INSTITUTO TECNOLGICO SUPERIOR DE TIERRA BLANCA

INGENIERA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

TESIS

ESTUDIO PRELIMINAR SOBRE LA INMOVILIZACIN DE P. stipitis ACL 2-1 EN

BAGAZO DE CAA DE AZCAR (Saccharum officinarum) PREHIDROLIZADO CON H2SO4

PARA LA PRODUCCIN DE ETANOL (BIOCOMBUSTIBLE)

PRESENTA:

Betsy Suhail Yiguez Balderas

ASESORES:

Dr. Benigno Ortiz Muiz Dra. Mara Guadalupe Aguilar Uscanga

Dr. Jos Armando Vargas Garca

Tierra Blanca, Ver., Mex. Mayo, 2012

i

Estudio preliminar sobre la inmovilizacin de P. stipitis ACL 2-1 en bagazo de

caa de azcar (Saccharum officinarum) prehidrolizado con HSO para la

produccin de etanol (Biocombustible)

Por

BETSY SUHAIL YIGUEZ BALDERAS

Tesis propuesta a la

Divisin de Ingeniera de Industrias Alimentarias

del

Instituto Tecnolgico Superior de Tierra Blanca

Como requerimiento parcial para

obtener el ttulo de

Ingeniero en Industrias Alimentarias

Mayo, 2012

ii

DEDICATORIA

Mi TESIS la dedico con todo mi amor y cario a:

Mis padres: Mara de los ngeles Balderas Ruiz y Jos ngel Yiguez

Barragn; a mi hermano: ngel Yair Yiguez Balderas; a mi novio:

Anselmo Franco Muoz y a mis abuelitos: Amelia Ruiz Ramrez y

Gernimo Balderas Serrano.

Betsy

iii

AGRADECIMIENTOS

A DIOS:

Agradezco en forma ilimitada su infinita ternura, ya que me ha dado

padres y abuelitos maravillosos, los cuales han sido y sern siempre el

motivo ms grande que me impulsa para lograr las metas que me he

propuesto.

A mis PADRES:

Les agradezco incomparablemente todo el amor, apoyo, consejos y

disciplina que me han brindado para abordar cualquier tarea con

entusiasmo y determinacin. Gracias por alentarme a seguir adelante

en los momentos ms difciles, anhelando que siempre me preparara

para enfrentarme a la vida. Siempre han estado a mi lado para guiarme

y ensearme el camino correcto, han sido mi fuente de inspiracin

constante. A ustedes les ofrezco con todo mi amor, mi carrera

profesional, son un genial ejemplo a seguir. Sin su amor y su apoyo

esta tesis no habra sido posible.

A mi HERMANO:

Por estar siempre a mi lado, brindndome momentos divertidos,

fantsticos, memorables y geniales en las diferentes etapas de nuestras

vidas. Por ayudarme siempre a estudiar y en mis tareas beb; por

hacerme compaa en las madrugadas, por compartir una infancia feliz,

por las experiencias que nunca olvidare. Beb este peldao que hoy

alcanzo, espero que sea el motor impulsor para que logres tus metas y

alcances el xito.

iv

A mi NOVIO:

Con todo mi amor en agradecimiento por ser parte importante de mi

vida y por estar todos estos aos siempre a mi lado. Por ensearme a

enfrentar los obstculos con alegra; gracias por el amor, cario, apoyo,

comprensin, consejos y confianza que siempre me has brindado para

la realizacin de mis sueos y de mi carrera profesional.

A mis ABUELITOS:

Gracias por ensearme los primeros pasos, por cuidarme cuando era

nia, por ser la pareja ideal. Por su apoyo y cario incondicional he

llegado a realizar una de mis ms grandes metas, la cual constituye la

herencia ms valiosa que pudiera recibir con admiracin y respeto. A

Momo por su increble fortaleza y a Ame por su gran corazn y por

consentirme demasiado todos los das.

A mis AMIGOS:

Con quienes he compartido experiencias inolvidables a lo largo de mi

vida, durante mi carrera profesional y mis residencias en el Laboratorio

de Bioingeniera, por pasar a mi lado los mejores momentos de nuestra

vida universitaria y por hacer que los malos momentos pasen

desapercibidos. En especial a: Emmanuel, Sonia, Ana, Alba, Francisco,

Claudia, Luis Enrique, Kati, Omar, Gil, Sam, Juan Jos, Diego, Amrica,

Gabi, Karen, Madiam, Hugo, Flor, Adda, Andrs, Jess, Aracely, Majo,

Ale, Levi, Daniel, Dra. Lore, Carlos, Martin, Leamsi, Cristian, Victor,

Rubi, Laura, Magbis, Carmen, Alejandra, Yadi, Irlleg, Jorge, Cesar,

Toms.

A mis ASESORES:

Dr. Beni, Dra. Lupita, Dr. Armando: gracias por brindarme sus

conocimientos, apoyo, experiencia, tiempo y consejos en el desarrollo

v

de esta Tesis; as como por invitarme a formar parte del Laboratorio de

Bioingeniera de la Unidad de Investigacin y Desarrollo de Alimentos

del Instituto Tecnolgico de Veracruz.

A mis MAESTROS:

Porque no solo fueron maestros de la carrera, sino maestros de la vida;

mil gracias porque de alguna manera forman parte de lo que ahora soy.

Por el apoyo que me han demostrado a lo largo de mi carrera, por

impulsarme a lograr mis sueos y por confiar en mi. En especial a: Ing.

Gerardo, Dra. Vero, Dr. Adolfo, M.C. Ibis, M.E. Ana Cristina, Dra. Beti,

Ing. Orlando, Lic. Ery Edmanuel.

Agradezco al Instituto Tecnolgico Superior de Tierra Blanca, a la

Unidad de Investigacin y Desarrollo de Alimentos del Instituto

Tecnolgico de Veracruz y al Consejo Nacional de Ciencia y

Tecnologa por su apoyo otorgado durante la realizacin de este

proyecto de tesis: Conacyt SENER proyecto 150625.

Betsy

vi

RESUMEN

YIGUEZ BALDERAS, BETSY SUHAIL; Divisin de Ingeniera en Industrias Alimentarias, Instituto Tecnolgico Superior de Tierra Blanca. Mayo de 2012. Estudio preliminar sobre la inmovilizacin de P. stipitis ACL 2-1 en bagazo de caa de azcar

(Saccharum officinarum) prehidrolizado con HSO para la produccin de etanol (Biocombustible). Asesores: Dr. Benigno Ortiz Muiz, Dra. Ma. Guadalupe Aguilar Uscanga y Dr. Jos Armando Vargas Garca.

El estudio de inmovilizacin de microorganismos como tcnica de aplicacin en la

biotecnologa, permite desarrollar nuevos procesos para la obtencin de productos

industriales como el bioetanol. Para tal propsito se han utilizado soportes tanto

naturales (bagazo de caa), como sintticos que proporcionan estabilidad a las

funciones celulares, lo cual permite alcanzar altas concentraciones celulares en

volmenes reducidos, as como la reutilizacin del biocatalizador que se ven

reflejados en incrementos en los rendimientos, productividad y una mayor estabilidad

del proceso.

La levadura P. stipitis ACL 2-1 fue inmovilizada en bagazo prehidrolizado con HSO

2% w/v, utilizando una relacin soporte solucin isotnica (NaCl 9 gL) de 1:20

evaluando as, tres tamaos de inoculo (3x106, 3x107 y 3x108 cel mL-1). Se realizaron

cinticas de inmovilizacin para determinar el tiempo de contacto y el tamao de

inculo.

Los resultados obtenidos de la inmovilizacin de P. stipitis ACL 2-1 fueron: tamao

de inculo de 3x108 cel mL-1, mayor adsorcin celular en un tiempo de contacto de

30 h. La viabilidad celular, retencin y eficiencia de la inmovilizacin fueron de 96%,

25.4 mgg-1 (miligramos de clulas por gramo de soporte) y 74%, respectivamente.

La inmovilizacin en bagazo prehidrolizado present mayor retencin y eficiencia en

menor tiempo en comparacin con el bagazo sin tratamiento. Esto sugiri que el

pretratamiento cido aplicado increment la porosidad del soporte, lo cual puede ser

debido al dao causado en la estructura cristalina de la hemicelulosa; permitiendo as

vii

un equilibrio entre la densidad celular, la produccin de etanol y el consumo de

sustrato, promoviendo que el proceso sea estable a condiciones ambientales y

permitiendo el reso del soporte como biocatalizador. Adems se observ que la

presencia de sales tuvo efecto favorable sobre la viabilidad debido al equilibrio

osmtico del sistema.

La evaluacin de la capacidad de las clulas inmovilizadas para producir etanol por

largos periodos de tiempo mostr que las levaduras retuvieron su actividad para la

produccin de biocombustible durante el transcurso de la cintica de estabilidad, al

mismo tiempo que se continu presentando el proceso de adsorcin sobre el

soporte. Se observ un equilibrio constante en la produccin de etanol (4.4 gL) y en

los residuales de glucosa (10.3 gL). As como tambin un aumento en la

productividad del proceso de estabilidad 2.6 veces mayor en comparacin con

sistemas de clulas libres, con una concentracin inicial de 30 gL de glucosa. El

soporte para la inmovilizacin proporcion resistencia y estabilidad a la masa de

clulas de levadura.

viii

CONTENIDO

RESUMEN ............................................................................................................... vi

CONTENIDO ......................................................................................................... viii

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................... xii

LISTA DE TABLAS ................................................................................................ xiv

INTRODUCCIN ..................................................................................................... 1

1. REVISIN BIBLIOGRFICA .......................................................................... 3

1.1 Biocombustibles .......................................................................................... 3

1.1.1 Definicin y ventajas de los biocombustibles ........................................... 6

1.1.2 Generaciones de los biocombustibles ..................................................... 8

1.1.3 Panorama mundial ................................................................................... 9

1.1.4 Tipos de materias primas utilizadas para la produccin de

biocombustibles ................................................................................................. 11

1.1.4.1 Diferencias entre las materias primas ................................................ 12

1.1.5 Tecnologas para la produccin de biocombustibles ............................. 13

1.2 Inmovilizacin ........................................................................................... 14

1.2.1 Tcnicas para inmovilizacin de clulas ................................................ 14

1.2.1.1 Inmovilizacin sobre superficies slidas ............................................. 16

1.2.1.2 Atrapamiento dentro de una matriz porosa ........................................ 16

1.2.1.3 Floculacin celular (agregacin) ......................................................... 17

1.2.1.4 Contencin mecnica detrs de una barrera ...................................... 17

ix

1.2.2 Requisitos previos para la inmovilizacin de clulas ............................. 18

1.2.3 Ventajas de sistemas de clulas inmovilizadas contra sistemas de

clulas libres ...................................................................................................... 19

1.2.4 Efecto del tamao del soporte en sistemas de clulas inmovilizadas .... 22

1.2.5 Reso de clulas inmovilizadas para la produccin de etanol ............... 23

1.3 Industria azucarera ................................................................................... 24

1.3.1 Caa de azcar ..................................................................................... 26

1.3.2 Constituyentes de la caa de azcar ..................................................... 26

1.3.3 Bagazo de caa de azcar .................................................................... 27

1.3.3.1 Composicin del bagazo de caa de azcar ...................................... 28

1.3.3.1.1 Hemicelulosa ................................................................................... 29

1.4 Pretratamiento del material lignocelulsico ............................................... 29

1.4.1 Pretratamiento Fsico ............................................................................. 30

1.4.2 Pretratamiento Qumico ......................................................................... 31

1.4.2.1 Hidrlisis alcalina ................................................................................ 31

1.4.2.2 Hidrlisis cida ................................................................................... 32

1.4.3 Hidrlisis enzimtica .............................................................................. 33

1.4.4 Otros pretratamientos ............................................................................ 34

2. JUSTIFICACIN .......................................................................................... 35

3. OBJETIVOS ................................................................................................. 36

3.1 Objetivo General ....................................................................................... 36

3.2 Objetivos Especficos ................................................................................ 36

x

4. MATERIALES Y MTODOS ........................................................................ 37

4.1 Materia prima ............................................................................................ 37

4.1.1 Pretratamiento de la materia prima ........................................................ 37

4.2 Microorganismo ........................................................................................ 37

4.3 Medios de cultivo ...................................................................................... 38

4.3.1 Medio de cultivo para conservacin y crecimiento................................. 38

4.3.2 Medio de cultivo para activacin y precultivo ......................................... 38

4.4 Condiciones del cultivo ............................................................................. 39

4.5 Inmovilizacin ........................................................................................... 39

4.6 Mtodos analticos .................................................................................... 40

4.6.1 Cuenta y viabilidad celular ..................................................................... 40

4.6.2 Determinacin de peso seco ................................................................. 42

4.6.3 Anlisis de sustratos y productos .......................................................... 44

4.7 Anlisis de datos experimentales .............................................................. 44

4.7.1 Clculo de rendimientos y productividad ............................................... 44

4.7.2 Clculo de retencin y eficiencia de la inmovilizacin ........................... 45

4.7.3 Anlisis estadstico ................................................................................ 46

5. RESULTADOS Y DISCUSIN ..................................................................... 48

5.1 Anlisis estadstico ................................................................................... 48

5.1.1 Diseo Box-Behnken ............................................................................. 48

5.1.2 Diseo aleatorizado codificado .............................................................. 48

5.1.3 Regresin de superficie de respuesta ................................................... 50

5.1.4 Grficas de contorno ............................................................................. 53

5.1.5 Optimizacin de respuesta .................................................................... 57

xi

5.2 Cintica de Inmovilizacin en medio con glucosa ..................................... 59

5.2.1 Anlisis de consumo de sustrato y formacin de productos .................. 60

5.3 Cintica de Inmovilizacin en medio con NaCl ......................................... 61

5.3.1 Efecto del tamao de inculo sobre la retencin de clulas inmovilizadas

............................................................................................................... 61

5.3.2 Efecto del tiempo de inmovilizacin sobre la retencin de clulas

inmovilizadas ...................................................................................................... 62

5.4 Efecto de la composicin del medio lquido sobre la inmovilizacin ......... 64

5.5 Efecto de lavados sobre el soporte inmovilizado ...................................... 65

5.6 Estabilidad ................................................................................................ 65

6. CONCLUSIONES......................................................................................... 70

7. RECOMENDACIONES ................................................................................ 72

8. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................................. 73

9. ANEXOS ...................................................................................................... 80

xii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Ruta del CO2 a partir de combustibles fsiles y de bioetanol............... 5

Figura 2 Participacin de las energas renovables dentro del consumo final de

energa 2008...... 10

Figura 3 Produccin mundial de bioetanol y biodiesel, 2000 2008... 11

Figura 4 Tecnologas para la conversin de materias primas en

biocombustibles..... 13

Figura 5 Mtodos bsicos de inmovilizacin celular: A) Inmovilizacin sobre la

superficie de un soporte slido; B) Atrapamiento dentro de una matriz

porosa, C) Floculacin celular (agregacin), D) Contencin mecnica

detrs de una barrera....... 15

Figura 6 Comparacin de la cintica de fermentacin entre un sistema de clulas

inmovilizadas y clulas libres con una concentracin inicial de 200 gL 21

Figura 7 Efecto del tiempo de cultivo sobre la concentracin de clulas

inmovilizadas.. 22

Figura 8 Efecto del tamao del bagazo de sorgo en la concentracin de clulas

inmovilizadas........................... 23

Figura 9 Cintica de fermentacin de clulas inmovilizadas de Saccharomyces

cerevisiae durante la produccin de etanol.. 24

Figura 10 Mapa de la Republica Mexicana, ubicacin de Ingenios Azucareros............. 25

Figura 11 Composicin del bagazo de caa de azcar.................... 28

Figura 12 Composicin de la hemicelulosa... 29

xiii

Figura 13 Pretratamiento del material lignocelulsico... 30

Figura 14 Cuenta celular en cmara de Thoma..... 41

Figura 15 Correlacin DO contra Peso seco (gL) de P. stipitis ACL 2-1. 43

Figura 16 Correlacin del nmero de clulas (cel mL) contra Peso seco (gL) de P.

stipitis ACL 2-1... 43

Figura 17 Diseo Box-Behnken con tres factores.. 47

Figura 18 Grfica de contorno de retencin 54

Figura 19 Grfica de contorno de eficiencia 55

Figura 20 Grfica de contorno de viabilidad 56

Figura 21 Grfica de optimizacin de respuesta del diseo Box-Behnken... 58

Figura 22 Eficiencia, viabilidad, retencin y pH de la inmovilizacin de clulas de P.

stipitis ACL 2-1 en bagazo de caa de azcar

prehidrolizado. 59

Figura 23 Consumo de glucosa y produccin de etanol en la cintica de

inmovilizacin de P. stipitis ACL 2-1............. 60

Figura 24

Efecto del tamao de inculo sobre la retencin, eficiencia, viabilidad y pH

de clulas inmovilizadas... 62

Figura 25 Efecto del tiempo de inmovilizacin sobre la retencin, eficiencia, viabilidad

y pH de P. stipitis ACL 2-1 en bagazo de caa de azcar

prehidrolizado. 63

Figura 26 Estabilidad de P. stipitis ACL 2-1 inmovilizada en bagazo de caa de

azcar prehidrolizado 66

xiv

LISTA DE TABLAS

Tabla 1 Composicin de la caa de azcar 26

Tabla 2 Composicin del jugo de caa de azcar. 27

Tabla 3 Composicin del medio de cultivo para conservacin 38

Tabla 4 Composicin del medio de cultivo para conservacin 38

Tabla 5 Tabla de diseo de Box-Behnken.. 48

Tabla 6 Unidades codificadas del diseo Box-Behnken... 49

Tabla 7 Tabla de diseo aleatorizada...... 49

Tabla 8 Coeficientes de regresin estimados de retencin.. 50

Tabla 9 Coeficientes de regresin estimados de eficiencia.. 51

Tabla 10 Coeficientes de regresin estimados de viabilidad.. 52

Tabla 11 Tabla resumen de resultados del medio de inmovilizacin: glucosa contra

NaCl........................... 64

Tabla 12 Efecto de lavados sobre el soporte con clulas inmovilizadas.. 65

Tabla 13 Tabla comparativa de trabajos de inmovilizacin para la produccin de

etanol... 68

1

INTRODUCCIN

En la actualidad los pases desarrollados experimentan grandes avances en el

campo cientfico y particularmente en el campo de la biotecnologa. No obstante, el

inters de muchos investigadores en el estudio de inmovilizacin celular como

tcnica de aplicacin de la biotecnologa ha permitido desarrollar nuevos mtodos

que han vuelto rentables a muchos procesos y productos industriales por su

simpleza, rendimiento y estabilidad.

Dentro de la industria alimentaria, la inmovilizacin de microrganismos en soportes

naturales o sintticos proporciona estabilidad a las funciones celulares. Esta tcnica

permite alcanzar altas concentraciones celulares en volmenes reducidos, as como

la reutilizacin como biocatalizador y la implantacin de sistemas continuos de

produccin.

El potencial de los subproductos y productos intermedios de la elaboracin de azcar

de caa como materia prima para la produccin de bioetanol, tiene un alcance

grande en vista de la demanda de etanol como una alternativa a los combustibles

fsiles. Adems, desde el punto de vista ecolgico, el uso de residuos

agroindustriales como soportes para la inmovilizacin de clulas es justificable.

El Instituto Tecnolgico de Tierra Blanca ha venido realizando investigaciones en

conjunto con el Instituto Tecnolgico de Veracruz, la Universidad de Guadalajara, la

Universidad Veracruzana y ahora recientemente con la Universidad Autnoma de

Tamaulipas con el fin de resolver la problemtica inherente a la produccin de etanol

como combustible, para ello se han realizado esfuerzos para lograr la mejora del

proceso, evaluando diferentes sustratos, microrganismos y la modificacin de stos

con el fin de lograr mejoras significativas en el mismo.

Los motivos para impulsar el sector caero de las instituciones participantes versa

sobre la problemtica tecnolgica, econmica y social inherente al mismo gremio y

2

que por la ubicacin de las Instituciones se ven directamente involucradas; y por otro

lado, a las necesidades de los respectivos estados y del pas por lograr el

establecimiento y consolidacin de la tecnologa acorde a las limitantes econmicas

existentes.

Debido a que Mxico se encuentra atrasado en materia de bioenergticos en

comparacin de otros pases como Estados Unidos y Brasil, pases en Amrica

considerados los lderes en materia de etanol (biocombustible), por lo que se vuelve

una exigencia actualizar conocimientos, adecuar, mejorar y desarrollar tecnologas

para obtener a partir de residuos de la agroindustria azucarera (bagazo de caa de

azcar) que impulsen al mencionado sector y sobre todo, sean extrapolables a otros

residuos agroindustriales.

Por todo lo anterior, surge el presente proyecto que propone el estudio preliminar

sobre la inmovilizacin de P. stipitis ACL 2-1 en bagazo de caa de azcar

prehidrolizado con cido sulfrico para la produccin de etanol, como parte

fundamental para el desarrollo de una tecnologa temprana para la produccin de

biocombustible que permitirn resolver la problemtica inherente al empleo de

hidrolizados lignocelulsicos (etanol de segunda generacin, que no compite por las

materias primas con alimentos).

Los biocombustibles pueden ser una buena oportunidad de negocios: son una fuente

de energa alternativa a los derivados del petrleo y el gas, y como tales tienen un

gran mercado. En Mxico PEMEX requerir de una gran cantidad de ellos, y en el

mundo existe una demanda cada vez mayor. Se han diseado polticas pblicas para

fomentar su produccin en gran escala, ofreciendo oportunidades de negocios para

los campesinos, ganaderos e industriales interesados

(http://www.bioenergeticos.gob.mx).

3

1. REVISIN BIBLIOGRFICA

1.1 Biocombustibles

El crecimiento de la poblacin a nivel mundial y en consecuencia, su mayor demanda

de energa y el cambio en las condiciones ambientales, as como la reduccin y

dificultad cada vez mayor de acceso a yacimientos de combustibles fsiles, han

planteado a la sociedad la necesidad de buscar fuentes alternativas para cubrir sus

necesidades.

En este marco, incorporar gradualmente las nuevas fuentes renovables de energa

en Mxico, que combinen con el consumo de combustibles tradicionales, requiere de

polticas pblicas que impulsen entre otros, un programa que incentive la produccin

agropecuaria para la generacin de bioenergticos, de tal manera que se asegure un

aprovechamiento sustentable de la gran biodiversidad existente, a la vez que

fomente las condiciones que garanticen el abasto alimentario y el cuidado del medio

ambiente.

Para lograr este objetivo, el sector agrcola de nuestro pas tiene por delante

importantes retos en la produccin de insumos vegetales para la generacin de

bioenergticos, respetando la parte medio ambiental con base en criterios de

sustentabilidad.

Para el planeta, los combustibles de origen vegetal o animal tienen dos ventajas:

ayudan a combatir el calentamiento global, porque son ms limpios y son una

alternativa para disminuir los riesgos provocados por el agotamiento de las reservas

de petrleo a nivel mundial, dado su carcter de recurso renovable. Para Mxico

representan una forma de impulsar el desarrollo de sectores de la agricultura y la

ganadera, ofrecindoles oportunidades de negocio tanto a las grandes empresas

como a los pequeos agricultores.

4

Tambin son importantes para el pas porque son una alternativa de largo plazo para

el petrleo que, como recurso no renovable, cada da es ms escaso y su extraccin

se hace ms costosa (http://www.bioenergeticos.gob.mx).

Los biocombustibles usan la biomasa vegetal sirviendo de fuente de energa

renovable. Su uso genera una menor contaminacin ambiental y son una alternativa

viable al agotamiento ya sensible de energas fsiles, como el gas y el petrleo,

donde ya se observa incremento sostenible en sus precios. Es importante destacar

que los biocombustibles son una alternativa ms, en vistas a buscar fuentes de

energas sustitutivas, que sirvan de transicin hacia una nueva tecnologa.

Los biocombustibles derivan de un sin nmero de productos agropecuarios, como

tambin de los productos forestales.

La produccin de biocombustibles traer consigo la creacin de nuevos puestos de

trabajo, el incremento de la actividad econmica, la reduccin de la dependencia del

petrleo, proveer al desarrollo de energas alternativas y fundamentalmente el

cuidado del medio ambiente. Una potencial solucin al problema energtico del Pas,

y el futuro del sector agrcola no exportador, al darle un nuevo impulso a una gran

superficie de hectreas.

Los biocombustibles emiten casi la misma cantidad de CO2 que los combustibles

fsiles, pero a diferencia de estos ltimos, el mismo es fijado nuevamente por la

masa vegetal a travs del proceso de la fotosntesis. De esta forma se produce un

ciclo de carbono, que hace que el CO2 quemado y liberado a la atmsfera, vuelva a

ser fijado y el ciclo tenga como resultado un balance cero, en lo que a emisiones se

refiere, no habiendo acumulacin de gases. El ciclo descrito contrasta notoriamente

con lo que sucede con la emisin de CO2 producido por la quema de los

combustibles fsiles en el cual el carbono liberado, fijado hace miles de millones de

aos, es quemado y vuelto a liberar, causando la acumulacin de los mismos en la

atmsfera, el efecto invernadero y el calentamiento global

(http://www.biocombustibles.cl/site/cont_productos.htm).

5

Se puede observar en la Figura 1 la generacin de CO2 a partir de dos tipos

diferentes de combustibles: el de origen fsil y el bioetanol. Puede notarse que el

combustible de origen fsil tiene mayor impacto ambiental al no ser aprovechado de

nuevo el CO2 y debido a que proviene de fuentes no renovables. Mientras que en el

bioetanol existe un mejor aprovechamiento del CO2 cargado en el ambiente

(http://www.mundoymotor.com/mm120/1071084115946.htm).

Figura 1. Ruta del CO2 a partir de combustibles fsiles y de bioetanol.

El bioetanol es un alcohol que se fabrica en su mayor parte mediante un

procedimiento similar al de la cerveza. A lo largo de este proceso los almidones son

convertidos en azcares, stos sufren una fermentacin que los transforma en

etanol, y ste es destilado en su forma final. Es producido principalmente a partir de

caa de azcar, cuyos carbohidratos son fermentados a etanol.

La caa de azcar representa la fuente ms atractiva para la produccin de etanol,

debido a que los azcares que contiene son simples y fermentables directamente por

6

las levaduras. La produccin puede llevarse a cabo tanto a partir de residuos

agrcolas, forestales, industriales o urbanos. Los desechos agrcolas y forestales,

materias primas ricas en celulosa, son las que ms abundan y cuya utilizacin tiene

un menor costo.

1.1.1 Definicin y ventajas de los biocombustibles

Los biocombustibles se dividen en tres grupos:

Bioetanol

Biodiesel

Biogs

En Mxico, la ley en la materia, que es la Ley de Promocin y Desarrollo de los

Biocombustibles, los define de la siguiente manera:

Combustibles obtenidos de la biomasa provenientes de materia orgnica de

las actividades, agrcola, pecuaria, silvcola, acuacultura, algacultura, residuos

de la pesca, domesticas, comerciales, industriales, de microorganismos, y de

enzimas, as como sus derivados, producidos, por procesos tecnolgicos

sustentables que cumplan con las especificaciones y normas de calidad

establecidas por la autoridad. (http://www.bioenergeticos.gob.mx).

Ejemplos de biomasa empleada para producir biocombustibles son la caa de azcar

y su bagazo, las plantas oleaginosas, los desechos y componentes orgnicos as

como los aceites de reso.

Se obtiene a partir de la fermentacin de dos tipos de biomasa:

La que es rica en azcares, como la caa de azcar, la remolacha o el sorgo

dulce.

La que es rica en almidones, como el maz, la yuca, etc.

7

El bioetanol es en s mismo un biocombustible, pero no se emplea de manera pura

en vehculos porque es agresivo para sus partes plsticas (a menos de que el

vehculo en cuestin haya sido diseado para funcionar con bioetanol). La prctica

comn es mezclarlo con gasolina en porcentajes que varan del 5% al 20%, sin

embargo en pases como Brasil, es comn utilizarlo de manera pura (E100) como

combustible

Cuando se mezcla en bajas proporciones con gasolina funge como oxigenante y, con

ello, eleva la potencia de su combustin (es decir, su octanaje), sustituyendo a un

componente tradicional de la gasolina denominado ter metil tert-butlico o MTBE, el

cual es altamente contaminante, por lo que las gasolinas mezcladas con etanol son

menos agresivas con el medio ambiente.

PEMEX lleva a cabo un ambicioso plan para adicionar 6% de bioetanol a las

gasolinas de las tres zonas metropolitanas del pas (D. F., Monterrey y Guadalajara)

entre el 2010 y el 2012, lo que resultar en una demanda de 986 millones de litros de

bioetanol para el bienio 2011-2012. Despus del 2012 este programa ir creciendo

hasta abarcar a toda la gasolina producida en Mxico (PROINBIOS, 2009).

Adicionalmente, la incorporacin de bioetanol producido en Mxico permitir

disminuir las importaciones del oxigenante MTBE al cual sustituir. Por ejemplo, si

todas las gasolinas producidas en Mxico emplearan 10% de bioetanol, se

ahorraran 2 mil millones de dlares al ao en importaciones de MTBE.

Por todo lo anterior, las ventajas de los combustibles son:

Son renovables: los biocombustibles son una alternativa conveniente frente a

los combustibles fsiles en primer lugar porque son renovables. Provienen de

materias primas agrcolas o ganaderas, que pueden cultivarse o criarse.

Son ms limpios: una de sus grandes ventajas es que son ms

biodegradables que los combustibles fsiles, por lo que son potencialmente

menos dainos en casos de derrames. Adicionalmente, aunque la idea est

8

todava a debate, se cree que emiten menos elementos contaminantes a la

atmsfera al momento de quemarse.

Generan empleos: son una alternativa para fomentar la inversin y el empleo

en la agricultura y el campo. Algunos biocombustibles pueden emplear cultivos

que se dan bien en tierras de baja productividad que actualmente estn

ociosas y, adems, beneficiar a pequeos productores o cooperativas

campesinas en condicin de pobreza.

Aprovechan materias tradicionalmente consideradas como desperdicio: la

basura, las grasas animales o usadas y el excremento animal son materias

primas para producir biocombustibles. Adems, para el caso de la basura y los

excrementos, su aprovechamiento evita que se emitan gases de invernadero a

la atmsfera con un alto potencial de contaminacin.

1.1.2 Generaciones de los biocombustibles

Los biocombustibles se clasifican en generaciones dependiendo de la materia prima

empleada en su elaboracin.

Primera generacin: son los biocombustibles que provienen de cultivos

alimenticios y que se procesan por medios convencionales, como el bioetanol

que se obtiene de la caa de azcar o la remolacha, o el biodiesel que

proviene de las semillas de crtamo o girasol.

La crtica ms fuerte que han recibido estos biocombustibles es que ocupan

tierras destinadas a cultivos alimenticios. Para Mxico, existe la oportunidad

de producir biocombustibles de primera generacin aprovechando tierras de

baja productividad, sin perjudicar la produccin de alimentos.

Segunda generacin: son los biocombustibles que se elaboran a partir de

materias primas que pueden convertirse en celulosa, como los desechos de

los cultivos alimenticios (por ejemplo bagazo de caa de azcar) e incluso el

aserrn o plantas con un alto contenido de materia lignocelulosa (que es la

estructura biolgica que hace que la planta se mantenga erguida).

9

Muchos de estos mtodos estn en experimentacin y todava no son

econmicamente rentables, pero la velocidad a la que se desarrollan sus

tecnologas es muy alta, por lo que existe la posibilidad de que en el mediano

plazo den resultados satisfactorios que permitan su implementacin.

Tercera generacin: esta es la que pretende crear bioetanol a partir de cultivos

especficos, como las algas. Las algas tienen un potencial energtico que

puede llegar a ser 30 veces mayor que el de los cultivos energticos en tierra,

ya que capturan una gran cantidad energa solar y se reproducen

rpidamente. Existe un tipo de algas que de manera natural produce bioetanol.

Sin embargo, la produccin de bioetanol a partir de algas todava se encuentra

en etapa experimental por lo que el uso de esta tecnologa para produccin en

masa de biocombustibles no es econmicamente viable.

1.1.3 Panorama mundial

El tema de los biocombustibles es importante para la agenda mundial ya que

actualmente distintos gobiernos a nivel mundial estn buscando fuentes alternativas

de energa, ms econmicas, sustentables y respetuosas con el medio ambiente.

Hay una gran diversidad en las posiciones y niveles de desarrollo entre los distintos

pases. Mientras unos ya tienen un plan de desarrollo estratgico con obligaciones y

metas a largo plazo, apoyos, subsidios, e investigacin y desarrollo para producir,

utilizar y/o exportar biocombustibles, otros apenas estn plantendose esa

posibilidad.

A continuacin se presenta un resumen del estado de los biocombustibles, el lugar

que ocupan dentro del panorama mundial de la energa, su participacin dentro de la

energa renovable y las polticas y metas de algunos pases, as como una lista de

las principales iniciativas sobre el tema por parte de los organismos internacionales.

Actualmente todas las energas renovables juntas proveen alrededor del 19% de la

energa mundial. De ellas, la mayor parte est representada por la biomasa

10

tradicional (principalmente lea: alrededor de 500 millones de familias en los pases

subdesarrollados la emplean para cocinar y calentarse) y slo el 0.6% de la energa

total proviene de los biocombustibles (Figura 2).

Figura 2. Participacin de las energas renovables dentro del consumo final de

energa 2008 (Renewables Global Status Report, 2010).

A pesar de su aparente insignificancia como fuente de energa, su tendencia es a

ocupar espacios cada vez ms importantes. Por ejemplo, tan slo entre 2004 y 2008

la produccin de bioetanol se sextuplic, mientras que la de biodiesel se duplic

(Figura 3). Del total de las inversiones en energa renovable en el mundo, el 13%

correspondi a los biocombustibles (Renewables Global Status Report, 2010).

Alrededor de 85 pases han implementado polticas y fijado metas delineadas para

llevar a cabo programas de energas renovables. En 2009 algunos de estos pases

hicieron avances importantes en el uso de biomasa. El ms notable es Suecia, en

donde la biomasa gener por primera vez mayor energa que el petrleo. Existen

plantas procesadoras de biocombustibles en alrededor de 50 pases, y prcticamente

todos estn expandiendo sus inversiones en este campo. Algunos ejemplos: Austria,

17%; Finlandia, 20%; y Alemania, 5% (REN21 Renewable Energy Policy Network for

the 21st. Century, Renewables 2010: Global Status Report).

11

Figura 3. Produccin mundial de bioetanol y biodiesel, 2000 2008 (Renewables

Global Status Report, 2010).

1.1.4 Tipos de materias primas utilizadas para la produccin de

biocombustibles

Las materias primas de primera generacin ms utilizadas por los productores de

bioetanol son, la caa de azcar, el maz, la remolacha azucarera, la yuca, el sorgo,

el trigo y la papa.

La primera generacin de biocombustibles es la fuente ms importante de

produccin en la actualidad, y tiende adems a expandirse. Sin embargo, este tipo

de biocombustibles enfrenta retos sociales y ecolgicos, principalmente porque se

elaboran a partir de cultivos alimenticios, y hay quienes afirman que ello ha

provocado un incremento en los precios internacionales de los alimentos y un cambio

en el uso de la tierra. Aunque todava no estn listas para la produccin comercial de

gran escala, la segunda y tercera generaciones, que producen biocombustibles de

materia lignocelulosa y algas (como los tallos y partes no usables de cultivos

alimenticios, o los desperdicios de la industria de la madera, por una parte, y diversos

12

tipos de algas marinas por la otra) est experimentando significativos avances

tecnolgicos que las convertirn en alternativas viables en el mediano plazo. Ello

permitir liberar tierras para que vuelvan a la produccin de cultivos alimenticios, al

tiempo de que se disminuirn todava ms las emisiones de gases de efecto

invernadero (http://www.bioenergeticos.gob.mx).

1.1.4.1 Diferencias entre las materias primas

Bioetanol derivado del maz: el principal productor de bioetanol derivado del

maz es Estados Unidos. Este tipo de bioetanol tiene un costo de 1 dlar con 9

centavos el galn. El precio de la gasolina al 2007 era de 3 dlares con 3

centavos el galn; mientras que el bioetanol (mezcla E85) costaba 2 dlares

62 centavos el galn y 3 dlares y 71 centavos para lograr su equivalencia de

energa a la de un galn de gasolina. La diferencia entre la energa invertida

en su proceso y la energa final que produce es 1 a 1.3. Es decir, se gana 0.3

de energa al final. Este bioetanol produce 22% menos emisiones de gas de

efecto invernadero que el que emite la gasolina.

Bioetanol derivado de la caa de azcar: el principal productor de bioetanol

derivado de la caa de azcar es Brasil. El precio de la gasolina mezclada con

25% de bioetanol en el 2007, era de 4 dlares 91 centavos el galn, mientras

que el del bioetanol puro era de 2 dlares 92 centavos y 3 dlares con 88

centavos para obtener el equivalente al galn de gasolina. La diferencia entre

la energa que se libera en el proceso de produccin de este tipo de bioetanol

en comparacin con la energa que se produce al final del proceso es uno a

ocho. Las emisiones de gas invernadero equivalen a un 56% menos de las

emisiones que se desprenden de la produccin y el uso de la gasolina

mezclada con el 25% de bioetanol.

Bioetanol producido de la celulosa (segunda generacin): Con este tipo de

bioetanol se producen 91% menos emisiones de gas invernadero, que con el

uso de gasolina. Dependiendo del mtodo de produccin la diferencia entre la

energa empleada en el proceso y la energa final producida al final puede

13

llegar a ser de una hasta 36 veces ms energa final que la invertida. (National

Geographic, Biofuels Compared, 2007).

1.1.5 Tecnologas para la produccin de biocombustibles

Hay muchas formas de convertir la biomasa en un producto de energa final. Varias

de las tecnologas de conversin se han desarrollado con base en adaptaciones a la

composicin fsica natural y qumica de la materia prima tratada, y al servicio de

energa requerido (calor, energa, combustible para el transporte). A continuacin se

muestra una grfica con las diferentes tecnologas para la conversin de materias

primas como pirlisis, gasificacin, hidrogenacin y fermentacin para producir

biocombustibles lquidos y gaseosos (Figura 4) (Tasneem Abbasi,

www.bioenergeticos.gob.mx).

Figura 4. Tecnologas para la conversin de materias primas en biocombustibles

(Tasneem Abbasi, www.bioenergeticos.gob.mx).

14

1.2 Inmovilizacin

Un aumento en el inters de la inmovilizacin de clulas de levadura para la

produccin de bioetanol ha tenido lugar recientemente, esto se debe principalmente

a las numerosas ventajas que ofrece la inmovilizacin de clulas, incluyendo

maximizar la productividad, viabilidad del proceso, estabilidad de las clulas y

soporte, reduccin de costos de produccin, as como la proteccin a la fisiologa de

las clulas contra la fuerza de corte. El uso industrial de clulas inmovilizadas es an

limitado, pero una mayor aplicacin depender del desarrollo, anlisis y evaluacin

de procesos y tcnicas de inmovilizacin optimizados.

1.2.1 Tcnicas para inmovilizacin de clulas

Sistemas de clulas inmovilizadas han sido tradicionalmente considerados como una

alternativa para aumentar la productividad del proceso y reducir al mnimo el costo de

produccin (Carvalho et al., 2003; Santos et al., 2005a; Sarrouh et al., 2007).

La inmovilizacin de clulas enteras se define como "la contencin fsica o

localizacin de las clulas intactas para una cierta regin del espacio con la

preservacin de una actividad cataltica deseada" (Karel et al., 1985), y es un

proceso que a menudo imita lo que ocurre cuando las clulas de manera natural

crecen en las superficies o en las estructuras naturales.

Numerosos procesos biotecnolgicos son favorecidos por la inmovilizacin de clulas

y por lo tanto varias tcnicas y materiales de apoyo se han propuesto, esas tcnicas

se pueden dividir en cuatro categoras principales, basadas en el mecanismo fsico

empleado (Pilkington et al., 1998) (Figura 5):

a) Anexo o adsorcin en superficies de soporte slidas.

b) Atrapamiento dentro de una matriz porosa.

c) Auto agregacin por floculacin (natural) o con agentes de reticulacin

(inducida artificialmente).

d) Celda de contencin detrs de barreras.

15

Figura 5. Mtodos bsicos de inmovilizacin celular: A) Inmovilizacin sobre la

superficie de un soporte slido; B) Atrapamiento dentro de una matriz porosa, C)

Floculacin celular (agregacin), D) Contencin mecnica detrs de una barrera

(Pilkington et al., 1998).

16

1.2.1.1 Inmovilizacin sobre superficies slidas

La inmovilizacin de la clula en un vehculo slido se lleva a cabo por adsorcin

fsica debido a las fuerzas electrostticas o por unin covalente entre la membrana

celular y el transportista. El espesor de pelcula de clulas por lo general oscila entre

una capa de clulas a 1 mm o ms. Los sistemas que utilizan las clulas de la

superficie inmovilizada son populares debido a la facilidad de llevar a cabo esta

inmovilizacin. La fuerza con la que las clulas estn unidas al soporte, as como la

profundidad de la biopelcula vara a menudo y no se determina fcilmente. Dado que

no existen barreras entre las clulas y la solucin, el desprendimiento de clulas y la

reubicacin es posible con la posible creacin de un equilibrio entre las clulas

adsorbidas y las clulas suspendidas libremente. Ejemplos de vehculos slidos

utilizados en este tipo de inmovilizacin son materiales celulsicos: DEAE-celulosa,

madera, aserrn, aserrn deslignificado; materiales inorgnicos: polygorskite,

montmorilonite, hydromica, porcelana porosa, vidrio poroso, etc. Los materiales

slidos como el vidrio o celulosa tambin pueden ser tratados con productos

qumicos para mejorar su capacidad de adsorcin (DAmore, 1994; Navarro y

Durand, 1977).

1.2.1.2 Atrapamiento dentro de una matriz porosa

En este tipo de inmovilizacin, las clulas penetran en la matriz porosa hasta que su

movilidad se ve obstaculizada por la presencia de otras clulas, o el material poroso

se forma in situ en un cultivo de clulas. Ambos mtodos de atrapamiento se basan

en la inclusin de las clulas dentro de una red rgida para evitar que la difusin de

clulas en el medio circundante, al tiempo que permite la transferencia de masa de

nutrientes y metabolitos. Algunos ejemplos caractersticos de este tipo de

inmovilizacin son el atrapamiento en geles de polisacridos como alginatos, k-

carragenina, agar, quitosano y cido poligalacturnico u otras matrices polimricas

como la gelatina, el colgeno y el alcohol de polivinilo. (Norton, S. y DAmore, 1994;

Park y Chang, 2000).

17

El crecimiento celular en la matriz porosa depende de las limitaciones impuestas por

la difusin de la porosidad del material y por el impacto de la acumulacin de

biomasa. Uno de los problemas de atrapamiento de clulas dentro de una matriz

porosa es la capacidad de multiplicarse de las clulas situadas en la superficie

exterior de las perlas y ser liberado de la matriz. Esto conduce a un sistema que

comprende de clulas inmovilizadas y clulas libre. (Tanaka et al., 1989; Taillandier

et al., 1994; Ramon-Portugal et al., 2003).

1.2.1.3 Floculacin celular (agregacin)

La floculacin celular ha sido definida por muchos autores como una agregacin

de clulas para formar una unidad ms grande o la propiedad de las clulas en las

suspensiones para que se adhieran en grupos y sedimentos rpidamente (Speers,

1998). La floculacin se puede considerar como una tcnica de inmovilizacin, ya

que el gran tamao de los agregados hace que su uso potencial en los reactores sea

posible. Estos reactores son empacados, lecho fluidizado y reactores continuos de

tanque agitado. La capacidad de formar agregados se observa principalmente en los

mdulos hongos y clulas de plantas. Agentes artificiales floculantes o reticulantes

pueden ser utilizados para mejorar la agregacin en cultivos de clulas que no

floculan naturalmente. La floculacin en las levaduras es una propiedad de gran

importancia para la industria cervecera, ya que afecta la productividad de la

fermentacin y la calidad de la cerveza adems de la eliminacin de levadura y la

recuperacin. Se ve afectada por muchos factores, incluyendo la composicin de la

pared celular, el pH, oxgeno disuelto y la composicin del medio.

1.2.1.4 Contencin mecnica detrs de una barrera

La contencin de las clulas detrs de una barrera puede ser alcanzada ya sea

mediante el uso de filtros de membranas microporosas por atrapamiento de las

clulas en la microcpsula o por la inmovilizacin de clulas en una superficie de

interaccin de dos lquidos inmiscibles. Este tipo de inmovilizacin es ideal para

18

cuando se requiere el producto libre de clulas y una transferencia mnima de

compuestos (Park y Chang, 2000). Esta tecnologa de birreactor de membrana es

ampliamente utilizada en reciclaje celular y en procesos continuos (Lebeau et al.,

1997; Kargupta et al., 1998). Las principales desventajas de la inmovilizacin celular

entre las membranas microporosas son las limitaciones de transferencia de masa

(Lebeau et al., 1998).

1.2.2 Requisitos previos para la inmovilizacin de clulas

La produccin de biocombustible es una opcin importante en vista de las reservas

mundiales de petrleo. La fermentacin del bioetanol se lleva a cabo utilizando

microorganismos inmovilizados (Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas mobilis,

Pichia stipitis, etc), que tienen muchas ventajas en comparacin con el uso de

clulas libres. Diversos soportes se han utilizado para la fermentacin del

biocombustible y para el atrapamiento de clulas (Murat, 2011). Un soporte es

adecuado para la inmovilizacin de clulas para la produccin de etanol, cuando los

requisitos siguientes se cumplen (Freeman, 1984; Martin, 1991):

El portador debe tener una superficie grande, con grupos funcionales de las

clulas a adherirse.

El vehculo debe ser fcil de manejar y regenerar.

La viabilidad celular y la estabilidad operativa del biocatalizador inmovilizado

debe ser alta y con gran poder de retencin en tiempos prolongados.

La actividad biolgica de las clulas inmovilizadas no debe ser afectada

negativamente por el proceso de inmovilizacin.

La porosidad del soporte debe ser uniforme y controlable, permitiendo el libre

intercambio de sustratos, productos, cofactores y gases.

El portador debe tener una buena retencin mecnica, estabilidad trmica y

biolgica y no ser fcilmente degradado por las enzimas, disolvente, cambios

de presin o fuerzas de cizallamiento.

19

El transportista y la tcnica de inmovilizacin deben ser fciles, rentables y

susceptibles de aumentar la escala.

1.2.3 Ventajas de sistemas de clulas inmovilizadas contra sistemas de

clulas libres

El aumento del inters en el uso de tcnicas de inmovilizacin de clulas para la

produccin de alimentos fermentados se debe principalmente a las numerosas

ventajas que ofrece ms de inmovilizacin convencionales de fermentacin libre de

clulas (Kourkoutas et al., 2004). Especialmente, en el caso de la produccin de

bebidas alcohlicas de estas ventajas incluyen:

Una actividad prolongada y la estabilidad del biocatalizador, debido al efecto

protector de la inmovilizacin de apoyo contra los efectos fsico-qumicos;

Una mayor densidad celular en el reactor biolgico que conduce a una mayor

productividad, menor tiempo de fermentacin;

Aumento de la adsorcin del sustrato y la mejora del rendimiento;

La viabilidad del tratamiento continuo;

Aumento de la tolerancia a altas concentraciones de sustrato y la inhibicin de

reduccin del producto final;

Viabilidad de la baja temperatura de fermentacin que conduce a mejorar la

calidad del producto;

Recuperacin fcil del producto sin necesidad de separacin y etapas de

filtracin, reduciendo as el costo de los equipos y la demanda de energa;

La regeneracin y la reutilizacin del biocatalizador durante largos perodos en

el lote operacional;

La reduccin del riesgo de contaminacin microbiana, debido a altas

densidades de clulas y la actividad de fermentacin;

Posibilidad de utilizar pequeos biorreactores con diseos de procesos

simplificados y por lo tanto menores costes de capital;

20

Alteraciones en el crecimiento celular, la fisiologa y la actividad metablica

puede ser inducida por la inmovilizacin de clulas, aunque es difcil predecir

el tipo y la magnitud de tales cambios.

Estudios comparativos sobre las clulas inmovilizadas y libres mostraron efectos

sobre la activacin del metabolismo de la levadura energtica, el aumento de los

polisacridos de almacenamiento, las tasas de crecimiento alterado, aumento de la

adsorcin del sustrato y el rendimiento del producto, menor rendimiento de los

subproductos de la fermentacin, los valores ms altos de pH intracelular, una mayor

tolerancia frente a txicos y compuestos inhibidores y aumento de actividad de la

invertasa. Entre estos efectos los ms destacados en el crecimiento y la fisiologa

son: la actividad metablica y tolerancia al estrs (Kourkoutas et al., 2004).

Por lo anterior, se muestra en la Figura 6 las ventajas de la tecnologa de clulas

inmovilizadas sobre los sistemas convencionales: ventaja es el incremento en la

productividad de dos a tres veces (Najafpour et al., 2004) y sustancialmente el

incremento en la densidad celular. El experimento fue llevado a cabo con una

concentracin inicial de azcar de 200 gL. En el sistema de clulas libres, tom 40

h el consumo del 98% del total de azcar, la produccin de etanol fue de 2.55

gLh. La concentracin de etanol y rendimiento fueron de 91.7 gL y 0.47 gg,

respectivamente. Por otro lado en el sistema de as clulas inmovilizadas, despus de

16 h, consumieron el 98.7% del total de azcar en el medio, con una productividad

de etanol de 5.72 gLh que es 2.24 veces mayor que la mostrada con el sistema

convencional de clulas libres; la concentracin de etanol y rendimiento fueron de

92.7 gL y 0.48 gg, respectivamente (J. Yu et al., 2007).

21

Figura 6. Comparacin de la cintica de fermentacin entre un sistema de clulas

inmovilizadas y clulas libres con una concentracin inicial de 200 gL (J. Yu et al.,

2007).

Como se muestra en la Figura 7, la concentracin de clulas inmovilizadas aumenta

rpidamente durante las primeras 16 h de la cintica (0.6 gg) as como la

concentracin de azcares disminuye lentamente aproximadamente a 20 gL. Esto

se puede ser a causas de la diferencia en la concentracin de azcares entre el

medio de fermentacin y en el interior del bagazo de sorgo (J. Yu et al., 2007).

22

Figura 7. Efecto del tiempo de cultivo sobre la concentracin de clulas inmovilizadas

(J. Yu et al., 2007).

1.2.4 Efecto del tamao del soporte en sistemas de clulas inmovilizadas

Estudios realizados en bagazo de sorgo para la produccin de etanol utilizando

Saccharomyces cerevisiae muestran que la mayora de clulas inmovilizadas se

encuentran incrustadas en la superficie del soporte. Si la masa total es igual, las

piezas de bagazo grandes tendrn ms clulas intactas que las piezas pequeas de

bagazo de sorgo y ms clulas podrn inmovilizarse por cada unidad de bagazo.

Pero a medida que aumenta el tamao, la transferencia de masa en el interior del

bagazo se hace ms difcil y finalmente influira en la productividad de la

fermentacin, por lo que un tamao ptimo de bagazo para ser optimizado es de 10

mm x 10 mm x 10 mm. El efecto del tamao del soporte se muestra en la Figura 8 (J.

Yu et al., 2007).

23

Figura 8. Efecto del tamao del bagazo de sorgo en la concentracin de clulas

inmovilizadas (J. Yu et al., 2007).

1.2.5 Reso de clulas inmovilizadas para la produccin de etanol

Una de las ventajas de los sistemas de clulas inmovilizadas es el reso del soporte

en procesos continuos de produccin de etanol, por lo consiguiente el bagazo con

clulas inmovilizadas de Saccharomyces cerevisiae se incubo con medio de

fermentacin y despus del tiempo ptimo de incubacin (16 h) fue retirado y se

transfiri uno fresco para la fermentacin. Este proceso fue repetido. En el sistema la

concentracin mxima de etanol fue de aproximadamente 96 gL durante 13

fermentaciones repetidas e incremento a 100 gL. La concentracin de clulas

inmovilizadas y libres disminuy lentamente durante el proceso de fermentacin. En

la siguiente Figura se muestran 21 baches de la fermentacin (J. Yu et al., 2007).

24

Figura 9. Cintica de fermentacin de clulas inmovilizadas de Saccharomyces

cerevisiae durante la produccin de etanol (J. Yu et al., 2007).

1.3 Industria azucarera

La industria del azcar se ha desarrollado en Mxico en forma interrumpida desde la

dcada de la Conquista espaola, siendo una de las actividades Agroindustriales de

mayor tradicin y trascendencia en el desarrollo histrico del pas. Actualmente en

Mxico existen 57 ingenios azucareros en 15 estados de la Repblica; de los cuales

20 se encuentran en el estado de Veracruz (Figura 10), donde se produce la mayor

cantidad de caa de azcar y por consiguiente la mayor cantidad de bagazo de caa.

Durante el ao 2011 se procesaron 44, 131, 570 toneladas de caa de azcar en la

zafra 2010 - 2011 (CNIAA, 2012).

25

Figura 10. Mapa de la Republica Mexicana, ubicacin de Ingenios Azucareros

(CNIAA, 2012).

La Unin Nacional de Caeros, con informacin proporcionada por las Asociaciones

Locales de Caeros afiliadas a esta Unin, en los 15 estados productores de caa de

azcar, comunica que en lo que va de la presente zafra 2011 2012, al 11 de

febrero, se han molido 19 millones 512 mil 236 toneladas de caa de azcar para

producir dos millones 30 mil 812 toneladas de azcar, con un rendimiento de fbrica

de 10.41%.

Durante la semana del 05 al 11 de febrero se molieron un milln 882 mil 316

toneladas de caa con las cuales se produjeron 211 mil 320 toneladas de azcar

para acumularse a las ms de dos millones de toneladas de azcar producidas

durante la presente zafra (Unin Nacional de Caeros A.C., 2012).

26

1.3.1 Caa de azcar

La caa de azcar es una planta proveniente del sureste asitico. Fue trada a

Mxico en 1522 y la primera plantacin se hizo en el Estado de Veracruz.

El jugo de su tronco es la principal fuente de azcar. Prcticamente el 70% del

azcar del mundo se produce a partir de la caa. Su cultivo es propio de zonas

tropicales y subtropicales, y necesita de abundante agua y suelos adecuados para

crecer bien. Mediante la fotosntesis puede absorber hasta el 2% de la energa solar

que recibe, para convertirla en un 14% a 17% de sacarosa y 14% a 16% de fibra.

El periodo de crecimiento de la caa de azcar toma entre 11 y 17 meses,

dependiendo de la variedad de la caa y la zona de cultivo. La planta retoa varias

veces y se puede seguir cortando (a estos cortes se les conoce como zafras). Debe

renovarse cada siete a diez aos con nuevos retoos porque su riqueza se deteriora

con el tiempo (http://www.bioenergeticos.gob.mx).

1.3.2 Constituyentes de la caa de azcar

El tronco de la caa de azcar est compuesto por una parte slida llamada fibra y

una parte lquida, el jugo, que contiene agua y sacarosa (Tabla 1). En ambas partes

tambin se encuentran otras sustancias en cantidades muy pequeas. Las

proporciones de los componentes varan de acuerdo con la variedad (familia) de la

caa, edad, madurez, clima, suelo, mtodo de cultivo, abonos, lluvias, riegos, etc. Sin

embargo, unos valores de referencia general pueden ser (Monografa de la Caa de

Azcar, Comisin Veracruzana de Comercializacin Agropecuaria):

Tabla 1. Composicin de la caa de azcar (Monografa de la Caa de Azcar,

Comisin Veracruzana de Comercializacin Agropecuaria).

Componente Porcentaje

Agua 73 76 %

Sacarosa 8 15 %

27

Tabla 1. Composicin de la caa de azcar (Monografa de la Caa de Azcar,

Comisin Veracruzana de Comercializacin Agropecuaria) Continuacin.

Componente Porcentaje

Fibra 11 16 %

La sacarosa del jugo es cristalizada en el proceso como azcar y la fibra constituye

el bagazo una vez molida la caa. Otros constituyentes de la caa presentes en el

jugo se presentan en la siguiente Tabla:

Tabla 2. Composicin del jugo de caa de azcar (Monografa de la Caa de Azcar,

Comisin Veracruzana de Comercializacin Agropecuaria).

Componente Porcentaje

Glucosa 0.2 0.6 %

Fructosa 0.2 0.6 %

Sales 0.3 0.8 %

cidos orgnicos 0.1 0.8 %

Otros 0.3 0.8 %

1.3.3 Bagazo de caa de azcar

El bagazo de caa es un desecho fibroso, residuo del tallo o cuerpo de la caa de

azcar (Saccharum officinarum) que se genera despus de haberle exprimido el jugo

durante la produccin de azcar. Por cada tonelada de caa de azcar que se muele

se producen aproximadamente 259 kg de bagazo de caa despus de la extraccin

del jugo. Tradicionalmente sirve de fuente de combustible para la industria

azucarera, as como de forraje para los animales y de abono para las plantas. En la

actualidad en pases como Brasil, India, Cuba y Mxico se utiliza como materia

prima en la industria papelera y como combustible en la industria azucarera,

alcoholera y qumica. En la practica, aproximadamente la mitad es fibra y la otra

mitad es jugo residual, con variaciones que resultan de los procedimientos de la

molienda y de la variedad y calidad de la caa (Rojas Reyes et al., 2002). Una

28

alternativa al uso del bagazo de caa, es el uso como soporte agroindustrial para la

inmovilizacin de clulas de levadura y la posterior produccin de biocombustible.

Algunas levaduras han sido inmovilizadas en una amplia variedad de soportes

naturales y soportes sintticos; unos de los soportes naturales ms ampliamente

utilizados son los materiales lignocelulsicos. Algunos soportes lignocelulsicos

investigados incluyen aserrn, virutas y hojuelas de madera, cascarilla de arroz y

paja. (Shukla et al., 1988; Das et al., 1993; Maryse y Zdravko, 1996).

1.3.3.1 Composicin del bagazo de caa de azcar

El tallo de la caa de azcar esta constituida por dos partes: una esponja central

llamada mdula, que es la que realmente se exprime, y una fibrosa, perifrica

denominada corteza. El bagazo es un material fibroso, heterogneo en cuanto a su

composicin granulomtrica y estructural, que presenta relativamente baja densidad

y un alto contenido de humedades, en la Figura 11 se muestra la composicin de

materiales aprovechables del bagazo y en la Figura 12 muestra la composicin de

la hemicelulosa (Aguilar-Uscanga et al., 2005).

Figura 11. Composicin del bagazo de caa de azcar (Aguilar-Uscanga et al.,

2005).

40%

20%

30%

10%

Composicin del bagazo de caa

Celulosa

Lignina

Hemicelulosa

Otros

29

Figura 12. Composicin de la hemicelulosa (Aguilar-Uscanga et al., 2005).

1.3.3.1.1 Hemicelulosa

Este trmino se utiliza para referirse a un grupo muy extenso de polisacridos que

son diferentes a la celulosa y al almidn. Por lo general este tipo de compuestos son

solubles en soluciones alcalinas concentradas. La hemicelulosa bsicamente

siempre se le encuentra asociada con otro polisacrido como las pectinas, la

celulosa y las gomas. Este tipo de carbohidrato presenta una capacidad de adsorcin

bastante considerable y es lo que se le conoce popularmente con el nombre de fibra

soluble.

1.4 Pretratamiento del material lignocelulsico

Muchos de los materiales lignocelulsicos requieren pretratamientos, parte

importante en los procesos de hidrlisis de cualquier material lignocelulsico. El

bagazo de caa de azcar debe pretratarse antes de la inmovilizacin, con la

finalidad de aumentar la afinidad de las clulas al material lignocelulsico, como se

muestra en la Figura 13 (Cadwell, 2006).

59% 15%

26%

Hemicelulosa

Xilosa

Arabinosa

Glucosa

30

Existen 2 tipos de hidrlisis: la enzimtica y la hidrlisis qumica que a su vez se

divide en hidrlisis alcalina e hidrlisis cida que pueden ser aplicadas para obtener

los azcares monomricos a partir de la fraccin hemicelulsica del bagazo de caa

(Gastlum Martnez, 2007).

Figura 13. Pretratamiento del material lignocelulsico (Cadwell, 2006).

1.4.1 Pretratamiento Fsico

Los materiales de desecho pueden ser reducidos por una combinacin de picado y

molido para reducir la cristalinidad de la celulosa. El tamao de los materiales

despus del cortado vara entre 10 a 30 mm y 0.2 a 2 mm despus del molido. El

molino de bola vibratoria se conoce como el ms efectivo en el rompimiento de la

cristalinidad de la celulosa en los abetos y astillas de lamo, mejorando la

digestibilidad de la biomasa (Millet et al., 1976). El requerimiento de energa para la

reduccin mecnica de material agrcola depende del tamao de partcula final y las

caractersticas de la biomasa (Cadoche et al., 1989).

31

1.4.2 Pretratamiento Qumico

Este pretratamiento puede ser de dos tipos:

a) Utilizando bases (hidrlisis alcalina)

b) Utilizando cidos (hidrlisis cida)

La hidrlisis qumica de residuos hemicelulsicos, se puede dividir en cida y

alcalina. Aqu se utilizan soluciones que se ponen en contacto con el material

hemicelulsico a una temperatura, presin y tiempo determinados. Este mtodo es

fcil de realizar sin embargo se generan subproductos como azcares de menor

tamao y compuestos inhibitorios del metabolismo de las levaduras como cido

actico, furfural, 5-hidroximetil furfural, entre otros (Gastlum Martnez, 2007).

1.4.2.1 Hidrlisis alcalina

Consiste en tratar la materia prima con una base diluida generalmente con NaOH. En

ausencia de deslignificacin, la extraccin de las hemicelulosas por una base diluida

es generalmente incompleta. La holocelulosa puede ser fcilmente separada en

celulosa y hemicelulosa por una solubilizacin alcalina seguida de una

deslignificacin (solucin tampn de clorito de sodio y cido actico a 75 C). Una

parte de la materia prima (fraccin A) se obtiene mediante precipitacin de

hemicelulosas, constituidas por L-arabino, D-xilanos y residuos de cidos

glucurnicos. La adicin de etanol precipita la fraccin B (Heteroxilanos sustituidos

ricos en arabinosa, galactosa y cido urnicos).La proporcin exacta de varios

azcares depende de la naturaleza de la materia prima y de la forma en la cual se

hidroliza. Estos azcares contaminantes pueden complicar la cristalizacin y

purificacin de Xilosa. La produccin de xilitol a partir de una fraccin de xilano es

alrededor del 50 al 60 % de la materia prima utilizada (Prez Bibbins, 2007).

32

1.4.2.2 Hidrlisis cida

Se ha descrito varios mtodos para la hidrlisis de los materiales celulsicos,

teniendo entre las mas importantes la hidrlisis acida (Olsson y Hahn-Hgerdal,

1996).

La hidrlisis acida es rpida y fcil, el acido puede penetrar profundamente en la

estructura morfolgica de la celulosa para efectuar una reaccin secuencial de

pseudo primer-orden. Normalmente la hidrlisis es llevada a cabo usando cidos

minerales tales como el H2SO4 o el HCl a temperaturas entre 120 y 200 C (Grethlein

y Converse, 1991; Torget y Hsu, 1994).

El proceso de hidrlisis cida tiene una ventaja econmica clara, las reacciones son

rpidas (minutos en vez de horas) y el cido inorgnico es econmico (el reactivo

qumico activo).

La hidrlisis cida es frecuentemente usada como un pre-tratamiento debido a que

puede ser adaptada a una amplia variedad de materias primas. Excepto en el caso

de hidrlisis con cido clorhdrico; esta es llevada a cabo generalmente a elevadas

temperaturas (100-240 C) durante varios periodos.

El cido sulfrico puede ser usado en forma concentrada, pero se usa en una

solucin diluida de 0.5 a 5 % (sobre una base p/p con slidos secos). El uso del

cido concentrado permite bajas temperaturas y presiones de la hidrlisis con pocos

subproductos producidos.

La hidrlisis, econmicamente hablando, ms efectiva es generalmente con cidos

diluidos utilizando el cido sulfrico entre 1 y 5 %. Este es utilizable para hidrolizar

maderas o residuos agrcolas y los rendimientos de azcares hemicelulsicos

pueden ser de 80 a 95 %.

El cido clorhdrico concentrado (47%) es utilizado algunas veces para hidrlisis con

otros cidos fuertes debido a que es relativamente fcil de recuperar. La hidrlisis

con cido clorhdrico concentrado proporciona uno de los rendimientos ms altos de

33

azcar. Se lleva a cabo a temperatura ambiente, la desventaja es que es altamente

corrosivo, voltil, caro, y quiz recuperarlo completamente sea esencial para hacer el

proceso econmico.

En la hidrlisis cida se obtienen azcares tales como:

Xilosa

Glucosa

Arabinosa

Manosa

Galactosa

As como los siguientes inhibidores:

Galactosa

Derivados de furanos (Furfural, HMF)

cidos alifticos (cido actico, cido frmico, cido levulnico)

Compuestos Fenlicos (Vainillina)

1.4.3 Hidrlisis enzimtica

La hidrlisis de celulosa utilizando enzimas tiene la ventaja de proceder en

condiciones de temperatura ambiente. Esto elimina el costo de construir y operar

reactores a altas presiones y temperaturas. Sin embargo, la hidrlisis enzimtica es

lenta, por lo cual se necesita recipientes de reaccin muy grande, y las enzimas son

muy caros y difciles de reutilizar (Prez Bibbins, 2007).

La hidrlisis enzimtica se lleva a cabo usando enzimas celulolticas. Los sistemas

de enzimas celulolticas son una mezcla de -glucosidasas, -1,4 endo-

glucanglucanhidrolasas, y -1,4 exo-glucancelobiohidrolasas (celulasas).

A pesar de ser un mtodo altamente selectivo, la hidrlisis enzimtica es inhibida por

los productos mismos generados durante el proceso con lo que la eficiencia de

34

hidrlisis se reduce (Palmqvist y Hahn-Hgerdal, 2000). Por otro lado es un proceso

de elevados costos debido al uso de enzimas comerciales especficas.

1.4.4 Otros pretratamientos

Actualmente se han probado una nueva metodologa de hidrlisis llamada explosin

de vapor. Esta consiste en elevar la presin a altos valores y posteriormente

despresurizar sbitamente el reactor. Con esto se pulveriza debido:

Al choque de presin la materia fibrosa se hidroliza en mayor medida la hemicelulosa

liberndose los azcares (Arrizon, 2007). Sin embargo, este mtodo tiene la

desventaja del costo del equipo, mientras que la hidrlisis cida o bsica se puede

realizar en cualquier autoclave de marca comercial.

De manera general, la hidrlisis cida es el mtodo preferido por practicidad y

buenos resultados para liberar los azcares de la fibra por lo que se han realizado

estudios en los que se modifican las condiciones de hidrlisis para obtener la

concentracin ms alta de xilosa.

Se han variado condiciones con ese objetivo como los tipos de soluciones acidas

(por ejemplo: H2SO4, HCl, HNO3) y alcalinas empleadas en la hidrlisis, tiempo de

contacto del cido con el material hemicelulsico y temperatura de operacin. Sin

embargo los rendimientos en xilosa, de los dems azcares y de otros componentes

(cido actico, furfural, 5HMF), estn en funcin el tipo de material hemicelulsico y

de la metodologa de hidrlisis (tipo de cido o base, tiempo, temperatura, relacin

material hemicelulsico-solucin de hidrlisis, entre otros).

35

2. JUSTIFICACIN

En la actualidad, no se satisface la demanda de etanol a nivel nacional para su uso

en la industria; as como tambin es necesario utilizar procesos para la obtencin de

fuentes de energa renovables (biocombustibles, etanol) que atiendan las demandas

del sector energtico.

Existen varias caractersticas y ventajas que ofrecen los sistemas de inmovilizacin

para la explotacin de clulas inmovilizadas en lugar de la utilizacin de clulas

libremente suspendidas; proporcionan una larga estabilidad, existe mayor

rendimiento de la fermentacin, alta actividad biocataltica, el agente biolgicamente

activo se concentra en un volumen pequeo tanto como sea posible, reutilizacin de

las clulas inmovilizadas, durabilidad funcional del sistema de inmovilizacin.

36

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo General

Establecer las condiciones para la inmovilizacin de P. stipitis ACL 2-1 en

bagazo de caa de azcar prehidrolizado con HSO para la produccin de

etanol (biocombustible).

3.2 Objetivos Especficos

Optimizar las condiciones de inmovilizacin por adsorcin de P. stipitis

ACL 2-1 para la produccin de etanol (tamao de inculo, relacin

lquido:slido y tiempo).

Evaluar la cintica de inmovilizacin bajo las condiciones ptimas

establecidas.

Evaluar la estabilidad de la inmovilizacin en la produccin de etanol por P.

stipitis ACL 2-1.

37

4. MATERIALES Y MTODOS

4.1 Materia prima

Se utiliz bagazo de caa de azcar procedente del ingenio Adolfo Lpez Mateos

(zafra 2007-2008).

Se procedi a su secado directo al sol y posteriormente en estufa a 100C. Se tritur

en un molino de martillos (Modelo 6, Molinos Lasser, Tlanepantla, Mxico) y

posteriormente el bagazo molido fue tamizado a fin de obtener una fraccin de

tamao de partcula de 4.75mm.

4.1.1 Pretratamiento de la materia prima

El bagazo de caa fue sometido a la accin del H2SO4 diluido (2% w/v) utilizando una

relacin slido-lquido de 1:14, la etapa de hidrlisis fue llevada a cabo a 121C

durante 40 minutos en autoclave, posteriormente el bagazo hidrolizado fue prensado

con la finalidad de obtener un filtrado libre de residuos slidos y finalmente se realiz

el secado natural del bagazo prensado.

El bagazo seco se neutraliz realizando lavados continuos con agua destilada hasta

obtener un pH de 5.5 6 y nuevamente se sec naturalmente. El bagazo

neutralizado se esteriliz en autoclave a 121C durante 15 minutos.

4.2 Microorganismo

La levadura utilizada es una cepa mutante deficiente respiratoria conservada en el

Laboratorio de Bioingeniera de la UNIDA, tal cepa es: P. stipitis ACL 2-1; la cual fue

mutada y seleccionada por Rasgado-Mellado (2011); presenta una deficiencia en el

38

citocromo C de la cadena de transporte electrnico a nivel mitocondrial por lo que

favorece el metabolismo fermentativo sobre el respiratorio, adems presenta una

mayor resistencia a etanol de 4.7% w/v. (Rasgado-Mellado, 2011).

4.3 Medios de cultivo

4.3.1 Medio de cultivo para conservacin y crecimiento

La levadura utilizada se mantuvo en cultivo fresco resembrando mensualmente en

medio sinttico slido donde se conserv en cajas Petri bajo refrigeracin a 4C; con

la composicin indicada en la Tabla 3.

Tabla 3. Composicin del medio de cultivo para conservacin.

Componente gL

Agar agar 20

Extracto de levadura 10

Glucosa (C6H12O6) 20

4.3.2 Medio de cultivo para activacin y precultivo

El medio sinttico lquido de la cepa utilizado, presenta la siguiente composicin que

se indica en la Tabla 4 utilizando como fuente de carbono glucosa (C6H12O6) y un pH

inicial de 5.5. Los medios se esterilizaron en autoclave a 121C durante 15 minutos

en matraces Erlenmeyer

Tabla 4 Composicin del medio de cultivo para conservacin.

Componente gL

Glucosa 70.0

Extracto de levadura 1.0

Fosfato de potasio monobsico (KH2PO4) 5.0

Sulfato de magnesio (MgSO4-7H2O) 0.4

39

Tabla 4 Composicin del medio de cultivo para conservacin (Continuacin).

Componente gL

Sulfato de amonio ((NH4)2SO4) 2.0

4.4 Condiciones del cultivo

La levadura utilizada se activ tomando tres asadas de una caja de medio slido en

conservacin y se pas al medio sinttico lquido incubndolo durante 12 h a 150

rpm y 30 C para ello se utiliz una incubadora con agitacin/refrigeracin, para

adaptar la cepa a la nueva fuente de carbono sustrato y su concentracin;

posteriormente se realiz un pase a otro matraz a las mismas condiciones para

finalmente obtener el inculo deseado en la fase exponencial, para el inicio de cada

cintica, dichos medios de cultivo antes de ser esterilizados fueron ajustados a un pH

de 5.5, utilizando H3PO4 y NaOH.

4.5 Inmovilizacin

Para la inmovilizacin de las clulas de levadura, se procedi a la activacin de P.

stipitis ACL 2-1 y la preparacin del preinculo, de acuerdo a lo mencionado

anteriormente. Posterior al crecimiento del microorganismo se prepararon 3

diferentes tamaos de inculo: 3x106, 3x107 y 3x108 cel mL.

El inculo obtenido fue centrifugado a 10,000 rpm durante 10 minutos. El pellet fue

recuperado, lavado y resuspendido en un volumen conocido de medio estril para la

inmovilizacin; se utilizaron dos diferentes tipos de medio lquido: medio con fuente

de carbono (glucosa 70 gL) y medio con una solucin isotnica (NaCl 9 gL) los

cuales se utilizaron en diferentes proporciones de soporte lquido para los

experimentos del diseo estadstico (1:16, 1:20 y 1:20).

40

Al mismo tiempo se esteriliz bagazo de caa de azcar hidrolizado y neutralizado

en matraces Erlenmeyer (121 C, 15 min). Posterior a la preparacin de los tamaos

de inculo y relacin soporte lquido, los experimentos fueron incubados a 30C,

durante 16, 20 y 24 h.

Despus de la incubacin se tomaron alcuotas para la determinacin de cuenta y

viabilidad celular; el soporte inmovilizado fue lavado con agua destilada estril y

secado a peso constante para la obtencin de las respuestas a evaluar: eficiencia y

retencin.

4.6 Mtodos analticos

4.6.1 Cuenta y viabilidad celular

Para las cinticas en medio sinttico, la medicin de la biomasa se determin por

conteo al microscopio del nmero de microorganismos contenidos en un volumen

conocido, empleando una cmara de Thoma en un microscopio (objetivo 40x). Las

muestras de cultivo son diluidas con el fin de contar cada vez un nmero mximo de

500 clulas; se coloc una alcuota de la solucin celular en la cmara de Thoma

(celda hemacitomtrica); esta cmara tiene un volumen conocido, delimitado por

lneas, (Figura 14) el cual se llena con una suspensin de clulas. Cada conteo se

realiza a partir de 5 cuadros grandes de la cmara Thoma. El volumen de cada

cuadro es de 4x106 mL. La concentracin de clulas (x) por mililitro del medio esta

dado por la ecuacin:

x =Nxd(1x10 )

4xn

Donde:

N: nmero de clulas vivas contadas

d: dilucin empleada

n: nmero de cuadros contados.

41

El conteo de las clulas viables de levadura se estima por conteo de clulas vivas al

microscopio despus de haber estado en contacto con el colorante azul de metileno.

La muestra se mezcla con el colorante en una relacin 1:1 y se deja reposar 5

minutos para diferenciar las clulas vivas y las clulas muertas. Despus del tiempo

de contacto, se realiza la determinacin al microscopio, en donde las clulas viables

no presentan coloracin alguna, mientras que las clulas muertas son coloreadas de

azul. Adems el azul de metileno, es un colorante de xidoreduccin, y es reducido

por una hidrogenasa y se vuelve incoloro (forma reducida) si la clula est viva. Este

mtodo permite fijar la tasa de inoculacin y el estado fisiolgico de las levaduras

durante la fermentacin.

Con el uso de este mtodo se tiene la seguridad de inocular una cantidad exacta de

levaduras en estado viable para cada una de las fermentaciones que se desean

realizar.

De acuerdo a lo reportado por Lange (1993) se calcula la viabilidad celular con la

siguiente ecuacin:

d d d =N d

N d x 100

Figura 14. Cuenta celular en cmara de Thoma.

42

4.6.2 Determinacin de peso seco

Para la determinacin del peso seco a partir de las cinticas realizadas en medio

sinttico con glucosa como fuente de carbono a 70 gL-1, por duplicado, se filtraron 20

mL del medio de cultivo en crecimiento, para recuperar las clulas en membranas

Millipore de 0.45 m, previamente a peso constante. Al mismo tiempo se realiz un

conteo directo para posteriormente realizar una curva de correlacin entre DO

(densidad ptica) y el nmero de clulas. Enseguida estas membranas fueron

llevadas a la estufa con la muestra de clulas filtradas, hasta su peso constante

(78C por 72 horas), al trmino de las cuales, se determin el peso seco de las

clulas contadas en cada muestra y se hicieron correlaciones para DO y nmero de

clulas. La ecuacin de correlacin obtenida para DO fue: y = 0.7558x - 0.0327 y

para el nmero de clulas fue: y = 5E-09x + 0.0926 (Figuras 15 y 16).

La ecuacin de la recta se utiliz para calcular la concentracin celular en medio

sinttico al correlacionar la DO con el peso seco. Esta tcnica no se utiliz para el

medio con bagazo de caa de azcar inmovilizado, debido a que el medio es de

color inestable y muy turbio debido a los slidos que contiene.

43

Figura 15. Correlacin DO contra Peso seco (gL) de P. stipitis ACL 2-1.

Figura 16. Correlacin del nmero de clulas (cel mL) contra Peso seco (gL) de P.

stipitis ACL 2-1.

y = 0.7558x - 0.0327 R = 0.998

0

1

2

3

4

0 5

Peso

seco

(g

L

)

Densidad ptica (620nm)

y = 5E-09x + 0.0926 R = 0.9918

0

1

2

3

4

0.E+00 5.E+08 1.E+09

Peso

seco

(g

L

)

Concentracin celular (Cel/mL)

44

4.6.3 Anlisis de sustratos y productos

La concentracin de glucosa, glicerol, etanol, cido actico fue determinada

mediante Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin (HPLC) Waters 600

utilizando una columna Shodex SH-1011, especfica para la separacin de azcares,

cidos orgnicos y alcoholes, columna de exclusin molecular e intercambio

catinico combinada.

La fase mvil empleada fue H2SO4 5mM. El detector utilizado fue el ndice de

refraccin. Las condiciones fueron: 0.6 mLmin, 55C. a su vez, el volumen

inyectado fue de 20L por medio de un automuestreador Waters 1700 plus.

Las muestras fueron centrifugadas a 10,000 rpm durante 10 minutos y congeladas.

El software utilizado fue el Data Apex v.2.0 por medio del clculo del rea del pico y

la concentracin de la muestra mediante una correlacin con estndares

previamente realizados.

4.7 Anlisis de datos experimentales

4.7.1 Clculo de rendimientos y productividad

La ecuacin de rendimiento Yx/s (gramos biomasa/gramos de sustrato) que expresa

la biomasa respecto al sustrato es definido como:

=

Donde:

: Rendimiento

(gramos biomasa/gramos sustrato)

: Biomasa inicial (gL)

: Biomasa (gL)

: Sustrato inicial (gL)

: Sustrato (gL)

45

La ecuacin de rendimiento Yp/s (gramos de producto/gramos de sustrato) que

expresa el producto respecto al sustrato es definido como:

=

Donde:

: Rendimiento

(gramos producto/gramos sustrato)

: Producto inicial (gL)

: Producto (gL)

: Sustrato inicial (gL)

: Sustrato (gL)

La ecuacin de productividad P (gramos de producto L h) que expresa la

velocidad de formacin de producto es definido como:

=

Donde:

: Productividad

(gramos producto L h)

: Producto final (gL)

: Tiempo final (horas)

4.7.2 Clculo de retencin y eficiencia de la inmovilizacin

La ecuacin de retencin de la inmovilizacin (considerando la humedad del soporte)

es definida como:

=

46

Donde:

: Peso inicial del soporte (gramos)

: Peso final del soporte (gramos)

: Soporte utilizado (gramos)

La ecuacin de eficiencia de la inmovilizacin (gramos de clulas

inmovilizadas/gramos de clulas totales) es definida como:

=

Donde:

: Eficiencia (porcentaje)

: Clulas inmovilizadas (gramos)

: Clulas libres (gramos)

4.7.3 Anlisis estadstico

Se emple el diseo de superficie de respuesta Box-Behnken (Box Behnken 1960),

el cual fue llevado a cabo con tres factores: tamao de inculo, relacin lquido

soporte, tiempo. El ensayo const de 15 corridas base por duplicado, siendo as un

total de 30 corridas. Para la evaluacin de la variable de respuesta se emple un

anlisis d