Introducción a la Fluorescencia.ppt

8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt

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Introducción a la

FluorescenciaAbril, 2012


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Antes que todorecordemos que…


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E n e r g i a

S0

S1′

h νex h νem

S1

1

2

3(λ)

(λ′)longitud deonda larga

Física de laFluorescencia

Estadodeexcitación

Estadofundamental

S0′

4alabras cla!e"

#ransición, estado excitado,energía absorbida, estabilidad$


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%

roducción de laFluorescencia


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&

'once(tos ) terminologíaim(ortanteEs(ectro de excitación"

Es(ectro de emisión"

Es la re(resentación del n*mero de fotones absorbidos (or unamol+cula con su corres(ondiente longitud de onda$

e(resentación de los fotones liberados al (asar del estado deexcitación al estado fundamental donde los electrones sonestables$


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-

.F / ariantes de 'ur!asde Fluorescencia

.F .reen Fluorescence rotein" Es una (roteínaque se utilia en biología molecular 4abitualmente

como marcador$


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5

6icrosco(ía de Fluorescencia


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6icrosco(ía de E(i8uorescencia

Fue descubierto en 1907 (or :;4ler )s larga$

=os colorantes 8uorescentes utiliados (ara latinción celular se denominan fuorocromos ó

fuoróoro (hechas a base de proteínas).

=a intensidad ) el color de la lu de emisión esuna (ro(iedad característica de la mol+cula8uorescente utiliada$

?o (ueden ser obser!ados durante largo


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enta@as

ermite un alto constraste entre la seal lo queinteresa ) el ruido lo que no interesa$


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El cubo Bltro de Fluorescencia

'om(onentes


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Filtro de Excitación

(asar las longitudes en el rango desde %&0C%90 nm color aul

Espejo dicroico

Este es(e@o tienen la (ro(iedad de re8e@ar la lu de ciertas longitudes deonda ) de de@ar (asar otras, ($e$ re8e@ar> longitudes de onda &10nm ómenos aul ) de@ar> (asar longitudes su(erior a &10nm !erde emitida(or el 8uorocromo de la muestra$

Filtro de emisión

($ e$ de@ar> (asar la longitud deonda &1&nm !erde

Por ejemplo:

'ubo Bltro I3, datos t+cnicos" excitation Blter D %&0%90, dic4romatic

mirror" &10, su((ression Blter" = &1&

'om(onentes


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C=as rendi@as del Bltro de excitación 4an de ser losuBcientemente estrec4as como (ara obtener un es(ectro bienresuelto$

C=os es(ectros de emisión a menudo son acom(aados (or otras

emisiones indeseables que diBcultan el estudio aquí el Bltrosu(resor adquiere im(ortancia$

CExiste un gran n*mero de @uegos de Bltros de excitación )emisión (ara los diferentes 8uorocromos, 4a) algunos que(ermiten la obser!ación simult>nea de dos o tres 8uorocromos$

'om(onentes


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Fuente de luminación

'om(onentes

“Lo ideal es tener una fuente de radiación potente que emita de

manera continua sobre un amplio intervalo espectral”

Lampara aló!ena

=>m(ara de arco de alta (resión de enón e

=>m(ara de ba@a (resión !a(or de 6ercurio Gg

=am(ara de Galogenuros 6et>licos

=EH


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b@eti!os

'om(onentes

CA ma)or A$?$ ma)or8uorescencia ser> ca(tada


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1&

http://www.atto.com/Carv/CarvSkinSection.htm

"onocal #icroscop$

J atented b) 6insK) in 19&5

J Eliminación de (lanos fuerade enfoque obser!ados en8uorescencia

esolución L(tica" 'on!encional #ambi+n llamado MideField!s$ 'onfocal


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'onBguración

"ubo Filtros

C reguntar que sondas o 8uorocromos utiliar>n en sus estudiosestos (ueden ser" Isotiocianato de 8uorceína, HAI, naran@ade acridina, etc$

El FI#' es am(liamente utiliado en microsco(ía de 8uorescenciaaco(lada a anticuer(os$ Entre FI#' ) HAI usado (ara A?Hest>n casi el 70N de las a(licaciones$

C Oncontrar la corres(ondencia entre los 8uorocromos ) loscubos Bltros #abla$

C He acuerdo a la cantidad de cubos Bltros a utiliar seleccionarel modelo del microco(io$ H65&01000 cuando sean comom>ximo 02 cubos Bltros, H620002&003000%000 ) H6I3000(ara m>ximo 0% cubos Bltros, H6I%000-000D (ara 0& cubos,H6&000&&00-000 4asta 05 cubos Bltro$


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'onBguraciónCubo Filtros

HAI, tie el AH?,(ermite ubicarc+lulas (or susn*cleos (ero nodistingue c+lulasmuertas de c+lulas!i!as$

FI#''on@ugado m>sem(leado (ara !er

reacciones antígenoCanticuer(o$


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Fuente de Iuminación


Es necesario tener en cuenta tres com(onentes im(ortantes"

CIntensidad de la l>m(ara

CHistribución de longitudes de onda de la radiación que emite lafuente

CEstabilidad


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Lampara Halógena

'onBguración

Lámpara de arco de alta presión de Xenón (Xe)

Lámpara de baja presión vapor de Mercurio (Hg)

Lampara de Halogenuros Metálicos

LED


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'onBguración

L%mparas de arco de alta presión de &enón

Emiten una radiación relati!amente estable de 8u@o contínuoentre 300 a 1300 nm, est>n limitados (or el desgaste delelectrodo ) la di!agación del arco$


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'onBguración

L%mparas de 'apor de #ercurio de baja presión

s frecuentemente utiliados, el arco resultante es difusa) muc4o menos intensa (ero con me@or estabilidad encom(aración al arco de enón una radiación intensa )relati!amente estable de 8u@o contínuo entre 300 a 1300 nm,esta limitado (or el desgaste del electrodo ) la di!agación del

arco$


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0,0%

10,0%

20,0%

30,0%

40,0%

50,0%

60,0%

70,0%

80,0%

90,0%

100,0%

250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750

Lambda [nm]

P o w e r [ m W ]

HBO

HXP120

FITC

Amarillo578

Verde 546

Azul 436

Viol45

!V365

!V334

'onBguración


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'onBguración


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'onBguración

ccesorios

C '>maras digitales

C


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equerimientos (ara ladigitaliación de la Fluorescencia

• Adquisición acti!a de$$ – (ida de im>genes

• Da@o ni!el de ruido con alto

rango din>mico – Extraer seales d+biles• Dinning

– Incrementar sensibilidad

•


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• A(licaciones de Fluorescencia en .eneral

DFC450

DFC450 CDFC495

DFC500

'onBguración

ccesorios

C '>maras


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'onBguración

ccesorios

C genes digitales en8uorescencia es es(ecial )a que loses(ecimenes frecuentemente no son estables) las im>genes (ueden (erder intensidad

• Esto 4ace a la fotografía tradicional com(le@a )(oco con!eniente

• =a imagen digital (roduce im>genes en unformato que (uede mani(ularse f>cilmente

(ara identiBcar detalles ) que es adecuado(ara medidas ) an>lisis

R'uando ) (or que utiliarlo S


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'onBguración

ccesorios

C mara digital ) una '• (timiado (ara adquisición de im>genes

multicanal (ara – isualiación, me@ora, documentación de im>genes

8uorescentes coloreadas de microsco(ia

• =as im>genes de los distintos canales secombinan en una imagen


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'onBguración

ccesorios

C ndar

– uede recombinar im>genes de canales (ara obtenerel as(ecto necesario utilia desde 2 4asta 7 canales

– uede adquirir m*lti(les canales ) combinar sólo losdeseados

– uede utiliarse tambi+n con HI' o DF

• cil com(osición de la imagen ) a@uste de la c>mara

los tiem(os de ex(osición se a@ustan (or se(arado(ara cada canal

• ecu(eración de datos de conBguración

– e(roducir adquisiciones es sim(le


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• Lente de refuer! "#r#

$nre&ent#r '# $nten($d#d

• F)* +F'u!re(ene )nten($t

*#n#-er. /e(t!r de )nten($d#d de

'# F'u!re(en$# "#r# #&$#r '#$nten($d#d de 'u ($n "erder

!ntr#(te

• /e(t!r de $t#$n "#r# #u(te

de $nten($d#d de d$ferente('!n-$tude( de !nd#

• D$#fr#- de #&"!(

ret#n-u'#re( "#r# "t$ (e#'

de r#t$! de ru$d! en $&-ene(

d$-$t#'e(

Otr!( !&"!nente(


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F'u! B!!(ter

• Lente de('$#nte !"$!n#'

• )nre&ent# '# $nten($d#d de'u #(t# 30%

• Puede (er #&$#d! "#r#

#'t# !&!-ene$d#d ! #'t#

$nten($d#d


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/e(t!r de )nten($d#d de '# F'u!re(en$#

+F'u!re(ene )nten($t *#n#-er.

F)*

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!r-#n$(&(

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• L# #tenu#$n (e #($-n# d$ret#&ente

# '!( u!( f$'tr!(


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/e(t!r de $t#$n+$t#t$!n *#n#-er.

• C!ntr!' de('$#nte O"$!n#'

• u(te de $nten($d#d #

d$ferente( '!n-$tude( de !nd#

• P#r# #'#ne :erde


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Fin

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