Hialuronidase in Vivo

5/13/2018 Hialuronidase in Vivo - slidepdf.com

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26 ISSN 0326-2383

PALAVRAS CHAVE: Hialuronidase, Histoquímica, Morfometria, Ultra-som.KEY WORDS: Hyaluronidase, Histochemical, Morphometry, Ultrasound.

* Autor a quem dirigir correspondência: E-mail: [email protected]

Avaliação Histológica da Pele Após Exposição à Gel Acrescido

de Hialuronidase Associado ou Não a Ultra-Som

Marlus CHORILLI 1,2*, Vivian ZAGUE 1,

Maria Cristina de Almeida Prado RIBEIRO 1, Gislaine Ricci LEONARDI 1,

Maria Sílvia Mariani PIRES-DE-CAMPOS 1 & Maria Luiza Ozores POLACOW 1

1 Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade Metodista de Piracicaba,

Rodovia do Açúcar, km 156, 13400-911, Piracicaba - SP, Brasil.2 Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas,

Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, Departamento de Fármacos e Medicamentos,

Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho,

Rodovia Araraquara-Jaú, km 1, 14801-902, Araraquara - SP, Brasil.

RESUMO. O objetivo deste trabalho foi verificar os efeitos na pele de suínos machos de gel (G) contendohialuronidase (H) associado ou não ao ultra-som (US). Em diferentes áreas aplicou-se G; G+H; G+H+US emesoterapia (M). Fragmentos de pele foram processados em parafina. Para evidenciar ácido hialurônico(AH) utilizou-se coloração com Alcian Blue (AB) e para morfometria coloração com Hematoxilina/Eosina.Observou-se que G+H e G+H+US não reduziu coloração pelo AB nem apresentou diferenças significantespela morfometria. Já H aplicada mesoterapicamente diminuiu coloração pelo AB. Logo, o uso da H asso-ciada ou não com US não mostrou-se eficaz na redução de HA.

SUMMARY. “Histological Evaluation of the Skin After Exposition to the Gel Increased of Hyaluronidase Associ-ated or not to Ultrasound”. The objective of this work was to verify the effect in the skin of male swines gel (G)containing hyaluronidase (H) associated or not to ultrasound (US). In different areas was applied G; G+US;G+H; G+H+US and mesotherapy (M). Skin fragment was processed in paraffin. To evidence hyaluronic acid(HA) coloration with Alcian Blue (AB) was used and coloration with Hematoxilin/Eosin for morphometry. Itwas observed that G+H and G+H+US did not reduce coloration for the AB nor presented significant differencesfor the morphometry. When H was applied mesoteraphycally coloration for the AB diminished. Then, the use of

H associated or with US did not seem efficient in the HA reduction.

INTRODUÇÃODo ponto do vista clínico, a lipodistrofia gi-

nóide, conhecida popularmente como celulite éum espessamento não inflamatório das capassubepidérmicas, às vezes doloroso, que se ma-nifesta em forma de nódulos ou placas de varia-da extensão e localização 1.

A lipodistrofia ginóide, além de trazer desa-grados do ponto de vista estético, pode tambémacarretar complicações nas zonas acometidas econseqüente diminuição das atividades funcio-nais, podendo levar à quase total imobilidadedos membros inferiores, além de dores constan-tes e problemas psicológicos. A alteração inicialque leva à formação deste quadro parece ser adeterioração da substância intersticial e rede ca-

pilar, levando à retenção excessiva de líquidosna derme e em tecidos subcutâneos 2.

Para Lotti et al. 3 as mudanças patológicassão edema, alargamento dos vasos linfáticos naderme, e um aumento no volume de célulasadiposas no subcutis.

O aspecto “casca de laranja” presente em umtecido com lipodistrofia ginóide é formado pelasalterações da arquitetura da derme e tecido sub-cutâneo associada à desidratação epidérmica 4.

Estudos de Rosenbaum et al. 5 apontam paraa anatomia topográfica do tecido adiposo, naqual distingüem-se duas camadas que são sepa-radas por uma fáscia superficial. A camada maisexterna, que fica em contato com a derme, cha-ma-se areolar, sendo composta por adipócitos

Latin American Journal of Pharmacy (formerly Acta Farmacéutica Bonaerense)

Lat. Am. J. Pharm. 26 (1): 26-30 (2007)

Trabajos originales

Recibido el 24 de marzo de 2006

Aceptado el 03 de agosto de 2006



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globulares e volumosos, em disposição vertical,com vasos sangüíneos numerosos e delicados. Já a camada mais profunda, chamada de lame-lar, apresenta células fusiformes, menores e comdisposição horizontal, onde os vasos são demaior calibre.

Em mulheres, o limite derme-hipoderme éirregular e os septos de tecido conjuntivo for-mam vigas verticais. Dessa forma, se houver hi-pertrofia da hipoderme, ocorrerá formação deherniações para a derme reticular, resultando noaspecto “casca de laranja” na pele. Em homens,o limite derme-hipoderme é liso, os septos sãomais espessos e oblíquos e quando ocorre hi-pertrofia da hipoderme, esses septos, por seremoblíquos, pressionam as células adiposas contraa musculatura subjacente em direção à derme,

sem formar, portanto, herniações. Tais dife-renças estruturais na fáscia superficial são dife-renciadas por hormônio sexual feminino estró-geno 5. Isto explica a presença de lipodistrofiaginóide mesmo em mulheres esbeltas, pois re-flete a expansão do tecido adiposo para dentroda derme, quando o próprio tecido e sua cápsu-la de tecido conjuntivo circundante se encon-tram comprimidos 5.

Alguns fatores como idade, hormônios, sol emudanças bruscas de peso provocam o relaxa-mento e estiramento do sistema fascial, já que

estão intimamente relacionados com as regiõesde aderência da fáscia superficial em virtude deque as áreas de menor aderência têm menorgrau de estiramento e menor volume. Tais ele-mentos, associados às áreas de gravidade, provocam ptose dos tecidos moles e formação delipodistrofia ginóide 6.

Com relação aos agentes etiológicos ou etio-patogenia da lipodistrofia ginóide, estão presen-tes os fatores desencadeantes, predisponentes eagravantes 1,7,8.

Os fatores desencadeantes compreendem asalterações de natureza hormonal que ocorremna adolescência. Dentre os hormônios envolvi-dos no processo de lipodistrofia ginóide, o prin-cipal é o estrógeno, que é o iniciador do pro-cesso e o principal responsável pelo agravamen-to da mesma, agindo ao nível de 8: a) substân-cia fundamental amorfa, provocando alteraçãodo colágeno e das glicosaminoglicanas, ocasio-nando conseqüentemente o edema intersticial(devido ao acúmulo de água) e levando a fibro-esclerose característica da lipodistrofia, b) adi-pócitos, aumentando a resposta dos receptoresalfa-antilipolíticos e estimulando a LPL, enzima

responsável pela lipogênese e c) microcircu-lação, provocando diminuição do tônus venosoe vasodilatação.

Os fatores predisponentes são os múltiplosfatores hereditários como: sexo; raça; biotipoconstitucional; distribuição do tecido adiposo;número, disposição e sensibilidade dos recepto-res das células afetadas pelos hormônios. Já en-tre os fatores agravantes estão hábitos alimenta-res, sedentarismo, fatores emocionais, hábitosde vida, patologias, medicamentos e gravidez 8.

Uma das mais importantes unidades funcio-nais do tecido conjuntivo adiposo é a unidadematriz-intersticial que é constituída por células(especialmente fibroblastos), pela matriz extra-celular, por uma parte fibrosa (fibras colágenas,elásticas e reticulares) e por substância funda-

mental (constituída de proteoglicanas, glicopro-teínas e ácido hialurônico) 8.

As glicosaminoglicanas (GAGs) são cadeiasde polissacarídios compostas de unidades repe-tidas de dissacarídeos, ligadas covalentementeàs proteínas para formar moléculas de proteogli-cana com alta propriedade hidrofílica 9. Concen-tram-se principalmente na matriz extracelular,na periferia e entre a elastina e o colágeno. Setegrupos maiores de glicosaminoglicanas têm sidodistinguidos: ácido hialurônico, condroitina-4-sulfato, condroitina-6-sulfato, dermatana sulfato,

heparana sulfato, heparina, queratana sulfato,sendo que o principal deles é o ácido hialurôni-co 3. Na pele, o ácido hialurônico provê uma al-ta hidratação que facilita o movimento de célu-las que ocorre em estágios prematuros de dano,inflamação ou cicatrização de feridas. Ele tam-bém pode contribuir para as propriedades elás-ticas da derme por formação de uma rede deestruturas helicoidais, e por diferenciação epi-dermal 10.

Na lipodistrofia ginóide, alterações nos fibro-blastos causadas principalmente pelo estrógenolevam a modificações estruturais das GAGs comhiperpolimerização, elevando seu poder hidrofí-lico e a pressão osmótica intersticial. Essa capa-cidade hidrofílica das GAGs resulta em grandeincorporação de água na matriz celular o que atorna a principal responsável pela pressão os-mótica intersticial. Isso gera turgor que faz comque a matriz resista às forças compressoras, de-monstrando, portanto, que há aumento da con-centração das GAGs 9.

Para atuar no tecido adiposo, principal re-gião acometida pela lipodistrofia ginóide, asubstância ativa precisa permear a pele e por is-



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CHORILLI M., ZAGUE V., RIBEIRO M.C. de A.P., LEONARDI G.R., PIRES-DE-CAMPOS M.S.M. & POLACOW M.L.O.

so promotores físicos de absorção, como o ul-tra-som (US), vêm sendo utilizados como umaalternativa à mesoterapia, técnica invasiva e bas-tante questionada nos dias atuais. A desorgani-zação das células da camada córnea provocadapor esses agentes é um importante mecanismo

para acelerar a penetração cutânea 11. A hialuronidase, enzima que despolimeriza o

ácido hialurônico, reduzindo a viscosidade domeio intercelular, aumentando a permeabilidadede membranas e vasos sangüíneos, levando àreabsorção de excesso de fluidos e mobilizandoos edemas 10, tem sido utilizada em associação,ou não, com o US na atenuação da lipodistrofiaginóide.

Nas áreas afetadas pela lipodistrofia ginóide,tem-se aumento de GAGs, sendo o ácido hia-lurônico a principal GAG no tecido conjuntivo.

Lotti et al. 3 observaram que o aumento da con-centração das GAGs é a causa da retenção hídri-ca, edema e fibroesclerose.

Dentre as substâncias ativas usadas nas for-mulações tópicas para o tratamento da lipodis-trofia ginóide tem-se a hialuronidase. Porém, ahialuronidase é uma molécula muito grande epara facilitar a penetração desta na pele tem-serecorrido ao emprego de técnicas físicas como afonoforese e a iontoforese.

Trata-se também de uma molécula sensívelque necessita de cuidados especiais para man-

ter-se estável na formulação. Logo, estudos deeficácia são necessários para avaliar-se o efeitodesta enzima no tratamento da lipodistrofia gi-nóide.

O objetivo deste trabalho foi verificar, napele de suínos, os efeitos de um gel (G) conten-do hialuronidase (100 UTR/g) associado ou nãoao uso do US através de análises histoquímica emorfométrica. Foi realizado também um estudocomparativo com a mesoterapia.

MATERIAL E MÉTODOSForam utilizados cinco suínos machos, híbri-

dos (Landrace X Large White), com 35 dias. Após tricotomia de 5 áreas (4 cm2) no dorso dosanimais, realizou-se os seguintes tratamentosdiários em áreas padronizadas: gel, gel + US, gel+ hialuronidase, gel + hialuronidase + US e me-soterapia (realizada em 4 sessões).

O gel foi constituído de 5% de propilenogli-col, 1% de ácido carboxivinílico, 0,2% de metildibromoglutaronitrila e fenoxietanol, água desti-lada e trietanolamina.

O gel foi acrescido, ou não, de hialuronidase(100 UTR/g).

O US utilizado foi o KW Sonomaster Micro-controlado, freqüência de 3 MHz, intensidadede 0,2 W/cm2, com emissão contínua, por 2 mi-nutos.

Para a mesoterapia, utilizou-se ampolas com2 mL de hialuronidase a 5000 UTR por apli-

cação. Vale salientar que a concentração de hia-luronidase utilizada para mesoterapia é diferenteda concentração da mesma no gel, pois em clí-nicas dermatológicas, até então, utilizavam-seesta concentração do fármaco para mesoterapia 12.

Após 15 dias de tratamento, fragmentos depele tratados foram retirados dos animais. A fi-xação dos segmentos foi em BOUIN (24 h), sen-do processados rotineiramente em parafina. Pa-ra evidenciar ácido hialurônico, utilizou-se Al-cian Blue (AB) pH 2,5 13, com o propósito de,através da intensidade da coloração, observar se

houve diminuição de ácido hialurônico.Para as análises morfométricas e histopatoló-

gicas, por área de tratamento de cada animal,obteve-se nove cortes de 6-7 µm de espessura,não seriados e tratados com Hematoxilina e Eo-sina (HE). A espessura das camadas da pele foiobtida através de vinte medidas feitas aleatoria-mente nos cortes, usando-se uma ocular milime-trada da Zeiss 14. As espessuras da epiderme eda camada córnea foram obtidas em micrôme-tros (µm). Já as espessuras da derme e hipoder-me foram obtidas em milímetros (mm).

A camada córnea foi mensurada em áreasonde esta se apresentava bem aderida à epider-me e foi considerada a distância entre a porçãosuperior da camada granulosa até a superfície.Para a epiderme obteve-se medidas em áreasplanas, sem muitas papilas dérmicas, através dadistância entre a membrana basal até a bordaexterna da camada córnea.

Para a derme, foram obtidas as distâncias en-tre a membrana basal até o limite da derme coma hipoderme, incluindo, assim, a derme papilare reticular. Por fim, as espessuras da hipodermeforam obtidas à partir do limite derme-hipoder-

me até a fáscia superficial, já que houve muitas variações na coleta da pele. Portanto, as medi-das obtidas referem-se à camada areolar (maisexterna), desprezando-se a camada lamelar(mais profunda), pois esta não estava íntegraem todos os cortes.

Realizou-se análise não paramétrica pelo tes-te de Friedman, já que a distribuição dos dadosnão foi homogênea. Para comparação das mé-dias dos tratamentos entre si, utilizou-se o testeDunnit’s de comparações múltiplas (p<0,05).



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RESULTADOS E DISCUSSÃOEm relação às lâminas coradas com AB ob-

servou-se nas áreas controle e tratadas com gel,gel + US, gel + hialuronidase e gel + hialuroni-dase + US a presença de ácido hialurônico, evi-

denciado pela coloração azul, sendo que nosgrupos tratados com hialuronidase bem comohialuronidase + US a intensidade da coloraçãonão diminuiu. Já nos fragmentos de pele trata-dos com mesoterapia, observa-se atenuação dacoloração entre os feixes de colágeno, principal-mente na derme, o que comprova a eficácia dométodo de coloração (Figs. 1 e 2). Estes resulta-dos confirmam os de Godeau & Robert 15, queobservaram, através de um estudo por análiseinformatizada de imagens, a redução de ácidohialurônico entre as fibras de colágeno em der-

me de coelho após tratamento mesoterápico

com hialuronidase. Já trabalho de Laugier et al.10 em cultura de pele e com aplicação tópica dehialuronidase e ácido hialurônico, demonstra-ram que a hialuronidase veiculada em solução,numa concentração de 100 UTR/mL, reduziu a

quantidade de ácido hialurônico, comprovadopela redução de reação histoquímica.

Na análise morfométrica, as espessuras dascamadas da pele podem ser observadas na Ta-bela 1.

Na camada córnea, observa-se redução esta-tisticamente significante para o tratamento gel +US. Provavelmente, isto se deve à ação do ultra-som que provoca desnaturação da queratina eremoção das células mortas 16, levando à dimi-nuição da espessura da mesma. Já na pele trata-da com gel + hialuronidase + US não houve re-

dução estatisticamente significativa. Porém, tes-

Figura 1. Fotomicrografias da pele de suínos. Observa-se principalmente nos tratamentos gel + hialuronidase egel + hialuronidase + US a presença de ácido hialurônico, evidenciado pela coloração azul - seta. Na pele trata-da com mesoterapia, a intensidade da coloração azul é menor (AB, 400x). A : Controle, B: Mesoterapia - H, C:Gel + H, D: Gel + H+ US.

Figura 2. Fotomicrografias da derme de suínos. Observa-se no grupo tratado com mesoterapia atenuação da co-loração entre os feixes de colágeno, evidenciando diminuição de ácido hialurônico, sendo que os grupos con-trole e tratados com hialuronidase e hialuronidase + US mantiveram a coloração - seta (AB, 400x). A : Controle,B: Mesoterapia - H, C: Gel + H, D: Gel + H+ US.



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CHORILLI M., ZAGUE V., RIBEIRO M.C. de A.P., LEONARDI G.R., PIRES-DE-CAMPOS M.S.M. & POLACOW M.L.O.

tes anteriores constataram que a presença daenzima no gel não ocasionou redução das on-das ultrassônicas.

Em relação à derme, não houve alteraçõessignificativas nos tratamentos realizados. Este re-sultado corrobora os dados das lâminas tratadascom AB, sugerindo a não eficácia da formulaçãotópica nas condições experimentais (na concen-tração de 100 UTR de hialuronidase / g de gel).

Na hipoderme, também não houve alte-rações estatisticamente significantes, inclusiveno tratamento mesoterápico, resultado já espera-do, pois não se observava, nos animais, excessode fluidos para ser diminuído com este fármaco.

Epiderme Camada córnea Derme Hipoderme

Controle 74,15±15,28 24,13±7,14 1,74±0,10 3,06±0,28

Gel 90,40±14,26 31,98±9,35 1,73±0,11 3,26±0,22

Gel + US 76,73±10,66 16,75±6,14* 1,44±0,16 3,12±0,24

Gel + Hialuronidase 81,70±10,78 22,58±8,68 1,71±0,17 3,10±0,30

Gel + Hialuronidase + US 74,33±9,97 19,78±5,46 1,58±0,17 2,97±0,30

Mesoterapia Hialuronidase 81,63±14,75 19,63±5,11 1,50±0,11 2,53±0,24

Tabela 1. Média ± desvio padrão da média da espessura da epiderme (µm), camada córnea (µm), derme (mm) ehipoderme (mm) de pele de suínos nos vários tratamentos (n=5). * Diferença estatisticamente significante(p<0,05).

CONCLUSÕESComo não houve redução de ácido hialurô-

nico nos fragmentos de pele tratados topica-mente com hialuronidase e hialuronidase + US,sugere-se que não houve a ação desta enzimanas condições experimentais empregadas.

A hialuronidase aplicada através de mesote-rapia provocou diminuição da coloração pelo AB, evidenciando a atividade enzimática. Com-prova-se, então, a eficácia desta enzima na me-soterapia.

Agradecimentos. Agradecemos ao CNPq e ao FAP-UNIMEP pelo apoio financeiro.

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