EXPRESSION CONDITIONNELLE GAL4- GFP …mastervrv.free.fr/S2/TBCV/Diaporamas/JGBLGCS.pdf · 3 DÉFINITIONS Enhancer trap system Séquence cis‐régulatrice d'un gène, qui déﬁnit

Master 1 Biologie et Valorisation des plantes – plantes et environnement

EXPRESSION CONDITIONNELLE GAL4- GFP ENHANCER TRAP SYSTEM

1Juliette Giniaux – Benjamin Le Gallic – Cybill Staentzel

2

Défini&ons

Objec&fs

Principe

EXPRESSIONCONDITIONNELLEGal4‐GFPenhancertrapsystem(HaseloffJim)

JimHaseloff AutresTravaux Avantages/Inconvénients Alterna9vesTechnique

3

DÉFINITIONS

Enhancertrapsystem

Séquencecis‐régulatriced'ungène,quidéfinitleplus souvent un profil d'expression spécifiquesuivantleSssuetlestadededéveloppement.

ExpressioncondiSonnelle

ExpressiongéniquesouscondiSons:selonla présence ou absence du gènerapporteur


Technique JimHaseloff AutresTravaux Avantages/Inconvénients Alterna9vesJimHaseloff AutresTravaux Avantages/Inconvénients Alterna9vesTechnique

4

DÉFINITIONS

GFP

ElémentP

ProtéinefluorescentevertePermetd’observer,localiseretétudieruneprotéinedansunecellulevivante

ElémentgénéSquemobileprovoquantunemutagénèsedite"spontanée".

GAL4 AcSvateurdetranscripSonchezlalevure

SéquenceUAS

SéquencecibledelaprotéineGAL4

4



5

OBJECTIFS

Marquerl’expressiond’ungène

• DéterminerlalocalisaSondugène

• DéterminersafoncSonauseindel’organisme



6

PRINCIPE Marquerl’expressiond’ungène

Fluorescence

QuelleestsafoncSon?

USlisaSondelaGFP

USlisaSondel’acSvateurde

transcripSonGAL4

ObservaSonduphénotype

AcSvaSonounondugène

Ouest‐ilexprimé?



7

PRINCIPE

hcp://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/assembly/page138/page138.html



8

PRINCIPE

GAL4‐VP16

GFP(gènerapporter)

BoiteTATA

GAL4‐UAS


Technique JimHaseloff AutresTravaux Avantages/Inconvénients Alterna9vesTechnique

9

PRINCIPE

Régionintergénique GFP‐REGAL4‐VP16

(modifiéGAL4‐VP16)

TATAboxUAS =UpstreamAc&va&on

Sequences

Enhancer

Synthèsedelaprotéine


SynthèsedelaGFP



10

PRINCIPE

GAL4‐VP16Enhancer




Régionintergénique

11

Présenta&ond’HaseloffJim

U&lisa&ondelaméthoded’expressioncondi&onnelleGal4–GFPEnhancertrapsystemafindecomprendrelesmécanismesdedéveloppementdesracineslatéraleschezArabidopsisthaliana


Technique JimHaseloff AutresTravaux Avantages/Inconvénients Alterna9ves

12

PRESENTATION DE JIM HASELOFF

Intérêt pour l’étude de la plas9cité au cours dudéveloppement et l’autonomie foncSonnelle des Sssusvégétaux, plus parSculièrement pour comprendre lesinteracSonslocalescellules–cellules.

Développementdeméthodespoursuivrelescellulesinplanta.

PremieràavoiruSliserl’expressioncondiSonnelleGal4–GFPenbiologievégétale.

Sujetpremierderecherche:TrouverdenouveauxouSlspouranalyserlamorphogénèsedesracineschezArabidopsis.

Jim Haseloff Department of Plant

Sciences University of Cambridge



13


JimHaseloff AutresTravaux Avantages/Inconvénients Alterna9ves

But:ComprendrelesmécanismesderamificaSondelaracine

Cellulesfondatricesdupéricycle

Programmededivisionorienté

FormaSonduprimordiumdelaracinelatérale

Technique

14



hcp://www.afd‐ld.org/~fdp_bio/content.php?page=morpho_meristemes&skin=modiia

Technique

15



U&lisa&ond’unsystèmeexpérimentalpropreàl’étudedudéveloppementchezladrosophile

SYSTÈMEGAL4/UAS

Technique

16



Par&cularitédelatechniqueetintérêtchezladrosophile:

Tissu–spécifiqueCellules–spécifique

Systèmeadaptéen1999

parJimHaseloffchezA.Thaliana

Technique

17



Transforma&onderacinesd’ArabidopsisWildtype

Collec&onde401GAL4‐GFPenhancertrap

GFP

Plantescul&véessurgélosever&cale

Sélec&onde4lignéesavecexpressionGFPdanslescellulesfondatricesouébauches

Sélec&ondes2lignéesspécifiquesaudéveloppementdesracineslatéralesJO121etJO192

Technique

18



Etudesaucoursdudéveloppementenmicroscopieconfocale

JO121:lignéespécifiqueauxcellulesdupéricycle

JO192:lignéespécifiqueauprimordiumderacineslatérales

Technique

19




JO121:lignéespécifiqueauxcellulesdupéricycle

• Pasdefluorescencedansleméristèmeracinaire

• ExpressionGFPdanslazoned’élongaSondelaracine

Expressionlimitéeauxcellulesdupéricycle

Technique

20




JO192:lignéespécifiqueauprimordiumderacineslatérales

StageIprimordium StageIIprimordium StageIIIprimordium StageVprimordium

ExpressiondelaGFPvarieaucoursdutempsetdudéveloppementObservaSond’unetransiSondupéricycleverslesflancsdelaracine

Technique

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T‐DNAinsérédanslegénomedemanièrealéatoire

déterminaSondelazoned’inserSon

RT‐PCR

LignéeJO121

LignéeJO192

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RégionsintergéniqueslignéeJO121

RégionsintergéniqueslignéeJO192

T‐DNAinsérédansLOB‐domainproteins

T‐DNA

LBD16 LBD17

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RECAPITULATIF

Plantemèreenfleurs

Bourgeonstrempésdanssolu9on

d’Agrobacterium

Inser9onaléatoireduplasmide Obten9ondegraines

Plantescul9véessurgélosever9cale

ObtenAondePLANTESF1transgéniques(expression

GFP)

SélecAonslignéesJO121

etJO191

Réalisa9ond’uneRT‐

PCR

Découvertedesdomainesdeprotéines

LOB

IdenAficaAonLBD16

24



RECAPITULATIF

Croisementstransgéniques

LBD16

EnhancertrapsystemGAL4GUS/DTAspécifiqueàLBD16

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RECAPITULATIF

TransacAvaAondegènesetablaAongénéAque

GUS

Permetdecomprendreoùselocalisel’expressionde

LBD16

DTA

Entraîneabla9ongéné9quedescellulescibles

Permetdecomprendrelafonc9ondeLBD16

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‐Déterminerlesgènesintervenantdansledéveloppementdesstomates

‐Déterminerlesgènesintervenantdansledéveloppementdesméristèmesracinaires

‐Déterminerlesgènesintervenantdansledéveloppementdestrichomes





Avantages

ObservaSonsurmatérielvivant

PermetdesuivreévoluSondesSssusetouorganesspécifiquesaucoursdutemps

Possibilitédegénérerungrandnombredelignéestransgéniques,chacuneayantunprofild'expressiondeGFPdifférent

Inconvénients

Impliquedenombreuxcontrôles:

• modificaSonstructuraledueàl’inserSondusystème

• stabilitédelaGFP

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JimHaseloff AutresTravaux Avantages/Inconvénients AlternaAvesTechnique

Avantages

ObservaSonsurmatérielvivant

PermetdesuivreévoluSondesSssusetouorganesspécifiquesaucoursdutemps

Possibilitédegénérerungrandnombredelignéestransgéniques,chacuneayantunprofild'expressiondeGFPdifférent

Alterna9ves

Gènesrapporteurs:

• GUS• Luciférase

Procédé:

• PromoteursinducSbles

Inconvénients

Impliquedenombreuxcontrôles:

• modificaSonstructuraledueàl’inserSondusystème

• stabilitédelaGFP

29

• Procédéintéressant


Conclusion

• CréaSond’unegrandebanqued’ArabidopsistransgéniquesexprimantlaGFPdansdiversSssusetàdiversstadededéveloppement

30


Conclusion

31

1. hcp://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/assembly/page138/page138.html2. hcp://www.afd‐ld.org/~fdp_bio/content.php?page=morpho_meristemes&skin=modiia


Bibliographie

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developmentinArabidopsisthaliana.JOURNALOFEXPERIMENTALBOTANY.2005;56(419):2433‐2442.2. HaseloffJ.GFPvariantsformulSspectralimagingoflivingcells.METHODSINCELLBIOLOGY,VOL58.

1999;58:139‐+.3. GardnerM,BakerA,AssieJ,etal.GAL4GFPenhancertraplinesforanalysisofstomatalguardcell

developmentandgeneexpression.JOURNALOFEXPERIMENTALBOTANY.2009;60(1):213‐226.4. JiaH,VanLoockB,LiaoM,VerbelenJ,VissenbergK.CombinaSonoftheALCR/alcAethanolswitchand

GAL4/VP16‐UASenhancertrapsystemenablesspaSalandtemporalcontroloftransgeneexpressioninArabidopsis.PLANTBIOTECHNOLOGYJOURNAL.2007;5(4):477‐482.

5. LaplazeL,BenkovaE,CasimiroI,etal.CytokininsactdirectlyonlateralrootfoundercellstoinhibitrootiniSaSon.PLANTCELL.2007;19(12):3889‐3900.

SITES INTERNET

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