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Research Collection
Doctoral Thesis
Synthèse biologique de l'acide hippurique
Author(s): Nielsen, Hjalmar Gaston
Publication Date: 1953
Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-000115989
Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted
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ETH Library
Synthèse biologique de l'acide hippurique
et
Phosphorylation biologique de la thiamine
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Thèse No 2014
Synthèse biologique de l'acide hippuriqueet
Plws|ilion lalion biologique de la thiamine
THÈSE
présentée à l'Ecole Polytechnique Fédérale, Zurich
pour l'obtention
du grade de Docteur es Sciences techniques
par
Hjalmar Gaston MKI SKN
de nationalité danoise
Ing.-chimiste E. P. F.
Rapporteur : Prof. Dr V. Prelog
Corapporteur : Prof. Dr L. Ruzicka
1953
Imprimerie Ganguin et Laubscher S. A. — Montreux
Que Monsieur le Docteur Fr. Leuthardt, Professeur de
Chimie physiologique à l'Université de Zurich, veuille trouver
ici l'expression de ma vive reconnaissance pour les conseils
éclairés et l'extrême bienveillance qu'il a bien voulu me pro¬
diguer tout au long de l'exécution de ce travail.
En témoignage de profonde reconnaissance et de respec¬
tueuse affection.
A Monsieur le Docteur L. Ruzicka, Professeur et directeur
de la Faculté de Chimie de l'Ecole Polytechnique Fédérale de
Zurich, qui a eu l'amabilité d'être le coréférent et membre du
jury de cette thèse, j'exprime mes hommages reconnaissants.
A Monsieur le Docteur V. Prelog, Professeur à la Faculté
de Chimie organique de l'Ecole Polytechnique Fédérale de
Zurich, qui a bien voulu accepter d'être le réfèrent et membre
du jury de la présente thèse, j'exprime mes remerciements et
mes hommages reconnaissants.
A la mémoire de mon Père
A ma Mère et à ma chère Edith
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INTRODUCTION
Les fonctions chimiques de la cellule ne sont compréhensibles quesi l'on admet que les différents processus chimiques sont liés à la structure
microscopique ou ultramicroscopique de la cellule. Depuis les travaux
classiques de Friedrich Miescher *sur la chimie du noyau cellulaire, on
a essayé de localiser dans les différentes parties de la cellule, certains
constituants ou ferments. Récemment on a isolé, par centrifugationsfractionnées et par d'autres méthodes appliquées à des tissus homogé¬néisés, des constituants morphologiquement bien définis de la cellide
(noyaux cellulaires, granules cytoplasmiques) et on les a obtenus assez
purs en grande quantité. De cette façon il a été possible d'analyser ces
constituants cellulaires et en particulier d'étudier leurs systèmes enzy-
matiques.Au cours des deux dernières années, nous avons entrepris dans notre
laboratoire diverses recherches sur la fonction des granules cytoplas¬miques (mitochondries) du foie. Ce travail fournit également une contri¬
bution à l'étude des systèmes enzymatiques dans la cellule hépatique.La première partie de ce travail traite de la synthèse de l'acide
hippurique. Nous démontrons que les mitochondries sont le siège de
cette réaction. Dans la seconde partie, nous décrivons un nouveau
ferment, une transphosphorylase, qui se trouve dans les fractions solubles
de la cellule et dont l'action consiste à transporter le pyrophosphate de
l'acide adénosine triphosphorique (ATP) sur la thiamine.
9
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PREMIERE PARTIE
SYNTHESE BIOLOGIQUE DE L'ACIDE HIPPURIQUE
/. Généralités
Nous nous sommes proposés d'étudier la synthèse de l'acide hippu¬rique en utilisant comme système enzymatique le foie de cobaye homo¬
généisé. Cet homogénat nous le fractionnons par des centrifugationssuccessives à 0° C. en nous basant sur les travaux de Hogeboom et coll. 2
el de Leuthardt et coll. 3. Nous avons ensuite cherché à localiser la
synthèse dans une des fractions. Dans un chapitre suivant, nous étudierons
la provenance de la glycine en la remplaçant par des peptides et par
d'autres acides aminés.
a) Les fonctions chimiques des mitochondries du foie.
Comme nous allons le montrer, la synthèse de l'acide hippuriqueest localisée dans les mitochondries. Ces dernières jouent aussi un rôle
dans la formation de la cocarboxylase, car elles sont le siège de la phos-phorylation oxydative de l'acide adénylique et fournissent ainsi l'ATP
nécessaire à la phosphorylation de la thiamine. Nous donnons, par
conséquent, d'abord quelques détails sur la fonction des granulescytoplasmiques.
Par centrifugation du foie homogénéisé on obtient facilement deux
fractions de particules : 1. un sédiment constitué par des granules visibles
au microscope (diamètre environ 0,5 - 3 ,m), « large granules » des auteurs
anglo-saxons, qui contient essentiellement les mitochondries de la cellule
hépatique ; 2. un surnageant à partir duquel on obtient par centrifu¬
gation prolongée, à grande vitesse de rotation (24.000-100.000 g), des
particules ultramicroscopiques désignées par Claudei comme « micro-
somes » (Claude 4, Sternh, Chantrenne6, Brachet1). D'après les recher-
U
ches de Brachet et de ses élèves cette fraction contiendrait la plus grandepartie de l'acide ribonucléique de la cellule.
L'analyse des différentes fractions de granules a montré que ces
dernières ne sont pas seulement une accumulation de différentes subs¬
tances représentant un matériel de réserve, mais qu'elles constituent de
vrais organes chimiques, contenant des systèmes enzymatiques importantsde la cellule. Ainsi se confirme l'hypothèse émise, il y a soixante-cinq ans
déjà, par R. Altmann 8, qui a considéré les granules cytoplasmiques dé¬
couvertes par lui, comme les organes du métabolisme cellulaire.
Dans nos recherches ce sont les mitochondries qui nous ont parti¬culièrement intéressés (morphologie voir Hertwig9). Hogeboom et ses
collaborateurs 10 furent les premiers à établir une méthode permettantd'obtenir des suspensions de mitochondries intactes gardant leurs carac¬
tères morphologiques. Ces auteurs se sont appuyés sur les anciennes
observations de Guillermond n sur le chondriome des cellules végétales,et ont utilisé une solution hypertonique de saccharose comme liquide de
suspension. Dans des solutions d'électrolytes, les mitochondries s'altèrent
et s'agglutinent. Dans ces conditions il est impossible de les séparer des
autres constituants du tissu. Dans nos recherches sur la formation de la
citrulline, la détermination colorimétrique en présence de saccharose n'a
pas pu être faite. De ce fait nous avons remplacé le saccharose par la
mannite. En outre la mannite n'est pas attaquée par les ferments des
mitochondries, ce qui évite une complication des processus enzymatiquesétudiés.
0. Warburg (1913) 12 semble être le premier à avoir démontré
expérimentalement la participation des granules cytoplasmiques du foie
à la respiration cellulaire. Il trouva qu'une suspension de granules pré¬parées à partir du foie de cobaye absorbe de l'oxygène. Des travaux
récents confirment en effet que les granules cytoplasmiques sont le siègeprincipal de la respiration cellulaire. Schneider et coll. 13
ont montré
que la succinodéhydrase se trouve exclusivement localisée dans les mito¬
chondries des cellules hépatiques. Des recherches ultérieures ont révélé
que les granules cytoplasmiques contiennent la totalité des enzymes du
cycle des acides tricarboxyliques et qu'elles sont aussi le siège de l'oxy¬dation des acides gras (Mùller et Leuthardt u, Leuthardt et Mauron 15,Kennedy et Lehninger 16). La figure 1 montre l'oxydation du pyruvateet de divers produits intermédiaires du cycle tricarboxylique au moyend'une suspension de mitochondries.
L'oxydation du pyruvate et des différents acides carboniques inter¬
médiaires représente la source d'énergie la plus importante pour la
phosphorylation oxydative dans la cellule hépatique. Les mitochondries,en fournissant continuellement l'ATP, jouent donc un rôle dans tous les
processus de la vie cellulaire utilisant des liaisons phosphatées riches en
énergie (« energy rich phosphate bonds » selon Lipmann 1?). Le rôle que
jouent les mitochondries dans les réactions dépendant de l'ATP se montre
12
d"une façon très nette au cours de la purification de certains enzymes
solubles. Si l'on travaille avec du tissu homogénéisé ou des extraits non
purifiés, on trouve que les mitochondries sont indispensables. Dans
l'extrait brut, l'ATP est continuellement hydrolyse par l'action de l'adé-
nosine triphosphatase (ATP-ase). Dans ces conditions il faut, pour
maintenir un taux suffisant en ATP. le système phosphorylant des
mitochondries. Une fois que le système enzymatique a été séparé de
l'ATP-ase, l'ATP ajouté n'est utilisé que par le système étudié ; il y a
une réaction stoechiométrique entre l'ATP et les substances en question.Un exemple du cas précité sera décrit dans ce travail ; un autre est donné
par la synthèse de la glutamine (Frei et Leuthardt 18, Speck 19).
b) Rôle de la formation de l'acide hippurique.
La synthèse de l'acide hippurique à partir de glycocolle et de l'acide
benzoïque nécessite la formation d'une liaison peptidique. Or cette
réaction peut être considérée, dans un certain sens, comme modèle de la
synthèse d'une liaison peptidique. On s'est déjà souvent demandé si la
synthèse peptidique dans l'organisme est simplement l'inverse de l'hydro¬lyse et dépend des mêmes peptidases. Les travaux de Bergmann 20
et de
ses élèves parlent en faveur de cette dernière hypothèse. Ces auteurs ont
décrit la formation de peptides à partir de certains acides aminés subs¬
titués (principalement des dérivés carbobenzoxy ou anilides), en présencede protéinases. Cependant les conditions dans lesquelles ces synthèsesfermentatives ont lieu ne peuvent pas être comparées directement aux
conditions physiologiques. Il ne s'agit pas de substances naturelles. La
formation des produits finaux est favorisée par leur faible solubilité.
Il est possible que, dans certains cas particuliers, des peptides puissentainsi être synthétisés dans les cellules vivantes. Dans la règle, la synthèsedes peptides à partir des acides aminés étant un processus exergonique,l'état d'équilibre serait déjà atteint après la formation de très petitesquantités de peptides. La synthèse peptidique doit donc être liée à un
processus exergonique et pour autant qu'on le sache aujourd'hui, elle
nécessite la présence de l'ATP. La synthèse de l'acide hippurique en est
un exemple. On connaît un ferment, l'hippuricase (ou histozyme) quihydrolise l'acide hippurique. La synthèse à partir du glycocolle et de
l'acide benzoïque se fait cependant par un système enzymatique pluscomplexe.
Au point de vue physiologique, la synthèse de l'acide hippuriqueappartient aux réactions désignées sous le nom de réactions de désintoxi¬
cation ou de détoxication. On groupe sous ce terme toutes les réactions
dans lesquelles interviennent des susbtances étrangères à l'organisme(Williams21). Le terme de désintoxication est inexact. Les produitsformés ne sont pas toujours moins toxiques que les produits initiaux.
13
Ils peuvent même l'être davantage. Souvent les produits introduits dans
l'organisme sont transformés en dérivés plus solubles (formation d'acides
glucuroniques conjugés ou de sulfates conjugés).Le couplage de l'acide benzoïque avec le glycocolle pour former de
l'acide hippurique, qui sert chez les herbivores à l'élimination des grandesquantités d'acide benzoïque formé dans l'intestin, est un des processusde désintoxication les plus répandus. On connaît d'autres réactions
similaires. C'est ainsi que dans l'organisme du lapin l'acide pyridine-a-carboxylique se couple avec le glycocolle pour donner de l'acide a-pyridin-urique. Les dérivés phénylés des acides gras subissent d'abord une
/î-oxydation et se transforment finalement en acide benzoïque ou phényl-acétique (Knoop 22).
Chez l'homme, le lapin, la chèvre et le porc, l'acide benzoïqueadministré se combine en majeure partie avec le glycocolle et s'élimine
sous forme d'acide hippurique. Le chien élimine environ 80 % de l'acide
benzoïque administré comme acide libre. Comme l'acide benzoïque,l'acide phénylacétique est en général couplé à la glycine et s'élimine
sous forme d'acide phénacétique. Chez l'homme ainsi que chez le chim¬
panzé, l'acide phénylacétique se combine avec la glutamine pour former
la N-phénacétyl-glutamine (Thierfelder et Sherwiti23). Chez les oiseaux
c'est l'ornithine qui remplace le glycocolle pour former de la dibenzoyl-ornithine. Des essais in vivo ont montré que par administration de fortesdoses d'acide benzoïque il y a plus de glycocolle excrété (sous forme
d'acide hippurique) qu'il n'y en a à disposition dans les protéines. C'étaitla première preuve directe de la synthèse d'un acide aminé dans l'orga¬nisme animal. L'excès de glycocolle doit provenir d'autres sources, car
cet acide aminé ne se trouve pas élaboré dans l'organisme en quantitéssuffisantes. Chez le chien, la formation de l'acide hippurique a lieu dansle rein, l'animal néphrectomisé est incapable de le synthétiser 2i. Chezle rat, le cobaye et le lapin, la synthèse se fait également dans le foie,qui en général est le siège principal des réactions de désintoxication.L'acide hippurique est un constituant normal des urines. Il se trouve
en petite quantité chez l'homme, en quantité plus élevée chez les herbi¬
vores, dont le régime contient des corps générateurs d'acide benzoïque.
c) Synthèse de l'acide hippurique.
En incubant des coupes de rein ou de foie de cobaye, de lapin ou
de rat, dans une solution appropriée contenant de l'acide benzoïque,Borsook et Dubnoff25 ont observé une formation d'acide hippurique.Ces auteurs ont établi que la synthèse est accompagnée d'une augmen¬tation de l'énergie libre. Ils trouvent pour la réaction : benzoate (aq) +
glycine (aq) = hippurate (aq), la valeur de A F = + 2670 Cal. à 38° C.Cela veut dire que la synthèse ne représente pas simplement l'inverse
14
de l'hydrolyse. Cette dernière peut se faire spontanément par l'hippu-ricase mais la synthèse doit être liée à une réaction libérant de l'énergie.D'après les observations de Borsook et Dubnoff23 cette énergie doit
provenir d'une oxydation car la synthèse est inhibée par une solution de
KCN, 0,001 M. Avec la méthode des coupes, il n'a pas été possible de
pousser plus loin l'étude des différentes étapes de la synthèse enzyma-
tique. Cette dernière est limitée par la perméabilité des surfaces cellu¬laires. L'étude approfondie des facteurs influençant la synthèse, ne
pouvait se faire qu'en utilisant des homogénats de tissus. Borsook et
Dubnoff 26 furent les premiers à obtenir une formation d'acide hippuriqueà partir de benzoate et de glycine en utilisant un homogénat de foie de
cobaye, préparé d'après la méthode de Potter et Elvehjem 27. L'additionà leur milieu d'incubation de cétoglutarate et d'acide adénylique avait
pour effet de doubler la quantité d'acide hippurique synthétisé. Cohenet Me Gilvery28 étudièrent la synthèse de l'acide p-amino-hippuriquedans des homogénats de foie de rat. Ces auteurs ont établi que la synthèsedépend de l'acide adénosine-triphosphorique. En fractionnant l'homo-
génat de foie de rat par centrifugation, ils purent démontrer que la
synthèse de l'acide p-amino-hippurique était liée aux particules insolublesde la cellule hépatique.
d) Formation de la glycine.
La glycine nécessaire à la synthèse de l'acide hippurique peut être
formée à partir d'autres acides aminés. Leuthardt 29 ainsi que Borsook
et Dubnoff 2oont obtenu en présence de coupes de foie de cobaye une
synthèse considérable d'acide hippurique en remplaçant la glycine parla I-glutamine, la d, I-sérine, la l-proline, l'oxyproline, l'acide aspartiqueet l'acide glutamique. Shemin 30, confirmant les résultats de Leuthardt
et Glasson sl, prouva par la suite à l'aide de la 1-sérine marquée (N15 dans
le groupe aminé et C13 dans le groupe carboxylique) que cet acide aminé
est transformé en glycine par la scission entre les atomes a et /5 de la
chaîne carbonée. La réaction est réversible. Sakami :i2 ainsi que Siekevitz
et Greenberg 83ont prouvé la synthèse de la 1-sérine à partir du glycocolle
et du formiate marqué. Sakami s~a également trouvé que l'atome en
position /? de la serine peut être fourni par les groupes méthyl de la
choline. Selon Siekevitz et Greenberg 33 l'atome en position a de la-
glycine fournit du formiate qui se condense avec une seconde molécule
de glycine pour donner de la serine. La synthèse de la serine à partirde la glycine est également prouvée par les constatations de Winnick
el coll. 34montrant que la radioactivité de la glycine marquée (C14) se
retrouve surtout dans la serine des protéines. Récemment Braunstein et
coll. 35 publièrent un travail sur la synthèse enzymatique de la glycineen utilisant des coupes de tissus de différentes espèces d'animaux. Ils
15
trouvèrent qu'en présence de coupes de foie de rat ou de cobaye, dans
la synthèse de l'acide hippurique, la glycine pouvait être remplacée par
la thréonine. Par des expériences in vivo, Abbott et Lewis 36ont trouvé
que la sarcosine (mais non la N, N-diméthylglycine ou la bétaïne) aug¬
mente également la quantité d'acide hippurique excrétée chez le lapin.En faisant ingérer de la sarcosine marquée (N15 du groupe aminé) Bloch
et Schœnheimer 3?ont confirmé les résultats d'Abbott et Lewis 36.
//. Partie expérimentale
a) Matériel.
Animaux : Nous avons utilisé des rats albinos adultes de 150-200 gr.
ainsi que des cobayes de 200-300 gr. Les animaux avaient reçu une
nourriture optimale et furent mis à jeun environ 36 à 40 heures avant
l'expérience.Substrats : Le benzoate de Na ainsi que le fumarate de Na sont
des produits commerciaux recristallisés. La glycine, l'acide glutamique,la thréonine, la sarcosine, la leucyl-glycyl-glycine, la leucyl-glycine, le
glutathion sont des produits Hoffmann - La Roche. L'acide /3-oxygluta-mique fut préparé selon la méthode de Harington et Randall 38. L'acide
adénosine-triphosphorique (ATP) est préparé selon les méthodes combi¬
nées de Needman, Kerr et Le Page 39. Le cytochrome C est préparé à
partir de cœur de cheval selon la méthode de Keilin et Hartree 40, et
gardé en solution. Une partie de ce produit nous a été fourni par la
Robapharm, Bâle.
Toutes les solutions sont préparées avec de l'eau bidistillée et leur
pH ajusté à 7,5. L'isotonicité du milieu est atteinte au moyen d'un tampon
phosphate de K et de pH 7,5.
b) Préparation des suspensions enzymatiques.
Toute la préparation des différentes fractions s'effectue à 0° C. et
à l'aide d'un centrifugeur à froid. Après la mort de l'animal, le foie est
immédiatement mis dans la glace. L'homogénéisation du tissu s'effectue
pendant au moins 45 secondes dans l'appareil de Potter et Elvehjem 27,contenant du KCl isotonique comme milieu de suspension. L'homogénatainsi obtenu est filtré à travers deux couches de gaze. La préparationdes différentes fractions s'effectue selon le schéma I.
16
SCHEMA I
10 ce. Homogénat de foie de 20
au KCl isotonique
centrifugé pendant 15 min. (3500 X g)
y
Résidu
r
Surnageant
+ 3 ec. mannite isot.
centrifugé pendant10 min. (3500 X g)
chauffé pendant 5 min.
au bain-marie à 100° C.
centrifugé pendant 10 min.
i
Y
Surnageant
Y
Résidu
J- 2 ce. mannite
isot. centrifugé7 min. (3500 X g)
Y Y
Résidu Surnageant
« Kochsaft »
Y
Surnageant
Y
Résidu
- 2,5 ce. mannite isot.
centrifugé pendant1 min. (3500 X g)
Y
Surnageant
Suspension de
mitochondries
Y
Résidu
(Noyaux, débris cellulaires)=
« Culot »
10 ce. d'un homogénat de foie de cobaye à 20 % sont centrifugéspendant 15 minutes à 4600 t. m. (3500 X g). Le surnageant est décanté
et gardé pour la préparation soit du jus bouilli (« Kochsaft »), soit d'un
surnageant dialyse. Le foie de cobaye contient une substance de coloration
verte, de densité un peu inférieure aux mitochondries. De ce fait nous
trouvons après la première centrifugation comme couche supérieure du
résidu, un anneau vert dont l'épaisseur et l'intensité de coloration varient
d'un homogénat à l'autre. Cet anneau est éloigné au moyen d'une pipette,car cette couche contient des corps inhibiteurs de la réaction étudiée. Il
est dans bien des cas impossible, même avec plusieurs lavages à la mannite
isotonique, d'éloigner complètement ce corps et la suspension de mito¬
chondries ainsi obtenue reste verdâtre. Pour notre synthèse une telle
suspension de mitochondries est peu active, dans certains cas même
11
totalement inactive. La nature du corps inhibiteur est inconnue. Il semble
qu'il provient de la bile (voir page 33). Il est particulièrement abondant
dans les foies des animaux recevant de l'herbe dans leur nourriture, il
manque en hiver, quand les cobayes sont nourris avec des betteraves, des
carottes et du foin. Peut-être s'agit-il d'un produit de dégradation de la
chlorophylle.Au résidu on ajoute 3 ce. d'une solution de mannite isotonique et
on refait une suspension homogène. Cette dernière est centrifugée pen¬
dant 10 minutes à 4600 t. m. Le surnageant est décanté. La troisième
centrifugation ne dure que 7 à 9 minutes. Une partie des mitochondries
ne se sont pas sédimentées et le surnageant blanc-verdâtre est décanté.
Ce n'est qu'après la quatrième centrifugation que nous obtenons, selon
ce procédé, une suspension de mitochondries presque blanche. Le
contrôle microscopique (microscope à contraste de phase) révèle une
suspension homogène de particules dans laquelle on ne trouve que rare¬
ment un noyau ou une hématie (fig. 2). L'activité des suspensions dépenddu nombre des granules par unité de volume, mais leur dénombrement
direct est très difficile. Dans quelques expériences nous avons comparéla densité optique des suspensions (mesurée à 375 m/u à l'aide du pho¬tomètre de Beckmann) avec leur teneur en azote. Le dosage de la densité
optique pour différentes dilutions de la même suspension, montre que
la densité optique est une fonction linéaire de la concentration de la
suspension, donc du nombre des particules. La figure 3 montre qu'enmoyenne la densité optique est également proportionnelle à la teneur en
azote. Ceci permet d'utiliser l'azote comme mesure approximative du
nombre des particules contenues dans une suspension.
c) Incubation.
Le volume final par essai est de 4 ce. La phase gazeuse est de l'air.
L'incubation s'effectue dans des erlenmeyers d'une capacité de 25 ce.
Ces derniers sont agités pendant 45 minutes à 38° C.
d) Extraction de l'acide hippurique.
Après l'incubation la réaction est arrêtée par l'adjonction de 1 ce.
d'une solution de 10 % d'acide métaphosphorique. Après centrifugationdes protéines on prélève 4 ce. que l'on pipette dans un petit appareild'extraction du type Kutscher-Steudel d'une capacité d'environ 6 ce.
On ajoute 0,2 ce. d'ILiSC^ N. Les tubes d'extraction sont refroidis à l'eau
froide afin d'éviter une hydrolyse. L'extraction dure 5 heures. Le résidu
de l'extrait éthéré est dissout dans 3 ce. d'HCl azéotropique. Le ballon
est muni d'un réfrigérant à reflux et on fait bouillir la solution pendant2 heures. Après hydrolyse l'HCl est complètement éliminé au vide à
100° C. Le résidu sec est dissout dans 10 ce. d'eau distillée. On agite
18
cette solution en présence de 0,5 gr. de permutite de Na pour éloignerl'NHfj. La solution est filtrée et une partie aliquote du filtrat sert à la
détermination de la glycine sous forme de N aminé.
e) Dosage de la glycine.
Méthode I (voir Russel 41). — Dans cette méthode nous avons utilisé
pour le dosage de la glycine le réactif de Folin i2 (coloration orange en
milieu alcalin avec l'acide a-naphto-quinone-sulfonique). Avec chaquesérie de dosage, les extinctions d'une solution test sont déterminées. La
densité optique des solutions est mesurée à l'aide du spectrophotomètrede Beckmann.
En utilisant cette méthode de dosage, il est important de refroidir
les récipients à extraction susmentionnés, dès que les essais contiennent
de l'acide glutamique ou de la glutamine, sinon ces derniers se trans¬
forment en acide a-pyrrolidonecarboxylique (Wilson et Cannan43) quiest extrait en partie et qui après hydrolyse apparaît sous forme d'azote
aminé.
Méthode II. — La méthode I n'est pas spécifique puisqu'elle englobetoutes les substances qui sont extraites par de l'éther et qui par hydrolysedonnent des groupes aminés libres. D'autre part, dans nos recherches,nous travaillons avec des homogénats de tissu et il fallait établir la
formation de glycine à partir d'autres acides aminés. C'est la méthode
de Krueger 44, qui est une modification de celle de Alexander et coll. 45,
que nous avons finalement employée. Cette méthode se base sur le fait
qu'une solution diluée de glycine donne à l'ébullition en présence de
ninhydrine (hydrate de tricétohydrindène) 1 mol. de formaldéhyde parmol. de glycine (Mac Fadyenie). D'après Eegriwe41 l'aldéhyde formiquese condense à 100° C. dans un milieu d'HgSC^ conc. avec de l'acide
chromotropique pour donner une coloration d'un violet intense. Les
détails du procédé sont ceux proposés par Krueger. Le rendement de la
première méthode est de 80 à 90 %, tandis que la seconde méthode nous
permet de retrouver 90 à 97 % de l'acide hippurique ajouté.
///. Résultats et discussion
a) Conditions de synthèse. Dépendance de VATP.
Borsook et Dubnoff 26ont prouvé pour la première fois la possibilité
d'une synthèse de l'acide hippurique dans le tissu homogénéisé (foie de
cobaye) et la nécessité de l'addition de l'ATP. Cohen et Me Gilvery 28
19
ont précisé les conditions de la synthèse en utilisant l'acide p-aminoben-zoïque. Nous prouvons dans ce travail que les mêmes conditions sont
nécessaires pour la synthèse de l'acide hippurique à partir de l'acide
benzoïque et de la glycine, dans le foie de cobaye. En exprimant l'activité
de la synthèse par le rapport : jumol. acide hippurique formé / mgr. N,nous observons que, dans les mêmes conditions d'expérience, une sus¬
pension de mitochondries préparée à partir d'un foie de rat est aussi
active qu'une même suspension préparée à partir d'un foie de cobaye(tableau 1). Le dosage de la glycine a été fait dans ces deux cas selon
TABLEAU 1
Suspension de mitochondries 0,5 ce. Acide benzoïque 0,001 M. ; glycine 0,015 M. ;
acide fumarique 0,0025 M. ; MgS04 0,0026 M. ; KC1 0,04 M. ; ATP 0,0005 M. ;
cytochrome C 0,0000145 M. L'isotonicité est atteinte au moyen d'un tampon phosphatede K de pH 7,5. Volume final 4 ce. Incubation 45 min. à 38° C. Dosage selon la
méthode I.
Essais Conditions fiM.. acide hippuriqueformé
Activité
Rat blanc
benzoate
benzoate + glycine
0,490,543,04
0,22
0,24
1,35
Cobaye blanc
benzoate
benzoate + glycine
1,00
2,034,91
0,420,852.05
la méthode I. Il est à remarquer que les valeurs à blanc sont élevées et
ceci surtout pour les essais contenant des mitochondries de foie de
cobaye. Dans ces essais nous extrayons, avec l'éther, après déprotéini-sation, une substance qui, hydrolysée, libère de l'azote aminé. C'est la
raison pour laquelle nous avons préféré la méthode II décrite plus haut.
La constatation la plus importante concernant la synthèse de l'acide
hippurique, est sa dépendance de l'ATP. Cette synthèse présente un
nouvel exemple d'une réaction endergonique couplée avec la déphospho-rylation de l'ATP. Le tableau 2 montre l'activité des mitochondries en
fonction de la concentration de l'ATP. Les mitochondries ainsi que la
solution surnageante contiennent des ferments hydrolysant l'ATP. Pour
maintenir une concentration suffisante en ATP, il faut ajouter un
substrat oxydable permettant la rephosphorylation oxydative de l'acide
adénylique (Millier et Leuthardt48). Nous avons utilisé le fumarate
comme substrat oxydable.
20
TABLEAU 2
Suspension de mitochondries 0 5 ce. Acide benzoïque 0.001 M. ; glycine 0,015 M. ;
acide fumarique 0,0025 M. ; MgS04 0,0026 M. ; KCl 0,04 M. ; cytochrome C 0,0000145 M.
L'isotonicité est atteinte au moyen d'un tampon phosphate de K de pH 7,5. Volume
final 4 ce. Incubation 30 min. à 38° C.
«M. ATP par essaifiM. acide hippurique
formé
0,150
0.5 0.20
1.0 0,40
3,0 1,10
6,0 3,05
b) Localisation de la synthèse.
Pour obtenir la synthèse de l'acide p-amino-hippurique, Cohen et
Me Gilvery28 avaient travaillé avec des homogénats lavés et avaient
trouvé que cette synthèse était liée aux particules insolubles de l'homo¬
génat. En étudiant la synthèse de l'acide hippurique, à partir de benzoate
et de glycine, dans les différentes fractions résultants des centrifugationsde l'homogénat, nous constatons que le système de synthèse se trouve
localisé dans les mitochondries, ceci aussi bien pour des mitochondries
préparées à partir d'un foie de rat que d'un foie de cobaye (tableau 3).
TABLEAU 3
Système enzymatique 0,5 ce. Acide benzoïque 0,001 M. ; glycine 0,015 M. ; acide
fumarique 0,0025 M. ; MgS04 0,0026 M. ; KCl 0,04 M. ; ATP 0,0005 M. ; cytochrome C
0,0000145 M. L'isotonicité est atteinte au moyen d'un tampon phosphate de K de pH 7,5.
Volume final 4 ce. Incubation 45 min. à 38° C. Hc = homogénat complet ; M =
mitochondries ; S = surnageant ; C = culot.
Additions
«M. acide hippuriqueformé
Activité
Cobaye Rat Cobaye Rat
Hc
Hc +- ac. benzoïqueHc 4 ac. benzoïque + glycine
M
M + ac. benzoïqueM 4- ac. benzoïque + glycine
S
S 4 ac. benzoïqueS 4- ac. benzoïque 4- glycine
C 4- ac. benzoïque + glycine
0,112
0,760
2,55
0,083
0,304
3,94
0,112
0,158
0,179
0,340
0,028
0,1331,25
0,0540,092
2,06
0,1790.108
0,195
0,230
0,730
2,220
0,068
0,645
0,358
0,566
0,072
0,155
21
La faible activité retenue dans le surnageant et le culot est due, dans
ces deux fractions, à la présence d'un reste de mitochondries.
Il est possible de déterminer approximativement la quantité de
mitochondries dans les différentes fractions en déterminant l'activité de
la succinodéhydrase (méthode de van Potter*9). Selon Schneider et
coll. lscet enzyme se trouve uniquement dans les mitochondries. Or
l'activité des différentes fractions est proportionnelle à leur teneur en
mitochondries. Par cette méthode nous avons trouvé qu'une certaine
quantité de mitochondries (ou débris de mitochondries) reste, après le
fractionnement par centrifugation, dans le liquide surnageant.En considérant l'activité de la synthèse, nous constatons qu'elle est
plus élevée dans les essais contenant les mitochondries que dans les
essais contenant de l'homogénat complet. Par contre, dans les essais quine contiennent comme substrat que du benzoate, la synthèse d'acide
hippurique est plus forte avec de l'homogénat complet qu'avec les mito¬
chondries. Le surnageant contient donc des substances qui, avec le
benzoate, donnent de l'acide hippurique. En prenant comme systèmeenzymatique les fractions suivantes : mitochondries seules, mitochon¬
dries + surnageant, mitochondries + Kochsaft, et comme substrat du
benzoate seul, nous avons constaté que la synthèse de l'acide hippurique
TABLEAU 4
Système enzymatique 0,5 ce. Acide benzoïque 0,001 M. ; glycine 0,015 M. ; acide
iumarique 0,0025 M. ; MgS04 0,0026 M. ; KC1 0,04 M. ; ATP 0,0005 M. ; cytochrome C
0,0000145 M. L'isotonicité est atteinte au moyen d'un tampon phosphate de K de
pH 7,5. Volume final 4 ce. Incubation 45 et 90 min. à 38° C. M = mitochondries ;
S = surnageant ; K = Kochsaft.
M S K
+
+
+
Benzoate Glycine /uM.acide hippurique
Activité
Incubation45
min.r
+
+
+
+
+
+
+
+
-h
+
+
+
+
+ +
0,2790,312
0,0090,387
0,413
0,0130,780
1,610
0,2213,200
0,179
0,243
0,198
0,212
0,840
0,091
2,010
Incubation 90min.+
+
+
+
+
—
+
+
+
+ -L-
0,8052,64
0,155
3,18
0,433
0,722
0,008
1,710
22
est plus importante dans les essais contenant en plus des mitochondries,le surnageant ou le Kochsaft. Ces deux dernières fractions contiennent
un précurseur thermostable de la glycine. La vitesse de synthèse à partirde ce précurseur est plus lente qu'à partir de la glycine (tableau 4). Enoutre la quantité d'acide hippurique formée à partir de ce précurseurvarie d'un animal à l'autre et peut atteindre après 90 minutes d'incu¬
bation des valeurs considérables.
c) Effet des fractions dialysées.
Nous avons dialyse à 0° C. 12 ce. de surnageant pendant 15 heures
contre 80 ce. d'eau distillée. Le volume du dialysat (solution extérieure)est réduit au vide, à 30° C. à 3 ce. La solution reste claire et il n'y a pasde précipitation. Simultanément 12 ce. du même surnageant sont gardésà la même température pendant le même temps. 13 ce. de surnageantsont chauffés au bain-marie bouillant pendant 5 minutes et centrifugés.Le surnageant ou Kochsaft est également dialyse pendant 15 heures
contre 15 ce. d'eau distillée. Le dialysat est réduit au vide à 3 ce. En
étudiant la synthèse de l'acide hippurique à partir de benzoate et du
précurseur en présence des fractions susmentionnées, nous constatons
que le surnageant dialyse perd son activité. Cette dernière peut être
restaurée en ajoutant le dialysat concentré aussi bien du surnageant quedu « Kochsaft » (tableau 5).
TABLEAU 5
Système enzymatique 0,5 ce. Acide benzoïque 0,001 M. ; glycine 0.015 M. ; acide
fumarique 0,0025 M. ; MgS04 0,0026 M. ; KC1 0,04 M. ; ATP 0,0005 M. ; cytochrome C
0,0000145 M. L'isotonicité est atteinte au moyen d'un tampon phosphate de K de
pH 7,5. Volume final 4 ce. Incubation 45 min. à 38° C. M = mitochondries ; S = sur¬
nageant gardé pendant 15 heures à 0° C. ; Sd = surnageant dialyse ; Ds = dialysatdu surnageant ; Kd = Kochsaft dialyse ; DK = dialysat du Kochsaft.
S Sd Ds
—
"T
—
+ ——
_
+ — — -;—— +
+ — — — i — + +
+ _ _ _
I__ _ +
Kd DK Benzoate Glycineac. hippurique
Activité
0,4100,730
1,59
1,90
3,55
0,229
0,2020,406
0,8602,04
0,300
0,725
1,43
3,48
0.130
0,290
0,5401.52
23
d) Peptides, précurseurs de la glycine.
Les résultats susmentionnés nous ont laissé supposer que le pré¬curseur pourrait être un acide aminé ou un peptide à poids moléculaire
peu élevé, tel que le glutathion. En effet en remplaçant la glycine par
certains di- ou tripeptides contenant dans leur molécule de la glycine,nous constatons que la synthèse de l'acide hippurique a lieu, et ceci aussi
bien avec l'homogénat complet qu'avec les mitochondries. Donc les deux
fractions contiennent les peptidases nécessaires à l'hydrolyse des pep¬
tides utilisés. En ayant comme système enzymatique une suspension de
mitochondries, la synthèse à partir de la 1-leucyl-glycyl-glycine, de la
« £0 SO W> SO 60 70 80 90 Jfltn-
FIGURE 1
Oxydation de divers acides intermédiaires du cycle tricarboxylique, au moyen
d'une suspension de mitochondries. Suspension de mitochondries 0,33 ce. (1,25 mgr. N) ;
substrats 0,0083 M. ; ATP 0,001 M. ; MgS04 0,0033 M. ; tampon phosphate 0,0066 M.
de pH 7,4. L'isotonicité est atteinte au moyen d'une solution de KCl 0,5 M. Volume
final 3 ce. Incubation à 38° C.
24
FIGURE 2o
Groupe de cellules hépatiques montrant les granules plasmatiques
(photographie au microscope à contraste de phases).
*#ÉF-* .4P tji7*C
>^2
S^-ff-*'
FIGURE 2 6
Suspension de mitochondries. Fixation à l'acide osmique.Coloration selon Altmann.
25
If-
¥
"f
1 2 3 4 î 6 Kfrjf'
FIGURE 3
Proportionnalité entre la densité optique et la teneur en azote de différentes
suspensions de mitochondries.
• Suspension de mitochondries préparées à partir d'un foie homogénéisé dans
du KC1 isotonique. Homogénat de foie de 10 %.+ Suspension de mitochondries préparées à partir d'un homogénat de foie au
KC1 isotonique. Homogénat de foie de 20 %.Q Suspension de mitochondries prépaiées à partir d'un foie homogénéisé dans
de la mannite isotonique. Homogénat de foie de 20 %.
glycyl-glycyl-leucine ou du glutathion est plus lente qu'à partir de la
glycyl-l-leucine. L'addition du surnageant ou du surnageant dialyse (doncne contenant plus le précurseur), à la suspension de mitochondries,accélère de beaucoup la synthèse à partir du tripeptide (tableau 6). Mais
comme nous l'avons indiqué 50, il semble que les dipeptidases et tripep-tidases sont différemment réparties entre les fractions protéiques solubles
de la cellule et les mitochondries. Un phénomène analogue a été observé
par P. J. Fodor, V. E. Price et J. P. Greenstein 51. La question se pose
de savoir si la synthèse de l'acide hippurique à partir des peptides,contenant de la glycine en position terminale, pourrait se faire en absence
de l'ATP, par le passage de la glycine d'un groupe acyl à un autre (réac¬tion analogue à la transphosphorylation). Le tableau 7 montre que tel
n'est pas le cas. La synthèse à partir des peptides en absence d'ATP
est aussi faible qu'à partir de la glycine libre. On peut en conclure que
la glycine est libérée avant d'être incorporée à l'acide hippurique.
e) Analyse chromatographique du dialysat, du surnageant et
du « Kochsaft ».
Nous avons essayé d'identifier la nature du précurseur par chroma-
tographie sur papier filtre (Consden, Gordon et Martin52, Dent53),
26
TABLEAU 6
Système enzymatique 0,5 ce. Acide benzoïque 0,001 M. ; di- ou tripeptides 0.015 M. ;
acide fumarique 0,0025 M. ; MgS04 0,0026 M. ; KCl 0,04 M. ; ATP 0,0005 M. ; cyto¬
chrome C 0,0000145 M. L'isotonicité du milieu est atteinte au moyen d'un tampon
phosphate de K de pH 7,5. Volume final 4 ce. Incubation 60 min. à 38° C. Hc =
homogénat complet ; M = mitochondries ; S = surnageant ; Sd =
surnageant dialyse.
Additions,aM. ac. hipp.
forméActivité
Hc + acide benzoïque + 1-leucyl-glycyl-glycine .
Hc + acide benzoïque + glutathion ....Hc + acide benzoïque + glycyl-1-leucine .
M + acide benzoïqueM + acide benzoïque + 1-Ieucyl-glycyl-glycine .
M + acide benzoïque + glutathion ....M + acide benzoïque 4- glycyl-1-leucineM + acide benzoïque + alanyl-glycine
M + S + acide benzoïqueM + S + acide benzoïque -h 1-leucyl-glycyl-glycineM + S + acide benzoïque + glycyl-1-leucine .
M + Sd + acide benzoïqueM + Sd + acide benzoïque -•- 1-leucyl-glycyl-glycine
1,00
2,60
2,033,15
0,33
1,101,43
3,313.35
1,15
3,693,26
0,733,27
0,2860,6580,605
0,900
0,140
0,6100,7701,400
1,790
0,277
0,8860,784
0,2080,935
TABLEAU 7
Suspension de mitochondries 0,5 ce. Acide benzoïque 0,001 M. ; glycine ou
dipeptides 0,015 M. ; acide fumarique 0,0025 M. ; MgS04 0,0026 M. ; KCl 0,04 M. ;
cytochrome C 0,0000145 M. L'isotonicité est atteinte au moyen d'un tampon phosphate
de K de pH 7,5. Volume final 4 ce. Incubation 30 min. à 38° C.
Exp. Additions«M. ATP par «M. acide hippurique
essai formé
I glycyl-1-leucineglycyl-1-leucineglycyl-1-leucineglycyl-1-leucine
0,5
1,0
3,0
6,0
0,10
0,20
0,30
2,15
II glycyl-l-leucineglycyl-1-leucinealanyl-glycinealanyl-glycineglycine
1,06,0
1,06.0
6,0
0,30
1,50
0,40
3,20
3,35
27
12 ce. de surnageant, d'un homogénat de 20 °0, sont dialyses pendant14 heures à 0° C. contre 70 ce. d'eau distillée. Le volume du dialysat est
réduit au vide à 3 ce. 1 ce. de cette solution est ajouté à 3 ce. d'HCl
de 20 % et le tout chauffé à ébullition pendant 10 heures. L'acide
chlorhydrique est évacué au vide. Le résidu sec est dissout dans 3 ce.
d'eau et filtré. Le volume du filtrat, dont la couleur est jaune, est réduit
au vide à environ 0,5 ce. Nous avons utilisé du papier filtre Whatman
No 1 et avons développé le chromatogramme pendant 18 heures à tem¬
pérature ordinaire en utilisant comme solvant une solution de phénolsaturée d'eau et une atmosphère contenant de l'ammoniaque.
Avec le filtrat susmentionné la ninhydrine fait apparaître deux
taches distinctes. Les niveaux de ces taches correspondent à l'acide
glutamique et à la glycine témoins sur la piste S (fig. 4).
-< acide glutamique
-< glycine
-4 alanine
FIGURE 4
Chromatogramme du dialysat du liquide surnageant d'un homogénat de foie de
cobaye centrifugé. Le dialysat est hydrolyse pendant 14 heures. Après évaporation de
l'HCl, le résidu est dissout dans 3 ce. d'eau bidistillée et filtrée. De ce filtrat on a
déposé en 2 deux, en 4 quatre gouttes. En S on a déposé une goutte d'une solution
standard de glycine, d'acide glutamique et d'alanine. — Développement à la ninhydrine.
13 ce. d'un surnageant de 20 % sont chauffés pendant 5 minutes
au bain-marie à 100° C. Les protéines coagulées sont séparées par cen-
trifugation. Le « Kochsaft » est dialyse pendant 15 heures à 0° C. contre
28
• là
30 ce. d'eau distillée. 13 ce. du même surnageant et du même homogénatsont également dialyses contre 30 ce. d eau distillée pendant le même
temps. Le volume des deux dialysats est réduit à sec par évaporation au
vide. Chaque résidu est redissout dans 3 ce. d'eau. De ces solutions 2 ce.
sont transférés dans deux ballons contenant 4 ce. d'HCl de 20 % que
l'on porte à ébullition durant 24 heures. Après distillation de l'HCl au
vide, chaque résidu est redissout dans 0,2 ce. d'eau bidistillée. Nous avons
opéré de la même manière avec l'hydrolysat du dialysat du « Kochsaft »
(DK). Après développement à la ninhydrine nous observons des taches
correspondant à l'acide glutamique et à la glycine (fig. 5).Nous pouvons en déduire que le précurseur du surnageant est iden¬
tique à celui du « Kochsaft » et, comme nous l'avons déjà mentionné,
thermostable. Même une hydrolyse prolongée de 10 à 24 heures ne fait
DK
2 S
DS
1 2 S
*• lit
cvsteine
acide glutamique
valine
FIGURE 5
Chromatogramme du dialysat du liquide surnageant et du Kochsaft du même
homogénat de foie de cobaye. Ds = chromatogramme de l'hjdrolysat du dialysat du
liquide surnageant. En 1 on a déposé une et en 2 deux gouttes de l'hydrolysat.DK = chromatogramme de l'hydrolysat du dialysat du Kochsaft. En 1 on a déposé
une et en 2 deux gouttes de l'hydrolysat. En S des deux chromatogramme^. on a
déposé une goutte d'une solution standard de valine. d'acide glutamique. de glycine
et de cystéine. — Développement à la ninhydrine
29
pas apparaître d'autres acides aminés que celui qui a une valeur Rf.
de 0,77. D'après le tableau de Dent 53nous pouvons avoir à cet endroit
l'ornithine, la valine, la norvaline ou le tryptophane. Il est possible que
le précurseur se trouve être la glutathion, car cette substance est assez
répandue dans les différents organes des mammifères (Awapara 54). Dans
nos conditions d'expérience nous n'avons néanmoins jamais pu prouver
la présence de la cystéine sous forme de cystine.
f) Influence de la concentration de la glycine.
D'après les travaux de Cohen et McGilvery2H il faut 15 fois plusde glycine que d'acide p-amino-benzoïque pour obtenir en 45 minutes une
synthèse totale. Nous avons montré qu'à partir de benzoate et du pré¬curseur on pouvait obtenir une quantité considérable d'acide hippurique.Il est peu probable que la glycine libérée ou formée à partir d'autres
corps se trouve dans une concentration dépassant de beaucoup celle de
l'acide benzoïque. En effet, dans nos conditions d'expérience, c'est-à-dire
avec un système enzymatique tel que les mitochondries, nous obtenons
en 45 minutes d'incubation avec 4 /«mol. de glycine une synthèse de
77 %. Avec 12 jumol. de glycine, donc une concentration trois fois supé¬rieure à celle de l'acide benzoïque, nous obtenons une synthèse de 98 %(tableau 8). Il est à noter qu'un tel rendement n'est possible qu'avec une
suspension de mitochondries suffisamment active contenant au moins
2 mgr. N par essai. En comparant nos expériences à celles de Cohen
et coll. 28nous voyons que la conjugaison de la glycine avec l'acide ben¬
zoïque se fait plus rapidement qu'avec l'acide p-amino-benzoïque.
TABLEAU 8
Suspension de mitochondries 0,5 ce., 2,07 mgr. N par essai. Acide benzoïque0,001 M. ; acide fumarique 0,0025 M. ; MgS04 0,0026 M. ; KC1 0,04 M. ; ATP 0,0005 M. ;
cytochrome C 0,0000145 M. L'isotonicité est atteinte au moyen d'un tampon phosphatede K de pH 7,5. Volume final 4 ce. Incubation 45 min. à 38° C.
Additions fM.ac. hippurique
Rendement
%
4 fM. ac. benzoïque + 4 fM. glycine4 fM.. ac. benzoïque + 8 fM. glycine4 fM. ac. benzoïque +12 ftM. glycine4 fM. ac. benzoïque + 20 fiM. glycine
0,25
3,083,56
3,95
3,98
76,9
89,5
98,6
99,5
30
g) Synthèse de la glycine à partir d'autres acides aminés.
Après ingestion de fortes doses d'acide benzoïque, la quantité de
glycine, éliminée sous forme d'acide hippurique, dépasse de beaucouples réserves de glycine (libre ou combinée) disponible dans l'organisme.11 doit y avoir une synthèse de la glycine à partir d'autres substances.
Borsook et Dubnoff 25, étudiant la formation de l'acide hippurique dans
des coupes de tissus, ont trouvé que certains amino-acides, en présencede l'acide benzoïque, augmentent la quantité d'acide hippurique formée.
Leuthardt 29a prouvé, à l'aide de coupes de foie de cobaye, que la gluta-
mine fournit presque autant d'acide hippurique que la glycine. Leuthardt
et Glasson 31ont montré que, dans les mêmes conditions d'expérience,
la serine est également transformée en glycine. Ce résultat fut confirmé
par Shemin 30 qui, en utilisant de la serine marquée (d, 1-sérine N15-l-C14),fournit la preuve définitive d'une scission de la chaîne carbonée de la
serine entre les positions fi et y. Nous basant sur ces données, nous avons
cherché la possibilité d'une synthèse de la glycine à partir d'autres acides
aminés dans l'homogénat de foie et les mitochondries.
Avec un homogénat de foie de cobaye ou une suspension de mito¬
chondries, il ne nous a pas été possible d'obtenir une synthèse d'acide
hippurique à partir des acides aminés suivants : acide /?-oxyglutamique,1-leucine, 1-valine, l'asparagine, la bétaïne, l'alanine et la d, 1-sérine. Par
contre à partir de la thréonine ou de la sarcosine, nous obtenons une
quantité considérable d'acide hippurique. Ceci aussi bien avec un homo¬
génat qu'avec une suspension de mitochondries. L'activité de ces deux
acides aminés est presque aussi grande que celle de la glycine. La synthèsede la glycine à partir de la thréonine et de la sarcosine se produit égale¬ment dans des suspensions de mitochondries pures. Les enzymes néces¬
saires à la transformation de ces deux corps en glycine se trouvent
localisés dans les mitochondries (tableau 9). Avec la glutamine ou l'acide
TABLEAU 9
Système enzymatique 0,5 ce. Acide benzoïque 0,001 M. ; acide fumarique 0,0025 M. ;
MgS04 0,0026 M. ; KC1 0,04 M. ; ATP 0,0005 M. ; cytochrome C 0,0000145 M. L'isoto-
nicité est atteinte au moyen d'un tampon phosphate de K de pH 7,5. Volume final 4 ce.
Incubation 45 min. à 38° C. Hc = homogénat complet ; M — mitochondries.
Additions/uM. ac. hipp.
forméActivité
Hc + acide benzoïqueHc + acide benzoïque + 40 mM. thréonine
Hc + acide benzoïque -1- 8 («M. thréonine
Hc + acide benzoïque + 40 «M. sarcosine
M + acide benzoïque + 40 ^M. thréonine
M + acide benzoïque + 8 /tM. thréonine
M + acide benzoïque f 40 ,«M. sarcosine
0,90
1,50
1,35
1,20
0,40
2,201,74
2,21
0,31
0,520,41
0,42
0,22
1,220,84
1,23
31
glutamique nous obtenons dans l'homogénal une faible formation d'acide
hippurique. En présence d'une suspension de mitochondries les valeurs
sont semblables à celles obtenues à partir du précurseur naturel dont il
était question plus haut (page 24). Les combinaisons des systèmes enzy-
matiques : mitochondries + surnageant, mitochondries + surnageant
dialyse ou mitochondries + Kochsaft, ne favorisent pas la formation de
la glycine à partir des deux acides aminés susmentionnés. La prolon¬
gation du temps d'incubation a pour seul effet d'augmenter la synthèsede l'acide hippurique à partir du benzoate et du précurseur. Nous avons
également varié la concentration du tampon, sans obtenir d'effet. Il est
curieux que la d, 1-sérine soit inactive tandis que la d, 1-phényl-sérinenous donne une faible synthèse en présence d'une suspension de mito¬
chondries. Dans ce cas également, la combinaison des différentes frac¬
tions ou la prolongation du temps d'incubation n'a aucun effet
(tableau 10). Les résultats obtenus avec la glutamine, l'acide glutamique
TABLEAU 10
Mêmes conditions que celles indiquées sous tableau 9. Incubation 45 min. à 38° C.
,,,.,.«M. ac. hipp. . .
...
Additionsr
. . Activité
forme
Hc + acide benzoïque + 40 ^M. glutamine
1,22 0,33
0,20 —
1,74 0,55
Hc + 40 /M. acide glutamique ....Hc + ac. benzoïque -+- 40 ^M. ac. glutamique
1,10
0,281.54
0,33
0,46
Hc + ac. benzoïque -f- 40 i/M. phényl-sérine
M + ac. benzoïque -j- 40/iM. phényl-sérine
0,90
0,960,451,10
0.27
0,29
0,24
0,59
et la phényl-sérine ne sont pas réguliers et ne peuvent pas encore être
interprétés. Or nous constatons que le tissu intact (coupes) a la capacitéde former de la glycine à partir de la d,l-sérine, de la glutamine et de
l'acide glutamique, tandis que ces transformations n'ont pas lieu dans
le tissu homogénéisé. Nous ne pouvons pas expliquer la raison pour
laquelle la scission de la chaîne carbonée ne peut se produire après la
32
destruction du tissu. Il est possible que les conditions de nos expériencesne soient pas optimales parce qu'un facteur indispensable a été détruit
pendant la préparation de l'homogénat, ou que ce facteur se trouve
être trop dilué.
h) Inhibition de la synthèse de l'acide hippurique par
un facteur hépatique.
Dans le chapitre concernant la préparation des mitochondries, nous
avons mentionné qu'une substance inhibitrice colorée se trouve dans les
homogénats de foie de cobaye. En présence de cette substance, on obtient
des suspensions de mitochondries légèrement colorées qui ne sont que
peu ou pas actives. Ces observations nous ont laissé supposer que le
corps inhibiteur pouvait provenir de la bile. Nous avons, après neutra¬
lisation, dilué 10 fois la bile du même animal avec un tampon phosphatede pH 7,5. Nous avons ajouté de cette solution une quantité croissante à
nos essais. L'inhibition de la synthèse de l'acide hippurique est nette,
mais n'est pas toujours la même et varie d'un animal à l'autre (tableau 11).L'activité de la synthèse dépend beaucoup de la manière dont les mito¬
chondries sont préparées (voir page 16). La quantité du facteur inhi¬
biteur, contenu dans le foie de cobaye, dépend de la nourriture de l'animal
(herbe ou foin plus betteraves). Cette constatation ainsi que la coloration
observée lors de la préparation des mitochondries, nous fait supposer
qu'il s'agit d'un pigment d'origine végétale. Dans des expériences ulté¬
rieures, il s'agira de chercher la nature chimique de cet inhibiteur.
TABLEAU 11
Suspension de mitochondries 0,5 ce. Acide benzoïque 0,001 M. ; glycine 0,015 M. ;
acide fumarique 0,0025 M. ; MgS04 0,0026 M. ; KC1 0,04 M. ; ATP 0,0005 M. ;
cytochrome C 0,0000145 M. L'isotonicité est atteinte au moyen d'un tampon phosphatede K de pH 7,5. Volume final 4 ce. Incubation 45 min. à 38° C. N bile = teneur
en azote de la solution de bile ajoutée, exprimé en mgr.
Additions N bile
0,0070,028
(«M. acide hippurique formé
benzoate + glycinebenzoate + glycinebenzoate + glycine
3,603.28
0.70
3,60
3,122.57
benzoate + glycinebenzoate + glycinebenzoate + glycine
0,0100,020
0,030
3 33
IV. Sommaire
1. Il y a synthèse d'acide hippurique à partir de benzoate et de glycinedans le tissu hépatique homogénéisé du rat et du cobaye. La synthèsen'a lieu qu'en présence de l'ATP.
2. Le système enzymatique nécessaire à la synthèse de l'acide hippu¬rique se trouve localisé dans les granules cytoplasmiques (mitochon¬dries) de la cellule hépatique.
3. En présence d'une suspension de mitochondries suffisamment
concentrée nous obtenons une synthèse stoechiométrique d'acide
hippurique à partir de benzoate et de glycine.4. Le liquide surnageant, obtenu après centrifugation des mitochon¬
dries, des noyaux et des débris cellulaires contient un précurseur de
la glycine thermostable et dialysable sans altération.
5. L'analyse du précurseur par chromatographie sur papier a révélé
de l'acide glutamique et de la glycine. Cela nous laisse supposer
qu'un des précurseurs au moins est du glutathion.6. La glycine peut en effet être remplacée par certains polypeptides.
Nous avons obtenu une synthèse d'acide hippurique à partir des
peptides suivants : 1-leucyl-glycyl-glycine, glycyl-glycyl-leucine, le
glutathion, la glycyl-1-leucine, et l'alanyl-glycine. En présence d'une
suspension de mitochondries le rendement en acide hippurique est
supérieur à partir des dipeptides. En ajoutant le liquide surnageantdialyse à la suspension de mitochondries on augmente la synthèseà partir des tripeptides. Ceci montre que dans la cellule la répar¬tition des di- et tripeptidases est différente entre les fractions
protéiques solubles et les mitochondries.
7. La synthèse à partir des peptides n'a lieu qu'en présence de l'ATP.
8. Dans nos conditions d'expériences la sarcosine, la thréonine et la
d, 1-phényl-sérine sont transformées en glycine. Nous obtenons
quelquefois une très faible formation d'acide hippurique en rem¬
plaçant dans la synthèse la glycine par l'acide glutamique, la glu-tamine et la d,l-sérine.
9. La bile de cobaye contient un facteur inhibiteur de la synthèse de
l'acide hippurique.
34
DEUXIEME PARTIE
LA PHOSPHORYLATION BIOLOGIQUE DE LA THIAMINE
/. Généralités
a) Rôle physiologique de la cocarboxylase.
Il est connu que les troubles de l'avitaminose Bi relèvent essentiel¬
lement d'un trouble du catabolisme glucidique qui se traduit par une
accumulation d'acide pyruvique dans les tissus et en particulier dans les
tissus nerveux. Ces phénomènes sont devenus plus clairs depuis qu'on a
montré que la thiamine sous la forme de son dérivé phosphorylé, le
thiaminepyrophosphate ou cocarboxylase, est le coenzyme de la décar¬
boxylation de certains acides a-cétoniques, surtout de l'acide pyruvique.Dans la levure, le produit de la décarboxylation de l'acide pyruvique est
l'aldéhyde acétique. Dans les tissus animaux, la décarboxylation est
couplée avec une oxydation. Mais il est peu probable que la cocarboxylasefonctionne en même temps comme coferment de la déshydrogénation.Nous discuterons ce problème plus tard. Un seul exemple de formation
d'un aldéhyde dans un extrait de tissu animal a été constaté (Green1).La signification de cette constatation reste douteuse (Krebs2). Green
et coll. 3ont étudié la spécificité de la carboxylase purifiée de la levure.
Ces auteurs ont trouvé que l'acide a-céto-isovalérique est décarboxyléavec la même vitesse que l'acide pyruvique. Pour l'acide oxalylacétiquela vitesse est d'un tiers, les acides a-céto-isocaproïque et a-cétoglutariquesont à peine attaqués. L'enzyme ne réagit pas avec les acides acétoacé-
tique, phénylpyruvique et p-oxy-phénylpyruvique.
b) Phosphorylation de la thiamine.
De nombreuses expériences prouvent actuellement que la forme
active de la vitamine Bi n'est pas la thiamine, mais son pyrophosphate.Ce dernier a été isolé pour la première fois par Lohmann et Schuster 4
35
à partir de la levure. Puisque la vitamine Bi est pleinement active dans
l'animal vivant, il est clair que l'organisme dispose d'enzymes permettantla phosphorylation de la thiamine en son ester pyrophosphorique. La
formation de ce dernier a été étudiée par plusieurs auteurs.
En général, la cocarboxylase formée a été dosée à l'aide de ]'« aetio-
zymase » (levure lavée avec des solutions tampons alcalines) contenant
la carboxylase privée de son coferment. Mais en utilisant de telles pré¬parations il apparaît une difficulté en ce sens que l'excès de thiamine
augmente l'activité de la cocarboxylase présente. Cet effet (découvertpar Ochoa) est explicable par le fait que la thiamine inhibe l'hydrolysede la cocarboxylase par une phosphatase contenue dans l'« aetiozymase »
(Westenbrink et coll. 5). Comme il n'a pas été tenu compte dans les
premières recherches sur la synthèse de la cocarboxylase de cet « effet
d'Ochoa », l'interprétation des résultats en est incertaine.
La levure, les bactéries et le tissu animal contiennent des systèmescapables de phosphoryler la thiamine. Euler et Vestin 6
ont observé quele pouvoir de décarboxylation, vis-à-vis de l'acide pyruvique, d'une poudrede levure de bière augmente lorsque cette dernière est incubée en pré¬sence de thiamine, de phosphate minéral et de l'acide adénosinetriphos-phorique (ATP). Goodhart et Sinclair7, Tauber9, Ochoa et Peters9 ont
étudié le mécanisme de la phosphorylation dans les tissus d'animaux.
Ochoa 10a trouvé que le foie contient un système phosphorylant actif.
Les interprétations données aux résultats obtenus ont soulevé un
certain nombre d'objections. Différents auteurs ont travaillé avec des
concentrations en thiamine assez considérables. Dans ces conditions,
l'augmentation de la décarboxylation que l'on observe en ajoutant à
Taetiozymase de levure la solution incubée, pourrait être due, comme
nous venons de voir, à l'activation de la cocarboxylase préformée et non
à la synthèse de cocarboxylase (Lipton et Elvehjem J1), Westenbrink et
coll.5). Ochoa10 a démontré que les extraits exempts de cellules (foie,muqueuse intestinale, cerveau) n'étaient pas actifs. Par contre les pulpesd'organes ne réalisent la phosphorylation qu'au cours d'une respirationactive. Weil-Malherbe 12 réussit à extraire d'une poudre acétonique de
levure de bière, par précipitations fractionnées, une protéine active
capable de phosphoryler la thiamine. Cette opération s'effectue en dehors
de tout processus d'oxydation et l'ATP se trouve être le donateur du
pyrophosphate. Nguyen van Thoai et Chevillard is décrivent une mé¬
thode de purification des protéines phosphorylant la thiamine. Ces
auteurs ont extrait d'un homogénat de foie de chien, par précipitationsfractionnées au sulfate d'ammonium, une fraction semble-t-il très active
et capable de phosphoryler la thiamine. Malheureusement, les conditions
d'expérience et de dosage manquent de clarté. Nous reviendrons sur
leurs résultats dans la discussion de ce travail.
36
c) Méthodes de dosage de la cocarboxylase.
Des méthodes chimiques et enzymatiques, c'est la dernière que nous
avons choisie afin d'avoir un dosage simple qui nous permette de déceler
de petites quantités de cocarboxylase. Le dosage se fait indirectement
et se base sur la décarboxylation de l'acide pyruvique en présence de
l'apoferment de la décarboxylase de la levure. La quantité de CO2 dégagéest mesuré manométriquement.
La plupart des auteurs ont utilisé, comme apoferment, de l'a levure
lavée en milieu alcalin (Auhagenu, Westenbrink et coll.0). Par plu¬sieurs lavages d'une poudre de levure de bière, avec des tampons phos¬phates alcalins ces auteurs éliminent le coferment. Pour supprimerl'« effet d'Ochoa », Westenbrink et coll. 3
proposent d'ajouter à la pré¬paration enzymatique un grand excès de thiamine. Dans ces conditions,la cocarboxylase préformée montre son activité maxima et n'est plusactivée par la thiamine contenue dans les solutions dont on veut doser
la teneur en cocarboxylase. Weil-Malherbe 12en se basant sur les données
de Axmacher et Bergstermann 13a préparé à partir d'une poudre de
levure une fraction protéinique contenant la carboxylase. Pour enlever
le coferment il s'est servi de la même méthode que Warburg et Christian 16
ont utilisée pour scinder la d-aminoacidodésaminase (addition de HC1
dilué en présence de sulfate d'ammonium). Cette préparation était surtout
destinée à étudier le mécanisme de la phosphorylation de la thiamine.
Green et coll. 1?ont extrait de la levure de bière par précipitation au
sulfate d'ammonium une décarboxylase très active. Cette dernière est
ensuite traitée à deux reprises avec une solution de sulfate d'ammonium
alcaline. De cette manière, ces auteurs obtiennent l'apoferment (« splitenzyme»). Kubowitz et Lûttgens 18
ont également préparé une carbo¬
xylase très active sans donner, cependant, des détails concernant la
préparation.Pour nos dosages de la cocarboxylase nous avons essentiellement
utilisé la préparation protéinique décrite par Weil-Malherbe 12. Mais
comme nous le verrons, les excès d'ATP et de thiamine contenus dans
nos essais peuvent fausser nos résultats quelle que soit la méthode de
dosage. La préparation protéinique de Weil-Malherbe contient encore un
enzyme pouvant phosphoryler la thiamine en présence d'ATP. Il nous
fallait donc tout d'abord fixer les conditions permettant de doser la
cocarboxylase formée en présence d'ATP et de thiamine.
37
//. Partie expérimentale
a) Matériel et conditions d'expérience.
Animaux : Nous avons utilisé des rats albinos adultes de 150-200 gr.
Ils ont reçu pendant environ 10 jours une nourriture optimale contenant
de la viande.
Substrats : La thiamine, la cocarboxylase, l'acide glutamique ainsi
que le pyruvate de Na sont des produits Hoffmann-La Roche. L'ATP est
préparé par nous selon des méthodes mentionnées dans la premièrepartie de ce travail. L'acide adénosine monophosphorique est un produitde Bischoff, U. S. A. L'acide adénosine diphosphorique a été obtenu à
partir de l'ATP et de myosine. La levure de bière a été mise obligeammentà notre disposition par la brasserie Hûrlimann à Zurich.
Conditions d'expérience : La phase gazeuse est de l'air. Après20 minutes d'incubation à 38° C. la réaction est arrêtée par déprotéini-sation à chaud pendant une minute au bain-marie. Après centrifugationune partie aliquote est prélevée pour le dosage de la cocarboxylase.
b) Dosage enzymatique de la cocarboxylase.
La préparation de l'apoferment selon la méthode de Westenbrink
et coll. 5 n'a pas donné des résultats satisfaisants avec la levure mise à
notre disposition. Il n'a pas été possible d'obtenir une actiozymasesuffisamment privée de cocarboxylase à partir de chaque préparationde levure séchée. La quantité de cocarboxylase présente dans nos pré¬parations, après le lavage alcalin, s'élevait souvent à 1/4 de la quantitéà doser. La préparation de l'apoferment selon les modalités de Weil-
Malherbe 12nous donna la méthode la plus sensible. Mais la fraction
protéinique qu'on obtient est capable de phosphoryler la thiamine en
présence d'ATP. Du fait que nos solutions à doser contiennent encore
de l'ATP et de la thiamine, il peut se produire en présence de l'enzymede la levure une synthèse de cocarboxylase qui fausse les résultats. En
évitant dans les essais un excès de thiamine il est cependant possibled'utiliser l'enzyme de Weil-Malherbe sans introduire une erreur notable.
Mais par fractionnement au sulfate d'ammonium, nous avons réussi à
éliminer complètement l'enzyme phosphorylant. Cette préparation ne
forme aucune cocarboxylase même en présence d'un excès considérable
de thiamine et d'ATP.
38
1. Préparation de la solution enzymatique.
La levure de bière fraîchement pressée est lavée pendant 72 heures
à l'eau courante, pressée à nouveau et séchée en fines couches à tem¬
pérature ordinaire. Une poudre sèche, gardée à 0° C, reste active pen¬dant plusieurs mois. La préparation de la poudre acétonique de la levure
se fait selon les indications de Weil-Malherbe 12. Gardée au vide dans
un dessicateur la poudre reste active pendant plusieurs semaines.
1 gr. de la poudre acétonique est pétri dans un mortier en présencede 30 ce. d'eau. On refroidit à 0° C. et on ajoute 1 ce. d'acide acétique2 N. Le précipité est séparé par centrifugation. A la solution, 15 ce.
de (NH4) 2SO4 sat. (1/3 saturation finale) sont ajoutés et le précipitéobtenu éloigné par centrifugation. A nouveau 15 ce. de (NH4) 2SO4 sat.
(1/2 sat. finale) sont ajoutés. Après centrifugation le précipité est dissout
dans 10 ce. de tampon phosphate (1/20 M.) de pH 6,2. On ajoute 50 ce.
d'eau et 30 ce. de (NH4) 2SO4 sat. (1/3 sat. finale). Après avoir refroidi
la solution à —5° C, 30 ce. de HC1 N/10 (contenant assez de (NH4) 2SO4pour donner une concentration finale de 1/3 saturation) sont ajoutésrapidement en agitant la solution. Il se forme un précipité. Ce dernier
est récolté par centrifugation à —5° C. et lavé avec 20 ce. de (NH4) 2SO43/4 sat. (A ce stade la fraction enzymatique peut être gardée comme
suspension dans une solution de (NH4) 2S04 3/4 sat. pendant plusieursheures sans perte d'activité.) Le précipité est dissout dans 45 ce. de
tampon phosphate (1/20 M.) de pH 6,2. Des protéines dénaturées sont
éliminées par centrifugation. Toutes les opérations ainsi que les centri-
fugations s'effectuent à 0° C. La solution enzymatique est préparéeavant chaque dosage à partir de la poudre acétonique.
2. Dosage manométrique.
Les fioles contiennent 1 ce. d'enzyme de levure, 1 ce. de tampon
phosphate (1/20 M.) de pH 6,2, 0,1 ce. d'une solution de Mn++ et
Mg++ N, et une partie aliquote de la solution de cocarboxylase inconnue.
Le volume final est de 3 ce. Pour établir une courbe de référence, on
remplace la solution inconnue par des quantités connues de cocarbo¬
xylase (en général 0,05 y, 0,10 y, 0,20 y). L'appendice contient 0,5 ce.
d'une solution de pyruvate 1/5 N. La phase gazeuse est de l'air. La
température du thermostat est de 27° C. Après 20 minutes d'équilibrationle pyruvate est versé de l'appendice dans la fiole. Dès ce moment, la
quantité de CO2 dégagée est mesurée toutes les 10 minutes pendant1 heure. Dans ces conditions la quantité de CO2 libéré est proportionnelleà la quantité de cocarboxylase présente. Nous comparons les valeurs
de CO2 obtenues après 30 minutes. Comme nous l'avons dit plus haut,notre préparation protéique contient une quantité variable d'un enzyme
catalysant la synthèse de la cocarboxylase en présence de la thiamine
39
et de l'ATP. La courbe (thiamine + ATP) de la figure 1 montre une
telle synthèse de la cocarboxylase. La thiamine ainsi que l'ATP seuls
donnent des valeurs identiques au blanc.
Dans nos expériences, la phosphorylation de la thiamine, en pré¬sence d'ATP et de l'enzyme hépatique, est incomplète. De ce fait il nous
reste après la période d'incubation un excès de thiamine et d'ATP.
Dans ces conditions la quantité de cocarboxylase peut augmenter au
cours de son dosage manométrique. En général l'erreur est négligeable;mais nous avons toujours ajouté à chaque série de dosage un essai
qui sert à fixer la limite supérieure de l'erreur. Nous ajoutons à la
solution enzymatique les quantités maxima de thiamine et d'ATP
pouvant être introduites avec la solution inconnue.
La figure 2 montre une courbe de référence. En général la quan¬
tité de CO2 libérée, après 30 minutes, est une fonction linéaire de la
quantité de cocarboxylase, jusqu'à une concentration d'environ 0,2 y
de cocarboxylase. La solution enzymatique préparée selon la méthode
que nous venons de décrire ne contient que des traces de cocarboxylasepréformée. La valeur de CO2 dégagé en présence de l'enzyme seul
ne représente en moyenne que les 3 % de la valeur obtenue pour 0,2 y
de cocarboxylase.
3. Purification de Vapoferment de la décarboxylase.
La solution enzymatique obtenue selon les modalités de Weil-
Malherbe 12 contient, entre autres protéines, une transphosphorylase très
0,2 y Cocurb
0,1 y Cocarb
0 05 y Cocarb
0,2 y Thiamine
+ 0,3fiMATP
10 20 30 40 50 60 Minutes
FIGURE 1
0.1 0.2 y Cocarb
FIGURE 2
40
active. Dans le paragraphe précédent nous avons décrit une méthode de
préparation d'une solution enzymatique ne contenant qu'une faible
quantité de transphosphorylase. Nous avons néanmoins constaté que
pour pouvoir étudier la synthèse de la eocarboxylase à partir de plusgrandes concentrations (5 à 10 y) de thiamine et (5 à 10 ,uM.) d'ATP,il était nécessaire, pour des raisons que nous avons indiquées dans le
chapitre susmentionné, d'éliminer complètement cette transphospho¬rylase. Nous avons encore apporté les modifications suivantes à la mé¬
thode de préparation de l'apoferment.Le précipité obtenu par acidification à —5° C. en un milieu de
(NH4) 2SO4 de 1/3 de saturation finale est récolté par centrifugation et
lavé avec 20 ce. de (NH4) 2SO4 3/4 sat. On le centrifuge. Au culot on
ajoute, tout en le triturant, 10 ce. d'une solution de NH4OH N/100. Le
résidu protéique ne se dissout que partiellement et le pH de la suspensionse trouve être de 7,0. A cette suspension on ajoute 30 ce. d'un tampon
phosphate 1/20 M. de pH 6,2. Une petite quantité de protéines déna¬
turées sont écartées par centrifugation. Au surnageant on ajoute 30 ce.
de (NH4) 2SO4 sat. (saturation finale de 43 %). Après centrifugation, le
culot est redissout dans 20 ce. de tampon phosphate 1/20 M. de pH 6,2et reprécipité à 43 % de saturation finale en (NH() 2SO4. On centrifuge.Le culot est redissout dans 15 ce. de tampon phosphate 1/20 M. de pH 6,2et la solution est employée comme telle. Cette dernière contient 65 à
80 y de tyrosine par ce.
Le tableau 1 montre quelques caractéristiques de notre solution
enzymatique. Il en ressort que la décarboxylase est très active et que
TABLEAU 1
Les récipients de Warburg contiennent 1,0 ce. de solution enzymatique de la
levure (environ 0,5 mgr. de protéines) ; 1,0 ce. d'une solution de tampon phosphate1/20 M. de pH 6,2 ; 0,1 ce. d'une solution contenant 1 mgr./cm3 de Mg 1 + et de Mn +
;
une partie aliquote de la solution à doser ; dans l'appendice 0,5 ce. d'une solution de
pyruvate de Na 1/5 M. Le volume est complété à 3 ce. avec HoO bidistillée. Les
quantités de substance indiquées dans le tableau se trouvent dans les récipients.
Additions mm3 CO-2 en 30 min.
0,05 y eocarboxylase .
0,10 y eocarboxylase .
10 y thiamine i- 2 mgr. ATP.
0,5 y thiamine + 0,05 mgr. ATP
2 mgr. ATP....
0,05 mgr. ATP....
1.5
97,7158.5
4.4
3,26.4
1.0
1.0
2.1
41
la transphosphorylase a été complètement éliminée. Même en présencede 10 y de thiamine et de 2 mgr. d'ATP nous n'obtenons pas, ou tout
au plus dans les limites d'erreur de la méthode, de formation de cocar-
boxylase. La valeur la plus élevée de 6,4 mm3 de CO2 après 30 et même
60 minutes, ne représente qu'environ 0,01 y de cocarboxylase. Il est à
remarquer que, contrairement aux résultats de Weil-Malherbe 12, nous
n'obtenons avec l'ATP aucun effet de cocarboxylase, ceci même avec
les concentrations de 2 mgr. d'ATP utilisées par cet auteur. Nous n'avons
observé cet effet qu'en employant un produit obtenu des Schwarz
Laboratories Inc., New-York, préparé à partir de la levure, et non pas
à partir du muscle de lapin comme le nôtre ainsi que celui utilisé parWeil-Malherbe. Une telle préparation contient encore des traces de
cocarboxylase (environ 8/100 de y par juM. d'ATP). L'effet de l'ATP
observé par Weil-Malherbe est probablement un effet secondaire dont
il est difficile de donner une explication. Il nous semble peu probablequ'il y ait formation, entre l'ATP et l'enzyme actif, d'une « pseudo-décarboxylase » de faible activité.
4. Dosage des protéines.
Le dosage de l'azote protéique des homogénats, des suspensions de
mitochondries et des surnageants a été fait selon la méthode de Kjeldahl.Pour les fractions contenant encore du (NH4) 2SO4 nous avons utilisé
la méthode de Folin-Ciocalteu19, basée sur la réaction de coloration
donnée par la tyrosine et le tryptophane. Les extinctions sont lues au
spectrophotomètre de Beckman. L'activité de la synthèse de la cocar¬
boxylase est exprimée par le rapport :
y cocarboxylase formée
par essai.
mgr. N
Pour calculer la teneur en N protéique, nous nous sommes basés
sur les données de Weil-Malherbe 12 indiquant que 0,126 mgr. de « tyro¬sine » correspondent à 1 mgr. de protéines. Cette valeur est en réalité
trop élevée pour notre enzyme hépatique. La coloration que nous avons
obtenue avec l'enzyme hépatique, équivaut à 7 - 8,5 % de tyrosine.N'ayant pu obtenir une teneur constante dans nos préparations, nous
avons adopté le rapport indiqué par Weil-Malherbe comme base fictive
permettant d'établir des points de comparaison d'une fraction à l'autre.
42
///. Résultats et discussion
a) Conditions de la synthèse dans le tissu hépatique.
Nous utilisons un homogénat de foie de rat de 10 % préparé dans
une solution de KCl isotonique au moyen de l'appareil de Potter et
Elvehjem 20. Une telle préparation contient un enzyme capable de syn¬
thétiser de la cocarboxylase à partir de la thiamine en présence de l'ATP,de ions Mg++ et d'un substrat oxydable tel que l'acide glutamique(tableau 2). Le substrat oxydable est nécessaire pour maintenir la
resynthèse oxydative de l'ATP, car les extraits bruts contiennent des
enzymes qui hydrolysent l'ATP (l'« apyrase »). Nous utilisons le nom
d'« apyrase » pour désigner un enzyme hydrolisant les liaisons phospha¬tées labiles de l'ATP. Le nom « adénosinetriphosphatase » ou « ATP-ase »
devrait être réservé à la myosine, seul enzyme connu qui n'enlève qu'unseul reste phosphoryl de l'ATP. Le tissu homogénéisé contient une
certaine quantité, variant d'un animal à l'autre, de cocarboxylase pré¬formée. L'activité de l'homogénat, après soustraction de la valeur à
blanc, est de 0,43.
TABLEAU 2
Le milieu d'incubation contient : 0,5 ce. d'homogénat de foie ; ATP 0,001 M. ;
Mg++ 0,0033 M. ; acide glutamique 0>0066 M. ; thiamine 2 y par essai ; tampon
phosphate de K 0,0066 M. de pH 7,4. L'isotonicité du milieu est obtenue avec une
solution de KCl. Volume final 3 ce. Incubation 20 min. à 38° C.
Additions y cocarboxylaseformée par essai
Activité
Homogénat + ac. glutamique + ATP.
Homogénat + ac. glutamique + thiamine.
Homogénat + ac. glutamique + thiamine + ATP
0,82
0,980,80
1,80
0,349
0,765
b) Localisation de la synthèse.
Par centrifugation nous avons séparé les homogénats de foie en
deux fractions : une suspension de granules cytoplasmiques (mitochon-dries) et le liquide surnageant. La préparation de ces fractions est
décrite dans un travail précédent 21. L'étude de la phosphorylation de
43
la thiamine dans l'une ou l'autre des fractions susmentionnées nous
montre qu'il faut la somme des systèmes enzymatiques pour obtenir une
synthèse (tableau 3, exp. III). Pour purifier la phosphorylase, nous avons
centrifugé un homogénat de 10 % pendant 30 minutes à 18.000 t. p. m.
(25.000 X g). Toutes les opérations s'effectuent à 0° C. Au liquidesurnageant, qui est tout à fait limpide, nous ajoutons un volume égald'acétone. Le précipité est lavé avec de l'acétone et séché au vide. Une
poudre acétonique gardée au froid dans un dessicateur ne perd pas de
son activité pendant deux semaines.
200 mgr. de poudre sèche sont triturés au moyen de l'appareil de
Potter et Elvehjem dans 5 ce. de KC1 isotonique. On centrifuge afin
d'écarter les particules insolubles. Dans un tel extrait, la formation de
la cocarboxylase à partir de la thiamine et de l'ATP a lieu (tableau 3,
exp. V), même en l'absence de mitochondries et du substrat oxydable.L'extrait contient encore une quantité considérable de cocarboxylasepréformée, exprimée dans le tableau par l'essai « extrait seul ». En
soustrayant cette valeur de celle obtenue pour l'essai « extrait + thia¬
mine » nous obtenons pour l'extrait une activité de 1,18.Ces expériences montrent que le liquide surnageant, résultant de
la centrifugation de l'homogénat complet, nécessite la présence du
système phosphorylant des mitochondries. Ces dernières, par contre, ne
TABLEAU 3
Le milieu d'incubation contient : suspension enzymatique ; ATP 0,001 M. ;
Mg++ 0,0033 M. ; acide glutamique 0,0066 M. ; thiamine 2 y par essai ; tampon
phosphate de K 0,0066 M. de pH 7,4. L'isotonicité du milieu est obtenue avec une
solution de KO. Volume final 3 ce. Incubation 20 min. à 38° C.
Exp. Additions y cocarboxylaseformée par essai
I
Mitochondries + thiamine0,490.59
II
Surnageant -r thiamine....
0,250.55
III Mitochondries + surnageant .
Mitochondries + surnageant + thiamine0,89
1,71
IV Extrait + mitochondries....
Extrait + mitochondries + thiamine
1,00
2,75
Extrait + thiamine.....
0,81
2,16
44
participent pas directement à la phosphorylation de la thiamine. Par
une série de travaux22 il a été prouvé que les granules cytoplasmiques
sont le siège du cycle des acides tricarboxyliques et de la phosphorylationoxydative de l'acide adénylique ou de l'acide adénosinediphosphorique.Dans l'essai « surnageant + thiamine », l'apyrase est très active et la
faible activité obtenue est probablement due à la présence de mito-
chondries restées en suspension qui suffisent à maintenir une faible
resynthèse de l'ATP. Le fractionnement à l'acétone élimine la plus grandepartie de l'apyrase présente, sans, pour autant, diminuer la teneur en
cocarboxylase préformée. C'est seulement après la séparation de la
transphosphorylase de l'apyrase que la synthèse devient indépendantedu système phosphorylant des mitochondries et du substrat oxydable.Ces constatations montrent que l'enzyme qui produit la phosphorylationde la thiamine est une protéine soluble, contenue dans le liquide sur¬
nageant et que l'ATP est nécessaire comme donateur de phosphore.
c) Elimination de la cocarboxylase préformée.
Pour séparer la cocarboxylase de la poudre acétonique, nous nous
sommes basés sur les constatations de Warburg et Christian 16concernant
la séparation du groupe prosthétique de la d-aminoacidodésaminase de
son apoferment. En présence de sulfate d'ammonium ayant une action
protectrice, le groupe prosthétique peut être séparé du ferment par
l'acide chlorhydrique dilué.
400 mgr. de poudre acétonique sont suspendus dans 10 ce. de tampon
phosphate 1/25 M. de pH 7,5. On centrifuge après 2 heures d'extraction.
A l'extrait, dont le volume mesure environ 9,7 ce., on ajoute 10 ce. de
tampon phosphate 1/20 M. de pH 6,2, 37,5 ce. d'eau froide et 28,5 ce.
de (NH4) 2SO4 sat. (saturation finale en (NH4) 2SO4 = 1/3). Le mélangeest refroidi à —5° C. Puis on ajoute en remuant 28,5 ce. d'une solution
d'HCl 1/10 N 1/3 saturé en (NH4) 2S04. Après centrifugation (—5° C.)la fraction précipitée est lavée avec 20 ce. d'une solution de (NH4) 2SO43/4 sat. Le résidu est dissout dans 7 ce. de tampon phosphate 1/25 M.
de pH 7,5. On élimine par centrifugation les protéines dénaturées, et la
solution est employée comme telle. Nous appelons cette fraction « pré¬
cipité HC1 ».
La phosphorylation de la thiamin»; avec cette fraction enzymatiqueest très active. La valeur à blanc est nulle, ce qui signifie que la cocar¬
boxylase préformée a été éliminée (tableau 3, exp. I). Nous avons vu
dans un chapitre précédent que le fractionnement du liquide surnageant
par l'acétone avait pour effet d'éliminer la plus grande partie de l'apyrase.Cette dernière a été totalement écartée par la seconde précipitation en
milieu acide. De ce fait, l'acide glutamique comme substrat oxydableservant à la resynthèse de l'ATP peut être supprimé. Nous observons
même une faible inhibition de la synthèse en présence de l'acide glu-
45
tamique (tableau 4, exp. II). La stabilité de l'enzyme a également aug¬
menté. Une solution enzymatique gardée à 0° C. pendant 5 jours ne
perd que 5 % de son activité initiale (tableau 4, exp. III).
TABLEAU 4
Le milieu d'incubation contient : suspension enzymatique ; ATP 0,001 M. ;
MgT + 0,0033 M. ; thiamine 2 y par essai ; tampon phosphate de K 0,0066 M. de pH7.4. Volume final 3 ce. Incubation 20 min. à 38° C. Ppté. HC1 = fraction enzymatique(préparation : voir chapitre « élimination de la cocarboxylase préformée », page 45).
Exp. Additions }' cocarboxylaseformée par essai
Activité
I Ppté. HC1 seul 0,00
1,60 4,74
II
Ppté. HC1 + thiamine + 5 [A.M. ac. glutamiquePpté. HC1 + thiamine + 10 /M. ac. glutamiquePpté. HC1 + thiamine -t 40 /<M. ac. glutamique
2,16
2,14
1,93
1,86
5,58
5,534.96
4,80
III
Ppté. HC1 frais + thiamine
Ppté. HC1 après 5 jours + thiamine.
0,00
2,34
2,22
6,00
5,70
IOuMATP
Influence de la concentration en ATP
Le milieu contient : solution enzymatique (ppté. HC1) ; Mg++ 0,0033 M. ;
thiamine 3 y par essai ; tampon phosphate de K 0,0066 M. de pH 7,4. Volume final
de 3 ce. Incubation 20 min. à 38° C.
Af>
d) Influence de lATP et des ions Mg++.
L'activité de la synthèse de la cocarboxylase est fonction de la
concentration en ATP (figure 3). La phosphorylation est égalementfonction des ions Mg++ (figure 4). La concentration optimale se trouve
0.6
3 0,4
*-0,2
10 20
FIGURE 4
30^MMg"
Influence de la concentration des ions Mg+ +
Le milieu d'incubation contient: solution enzymatique (ppté. HC1). ATP 0,001 M.;thiamine 2 y par essai ; tampon phosphate de K 0,0066 M. de pH 7,4. Volume final3 ce. Incubation 20 min. à 38° C.
7.5 pH
FIGURE 5
Effet du pH
Le milieu d'incubation contient : solution enzymatique (ppté. HC1 neutralisé) ;ATP 0,001 M. ; Mg++ 0,0033 M. ; thiamine 2 y par essai ; tampon phosphate de
K 0,0066 M. de pH différents. Volume final 3 ce. Incubation 20 min. à 38° C.
47
entre 15 et 20 //M. de Mg par essai. 30 /uM. ont une action légèrementinhibitrice. Le rôle des ions Mg++ lors de la transphosphorylation est
encore peu clair. Le Mg semble être indispensable pour toutes les réac¬
tions nécessitant de l'ATP.
e) Effet du pH du milieu et du temps d'incubation.
La figure 5 montre l'activité de la synthèse en fonction du pH du
milieu d'incubation. Ce dernier a été mesuré au moyen de l'électrode
de verre avant et après l'incubation. L'activité de la synthèse est optimaleà un pH de 6,8 à 6,9.
Dans nos conditions d'expérience, c'est-à-dire en présence de 2 y de
thiamine, la formation de la cocarboxylase est en général achevée après20 minutes d'incubation. Ce temps augmente considérablement si l'on
veut phosphoryler quantitativement 5 y de thiamine (tableau 5). La pré¬sence de la cystéine (60 juM. par essai) ou du NaCN (160 /<M. par essai)dans le milieu d'incubation n'a aucun effet stimulateur ou inhibiteur sur
l'activité de l'enzyme.
TABLEAU 5
Le milieu contient : solution enzymatique (ppté. HC1) ; ATP 0,001 M. ;
Mg++ 0,0033 M. ; 5 7 de thiamine par essai ; tampon phosphate de K de pH 7,4
0,0066 M. Volume final 3 ce. Incubation à 38° C.
Temps d'incubation Cocarboxylase formée
en minutes en y
20 1,3240 2,2060 2,3390 3,30
120 5,43
f) Variation de la concentration de l'enzyme.
La figure 6 montre la phosphorylation de la thiamine en fonction
de la concentration de l'enzyme. La quantité de cocarboxylase formée
augmente jusqu'à ce que la quantité de thiamine présente devienne le
facteur limitant de la réaction. Dans l'expérience représentée par la
courbe supérieure, la phosphorylation complète de la thiamine est
atteinte avec une concentration de 0,210 mgr. N. (dosage selon Folin)
par essai. La courbe inférieure est obtenue avec une solution enzymatiqueun peu moins active.
48
0.1 0,2 0,3 0.4 mgN
FIGURE 6
Concentrations variables de la solution enzymatique
Le milieu d'incubation contient : quantités variables de la solution enzymatique(ppté. HCl). ATP 0,001 M. ; MgH + 0,0033 M. ; thiamine 2 y par essai ; tampon
phosphate de K 0,0066 M. de pH 7,4. Volume final 3 ce. Incubation 20 min. à 38° C.
La courbe supérieure correspond à une solution enzymatique plus pure (0.21 mgr. N/cc.)
que la courbe inférieure (0,42 mgr. N/cc).
g) Mécanisme de la synthèse.
La phosphorylation enzymatique de la thiamine en présence de
FATP peut s'effectuer de deux manières différentes :
1. Par l'addition successive de deux restes phosphoryl, en passant
par une substance intermédiaire, le monophosphate de la
thiamine.
ATP + thiamine > thiamine monophosphate + ADP
ATP + thiamine monophosphate cocarboxylase + ADP
en résumé :
2 ATP + thiamine cocarboxylase + 2 ADP.
2. Par addition d'un groupe pyrophosphate.
ATP + thiamine > cocarboxylase + AMP
(ADP = adénosine diphosphate ; AMP= adénosine monophos¬
phate).
i 49
L'ADP qui possède encore un reste phosphoryl labile, ne peut pas
fonctionner comme donateur de phosphate. Il a au contraire une action
fortement inhibitrice (tableau 6, exp. II). Il s'agit très probablementdune substitution dans le complexe enzymatique de l'ADP à l'ATP
(« compétitive inhibition »), car la structure de l'ADP est très semblable
à celle de l'ATP. Cette inhibition est fonction de la quantité d'ADP
présente. En remplaçant l'ATP par l'ADP, nous n'obtenons qu'une très
faible formation de cocarboxylase et ceci même avec 10 juM. d'ADP quicontiennent autant de P labile que 5 fiM. d'ATP (tableau 6, exp. III).L'AMP ne contenant aucun P labile a également un effet inhibiteur sur
la phosphorylation de la thiamine (tableau 6, exp. IV). L'action inhibi¬
trice de l'AMP est cependant plus faible que celle de l'ADP. Cette cons¬
tatation est en plein accord avec notre hypothèse selon laquelle il s'agiraitd'un remplacement de l'adénosine de l'ATP dans le complexe enzyma¬
tique par les substances inhibitrices. La structure de l'ADP est plusproche de la structure de l'ATP que celle de l'AMP. Il faut donc s'at¬
tendre à ce que l'ADP possède pour l'enzyme une affinité plus forte
que l'AMP.
TABLEAU 6
Le milieu contient : solution enzymatique (ppté. HC1) ; MgT + 0,0033 M. ;
5 y de thiamine par essai, tampon phosphate de K 0,0066 M. de pH 7,4. Volume
final 3 ce. Les quantités d'ATP, d'ADP et d'AMP indiquées dans le tableau sont
celles contenues dans le volume final de 3 ce. Incubation 20 min. à 38° C.
Exp.
I
II
Additions y cocarboxylaseformée
5 «M. ATP
2,5 /uM. ATP1,50
1,02
5 fiM. ATP + 2,5 /M. ADP.
5 ^M. ATP + 5 /M. ADP.
5 fiM. ATP + 10 fiM. ADP .
0,590,37
0,27
III 2,5 fiM. ADP5 ^M. ADP
10 /uM. ADP
0,160,160.16
IV 4 fiM. ATP
4 fiM. ATP + 0,5 /M. AMP.
4 ,«M. ATP + 2 fiM. AMP .
6 /M. ATP
6 /M. ATP + 2 (M. AMP.
2,00
1,831,52
2,20
1,72
50
Si le monophosphate de la thiamine était un produit intermédiaire
dans la formation de la cocarboxylase, celui-ci devrait pouvoir remplacerla thiamine. Le tableau 7 montre que si nous substituons la thiamine-
monophosphate * à la thiamine, on ne trouve qu'une faible synthèse de
cocarboxylase. Il est donc peu probable que la thiamine-monophosphatesoit l'étape intermédiaire dans la formation de la cocarboxylase. On
devrait s'attendre, dans ce cas, à ce que le monophosphate soit transformé
en cocarboxylase avec la même vitesse que la thiamine. La faible synthèse
que nous avons constatée, peut être due à une hydrolyse partielle de
la thiamine-monophosphate en donnant de la thiamine. Weil-Malherbe u,dans ses expériences avec l'enzyme de levure, avait trouvé une périoded'induction plus longue, c'est-à-dire une vitesse de synthèse plus faible,en substituant la thiamine-monophosphate à la thiamine. D'autre part,la formation de la cocarboxylase est légèrement inhibée par l'addition
de la thiamine-monophosphate.
TABLEAU 7
Mêmes conditions que celles indiquées pour le tableau 6. TMP = thiamine-
monophosphate.
Additions }' cocarboxylase formée
5 y TMP 0,20
5 y TMP + 5 <uM. ATP .... 0,56
5 y TMP + 5 fM. ATP + 5 y thiamine 1,52
5 y thiamine + 5 /M. ATP. . .
2.33
Au cours de la synthèse, il se forme selon la première hypothèsede l'ADP et selon la seconde de l'AMP. Comme nous travaillons en
présence d'un très grand excès d'ATP par rapport à la thiamine, la
quantité d'ADP ou d'AMP formée, par transphosphorylation, est du même
ordre de grandeur que celle formée par hydrolyse spontanée de l'ATP
au cours de l'expérience. Pour cette raison, il n'est pas possible de
prouver l'une ou l'autre des hypothèses par recherche des produits de
dégradation de l'ATP. D'après nos constatations, nous tirons la conclu¬
sion que la phosphorylation de la thiamine s'effectue par le transport
d'une molécule de pyrophosphate.
* La substance a été mise obligeamment à notre disposition par le professeurM. Viscontini.
51
H3C-CIIN
CH
C - CH2 - N
C-NH2
IH3C-C
IIN
CH
IC-CHo-N
CH3IC = C - CH2-CH2 OH
C - s
H
OH OH ! OHI I
HO-P-O-P-O-P-O-adénosine
O O O
I
CH3 OH OH OH
! I IC = CCH0-CH2-O-P-O-P = 0 + 0 = P-O-adénosine
Il II IO OH OH
Il XC-NH-> C - S
H
h) Phosphorylation de la dihydrothiamine.
Nous avons étudié la phosphorylation de la dihydrothiamine, qui a
été récemment synthétisée par Karrer et Krishna 23 *:
N
ICH
H3C - C C - CH2 N
'I l
N - C - NH2
CH3
C = C CH2 CH2 OH
C
H2
En prenant comme système enzymatique l'extrait de la poudreacétonique, nous obtenons une faible synthèse de cocarboxylase à partirde la dihydrothiamine en présence d'ATP et de ions Mg++ (tableau 8,
exp. I). Elle représente environ le 40 % de la synthèse obtenue avec la
même concentration de thiamine. Avec une solution enzymatique telle
que « le précipité HCl », nous obtenons une synthèse variant entre 40
et 60 %, comparée à celle de la thiamine (tableau 8, exp. II). Comme
pour la thiamine, la formation de la cocarboxylase à partir de la dihy¬drothiamine est fonction de la concentration de l'enzyme présent
(tableau 8, exp. III).
* La substance a été obligeamment mise à notre disposition par le professeurP. Karrer.
52
TABLEAU 8
Le milieu contient : solution enzymatique ; ATP 0,001 M. ; Mg^
0,0033 M. ;
2 y de dihydrothiamine ou de thiamine par essai ; tampon phosphate de K 0,0066 M.
de pH 7,4. Volume final 3 ce. Incubation 20 min. à 38° C.
Exp.
I
II
III
Additions y cocarboxylaseformée
Extrait + dihydrothiamineExtrait + thiamine
.....
0,89
1,30
1,88
Ppté. HC1 + dihydrothiamine .
Ppté. HC1 + dihydrothiamine sans ATP
Ppté. HC1 + thiamine....
0,45
0,00
0,95
0,5 ce. ppté. HC1 + dihydrothiamine1,0 ce. ppté. HC1 + dihydrothiamine1,5 ce. ppté. HC1 + dihydrothiamine
1,0 ce. ppté. HC1 + thiamine.
0,50
0,60
0,78
1,14
L'étude de la phosphorylation dans des conditions anaérobies et
aérobies, avec et sans cystéine, montre que la quantité de cocarboxylaseformée est plus forte en présence d'oxygène et en l'absence de cystéine.Il semble qu'une certaine quantité de dihydrothiamine est toujours oxydéeen milieu aqueux (tableau 9). La quantité d'oxygène nécessaire pour
TABLEAU 9
Le milieu contient : solution enzymatique (ppté. HC1) ; ATP 0,001 M. ;
Mg'+ 0,0033 M. ; 2 y de dihydrothiamine par essai ; cystéine 0,0032 M. ; tampon
phosphate de K 0,0066 M. de pH 7,4. Volume final 3 ce. Incubation 20 min. à 38° C.
Les essais sont effectués dans des fioles de Warburg. La dihydrothiamine ainsi que
la cystéine sont placées dans l'appendice. Pour les essais en milieu anaérobie on placedans le tube central de la fiole du phosphore et l'air est chassé par un courant d'azote.
Le contenu de l'appendice est ajouté au milieu d'incubation lorsque les conditions
anaérobies sont atteintes.
Anaérobie
Additions y cocarboxylaseformée
Dihydrothiamine sans cystéineDihydrothiamine avec cystéine
0,39
0,40
Aérobie Dihydrothiamine sans cystéineDihydrothiamine avec cystéine
0,62
0,42
0,98
53
l'oxydation de cette petite quantité de dihydrothiamine est très faible
(pour 1 7 il faut 4.10-8 ce. d'C^). Il est évidemment impossible d'avoir
des conditions anaérobies suffisamment rigoureuses pour éviter toute
oxydation de la substance.
i) Purification de l'enzyme hépatique.
Afin d'obtenir une solution enzymatique plus pure, nous avons
continué à fractionner la solution protéique « précipité HCl » par des
précipitations successives avec une solution de (NH4) 9SO4 saturée
à 0° C.
A 17 ce. de la solution « précipité HCl » on ajoute 12,8 ce. de
(NH4) 2SO4 sat. (saturation finale de 43 %). Ce précipité est inactif et
nous l'éloignons par centrifugation. Au surnageant nous ajoutons 26,9 ce.
de (NH4) 2SO4 sat., ce qui porte la saturation finale à 70 %. Le précipitéest récolté par centrifugation et dissout dans 10 ce. de tampon phosphate0,004 M. de pH 7,1. Cette solution enzymatique est active et nous l'ap¬pelons « précipité 43-70 % I ». A 7,5 ce. de cette solution protéique,nous ajoutons 10 ce. de (NH4) 2SO4 sat. (saturation finale de 57 %). Le
précipité est éloigné par centrifugation. Au surnageant on ajoute de
nouveau 10 ce. de (NH4) 2SO4 sat. (saturation finale 73 %). Après cen¬
trifugation le précipité est dissout dans 3 ce. de tampon phosphate0,004 M. de pH 7,1. Nous appelons cette fraction « précipité 57-73 % II ».
Le tableau 10 montre l'activité des différentes solutions enzyma-
tiques. L'activité moyenne de synthèse du « précipité 57-73 % II » est
de 18 à 23 7 de cocarboxylase par mgr. N. protéique. Cette fraction
enzymatique est la plus pure que nous ayons obtenue jusqu'à maintenant.
Nous avons un enrichissement de l'activité enzymatique de 50 à 60 fois
comparée à celle de l'homogénat complet.
TABLEAU 10
Le milieu d'incubation contient : solution enzymatique ; ATP 0,00166 M. ;
Mg++ 0,0033 M. ; thiamine 5 y par essai ; tampon phosphate de K 0,0066 M. de pH 7,1.
Volume final 3 ce. Incubation 20 min. à 38° C.
Additions y cocarboxylaseformée par essai
Activité
Ppté. HCl seul
Ppté. HCl + thiamine....
Ppté. 43 - 70 % I seul ....
Ppté. 43-70 % I + thiamine.
Ppté. 57 - 73 % II seul....
Ppté. 57 - 73 % II 4 thiamine
0,00
2,22
0,00
2,26
0,00
2,86
7,8
16
24
54
IV. Sommaire
1. Nous avons décrit une méthode permettant de préparer, à partird'une poudre sèche de levure de bière, une solution enzymatiquequi contient Fapoferment de la décarboxylase de l'acide pyruvique.Au moyen de cette solution enzymatique, il est possible, dans des
conditions appropriées, de doser d'une manière indirecte des quan¬
tités variant de 1/100 à 1/5 de y de cocarboxylase.
2. Cette solution enzymatique est très active et relativement instable.
En présence d'un excès de cocarboxylase nous obtenons environ
700 ce. de CO2 par minute par mgr. N. protéique. Cette préparationenzymatique ne contient plus de transphosphorylase. De ce fait, il
est possible de doser de faibles quantités de cocarboxylase en pré¬sence de thiamine et d'ATP.
3. Nous avons étudié la synthèse de la cocarboxylase à partir de la
thiamine, en présence d'ATP, dans l'homogénat de foie de rat.
L'enzyme hépatique provoquant la transphosphorylation est une
protéine soluble, assez stable.
4. Nous développons une méthode permettant d'obtenir une solution
enzymatique hépatique très active, ne contenant plus de cocarboxy¬lase préformée. C'est en présence de cette solution enzymatiqueque nous avons étudié la synthèse biologique de la cocarboxylase.
5. La phosphorylation de la thiamine nécessite la présence de l'ATP
et de ions Mg++. La phosphorylation de 2 y de thiamine est totale
après 20 minutes d'incubation à 38° C, en présence d'une solution
enzymatique contenant au moins 0,240 mgr. N. protéique. Le pHoptimum se trouve entre 6,8 et 6,9.
6. L'étude du mécanisme de la phosphorylation de la thiamine est
discutée. L'ADP ne fonctionne pas comme donateur de phosphate.La phosphorylation par l'ATP, du corps intermédiaire hypothétique,la thiamine monophosphate, est très faible. L'AMP a un effet
inhibiteur beaucoup plus faible que l'ADP. De nos expériences, nous
tirons la conclusion que la phosphorylation de la thiamine s'effectue
par le transport d'une molécule de pyrophosphate de l'ATP sur la
thiamine.
55
7. Nous avons étudié la phosphorylation enzymatique de la dihydro-thiamine synthétique en milieu aérobie et anaérobie en présenced'ATP et de ions Mg~t" +. Nous avons obtenu une synthèse de cocar-
boxylase variant entre 40 et 60 %, par rapport à la synthèse à
partir de la thiamine.
8. L'enzyme hépatique a encore été purifié par fractionnement de la
solution protéique avec une solution de (NH4) 2SO4 sat. La fraction
la plus pure a une activité de synthèse de 24 y de cocarboxylasepar mgr. N. protéique. Nous avons ainsi augmenté de 50 à 60 fois
l'activité enzymatique par rapport à celle de l'homogénat complet.
Physiologisch-chemisches Institut der Universitàt,Zurich, Januar 1951.
56
CURRICULUM VITAE
De nationalité danoise, je suis né le 6 octobre 1918 à Sœrabaja, en
Indonésie, où j'ai vécu onze années. En 1930, je suis entré à l'Ecole Privât
à Genève. Faute de bases solides, j'ai dû quitter cette école en 1931 pour
l'Institut G. Rauch à Genève, où je me suis préparé pour les examens
d'entrée au Technicum de Genève. J'ai réussi ces examens en automne
1934. En 1936, des raisons majeures ont obligé mes parents à quitterla Suisse, et j'ai dû les suivre. Je suis entré alors provisoirement au
Loughborough Collège en Angleterre.Au printemps 1937, j'ai quitté l'Angleterre pour la Suisse et suis
entré à l'Ecole Lémania à Lausanne, pour y préparer la maturité fédérale
type C. J'ai passé ces examens en 1940, session de Fribourg. Les semestres
de l'Ecole Polytechnique Fédérale ne commençant qu'en automne, je me
suis fait immatriculer pour le semestre d'été à l'Université de Lausanne,à la Faculté des Sciences.
En automne 1940, je me suis fait immatriculer à l'E. P. F. à la section
de chimie. Au printemps 1945, j'ai obtenu le diplôme d'ingénieur-chimistede l'E. P. F.
Au début de l'année 1946, j'ai fait, pendant quelques mois, un
remplacement comme professeur de branches scientifiques, dans un
internat 4e Villars-sur-Ollon.
En automne 1946, j'ai été engagé comme assistant non officiel et
collaborateur scientifique par M. le Professeur Leuthardt, Directeur de
l'Institut de Chimie physiologique de la Faculté de Médecine de l'Uni¬
versité de Genève. En automne 1947, M. le Professeur Leuthardt ayant
été nommé directeur de l'Institut de Chimie physiologique de l'Université
de Zurich, je l'y ai suivi, et, jusqu'au printemps 1951, j'ai travaillé dans
cet institut en qualité de collaborateur scientifique. Mes travaux ont
porté surtout sur la recherche du métabolisme de l'azote et sur les
vitamines.
De 1948 au printemps 1951, j'ai eu le privilège de pouvoir travailler
à cette thèse, que j'ai présentée au printemps 1951 à la section de chimie
de l'E. P. F.
A partir de cette date, j'occupe un poste d'ingénieur dans l'industrie.
57
BIBLIOGRAPHIE
PREMIERE PARTIE
1 Friedrich Miescher, Die Histochemischen und physiologischen Arbeiten, F. C. Vogel,Leipzig 1897.
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H. Nielsen, Helv. Chim. Acta 32, 744 (1949).4 A. Claude, Cold Spring Harbor Symposia on Quant. Biol. 9, 263 (1941) ; J. Exp.Med. 80, 19 (1944), 84, 51, 61 (1946).
5 K. Stern, Cold Spring Harbor Symposia on Quant. Biol. 7, 312 (1939).6 H.Chantrenne, Biochim. Biophys. Acta 1, 437 (1947).1 ]. Brochet et R. Jeener, Enzymol. JJ, 196 (1943).8R. Altmann, Studien ûber die Zelle, Veit et Comp., Leipzig 1886.9 G. Hertwig, Mollendorfs Handbuch der Histologie.
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58
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43H. Wilson et R.K. Cannan, J. Biol. Chem. 119, 309 (1937).44R. Krueger, Helv. Chim. Acta 32, 238 (1949).45 B. Alexander, G. Landwehr et XM. Seligman, J. Biol. Chem. 760, 51 (1945).
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Chem. 149, 217 (1943).50 H. Nielsen et F. Leuthardt, Helv. Physiol. Acta 7, C 53 (1949).51 P. J. Fodor, V.E. Price et J.P. Greenstein, 3. Biol. Chem. 180, 193 (1949).
52R. Consden, A.H. Gordon et A. J.P. Martin, Biochem. J. 38, 224 (1944).
53CE. Dent, Biochem. J. 43, 169 (1948).54 J. Awapara, Arch. Biochem. 19, 172 (1948).
DEUXIEME PARTIE
1 D. E. Green, W. W. Westerfeld, B. Vennesland et W. E. Knox, J. Biol. Chem. 140,
683, (1941).2 H. A. Krebs, Adv. in Enzymol. 3, 24 (1943).
3D.E. Green, D. Herbert et F. Subrahmanyan, J. Biol. Chem. 135, 795 (1940).
'K. Lohmann et P. Schuster, Biochem. Zschr. 294, 188 (1937).3 H. G. K. Westenbrink, P. E. Steyn Partie, A. C. van der Linden et W. A. van den
Brock, Z. Vitaminforschg. 13, 218 (1943).
eH.V. Euler et R. Festin, Naturwiss. 35, 416 (1937).
iR.S. Goodhart et H.Jtf. Sinclair, Biochem. J. 23, 1099 (1939).8 H. Toufter, J. Biol. Chem. 123, 499 (1938).9 S. Ochoa et R.A. Peters, Nature 142, 356 (1942).10 S. Ocfcoa, Biochem. J. 33, 1262 (1939).11 M. X Lipton et C.^. Elvehjem, J. Biol. Chem. J36, 637 (1940).12 M. Weil-Malherbe, Biochem. J. 33, 1997 (1939).
i3Nguyen van Thoai et L. Chevillard, Bull. Soc. Chim. Biol. 31, 204 (1949).
14E. Auhagen, Naturwiss. 19, 916 (1931).13 F. Axmacher et H. Bergstermann, Biochem. Zschr. 272, 259 (1934).16 O. IFarèurg et W. Christian, Biochem. Zschr. 298, 368 (1938).
17D.E. Green, D. Herbert et V. Subramanyan, J. Biol. Chem. 138, 327 (1941).
18F. KubowUz et JV. LUttgens, Biochem. Zschr. 307, 170 (1941).
19O. Folin et F. Ciocalteu, J. Biol. Chem. 73, 627 (1927).20 V.R. Potter et C.A. Elvehjem, J. Biol. Chem. 114, 495 (1936).^ ti iViBiscii' vide Diss S22 A.F. Millier et F. Leuthardt, Helv. Chim. Acta 32, 2349 (1949).23 P. Korrer et H. Krishna, Helv. Chim. Acta 33, 555 (1950).
59
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TABLE DES MATIERES
PREMIERE PARTIE
Synthèse biologique de l'acide hippurique
Introduction 9
I. Généralités 11
a) Les fonctions chimiques des mitochondries du foie 11
b) Rôle de la formation de l'acide hippurique 13
c) Synthèse de l'acide hippurique 14
d) Formation de la glycine 15
II. Partie expérimentale 16
a) Matériel 16
b) Préparation des suspensions enzymatiques 16
c) Incubation .............18
d) Extraction de l'acide hippurique ......... 18
e) Dosage de la glycine 19
III. Résultats et discussion .19
a) Conditions de synthèse. Dépendance de l'ATP 19
b) Localisation de la synthèse 21
c) Effet des fractions dialysées .23
e) Analyse chromatographique du dialysat, du surnageant et du «Kochsaft» 26
f) Influence de la concentration de la glycine 30
g) Synthèse de la glycine à partir d'autres acides aminés .... 31
h) Inhibition de la synthèse de l'acide hippurique par un facteur hépatique 33
IV. Sommaire 34
61
DEUXIEME PARTIE
La phosphorylation biologique de la thiamine
I. Généralités 35
a) Rôle physiologique de cocarboxylase 35
b) Phosphorylation de la thiamine 35
c) Méthodes de dosage de la cocarboxylase 37
II. Partie expérimentale 38
a) Matériel et conditions d'expérience 38
b) Dosage enzymatique de la cocarboxylase 38
1. Préparation de la solution enzymatique 39
2. Dosage manométrique 39
3. Purification de Papoferment de la décarboxylase .... 40
4. Dosage des protéines 42
III. Résultats et discussion 43
a) Conditions de la synthèse dans le tissu hépatique 43
b) Localisation de la synthèse 43
c) Elimination de la cocarboxylase préformée 45
d) Influence de l'ATP et des ions Mg++ 47
e) Effet du pH du milieu et du temps d'incubation 48
j) Variation de la concentration de l'enzyme 48
g) Mécanisme de la synthèse 49
h) Phosphorylation de la dihydrothiamine 52
i) Purification de l'enzyme hépatique 54
IV. Sommaire 55
Curriculum vitae 57
Bibliographie 58
62
