Embed Size (px)
Citation preview
i
LAPORAN KEMAJUAN PROGRAM KREATIVITAS MAHASISWA
CA-NEURO (Centella asiatica Extract Phytosome as Neuroprotector):
OPTIMALISASI HERBAL DELIVERY SYSTEM EKSTRAK PEGAGAN SEBAGAI
MODULATOR NEUREGULIN-1 (NRG-1) PADA OLIGODENDROSIT TIKUS
MODEL TRAUMATIC BRAIN INJURY (TBI) MENGGUNAKAN TEKNOLOGI
PHYTOSOME
BIDANG KEGIATAN :
PKM - PENELITIAN
Diusulkan oleh:
Putri Fitri Alfiantya 115070107111061 Angkatan 2011
Oktavia Rahayu Adianingsih 105070500111029 Angkatan 2010
Zulkarnaen 105070500111023 Angkatan 2010
Alif Fariz Jazmi 125070107111051 Angkatan 2012
Sitti Ayu Hemas Nurarifah 125070100111093 Angkatan 2012
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2014
ii
iii
RINGKASAN
Sistem saraf pusat merupakan pusat kendali tubuh mulai dari mengendalikan dan
menanggapi perubahan lingkungan sampai mengatur semua proses vital tubuh. Pada tingkat
dasar, fungsi sistem saraf sebagai pengirim sinyal dari satu lokasi tubuh ke lokasi yang
lainnya. Sistem saraf mayoritas terdiri dari neuron dan glia, neuron berfungsi mengirimkan
informasi ke seluruh tubuh dalam bentuk sinyal listrik di sepanjang akson. Oligodendrosit
yang merupakan salah satu jenis glia pada sistem saraf pusat berfungsi menghasilkan
membran kaya lipid yang disebut mielin yang membungkus akson sebagai isolator. Mielin
dapat meningkatkan kecepatan konduksi listrik pada akson, jika terdapat kerusakan mielin
atau penurunan mielin maka akan menghambat proses konduksi listrik pada akson tersebut
sehingga fungsi pengendalian tubuh akan terganggu.
Ada beberapa gangguan sistem saraf pusat, seperti pada penyakit Parkinson,
Alzheimer, dan Traumatic Brain Injury (TBI). TBI merupakan gangguan sistem saraf pusat
yang disebabkan oleh trauma kepala yang serius. Di Indonesia, tepatnya di DKI Jakarta,
tercatat 53.4% korban kecelakaan mengalami cedera parah terutama pada bagian kepala.
Pada TBI terjadi apoptosis oligodedrosit dan kerusakan akson yang dapat menurunkan
sintesis protein neuregulin-1 (NRG-1) yang berperan dalam pembentukan mielin. Untuk itu
diperlukan terapi untuk meningkatkan NRG-1 untuk mengembalikan fungsi akson.
Salah satu tanaman herbal di Indonesia, yaitu Pegagan (Centella asiatica)
mengandung glikosida saponin triterpenoid yang secara etnomedicine sering digunakan untuk
berbagai macam pengobatan, salah satunya sebagai neuroprotektor. Namun, hingga saat ini
belum ada penelitian mengenai efek neuroprotektif pegagan terhadap peningkatan ekspresi
NRG-1 pada TBI, sehingga diperlukan penelitian lebih lanjut mengenai hal ini. Komponen
fitokimia yang terkandung pada ekstrak pegagan cenderung bersifat polar sehingga
diperlukan cara untuk memodifikasi kepolaran dari ekstrak dengan cara memformulasikan
ekstrak dalam bentuk phytosome sebagai herbal delivery system sehingga dapat
meningkatkan absorbsi dan bioavailabilitas zat aktif obat serta cocok untuk sistem
penghantaran senyawa aktif dari tanaman karena dapat membawa senyawa hidrofil dan
lipofil dari tanaman.
Tujuan penelitian ini adalah membuktikan efektivitas phytosome sebagai optimalisasi
herbal delivery system ekstrak Pegagan sebagai neuroprotektor yang ditandai dengan
peningkatan ekspresi NRG-1 dan perbaikan tingkat mielinasi neuron. Pegagan diekstraksi
menggunakan metode maserasi dengan pelarut etanol 70% selama 24 jam dengan re-maserasi
3 kali. Phytosome ekstrak pegagan diformulasikan menggunakan metode sonikasi dan
dilakukan karakterisasi menggunakann spektroskopi KLT, LC/MS-MS dan SEM. Penelitian
ini dilakukan dengan menggunakan hewan coba tikus wistar sebanyak 32 ekor. Tikus
diinduksi TBI menggunakan tabung silinder besi 45 gram yang dijatuhkan ke bagian kepala.
Hewan coba dibagi menjadi 8 kelompok perlakuan, yaitu kelompok kontrol negatif, kontrol
positif, 3 kelompok perlakuan yang diberi ekstrak Pegagan, dan 3 kelompok perlakuan diberi
phytosome ektrak Pegagan dengan dosis masing-masing kelompok adalah 90 mg/kgBB, 180
mg/kgBB, dan 360 mg/kgBB. Setelah itu dilakukan pemeriksaan histologi untuk mengukur
ketebalan mielin dengan pewarnaan Hematoksilin-Eosin (HE) dan pengukuran ekspresi
neuregulin-1 (NRG-1) dengan immunohistokimia. Kemudian data dianalisis menggunakan
program IBM SPSS Statistic 20 dengan tingkat signifikansi 0,05 (p = 0.05) dan tingkat
kepercayaan 95% menggunakan uji One-Way ANOVA.
Kata kunci: TBI, neuregulin-1 (NRG-1), phytosome, mielinasi, Centella asiatica
iv
DAFTAR ISI
Halaman Sampul .................................................................................................................... i
Halaman Pengesahan............................................................................................................. ii
Ringkasan ............................................................................................................................... iii
Daftar Isi ................................................................................................................................. iv
I. PENDAHULUAN
1. Latar Belakang Masalah .............................................................................................. 1
2. Rumusan Masalah ......................................................................................................... 2
3. Tujuan Penulisan .......................................................................................................... 2
4. Luaran yang Diharapkan...............................................................................................2
5. Kegunaan Program………………………………………………………….………....2
II.TINJAUAN PUSTAKA
1. Sistem Saraf ................................................................................................................... 2
2. Traumatic Brain Injury (TBI) ...................................................................................... 2
3. Neuregulin-1 (NRG-1) .................................................................................................. 3
4. Pegagan (Centella asiatica). .......................................................................................... 3
5. Phytosome ....................................................................................................................... 4
III. METODE PENELITIAN
1. Kerangka Konsep Penelitian ........................................................................................ 4
2. Rancangan Penelitian ................................................................................................... 5
3. Variabel Penelitian ........................................................................................................ 5
4. Sampel Penelitian .......................................................................................................... 5
5. Tempat Penelitian ......................................................................................................... 6
6. Definisi Operasional ...................................................................................................... 6
7. Alat dan Bahan………………………………………………………………………....6
8. Prosedur Penelitian
1.Perawatan Hewan Coba.............................................................................................. 6
2.Ekstraksi Pegagan ........................................................................................................6
3.Pembuatan Phytosome Ekstrak Pegagan .................................................................... 6
4.Induksi Traumatic Brain Injury (TBI) ........................................................................ 6
5.Pembuatan Preparat Histopatologi Jaringan Otak, Pewarnaan Hematoksilin-Eosin
(HE) dan Pengukuran Ketebalan Mielin ................................................................... 7
6. Pemeriksaan Ekspresi Neuregulin-1 (NRG-1) .......................................................... 7
v
9. Prosedur Pengumpulan dan Analisis Data ................................................................. 7
BAB IV. HASIL YANG DICAPAI....................................................................................... 7
1. Kemajuan Pekerjaan.......................................................................................................7
1. Identifikasi Senyawa Asiatikosida dalam Ekstrak Etanol 70% Pegagan .................... 7
2. Penetapan Kadar Asiatikosida Pada Ekstrak……………………………..…………..8
3. Visualisasi Partikel Menggunakan Scanning Electron Microscopy (SEM)……...8
4. Pembuatan Slide Imunohistokimia ………..……………..…………………………....8
2. Ketercapaian Target Luaran………………………......................................................9
BAB V. RENCANA KEGIATAN SELANJUTNYA .......................................................... 9
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................................. 9
LAMPIRAN – LAMPIRAN
Lampiran 1. Penggunaan Dana ........................................................................................... vi
Lampiran 2. Dokumentasi Kegiatan…………..……………...…………………………..viii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1 Aktivasi NRG-1 dan sintesis mielin ................................................................... .3
Gambar 2.2 Pegagan............................................................................................................... .3
Gambar 2.3 Struktur Kimia Glikosida Saponin Triterpenoidpada Pegagan .......................... .4
Gambar 2.4.Perbedaan Struktur Liposome danPhytosome .................................................... .4
Gambar 3.1 Kerangka Konsep Penelitian.................................................................................4
Gambar 3.2 Rancangan Penelitian secara in vivo.....................................................................5
Gambar 4.1 Plat Hasil KLT pada UV 365 dan secara visual...................................................7
Gambar 4.2 Kromatogram LC dan Fragmentasi Spektra MS/MS Phytosome......................8
Gambar 4.3 Visualisasi Bentuk dan Ukuran Partikel Phytosome…………............................8
Gambar 4.4 (A)Induksi TBI(B)Pengecatan IHK untuk Pemeriksaan NRG-1(C)Slide IHK..9
1
BAB I. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Masalah
Trauma kepala sebagian besar berdampak serius pada sistem saraf pusat yang dikenal
dengan istilah Traumatic Brain Injury (TBI) (Jorge et al., 2005). Menurut Brain Trauma
Foundation tahun 2007, TBI paling banyak disebabkan oleh kecelakaan kendaraan bermotor,
cedera ketika berolahraga, atau akibat terjatuh. Di Indonesia sendiri, tepatnya di DKI Jakarta,
tercatat 53,4% korban kecelakaan mengalami cedera parah terutama pada bagian kepala
(Riyadina et al., 2009).
Penatalaksanaan pasca TBI sangatlah komplek, yang meliputi rehabilitasi kognitif,
emosional, dan sosial (Block and West, 2013). Penurunan kognitif, sosial, dan emosional
dapat dikaitkan dengan inflamasi saraf persisten dan cedera penumbra pada keadaan pasca
TBI (Tobinick et al.,2012). Gangguan perilaku akibat TBI disebabkan oleh cedera akson
sehingga terjadi kerusakan mielin dan atau hilangnya oligodendrosit yang dapat menghambat
transduksi sinyal dan mengurangi integritas akson, apoptosis oligodendrosit, dan peningkatan
jumlah sel progenitor oligodendrosit. Kerusakan akson menyebabkan penurunan sintesis
protein neuregulin-1 (NRG-1) yang berperan dalam pembentukan mielin oleh oligodendrosit
sehingga pada kondisi TBI tidak terjadi pembentukan mielin (Calaora et al., 2001). Modulasi
NRG-1 pada TBI akan menurunkan gangguan fungsi akibat kerusakan mielin dan dapat
menjadi sasaran terapi baru untuk TBI (Flygt J., 2013).
Pegagan (Centella asiatica) merupakan tanaman yang sangat sering ditemui di semua
wilayah di Indonesia. Secara etnomedicine, Pegagan sering digunakan untuk pengobatan
berbagai macam penyakit, terutama sebagai wound healing dan neuroprotektor dengan
kandungan fitokimia glikosida triterpenoid saponin, yaitu asiaticoside, asiatic acid,
madecassoside dan madecasic acid (Alfarra and Omar, 2013). Namun, komponen fitokimia
tersebut cenderung bersifat polar sehingga diperlukan cara untuk memodifikasi kepolaran
dari ekstrak dengan cara memformulasikan ekstrak dalam bentuk phytosome. Phytosome
adalah teknologi terbaru dalam formulasi obat herbal yang dikembangkan untuk memperbaiki
farmakokinetika bahan aktif obat herbal yang merupakan pengembangan dari produk herbal
konvensional dengan mengikat komponen ekstrak tanaman herbal dengan fosfatidilkolin
sehingga dapat dihasilkan produk yang mempunyai tingkat absorbsi yang lebih baik daripada
ekstrak herbal konvensional (Sharma and Roy, 2010).
Hingga saat ini, belum ada penelitian mengenai efek neuroprotektif Pegagan terhadap
peningkatan ekspresi NRG-1 pada TBI sehingga kami mencoba memberikan alternatif
pendekatan terapi TBI yang efektif dengan membuat suatu rancangan formulasi sediaan
2
phytosome ekstrak Pegagan dalam upaya modifikasi herbal delivery system sebagai
modulator neuregulin-1 (NRG-1) dalam proses mielinasi neuron.
1.2 Rumusan Masalah
Rumusan masalah penelitian adalah apakah pemberian phytosome ekstrak pegagan
(Centella asiatica) mampu meningkatkan ekspresi neuregulin-1 (NRG-1) dan memperbaiki
tingkat mielinasi pada model tikus Traumatic Brain Injury (TBI).
1.3 Tujuan Program
Tujuan Umum
Membuktikan efektivitas phytosome dalam optimalisasi herbal delivery system ekstrak
Pegagan (Centella asiatica) sebagai neuroprotektor yang ditandai dengan peningkatan
ekspresi neuregulin-1 (NRG-1) dan perbaikan tingkat mielinasi neuron.
Tujuan Khusus
Mengetahui pengaruh pemberian phytosome ekstrak pegagan (Centella asiatica) terhadap
peningkatan ekspresi neuregulin-1 (NRG-1) dan peningkatan tingkat mielinasi oligodendrosit
pada model tikus TBI.
1.4 Luaran yang Diharapkan
Luaran yang diharapkan berupa publikasi dan HKI.
1.5 Kegunaan Program
Dapat dijadikan sebagai dasar teori tentang potensi phytosome ekstrak Pegagan sebagai
modulator NRG-1 dalam proses mielinasi neuron dan kegunaan teknologi phytosome sebagai
optimasi herbal delivery system untuk meningkatkan efek terapeutik dari sediaan obat.
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Sistem Saraf
Pada tingkat yang paling dasar, fungsi sistem saraf adalah untuk mengirim sinyal dari
satu lokasi tubuh ke lokasi lainnya. Sistem saraf terdiri dari neuron dan glia. Neuron
mengirimkan informasi ke seluruh tubuh dalam bentuk sinyal listrik di sepanjang akson
(badan sel) dan pelepasan neurotransmiter pada sinapsis. Pada sistem saraf pusat, jenis sel
glia utama adalah astrosit dan oligodendrosit. Oligodendrosit menghasilkan mielin, yaitu
membran kaya lipid yang membungkus akson dan berfungsi sebagai isolator listrik. Mielin
mengurangi kapasitansi melintasi membran dan meningkatkan hambatan listrik sehingga
meningkatkan kecepatan konduksi listrik pada akson (Darbas, 2004).
2.2 Traumatic Brain Injury (TBI)
TBI sering didefinisikan sebagai perubahan fungsi otak. yang bermanifestasi sebagai
kebingungan, tingkat kesadaran yang berubah, kejang, koma, dan / atau deficit sensoris fokal
atau motoris neurologis diakibatkan tekanan benda tumpul atau penetrasi benda tajam masuk
3
ke dalam kepala (Bruns and Hauser, 2003). Mekanisme utama dari TBI diklasifikasikan
sebagai kerusakan otak fokal atau kerusakan otak difus yang dapat mengakibatkan cedera
aksonal atau pembengkakan otak (Nortje, 2004).
2.3 Neuregulin-1 (NRG-1)
NRG merupakan protein signaling akson yang merupakan ligan dari reseptor tirosin
kinase ErBb yang berada pada oligodendrosit (Douglas, 2002). NRG-1 mengatur berbagai
aspek perkembangan oligodendrosit termasuk kelangsungan hidup dan migrasi prekursor
oligodendrosit serta fungsinya dalam proses mielinasi, yaitu mengontrol ketebalan selubung
mielin yang berkaitan dengan ukuran akson (Michailoc et al., 2004). Hilangnya NRG-1
menyebabkan remielinasi terganggu pada saraf yang mengalami kerusakan akibat cedera atau
trauma. NRG-1 merupakan faktor penting dalam perbaikan
fungsional saraf pada fase awal kerusakan saraf (Fricker et al.,
2013). NRG-1 akan mengaktifkan beberapa kaskade second
messenger antara lain: phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K),
MAPK pathways, focal adhesi kinase, dan Ca2+
(Taveggia et
al., 2010). Aktivasi berurutan PI3K–AKT/PKB (AKT1)-
mTOR kinase menyebabkan aktivasi gen mielin yang terkait
dalam inti sel oligodendrosit (Simon and Lyon, 2013).
2.4 Pegagan (Centella asiatica)
Taksonomi dari Pegagan (Centella asiatica) antara lain (Ross, 2005):
Kingdom : Plantae
Divisi : Spermathophyta
Subdivision : Angiospermae
Class : Dicotyledonae
Ordo : Umbilales
Family : Umbilaferae (Apiaceaea)
Genus : Centella
Species : Centella asiatica (L) Urban
Pegagan mengandung asiaticoside, thankuniside, isothankuside, madecassoside,
brahmoside, brahmic acid, madasiatic acid, hydrocotyline, mesoinositol, centellose,
carotenoids, garam mineral, zat pahit vellarine, dan zat samak (Kristina dkk, 2009). Pegagan
mampu melindungi kerusakan neuron melalui mekanisme antiinflamasi dan antioksidan
dengan meregulasi kadar kalsium intrasel untuk memicu terjadinya mielinasi (Husnul,2009).
Gambar 2.2 Pegagan
(Ross, 2005).
Gambar 2.1 Aktivasi NRG-1
dan sintesis mielin (Klaus, 2010)
4
Gambar 2.3 Struktur Kimia Glikosida Saponin Triterpenoidpada Pegagan(WHO, 1999).
2.5 Phytosome
Phytosome merupakan suatu teknologi yang dikembangkan dari pembuatan obat dan
nutraceutical, untuk menggabungkan ekstrak dari tanaman yang larut didalam fitokonstituen
ke dalam fosfolipid untuk membentuk kompleks molekul lipid (Jain et al., 2010).
BAB III. METODE PENELITIAN
3.1 Kerangka Konsep Penelitian
Saat terjadi trauma akan terjadi peningkatan ekspresi NRG-1 pada neuron akibat gaya
mekanik maupun gangguan supply darah dan oksigen. Ekstrak Pegagan akan meningkatkan
ekspresi NRG-1 yang akan memicu kaskade intraseluler untuk mengaktifkan protein
regulatory gene yang berakhir pada sintesis serabut mielin. NRG-1 akan berikatan dengan
reseptor ErbB pada oligodendrosit.
Gambar 2.4.Perbedaan Struktur
LiposomedanPhytosome(Acharya et al.,
2011).
Keuntungan dari phytosome antara lain dapat
meningkatkan kelarutan dari senyawa fitokonstituen
dalam lemak baik secara oral maupun secara topikal, dan
secara signifikan dapat meningkatkan manfaat
terapeutiknya. Selain itu juga dapat meningkatkan
absorbsi senyawa aktif dan dimana ikatan kimia antara
fosfatidilkolin dan fitokonstituen menunjukkan stabilitas
yang baik (Sharma and Roy, 2010).
Keuntungan dari phytosome antara lain dapat
meningkatkan kelarutan dari senyawa fitokonstituen
dalam lemak dan secara signifikan dapat meningkatkan
manfaat terapeutiknya. Selain itu juga dapat
meningkatkan absorbsi senyawa aktif dan dimana ikatan
kimia antara fosfatidilkolin dan fitokonstituen
menunjukkan stabilitas yang baik (Sharma and Roy,
2010).
Influx Ca2+ oligodendrosit
Sintesis Mielin
Aktivasi PI3K–AKT/PKB (AKT1)- mTOR kinase
Kerusakan saraf
Traumatic Brain Injury Ekstrak dan phytosome Pegagan
modulasi Peningkatan ekspresi NRG-1
Gambar 3.1 Kerangka Konsep Penelitian
Antiapoptosis, peningkatan GSH, mencegah
kerusakan mitokondria
Asiaticoside, madecacosside
5
3.2 Rancangan Penelitian
Penelitian ini menggunakan desain eksperimen murni (true experimental design) di
laboratorium secara in vivo menggunakan rancangan Randomized Post Test Only Controlled
Group Design. Desain penelitiannya adalah sebagai berikut:
Gambar 3.2 Rancangan Penelitian
Keterangan:
1. Kontrol negatif (n=4): tikus sehat tanpa diberikan perlakuan apapun.
2. Kontrol positif (n=4) : tikusdiinduksi TBI tanpa diberikan ekstrak dan atau phytosome
3. Perlakuan 1 (n=4) : tikus diinduksiTBI dan diberikan phytosomedosis 90 mg/kgBB.
4. Perlakuan 2 (n=4) : tikus diinduksiTBI dan diberikan phytosomedosis 180mg/kgBB.
5. Perlakuan 3 (n=4) : tikus diinduksiTBI dan diberikan phytosomedosis 360 mg/kgBB.
6. Perlakuan 4(n=4) : tikus diinduksiTBI dan diberikan ekstrak dosis 90 mg/kgBB.
7. Perlakuan 5(n=4) : tikus diinduksiTBI dan diberikan ekstrak dosis 180mg/kgBB.
8. Perlakuan 6(n=4) : tikus diinduksiTBI dan diberikan ekstrak dosis 360 mg/kgBB.
Pemberian ekstrak dan atau phytosome dilakukan 2 jam setelah induksi TBI. Ekspresi
NRG-1 diketahui melalui pemeriksaan imunohistokimia sedangkan pemeriksaan
histopatologis untuk melihat gambaran ketebalan mielin (Svenningsen and Dahlin, 2013).
3.3 Variabel Penelitian
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah dosis ekstrak dan phytosome ekstrak
Pegagan sedangkan variabel terikat adalah ekspresi NRG-1 dan ketebalan mielin neuron.
3.4 Sampel Penelitian
Berdasarkan rumus Federer, jumlah sampel tiap perlakuan minimal 4 ekor tikusn jadi
jumlah total tikus yang dibutuhkan sejumlah 32 ekor menggunakan simple random sampling.
Induksi Traumatic Brain Injury(TBI)
E3360
mg/kgBB
TikusRattus norvegicus Wistar jantan, usia4-5 bulan berat badan 300-400 g
Kontrol (-) Kontrol (+) Perlakuan 6 Perlakuan 5 Perlakuan 4 Perlakuan 3 Perlakuan 2 Perlakuan 1
Setelah
2 jam
Ketebalan mielin
P1 90
mg/kgBB
Ekspresi NRG-1
P2 180
mg/kgBB
P3 360
mg/kgBB
E1 90
mg/kgBB
E2 180
mg/kgBB
Pembedahan otak pada hari ke-7 (n=2)
6
3.5 Tempat Penelitian
Tempat penelitian yang digunakan adalah Lab. Biokimia FKUB, Lab. Patologi
Anatomi FKUB, Farmasetika FKUB, Farmakokinetika FKUB, Farmakologi FKUB, dan
LSIH UB.
3.6 Definisi Operasional.
1. Phytosome adalah gabungan ekstrak dari tanaman yang larut didalam
fitokonstituen dan fosfolipid untuk membentuk kompleks molekul lipid.
2. NRG-1 adalah growth factor yang mempengaruhi proses mielinasi oleh oligodendrosit.
3. Mielinasi adalah proses pembentukan selubung mielin neuron oleh oligodendrosit.
3.7 Alat dan Bahan
Bahan penelitian, yaitu ekstrak Pegagan dan phytosome ekstrak Pegagan, Povidon Iodin
10% 50cc, NaCl fisiologis, dan jaringan otak tikus untuk pemeriksaan histopatologis. Alat
penelitian adalah sebagai berikut: kandang; tempat minum, dan makanan tikus; peralatan
anestesi intraperitoneal; peralatan induksi TBI; timbangan; spuit; pipet hisap; pipet tetes;
mikropipet 10-100 µl dan 200-1000 µl dan tipnya; serta imunohistokimia kit.
3.8 Prosedur Penelitian
3.8.1 Perawatan Tikus
Tikus ditimbang dan dilakukan adaptasi selama satu minggu di dalam kandang
berukuran 30 x 20 cm, tiap kandang berisi 4 ekor tikus. Tikus diberi makan 1 kali sehari.
3.8.2 Ekstraksi Pegagan
Setiap 400 mg serbuk kering tanaman ditambahkan 500 ml etanol teknis dan dicampur
dalam maserator dengan penggojokan pelan selama 30 menit pada awal perendaman.
Campuran disimpan selama 1 hari. Setelah itu filtrat disaring dan pelarut diuapkan dengan
rotary evaporator (suhu 800C) (Adianingsih et al., 2013; Pramono dan Ajiastuti, 2004).
3.8.3 Pembuatan Phytosome
Pembuatan phytosome melalui metode sonikasi dengan mencampur lecithin, etanol
70%, ekstrak Pegagan, PEG dan natrium cholat, lalu distirer 3 jam dengan magnetig stirer
2000 rpm. Pelarut diuapkan lalu dihidrasi dengan aqua bebas CO2 kemudian disonikasi. Lalu
dilakukan karakterisasi menggunakan spektroskopi KLT, LC-MS/MS, dan SEM.
3.8.4 Induksi Traumatic Brain Injury (TBI)
Tikus dianestesi kemudian bulu kepala dicukur dan dibersihkan dengan alkohol 70%.
Kemudian kulit kepala dibuka. Silinder besi seberat 45 gram (diameter 4mm) dijatuhkan
dengan sudut 90º dari ketinggian 100 cm sebanyak 1 kali. Setelah itu kulit kepala tikus dijahit
kembali. 2 jam setelah induksi, 3 kelompok perlakuan diberi ekstrak Pegagan dan 3
kelompok perlakuan diberi phytosome ektrak Pegagan intraperitoneum. Setelah 1 minggu
pascatrauma diperiksa histopatologi jaringan otak dan imunohistokimia ekspresi NRG-1.
7
3.8.5 Pembuatan Preparat Histopatologi Jaringan Otak, Pewarnaan Hematoksilin-
Eosin (HE) dan Pengukuran Ketebalan Mielin
Jaringan otak difiksasi mengunakan formalin 10% selama 24 jam, dicuci dengan air
kran mengalir atau alkohol 90%, dan dilakukan tahap dehidrasi. Setelah itu, dilakukan tahap
pembeningan (clearing), pembenaman (impregnation), pengecoran (blocking), dan
pewarnaan HE. Pengamatan dilakukan menggunakan program Scan Dot Slide OlyVIA
pembesaran 20x obyektif pada delapan titik tiap slide.
3.8.6 Pemeriksaan Ekspresi Neuregulin-1 (NRG-1)
Sampel yang sudah diblok dengan parafin di deparafinisasi terlebih dahulu. Setelah
disimpan selama 24 jam dilakukan pengecatan IHK dengan cara sebagai berikut: sampel
dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 2x5 menit, tetesi larutan H2O2 selama 30 menit, cuci
dengan PBS sebanyak 3x 5 menit, lakukan blocking protein dengan serum 1% selama 20
menit, cuci dengan PBS 3x 5 menit, inkubasi dengan antibodi primer dalam serum 1:500
selama 2 jam pada suhu ruang, cuci dengan PBS 3x 5 menit, inkubasi dengan antibodi
sekunder 1:500 selama 1 jam pada suhu ruang, cuci dengan PBS 3x 5 menit, tetesi polimer
selama 40 menit, cuci dengan PBS 2x 5 menit, cuci dengan aquadest sebanyak satu kali,
tetesi dengan Diamono Benzidine (DAB) dan dibiarkan selama 20 menit, cuci dengan
aquadest, tetesi dengan mayer hematoxilen selama 5 menit, tambahkan aquadest, diamkan
selama 10 menit, cuci dengan aquadest mengalir, keringkan selama 3 jam, tetesi dengan
entelan, dan terakhir tutup dengan coverslip (Fatmawati et al., 2010). Slide hasil pengecatan
diperiksa menggunakan program Scan Dot Slide OlyVIA. Kemudian dilakukan pemeriksaan
ekspresi NRG-1 dengan pembesaran 20x obyektif dengan 20 lapang pandang pada tiap slide.
3.9 Prosedur Pengumpulan dan Analisis Data
Hasil pengukuran ketebalan mielin dan ekspresi NRG-1 dianalisa menggunakan
program IBM SPSS Statistics 20 dengan tingkat signifikansi 0,05 (p = 0,05) dan taraf
kepercayaan 95% (α = 0,05).
BAB IV. HASIL YANG DICAPAI
4.1. Kemajuan Pekerjaan
4.1.1. Identifikasi Senyawa Asiatikosida dalam Ekstrak Etanol 70% Pegagan
Identifikasi kimia dilakukan untuk uji
kualitatif ekstrak sebelum dilakukan uji kuantitatif,
identifikasi dilakukan dengan menggunakan metode
Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Uji KLT
(A) (B)
Gambar 4.1 Plat Hasil KLT (A)
pada UV 365 nm (B) visual
8
menggunakan larutan standar asiatikosida 1 mg /1 ml metanol dan ekstrak pegagan 30 mg/3
ml metanol, menggunakan eluen dengan perbandingan pelarut kloroform:asam asetat
glacial:metanol:air (60:32:12:8), perhitungan konstanta dielektrik campuran eluen adalah
13.575 < 15 menunjukkan campuran eluen bersifat non polar, penampak noda anisaldehid
asam sulfat (anisaldehid 0.5 ml, asam asetat glacial 10 ml, metanol 85 ml, dan asam sulfur 5
ml), dan fase diam plat KLT.
4.1.2 Penetapan Kadar Asiatikosida Pada Ekstrak
Penetapan kadar asiatikosida menggunakan metode LC–MS/MS tervalidasi. Kadar
asiatikosida ekstrak etanol 70% pegagan yang didapatkan adalah 0.232 %.
Gambar 4.2. Kromatogram LC dan Fragmentasi Spektra MS/MS Phytosome
4.1.3 Visualisasi Partikel Menggunakan Scanning Electron Microscopy (SEM)
Gambar 4.3. Visualisasi Bentuk dan Ukuran Partikel Phytosome
. Dari hasil analisis SEM didapatkan rentang diameter phytosome antara 1,39-2,06 μm.
4.1.4. Induksi TBI dan Pembuatan Slide Imunohistokimia
Tikus diinduksi TBI menggunakan tabung silinder besi 45 gram yang dijatuhkan ke
bagian kepala. Setelah perlakuan selama satu minggu, dilakukan pemeriksaan histologi otak
untuk mengukur ketebalan mielin dengan pewarnaan Hematoksilin-Eosin (HE) dan
pengukuran ekspresi neuregulin-1 (NRG-1) dengan immunohistokimia.
9
Gambar 4.4. (A) Induksi TBI (B) Pengecatan IHK untuk Pemeriksaan NRG-1 (C) Slide IHK
4.2. Ketercapaian Target Luaran
No. Keterangan Proporsi Ketercapaian No. Keterangan Proporsi Ketercapaian
1 Mengurus ethical clearance 3% 3% 9 Induksi TBI 6% 6%
2 Perijinan laboratorium 2% 2% 10 Pemberian Ekstrak/Phytosome 3% 3%
3 Persiapan alat dan bahan 7% 7% 11 Pembedahan 20% 20%
4 Aklimatisasi tikus 8% 8% 12 Pembuatan slide preparat 3% 3%
5 Ekstraksi Pegagan 8% 8% 13 Pemeriksaan histologis 6% 0%
6 Karakterisasi ekstrak 5% 5% 14 Pemeriksaan ekspresi NRG-1 6% 6 %
7 Pembuatan phytosome 6% 6% 15 Analisa Data 5% 0%
8 Karakterisasi phytosome 7% 7% 16 Penyusunan laporan akhir 5% 0%
Total 100% 84%
BAB V. RENCANA TAHAPAN BERIKUTNYA
Saat ini sedang dalam proses penghitungan ekspresi NRG-1 dan pembuatan slide histologi
jaringan otak dengan pewarnaan HE. Rencana tahap berikutnya yang akan dikerjakan:
1. Pemeriksaan histologis myelin.
2. Analisa data.
3. Penyusunan laporan akhir dan pembuatan artikel ilmiah untuk paten.
DAFTAR PUSTAKA
A. Darbas.2004. Cell autonomy of the mouse claw paw mutation. Dev Biol 272, 470.
Adianingsih O.R., Sulistiyani P.., Zulkarnaen., Alfiantya P.F., Agustin E.N.S. 2013.
Characterization and Effect of Lotion Containing Centella asiatica Extract-
Phospholipid for Irritant Contact Dermatitis. Unpublished. Malang: UB.
Alfarra, Helmi Yousif and Omar, Muhammad Nor. 2013. Centella asiatica : from folk
remedy to the medical biotechnology. International Journal of Bioscience.Vol.3, No.
6, p.49-67.
Åsa Fex Svennigsen and Lars B. Dahlin. 2013. Repair of the Peripheral Nerve—
Remyelination that Works. Brain Sci 3, 1182-1197; doi:10.3390/brainsci3031182.
Block, Cady K.West, Sarah E. 2013. Psychotherapeutic treatment of survivors of traumatic
brain injury: Review of the literature and special considerations.
0% 50% 100%
Kegiatan terlaksana
Total Penelitian Perkembangan Penelitian 84%
(A) (B) (C)
10
Brain Trauma Foundation. 2007. TBI Statistics. Online. https://www.braintrauma.org/tbi-
faqs/tbi-statistics/. Diakses pada 20 Oktober 2013.
Bruns J, Hauser WA. 2003. The epidemiology of traumatic brain injury: A review. Epilepsia.
(Suppl. 10):2–10.
C. Werner and K. Engelhard. 2013. Pathophysiology of traumatic brain injury.Oxford
Journals Medicine BJA.Volume 99, Issue 1 Pp. 4-9.
Center of Disease Control and Prevention.Traumatic Brain Injury in the United States:
Emergency Department Visits, Hospitalizations and Deaths.Online. 20 Oktober 2013.
Dahlan, M. Sopiyudin. 2004. Seri Statistik: Statistik untuk Kedokteran dan Kesehatan; Uji
Hipotesis dengan Menggunakan SPSS Program 12 Jam. Jakarta: Arkans. Hal. 4-26.
Edward Tobinick, Nancy M. Kim, Gary Reyzin, Helen Rodriguez-Romanacce, Venita
DePuy. 2012. Selective TNF Inhibition for Chronic Stroke and Traumatic Brain
Injury An Observational Study Involving 629 Consecutive Patients.
Fatmawati, Heni dkk.2010. Pengaruh Likopen terhadap Penurunan Aktivitas Nuclear Factor
kappa Beta (NF-kB) dan Ekspresi Intracelular Cell Adhesion Molecule-1 (ICAM-1)
pada Kultur HUVECs yang Dipapar Leptin. Jurnal ILMU DASAR,Vol.11 No.2:143.
Flygt J, Djupsjö A, Lenne F, Marklund N.2013.Myelin loss and oligodendrocyte pathology in
white matter tracts following traumatic brain injury in the rat.Epub.
Fricker F.R, et al. 2013. Axonal Neuregulin 1 is a Rate Limiting but not Essential Factor for
Nerve Remyelination. Brain: A Journal of Neurology. 136; 2279–2297.
George M., Joseph L and Ramaswamy. 2009. Anti-allergic, Anti-pruritic and Anti-
inflammatory Activities of Centella Asiatica Extracts. Afr J. Traditional, Vol.6(4):554
Jain N., Gupta BP., Thakur N., Jain R., Banweer J., Jain DK., Jain S. 2010. Phytosome: A
Novel Drug Delivery System for Herbal Medicine. International Journal of
Pharmaceutical Sciences and Drug Research, Vol.2(4): 224-228.
Jorge RE, Starkstein SE, Arndt S, Moser D, Crespo-Facorro B, Robinson RG. 2005. Alcohol
misuse and mood disorders following traumatic brain injury. Archives of
GeneralPsychiatry;62:742–749.
Khotimah, Husnul, Riawan W., Kalsum U. 2009.Efek Neuroprotektif Ekstrak Pegagan
(Centella asiatica) terhadap BDNF (Brain-Derived Neurotropic Factor), TNFaR,
NFkB dan Apoptosis pada Kultur Sel Saraf yang Diinduksi LPS. UB.
Kristina NN, Kusumah ED, Lailani PK. 2009. Analisis Fitokimia dan Penampilan Polapita
Protein Tanaman Pegagan (Centella asiatica) Hasil Konversi In Vitro. Bul. Littro, Vol
20 (1):11-20.
Nortje J, Menon DK. 2004. Traumatic brain injury: physiology, mechanisms, and outcome.
Curr Opin Neurol.17:711-8
Pramono S dan Ajiastuti D. 2004. Standarisasi Ekstrak Herba Pegagan (Centella asiatica (L.)
Urban) berdasarkan Kadar Asiatikosida secara KLT-Densitometri. Majalah Farmasi
Indonesia, Vol. 15 (3): 118-123.
Riyadina, Woro dkk. 2009. Pola dan Determinan Sosiodemografi Cedera Akibat Kecelakaan
Lalu Lintas di Indonesia.Online.http://indonesia.digitaljournals.org/index.php/idnmed.
Diakses pada 20 Oktober 2013.
Ross, I.A. 2005. Medicinal Plants of the Worlds Volume 3: Chemical Constituents,
Traditional and modern Medicinal Uses. Totowa : Humana Press Inc.
Sharma S and Roy RK. 2010. Phytosome: an Emerging Technology. International Journal
of Pharma Research and Technology, Vol.2(s):1-7.
Simon M and Lyons DA. 2013. Axonal selection and myelin sheath generation in the central
nervous system. Cell Biology,25:512-51.
Taveggia, C., Feltri, M. L. & Wrabetz, L. 2010. Signals to promote myelin formation and
repair.Nature Rev. Neurol. 6, 276–287.
vi
LAMPIRAN
1. Penggunaan Dana
Periode Bulan Februari 2014
Tanggal Uraian Kegiatan Debet (Rp) Kredit (Rp)
31-10-2013 Fotokopi + jilid proposal 12.000,00
03-01-2014 Toples 24.000,00
Etanol 70% 110.000,00
24-01-2014 Fotokopi + jilid mika 25.500,00
12-02-2014 Etanol 70% 130.000,00
13-02-2013 Es batu 4.000,00
14-02-2013 Es batu 2.500,00
17-02-2014 Es batu 4.000,00
Es batu 4.000,00
26-02-2014 Pembelian buku logbook 30.000,00
Dana talangan rektorat 2.500.000,00
Es batu 7.000,00
Total 2.500.000,00 353.000,00
Saldo Februari 2014 2.147.000,00
Periode Bulan Maret 2014
Tanggal Uraian Kegiatan Debet (Rp) Kredit (Rp)
01-03-2014 Saldo Februari 2014 2.147.000,00
06-03-2014 Simplisia serbuk Pegagan 90.000,00
16-03-2014 Handscoen 45.000,00
Masker tali 33.000,00
Alkohol swab 17.000,00
17-03-2014 Gunting 3.000,00
Lakban bening 8.500,00
Sekam kayu 15.000,00
18-03-2014 Tempat minum mencit 62.500,00
19-03-2014 Sekam kayu 15.000,00
Pars 7.000,00
Tikus 1.225.000,00
Aquabidest 2L 50.000,00
Aquadest 2.500,00
Etanol 70% 1 L 125.000,00
vii
Pipet tetes 4.000,00
Botol penicillin 6 buah 6.000,00
Botol obat 7 ml 1.000,00
Total 2.147.000,00 1.709.500,00
Saldo Maret 2014 437.500,00
Periode Bulan April 2014
Tanggal Uraian Kegiatan Debet (Rp) Kredit (Rp)
01-04-2014 Saldo Maret 2014 437.500,00
02-04-2014 Tepung 2 kg 19.400,00
10-04-2014 Jilid mika proposal 4.000,00
Tepung 9.700,00
11-04-2014 Fotokopi proposal 3.600,00
14-04-2014 Plain catgut 2-0 10.500,00
Spuit 1 cc 3 buah 3.000,00
Sekam kayu 15.000,00
16-04-2014 Jarum pentul 2.000,00
Catgut plain 3/0 2 pak 11.000,00
Spuit 3 cc 5 buah 5.000,00
Pot kuning 5 buah 10.000,00
Needle 5 buah 3.000,00
Terigu 2 kg 13.000,00
20-04-2014 Handscoen 46.000,00
Tepumg terigu 2 kg 20.800,00
23-04-2014 Fotokopi 4.500,00
Sekam kayu 15.000,00
LC-MS 2.050.000,00
24-04-2014 Fotokopi 1.600,00
28-04-2014 Needle 1 kotak 40.000,00
Spuit 1 cc 14 buah 14.000,00
Iuran anggota 1.863.600,00
Total 2.301.100,00 2.301.100,00
Saldo Periode April 2014 0
Periode Bulan Mei 2014
Tanggal Uraian Kegiatan Debet (Rp) Kredit (Rp)
01-05-2014 Saldo April 2014 0
viii
Pembayaran SEM 250.000,00
02-05-2014 Glukosa 5% 7.000,00
Handscoon 46.000,00
03-05-2014 Tepung 1 kg 10.300,00
04-05-2014 Povidon Iodine 60ml 4.500,00
Kasa OM 8.500,00
20-05-2014 Tikus 20 ekor 525.000,00
Urunan anggota 960.400,00
26-05-2014 Alkohol swab 17.000,00
28-05-2014 Xyla 3 ml 30.000,00
Plain catgut 1 buah 5.500,00
Gentamycin 0,1% 2.500,00
Alkohol 70% 20.300,00
30-05-2014 Spuit 1 ml 10 buah 7.000,00
Plain catgut 3 buah 16.500,00
31-05-2014 Tepung 10.300,00
Total 960.400,00 960.400,00
Saldo Periode Mei 2014 0
Periode Bulan Juni 2014
Tanggal Uraian Kegiatan Debet (Rp) Kredit (Rp)
01-06-2014 Saldo Mei 2014 0
02-06-2014 Masker 30.000,00
Handschoen 46.000,00
Masker 3.000,00
Glukosa 5% 2 buah 14.000,00
Spuit 3 cc 5 buah 5.000,00
Botol organ 5 buah 5.000,00
03-06-2014 Xyla 5 ml 50.000,00
Catgut 3 buah 16.500,00
Handschoen 46.000,00
Spuit 1 cc 25 buah 25.000,00
Fee laboran untuk sonde 100.000,00
06-06-2014 Xyla 5 ml @ Rp 10.000,00 50.000,00
Pot 10 buah @ Rp 1.000,00 10.000,00
Glukosa 5% 6.500,00
ix
23-06-2014 Pars Tikus 57,6 kg @Rp 8.450,00 486.720,00
Sekam 10 pak @Rp 15.600,00 156.000,00
Fee tempat hewan coba 2 bulan @Rp
50.000,00
100.000,00
Injeksi hewan coba 22x @ Rp 1.000,00 22.000,00
KCl 7 gram @Rp 800,00 5.600,00
Di-natrium hydrogen 2,4 mg @Rp 3.225,00 7.740,00
Di-natrium hydrogen 1,2 mg @Rp 1.100,00 1.320,00
Kalium dihidrogen 0,7 gram @Rp 4.100,00 2.870,00
Aquadest steril 0,1 L @ Rp 16.000,00 1.600,00
26-06-2014 Coverglass Duran 28.000,00
Immunohistokimia kit 2.887.500,00
27-06-2014 Iuran Anggota 4.106.350,00
Total 4.106.350,00
Saldo Periode Juni 2014 0
Total Penggunaan Anggaran Feb-Juni 2014 Rp 9.430.350,00 (85,7%)
2. Dokumentasi Kegiatan
Rapat perdana
Survey ke laboratorium
farmakognosi & fitoterapi
Penyiapan bahan untuk
ekstraksi
Ekstraksi Pegagan
Homogenasi menggunakan
magnetic stirrer
Pengeringan pelarut
menggunakan rotavapor
x
Penghilangan kandungan air
menggunakan vacum drying
Preparasi larutan standar
Karakterisasi menggunakan
KLT
Karakterisasi menggunakan
LC-MS/MS
Karakterisasi menggunakan
SEM
Pemberian makan tikus
Penggantian sekam tikus
Induksi TBI
Tikus aktif pasca induksi
TBI
Pembedahan
Deparafinisasi
IHK
xi
Induksi TBI didampingi
oleh dosen pembimbing
Presentasi monev fakultas I
Otak dalam Formalin
