INTRODUCCIÓN

7/16/2019 INTRODUCCIÓN

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Práctica 1 Fermentación de carbohidratos por la levadura Sacharomyces cerevisiae

I ngeniería en Biotecnología Fermentaciones I ndustr iales

0

UNIVERSIDAD POLITECNICA DE PACHUCA

LABORATORIO DE FISFER

FERMENTACIONES INDUSTRIALES

PRÀCTICA 1:

“Fermentación de carbohidratos por la levadura Sacharomyces cerevisiae ”

M. en C. Jorge Álvarez Cervantes

GRUPO: 27265

Hernández Hernández Yenni Leidy

Luna Valdez María Ofelia

Marcelino Pérez Gabriel

Reyes Mata Silvia Denisse

Sánchez Martínez Rosa Gloria

MAYO – AGOSTO 2013

FECHA DE ELABORACION DE LA PRÁCTICA: 22 DE MAYO DE 2013

FECHA DE ENTREGA DEL REPORTE: 29 DE MAYO 2013

0

INTEGRANTES FIRMA





1

INTRODUCCIÓN

La fermentación es el catabolismo anaerobio de un compuesto orgánico en el que elcompuesto sirve tanto de donador de electrones como de aceptor como de aceptor deelectrones, y en el que el ATP se produce normalmente por fosforilación a nivel del

sustrato (T. Madigan et al. 2009). El proceso de fermentación es producido por acciónde las enzimas, lo cual conlleva cambios químicos en las sustancias orgánicas (Y.Stanier, 2005). Son diversos los productos que se pueden obtener de una fermentacióntales como:

Alcoholes y solventes: acetona, butanol, 2,3-butanodiol, etanol, glicerol.

Ácidos orgánicos: acético, cítrico, fumárico, glucónico, itacónico, láctico.

Aminoácidos: lisina, metionina, triptófano, valina.

Antibióticos: bacitracina, Esteptomiciana, neomicina, penicilina, riboflavina.

Esteroides: cortisona, hidrocortisona, testosterona, etc.

(García Garibay, 2005)

Las levaduras son organismos vivos, vegetales microscópicos de una sola célula, másespecíficamente hongos, crecen bien en un medio constituido por aun azúcar, fosfatos yextracto de lavadura. El pH más favorable para ella se encuentra entre 3-5 y 4-5.También es posible clasificar a las fermentaciones por la presencia o ausencia deoxigeno molecular durante el proceso. Los procesos se pueden denominar, fermentaciónaerobia y anaerobia. (M. Prescott, 2002).

En la fermentación aerobia, el aceptor final de electrones es el oxígeno; su presenciaimplica el desarrollo del microorganismo y la producción del compuesto fundamental

biomasa, dióxido de carbono y agua. Mientras que la fermentación anaerobia, el proceso

de producción del metabolito de interés se desarrolla en ausencia de oxigeno; los productos finales son sustancias orgánicas, en este proceso los microorganismo producen mucho menor energía que los aerobias y por suplir sus necesidades de energíametabolizan mayor cantidad de azucares, por tanto elaboran más metabolitos, por lo quecontrolar la presencia de oxígeno para incrementar la producción (Pares Arras, 2002).

Es de gran importancia conocer las rutas bioquímicas de degradación de compuestosorgánicos, ya que ello ayuda a determinar que compuestos se obtendrá, sino también por la posibilidad de manipular el proceso. Existen varias rutas, sin embargo únicamente lasmás relevantes son la dela glucolisis (Vía Embden-Meyerhof-Parnas), el ciclo de Krebs

que ayudan a transportar electrones durante el metabolismo aerobio y la cadenarespiratoria (T. Madigan, M. Martinko, V. Dunlap, & P. Clark, 2009).





2

En la elaboración del pan las levaduras transforman el almidón (un azúcar complejo) englucosa. Lo hacen mediante la enzima amilasa (otras enzimas: glucosidasas yamiloglucosidasas). La mayor parte de los azúcares que desdobla la levadura los utilizala propia levadura para vivir y desarrollarse, y otra parte quedan en la masa del pan,dándole parte de su sabor y el color dorado del horneado (García Garibay, 2005).

OBJETIVO

Determinar el sustrato (carbohidratos) a que la levadura Saccharomyces cerevisiaemetaboliza más rápidamente teniéndola a diferentes temperaturas (ambiente y 37 °C) yal mismo tiempo entender el cambio que sufren las moléculas de los carbohidratos.

HIPÓTESIS

La fermentación que se llevará a cabo dependerá directamente del tipo de carbohidrato,

su asimilación por el microorganismo y las distintas temperaturas a las que sesometerán.

METODOLOGÍA

MATERIALES

5 vasos de precipitado de 50 ml 2 vasos de precipitados de 600

ml 1 vaso de precipitados de 150 ml

Termómetro 16 tubos de fermentación 1 vidrio de reloj 1 probeta de 100 ml 1 parrilla de calentamiento 1 gradilla 1 espátula

1 propipeta 5 pipetas de 10 ml

REACTIVOS

90 ml Agua destilada

60 ml Lactosa 60 ml Almidón 60 ml Sacarosa 60 ml Glucosa

MICROORGANISMOS9g de Sacharomyces cerevisiae.

PROCEDIMIENTO:

1) Activación de la levadura

Se pesan 9g de levadura Se activa en 90 ml

de H2O a 37°C

Levadura

activada a 37°C





1

2) Fermentación de Glucosa

2 tubos a 37 ºC

2 tubos atemperatura

ambiente

5 minutos después

Medir el CO2 encm (la burbujaque se formó)

Repetir medición a0, 15, 30 y 45

minutos

Se vacía 15 mlde glucosa en 4

tubosSe agrega 5 ml

levaduraSe toman 15 mlde glucosa

Glucosa

Mezclar 5 ml delevadura en los 4 tubos

con glucosa





2

3) Fermentación de Almidón

2 tubos a 37 ºC


ambiente

5 minutos después



minutos

Se vacía 15 mlde almidón en 4

tubos Se agrega 5 mllevadura

Se toman 15 mlde almidón

Almidón


con almidón





3

4) Fermentación de Sacarosa

2 tubos a 37 ºC


ambiente

5 minutos después



minutos

Se vacía 15 ml

de sacarosa en4 tubos

Se agrega 5 mllevadura

Se toman 15 mlde sacarosa

Sacarosa


con sacarosa





4

5) Fermentación de Lactosa

2 tubos a 37 ºC

2 tubos a

temperaturaambiente

5 minutos después

Medir el CO2 encm (la burbuja

que se formó)


minutos

Se vacía 15 mlde lactosa en 4

tubosSe agrega 5 ml

levaduraSe toman 15 ml

de lactosa

Lactosa


con sacarosa





5

RESULTADOS

En la presente practica se llevó a cabo la fermentación de azucares (glucosa 10%,sacarosa 10%, lactosa 10% y almidón 10%) por la levadura Saccharomyces cerevisiae en diferentes temperaturas que fueron a temperatura ambiente y a 37 °C.

Tabla 1. Tiempo y producción de CO2 por Saccharomyces cerevisiae al metabolizarglucosa.

GLUCOSA

Tiempo(minutos)

Cantidad deCO2

producido(cm2) a 37 °C

tubo A

Cantidad deCO2


tubo B

Cantidad de CO2

producido (cm2) atemperatura

ambiente

tubo C

Cantidad de CO2

producido (cm2) atemperatura ambiente

tubo D0 0 0 0 0

5 0.7 2.5 0.3 0.6

15 4.1 4.5 1.2 1.1

30 7.2 7.6 3.3 3

45 9.5 8.9 5.4 5.1

0

0.7

4.1

7.2

9.5

0

2.5

4.5

7.6

8.9

00.3

1.2

3.3

5.4

0

0.61.1

3

5.1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 10 20 30 40 50

C O 2

( c m 2 )

Tiempo (minutos)

Saccharomyces cerevisiae en GlucosaTubo A a 37 C

Tubo B a 37 C

Tubo C a temp. Ambiente

Tubo D a temp. Ambiente

Figura 1.- Producción de CO2 a dos diferentes temperaturas en determinado tiempo.





6

Tabla 2. Tiempo y producción de CO2 por Saccharomyces cerevisiae al metabolizarsacarosa.

SACAROSA

Tiempo(minutos)

Cantidad deCO2


tubo A

Cantidad deCO2


tubo B

Cantidad de CO2


ambientetubo C

Cantidad de CO2


tubo D

0 0 0 0 0

5 2.3 2.2 0.5 0.8

15 5 4.4 1.5 1.3

30 6.7 5.6 2.7 4

45 6.9 6.2 3.4 4.2

Figura 2.-Producción de CO2 a dos diferentes temperaturas en determinado tiempo.

0

2.3

5

6.76.9

0

2.2

4.4

5.6

6.2

0

0.5

1.5

2.7

3.4

0

0.8

1.3

44.2

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 10 20 30 40 50

C O 2

( c m 2 )

Tiempo (minutos)

Saccharomyces cerevisiae en Sacarosa

Tubo A a 37 C

Tubo B a 37 C

Tubo C a temp. ambiente

Tubo D a temp. ambiente





7

Tabla 3.- Tiempo y producción de CO2 por Saccharomyces cerevisiae almetabolizar Lactosa.

LACTOSA

Tiempo(minutos)

Cantidad deCO2


tubo A

Cantidad deCO2


tubo B

Cantidad de CO2


ambientetubo C

Cantidad de CO2


tubo D

0 0 0 0 0

5 0 0 0 0

15 0.2 0.1 0 0

30 0.4 0.3 0.1 0.1

45 0.5 0.35 0.15 0.2


0 0

0.2

0.4

0.5

0 0

0.1

0.3

0.35

0 0 0

0.1

0.15

0 0 0

0.1

0.2

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 10 20 30 40 50

C O 2

( c m 2 )

Tiempo (minutos)

Saccharomyces cerevisiae en Lactosa

Tubo A a 37 C

Tubo B a 37 C

Tubo C (Ambiente)

Tubo D (ambiente)






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Tabla 4. Tiempo que tardo la levadura en consumir el Almidón.

ALMIDÓN

Tiempo(minutos)

Cantidad deCO2


tubo A

Cantidad deCO2


tubo B

Cantidad de CO2


ambientetubo C

Cantidad de CO2


tubo D

No se observó producción de CO2 en las dos diferentes temperaturas durante los 45minutos que duró el experimento por este sustrato.

Tabla 5. Balance energético de azucares fermentados por levaduras

Azúcar Estequiometria Energía libreGlucosa

1. Etanol/CO2= -

238.8 kJ/mol deglucosa fementada.

Sacarosa

Sacarosa fosforilasa

α-D-glucosa + 1-P-fructosa

Al deshacerse el disacárido se obtienen α-D-glucosa + 1-P-fructosa los cuales son

introducidos rápidamente a la vía de laglucolisis obteniéndose el doble de productos

que con una sola molécula de glucosa.

2. Etanol/CO2= -477.6 kJ/mol desacarosafementada.

Lactosa

Β-Galactosidasa +H2O

(Galactosa +Glucosa)

Al igual que la sacarosa pasa lo mismo con lalactosa se obtienen dos monosacáridos que son

galactosa y glucosa, solo que aquí hay unadiferencia ya que la galactosa lleva a cabo unaserie de trasformaciones que se muestran en laimagen 4 hasta llegar α-D-glucosa-6-fosfato

para entrar a la ruta de la glucolisis.

3. Etanol/CO2= -477.6 kJ/mol delactosa fementada





9

Figura 4. Transformaciones de la Galactosa para entrar a la vía de la Glucolisis.

(M. Prescott, 2002)

DISCUSIÓN

En la Figura 1 se muestra la gráfica de producción de CO2, la cual fue construida conlos datos de la Tabla 1 y se observa una mayor eficiencia de fermentación de la Glucosaa 37 °C que a temperatura ambiente al igual que cualquier otro carbohidrato probado enesta práctica ya que se obtuvo hasta 9.5 cm2 de CO2 resultado de la fermentación de laglucosa en 45 minutos , debido a que es el azúcar que metaboliza preferentemente laslevaduras del genero Saccharomyces aunque en algunos casos prefiere fructosa comolas levaduras del vino. Otras fuentes de carbono que puede utilizar Saccharomyces

cerevisiae son: maltosa, sacarosa, maltiotriosa, galactosa, suero hidrolizado y enalgunos casos particulares puede utilizar etanol (Owen P. , 1989). El rendimiento





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teórico posiblemente obtenido por gramo de glucosa es de 0.51 g de etanol y 0.49 g deCO2. Y si el rendimiento quizá no se obtuvo porque no se tuvieron las condicionesóptimas como los son la velocidad de fermentación que aumenta generalmente entre los15 y los 35 °C y nuestra temperatura utilizada fue de 37 °C. Otro factor que pudoafectar el experimento fue que no se midió el pH y es indispensable para la formaciónde subproductos el cual debe estar en un rango de entre 3-6 que son favorables para laactividad fermentaría (T. Madigan et al. 2009).

Sacarosa fue el segundo carbohidrato en mostrar una buena fermentación a 37 °C,obteniendo una máxima producción de CO2 de 6.9 cm2 en 45 minutos, estos datos sevisualizan en Tabla 2, en la Figura 2 se observa la producción gradual de CO2 conformetrascurre el tiempo con y sin temperatura. Esta no fue tan eficiente como la glucosa, yaque para llevar a cabo la fermentación tuvo que excretar una enzima para poder hidrolizar al disacárido (glucosa y fructosa conforman a la sacarosa), en este caso la

enzima que excreto fue una invertasa, para que después los monosacáridos (glucosa yfructosa) sean transportados a través de la membrana celular ya sea por transporte activoo pasivo en donde intervienen permeasas producidas constitutivamente o inducibles

para después entrar a la vía de Embden-Meyerhof en el caso de la glucosa y para lafructosa a la vía de la pentosas fosfato para después incorporarse a la vía de Embden-Meyerhof (T. Madigan et al. 2009).

Los datos arrojados en el experimento con Lactosa mostrados en la Figura 3 y Tabla 3nos dicen que Saccharomyces cerevisiae metaboliza la Lactosa en mínimas

proporciones casi nada a 37 °C y mucho menos a temperatura ambiente, pero Owen P.en 1989 reporta que Saccharomyces cerevisiae puede fermentar la lactosa, debido q quetiene un sistema lactosa permeasa para transportar la lactosa dentro de la célula, dondese hidroliza a glucosa y galactosa, que entran a la vía de la glucolisis. Probablemente nose obtuvieron estos resultados causados por las condiciones de temperatura y pHexplicados anteriormente.

En el caso del almidón no se observó producción alguna de CO2 con y sin temperatura(37°C) debido a que las levaduras Saccharomyces son incapaces de hidrolizar elalmidón y las dextrinas (T. Madigan et al. 2009). Por lo cual, el empleo de materiales

basados en almidón para la fermentación alcohólica requieren la acción de enzimasextracelulares como las α y β-amilasas (glucoamilasas) y pululanasas (Owen P. , 1989).

CONCLUSIÒN





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CUESTIONARIO

1) Menciona las diferencias entre la fermentación alcohólica y lácticaLa fermentación láctica ocurre en algunas bacterias y gracias a este procesoobtenemos productos de origen lácteo tales como yogurt, crema agria y quesos.Este proceso sucede también en el músculo esqueletal humano cuando haydeficiencia de oxígeno, como por ejemplo, durante el ejercicio fuerte y continuo. Laacumulación del ácido láctico causa el dolor característico cuando ejercitamos losmúsculos excesivamente. Se realiza por las bacterias del ácido láctico gracias a la

presencia de una enzima, llamada lactato deshidrogenasa. En este tipo defermentación es el ácido pirúvico producto de la glucólisis, el que acepta los

electrones y se convierte en ácido láctico.

En la fermentación alcohólica suceden dos reacciones consecutivas:

Ácido pirúvico Acetaldehído CO2 Acetaldehído + NADH+H+ Etanol + NAD+

Este tipo de fermentación ocurre en levaduras, ciertos hongos y algunas bacterias, produciéndose CO2 y alcohol etílico (etanol). Las moléculas de glucosa (presentes

en la masa) sufren glucólisis originando ácido pirúvico, este ácido pirúvico encondiciones anaeróbicas se descarboxila para transformarse en acetaldehído, el cualse reduce a alcohol etílico por acción del NADH2 convirtiéndose así en el aceptor final de los electrones del NADH obtenido en la glucólisis. La diferencia entre estasfermentaciones inicia desde el microorganismo, debido a que la fermentaciónalcohólica es llevada por levaduras y bacterias, mientras que la fermentación lácticaes llevada por bacterias. (M. Prescott, 2002)

Los productos al fin de la fermentación en la alcohólica se obtiene etanol, CO 2 y2ATP, mientras que la fermentación láctica depende si es homofermentativa se

obtiene 2 lactatos y 2 ATP, si heterofermentativa se obtendrá 1 ATP, 1 lactato, 1etanol y 1 CO2 por una molécula de glucosa fermentativa. (Respiracion Celular ,2010)





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2) En términos evolutivos ¿Cuál de las dos rutas debió surgir primero?

La fermentación alcohólica, debido a que hace 3,500 millones de años la atmosferade la Tierra contenía muy poco oxígeno, por lo cual los organismo primitivossurgieron en una atmosfera sin oxígeno, desarrollaron un mecanismo bioquímicosencillo y primitivo de producción de energía libre sin necesidad de esteelemento, Las levaduras y bacterias causantes de este fenómeno sonmicroorganismos muy habituales en las frutas y cereales y contribuyen en granmedida al sabor de los productos fermentados. Una de las principales característicasde estos microorganismos es que viven en ambientes completamente carentes de

oxígeno (O2). (Macias, 2008)

Figura 5. Ruta de la glucólisis

Figura 6. Fermentación alcohólica





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3) ¿Cuál es el propósito de la fermentación?El propósito de la fermentación es que los microorganismos produzcan metabolitoso biomasa a partir de la utilización de sustancias orgánicas en ausencia o presenciade oxígeno. La descomposición de los sustratos se llevara a cabo por enzimas

producidas por microorganismos para la finalidad. (Hernandez, 2009)

4) ¿Qué pasaría si en vez de llevar a cabo la fermentación láctica que nosotrosllevamos utilizáramos la fermentación alcohólica?Tendríamos que cambiar el microorganismo por que la fermentación alcohólica esllevada por levaduras y bacterias, mientras que la fermentación láctica es llevada

por bacterias. Lo que pasaría seria la obtención de productos en la fermentaciónláctica, obtendríamos ATP, lactato, etanol y CO2 mientras que en la alcohólicaobtenemos ATP, alcohol y CO2. (Respiracion Celular , 2010)

5) ¿En qué parte de una célula Eucariota debe ocurrir la fermentación?En el citosol, en la cual se oxida parcialmente la glucosa para obtener energía.(Planeta Saber, 2012)

BIBLIOGRAFÍAPlaneta Saber (2012). Cèlulas Eucariotas. Recuperado el 28 de Mayo de 2013, de

http://www.planetasaber.com/celulas_eucariotas/biology/32456/

García Garibay, M. (2005). Biotecnología alimentaria. México: Limusa.

Hernandez, A. (2009). Microbiologia Industrial . Argentina .

M. Prescott, L. (2002). Microbiología. Madrid: McGraw-Hill.

Macias, E. B. (2008). Fermentación por Saccharomyces cerevisae de algunos tipos deglúsidos. Congreso de la Investigación, 2-3.

Owen P. , W. (1989). Biotecnología de la Fermentación. (M. Calvo Rebollar, Trad.)Madrid, Primera Edición: ACRIBIA, S. A.

Pares Arras, R. (2002). Bioquímica de los microorganismos. Barcelona:REVERTÉ,S.A.

Respiracion Celular . (14 de Marzo de 2010). Recuperado el 28 de Mayo de 2013, dehttp://academic.uprm.edu/~jvelezg/lab8.pdf

T. Madigan, M., M. Martinko, J., V. Dunlap, P., & P. Clark, D. (2009). Biología de losmicroorganismos (Duodécima Edición ed.). Barcelona: PEARSONEDUCACIÓN, S.A.

Y. Stanier, R. (2005). MICROBIOLOGÍA (SEGUNDA EDICIÓN ed.). Barcelona:REVERTÉ, S. A.





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