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LABORATORIO DE HPLC
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Universidad Andrés bello
Departamento de Ciencias Químicas
Laboratorio de Química e Instrumental
LABORATORIO N°6
CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION (HPLC)
DETERMINACIÓN DE TEOFILINA EN UNA MUESTRA PROBLEMA
INTEGRANTES : RODRIGO AGUILAR
CHRISTOPHER ESPINOZA
GRUPO : N°4
PROFESOR : LUIS RAUL DE LA NUEZ
FECHA
ENTREGA
: 16/11/2015
RESULTADOS
Determinación de la concentración de Teofilina en una
muestra problema (MP)
Se trabajó con una fase móvil isocrática (30:70 = Metanol, Agua), a un flujo
de 1mL/min y utilizando una longitud de onda detección de 260nm.
Por el método de estándar interno (10ppm de Teobromina) se determinara la
concentración de MP, ya que se hace una curva de calibración previamente
medida usando patrones de Teofilina de 5, 10, 15, 20 y 25 ppm.
Luego del análisis en el cromatógrafo liquido de alta resolución de todos los
patrones de Teofilina y la MP, se tabularon los siguientes datos.
TABLA N°1: MEDICIÓN CROMATOGRAFICA
Flujo
1mL/min
5ppm 10ppm 15ppm 20ppm 25ppm MP
Teob Teof Teob Teof Teob Teof Teob Teof Teob Teof Teob Teof
A 25837 28760 24420 40086 24442 90427 24398 118137 24325 137076 24594 106304
Tr 5,092 6,842 5,275 7,392 5,083 6,958 5,133 7,042 5,233 7,217 5,158 7,083
w 1,12 1,37 1,23 0,99 1,16 1,63 1,18 1,56 1,14 1,43 1,18 1,52
Tm 1,617 1,592 1,583 1,583 1,583 1,592
A: área de pico; Tr: Tiempo de retención; w: Ancho de banda; Tm: Tiempo muerto
TABLA N°2: VALORES PROMEDIO DE MEDICION CROMATOGRAFICA
Valores promedio
(Flujo 1mL/min)
Teob Teof
A 24684,4 82897,2
Tr 5,1632 7,0902
w 1,166 1,369
Tm 1,5916
Influencia del flujo de la fase móvil
Se trabajo con un patrón de 10 ppm de Teofilina y una fase móvil isocrática (30:70=
Metanol, Agua). Se midió a 260 nm con flujos de 0,8 mL/min y 1,2 mL/min.
Se tabularon los siguientes datos:
TABLA N°3: FLUJO DE FASE MOVIL (10ppm) POR TIEMPO (mL/min)
Flujo 0,8 mL/min 1,0 mL/min 1,2 mL/min
Teob Teof Teob Teof Teob Teof
A 21659 44550 24420 40086 22028 49296
Tr 6,292 8,608 5,275 7,392 4,3 5,792
W 1,31 1,14 1,23 0,99 1,13 1,35
Tm 1,942 1,592 1,358
A partir de la medición se obtuvieron los siguientes datos:
TABLA N°4: CONCENTRACION DE TEOFILINA (ppm), AREA DEL PICO DE
TEOFILINA Y TEOBROMINA
Concentración
Teofilina (ppm)
Área del pico
Teofilina
Área del pico
Teobromina
5 28760 25837
10 40086 24420
15 90427 24442
20 118137 24398
25 137076 24325
Muestra 106304 24594
Para determinar la concentración de la MP, se hizo una curva de calibración en
donde se grafica área del pico de teofilina/área del pico del patrón interno en función
de la Concentración de Teofilina.
TABLA N°5: CONCENTRACION TEOFILINA V/S ATEOF/ATEOB
Concentración de Teofilina (ppm) ATeof/ATeob
5 1,113
10 1,641
15 3,699
20 4,842
25 5,635
Muestra 4,322
Según esta tabla se obtiene el siguiente gráfico:
GRAFICO N°1 CURVA DE CALIBRACION: [ ] TEOFILINA V/S COCIENTE
ENTRE AREA TEOF Y TEOB
y = 0,2449x - 0,2871R² = 0,9681
0
1
2
3
4
5
6
7
0 5 10 15 20 25 30
AT
eo
f/A
Teo
b
[TEOFILINA]ppm
[ ] Teofilina (ppm) V/S ATeof/ATeob
Para calcular la concentración de Teofilina en la muestra problema se reemplaza
Y = 4,322 (ATeof/ATeob con los datos obtenidos de la Tabla N°5 para la muestra) en
la ecuación de la recta obtenida, entonces:
𝑌 = 𝑚𝑥 + 𝑏
𝑌 = 0,2449𝑥 − 0,2871
4,322 = 0,2449𝑥 − 0,2871
𝑥 =4,322 + 0,2871
0,2449= 18,82𝑝𝑝𝑚
Por lo tanto la concentración de Teofilina la muestra problema es 18,82 ppm
Teofilina.
Determinación promedio de platos teóricos
Se procede en calcular los platos teóricos en base a la tabla N°3.
Entonces: 𝑁 = 16 ∗ (𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑡𝑒𝑛𝑐𝑖𝑜𝑛
𝑎𝑛𝑐ℎ𝑜 𝑑𝑒 𝑏𝑎𝑛𝑑𝑎)
2
- Para la Teobromina con un flujo 0,8 mL/min
𝑁 = 16 ∗ (6,292
1,31)
2
= 𝟑𝟔𝟗, 𝟏𝟏
- Para la Teofilina con un flujo de 0,8 mL/min
𝑁 = 16 ∗ (8,608
1,14)
2
= 𝟗𝟏𝟐, 𝟐𝟓
- Para la Teobromina con un flujo de 1,0 mL/min
𝑁 = 16 ∗ (5,275
1,23)
2
= 𝟐𝟗𝟒, 𝟐𝟖
- Para la Teofilina con un flujo de 1,0 mL/min
𝑁 = 16 ∗ (7,392
0,990)
2= 𝟖𝟗𝟐,02
- Para la teobromina con un flujo de 1,2 mL/min
𝑁 = 16 ∗ (4,300
1,13)
2
= 𝟐𝟑𝟏, 𝟔𝟗
- Para la Teofilina con un flujo de 1,2 mL/min
𝑁 = 16 ∗ (5,792
1,35)
2
= 𝟐𝟗𝟒, 𝟓𝟐
Con los cálculos señalados se genera esta tabla:
TABLA N°6: PLATOS TEORICOS TEOBROMINA Y TEOFILINA EN LOS 3
FLUJOS MEDIDOS
FLUJO FASE MOVIL
(mL/min)
Teobromina Teofilina
0,8 369,11 912,25
1,0 294,28 892,02
1,2 231,69 294,52
Ahora se puede calcular los promedios de los platos teóricos para cada flujo
TABLA N°7: RESUMEN CALCULOS DE PROMEDIOS PLATOS TEORICOS
FLUJO (mL/min) PROMEDIO PLATOS TEORICOS
0,8 N = 𝟗𝟏𝟐,𝟐𝟓 + 𝟑𝟔𝟗,𝟏𝟏
𝟐 = 640,68
1,0 N = 𝟐𝟗𝟒,𝟐𝟖+ 𝟖𝟗𝟐,𝟎𝟐
𝟐 = 593,15
1,2 N = 𝟐𝟗𝟒,𝟓𝟐+𝟐𝟑𝟏,𝟔𝟗
𝟐 = 263,11
DETERMINACIÓN DE ALTURA DE PLATOS TEÓRICOS
Luego calcular los platos teóricos (N) se puede obtener la altura de platos teóricos
aplicando la siguiente ecuación:
𝑁 = 𝐿
𝐻 En donde L= altura de la columna y H= altura de platos teóricos.
Para este práctico la altura de columna es de 25cm. Entonces por simple despeje
nos queda:
𝐻 =𝐿
𝑁
Entonces para cada flujo seria así:
TABLA N°8: RESUMEN DE CALCULO DE ALTURA DE PLATOS TEORICOS
POR CADA FLUJO FASE MOVIL
FLUJO FASE MOVIL (mL/min) ALTURA PLATOS TEORICOS
0,8 H =
25 𝑐𝑚
640,68 = 0,0390 cm
1,0 H =
25 𝑐𝑚
593,15 = 0,0421 cm
1,2 H =
25 𝑐𝑚
263,11 = 0,0950 cm
DETERMINACIÓN DE LA RESOLUCIÓN (Rs)
Para obtener la resolución se ocuparon los datos de la Tabla N°3 y la siguiente
ecuación:
𝑅𝑠 = 2 (𝑇𝑟(𝑇𝑒𝑜𝑓𝑖𝑙𝑖𝑛𝑎) – 𝑇𝑟(𝑇𝑒𝑜𝑏𝑟𝑜𝑚𝑖𝑛𝑎))
𝑊(𝑇𝑒𝑜𝑏𝑟𝑜𝑚𝑖𝑛𝑎) – 𝑊(𝑇𝑒𝑜𝑓𝑖𝑙𝑖𝑛𝑎)
Tr: Tiempo de retención; W= ancho de pico
Entonces para flujo 0,8 mL/min
𝑅𝑠 = 2 (8,608 − 6,292)𝑚𝑖𝑛
(1,31 + 1,14)𝑚𝑖𝑛= 1,891
Para flujo 1,0 mL/min
𝑅𝑠 = 2 (7,392 − 5,275)𝑚𝑖𝑛
(1,23 + 0,99)𝑚𝑖𝑛= 1,907
Y, para el flujo 1,2 mL/min
𝑅𝑠 =2 (5,792 −4,300)𝑚𝑖𝑛
(1,13+1,35)𝑚𝑖𝑛= 1,203
TABLA N°9: RESOLUCIONES CALCULADAS A 0,8; 1,0 Y 1,2 mL/min
FLUJO FASE MOVIL
(mL/min)
RESOLUCIÓN
(Rs)
0,8 1,891
1,0 1,907
1,2 1,203
DETERMINACIÓN DE LA SELECTIVIDAD (α)
Para calcular la selectividad de cada flujo se necesita aplicar la siguiente ecuación:
𝛼 =𝑇𝑟(𝑇𝑒𝑜𝑓𝑖𝑙𝑖𝑛𝑎) − 𝑇𝑚
𝑇𝑟(𝑇𝑒𝑜𝑏𝑟𝑜𝑚𝑖𝑛𝑎) − 𝑇𝑚
Tr: Tiempo de retención; Tm: Tiempo muerto
Entonces, para el flujo de 0,8 mL/min
𝛼 =(8,608 − 1,942)𝑚𝑖𝑛
(6,292 − 1,942)𝑚𝑖𝑛= 1,532
Para el flujo de 1,0 mL/min
𝛼 =(7,392 − 1,592)
(5,275 − 1,592)= 1,575
Y, para el flujo 1,2 mL/min
𝛼 =(5,792 − 1,358)
(4,300 − 1,358)= 1,507
TABLA N°10: RESUMEN DE CALCULO DE SELECTIVIDAD (α)
FLUJO FASE MOVIL
(mL/min)
SELECTIVIDAD
(α)
0,8 1,532
1,0 1,575
1,2 1,507
DISCUSION
En el presente practico utilizamos la técnica de cromatografía liquida de alta
resolución (HPLC), con el cual determinamos la concentración de una muestra
problema que contenía teofilina utilizando como patrón interno teobromina (10 ppm).
Para determinar la concentración de la muestra problema utilizamos una curva de
calibración con el cual preparamos soluciones con diferentes concentraciones de
teofilina y el patrón interno (teobromina) obteniendo a través de la gráfica
Aanalito/Apatron interno vs concentración del analito. La ecuación de la recta en la cual
obtuvimos el siguiente valor Y =0,2449x- 0,2871, donde “y” corresponde al valor del
área del analito de la muestra problema obtenido. Y “x” corresponde al valor de la
concentración del analito. Al despejar la x de la ecuación de la recta se obtuvo la
concentración del analito correspondiente a 18,82 ppm. El coeficiente de regresión
dio un valor lejano al ideal (R2= 0,9681), puesto que el punto N°2 correspondiente a
1,641 - 10 ppm (y,x), se desvía hacía la parte inferior del gráfico, por lo tanto el
cálculo de la concentración del analito en la muestra problema estará afectada por
algún tipo de error, lo más probable que por parte del cromatógrafo no hay mucho
error porque es manejado, entonces el error se debe con mayor certeza de una falla
humana de manipulación, ya que el cromatógrafo de alta resolución es un
instrumento extremadamente sensible se necesita una prolijidad ya sea para
maniobrar la bomba presión, la cual se encarga de introducir el soluto a presión para
una óptima separación, y por la intensidad de corriente que debe haber durante el
proceso de análisis ya que no debe hacer baja de voltaje porque el cromatógrafo es
muy costoso y también para que su análisis sea confiable.
En cuanto a la Influencia del flujo de la fase móvil podemos decir que a medida que
se aumente el flujo de la fase móvil el tiempo de retención y el área de la teofilina y
de la teobromina disminuyen, estando en una relación inversamente proporcional
entre el flujo y el área y/o el tiempo de retención (1).
En cuanto a la resolución medida a un flujo de 1mL/min que dio 1,907 comparado
con la resolución a un flujo de 1,2mL/min que dio 1,203 se evidencia claramente
que el aumento de flujo afecta la resolución pero no baja del valor aceptable que
1,0.(2).
Cada plato teórico representa un equilibrio teórico de distribución del soluto entre
las fases. El número total de platos teóricos de una columna representa el poder de
separación de la columna. Una buena columna tiene un número alto de platos
teóricos(3). En este practico se midieron los platos a 3 flujos los cuales dieron, para
un flujo de 0,8mL/min =640,68; para un flujo de 1,0mL/min = 593,15 y para un flujo
de 1,2mL/min = 263,11. Entonces en un flujo de 0,8mL/min los platos fueron
mayores contra los medidos para los otros flujos, cabe destacar que en la medición
de 1,0mL/min se produjo un error anteriormente señalado, el cual pudo haber
incidido en los cálculos de platos.
Por último se calcularon las selectividades a 0,8mL/min; 1,0mL/min y 1,2mL/min,
siendo 1,532; 1,575 y 1,507 respectivamente. Como La selectividad se refiere a la
capacidad del método para distinguir las propiedades de los componentes a nivel
molecular y que permite diferenciarlos, por eso que su selectividad son muy
parecidas porque solo medimos una mezcla de Teobromina y Teofilina las cuales
tienen igual formula molecular y solo difieren en su conformación.
CONCLUSION
Se obtuvieron resultados muy fiables, por lo que podemos decir que la
concentración de la muestra problema es de 18,82ppm de Teofilina y se obtuvo al
interpolar la señal que dio el cromatógrafo en la ecuación de la recta que dio la curva
de calibración.
Con los datos obtenidos por el análisis se pudo calcular: promedio platos teóricos
para cada flujo, altura de platos para cada flujo, resolución para cada flujo y
selectividad.
En conclusión aprendió todo el manejo para poder operar un cromatógrafo de alta
resolución ya que es una herramienta fundamental En la actualidad, ya que ha
alcanzado tal nivel de fineza y especialización que cada uno de sus tipos constituyen
herramientas imprescindibles en las áreas de la ciencia y la tecnología, en la
industria química, farmacéutica, cosmética, en estudios ambientales, en la clínica,
en alimentos, etc(4).
Buen laboratorio
BIBLIOGRAFIA
(1)Willard, HH., Instrumental Methods of Analysis, Wadsworth, Inc., U.S.A., 1988.
(2) Karger B.L., Snyder L.R. and Horvath C., An introduction to separation science.
John Wiley and Sons, Canada, 1973.
(3) Howard G.A. and Martin A.J.P., The separation of the C12C18 fatty acids by
reversedphase partition chromatography, Biochem J, 1950, 46:532538.
(4) Gooding K. and Regnier F., HPLC of Biological Macromolecules, Vol 51,
Chromatographic Science Series, Marcel Dekker Inc., USA, 1990