Fast versus slow microbiology : come e quando · Coltura Test molecolare Campione per sorveglianza (e. g. tampone nasale, rettale …) Terreni selettivi cromogeni RT-PCR da campione

Fast versus slow microbiology:

come e quando

P.Pecile

AOU CAREGGI, Firenze

La diagnostica “ molecolare “ in microbiologia clinicaLa diagnostica “ molecolare “ in microbiologia clinica

o Indipendente dalla necessità di

isolare il patogeno in coltura /

visualizzarlo al microscopio

o Possibile automazione

- Sensibilità (patogeni non/

difficilmente coltivabili/

visualizzabili, patogeni non vitali)

- Rapidità

polisaccaridi,proteine, acidi nucleici

microbiologia fast

o Maggiore rapidità

o Maggiore sensibilità

o Maggiore accuratezza

o Aumento dei costi diretti

o Impatto organizzativo

Targets and technologies in diagnostic molecular microbiologyTargets and technologies in diagnostic molecular microbiology

Immunoassays

Mass spectrometry

Filter/liquid hybrid., FISH, Microarrays

NAATs (+microarrays; +ESI-MS)

NGS

Immunoassays

LFIA

Informazioni diverse/complementari vs. altre diagnostiche

o GI

o STD

oMDRO

oMeningite

o Sepsi

o LRT: CAP - HAP/VAP

Possibili applicazioniPossibili applicazioni

sorveglianza

Ricerca della colonizzazione da batteri MDR

Vie respiratorie

Intestino

Cute

Informazioni per infection prevention and control

Informazioni per stewardship antibiotica

MRSA ESBL CRE

CRE: forte raccomandazione a fare sorveglianza pro-attiva

Ricerca della colonizzazione da batteri MDR

Coltura Test molecolare

Campione per sorveglianza (e. g. tampone nasale, rettale …)

Terreni selettivi

cromogeni

RT-PCR da

campione

Risultato in

24-48 h

Risultato in

1-4 h

Fast Microbiology per

screening portatori di

MDRO (MRSA, VRE, CRE)

System Producer ARD TTR

(in ore) Samples

Xpert MDRO Cepheid blaKPC, blaVIM, blaNDM,

blaOXA 1 Rectal swab

Hyplex SuperBug ID Amplex

Biosystems

blaKPC, blaOXA, blaNDM, blaVIM

<2 Rectal swab

Check-MDR Carba

(con BD-MAX) Check-point

blaKPC, blaOXA, blaNDM, blaVIM

<2 Rectal swab

CRE ELITe MGB Kit su ELITe InGenius

Elitech blaKPC, blaOXA, blaNDM,

blaVIM, blaIMP <3 Rectal swab

ESBL ELITe MGB Kit su ELITe InGenius

Elitech blaCTX-M-1, blaCTX-M-9,

blaCTX-M-14, blaCTX-M-15, <3 Rectal swab

Eazyplex SuperBug CRE

Amplex

Biosystems

blaKPC, blaOXA, blaNDM, blaVIM, blaCTX-M

15 minuti Rectal swab (dopo

trattaemento campione)

ARD= antimicrobial resistant determinants

Metodi molecolari per screening enterobatteri MDRMetodi molecolari per screening enterobatteri MDR

ISOLAMENTO25-40 €/giorno

• guanti• camici

• gel alcolico• tempo staff

Sorveglianza pro-attiva su patogeni Gram-negativi MDR

Sorveglianza pro-attiva su patogeni Gram-negativi MDR

WHO, novembre 2017

……there is no one single best approach, but instead the decision should be guided by the local epidemiology, resource availability and the likely clinical impact of a CRE

outbreak…

…this guidance document offers suggestions forbest practices, but is in no way prescriptive for all

healthcare settings and all countries…… The optionsfor intervention can be adopted or adapted to localneeds, depending on the availability of financial and

structural resources….

oDiagnosi agente eziologico infezioneoDiagnosi agente eziologico infezione

Identificazione (ID)Antibiogramma (AB)

Gram ID BIOCHIM

1-2 h

Tempi di risposta (TTR) teorici dalla

positivizzazione

IncubazioneCheck-in

AB

Positivizzazione

AB

preliminare

ID BIOCHIM

preliminare

16 -24 h >= 40 h

Aggiustamento

ter. empirica

Aggiustamento

ter. empirica

Ter.

definitiva

Emocoltura: lo standard-of-care per la diagnostica microbiologica della sepsiEmocoltura: lo standard-of-care per la diagnostica microbiologica della sepsi

2 – 110 h

mediana 21 h

Empirica

- 1 giorno

Gram

72h

ID BIOCHIM

IncubazioneCheck-in IdentificazioneAntibiogramma

ID MALDI

Gram

Incubazione

fast track

2h

ID MALDI

Check-in

T e r a p i a a n t i b i o t i c a

Il flusso di lavoro dell’emocoltura: impatto della spettrometria di massa MALDI-ToFIl flusso di lavoro dell’emocoltura: impatto della spettrometria di massa MALDI-ToF

Definitiva

Empirica

Revisione

più precisa

Dipende orario apertura Lab

subcoltura rapida

6h + atb

24h24h

ID rapida ( 1-2 h / 5-6 h

Costo ridotto grossi carichi di lavoro

NO campioni polimicrobici

NO dati sensibilità

1 - 2 h

MOLECULAR ID

MOLECULAR ANTIBIOGRAM

+2 daysIncubationCheck-in

IdentificationAntibiogram

ID MALDI

+1 day

Gram

Riduzione TTR : NAATRiduzione TTR : NAAT

ID specie/genere ( Si polimicrobiche)

Geni di resistenza

Escherichia coli,

Enterobacter spp.

Klebsiella oxytoca,

Klebsiella pneumoniae

Serratia marcescens

Proteus spp.

Citrobacter spp.

Acinetobacter spp.

Pseudomonas aeruginosa

CTX-M (ESBL)

KPC

OXA

VIM

NDM

IMP

Costi elevati (4 – 5 x)

Empiric

Antimicrobial

chemotherapy

Definitive

Gram

Incubation2 h

ID

AB

7 h

Ibridazione in situ + analisi

morfocinetica cellulare

valori di MIC

- 2 days

Gram

+ 2 giorni

ID BIOCHEM

Incubation IdentificationAntibiogram

ID MALDIE. coli isolate

Riduzione TTR : Single Cell Automated Time-lapse MicroscopyRiduzione TTR : Single Cell Automated Time-lapse Microscopy

Dipende orario apertura Lab

SCATMSCATM


Neely et al - Sci Trasl Med 2013

Ricerca diretta su sangueRicerca diretta su sangue

Increases 100-1000 fold

the detection sensitivity

in 4-5 hrs

Direttamente da sangue

T2 Magnetic Resonance (T2MR)risonanza magnetica miniaturizzata

• C. albicans e C. tropicalis (A / T)

• C. krusei e C. glabrata (K / G)

• C. parapsilosis (P)

I raggruppamenti di specie sono quelli raccomandati dalla Società Malattie Infettive dell'America per essere utilizzati come

surrogati per i test di sensibilità antifungina per la selezione della terapia antifungina empirica ( 2016)

E. coli

K. pneumoniae

P. aeruginosa

A. baumannii

S. aureus

E. faecium

For target pathogens:

Sensitivity 89.5%

Specificity 98.4%

T2 bacteria

4-5 hrs – from blood


+2 giorniIncubazioneCheck-in

IdentificazioneAntibiogramma

Riduzione TTR : LFIA per carbapenemasiRiduzione TTR : LFIA per carbapenemasi

ID MALDI

+1 giorno

15 min

da subcoltura rapida

LFIA

+MALDI ID

+ ATBInformazioni: 10/15’

- produzione enzima

- tipo di carbapenemasi

Empirica

Revisione più accurata

T e r a p i a a n t i b i o t i c a

Da sangue4 ore

NAAT per emocolture positive: impatto su antimicrobial stewardshipNAAT per emocolture positive: impatto su antimicrobial stewardship

Emocoltura positiva dopo 12 ore

Sepsi in paziente post-cardiochirurgico

Empirica: MEROPENEM + VANCOMICINA

Revisione anticipabile di 1-2 giorni

Cocchi Gram-positivi

++

-----------

------

-----

---

emocultura: positiva dopo 11 hrs

Gram-negativi bacilli

Sepsi in pz con chirurgia addominale

Empirico: Pip/Tazo + Vancomicina Escherichia coli,

Enterobacter spp.

Klebsiella oxytoca,


Serratia marcescens

Proteus spp.

Citrobacter spp.

Acinetobacter spp.

Pseudomonas aeruginosa

CTX-M (ESBL)

KPC

OXA

VIM

NDM

---+-----

-+---

NAAT + microarray

Verigene® GN

1.5 hrs

AST molecolare

ID molecolare

Upgrade terapia anti-CRE con anticipo 24/48 ore


Dopo 22 h: emocoltura positiva per bacilli Gram-

Considera downgrade a Pip/Tazo (anticipato di 24-48 h)

Empirico: Imipenem/Cilastatin

ID molecolare = E. coli;

AB molecolare: negativo per CTX-M (la più

comune ESBL) e carbapenemasi (KPC, OXA-48,

VIM, NDM)

1.5 hrs

Paziente settico proveniente da casa di riposo (storia

pregressa di UTI)


Film Array BCID system – studi cliniciFilm Array BCID system – studi clinici

Study designNo.

patientsCountry/ setting Patients Outcomes

Effect on time

to appropiate

therapy

Overall

study

quality

Reference

Single center,

Pre/post68

USA, medical

center

Adults with

VRE BSI

No differences in:

- 30-day mortality

- readmission rate

- ICU LOS

Yes Good

MacVane et

al. Infectious

diseases 2016

Single center,

Pre/post100

UK, Tertiary

Children's

Hospital

Children with

BSI

Several cases

conducted to early

discharge

Yes LowRay et al. –

PIDJ 2016

Prospective

randomized

controlled

617USA, Tertiary care

hospital

Adults and

children with

BSI

No differences in:

- 30-day mortality

- LOS

- Total cost per

patient

Yes HighBanerjee et

al. CID 2015

- No differenze in mortalità e durata degenza

- terapia appropriata in tempi ridotti

Standard interno ad una concentrazione nota

di 10^6 copie/ml La differenza tra

l’amplificazione del QSM e l’amplificazione di un target viene usata per estrapolare la concentrazione in copie/mL del target

USO DI UN MATERIALE STANDARD INTERNO CERTIFICATO A CONCENTRAZIONE NOTA (QSM: Quantified Standard Material)Riferimento interno per determinare le copie/ml

I risultati relativi ai batteri comuni sono di tipo semi-quantitativo, conrefertazione in «bin»: 104, 105,106, >107 copie genomiche/ml di campione

Le copie/mL NON sono CFU.

I risultati vanno sempre interpretati tenendo in considerazione la presentazione clinica (sintomatologia), la storia clinica e gli altri dati diagnostici disponibili.Non dovrebbe impiegato come unico strumento per la gestione del paziente, la diagnosi ed il trattamento.

the FilmArray RP is essential for the administration of appropriate antiviral therapy, which dramatically shortens hands-on time (62.7 hours versus 1.2 hours); the reduction in average time to discontinuation of oseltamivir resulted in cost savings of approximately US$34.16 per patient . In addition, FilmArray RP results in overall decreased duration of antibiotic use of half a day, a shorter stay (a quarter of a day less)

The Clinical Significance of FilmArray Respiratory Panel in Diagnosing Community-Acquired PneumoniaHuanzhu Chen, 1 Huilan Weng, 2 Meirui Lin, 2 Ping He, 1 Yazhen Li, 1 Qingdong Xie, 1 Changwen Ke, 1 and Xiaoyang Jiao 1

Diagnostica microbiologica fast: limiti

Arena et al – Fut Microbiol 2017

o NAAT : ricerca solo alcuni patogeni / meccanismi di R

o NAAT : possibile sovrastima resistenze (geni non espressi)

o Informa prevalentemente su resistenze

o No informazioni sulla MIC

o Informazioni di tipo diverso / non sostitutivo

Antibiogramma molecolare

• si presume un fenotipo di resistenza

- presenza di un gene di resistenza non necessariamente correla con sua espressione

- assenza di un gene di resistenza non necessariamente correla con la sensibilità a un farmaco che non è interessato da quel meccanismo di resistenza se non si possono escludere altri meccanismi di resistenza

AntibioticMIC mg/L

(S/I/R)

Amoxi/Clav >16 R

Pip/Tazo >128 R

Ceftriaxone >4 R

Ceftazidime >128 R

Cefepime >32 R

Ertapenem >1 R

Imipenem >16 R

Meropenem >64 R

Fosfomycin >128 R

Amikacin >16 R

Gentamicin 1 S

Ciprofloxacin >4 R

Tigecycline 1 S

Colistin >8 R

CAZ-AVI 4 S

antibiogramma fenotipico


Genii resistenza:

CTX-M negativo

KPC positivo

VIM negativo

OXA-48 negativo

NDM negativo

- Presunta resistanza ai beta-

lattamici, inclusi

carbapenemi

- Probabile sensibilità a CAZ-

AVI

- Nessuna informazione sulla

sensibilità a altre molecole

- No MIC

Antibiotic

Amoxi/Clav R

Pip/Tazo R

Ceftriaxone R

Ceftazidime R

Cefepime R

Ertapenem R

Imipenem R

Meropenem R

Fosfomycin ?

Amikacin ?

Gentamicin ?

Ciprofloxacin ?

Tigecycline ?

Colistin ?

CAZ-AVI S

Antibiogramma molecolare e antibiogramma fenotipicoAntibiogramma molecolare e antibiogramma fenotipico


AntibioticMIC mg/L

(S/I/R)

Amoxi/Clav 8 S

Pip/Tazo 4 S

Ceftriaxone 0.12 S

Ceftazidime 0.25 S

Cefepime <0.12 S

Ertapenem 0.12 S

Imipenem <0.50 S

Meropenem <0.12 S

Fosfomycin 8 S

Amikacin 4 S

Gentamicin 1 S

Ciprofloxacin >4 R

Tigecycline 0.5 S

Colistin 0.5 S

- Probabile sensibilità ai

carbapenemi; possibile

sensibilità cefalosporine

e BLICs

- Nessuna informazione sulla

sensibilità a altre molecole

- No MIC

Antibiotic

Amoxi/Clav S?

Pip/Tazo S?

Ceftriaxone S?

Ceftazidime S?

Cefepime S?

Ertapenem S

Imipenem S

Meropenem S

Fosfomycin ?

Amikacin ?

Gentamicin ?

Ciprofloxacin ?

Tigecycline ?

Colistin ?

antibiogramma fenotipico

E. coli

Geni resistenza

CTX-M negative

KPC negative

VIM negative

OXA-48 negative

NDM negative


Antibiogramma molecolare e antibiogramma fenotipicoAntibiogramma molecolare e antibiogramma fenotipico

NOTA : Assenza dei più comuni geni codificantiper carbapenemasi: l’informazione non consente dipredire il profilo di resistenza ai ß-lattamici.Probabile sensibilità a ceftalozano/tazobactam

Maggiore rapidità, ma anche limiti che

devono essere conosciuti, e diversità nel

significato delle informazioni

Fast versus slow microbiology

Quando ????

Diagnostic stewardship: prioritizing patients for access to fast-track Micro Labs

Microbiologia fast: conclusioniMicrobiologia fast: conclusioni

o Nuove tecnologie diagnostiche consentono di

accorciare significativamente i tempi di risposta ( non

dipendono solo dalla scelta del test, ma anche dalla

organizzazione del laboratorio)

o Evidenze per impatto clinico: presenti ma ancora

limitate (complessità degli studi di validazione)

o Impatto economico ed organizzativo: necessità di

posizionarle correttamente nel percorso diagnostico

(stewardship diagnostica)

o Verso la differenziazione dei processi diagnostici per

“intensità di cura”

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Fast versus slow microbiology : come e quando · Coltura Test molecolare Campione per sorveglianza (e. g. tampone nasale, rettale …) Terreni selettivi cromogeni RT-PCR da campione