, w których rozpuszczalnikami s¹zazwyczaj etanol lub metanol, rzadziej wy¿sze alkohole: propanol czy butanol. Po-



Rys. 1. Schemat otrzymywania ró¿nych materia³ów za pomoc¹ metody zol-¿el (10).

przez dobór odpowiedniego rozpuszczalnika i zmianê stê¿enia alkoholanu mo¿na,do pewnego stopnia, kontrolowaæ szybkoœæ tworzenia siê ¿elu (11).

We wszystkich odmianach metody zol-¿el (12) mo¿na wyró¿niæ nastêpuj¹ce etapy:– przygotowanie homogenicznego roztworu prekursora w rozpuszczalniku or-

ganicznym mieszaj¹cym siê z wod¹;– przekszta³cenie roztworu w zol za pomoc¹ odpowiedniego reagenta, na przy-

k³ad wody z HCl;– przejœcie zolu w ¿el w reakcjach hydrolizy i polikondensacji;– kszta³towanie ¿elu (lub lepkiego zolu) w odpowiednie formy na przyk³ad w po-

staæ monolitu, cienkiej warstwy (na noœniku z metalu, szk³a czy tworzywa sztuczne-go), w³ókna lub ziaren;

– dojrzewanie (zwane te¿ starzeniem) i suszenie ¿elu.Jeœli wysuszony ¿el ma byæ przeprowadzony w szk³o lub materia³ ceramiczny, to

spiekanie ukszta³towanego ¿elu przebiega w temperaturach zazwyczaj znacznieni¿szych (~ 500°C) ni¿ zazwyczaj stosowane w konwencjonalnych metodach cera-micznych.

Z chemicznego punktu widzenia proces zol-¿el rozpoczyna siê ju¿ po rozpusz-czeniu alkoholanu w odpowiednim rozpuszczalniku i dodaniu wody. W omawianymprocesie maj¹ miejsce reakcje hydrolizy i kondensacji alkoholanów. W przypadku al-koholanów krzemu reakcje te mo¿na przedstawiæ nastêpuj¹co:

hydroliza Si(OR)4 + nH2O � (OR)4-n-Si-(OH)n + nROH [1]gdzie R jest grup¹ alkilow¹;

kondensacja (RO)3Si-OR + HO-Si(OR)3 � (RO)3Si-O-Si(OR)3 + ROH [2a]

lub(RO)3Si-OH + HO-Si(OR)3 � (RO)3Si-O-Si(OR)3 + H2O [2b]

Hydrolizê i kondensacjê alkoholanów krzemu przyœpiesza siê za pomoc¹ katali-zatorów kwasowych lub zasadowych. Kwasy nieorganiczne protonuj¹ (odwracalnie)



Rys. 2. Wzór oraz struktura przestrzenna cz¹steczki tertraetoksysilanu (TEOS).

obdarzone ³adunkiem grupy alkoholanowe -OR w stanie przejœciowym i powoduj¹wzrost szybkoœci reakcji, w wyniku której od³¹czaj¹ siê te grupy zgodnie z równa-niem:

H|

H3O+ + �Si-OR � �Si-OR+ � �Si-OH + ROH + H+ [3]|

H2O

Proton przyci¹gany przez atom tlenu grupy -OR powoduje przesuniêcie chmuryelektronowej w wi¹zaniu �Si-O- w kierunku atomu tlenu. W ten sposób wzrasta ³adu-nek dodatni na atomie krzemu, do którego przy³¹cza siê cz¹steczka wody, tworz¹ckompleks aktywowany krzemu w jego piêciokoordynacyjnym stanie przejœciowym.W rezultacie wzrasta szybkoœci reakcji w wyniku której grupy -OR ulegaj¹ od³¹cze-niu (reakcja [1]). Katalizatory zasadowe dostarczaj¹ silnych nukleofilowych grupOH-, które w trakcie reakcji hydrolizy deprotonuj¹ grupy silanolowe, tworz¹c �Si-O-

w obecnoœci nadmiaru wody, co zwiêksza szybkoœæ kondensacji (reakcja [2]) (11).Tak zatem, katalizator kwasowy sprzyja hydrolizie, prowadz¹c do utworzenia

Si(OH)4. Z kolei kondensacja zachodzi szybciej w obecnoœci katalizatorów zasado-wych. Nale¿y podkreœliæ, ¿e reakcje hydrolizy i polikondensacji przebiegaj¹ równo-czeœnie, a szybkoœæ poszczególnych reakcji zale¿y od pH œrodowiska. W wyniku po-stêpuj¹cej polikondensacji nastêpuje wzrost cz¹steczek polimeru w roztworze, a¿do utworzenia trójwymiarowej sieci krzemionki. Stopniowo zatem ma miejsce przej-œcie do stanu koloidalnego, zwanego zolem, w którym zgodnie z ogólnie akcepto-wan¹ definicj¹ rozmiary cz¹stek fazy rozproszonej zawieraj¹ siê w przedziale od1 do 1000 nm (11). Zol nastêpnie przechodzi w ¿el, a próbka powoli zwiêksza me-chaniczn¹ spójnoœæ i zachowuje kszta³t nadany przez naczynie, w którym siê znaj-duje.

W praktyce procesy hydrolizy i polimeryzacji przebiegaj¹ równoczeœnie, dlategote¿ ¿el trzeba poddaæ procesowi dojrzewania, które zwiêksza odpornoœæ próbki napêkanie w póŸniejszych etapach. Podczas tego procesu nastêpuje synereza, czyliuwalnianie wody i alkoholu z porów, a w konsekwencji zmniejszenie siê objêtoœci¿elu, co wi¹¿e siê bezpoœrednio ze zmniejszeniem wielkoœci porów. Kolejnym eta-pem obróbki materia³u zol-¿elowego jest suszenie, którego rezultatem s¹ ksero-¿ele, o czêsto nawet kilkukrotnie mniejszej objêtoœci ni¿ wyjœciowa próbka. Mo¿naje poddaæ wypalaniu w wysokiej temperaturze (nawet do 1250°C), a uzyskany wów-czas materia³ niczym nie ró¿ni siê od klasycznego, topionego szk³a.

Bardzo wa¿n¹ zalet¹ metody zol-¿el jest mo¿liwoœæ otrzymania monolitycznychi transparentnych optycznie ¿eli, zwanych alko-, hydro-, aero- i ksero¿elami, przyczym te ostatnie maj¹ ju¿ w³aœciwoœci szk³a, a ró¿ni¹ siê od szk³a znacznie mniejsz¹gêstoœci¹. W³aœnie z powodu nowej jakoœci takiego materia³u IUPAC wprowadzi³now¹ definicjê szk³a, w myœl której, ksero¿el nie jest szk³em, chocia¿ posiada



wszystkie jego w³aœciwoœci, poniewa¿ jest materia³em, który nie uleg³ transformacjitermicznej. Jednak¿e w³aœnie ten brak transformacji termicznej powoduje, ¿e w ¿e-lach mo¿na zamykaæ biomoleku³y nie niszcz¹c ich struktury. Przyk³ady monolitycz-nych ¿eli krzemionkowych z porami wype³nionymi kompleksem porfiryna-bia³kopokazano na rysunku 3. Poniewa¿ pory te s¹ otwarte dla mniejszych cz¹steczek,kompleks ten mo¿e wchodziæ w szereg reakcji z ma³ymi cz¹steczkami, a przezro-czystoœæ materia³u pozwala na œledzenie przebiegu tych reakcji zarówno za pomoc¹widm absorpcyjnych jak i emisyjnych.

3. ¯ele domieszkowane zwi¹zkami organicznymi

Zwi¹zki organiczne i bioorganiczne mo¿na wprowadziæ do materia³ów otrzyma-nych metod¹ zol-¿el trzema sposobami:

1) poprzez adsorpcjê na powierzchni ¿elu, niezale¿nie od tego czy wystêpuje onw postaci cienkiej warstwy czy te¿ granulatu;

2) poprzez zwi¹zanie wprowadzanych do ¿elu cz¹steczek z pod³o¿em za po-moc¹ wi¹zañ kowalencyjnych, w wyniku czego powstaje trwa³y zwi¹zek biocz¹s-teczki z pod³o¿em;

3) na drodze enkapsulacji, zwanej czasami „pu³apkowaniem” (ang. entrapment).Stosunkowo naj³atwiejsza w realizacji jest adsorpcja, ale posiada te¿ wiele wad.

Najwa¿niejsza z nich to stosunkowo s³abe zwi¹zanie immobilizowanej cz¹steczkiz powierzchni¹ adsorbenta, ponadto liczba zaadsorbowanych biomoleku³ o du¿ychwymiarach jest stosunkowo ma³a. Z kolei trwa³e zwi¹zanie biocz¹steczki z pod-³o¿em, za pomoc¹ wi¹zania chemicznego wymaga do³¹czenia do niej odpowiednichgrup funkcyjnych umo¿liwiaj¹cych wytworzenie takiego wi¹zania. Jest to trudne do



Rys. 3. Próbki monolitycznych ¿eli krzemionkowych domieszkowanych mieszaninami tetrametylo-pirydyloporfiryny Cu(II) z konkanawalin¹ A, o ró¿nych stê¿eniach (od 2,5 × 10-6 do 1,5 × 10-5 M) i o ró¿-nym stosunku molowym: 1:2 (1), 1:1 (2), 2:1 (3) i 3:1 (4), po szeœciu miesi¹cach suszenia w temp. 25°C(12).

wykonania i prowadzi zwykle do zmian struktury immobilizowanej cz¹steczki,a w konsekwencji do zaniku aktywnoœci katalitycznej, czy te¿ zdolnoœci do pe³nie-nia funkcji analitycznego reagenta w czujniku.

Ostatnia metoda jest szczególnie interesuj¹ca, gdy¿ dziêki niej mo¿na zamykaæw materia³ach ¿elowych moleku³y o rozmaitych kszta³tach, wielkoœciach i ³adunkachelektrycznych. Wprowadzenie du¿ej biocz¹steczki ju¿ na etapie formowania zolui dalsze przeprowadzenie uk³adu w ¿el powoduje bowiem okludowanie moleku³yw tworz¹cej siê sieci trójwymiarowych wi¹zañ �Si-O-Si�. Bardzo istotn¹ cech¹ mate-ria³ów ¿elowych jest niska temperatura procesu ich suszenia. Zazwyczaj proces tenprzeprowadza siê w temperaturze pokojowej, zapewnia trwa³oœæ immobilizowa-nych substancji. Stosuj¹c temperaturê suszenia nawet poni¿ej 100°C mo¿na uzyskaæsuche i transparentne optycznie ksero¿ele (9).

Istot¹ metody zol-¿el jest przeprowadzenie w temperaturze pokojowej równo-czesnych reakcji hydrolizy i polikondensacji zwi¹zków organometalicznych. Otrzy-many na tej drodze materia³ jest porowat¹ matryc¹, zawieraj¹c¹ po³¹czone ze sob¹pory o kszta³cie „butelek z cienk¹ szyjk¹”, zwanych te¿ czasami porami „wnêkowy-mi i klatkowymi” (ang. cavity and cages). Pory te s¹ utworzone przez trójwymiarow¹sieæ krzemionkow¹, a rozmiar tych porów zale¿y przede wszystkim od wielkoœci za-mykanej w nich cz¹steczki. Mówi¹c obrazowo, sieæ krzemionkowa „opakowuje”du¿e moleku³y. Bioenkapsulacja jest zatem metod¹, która ³¹czy zalety dwóch pierw-szych metod immobilizacji cz¹stek o biologicznej aktywnoœci, a równoczeœnie, jaksiê wydaje, jest pozbawiona ich wad. Do bioenkapsulacji wykorzystywano g³ówniepolimery organiczne (takie jak polichlorek winylu, polistyren i poliakrylany), a nie-organiczne polimery nie wzbudza³y zainteresowania do czasu klasycznej ju¿ pracyAvnira z roku 1990 (15). Od tego czasu rozpoczê³o siê zainteresowanie bioenkapsu-lacj¹ przy wykorzystaniu metody zol-¿el (16-18), co wynika z szeregu korzystnychcech, jakie posiadaj¹ polimery krzemionkowe w porównaniu z polimerami organicz-nymi. Do najwa¿niejszych nale¿¹:

– znaczna odpornoœæ mechaniczna;– wytrzyma³oœæ na chemiczn¹ i biologiczn¹ degradacjê;– mo¿liwoœæ pracy w œrodowisku gazowym, ciek³ym (uk³ady wodne, organiczne

i mieszane) oraz w warunkach pod- i nadkrytycznych;– pe³na immobilizacja w porach du¿ych biocz¹steczek, przy jednoczesnym za-

chowaniu ich struktury i w³aœciwoœci;– zwiêkszenie odpornoœci biomoleku³ na denaturacjê termiczn¹ i chemiczn¹,

a tak¿e wyd³u¿enie czasu ich aktywnoœci;



Rys. 4. Schemat bioenkapsulacji cz¹steczek aktywnych biologicznie (np. bia³ek) w ¿elach otrzyma-nych metod¹ zol-¿el (R = grupa alkilowa). Autorzy wyra¿aj¹ podziêkowanie wydawnictwu Elsevier zapozwolenie wykorzystania rysunku z artyku³u (10).



– mo¿liwoœæ kontrolowania w³aœciwoœci fizycznych i chemicznych porowategomateria³u poprzez ogromn¹ iloœæ ró¿nego rodzaju prekursorów, modyfikatorów,domieszek, a tak¿e zmianê warunków polimeryzacji.

Doœæ czêsto jako substratów w procesie zol-¿el u¿ywa siê organicznie modyfiko-wane alkoholany krzemu o ogólnym wzorze R’xSi(OR)4-x, gdzie R i R’, to w praktyceprawie wszystkie znane rodniki organiczne. Zwi¹zki te zawieraj¹ niepolarne wi¹za-nia �Si-C� nieulegaj¹ce zerwaniu w trakcie hydrolizy i kondensacji. Dziêki nim mo¿-na utworzyæ po³¹czenia hybrydowe organiczno-nieorganiczne znane jako krzemianymodyfikowane organicznie (ang. ormosil = organically modified silicate) lub ksero¿elemodyfikowane organicznie (ang. OMX = organically modified xerogel). Chemia tychzwi¹zków by³a centrum zainteresowania wielu autorów (19-21), znane s¹ te¿ prace,w których do takich nieorganiczno-organicznych materia³ów wprowadzano miêdzyinnymi, porfiryny (22-24). W wielu przypadkach za stosowaniem prekursorów mody-fikowanych organicznie przemawia mniejsza porowatoœæ i zwiêkszona odpornoœæmechaniczna, która pozwala na ich ciêcie, rozdrabnianie i polerowanie (25). Wielebarwników organicznych, które znalaz³y zastosowanie w technice laserowej, z do-brym skutkiem by³o pu³apkowanych w tego typu materia³ach, nie tylko ze wzglêduna wiêksz¹ elastycznoœæ hybrydowych ¿eli zawieraj¹cych du¿y procent substancji or-ganicznych, ale tak¿e z uwagi na podobieñstwo chemiczne organicznej czêœci matry-cy i zastosowanego barwnika (26). Schemat postêpowania w procesie enkapsulacjibiologicznie aktywnych materia³ów w matrycach zol-¿elowych pokazano na rysunku 4.

Bardzo czêsto tego typu materia³y otrzymane na drodze zol-¿el pozwalaj¹ na ko-walencyjne zwi¹zanie biocz¹steczek na powierzchni noœnika. Przyk³adem mo¿e byæimmobilizacja enzymu – acylazy penicylinowej G w organicznie modyfikowanymksero¿elu, utworzonym przez zmieszanie tetraetoksysilanu i pochodnej aminowejw postaci (3-aminopropyl)trimetoksysilanu, (MeO)3Si(CH2)3NH2 (27). Kowalencyjneprzy³¹czenie enzymu do powierzchni tego noœnika by³o mo¿liwe dziêki wczeœniej-szej aktywacji za pomoc¹ aldehydu glutaralowego (rys. 5). Uk³ad ten znalaz³ prak-tyczne zastosowanie w biokatalizie.



Rys. 5. Struktura organicznie modyfikowanego ksero¿elu (OMX) i proces wielopunktowej immobili-zacji acylazy penicylinowej G (PGA) na jego powierzchni. Autorzy wyra¿aj¹ podziêkowanie wydawnictwuElsevier za pozwolenie wykorzystania rysunku z artyku³u (27).

3.1. Zastosowanie bioenkapsulacji do konstrukcji czujników analitycznych

Atrakcyjnym i najszybciej rozwijaj¹cym siê aspektem wykorzystania technologiizol-¿elowej jest mo¿liwoœæ konstruowania ró¿nego rodzaju czujników do pomiarurozmaitych parametrów fizycznych i chemicznych. Zasada dzia³ania takiego czujni-ka opiera siê na zamkniêciu substancji aktywnej (sensorycznej) w matrycy otrzyma-nej metod¹ zol-¿el. Tym samym du¿a moleku³a biosensora jest opakowana, czy te¿uwiêziona w strukturze krzemionkowej, podczas gdy ma³e, reaguj¹ce z ni¹ cz¹s-teczki mog¹ swobodnie do niej dotrzeæ poprzez pory matrycy. Ze wzglêdu na sy-gna³ zwrotny, konstruowane w ten sposób czujniki dzielimy na: optyczne (zwaneoptodami) i elektrochemiczne. Matryca zol-¿elowa jest materia³em transparentnymoptycznie, czyli mo¿e byæ zintegrowana z metodami spektroskopii absorpcyjneji emisyjnej, st¹d zastosowanie jej do budowy tak zwanych optod zas³uguje naszczególn¹ uwagê. Do innych zalet matryc krzemionkowych, które stanowi¹ o ichu¿ytecznoœci w konstrukcji biosensorów, zaliczyæ mo¿na:

– nisk¹ temperaturê otrzymywania oraz odpornoœæ termiczn¹;– porowatoœæ, du¿¹ zwil¿alnoœæ, hydrofobowoœæ i hydrofilowoœæ;– mo¿liwoœæ wprowadzania jako domieszek metali, tlenków metali lub grafitu,

do konstruowania biosensorów amperometrycznych;– mo¿liwoœæ formowania noœnika o ró¿nych kszta³tach.Szczególne interesuj¹ce s¹ sensory wykorzystuj¹ce w reakcji analitycznej immo-

bilizowane zwi¹zki o znaczeniu biologicznym. Szeroki przegl¹d mo¿liwoœci zamy-kania bia³ek hemowych w zol-¿elowych matrycach zosta³ przedstawiony w pracyLana i wsp. (16). Takie uk³ady mog¹ byæ wykorzystane do konstrukcji czujnikówoptycznych (28,29), w których bia³ka hemowe zachowuj¹ wszystkie swoje funkcje:biokatalityczne, chemiczne utleniaj¹co-redukuj¹ce, oraz mo¿liwoœci przy³¹czaniatakich ligandów jak O2, CO i NO. W tabeli 1 przedstawiono przyk³ady czujnikówopartych na matrycach krzemionkowych z unieruchamianymi bia³kami i enzymami.

T a b e l a 1

Optyczne i elektrochemiczne czujniki oparte na zwi¹zkach biologicznie aktywnych immobilizowanych w ma-trycach otrzymanych metod¹ zol-¿el

Enkapsulowany biosensor Typ matrycy zol-¿elowej Substancja wykrywana Typ czujnika Literatura

1 2 3 4 5

dysmutaza i peroksydazaponadtlenkowe

SiO2 rodniki ponadtlenkowe optyczny (fluorescencyjny) (36)

oksydaza glukozowa SiO2/poliuretan NO amperometryczny (37)

lucyferaza SiO2/glukoza ATP optyczny (fluorescencyjny) (38)

oksydaza glukozowa SiO2/polimer celulozowy glukoza optyczny (UV-Vis) (39)

peroksydaza chrzanowa APTMS/TEOS* H2O2 amperometryczny (40)

ureaza, peroksydaza SiO2 kwas moczowy optyczny (fluorescencyjny) (41)



1 2 3 4 5

dehydrogenaza mleczanowa SiO2 L-mleczan optyczny (fluorescencyjny) (42)

lakaza** SiO2 fenole, aryloaminy optyczny (UV-Vis) (43)

katalaza SiO2 H2O2 optyczny (UV-Vis) (44)

cytochrom c SiO2 NO optyczny (UV-Vis) (44)

ureaza SiO2 mocznik optyczny (UV-Vis) (45)

oksydaza i dehydrogenazamleczanowe

SiO2 mleczan, pirogronian optyczny amperometryczny (46)

** 3-aminopropyltrimetoksysilan/tetrametoksysilan

** benzenodiol: O2 oksydoreduktaza (EC 1.10.3.2)

Najbardziej znanym kierunkiem wykorzystania enzymów unieruchomionych w a-nalityce s¹ tzw. elektrody enzymowe (30). Stanowi¹ one najwa¿niejsz¹ grupê czujni-ków enzymatycznych o du¿ych perspektywach i mo¿liwoœciach zastosowañ, zw³asz-cza w diagnostyce medycznej, biotechnologii i ochronie œrodowiska. S¹ to uk³adyz³o¿one z odpowiedniego (dla oznaczanego substratu) enzymu, unieruchomionegow bezpoœredniej bliskoœci elektrody czu³ej na dany substrat, po³¹czone z jonoselek-tywnymi lub czu³ymi na okreœlone gazy elektrodami, mierz¹cymi bezpoœrednie stê-¿enie jonów H+, NH4

+ lub gazów takich jak NO2, O2, SO2, CO2 (31). Zalety elektrodenzymatycznych wynikaj¹ z po³¹czenia dwóch zasadniczych cech: specyficznoœcisubstratowej enzymu oraz precyzji, prostoty i szybkoœci pomiaru sygna³u elektrycz-nego elektrody. Zakres ich dzia³ania mo¿na poszerzyæ przez wspóln¹ immobilizacjêdwu lub wiêcej enzymów. Przyk³adami elektrod multienzymatycznych s¹: elektrodaz unieruchomion¹ oksydaz¹ glukozow¹ i glukoamylaz¹, s³u¿¹ca do oznaczania glu-kozy, maltozy oraz wielocukrów ulegaj¹cych hydrolizie pod wp³ywem glukoamylazy(31). Schemat dzia³ania czujnika do oznaczania glukozy pokazano na rysunku 6.W dalszych badaniach zmierza siê w kierunku zwiêkszania czu³oœci oznaczeñ, zwiêk-szania szybkoœci odpowiedzi elektrody oraz miniaturyzacji elektrod, pozwalaj¹cychna oznaczenia in vivo w tkankach miêœniowych, ¿y³ach i tkance mózgowej (31).

Ze wzglêdu na ³agodne warunki procesu bioenkapsulacji w matrycach zol-¿elo-wych, zw³aszcza pokojowej temperatury ¿elowania, mo¿liwe jest wprowadzenie dowyjœciowego zolu tak¿e porfiryn i ich nawet nietrwa³ych, kompleksów z metalami.Dziêki swym receptorowym w³aœciwoœciom, cz¹steczki porfiryn zamkniête w po-rach powstaj¹cego ¿elu mog¹ byæ zastosowane w technice sensorowej i wykorzysta-ne do konstrukcji czujników wykrywaj¹cych tlen (32), jony rtêci (33), aminy (34), jakrównie¿ do oznaczania pH (35). Matryce krzemionkowe s¹ materia³em transparent-nym optycznie w zakresie 300-800 nm, dlatego s¹ dobrym materia³em do immobili-zacji porfiryn i ftalocyjanin poniewa¿ pasma absorpcji i emisji tych zwi¹zków s¹po³o¿one w tym zakresie.

Du¿a biokompatybilnoœæ matryc krzemionkowych umo¿liwia zamykanie w nich¿ywych komórek, tkanek i mikroorganizmów (47-49). Wykorzystanie bakterii, jako



czynników sensorycznych zamkniêtych w zol-¿elu przedstawiono w wielu doniesie-niach (50-52). Takie czujniki wykorzystuj¹ce w³aœciwoœci fluorescencyjne niektórychbia³ek mog¹ byæ wykorzystywane do ró¿nych celów, na przyk³ad do oznaczania tle-nu singletowego, który powoduje wygaszanie fluorescencji. Wykazano, ¿e zamkniê-te w matrycy krzemionkowej bakterie zachowuj¹ doœæ du¿¹ ¿ywotnoœæ, a jednoczeœ-nie trac¹ zdolnoœæ podzia³u. Jest to szczególnie istotne, gdy chcemy by sygna³ przeznie przekazywany by³ miarodajny i odtwarzalny.

Niestety matryce zol-¿elowe wykazuj¹ pewnie niedogodnoœci podczas stosowa-nia ich do konstruowania czujników, w tym (53):

– d³ugi czas odpowiedzi, ograniczony przez dyfuzjê reaguj¹cych cz¹steczek downêtrza porów;

– mimo ¿e elucja sensora z matrycy krzemionkowej jest ograniczona i niewielkaw porównaniu z innymi rodzajami noœników, to jednak wci¹¿ istnieje i mo¿e wp³y-n¹æ na intensywnoœæ sygna³u;

– w ksero¿elu, otrzymanym metod¹ zol-¿el z prekursorów czterofunkcyjnych,d³ugo po z¿elowaniu bêdzie przebiegaæ proces kondensacji, powoduj¹c kurczenienoœnika. Skutkiem tego nast¹pi zmniejszanie siê jego porów, a przez to ogranicze-nie iloœci dyfunduj¹cych przez nie cz¹steczek reagenta;

– zamkniêcie w ¿elach mo¿e jednak wp³ywaæ na w³aœciwoœci chemiczne i spek-troskopowe zamkniêtej w porach cz¹steczki, ze wzglêdu na ograniczenie stopniswobody cz¹steczek w porach (czasami mog¹ wyst¹piæ trudnoœci z okreœleniem licz-by faz w regule Gibbsa), a ponadto istnieje mo¿liwoœæ oddzia³ywania uwiêzionejcz¹stki z sieci¹ krzemionki.



Rys. 6. Immobilizacja oksydazy glukozowej w ¿elu SiO2 i schemat dzia³ania czujnika wykrywaj¹cegoglukozê. Autorzy wyra¿aj¹ podziêkowanie wydawnictwu Elsevier za pozwolenie wykorzystania rysunkuz artyku³u (28).

3.2. Przyk³ady zastosowania bioenkapsulacji w katalizie

Matryce krzemionkowe otrzymane metod¹ zol-¿el nadaj¹ siê doskonale na noœ-niki katalizatorów w katalizie heterogenicznej. Wynika to z faktu, ¿e materia³y teodznaczaj¹ siê wysok¹ porowatoœci¹, du¿¹ powierzchni¹ w³aœciw¹, du¿¹ czystoœci¹,ma³¹ gêstoœci¹ oraz nisk¹ temperatur¹ i ³atwoœci¹ otrzymywania. Istotna jest rów-nie¿ ich du¿a jednorodnoœæ, umo¿liwiaj¹ca równomierny rozk³ad sk³adników ak-tywnych. Prowadzono badania nad wykorzystaniem aero¿eli dotowanych katalizato-rami nieorganicznymi w postaci tlenków metali, mieszanin tlenków metali, jak rów-nie¿ katalizatorów typu metal-tlenek metalu. Uk³ady takie by³y stosowane do katali-zowania reakcji uwodornienia, hydrolizy, czêœciowego utlenienia, syntezy amonia-ku, syntezy Fischera-Tropscha oraz wielu innych (54).

Wiele bioprocesów komercyjnych opiera siê na wykorzystaniu katalizatorów zam-kniêtych w ró¿nego rodzaju noœnikach, w tym równie¿ w matrycach zol-¿elowych.Nale¿¹ do nich miêdzy innymi: produkcja glicerydów, fosfolipidów, peptydów, bia-³ek, aminokwasów, antybiotyków, szeregu farmaceutyków oraz chiralnych pó³pro-duktów (14). Przemys³owe procesy biokonwersji czêsto wymagaj¹ biokatalizatorówheterogenicznych, które daj¹ siê formowaæ w po¿¹dane kszta³ty, wykazuj¹ wysok¹aktywnoœæ i d³ugotrwa³¹ stabilnoœæ w specyficznych warunkach, równie¿ w rozpusz-czalnikach organicznych. Warunki te, jak siê wydaje, spe³niaj¹ katalizatory immobi-lizowane w matrycach krzemionkowych otrzymanych metod¹ zol-¿el. Uk³ady opartena tego typu ksero¿elach mo¿na formowaæ w postaci monolitów, granulek, mi-krocz¹stek, grubych i cienkich filmów. Zalet¹ tego typu noœników jest mo¿liwoœæzwiêkszenia stabilnoœci chemicznej i termicznej katalizatora, nie ograniczaj¹cw znacznym stopniu jego wydajnoœci. Wykazano, ¿e wydajnoœæ takich enzymów jak:oksydaza glukozowa, fosfataza, trypsyna, aspartaza i anhydraza wêglanowa w for-mie „uwiêzionej” w ksero¿elu krzemionkowym wynosi³a od 30 do 100% ich wydaj-noœci w formie natywnej (55). Przyk³ady procesów katalizowanych przy u¿yciu enzy-mów unieruchomionych w matrycach zol-¿elowych zestawiono w tabeli 2.

T a b e l a 2

Przyk³ady enzymów enkapsulowanych w matrycach otrzymanych metod¹ zol-¿el

Enkapsulowany biokatalizator Typ matrycy zol-¿elowej Proces katalizowany Literatura

1 2 3 4

acylaza penicylinowa G SiO2/pochodna aminowa hydroliza benzylopenicyliny (39)

chloroperoksydaza SiO2 enancjoselektywne utlenianie siarczkówza pomoc¹ H2O2

(57)

chloroperoksydaza SiO2 nadtlenkowe fluorowcowanie i epoksy-dowanie alkenów bez pomocy jonów ha-logenkowych

(58)

peroksydaza chrzanowa SiO2 tworzenie grup nadtlenkowych (59)



1 2 3 4

peroksydaza chrzanowa SiO2 asymetryczne utlenianie tioanizoluw acetonitrylu za pomoc¹ H2O2

(60)

�-glukuronidaza, arylosulfataza SiO2 rozprzê¿anie koniugatów zawartychw moczu

(61)

proteinazy serynowe (trypsyna, subtyli-zyna Carlsberga, �-chymotrypsyna)

SiO2 transestryfikacja N-acetylo-L-fenyloala-ninianu etylu z 1-propanolem w cyklo-heksanie

(62)

mioglobina, peroksydaza, cytochrom c,hemoglobina,

SiO2 S-utlenianie dibenzotiofenu (63)

dehydrogenazy: formaldehydowa,alkoholowa

SiO2 konwersja CO do metanolu (64)

lipaza z Burkholdelia cepacia MTMS/TMOS*

TMOS

transestryfikacja laurynianu winyluz 1-octanolem

(65)

lipazy MTMS/TMOS reakcja estryfikacji kwasu laurynowegoz 1-octanolem

(66)

* metylotrimetoksysilan/tetrametoksysilan

Z punktu widzenia sposobu prowadzenia procesu katalizy po¿¹dane jest umiesz-czenie katalizatora na kolumnie (56), zapewniaj¹ce ci¹g³oœæ procesu oraz mo¿liwoœæregeneracji kolumny, co naj³atwiej uzyskaæ poprzez przeprowadzenie biodotowane-go ksero¿elu w postaæ drobnych ziaren.

Wa¿n¹ grup¹ katalizatorów stosowanych w formie immobilizowanej w matry-cach zol-¿elowych s¹ porfiryny i ich pochodne. Zazwyczaj katalizê w której uczest-nicz¹ porfiryny nazywamy biomimetyczn¹, poniewa¿ czêsto imituj¹ one enzymyw tego typu uk³adach (67). W ten sposób porfiryny mog¹ katalizowaæ na przyk³adutlenianie alkanów i alkenów ³añcuchowych (68,69) oraz cykloalkenów (70).

3.3. Zastosowanie bioenkapsulacji w medycznych materia³ach ¿elowychdo celów medycznych

Porowate ksero¿ele krzemionkowe, jako ca³kowicie biokompatybilne, s¹ bardzoatrakcyjnym materia³em do zastosowañ medycznych. Wiele badañ z tego zakresudotyczy zastosowania tego typu matryc jako uk³adów noœnikowych dla ró¿nego ro-dzaju leków (71). Przyk³adem mo¿e byæ wykorzystanie sztucznie skonstruowanychwysepek Langerhansa do powolnego dozowania insuliny u diabetyków (72,73). Napodstawie przeprowadzonych eksperymentów in vitro dowodzi siê, ¿e ksero¿elekrzemionkowe mog¹ uwalniaæ leki o niskiej masie cz¹steczkowej, takie, jak antybio-tyki (np. wankomycyna o masie cz¹steczkowej 2,8 kDa) (74,75). Równie¿ wiêkszecz¹steczki, takie, jak bia³ka i czynniki wzrostu (masa cz¹steczkowa oko³o 20 kDa),mog¹ byæ uwalniane z odpowiednio przygotowanych matryc krzemionkowych, przy



czym podczas ich „wychodzenia” z porów nie nastêpuj¹ uszkodzenia (76,77). Is-totn¹ zalet¹ tego typu uk³adów jest mo¿liwoœæ kontroli szybkoœci uwalniania lekuz porów. Z badañ Radin i wsp. (78) wynika, ¿e ksero¿ele doskonale sprawdzaj¹ siêjako noœniki w kontrolowanym uwalnianiu leków tak¿e in vivo, co zosta³o wykorzy-stane m.in. w leczeniu infekcji kostnych. Szeroki przegl¹d zastosowañ materia³ówotrzymanych metod¹ zol-¿el w medycynie do takich celów jak kontrolowane uwal-nianie leków czy te¿ pokrywanie cienkimi warstwami metalicznych implantów zo-sta³ przedstawiony w pracy Salina i wsp. (79).

Zamkniête w matrycach zol-¿elowych enzymy znalaz³y zastosowanie w analitycemedycznej do oznaczania substancji bêd¹cych substratami, aktywatorami lub inhibi-torami enzymów. U¿ycie odpowiednich enzymów pozwala na selektywne i czu³eoznaczanie we krwi, moczu, a tak¿e bezpoœrednio w tkankach, wa¿nych fizjologicz-nych zwi¹zków, takich jak: mocznik, kwas moczowy, glukoza i inne cukry, lipidy,fosfolipidy, cholesterol i antybiotyki (3-5). Wykorzystana tu zosta³a zdolnoœæ enzy-mu, na przyk³ad peroksydazy, do barwnych reakcji z substratami. W wielu przypad-kach zadziwia czu³oœæ stosowanych uk³adów detekcji, np. lucyferazê immobilizo-wan¹ na zmodyfikowanych kuleczkach szklanych, którymi wype³niono szklan¹ rurkêwykorzystano do wykrywania ultraœladowych iloœci NADH (koenzym wielu reakcjienzymatycznych), w tym przypadku dolna granica czu³oœci wynosi³a 1,3 × 10-13

mola.Maruszewski i wsp. (80) otrzymali ¿ele krzemionkowe, zawieraj¹ce immobilizo-

wan¹ karbocyjaninê, bêd¹c¹ obiecuj¹cym fotouczulaczem dla terapii fotodynamicz-nej (PDT). Celem ich badañ by³o podniesienie fotostabilnoœci tego barwnika poprzezzamkniêcie go w matrycy zol-¿elowej. Okazuje siê bowiem, ¿e to co stanowi o anty-nowotworowej aktywnoœci danego fotouczulacza, czyli produkcja cytotoksycznegotlenu singletowego, jednoczeœnie powoduje niszczenie uczulacza w reakcji fotolizy(81). W wyniku enkapsulacji w matrycy krzemionkowej proces rozk³adu barwnika,zwany fotowybielaniem (ang. photobleaching), ulega znacznemu spowolnieniu. Takzatem, unieruchomienie badanego przez fotouczulacza w zol-¿elu prowadzi³o doznacznego zwiêkszenia jego fototrwa³oœci.

Podbielska i wsp. (82) poszli o krok dalej w wykorzystaniu ¿eli krzemionkowychdotowanych fotosensybilizatorami w terapii fotodynamicznej. Opracowana przeznich metoda polega na immobilizacji barwników porfirynowych (opartych na prepa-ratach uzyskanych z chlorofilu) w matrycy krzemionkowej. Pokryli oni cienk¹ war-stw¹ koñcówkê œwiat³owodu, którym doprowadzane jest œwiat³o lasera w pobli¿ekomórek nowotworowych. W ten sposób koñcówka tego urz¹dzenia staje siê rów-nie¿ dodatkowo Ÿród³em cz¹steczek fotosensybilizatora, a podczas naœwietlania,tak¿e generatorem tlenu singletowego niszcz¹cego komórki nowotworowe.



4. Podsumowanie

Uniwersalnoœæ enkapsulacji cz¹steczek aktywnych biologicznie w matrycach uzy-skanych metod¹ zol-¿el w stosunku do rodzaju unieruchamianej substancji, a tak¿eró¿ne mo¿liwoœci zastosowania tak otrzymanych uk³adów, daj¹ ogromne nadziejena przysz³oœæ. Dodatkowym atutem metody jest prostota oraz brak modyfikacji che-micznej immobilizowanej substancji. Cz¹steczki, ¿ywe komórki, a nawet mikroorga-nizmy uwiêzione fizycznie w sztywnej strukturze tego rodzaju matryc zachowuj¹swoje w³aœciwoœci spektroskopowe, a tak¿e aktywnoœæ biologiczn¹.

Literatura

1. Barker S. A., Kay I., (1975), Handbook of Enzyme Biotechnology, Ed. Wiseman A., J Wiley and Sons Inc.,New York.

2. Horitsu H., Takahashi Y., Adachi S., Xioa R., Hayashi T., Kawai K., Kautola H., (1988), Fundamentals

and Applications, Ed. Murray Moo-Young, Elsevier Applied Science, 287-300.3. Vandamme E. J., (1988)), Fundamentals and Applications, Ed. Murray Moo-Young, Elsevier Applied

Science, 287-300, London.4. Chmiel A., (1994), Biotechnologia, podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne, Wyd. Naukowe PWN,

126-142; 314-319, Warszawa.5. £obarzewski J., Ginalska G., (1995), Plant Peroxidase Newsletters, 6, 3-7.6. Tosa T., Mori T., Fuse N., Chibata I., (1967), Enzymologia, 32(3), 153-168.7. Ginalska G., (2001), Sposoby immobilizacji ligandów na matrycach sta³ych i ich zastosowanie w badaniach

biochemicznych, Wydawnictwo Uniwersytetu Marii Curie-Sk³odowskiej, Lublin.8. IUPAC Compendium of Chemical Terminology http://www.iupac.org/publications/compendium/in-

dex.html.9. Maruszewski K., (2000), Fizykochemia moleku³ zamkniêtych w zeolitach i zol-¿elach, Wyd. UWr.,

Wroc³aw.10. Dargiewicz-Nowicka J., (2002), Charakterystyka spektralna porfiryn i ich kompleksów z metalami w ma-

trycach krzemionkowych uzyskanych metod¹ zol-¿el, praca doktorska, Wydzia³ Chemii, UMCS, Lublin.11. K³onkowski A. M., (1993), Wiad. Chem., 47, 497-519.12. Polska K., (2005), Tworzenie siê zwi¹zków kompleksowych pomiêdzy konkanawalin¹ A i porfirytami, praca

doktorska, Wydzia³ Chemii, UMCS, Lublin.13. Livage J., (1997), Current Opinion in Solid State & Materials Science, 2, 132-138.14. Gill I., Ballesteros A., (2000), TIBTECH, 18, 282-296.15. Zusman R., Rotman C., Avnir D., (1990), J. Non-Cryst. Solids, 122, 107-109.16. Lan E. H., Dave B. C., Fukuto J. M., Dunn B., Zink J. I., Valentine J. S., (1999), J. Mater. Chem., 9,

45-53.17. Sacco H. C., Ciuffi K. J., Biazzotto J. C., Mello C., de Oliveira D. C., Vidoto E. A., Nascimento O. R.,

Serra O. A., Iamamoto Y., (2001), J. Non-Cryst. Solids, 284, 174-182.18. Kawano S., Tamaru S., Fujita N., Shinkai S., (2004), Chem. Eur. J., 10, 343-351.19. Li X., King T. A., (1996), J. Non-Crystalline Solids, 204, 235-242.20. Prabakar S., Assink R. A., (1997), J. Non-Crystalline Solids, 211, 39-48.21. Zhang Y., Wang M., (2000), J. Non-Crystalline Solids, 271, 88-93.22. Ciuffi K. J., Sacco H. C., Valim J. B., Manso C. M. C. P., Serra O. A., Nascimento O. R., Vidoto E. A., Ia-

mamoto Y., (1999), J. Non-Crystalline Solids, 247, 146-152.23. Kulikov S. G., Veret-Lemarinier A. V., Galaup J. P., Chaput F., Boilot J. P., (1997), Chemical Physics,

216, 147-161.



24. Arabei S. M., Kulikov S. G., Veret-Lemarinier A. V., Galaup J. P., (1997), Chemical Physics, 216,163-177.

25. Reisfeld R., (2001), Optical Materials, 16, 1-7.26. Lin H. T., Bescher E., Mackenzie J. D., Dai H., Stafsudd O. M., (1992), J. Mater. Sci., 27, 5523-5529.27. Basso A., de Martin L., Ebert C., Gardossi L., Linda P., Sibilla F., (2003), Tetrahedron Lett., 44,

5889-5891.28. Künzelmann U., Böttcher H., (1997), Sensors and Actuators B, 38-39, 222-228.29. Yu J., Ju H., (2003), Anal. Chim. Acta, 486, 209-216.30. Russel S., (1990), Biotechnologia, Wyd. Naukowe PWN, 168-200, Warszawa31. Sugier H., (1994), Biotechnologia, 1 (24), 133-147.32. Lee S. K., Okura I., (1997), Anal. Chim. Acta, 342, 181-188.33. Plaschke M., Czolk R., Ache H. J., (1995), Anal. Chim. Acta, 304, 107-113.34. Delmarre D., Bied-Charreton C., (2000), Sensors and Actuators B, 62, 136-142.35. Delmarre D., Meallet-Renault R., Bied-Charreton C., Pasternack R. F., (1999), Anal. Chim. Acta, 401,

125-128.36. Pastor I., Esquembre R., Micol V., Mallavia R., Mateo C. R., (2004), Anal. Biochem., 334, 335-343.37. Shin J. H., Marxer S. M., Schoenfisch M. H., (2004), Anal. Chem., 76, 4543-4549.38. Cruz-Aguado J. A., Chen Y., Zhang Z., Elowe N. H., Brook M. A., Brennan J. D., (2004), J. Am. Chem.

Soc., 126, 6878-6879.39. Wu X. J., Choi M. M. F., (2004), Anal. Chim. Acta, 514, 219-226.40. Prieto-Simon B., Armatas G. S., Pomonis P. J., Nanos C. G., Prodromidis M. I., (2004), Chem. Mater.,

16, 1026-1034.41. Martinez-Perez D., Ferrer M. L., Mateo C. R., (2003), Anal. Biochem., 322, 238-242.42. Li C. I., Lin Y. H., Shih C. L., Tsaur J. P., Chau L. K., (2002), Biosensors & Bioelectronics, 17, 323-330.43. Simkus R. A., Laurinavicius V., Boguslavsky L., Skotheim T., Tanenbaum S. W., Nakas J. P., Slom-

czynski D. J., (1996), Anal. Lett., 29, 1907-1919.44. Miller J. M., Dunn B., Valentine J. S., Zink J. I., (1996), J. Non-Cryst. Solids, 202, 279-289.45. Narang U., Prasad P. N., Bright F. V., Kumar A., Kumar N. D., Malhotra B. D., Kamalasanan M. N.,

Chandra S., (1994), Chem. Mater., 6, 1596-1598.46. Park T. M., Iwuoha E. I., Smyth M. R., Freaney R., McShane A. J., (1997), Talanta, 44, 973-978.47. Carturan G., Dal Monte R., Pressi G., Secondin S., Verza P., (1998), J. Sol-Gel Sci. Technol., 13,

273-276.48. Inama L., Dire S., Carturan G., Cavazza A., (1993), J. Biotechnol., 30, 197-210.49. Boninsegna S., Bosetti P., Carturan G., Dellagiacoma G., Dal Monte R., Rossi M., (2003), J. Biotech-

nol., 100, 277-286.50. Nassif N., Roux C., Coradin T., Bouvet O. M. M., Livage J., (2004), J. Mater. Chem., 14, 2264-2268.51. Ferrer M. L., Yuste L., Rojo F., del Monte F., (2003), Chem. Mater.,15, 3614-3618.52. Premkumar J. R., Sagi E., Rozen R., Belkin S., Modestov A. D., Lev O., (2002), Chem. Mater., 14,

2676-2686.53. Lin J., Brown C. W., (1997), Trends Anal. Chem., 16, 200-211.54. Pniak B., Walendziewski J., Stolarski M., Steiniger M., (1997), Wiad. Chem., 51, 365-381.55. Shtelzer S., Rappoport S., Avnir D., Ottolenghi M., Braun S., (1992), Biotechnol. Appl. Biochem., 15,

227-235.56. Campestrini S., Meunier B., (1992), Inorg. Chem., 31, 1999-2006.57. Trevisan V., Signoretto M., Colonna S., Pironti V., Strukul G., (2004), Angew. Chem., 43, 4097-4099.58. Han Y. J., Watson J. T., Stucky G. D., Butler A., (2002), J. Mol. Catal. B, 17, 1-8.59. Smith K., Silvernail N. J., Rodgers K. R., Elgren T. E., Castro M., Parker R. M., (2002), J. Am. Chem.

Soc., 124, 4247-4252.60. Ferrer M. L., Levy D., Gomez-Lor B., Iglesias M., (2004), J. Mol. Catal. B, 27, 107-111.61. Cichna M., (2003), J. Sol-Gel Sci. Technol., 26, 1159-1164.62. van Unen D. J., Engbersen J. F. J., Reinhoudt D. N., (2001), Biotech. Bioeng., 75, 154-158.63. Wu S., Lin J., Chan S. I., (1994), Appl. Biochem. Biotechnol., 47, 11-20.



64. Obert R., Dave B. C., (1999), J. Am. Chem. Soc., 121, 12192-12193.65. El Rassy H., Perrard A., Pierre A. C., (2004), J. Mol. Catal. B, 30, 137-150.66. Jaeger K. E., Reetz M. T., (1998), TIBTECH, 16, 396-403.67. Damos F. S., Sotomayor M. D. T., Kubota L. T., Tanaka S. M. C. N., Tanaka A. A., (2003), Analyst,

128, 255-259.68. de Faria A. L., Airoldi C., Doro F. G., Fonseca M. G., Assis M. D., (2004), Appl. Catal. A, 268, 217-226.69. Cunningham I. D., Danks T. N., Hay J. N., Hamerton I., Gunathilagan S., Janczak C., (2002), J. Mol.

Catal. A, 185, 25-31.70. Vidoto E. A., Moreira M. S. M., Fabio D. V., Ciuffi K. J., Nascimento O. R., Iamamoto Y., (2002), J.

Non-Crystalline Solids, 304, 151-159.71. Barbe C., Bartlett J., Kong L. G., Finnie K., Lin H. Q., Larkin M., Calleja S., Bush A., Calleja G., (2004),

Adv. Mater., 16, 1959-1966.72. Sakai S., Ono T., Ijima H., Kawakami K., (2001), Ann. NY Acad. Sci., 944, 277-283.73. Pope E. J. A., Braun K., Peterson C. M., (1997), J. Sol-Gel Sci. Technol., 8, 635-639.74. Radin S., Ducheyne P., Kamplain T., Tan B. H., (2001), J. Biomed. Mater. Res., 57, 313-320.75. Aughenbaugh W., Radin S., Ducheyne P., (2001), J. Biomed. Mater. Res., 57, 321-326.76. Nicoll S. B., Radin S., Santos E. M., Tuan R. S., Ducheyne P., (1997), Biomaterials, 18, 853-859.77. Santos E. M., Radin S., Ducheyne P., (1999), Biomaterials, 20, 1695-1700.78. Radin S., El-Bassyouni G., Vresilovic E. J., Schepers E., Ducheyne P., (2005), Biomaterials, 26,

1043-1052.79. Vallet-Regí M., Ragel C.V., Salinas A.J., (2003), Eur. J. Inorg. Chem., 6, 1029.80. Maruszewski K., Sidorowicz A., Ulatowska A., Podbielska H., Strêk W., (1998), J. Mol. Struct., 450,

193-200.81. Ion R-M., (1996), Romanian J. Biophys., 6, 205-212.82. Podbielska H., Ulatowska-Jar¿a A., Binding U., Ho³owacza I., Strêk W., Muller G., Eichler H. J.,

(2004), Proceedings of the International Conference “Sol-Gel Materials ’04”, Wroc³aw, 49.



Documents

Katarzyna Polska1, Jan Fiedurek2, Stanisław Radzki1