UNIVERSIDAD COMPLUTENSEDE MADRIDFACULTAD DE VETERINARIA

DEPARTAMENTO DE PATOLOGíA ANIMAL 1

ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LA DEFICIENCIA EN SELENIOY VITAMINA E EN LA LISTERIOSIS MURINA.

JOSEANTONIO GARCíA CABRERA

MEMORIA PRESENTADA PARA OPTAR AL TITULO DEDOCTOR EN VETERINARIA

Directoresdc a tesisDr. D. Lucas Do,ní,,gueiRodríguezDr. 1). Victor BrionesDiesteDr. 1). JoséFranciscoFernández-Garayzábal

Madrid, 1995

úD~ [OS ¿icffes y fiunzifdesp uede.n salir [ossantos,pocasveces[ossabios.

Santiago£Pyanióny Cajal

~$1Ana

A mis paifres

AGRADECIMIENTOS

Cuando uno llega al final de un camino tan sólo se recuerdan los buenos momentos, y se

tiende a olvidar todas las dificultades y malos tragos que se han tenido que pasar. Sin embargo, no

quisiera olvidarlos sin recordar antes a todos los que, de alguna manera, han colaborado a que este

trabajo haya podido ver la luz.

A los tres directores de la presente Tesis:

Al Dr. Lucas Domínguez por numerosas razones imposibles de enumerar, por la paciencia que

ha demostrado conmigo, su comprensión ante mi desánimo y su preocupación por mí, que ha

ido más lejos de lo exigible a un director por su pupilo.

Al Dr. Víctor Briones por compartir tantos sacrificios, así como por su amistad.

Al Dr. José Francisco Fernández-Garayzábal, porsus acertados consejos y enfoques durante

la realización del presente trabajo.

A D~. Ana Doménech, porque si valoro en mucho su capacidad de trabajo y rigor en el

laboratorio, valoro aún más su voluntad y capacidad de sacrificio fuera de él.

Al Dr. Guillermo Suárez por sus consejos, y su ejemplo de dedicación a la Universidad.

Al Dr. Joaquín Goyache, porque siempre ha estado ahi, incluso en los momentos más críticos.

A los Drs. José Luis Blanco y Marta García, por tanto tiempo perdido conmigo.

A las Dras. María Teresa Cutu¡i, Ana Mateos y M~ Jesús Payé, por ofrecerme sus consejos

y su ayuda desinteresada.

A la Dra. Esperanza Gómez-Lucía, por su carácter jovial y por tener siempre una palabra

amable.

Al resto del equipo listerias, Dra. Mar Blanco, compañera de fatigas durante todo este tiempo:

Dr. José Antonio Vázquez-Boland, ejemplo de combatitividad, incluso en inferioridad aquí y en Berlín;

Dras. Alicia Gibello y Mónica Suárez, que aunque han sido las últimas incorporaciones no han

regateado esfuerzos para ponerse a la altura del resto; D~. Mayte Ripio y D. Gustavo Domínguez, claro

ejemplo de que se puede disfrutar de la vida aunque sea en el laboratorio; D~. Belén López, toda una

Al resto de compañeros de Microbiología del Departamento de Patología Animal 1, Dr. Miguel

Angel Moreno, porque ha sabido trasmitir su carácter organizativo a todo aquello en lo que interviene;

0. Ignacio Septién, porpresentarme al “Orfeón Burgalés”; D8 Alicia Aranaz y D. Ernesto Liébana, “tanto

monta, monta tanto...”; D. Louie LLames, por haber sabido apreciar lo mejor de las costumbres

españolas; 08. Mercedes García, por saber aclimatarse a cualquier situación; D. Félix Fernández y 08.

Pilar Capón, porque siempre han estado prestos a ayudar.

Al Dr. Ricardo de la Fuente, por su ejemplar actitud.

A los Dra. José Antonio Orden y José Antonio Ruiz-Santa Quiteria, compañeros de “cubículo,

dispuestos a cualquier cosa para mejorar la convivencia.

Al resto de integrantes de Patología Infecciosa del Departamento de Patología Animal 1, en la

que me encuentro perfectamente integrado.

A los restantes miembros del Departamento de Patología Animal 1, con los que la convivencia

diaria es todo un placer.

Al Dr. Javier Cañón, del Departamento de Producción Animal, por su inestimable ayuda en

el estudio estadístico.

A los Drs. Mariano Domingo y Alberto Marco, así como a D~. Neus Prats ya D. Jaume Altimira,

del Departamento de Anatomía Patológica e Histología de la Facultad de Veterinaria de la Universidad

Autónoma de Barcelona, sin cuya colaboración la parte histológica de este trabajo hubiera tenido

mayores dificultades. A los tres últimos, además por una cena “inolvidable” en Madrid.

A todos aquellos que, por un imperdonable error, han quedado fuera de esta relación, muchas

gracias.

INDICE

Indice

INTRODIJCCION

1.1- BREVE RESEÑA HISTORICA

1.11- TAXONOMíA

lila- TAXONOMÍA INTERGENERICA

l.II.b- TAXONOMíA INTRAGENERICA

1.111- ESTRUCTURA ANTIGENICA

¡.1V- EPII)EMIOLOGIA DE LA LISTERIOSIS

IIVa- RESERVORIOS

1.IV,b- VíAS DE TRANSMISION

1 IVe- MARCADORES EPIDEMIOLOGICOS

1V- ENFERMEDAD

IVa- PENETRACION EN EL HOSPEDADOR

1.V,b- CINETICA DE LA INFECCION Y RESPUESTA

[VI- FACTORESPREDISPONENTES

IVII- FORMAS CLíNICAS

IViIa- MENINGITIS Y ENCEFALmS

I.VII.b- INFECCION MATERNO-FETAL

1 ,VII,c- INFECCIONESSEPTICEMICAS

1.VII.d- OTRAS FORMAS CLíNICAS

1 VIII- DEFICIENCIAS NUTRICIONALES Y ENFERMEDAD

1 IX- IMPORTANCIA BIOLOGICA DEL SELENIO

1 IXa- ACCIONES BIOLOGICAS. ENZIMAS.

1 .IX.b- TOXICIDAD DEL SELENIO

1,IX.c- DEFICIENCIA EN SELENIO

I.IX.d- SELENIO Y SISTEMA INMUNE

INMUNE

l.IX.d.1- Influencia sobrela función fagocítica

1.IX.d.2- Influencia sobrela producciónde

anticuerpos

1.IX.d.3- Influencia sobrela función secretora

de las célulasdel sistemainmune

1.IX.d.4- Influencia sobrela capacidad

proliferativadc los linfocitos T y E

1.X- SELENIO Y RESISTENCIAA ENFERMEDADES INFECCIOSAS

2. OBJETIVOS

3. MAtERIAL Y METODOS.,,.,

3.1- MATERIAL

3.11- MEDIOS DE CIJETIVO

3.111- 501.1ICIONES

3.1V- CEPAS

2

3

6

9

12

12

14

15

18

¡8

21

24

28

28

29

30

31

32

36

36

39

41

43

45

47

49

50

52

55

58

59

59

60

62

Indice

3.V- ANIMALES DE EXPERIMENTACION

3.VI- ALIMENTO Y AGUA DE BEBIDA

3.VI,a- RATONES NORMALES

3.VI.b- RATONES DEHCIENTESEN SELENIO Y VITAMINA E

3.VII- OBTENCION DEL INOCULO

3.VIII- INOCIJLACIONES

3 VIlla- INOCULACIONES ENDOVENOSAS

3,VIII.b- INOCULACIONES ORALES

3.IX- SACRIFICIOS Y OBTENCION DE LOS ORGANOS

3.X- CALCULO DE LA DOSIS LETAL 50 (DL5O) PORVIA

ENDOVENOSA

3.XI- ESTUDIOS DE MORTAnDAD POR VíA ORAL CON DOSIS UNICA

3.XII- ESTUDIODE MORTALIDAD POR VíA ORAL CON DOSIS

REPETIDAS

3.XIU- SEGUIMIENTO DE LA INFECCION POR VíA ENDOVENOSA..

3.XIV- ESTUDIO DE LA INFECCION PORVíA ORAL

3,XIV.a- SEGUNLA VíA DE INOCULACION EMPLEADA

3.XIV.b- SEGUN LA CEPA EMPLEADA

3.XIV.c- SEGUNDOSIFICACION UNICA O REPETIDA

3.XV- ESIUDIO DE LA INFECCION POR VíA ORAL EN RATONES

DEFICIENTES/NODEFICIENTES

3.XV.a- SEGUIMIENTO DE LA INFECCION POR VíA ORAL

CON DOSIS UNICA

3,XV.h- SEGUIMIENTODE LA INFECCION POR VíA ORAL

CON DOSIS REPETIDAS

3.XVI- ESTUDIO IIISTOPATOLOGICO

3.XVI.a- PREPARACION DE LAS MUESTRAS

3.XVI.b- ESTUDIO HISTOLOGICO

3.XVII- DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE SELENIO

3.XVIII- VALORACION DE LA DEFICIENCIA EN SEI.,ENIO EN

FUINCION DEL GRADO DE HEMOLISIS

3.XIX- ESTUDIOESTADíSTICO

.4 RESULTADOSY DISCIJSION

4,1- VALORACION DE LAS CONCENTRACIONESDE SELENIO EN

1-lIGADO

4.11- ESTUDiOSDF. MORTALIDAD

4.II,a- DL50 VíA ENDOVENOSA

4.II,b- MORTALIDAD POR VíA ORAL CON DOSIS UINICA Ql

63

63

63

63

64

66

66

66

67

71

72

73

73

76

76

76

78

78

78

81

81

81

83

83

84

84

86

87

91

Ql

II

Li’dice

4.II.c- MORTALIDAD PORVíA ORAL CON DOSIS REPETIDAS. 94

4.111- SEGUIMIENTO DE LA INFECCION POR VíA ENDOVENOSA 96

4.lli.a- DOSIS io4-5 .,... 96

4mb- DOSIS i0~5 101

4.1V- SEGUIMIENTO DE LA INFECCION POR VíA ORAL CONDOSIS

UNICA 105

4.IV.a- CON Listeria ,oonocvtogenes4b ..... 105

4.IV.h- CON Listeria monocytcgenes112a 119

4.IV.c- COMPARACION DE AMBAS SEROTIPOS 119

4V- SEGUIMIENTODE LA INFECCION POR VTA INTRAGASTRICA , 123

4.VI- COMPARACION DE LAS VIAS ORAL-INTRAGASTRICA 127

4.VII- SEGUIMIENTODE LA INFECCION POR VíA ORAL CON

100 7 DíAS ..,............ 128

4.VIII- DEHCIENCIA EN SELENIO Y VITAMINA E Y

SUSCEPTIBILIDAD A LA LISTERIOSIS 132

5. CONCLUSIONES 137

6. RESUMEN 140

7. BIBLIOGRAFIA 142

III

1. INTRODUCCION

1 utroducción

1.1- BREVE RESEÑAHISTORICA

La historia del género Listeria es relativamentereciente, ya que arrancade la

descripciónque Murray, Webb y Swann hacendel microorganismoresponsablede una

epizootiaentre los conejosy cobayosde su laboratorioen 1924 (Murray et aL, 1926). Al

considerarque la bacteriaaisladaporellosno habíasido descritaaúndecidenbautizaríacomo

“Bacteriurn monocytogenes’,al cursarel procesoinfeccioso,como signo máscaracterístico,

con una intensamonocitosis.

Sin embargo,parecequeestosautoresno fueron los primerosen encontrarsecon L.

monocytogenes.En 1911 GustavHtilphers habíaaisladoun microorganismomuy similar a

partir de lesionesnecróticasde hígadode conejo; desgraciadamentesus cultivos no fueron

conservadosy, por tanto, no pudieronsercontrastadoscon los de Murray, Webb y Swann.

Porotra parte.en 1921 Dumonty Cotonidescribenun microorganismoparecidoa “Bacterium

rnonocvtogenes”,aisladoa partir de un casode meningitishumana.Estos autoresunicamente

señalaronquesetratabade unabacteriamuyparecidaa la productoradel Mal Rojo del cerdo.

Este descubrimientopemanecióignorado durantemuchos años, al no ser colTectamente

interpretado,por lo queseconsiderancomoauténticosdescubridoresdel géneroa los autores

citadosen primer lugar.

Posteriormente,Pide aislauna bacteriagram-positivaa partir de un broteepizoótico

en gerbos(Tatera lobenguiae)duranteel cursode unasinvestigacionessobrela pestehumana

en Sudáfrica. Al no encontrarreferenciaalguna sobre la enfermedad,cuya lesión mas

importanteconsistíaen la existenciade focosnecróticosen hígado,ni sobreel agentecausal

propuso denominarlasrespectivamente“Tiger River Disease’ atendiendoa la localizacion

geográficaen que seproduce(zonadel río Tiger, en el estadolibre de Orange),y “Listerella

hepatolytica’ (Pirie, 1927) en honor a Lord Lister.

A partir de ese momento se suceden las aportacionesque involucran a este

microorganismoen la etiologíade diversosprocesosinfecciosos.Así, Nyfeldt (1932) la aísla

a partir de sangrede individuosenfermoscon un cuadroclínico de mononucleosis(‘Listerella

monocvtogeneshominis”), relacionándolapor primeravezcon un cuadroinfecciosohumano.

PocosañosdespuésBurn establecelos descuadrosprincipalesde la listeriosishumana,al

2

Introduccion

aislarlaen 1933 de casosde septicemianeonatal,y en 1935 de cuadrosde meningoencefalitis

fatal en adultos.Sin embargo,los trabajosde Burn (1935, 1936) fueron prontoolvidados,ya

que en 1951 Reiss, Potel y Krebs publican sus hallazgos sobre la “granulomatosis

infantiseptica” de la que responsabilizana “Corynebacrerium infanriseprica”, que. sin

embargo,no eraotra que L. rnonocytogenes tal y como demostróSeeligerposteriormente

(Seeliger, 1952). Peroestosautoresno fueron los primerosen confundir L. nionocvtogenes

con unacorinebacteria,en 1934 Schultz et al. describencomoagenteresponsablede cuadros

de meningoencefalitishumanaa “Corynebacreriumparvulum”.

Con lo expuestohasta ahora, debemosestar de acuerdocon las afirmacionesde

Vázquez-Boland(1989),segúnlas cualesla listeriosis neonatalen fonria de “granulomabosís

infantiseptica” habría sido observadacon anterioridad a la descripción de Burn ya

mencionada.Estos cuadroshabrían sido recogidos bajo la denominaciónde “septicemia

neonatal’ y se habríaresponsabilizadode ella a “bastoncillosgram-positivoso argentófilos’.

sin que sellegasea establecersu correctaetiología.

Las primerasaportacionesen relación con la listeriosis dentro del mundo de la

Veterinaria,son debidasa GuI (1933, 1937). Esteinvestigadorfue el primeroen relacionar

una afeccióndel sistemanerviosode las ovejas,la llamada“circling disease’o torneo (hoy

por extensióntodaafeccióndel sistemanerviosocentralde los rumiantespor Listeria) con

un microorganismoal que denomina“Ltnerella ovis”.

Por fin, en 1940Pirie proponecomo nuevonombredel géneroel de Listeria ya que

el de ‘Listerella” ya sehabíaempleadocon anterioridadparadesignara un génerovegetal.

1.11- TAXONOMIA

1.I1.a- TAXONOMIA INTERGENERICA

Listeria es un género formado por bacilos gram-positivos,mesófilos, aerobioso

anaerobiosfacuhativos,no capsuladosni formadoresde esporos,catalasapositivos, no

miceliaresy productoresdel ácidoL(-i-)láctico en el metabolismofermentativode la ghícosa.

Por todo esto,esfácil suponerquelas relacionestaxonómicasintergenéncasde ListeRohayan

3

Introducción

sido productode gran controversiaduranteaños.

En la 7~ edición del Bergey’s Manual (Breed et aL, 1957) se incluyen dentro de la

familia Corynebacteriaceae,con el géneroCorynebacteriurncomo génerotípico, atendiendo

a sus característicasmorfológicas. Dentro de esa misma familia se incluía el género

Erysipelothrix,con el que algunosautoresconsiderabanmuy relacionadasa Listerio (Jones,

1975). Posteriormente,y atendiendoa estudios de taxonomíanumérica(Davis y Newton,

1969; Davis er aL, 1969; Stuarty Pease,1972; citadospor Vázquez-Boland,1989; Stuarty

Welshimer,1973, 1974)y de composiciónquímicade la pared(Cumminsy Harris, 1956)se

demostróque las listeriaserandistintas a las corinebacterias,y que incluso no estabantan

relacionadascon Erysipelorhrixcomo secreíaen un principio. Segúnestosestudios,parecían

másemparentadascon Staphylococcus,Racillus,Kurthia y, sobretodo, Brochotrix.Por todo

ello, en la 8~ edición del Bergey’sManual (Seeligery Welshimer, 1974) el géneroListeria

apareceseparadode la familia Corynebacteriaceaey esincluido entrelos génerosde filiación

inciertajunto con Erysipelothrix, Ca.ryophanony la familia Lactobacillaceae,mientrasque

BroChotrix (poraquelentoncesMicrobacteriurnrherrnophactum)y Kurthia sí semantuvieron

dentrode la familia Corynebacteriaceae.

Esta separaciónde las corinebacteriasfue confirmadapor posterioresestudiosde

taxonomía numérica (Jones, 1975; Wilkinson y Jones, 1977; Jones et aL, 1986),

quimiotaxonomia(Tadayony Carrol, 1971; Srivastavay Siddique, 1973; Kamisangoet aL,

1982; Collins y Jones,1981; Fiedíery Seger,1983; Fiedíeretat, 1984;citadosporVázquez-

Bolanó, 1989; Joneset al., 1979, 1986), composicióndel AUN e hibridación AUN-AUN

(Stuarty Welshimer, 1973, 1974, citadosporVázquez-Boland,1989; Rocourt et al., 1982).

Estos estudiosconfirmaron a su vez la estrecharelación entre Listeria y Lactobacillus,

Streptococcus,Enterococcus,Lactococcus,Staphylococcus,Racillusy Kurthia, observándose

la máximaproximidadconBrochotrix(Kandlery Weiss,1986; Seeligery Jones,1986;Jones,

1988). Géneroscaracterizadostodos ellos por poseerun bajocontenidode G+C en su AUN

(36-42%),por no tenerácidosmicólicospero sí lipoteicoicos,por tenerpeptidoglicanode la

variedad Al gammaasociadoa ácidosteicoicos del tipo polirribitol-fosfato, y por poseer

comomenaquinonaprincipal la MK 7 (Joneset al., 1972; Ruhlandy Fiedler, 1987; Fiedler,

1988,; citadospor Vá-zque-z-Boland,1989; Seeligery Jones,1986).

4

~ete~ia—

ac,:cac:¡Ius:7:u:

— vrerc::z

e05

oo51

6-05o5

e’o

eaoe’c

Mee:otasr¿S—

•ar:ctjs 2 •. ¡res—

o

oa‘eo

.3-.-

c<~o

.0’‘Ú~ </7/7 <‘

‘5 ,/ -¼,.,

- - . 3..

Figura 1- Dendrogramasimplificado, enel quese puedenobservarlas relacionesfilogenéticasdelgéneroListeria conotrasbacteriasgranipositivas(tomadodeJones,1988>.

NiotO. úxvgen USOSVTS 13.05 STO.COuire meno , - .. ase

5.; ,~ duwcn

AC:a15005

ose

2~550. NíainoiePtao. Níasor

,%~3fl .a5’&0t05, !V.5tV¿-

3010 2tnone

Srorhorhrsx — Faculsarove — -r — — A meso-DA? XIX- 7 S.l. -

zr’sioesothr:x — Facuitauve — — — — E L-Lvs¡ne — 5. A. ¡ L o—-OPacuicarive — — — — ..-. meso-DA? XIX-’ 5. A. 5 n 5

— Pacuirarove -- — — — A. Lvssneor — t.

‘sieso-DA?

or orojíhine

Xurjo:a — Aerob,c — — — — A L-LVSiaC XIX- 7 5. A. s 6.. .9

Tabla 1- Caracteresdiferencialesde los génerosBrnchorhrix, Erysipelothrix,Lactobacillus,Kurtl,ia y

Listeria (tomadode Seeligery Jones,1986)

.55<00

Introducción

Todos estos estudios concuerdancon los de base filogenética (catalogación de

secuenciasde oligonucleótidosdelARN 16s) segúnlos cualesListeria seencuadradadentro

de la rama Cíostridium-Lactobacilius-Bacillus(porcentaje molecular de G+C < 55%)

(Stackerbrandty Woese,1981 , citados porVázquez-Boland,1989),con una relación más

estrechacon Brochotrix, y ocupandocon ésteuna posición intermediaentreBacillus y el

grupoLoctobaciliuslStreptococcus(Stackerbrandtet aL, 1983; Ludwig et aL, 1984; citados

por Vázquez-Boland,1989; Rocourtci aL, 1982; Kandler y Weiss, 1986).

1.II.b- TAXONOMLX INTRAGENERICA

Durantemuchosañosel géneroListeria estuvoconstituido poruna únicaespecie,L.

~nonocytogenes,en la que seencontrabanincluidastodaslas cepasaisladas.Estoconlíevóque

cepashemolíticasy patógenasseencuadraranjunto con cepasno hemolíticasy apatógenas,

con la consiguienteconfusión a la hora de intentarextraerconclusionesde tipo ecológico-

epidemiológico de muestras no clínicas (Seeliger, 1976). Además se observó que L.

rnonocytogenes‘sensu lato” tal y como estabadescritaen la ga edición del Bergey’sManual

(Seeligery Welshimer,1974) resultabaun taxónheterogéneo,no sólo desdeel punto de vista

de poder hemolítico y patógeno,sino incluso en cuanto al patrón de acidificación de

determinadosazúcares,llegándosea demostrarque estas diferencias no se limitaban a

aspectosfenotípicos,sino que existíandiferenciasgenómicas(Stuart y Welshimer, 1973).

Así, de las que actualmentecomponenel género,la primera especiedistinta dc L.

monocvtogenes propuestafue L. innocua(Seeliger, 1981) en la que se incluyeron todas las

cepasno hemolíticasy no patógenasque presentaranlos factoresantigénicosO-XI y O-XV.

y que hubieransido aisladasa partir de portadoressanoso de fuentesambientales(Bojsen-

Moller, 1967; citadosporVázquez-Boland,1989;Welshimer,1968;Ralovich, 1975; Seeliger,

1975, 1976; Seeligery SchooÑ,1979). Por otro lado, se propusola inclusión de las cepas

aisladaspor Ivanov en Bulgariaen 1955 a partir de ovejascon listeriosis (Ivanov, 1962)en

otraespeciequesedenominada“L. bulgarico” (Ivanov,1975)o “L perhaemolvtica” (Seeliger

ci aL. 1982, citado por Vá-zquez-Boland,1989).Estascepasse caracterizabanpor pertenecer

específicamentea un único serovar,el 5, por presentarun marcadoefecto hemolíticobizonal

en agar sangre,y por ser patógenasexclusivamentepara el ganadoovino (lvanov, 1957,

1962).Estascepasfueron caracterizadasposteriormentepor el mismo autor (Ivanov, 1975).

6

Introducción

Posteriormente,Rocourt et aL (1982) propusieronla división de L. rnonocvtogenes

‘sensu lato” en cinco grupos genómicosdistintos, medianteensayosde hibridación AUN-

AUN. Estoscinco gruposserían:

- grupo 1- constituidopor las cepas“clásicas’ de L. nwnocvtogeneshemolíticas y

patógenas(L. ¡nonocytogenes‘sensu stricto”) en el que se incluirían cepasde los

serovares112a, 1/2b, l/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d y 7;

- grupo 2- en estegrupo se incluirían las cepashiperhemolíticasy patógenasdel

serovar5;

- grupo3- aquíseencuadraríanlas cepasno hemolíticasy apatógenasde los serovares

4ab, 6a y 6b;

- grupo4- en estegrupoquedaríanencuadradaslas cepas“americanas’de L. inflOCua

descritaspor primeravezen Norteamérica,y quese diferenciande las ‘europeas’por

presentarreacciónpositiva a la xilosa (Grovesy Welshimer,1977; Rocouí’t y Seeligeí;

1985);

- grupo 5- este grupo quedaría reservadopara cepas debilmente hemolíticas y

apatógenasde distintos serovares.

Al observarque cadauno de estosgrupospodíanserconsideradoscomo una especie

distinta sc ha consideradola división de L. mcnocytogenes“sen9u lato’ en cínco especies

distintas:

- grupo 1- L. inonocvtogenes

- grupo2- L. ivanovil (nombredefinitivo de 1. bulgañea’ (Seeligeret aL, 1984))

- grupo 3- L. innocua

- grupo4- L. welshimer,

- grupo5- L.seelige¡-i

A estascinco especieshabríaqueañadirotrasespeciesdescritasindependientemente,

L. gravi (Larsen y Seeliger, 1966, citados por Vázquez-Boland,1989) y L. ,nurrav,

(Welshirnery Meredith, 1971),que a pesarde la controversiaque su inclusión dentrode este

géneí-o despenéen un principio, llegándoseincluso a pretendersu exclusión del mismo

(Stuart y Welshimer, 1974), hoy son consideradascomo miembros de un mismo taxón

homogéneo,queconfirmalassimilaridadesfenotípicasy genotípicasencontradas,y querecibe

7

00

o>e’

‘oe->cee->e->-e:

o‘e00—

v+

++

+

ce

+‘S

S

ce00o+

+u

+

ce•~

ce

‘Oc

s~

‘ece-e00e’o>---.0+

.~

‘ece‘e00e

’

e’-—

o)+

te)=

-_

‘ece‘e00e

’

e’

.0‘0)‘e

“-.500

e.>

e’

+

-4-

+

e’

ceC

iD++

uu

eee’e’-o.’.

e)

o.)~,

~

00o>e)

0.0ooE2

e’

.~2

¡¡.t002

e)-~

Q.e

’00~.>

<2

‘05

ce

Ee).0‘ee)ceQee

’c~

-o—

-uceo.>

—Q

e)‘e

’

0)

n-t

—e)

-u~

Qe‘O

LZ

ct

--o

-

e)

ooo00

5

-OC

-

00

5

0~

>E

‘eoe

E-

o-t

oe

s

NO

0>0

-

Ini roducción

el nombrede L. grayi (Rocourtu al., 1992).

Mención apartemerecela primeraespeciedescritadespuesde L. nwnocvtogenes,L.

denitrificans. Su inclusión dentro del géneroListeria fue cuestionadadurantemuchosaños,

hastaque recientesestudiosde secuenciacióndel ARNr lás demostraronsu pertenencia

filogenética a la subdivisióncorineformes-actinomicetos,bacteriasgrarn-positivasde alto

contenidoen G+C (>55%), y ha sido transferidaa un nuevo génerocon la denomínaciónde

Jonesiadenitlficans(Rocourtu aL, 1987; Rocourt, 1988).

Paraconcluir estecapítulo,y resumiendotodo lo expuestohastaaquí, debereseñarse

queel géneroListeria constituyeun grupohomogéneoquimiotaxonómicamente,formadopor

7 especiesquetienenen comúnun contenidoen G÷Cde 36-42%,poseenun peptidoglicano

Aly asociadoa ácidosteicoicosdel tipo polirribitol-fosfato, carecende ácidos micólicos,

poseenácidos lipoteicoicos y presentancomo menaquinonaprincipal la MK 7. Estas7

especiespuedendividirse en dos gruposdesdeel punto de vista filogenético, en vino se

encuadraríanL. grayi (incluyendo a L. rnurravi), y en el otro las cinco especiesrestantes

(Rocourt, 1988).

1.111- ESTRUCTURA ANTIGENICA

Los estudiosserológicoshan sido una herramientaampliamenteutilizada en la

clasificaciónde numerososgruposbacterianos,no siendoListeuia una excepcióna esto. Es

más, la estructuraantigénicaen estegéneroha sido el origen de una de las más aceptadas

clasificacionesbasadasen criterios serológicos.

El primeroen realizarestudiosserológicoscon distintascepasde Listenafue Seastone

(citado por Domínguez,1982), quien encontróuna estrecharelación entrecepasde origen

humano y cepasde origen animal, a excepciónde la cepa tipo original de Murray que

reaccionabade formadistinta. Tambiénencontraronuna gransimilitud en el comportamiento

serológicoentrelas distintascepasde Listería Webh y Barberen 1937 (citadosporVázquez-

Boland, 1984).

Utilizando un gran númerode cepasprocedentesde GranBretañay EstadosUnidos

9

lníroduccion

Seastoneintentó estableceruna relación entre las diferenciasantigénicasde los grupos

serológicosy el origen de las mísmas.Deestamanera,seguíael ejemplode lo realizadocon

el géneroSainwnella,dondesehabíaencontradouna relaciónserotipo-hospedador,relación

que hoy se sabees una excepciónen estegénero.Desgraciadamente,las cepasbritánicas

proveníande roedoresy las americanasde rumiantesen su mayoría. Así, dadoque las cepas

europeaspertenecíana un grupo serológico(serovar1) y las americanasa otro (serovaí~4),

Schultzpor un ladoy Julianelley Ponspor otro (citadospor Vázquez-Boland,1984) llegaron

a la conclusiónde que las listeriasdebíandividirse en dos gruposserológicosdistintos,que

estarían relacionadoscon el origen de la cepa (grupo Roedoresy grupo Rumiantes).

estableciendo,por tanto, una clasificación sero-ecológica.Las cepas de Listeria de

procedenciahumanaperteneceríanindistintamentea uno o a otro grupo. Sin embargo,

Patersonen 1939 y 1940 (Domínguez,1982) consiguióidentificar serologicamentedistintos

modelos antigénicossomáticos (O) y flagelares (H) usando los mismos métodos que

Kauffman y White habíanutilizado parala clasificacióndel géneroSalnwnella, paralo que

empleó54 cepasde listerias. De estamaneraestablecióla base de la actual clasificación

serológicadel géneroListeria. Con los resultadosobtenidos,esteautordividió la especieL.

rnonocytogenes en cuatroserotipos,demostrandoademásla no existenciade relaciónalguna

entreserotipoy hospedador.De los cuatroserotiposencontrados,el 1, 3 y 4 sediferenciaban

por sus antígenossomáticos;mientrasque el 2 tenía la misma composiciónde antígenos

somáticosque el 1, del que sólo sediferenciabapor sus antígenosflagelares.

Aunqueel modelo de Patersonsigue todavíahoy vigente,seha tenido que ampliar al

demostrarsela existenciade otros factoresantigénicos.En 1958 Seeliger(citado por Seeliger,

1961) subdividió el serotipo4 en otros dos serotipos,que denominó4a y 4b, basándoseen

diferenciasde antígenosO. Donker-Voet(1957y 1958, citado por Vázquez-Boland,1984)

añadiónuevosserotipos,4c y 4d atendiendoa diferenciasen antígenosO, y la y 3a por

diferenciasen los antígenosH.

En 1962 Ivanov describióel serotipo5 al estudiarla listeriosis ovina. Este nuevo

serotipopresentaun factorantigénicoqueno existeen los serotipos1, 2, 3 y 4a al 4e (Cooper

et aL, 1973), y difiere del restode las listeriaspor su granpoderhemolítico.En 1966Donker-

Voet describiólos serotipos3c, 6 y 7, y en 1974 Stuarty Welshimerdescribieronel serotipo

de L. inurrayL

1<>

ji

~2.

xl

>1

xixxi

¡

xi

xxxi

xi

xi

xi

xi

¡1¡

•¡

¡—

——

—‘o

¡—

——

o-

>>

>:-

0-0>

>>

>‘o>e

)

.‘Oo

0~

ce—

—e

)

-o)ce0-~-é

-o.>05

o’te

00

1

o‘o

.N

0-0.

e:0.’~

.—

050t

1ntroduccion

Seeligery Donker-Voetdescribieronlos serotipos4f, 4g y 6 (citado por Vázquez-

Boland, 1984). Estos poseíanuna estrecharelaciónserológicay correspondíana cepasno

hemolíticasy no patógenasdelisterias;en 19>79Seeligery Hóhneencuadraronestosserotipos,

que nunca habíansido aisladosde materialpatológico alguno y sí de hecesy del medio

ambiente,en la nuevaespecieL. innocua.Más tardeSeeligery Schoofs(1979)revisaronla

designación de estos serotipos no hemolíticos encuadrándolosen el serotipo 6, que

subdividieronen 6a y 6b (que corresponderíana los antiguos4f y 4g) puestoque el factor

VIII presenteen el 6 y no en 4f y 4g no volvió a encontrarseal volver a analizarestascepas.

Sin embargo,Ralovich en 1984 pusode manifiestola complejidadserológicade la especie

L. innocua, ya que los serotipos6a y 6b puedendividirse a su vez en vanossubserotipos.

Todos estoscambiosestánreflejadosen la 905 edicióndel Bergey’s Manual(Seeligery Jones.

1986).

Nuestro grupo ha contribuido al establecimientode la clasificación antigénicade

Listeria, así,en 1988 Vázquez-BolandetaL describieronunanuevaestructuraantigénicapara

L. grayi y L. murrayi, segúnla cualestosdos serotiposcompartiríantres lactoresantigénicos

comunes,pero cadauno de ellos presentaríaademásal menosun factor propio. Igualmente,

Garcíaet al. (199<)) encontraronvariacionescon respectoa la estructuraantigénicasomática

admitida hastaese momentoparaListeria. Estasvariacionessecircunscribena la aparición

del factor IX en cepasde serotiposque aparentementeno lo poseían(4ab y 6b), a la no

aparicióndel mismo factoren todas las cepasdel serotipo4b, y a la no aparicióndel factor

VIII en todaslas cepasdel serotipo6b. Segúnesto la estructuraantigénicadelgéneroListeria

seríacomo apareceen la tabla 3.

1.1V- EPIDEMIOLOGíA DE LA LISTERIOSIS

I.IV.a- RESERVORIOS

Laenormeubicuidadde L. monocytogenesha sido puestade manifiestocon numerosas

referenciasal aislamientode estemicroorganismoa partir de una gran cantidadde sustratos.

Así, se han descrito aislamientosde sueloscultivados,barbechos,lodos, etc. (Blenden y

Szatalowich,1967; Weisy Seeliger,1975; Weis, 1975; Kampelmachery Janssen,1975; Mero

y Steucr, 1981; Watkins y Sleath, 1981); de vegetales,como pastos, cultivos, hierbas,

12

mt roducciSn

ensiladosmal conservados,hojasde arbustos(Welshimer,1968; Welshimery Donker-Voet,

1971; Weis y Seeliger, 1975; Vázquez-Bolandet aL, 1992); y, de aguasresidualestratadas

y sin tratar, aguas fluviales, lagos, efluentes de mataderose industrias transformadoras

(Dijkstra, 1981; Watkins y Sleatb, 1981); todo lo cual constituyeel llamado reservorio de

origen telúrico.

También los animales constituyen un importante reservorío. De hecho L.

rnonocyrogenesha sido aisladaa partir de másde 42 especiesde mamíferos,22 de aves,30

de peces, anfibios, crustáceos,arácnidose insectos (Gray y Killinger, 1966; Hird y

Genigeorgis,1990).En estesentido,seconsiderancomo los más importantesreservoriosde

Listeria a las personasy los animalessanos;llegándosea estimarque un 40% de la población

humanason portadoresfecales de L. rnonocytogenes(Lovett, 1989, como media de 29

estudiosdistintos), aunqueentre la población sometidaa riesgo de carácterprofesional

(matarifes,veterinarios,ganaderos,etc,) estosporcentajespuedendispararsehastaun

(Kampelmachery Van Noorle-Janssen,1968, citadospor Briones, 1990; McLauchlin, 1987).

El porcentajedeportadoresfecalesentrelos animalessanostambiénesenormementevariable,

oscilandoentre un 14% (Ralovich, 1984a) y un 52% (Skovgaardy Morgen, 1988). Es

importantesubrayarel importantepapeldesempeñadopor los portadoresfecalesdesdeel

punto de vistaepidemiológico,puescontribuyenenormementea la diseminaciónde Liste,-ia,

al constituirun elementobásicoen la transmisiónde la enfermedadbien de forma directao

biende formaindirectaa travésde sus productos(carne,leche,etc.) o contaminandocon sus

excrementosdistintosproductosde consumohumano,comoson las verdurasy hortalizas.En

estesentido,caberecordarel papel atribuido a las aves,que actúancomo portadoresfecales

contaminandocon sus excrementoslos ensilados(Penlon, 1985). Sin embargo,la principal

fuente de contagiola constituyenlos animalesenfermosque diseminanla bacteriaa través

de su ovina, hecesy secreciones(Cray y Killinger, 1966).

A pesarde todo lo expuestohastaaquí, debemosrealizar algunasmatizaciones.No

podemosolvidar la existenciade especiesno patógenasdentrodel género(Listeria innocua

especialmente)que también puedenser aisladasde las mismasfuentes que las patógenas

(Seeliger,1976). Por otro lado,tambiéndebemosseñalarqueel numero de individuosen los

quesedeteetaL. rnvnocytogenesen tracto gastrointestinalesmuy superioral de aquellosque

llegan a desarrollaralgún tipo de manifestaciónclínica; en estesentido,nuestro grupo ha

13

1 n roducción

descrito la excreción fecal de L. rnonocytogenespor parte de ratones inoculados

experimentalmenteporvía subcutáneaque no desarrollaronSignosclínicosy quepresentaron

muy escasaslesiones(Brioneset aL, 1992), lo quesugiereotro posibleorigen de portadores

fecalesapartede la ingestión.

1.IV.b- VíAS DE TRANSMISION

Pesea la gran ubicuidadde Listeria y su aislamientoa partir de tan amplio espectro

de substratos,la verdaderaimportanciasanitariade estosmicroorganismosradicaen que la

listeriosisesunaenfermedadtransmitidaprincipalmentepor los alimentos(GómezMampaso,

1993). Es importanteseñalarque el númerode casosen 1990 (Rocourt, citadapor Gómez

Mampaso,1993)seencontrabaentre0,22 y 7,4/millón de habitantessiendoEE.UU.,Nueva

Zelanda,Australia, Franciay Dinamarcalos paísescon mayor incidencia,señalándosepara

España,en esteestudio,una incidencia del 0,6/millón de habitantes.

La contaminaciónde los alimentosha sido temade bastantecontroversiadurantelos

añosen quela patogeniade la listeriosiseraun tema“oscuro”. Perola existenciade una vía

de transmisión indirecta a través de los alimentos fue puestade manifiesto de manera

indiscutible medianteel aislamientode LineRa a partir dc alimentosdestinadosa] consumo

humano.Entre los alimentosimplicadosde formaespecialen estatransmisiónseencuentran

los productos lácteos, carnesy verduras,responsablesde los últimos brotes de listeríosís

(Schlechet al., 1983; Fleming et aL, 1985; Jameset al., 1985; Ho et aL, 1986; Bille, 1988).

En este sentido, cabe recordar que L. nwnocyrogenesha sido aislada de leche cruda y

pasterizada(Lovetí et aL, 1987; Fernández-Garayzábalu aL, 1986), quesos frescos y

madurados(Marth. 1988b),en carnesde poiio, corderoy ternera (Lee y MeClain, 1986;

Lowry y Tiong, 1988), salsaspreparadas(Farber, 1987, citado por Bracket, 1988), frutas,

verdurasy hortalizas(Schlechet aL, 1983; Ho etal., 1986),asícomode pescadosy mariscos

(Lennon et aL, 1984), sin olvidar el evidente riesgo de contaminaciónde los alimentos

durantesu manipulacióny procesamientoindustrial. De estamanera,los lugareshúmedosy

con restos de materia orgánica, sumideros, etc. constituyen impol-tantes fuentes de

contaminaciónexógenade los alimentos (Lowry y Tiong, 1988; Cox, 1989; Skovgaardy

Morgen, 1988),asícomomanipuladoresdelos alimentoscon unalisteriosislatente(Ralovich,

14

Introducción

1984b).Otro importantehechoque debeser tenido en cuentaes la capacidadde Listeria de

crecera bajastemperaturas,lo que permitiría su proliferaciónen alimentosalmacenadosen

refrigeración.

De lo señaladoanteriormente,sedesprendeel carácterzoonósicode la listeriosis y la

importanciade la transmisióna travésde los alimentos(Hird, 1987). Sin embargo,algunos

autores(GómezMampaso,1993)señalanla alta frecuenciacon que aparecealgunapatología

subyacente:70% en Franciaó 82% en nuestropaís.

Ademásde la transmisiónporlos alimentosno sedebendescartarotrasvías, como la

transmisión directa de los animales al hombre, caso de la listeriosis cutáneade los

veterinarios,contraídaal manipularprotegidosde maneraindebidafetos abortadoso el tracto

genital de hembrasenfermas(Blendenci aL, 1987).Es tambiénposiblela transmisióndirecta

hombre-hombre,como ha ocurrido en algunosbrotesintrahospitalarios(McLauchlin, 1987;

Ho et aL, 1986).

Por último, la listeriosis de los recién nacidos puede tener dos orígenes: una

transmisióndirecta madre-hijo(hematógenao producidaen el momento del parto), o una

transmisiónnosocomial,de aparicióntardía,debidaal deficientemanejode material clínico

(termómetros,sondas,etc.) (McLauchlin, 1987).

En cuantoa la listeriosis animal, el carácterubicuitariode Listeria, y su presenciaen

el suelo,la vegetación,aguassuperficiales,etc. permitensu apariciónen alimentosdestinados

a los animales,en especialensiladosy forrajes en mal estadoo con un pH alto, existiendo

unaestrechaasociaciónentreel consumode estosproductosy la apariciónde listeriosis(Gray

y Killinger, 1966; Fenlon, 1985; Giner et al., 1986; Dijkstra, 1987). A su vez, los animales

infectadosjueganun importantepapelen la transmíslona otros animalesy al hombre,tanto

de forma directacomo indirecta.

1.IV.c- MARCADORES EPIDEMIOLOGICOS

En los últimos brotesde listeriosisocurridosen EstadosUnidos y Canadáseprocedió

a una encuestaepidemiológicaexhaustiva,con el fin de determinarlas circunstanciasy la

¡5

Introducción

fuentede contagio (Schlecha aL, 1983; Fleming a aL,1985;Jamesci al., 1985). En este

sentidose utilizaron los datos concernientesa alimentación,pero también otros como los

relativosal desarrollode actividadesal aire libre Gardinería),viajes,contactocon enfermos,

educación,etc. Se tuvo en cuenta,parala definición de listeriosis,unicamenteaquelloscasos

en los queel aislamientode L. rnonocyeogenesfue positivo,aúnen los casosen queno estuvo

acompañadode sintomatología(Schlechet aL, 1983; McLauchlin, 199<)).

Enla mayoríade los brotessepudodeterminarel origencomúnde los mismosgracias

al empleo de marcadoresepidemiológicos.Entre las técnicas utilizadas se mostraron

especialmenteútiles la fagotipia y la serotipia, aunqueel empleode técnicasbasadasen la

hibridaciónde AUN (sondas,patronesde restricción,PCR) y las técnicasínmunoenzímáticas

presentanuna gran proyecciónde futuro (Blancoci aL, 1993). Sin embargo,por el momento

presentancomo inconvenientespara su utilización de forma general un elevadocoste, la

necesidadde personalespecializado,y el queno hayandemostradounamayorefectividadcon

respectoa los métodosmicrobiológicosclásicos(Blancoci al., 1993).

La fagotipia fue propuesta,al ampliar la capacidadde establecerrelacionesentre

distintas cepas,como una nuevaaportaciónal estudioepidemiológicode la listeriosis. En

1985 Auduriere, al. describieronun sistemade tipificación de L. rnonocvtogenes de 27 fagos.

Con los datos obtenidosen un brote en 1975. este grupo sugirió la posibilidad de que

existieseuna estrecharelación entrelas estructurasutilizadaspor los fagoscomo receptores

y los antígenossomáticos,es decir, entrelos fagovaresy los serovares.

La fagotipiapresentaunaelevadaespecificidad,no produciéndosereacciónde lisis con

otras 2<> especiesbacterianastaxonómicamentepróximasa Listeria (Lovett. 1989; Ortel,

1989b;Rocourty Catimel, 1989;Loessnery Busse,1990). La fagotipiay laserotipiahan sido

empleadasconjuntamentecon resultadosque puedencalificarsecomo excelentes(Espazeet

aL, 1989). Sin embargo,algunosserovares,el 1/2 en especial,presentanuna bajacapacidad

de fagotipia (es decir, reaccióncon al menosun fago), que en ocasionesalcanzatan solo un

29% de cepasfagotipables,lo que anula, en cierta medida, la validez de estastécnicas

(McLauchlin, 1987; Saunderset aL, 1989).

El análisisserológicode casosaisladosy brotesde listeriosis ha probadoqueel título

16

Introducción

de anticuerposfrente a las listerias aumentacomo consecuenciade la infección, no

pudiéndosenegaruna correlaciónentrela incidenciade la enfermedady la elevaciónde las

tasasde anticuerpos(Larsen y Jones, 1972; López et aL. 1992). aunqueel estudio de la

presenciade aglutininasanti-Listeria en la poblaciónsanatanto humanacomo animal, pone

en evidenciala existenciade un alto númerode individuosque presentantítulos séricoscon

valoressimilares a los encontradosen los individuos enfermos(Jasinska,1969, citado por

Hyslop, 1975; Domínguez,1982).Varias hipótesishantratadode explicarestefenómeno,una

de ellas implica a las listeriaspresentesen el intestinode los individuos comoresponsables

de estastasasde anticuerpos(Domínguez,1982; Seeliger, 1987).Por otro lado, tambiénse

ha responsabilizadoa la existenciade reaccionescruzadasentre los microorganismosdel

géneroListeria con Staphylococcusaureus(Seeligery Sulzbacher,1956). Pero el hechode

queen muchasocasioneslos serovaresaisladosde portadoresfecalesno se correspondancon

los aisladosde procesospatológicosllamapoderosamentela atención.En estesentido,nuestro

grupo ha realizadoestudioscon especiesrelacionadascon Listeria que apuntanque la

existenciade anticuerposespecíficosfrentea Listeria sólo seaposible por un contactoprevio

con este agente,y no por reaccíonescruzadascon otros aeentesbacterianos(López et al.,

1993).

Los serovaresmás frecuentementeaisladosde individuos enfermossonel 4b y el l/2a

(Farber y Peterkin, 1991; Suárez, 1991). SegúnMcLauchlin (199<)), el serovar4b es el

responsablede la mayoríade los casosde listeriosis registradospor su laboratoriode 1967

a 1988 (64%), seguidopor l/2a (15%) y l/2b (10%). Estascifras coincidencon las señaladas

porGouletetaL (1989)en un estudiollevado a caboen Franciaentre 1983 y 1986, en el que

los porcentajesson respectivamente62%, 22% y 13%. En cuanto al resto de serovares,

McLauchlin (199<)) les concedevalores del 6% de casos de listenosísproducidos por

serovares4 distintos al 4b, un 4% para l/2c y, por último, un 1’X para los serovares3.

GómezMampaso(1993)afirmaque en nuestropaíshasta1986 los serotiposdel grupo4 eran

responsablesdel 92% de los casosde listeriosis,mientrasque los del 1/2 lo eran del 8%

restante;esteautor cita, asimismo,un estudiode Rocourtde 1990, en el queel 54% de los

casossondebidosal serogrupo4, y el 43% al 1/2.

17

1nt roduccwn

1.V- ENFERMEDAD

Tal y comose ha señaladoen el capítulode epidemiología,el númerode casosde

listeriosis resulta pequeñocon respectoa la ubicuidad de estos microorganismos.Parece

obvio, por tanto,que el desarrollode la listeriosisprecisade unacombinaciónde factoresde

patogenicidadde Listeria y de susceptibilidaddel hospedador(Kampelmachery Janssen,

1969), lo que parecedemostrarlo acertadode la calificación de “agentes oportunistas’

realizada por Simpson en 1971 sobre estos microorganismos(citado por Fernández-

Garayzábal,1984). De tal forma que hoy se consideramás importante la existenciade

factores predisponentespara el desarrollo de la enfermedadque la mera entrada del

microorganismoen un posible hospedador.Los factorespredisponentesmás conocidosson

la depresiónde la inmunidad de basecelular durantela gestación,inmadurezdel Sistema

Inmune en los recién nacidos, inmunosupresiónterapéuticaen trasplantados,linfomas,

tratamientoscon antiácidos,etc. (Siddiqueci aL, 1985; Stammet aL, 1982; Briones, 1993).

Sin embargo,todavíaexistencasosque no puedenserexplicadospor la existenciade estos

factores,lo queha llevado alos investigadoresal convencimientode que no seconocentodos

los factorespredisponentesque puedenintervenir en la listeríosís.

Afortunadamenteel modelo experimentalmurino permite observartodas las formas

de listeriosis que podemosencontrar en el hombre y en nuestrasespeciesdomésticas

(Domingo et aL, 1993). Este modelo tambiénpermiteel estudiode la respuestainmune de

basecelular, así como los mecanismosque utiliza Listeria para producir la infección, y se

consideraválido paraextrapolarlos resultadosal hombre(Stelmaet aL. 1987).

1.V.a- PENETRACION EN EL HOSPEDADOR

La listeriosis presentatres cuadros clínicos principales (abortos, septicemiasy

encefalitis),así como otra seriedc cuadrosque suelennecesitardel establecimientode una

septicemiaprevia.De formageneral,tal y comoconfirmanlos últimos brotesapaíecidosentre

la población humana,a excepcióndel brotefrancésde 1992 que no ha podido relacionarse

claramentecon alimentoalguno (Dehaumont,1993). todos ellos se encuentranasociadosal

consumode productoslácteos,carnesy verdurascontaminadas(Schlecbet aL, 1983;Fleming

eaaL, 1985; Jameset aL, 1985; Ho ci aL, 1986; Bule, 1988), y en los animalescasi siempre

lx

1 ntroduccio

seencuentreasociadaal consumodeensilado en mal estado(Grayy Killinger, 1966;Fenlon,

1985; Audurieret aL, 1985;Gitter, 1985;Dijkstra, 1987),por tanto, podemosafirmar que la

vía de entradade Listeria enel hospedadores la oral (Domingoa al., 1993),si exceptuamos

la formaencefálicaen los rumiantesque trataremosposteriormente.Sin embargo,aúnexisten

dificultadespara conocerel mecanismoexacto de la infección por vía oral, como son la

necesidad de emplear altísimas dosis infectantes para reproducir la enfermedad

experimentalmente,y, de forma especial,la variabilidad en la respuestade individuos en

condicionessimilares.

Dos son las vías de penetraciónpropuestasa partir de la luz intestinal. Raczy col.

(citadospor Gaillard et al.,1987; y por Briones, 1990), medianteestudios de microscopia

electrónica,describenla invasión, en una primera fase, de los enterocitosdel intestino

delgado,y la multiplicación de L. nwnocyrogenesen el interior de esascélulas.Las listerias

libres en el citoplasmapodríanpasara enterocitosadyacentes,o bien salir al exteriordonde

seríancapturadaspor células fagocíticas.Estateoríapermitea L. monocytogeneseludir en

ciertamedidala acciónbactericidade los macrófagosde la lámina propia,convirtiéndolaen

un parásitointracelularcapazde invadir célulasno fagocíticas.

Estahipótesisse ve reforzadaen primer lugar por el hecho de que otros epitelios

(conjuntiva, epitelio nasal) puedenservir como lugaresiniciales de la infección (Gray y

Killinger, 1966); y, ensegundolugarpor la capacidadde Listeria de penetrary multiplicarse

en célulasepitelialesin vitro (Gaillard u aL, 1987; Cossarty Mengaud, 1989; Meyer et al.,

1992). En esta fase la hemolisina desempeñaun importante papel en la diseminación

extraintestinalde Listeria (Rolí y Czuprynski,1990),ya queuna vezen el interior de la célula

hospedadoraL. monocytogenesdependede ella para su multiplicación, al intervenir en su

liberacióndel fagosoma(Gaillard et aL, 1987; Kuhn et aL, 1988; Portnoy, 1992).

La segundahipótesis(MacDonaldy Carter,1980; Marco et aL, 1992b)sitúala puerta

de entradaen unascélulasespecializadasde las placasde Peyer.denominadascélulas M. a

partir de las que Listeria sería rápidamentefagocitadapor los macrófagosíntimamente

asociadosa estascélulas,sin que seproduzcamultiplicación en las célulasM. Por tanto, en

esta hipótesis la difusión de las listerias en el hospedadordependeúnicamente de su

capacidadde multiplicarsedentrode los macrófagos.Es conocidala capacidadde las células

19

Listeria

Teoría de McDonald/Carter Teoría de Racz

Figura 2- Esquemade penetración deListeria en el hospedador.

Enterocito

Macrófagos

Introducción

M para procesarantígenossolublesintestinalesy de fagocitar procariotas;de hecho los

Reovirusutilizan estavía paraatravesarla barreraintestinal (Wolf et al., 1981, citado por

Briones, 1990).

Sin embargo,puedenconsiderarseno excluyentes,y es posible que Listeria utilice

ambasvías parapenetrara travésdel epitelio intestinal (Czuprynski, 1994).Una vez en el

citoplasmaListeria es capaz de inducir la polimerización de filamentos de actina a su

alrededor,lo quele sirve paradesplazarseporel citoplasma,e inclusoparapenetrarencélulas

adyacentessin salir al medio externo(Tielney y Tielney, 1993; Czuprynski, 1994) (Fig. 2).

Porúltimo, esprecisoreseñarotra posiblevía de infecciónsustentadaen la ideade

que Léteria puedeescapara la accióndel SistemaInmunesi se encuentracon una mucosa

o epitelio alterados.Barlow y McGorumdemostraronque las ovejasen épocade cambiode

denticióny sometidasa factoresde alto riesgo,comoesla alimentaciónmedianteensilado,

presentabanuna mayorprevalenciade encefalitis por listerias (Barlow y McGorum, 1985).

Listeria rnonocyrogenes alcanza las terminaciones nerviosas de los pares craneales,

principalmentetrigémino,facial y vestibulococlear(DomingoetaL, 1993),y avanzade forma

centrípetahacia el cerebro por el interior de los axones (Otter y Blakemore, 1989),

pudiéndoseproducir lesionesde tipo inflamatorio. Una vez en el cerebro,continúa su

migración a través de las fibras nerviosas,produciéndosela apariciónde fuertesreacciones

inflamatoriasen cuyo inicio predominanpolimorfonuclearesneutrófilos,que posteriormente

son sustituidospor macrófagosactivados. Esta fuerte reacción inmunopatológicaque se

produce en el cerebro puede ocasionar graves alteraciones tisulares (microabscesos,

demielinización,necrosis)responsablesa su vez de los síntomasclínicos apreciadosen este

cuadro(Charíton y García, 1977; Domingo et aL, 1993). Tambiénse ha sugeridoque las

heridasde cabezay cuello podrían actuar de igual forma (Pohjanviruay Huttunen, 1985),

afirmación que se ha visto apoyadapor los resultadosde nuestrogrupo, al demostrarla

aparición de meningitis en animalesinoculadospor vía subcutánea(Prats et aL, 1992a,

1 992b).

I.V.b- CINETiCA DE LA INFECCION Y RESPUESTA INMUNE

Los estudiosrelativosa la cinéticade la enfermedad,la diseminaciónintraorgánica,

21

Introducción

histopatología,etc, han necesitadoel desarrollode un modelo experimentalen el que se

pudieraninvestigar éstos y otros extremos.En estesentido son numerososlos estudios

realizadossobre la listeriosis experimentalen el ratón desde los primeros trabajos de

Mackanessen 1962(citado porBriones, 1990).El carácterde parásitointracelularde Li steria

y la inmunidad de base celular como respuestaa la infección confieren a la listeríosís

experimentalcaracterísticaspeculiaresen lo que a sus mecanísmospatogénicos,mediadores

del SistemaInmune,modulaciónde la respuestainmune,etc., serefiere.

La cinética de la infección sigue un patrón ampliamenteaceptadopor los diversos

autores(Wilkinson y Hall, 1971; Cheerset aL, 1978; Kongshaveny Skamene,1984).Ue los

estudiosrealizadosen ratonesseconocela existenciade varias fasesen la resistenciaa la

enfermedad.A los 10 minutosde unainoculaciónendovenosacon una dosissubletal.el 9<1%

de las células han sido capturadaspor los macrófagosresidentesdel hígado (células de

Kupffer) y la mayoríade las restantespor los del bazo(Kongshaveny Skamene,1984); a las

6 horasse ha producidouna destrucciónde un 9<1% de las bacteriasviablesexistentesen

estosórganosimputablea los macrófagostisulares(Mainou-Fowleret al., 1988).

En el caso de la vía intraperitonealla infección sigue una pautamuy similar a la

reseñadaparala vía endovenosa,si bien en estecaso los macrófagosperitonealescapturan

una cierta cantidadde las bacteriasinoculadas(Archinal y Wilder, 1988b). Cuandola vía

empleadaesla oral, sonlos macrófagosde la láminapropiadel intestinolos responsablesde

la fagocitosisde las listeriasque hanconseguidoatravesarel epitelio, independientementede

la rutaseguidaparahacerlo.Tambiénesésteel patrón aceptadoparaotrasvías de infección

a través de epitelios, comoel conjuntival y el nasal (Kautterea aL, 1963; Miller y Burns,

1970; Pohjanvirtay Huttunen, 1985).

Trasestaprimerafase, las listeriascomienzana multiplicarsede formalogarítmicaen

cl interior de los macrófagosdel hígado y bazo, alcanzandoel máximo de población de

listeriasa los 2-3 díasdel comienzode la infección, segúnla vía. Se ha podido comprobar

que estos macrófagosinfiltrados en los tejidos provienende la médulaósea a través del

torrentecirculatorio,ya queel usoen estafasede sustanciasincrementadorasde la respuesta

macrofágicao de la monocitopoyesis(RX, vinblastina, carragenina,ciclofosfamida,etc.)

aumentadc maneraconsiderableel número de células macrofágicasy, por tanto, el de

22

Introduccion

bacteriaspor aumentodel númerode lugaresen los que puedenmultiplicarse.

Otra seriede mediadoresde la respuestamonociticaque intervienenen estafase son

el CSF (Colony Stimulating Factor)(Cheersy Stanley, 1988; Mielke et aL, 1993), y el TNF

(Tumor NecrosisFactor) (Nakaneet aL, 1988a;Miclke er aL, 1993). En resumen,podemos

afirmar que se produce una respuestainmune no específica mediada por fagocitos

profesionales,entrelos quepredominanlos monocitos y dondepodemosencontrar,a su vez,

numerosospolimorfonuclearesneutrófilos.Esteaflujo de célulasinflamatoriasda lugara los

granulomasque constituyenla lesiónespecíficade la listeriosis.

A partir de estemomento,comienzauna tercerafase,en la que el desarrollode una

inmunidad de basecelular, basadaen macrófagosactivadospor linfoquinas originadaspor

linfocitos T sensibilizadosprovocauna rápida inactivaciónde las listerias (Kongshaveny

Skamene,1984; Mainou-Fowleret aL, 1988). Esta activaciónde los macrófagosdestruye

rápidamentea las bacteriaspor un incrementode su poderbactericida.La sensibilizacióny

proliferaciónde los linfocitos T exige,previamente,el contactoentreL. rnonocvtogenesy los

macrófagosresponsablesde su presentacióna las célulasT (Goosenset al., 1988). En este

procesojueganun importantepapel las moléculasla superficiales(Deschryver-Kecskemeti

et aL, 1988).Unavezactivadoslos linfocitos T inducenunaactivamonocitopoyesismediada

por linfoquinas como el CSF, 1L2 (interleuquina2), a, f3 y y interferón, etc. (Kratz y

Kurlander, 1988; Nakaneci’ aL, 1989; Mielke ci’ aL, 1993).

La secreciónde IFN-gammaimpide lasalidade los microorganismosde los fagosomas

y, por ende,su multiplicación en el citoplasma(Czuprynski, 1994; Fujiki y Tahaka, 1988;

Higginbotham er al, 1992). Al parecereste efecto del IFN-gammase debe a una mayor

producciónde peróxidos(Higginbothamci al, 1992; Tielney y Tielney, 1993).Sin embargo,

estafunción del lEN-gammano pareceestartan clara,ya queMielkeci aL (1993)afirma que.

basadosen experimentosin vitro, sí pareceactuarde la forma indicada,esto es. impidiendo

la salidade listerias al citoplasmacelular;pero, por otra parte,su apariciónno coincidecon

la etapade desapariciónde las listerias,por lo que pareceque su acción seríamásresultado

de las funciones proinflamatoriasdurantela infección, que un efecto sobrela capacidad

bacteriostáticacelular. Este mismo autorafirma que esel TNF-alfa el que puedeestimular

o coeslimularla producciónde estoscompuestosde oxígeno,actuandoasísobrela capacidad

23

Introducción

antibacterianade los fagocitos.

Llegadoestepunto,el hospedadorpuedecontrolardefinitivamentela infección,reducir

el númerode listerias y, en el plazo de aproximadamenteuna semanaeliminarías,o bien

sufrir unasepticemia(Briones, 1990).A esterespectoparecequela limitación del crecimiento

bacterianoen los primerosestadiosde la infección sedebea la presenciade un alto número

de linfocitos T reactivos(Goosensci aL, 1988).

La inmunidad de tipo humoral no es predominanteen el establecimientode la

resistenciaa la infecciónporListeria, lo cualsedemuestraporel hechode que no seaposible

conferir una inmunidad de tipo pasivo medianteel empleo de suerohiperinmune(Miki y

Mackaness,1964).

l.VI- FACTORESPREDISPONENTES

La resistenciao susceptibilidada la infecciónpor L. monocvtogenesen el ratónestá

íeguladapor un genautosomaldominante(genLr, Listeriaresistance)queseexpresadurante

la multiplicación logarítmica manteniéndolabajo control (Mandel y Cheers, 1980). Esta

resistenciapareceresidir en la capacidadde desarrollaruna inmunidad no específicaque

apareceríaen la 20> fase de la infección, originándoseuna cierta inmovilización de los

macrófagosintegrantesde los infiltrados inflamatorios,o una disminución de su capacidad

paraeliminar las listerias (Czuprinsky et aL, 1985).La ausenciao disminuciónde respuesta

en este momentopuedeoriginar una septicemiacon posible muerte del animal (Mandel y

Cheers,1980).

La mayoría de los casosde listeriosis humanaparecenocurrir en individuos que

presentanalgún tipo de factor subyacenteque conducea una alteración de la respuesta

inmune mediadapor células1 (Farber y Peterkin, 1991). Aunque todavía parecenexistir

algunaslagunasen estaafirmación,ya que ello implicaría una gran incidencia de listeriosís

entre los enfermosde SIDA, y esto no ocurreasí (Schuchatei’ al., 1991; Deckeret aL, 1991;

Berengueret aL. 1991; Farber y Peterkin, 1991), aunque parece que la incidencia de

meningitisy septicemiaporLisrerio entreestosenfermosseencuentraen ascenso(Juradoet

aL, 1993); ademásesteautorseñalala existenciade casosen individuos que no presentaban

24

Intr(xIucci(Sn

ningún tipo de factor predisponente.

Es fácil deducir la importanciaque tiene en la listeriosis la capacidadde respuesta

inmunecelular,atendiendoalmecanismopatogénicode L. rnonon’togenes. Así,el tratamiento

con inmunomoduladoresmodifica la susceptibilidadde éstea la infección, incrementándola

o disminuyéndola.De forma general,podemosafirmar quecualquierinmunomoduladorque

estimule la respuestamacrofágicay que sea inoculado antesde la infección aumentala

resistenciaa la misma;por tanto, la acciónde inmunoestimulantesreduceconsiderablemente

la susceptibilidaddel ratóna la infecciónporL. rnonocytogenes.A esterespecto1-a acciónde

las citoquinas,comoel IFN-’y (Nakaneet aL, 1988b),o el TNF (Nakaneet aL, 1 988a;Mielke

et aL, 1993),o las ILI, 1L2 ó 1L12 (Mielke et aL, 1993) tienen un efectoprotector;y. de

hecho, el tratamiento previo con inmunoglobulinasanti-IFN-y y anti-TNF aumenta la

susceptibilidada la infección por L. rnonocytogenesen ratonesnormales (Nakaneet al.,

1989); sin embargo,Mielke eraL (1993)afirma quela accióndel IFN-y, esmásun resultado

susfuncionesproinflamatoriasqueuna accióndirectasobrelos mecanismosbacteriostáticos

de la célula.

Por el contrario,y tal comocabríaesperartras lo expuestoen el párrafoanterior, el

tratamientocon inmunosupresores,como la carragenina(Stelmau aL, 1987) o ciclosporina

(Hanger al., 1987),permitela producciónde la enfermedadcon dosisde L. rnonocytogenes

considerablementebajas. En este sentido, diversosautores(Stamm ea al.. 1982; Gómez

Mampaso et al., 1987; Gómez Mampaso, 1993) han alertado sobre las posibles

complicaciones que L. monocvwgenes puede ocasionar en enfermos sometidos a

inmunosupresiónterapéutica(trasplantadosrenaleso cardíacospor ejemplo).Asimismo, los

individuosquepresentanun cuadrode inmunodeficienciaadquirida(Ridgwayy Brown, 1989,

GómezMampaso,1993), con la salvedadya comentadaen el casodel SIDA, o congénita

(Ueschryvert-Kecskemetiy Bancroft, 1988) también presentanuna mayor susceptibilidad

frente a la listeriosis. Asimismo, otras enfermedadescomo la diabeteso las hepatopatias

puedenpredisponera padecerla listeriosis (Gómez Mampaso. 1993; Ribiere ci aL, 1990:

Schuchatet aL, 1991).

Ademásde los inmunomoduladores,tambiénexistenotros factoresde tipo fisiológico

que influyen en la presentaciónde la enfermedad.Es de sobraconocidala susceptibilidadque

25

F

introducción

presentanlas hembrasgestantes(Luft y Reminglon,1982; Siddiqueet aL, 1985; Lallemand

et aL, 1992; Briones, 1993),y que sedebeaunadisminuciónde la inmunidadde basecelular

provocadaporel crecientenivel de progesteronageneradopor la placenta(Pungci aL, 1985).

Asimismo, hay autores(Kos et aL, 1984) que afirman queratonesalimentadoscon una dieta

rica en colesterolsufrenuna disminuciónde la actividadmacrofágica,y, por tanto, son más

susceptiblesa la enfermedad;mientrasque otros (Pohjanvirtay Huttunen. 1985) mantienen

quelos animalessometidosa dietaparecensermásresistentesa la infección.A pesarde esta

controversia,pareceinnegableque determinadoshábitosalimentarioscontribuyena facilitar

la apariciónde la enfermedad(Briones, 1993).

Otros factoresrelacionadoscon la apariciónde la listeriosis han sido (Briones, 1993):

las variacionesbruscasde la temperatura,aunqueno existenestudios concluyentesa este

respecto;el estrés,que provocaun aumentode corticoidesque conlíevauna disminuciónde

la inmunidad de basecelular; la existenciade heridas,principalmenteen encíasy zonasde

cuello y cabeza;la existenciade tumores,principalmentelinfomas (Schuchatci aL, 1991);

y, la edad,no olvidemos que, aunquetodas las edadesson susceptibles.existe una mayor

incidenciaen individuos jóvenesy ancianos.

Finalmente, no queremos,dentro de esta relación de factoresque tienen alguna

incidencia sobrela susceptibilidada la infecciónpor L. monocytogenes,olvidar el papeldel

pH gástrico.En estesentido, se ha asociadoel uso de cimetidina con la adquisiciónde la

enfermedaden uno de los brotes ocurridos en EstadosUnidos (Ho et aL, 1986). En ratas

tratadascon cimetidina,parecensernecesariasdosisde L. rnonocytogenessignificativamente

menorespara provocar la enfermedadque las necesítadasen ratas no sometidasa este

tratamiento(Schlechet aL, 1986, 1990). Ello demostradael papel protectorque ejerceel pH

gástricoen la infecciónpor vía oral. Aunqueestefactor no pareceser importantea la hora

de estableceruna respuestahumoral(LópezeaaL, 1992).

A pesarde lo expuestohastael momentoacercade los factorespredisponentes,existen

casosque no parecenpoder explicarsepor los expuestosaquí, lo que hacepensaren la

existenciade otros factoresdistintos.

26

Serovares Significaciónpatógena

t. monocytogenes

1<. ivannovií

lb. innocua

l/2a 1/2b l!2cSa 3b Sc4a 4ab 4c 4d 4e7

5

4ab 6a 6bindeterminados

Abortos,rneningoencefalitis,septicemias

fundamentalmenteabortos en ovejas

no patógenas

lb. weishimeri 6a 6b practicamenteapatógenas

lb. seeilígeri 1/2b 4c 4d 6bindeterminados

1 caso descrito

no patógenas

Tabla 4— Significación patógena de lasy serovares de Listaría.

distintas especies

FORMASCLINICOPATOLOGICAS ESPECIES

Septicémica Hombre, animales jóvenes deespecies domésticas, roedores

y lagomorfosMeningítica

Abortos Hombre, rumiantes y roedores

Romboencefálica Hombre y rumiantes

Miocárdica (postsepticémica) Aves domésticas

Cutánea H0mbre

Queratoconjuntival Hombre, rumiantes, roedores ylagomarf os

Mastitis Vaca

Endocarditis Hombre

Tabla 5- Principales cuadros clínicos de la listeriosis (tomadode Domingo et al., 1993)

Especie

lb. grayí

Iniroduccion

l.VII- FORMAS CLINICAS

Comohemosexpuestoyaanteriormente,el númerodepersonasy animalesquepueden

serinfectadospor L. nzonocytogeneses muy elevado,aunqueen la mayoríade ellos no se

desarrollarála enfermedad.Sin embargo,en los casosen quesilo hacen,la listeriosis puede

presentaruna gran diversidadde cuadrosclínicos, tantoen el hombrecomo en los animales,

aunquelos más frecuentesson las formas meningiticas o encefalíticas,materno-fetalesy

septicémicas(tablas4 y 5), que estudiaremosbrevementeen esteapartado.

1.VII.a- MENINGITIS Y ENCEFALITIS

Es la forma más frecuente en los animales domésticos, entre los que afecta

principalmentea los pequeñosrumiantes,en los que cursacomo encefalitis;pero también lo

es en las personasadultasy en individuos inmunocomprometidos,en las que cursacomo

meningitis (Farber y Peterkin, 1991; Schuchates al., 1991; Domingo es al., 199i~). Las

manifestacionesclínicassecorrespondencon las de unameningoencefalitiscon afectacióndel

romboencéfalo,tallo cerebral y médula oblonga. Esto se traduce en la aparición de

opistótonos.ceguera,nistagmo,parálisisfacial, ptosis parpebral,sialorrea,y el típico andar

en círculosque le dio nombrea la enfermedaden el ganadoovino: “circling disease.Esto

último seproduceal afectarselos núcleosfacial y vestíbulococlear(Briones, 199<)). En las

personasadultas,estaforma sueleestarasociadacon una alta mortalidad(Farber y Peterkin,

1991), entreel 13 y el 34% duranteel año 1989 en todo el mundo.

Segúnha sido señaladopor investigadoresde nuestrogrupode trabajo (Pratses aL,

1992a,1992b), una de las vías de producciónde meningitisseríala llegadade las listerias al

sistemanerviosocentral a partir de monocitos infectadosque ingresanen él a través de los

plexos coroideos.De esta forma se produce una inflamación de los mismos que acaba

desembocandoen meningitis.

En la oveja y cabra esta forma de listeilosis puede ser extremadamentegrave,

pudiendoproducir la muertedel animal entrelas 4 y 48 horassiguientesa la apariciónde los

primerossignos.En el casode la vaca,sin embargo,el cuadroesmenosagudo,sobreviviendo

y reponiéndosela mayoríade los animalestras 4-14 días de la apariciónde los primeros

28

InI ¡oclucci,in

síntomas.La recuperaciónespontáneaes relativamentefrecuente(Gitter, 1985; Dijkstra,

1987).

En el caso del hombre, y aunquepuededarse en niños, en cuyo caso tiene un

desenlacefatal, tiene una apariciónpredominanteen adultos.Normalmentecomienzacon un

cuadropseudo-gripaly secontinúacon cefaleas,artralgias,conjuntivitis, rinitis, fiebre,rigidez

creciéntedel cuello, náuseas,vómitos y fotofobia (Farbery Peterkin,1991; Schuchatet aL,

1991). Estafase de excitaciónno sueledurar más de unos 10 días,y se continúacon una

somnolenciaqueseincrementahastallegar al comacon episodiosconvulsivos;en esteestado

se produce la muerte tras 2-3 días desde su aparición sí no se instaurael tratamiento

adecuado,que consisteen ampicilina (sola o en combinacióncon un aminoglucósido),

penicilinaG, y másreciéntementecotrimoxazol(Carvajales al., 1989).En sangrecirculante

se detectauna marcadaleucocitosiscon predominanciade granulocitos,mientras que en

líquido céfalo-raquídeoseapreciapresiónelevada,valoresde glucosamuy bajos, turbideze

inclusoaspectopurulento.La apariciónde monocitosen LCR esindicativo de una meningitis

producidapor L. monocvtogenes.En este caso es posible el aislamiento a partir de éste

(Seeliger,1961; Emile y Bazin, 1975; Ralovich, 1984a;Domingo esaL, 1986; Allerbergery

Guggenbichler,1989; Ortel. 1989b: Carvajalet aL, 1989).

1.VII.b- INFECCION MATERNO-FETAL

Esta forma no es sino una consecuenciade una infección materna que acaba

provocandoabortoo septicemiaperinatal(Schuchatet al., 1991), aunquela infección de la

madre no implica necesariamentela infección del feto (Farber y Peterkin, 1991).

Fundamentalmentese presentaen oveja, vaca y la mujer. En estaúltima puede cursarde

forma inaparenteo bien producir un cuadro inespecíficocon cefalea, fiebre, en ocasiones,

faringitis y pielitis, e incluso síntomasgastrointestinales(SchuchatesaL, 1991). Estecuadro

pseudogripal(Farbery Peterkin,1991)coincidecon la bacteriemia(Briones, 1990; Domingo

u aL, 1993), y duranteel mismo puedenalsíarselisteriasde sangre.loquios.mucus vaginal,

orina y tejido de placenta (Briones, 1990). El endometrio gestantese infecta por vía

hematógena,pasandola infeccióna placentade forma muy rápida (Domingo es al., 1993).

A la fasede bacteriemiale sigueun periodoen el cuallas listeriasseencuentranen el liquido

amniótico, de donde es aspiradopor el feto, provocandola implicación de los tractos

29

Introducción

digestivoy respiratoriode ésteen los quesedesarrollanlesionesapreciablesen la necropsia

(Briones, 1990). Tambiénesfactible que la diseminaciónorgánicay apariciónde Listeria en

los distintostejidosseaconsecuenciade labacteriemia(Seeliger,1961).Trasla infeccióndel

feto, éstemuereproduciéndoseel aborto, lo más frecuenteen vaca y oveja, o si llega a

términoel neonatomuererápidamentedebidoa una septicemia(Domingo u al., 1993).

Estecuadrosepticémicodel neonatocursacon disnea,cianosis,vómitos,adipsia,etc.

(Lorber, 1990; Farber y Peterkin, 1991), siendo más propio de la especiehumana.En los

rumiantesel cuadroesmásatenuado,pasandoprácticamentedesapercibido(Dijkstra, 1987).

En el hombrese produceuna marcadaleucocitosiscon apariciónde célulasrojas y blancas

inmaduras,y, en algunos individuos, pueden apreciarsepequeñosgranulomascutaneos,

llamados listeriomas, que constituyen la denominada ‘granulomatosis infantiséptica’

(Ralovich, 1984a;Gitter, 1985; SchuchatesaL, 1991; Farbery Peterkin, 1991). En algunos

casos,fundamentalmenteen el hombre,el reciénnacidopuededesarrollarun cuadro tardío,

de apariciónentre varios días y varias semanasposterioresal parto de tipo meningítico

(Schuchates aL, 1991; Farbery Peterkin, 1991), que puedeestaracompañadode trastornos

gastrointestinales,conjuntivitis y neumonía.Esta forma clínica suele estar asociadacon

infeccioneshospitalariasde tipo nosocomial,aunquetambiénseha demostradola existencia

de contagioen el momentodel parto (McLauchlin, 1987; Lorber, 1990; Farbery Peterkin,

1991). Tras el parto o aborto la hembrapuedeseguirportandoListeria en su tracto genital

o eliminaríasporhecesduranteun tiempo variable,lo que esrelativamentefrecuenteen los

rumiantes(Grayy Killinger, 1966; Clegg, 1975; Larsson,1979; Gitter, 1979; Dilkstra, 1987;

Goulet ti’ aL, 1989; Marth, 1988a).

1.VII.c- INFECCIONES SEPTICEMICAS

Los individuos adultos tambiénpuedenverse afectadospor una forma septicemíca.

Estaformaincluyeaproximadamenteal 25 % de los casos(Lorber, 1990). Normalmentesólo

son afectados por esta forma los individuos adultos cuando sufren algún tipo de

inmunodepresión;porestemotivo, esunagravecomplicaciónde cualquiercuadropatológico

que produzcaalgún gradode inmunodepresión(linfomas,enfermedadde Hodgkin, diabetes,

alcoholismo,lupus eritematoso,SIDA, etc.) (Ortel, 1989a;Carvajal ea aL, 1989; Gómez

Mampaso. 1993), así como de pacientessometidos a tratamiento inmunomodulador

30

Intr’>duccion

(trasplantados,quimioterapia,radioterapia)(GómezMampaso,1993).

Desdeel puntode vistaanatomo-patológico,estecuadroafectaa numerososórganos,

en los queprovocala apariciónde nódulosde distintostamaños.En cualquiercaso,el hígado

es el órgano diana por excelencia,y en él se desarrollannumerososgranulomas; otios

órganosque también pueden verse afectadosson el bazo, glándulas adrenales,pulmon.

esófago,paredfaríngea,tonsilas,nódulos linfáticos, timo, médulaósea,miocardio,testículos

y músculosesqueléticos.La localizaciónde estosgranulomasen tejidos epitelialespuede

originar la apariciónde áreasnecróticasen éstos.

Estaforma esmuy infrecuentementeobservadaen los animalesdomésticos(Hird y

Genigeorgis,1990).

1.VII.d- OTRAS FORMAS CLíNICAS

Existen un buen númerode formas clínicas, de menor importanciaen cuanto a su

frecuencia,como son las infeccionesmixtas en las que concurrenotras infeccionescon la

listeriosis,aunqueno seconocenporel momentolas circunstanciasen las queseproduceesta

concurrencia(Gitter, 1985). A consecuenciageneralmentede un cuadrosepticémicopuede

desarrollarseunaneumoníay endocarditisagudao subaguda,lo quepodríamosdescribircomo

listeriosisneumónica,y que sueleconstituirunagravecomplicación(Marth, 1988a;Schuchat

et aL, 1991). Los pacientesafectadospor una listeriosis septicémicasuelendesarrollarcon

frecuenciaendocarditisy un cuadrode hepatitis(Armstrong,1985). Las infeccionesfocales

puedentraducirseen artritis, osteomielitisy abscesosespinaleso cerebrales(Schuchatci al.,

1991).

Sin embargo,podríamosdecirque las másimportantesde entretodasellasson las que

brevementedescribiremosa continuación.

- Queratoconjuntivitis:En humanossueleserfrecuentecomo una secuelade la forma

septicémica,aunquetambiénpuedeapareceraisladamentepudiendollegar a provocar

el cuadromeningíticodebidoa una diseminaciónnerviosacentrípeta(Ortel, 1989a).

En los bóvidos es relativamentefrecuentela apariciónde Listeria asociadaa otros

31

Introduccion

microorganismoscomo Mycoplasrnabovoculi, Moraxella bovis. etc, másque como

único agenteresponsabledel cuadro(Gitter, 1985).

- Lisíeriosis cutánea:es una forma muy rara en los animales. Suele apareceren

ganaderosy veterinariosque han tenido contactocon tejidos infectados.Las lesiones

que puedenobservarseson nódulos cutáneosque devienenen pústulas,de cuyo

líquido puedeaislarseL. monocytogenes (Cain y McCann, 1986). Estas lesiones

cutáneaspodríanser causade la apariciónde portadoresfecales,tras una fase de

bacteriemia,colonizaciónhepáticay posteriorexcreciónbiliar (Brionesei’ aL. 1992).

- Mastitis: Debido a la ubicuidadde Listeria seriade esperarque estecuadrofuese

más frecuentede lo que esen realidad.Es un cuadroque carecede especialrelevancia

desdeel punto de vistaclínico, sin embargodesdeel punto de vistaepidemiológico

y de SaludPública si quetiene unamayorimportancia,ya que seríael responsablede

unacontaminaciónendógenade la leche por L. rnonocvtogenes. En estalínea Gitter

(1985)consiguiódemostrarla presenciade Listeria en leche de vacasvarios meses

despuésde haberdesaparecidola sintomatología.Sin embargo,el principalriesgo,más

que los animales que llegan a desarrollarsintomatologíaclínica, lo constituirían

aquellosque padecenuna mastitis subelínica,al serdifícil su detecciónporquese ha

de demostrarla presenciade un elevadonúmero de leucocitosen la leche, o bien

aislarseL. monocytogenesen cantidadesde aproximadamenteí03 UFC¡ml (Errebo-

Larsen y Jensen,1979; Dijkstra, 1987; Bryner et al., 1989). Sin embargo,en la

actualidad se han puesto a punto medios lo suficientementeselectivoscomo para

poder llegar a detectarla presenciade hasta 10’ UFC Listeria /ml (Blanco et al.,

1989).

1.VIII- DEFICIENCIAS NUTRICIONALES Y ENFERMEDAD

Los seresvivos necesitaningerir una serie de sustanciasparapoder mantenersus

funciones biológicas en perfecto estado. Estas sustanciasson, de forma general, agua,

prótidos, lípidos, glúcidos, vitaminas y elementosminerales. La ingestión insuficientede

algunosde estosprincipios podríaproducir un estadocarencialque puedeprovocaralgún

estadopatológicoper se,o bien puedefacilitar la instauraciónde éste.Sin embargo,además

32

Introducción

de la ingestióninsuficientehemosde teneren cuentaque,en ocasiones,a pesarde haberuna

cantidadóptima en la dietade estoselementos,la existenciade circunstanciasque alteransu

normal absorciónpuedeconllevar los mismos efectosque si no lo estuviesen;entreestas

alteracionescabecitar alteracionesdentarias,del tubo digestivo y glándulasanejas(Blood et

al., 1986).

Otros factoresque puedenprovocarla apariciónde deficienciasnutricionalesen un

individuo es la existenciade sustanciasque destruyandeterminadoselementosabsorbidoso

sus metabolitos, o bien que impidan a alguno de ellos realizar sus funciones;cualquier

alteraciónen el transportede metabolitostiene tambiénel mismo efecto; y, porúltimo, la

falta de apetito o anorexia,bien sea patológicao voluntaria, producetambién los mismos

efectos(Blood et aL, 1986).

La resistenciafrente a las enfermedadesse halla íntimamenterelacionadacon la

ingestadel individuo, relación que se ha visto confirmada por estudios epidemiológicos

llevadosa cabo, principalmente,en el TercerMundo, aunqueno debemosolvidar que las

deficienciasnutricionalesno son rarasen los paisesdesarrollados,en los queesrelativamente

frecuenteencontrarestadosde ligeras deficiencias.Por ejemplo en Norteaméricaexiste

deficienciade hierro en al menosun 9% de la población.En casosde malnutriciónproteica

y energéticapuedenapareceralteracionesde la respuestainmune, que, además,pueden

apareceren casosde deficienciasde un único elemento(Chandra,1985, 1989).

Sin embargo,existenpocosdatos sobrela significacióneconómicay la incidencia de

estosproblemasa los que poderreferirnos.La mayoríade los trabajospublicadossobrelas

enfermedadescarencialesmás conocidasno dan en su mayoría datos cuantitativos que

permitanconocersu verdaderaincidencia así como su impacto económicoreal. A pesarde

estasdeficienciasinformativas,el libro de SanidadAnimal de la FAO/OMS (citadopor Blood

et aL, 1986) revela que una gran mayoría de los casosen los que se pudo identificar las

causasfueron debidasa problemasnutricionales,bien deficienciaso bien excesos.

Otro problemasobreañadidoa la hora de valorar la importanciaeconómicade estos

procesosse encuentraen que muchasveces la deficiencia nutricional provoca un mayor

susceptibilidada otras enfermedadesque son a las que se achacanesaspérdidas.Como

33

Introducción

ejemplo digamosque en el Reino Unido, a pesarde la política de suplementarlas dietas,

aparecensignosde deficienciaen cobreanualmenteen el 0,9% de la poblaciónvacuna,pero

las pérdidasdebidasa estadeficienciapodríanestarmuy infravaloradasdebido una mayor

susceptibilidadde los animalesdeficientesen cobrea las enfermedadesinfecciosas(Blood et

aL, 1986).

Podemosafirmar, por tanto, que las deficienciasmineralesseencuentranampliamente

distribuidas, pero el conocimiento de su incidencia e importancia real se encuentra

infravaloradodebidoa quelas formassubclínicasde deficienciasuelenpasardesapercibidas.

En los paísesdesarrolladoslas deficienciasde los oligoelementossuelenconfundirse

con otrascarenciasmáscomunescomosonlas deficienciasenergéticas,proteicas,de fósforo

y aguaque afectanal desarrollopostnataly a la función reproductora.De formageneral,se

consideraa la malnutricióncomola causamás frecuentede inmunodeficienciasecundariaen

el mundo.Podemosafirmar quela malnutriciónprovocaalteracionesen los tejidos linfoides,

que presentanun menordesarrolloque en condicionesnormales.Son numerososlos factores

involucradosen estemenor desarrollo,pero podemoscitar, entreotros, un descensoen la

síntesis proteica y, por tanto, en la proliferación celular, así como un aumentode los

fenómenosde citolisis debido a un aumentode los niveles de glucocorticoides(Chandra.

1985).

Porotraparte, las deficienciasmineralesy los desequilibriosen el sueloy forrajeshan

sido factoresadmitidoscomocausasdebajaproduccióny problemasreproductivos.Dehecho,

el ganado de zonas con bajas cantidadesde cobre, cobalto y fósforo en los terrenosse

encuentranmás limitados incluso por la falta de estoselementosque por deficienciasde

energíao proteínas(Blood et aL, 1986).

De forma generalpodemosafirmarquelos elementosesencialesparalos seresvivos

son 15, que puedendividirse en dos grandesgrupos:

a) macronutrientes:calcio, cloro, fósforo, sodio, potasio,magnesioy azufre;

b> micronutrientes:cobre,selenio,zinc,cobalto,hierro,lodo, manganesoy molibdeno.

34

introducción

Estosmicronutrienteso elementostrazaseencuentraninvolucradoscomocomponentes

de muchostejidosy algunosson indispensablesparael correctofuncionamientode unao más

enzimas.Su carenciaconduciríaa una ampliaseriede consecuenciaspatológicasy defectos

metabólicos(Blood et aL, 1986).

La susceptibilidad a enfermedadespodría encontrarseinfluida por el estado de

desarrollofisiológico, diferenciasgenéticase interrelacionescon otros elementos;por tanto,

dos animalescon niveles parecidosde un elementono tendrían por qué responderigual

(Blood esal., 1986).

Unadeficiencianutricionalno implica la aparicióndeenfermedad,existenfactoresque

predisponenel individuo parasu aparicióncomo la edada la que aparecela deficiencia,

determinadoscambiosen el medioambiente,el contactocon determinadosagentesinfecciosos

y/o parasitarios,la respuestaindividual a la deficiencia, la posibilidad de utilizar rutas

alternativaspor partedel organismo,y la existenciay tamañode reservasde ese elemento

(Blood e, aL. 1986).

Los tres principios quedeberíanpresidirla interpretaciónde los criterios bioquímicos

acercadel estadode los elementosmineralesson:

1- su relación con la ingesta;

2- tiempo que dura la deficiencia;y,

3- función del elementodeficiente.

Cuandoun elementodesaparecede la dieta, seproduceun aportedel mineral a partir

de los distintoscompartimentosdel organismo,lo que permiteque durantealgún tiempo los

nivelessanguíneosdel mineralencuestiónno varien.~Sinembargo,si la deficienciapersiste,

los mecanismosencargadosde mantenerla homeostasisen el organismono puedenmantener

esosnivelesplasmáticos;así se llega aun momentoen el cualla actividadde la(s) enzima(s)

que necesitana esemineral comienzaa disminuir, apareciéndouna fasede disfunción. Esta

fase,de duraciónvariable,suelecoincidir con el periodo subclinicode la deficiencia,pci-o sí

finalmente la carenciamineral en la dieta no se recupera,aparecenuna serie de cambios

celularesresponsablesde las manifestacionesclínicas (Blood es aL, 1986).

35

1 uir,,ducción

1.IX- IMPORTANCIA BIOLOGICA DEL SELENIO

1.IX.a- ACCIONES BIOLOGICAS. ENZIMAS.

La importanciaen los seresvivos de esteelementofue debidaen un principio a sus

efectostóxicos (Spallholzet aL, 1990; Turnery Finch, 1991).En estesentido,estosúltimos

autoresafirmanque de los escritosde MarcoPolo puedeinferirsequealgunosmercaderesen

viaje haciael LejanoOrientepudieranperdersus bestiasde cargadebidoal usocomo forraje

de hierbacon altoscontenidosen selenio.

Durantemuchosañospredominósu consideracióncomo tóxico (Gyanget aL, 1984;

Spallholzci aL, 1990; Bedwal et aL, 1993),hastaque en 1957 Schwarz(citado porBackall

y Scholz, 1979; Gyang ci aL, 1984; Miller, 1985; Spallholz ei’ aL, 1990; Turner y Finch,

1991; Zacharaet aL, 1993) publica los resultadossobresus investigacionesacercade la

degeneraciónhepáticanutricionalen la ratay la influenciade unadieta pobreen vitaminaE.

En éstos afirma que el llamado “Factor 3’ aislado de hígado porcino prevenía esta

enfermedad.Este “Factor 3” conteníaen su composiciónselenio,y poco tiempo despuésse

demostróque esteelementoeracapazde prevenirla degeneraciónhepáticanutricionalen la

iata. Desdeese momento se le reconocíasu papel como un nutriente esencial para el

organismo.

A partirde estehecholos descubrimientosrelacionadoscon el seleniose multiplicaron

(Miller. 1985; Zacharaci aL, 1993). Especial relevanciatuvo el descubrimientode que

lormabaparteesencialde la enzimaglutation-peroxidasa(GSHPx),llevado a cabo en 1973

por John Rotruck (citado por Backall y Scholz, 1979; Miller, 1985; Spallholzet al. 199<);

Turner y Finch 1991). Estaenzima,junto con la vitamina E, forma partede los sistemasde

detoxicación de determinadosmetabolitos activos de oxígeno que se producen durante

numerosasfuncionesmetabólicasde las células (Fig. 3). El fallo de estossistemascausaun

dañocelular e incluso la muertecelular (Rotruck, 1972; Morris, 1984; citadospor Boyne y

Arthur, 1990).

La glutation-peroxidasano esla únicaenzimadependientede selenioen los animales

superiores.En 1985 Ursini (Spallholz. ei’ aL, 1990) describela existenciade una enzimade

36

Introducción

peso molecular inferior a la primera (20.00<) y 84.000 respectivamente), la

fosfolipidihidroperóxido glutation peroxidasa(PLGSHPx). Esta enzima parece tener las

mismas acciones que la anterior, además de intervenir en la reducción de los

fosfolipidihidroxiperóxidos.El selenioestambiénun componentede otrasproteínascomoson

la selenoproteinadel músculo,la selenoflagelina,las proteínastransportadorasde selenioy

las enzimasbacterianasformato-dehidrogenasay glicina-reductasa(Koller y Exon, 1986).

Asimismo, el selenioparticipaen el metabolismode numerosasdrogasy xenobióticos;por

ejemplo, el selenio contrarrestala toxicidad de determinadosmetales pesadoscomo el

arsénico,cadmio,mercurio,cobre,plata y plomo (Hill, 1975; Koller y Exon, 1986).

El papelbioquímicoesencialdel seleniosedebe,pues,aque formapartede la enzima

glutation-peroxidasa(GSHPx)(Braun ei’ aL, 1991;Bedwalet aL, 1993).La actividad de esta

enzimaen los eritrocitosha sido directamenterelacionadacon la concentraciónhemáticade

selenioen vacuno,ovejas,caballospoílos, ratasy cerdos(Backall y Scholz, 1979), y es un

dato muy útil tantoel diagnósticode la deficienciaen selenio,existiendouna relacióndirecta

entrelos nivelesde GSHPxy tasade selenioen sangrey tejidos de estosanimales(Backall

y Scholz, 1979). Estaenzimacontiene4 moles de seleniocomo selenocisteinaen su región

activa(Bedwal et aL, 1993).

La glutation peroxidasaprotegela fracción lipídica de las membranascelularesy

orgánulosdel daño por peroxidaciónmedianteinhibición y destrucciónde los peróxidos

endógenos,actuandoen conjunción con la vitamina E paramantenerla integridadde estas

membranas(Backall y Scholz, 1979; Koller y Exon, 1986). El peróxido de hidrógeno y

peróxidoslipídicos producenla desnaturalizaciónirreversiblede proteínasesencialesde la

célula lo que conduciría a la degeneracióny necrosis,por alteración de las membranas

biológicas,e incluso,a la destruccióndel tejido conectivo(Braun eta!., 199]). La GSHPx

catalizala degradaciónde peróxido de hidrógenoy determinadoshidroperóxidosorgánicos

producidospor el glutation duranteel ciclo redox (Koller y Exon, 1986) (Fig. 4). Esta

dependenciade la actividadGSHPxcon la presenciade selenioexplica la interrelaciónentre

selenio,vitamina E y los aminoácidossulfuradosen los animales.Estosaminoácidospueden

actuarcomo precursoresdel glutation que, a su vez, aauai-íacomo substratode GSHPx y

mantienelos grupossulfidrilos de la célula.

37

Fi

Daño a proteinas SHHO+ 1120

2estala a

2H022 2

Vitamina 2GSH glutation

peroxidasa GSSG

s¿len ¡o

ROH +HO2

peroxidación ¡ipidica

Figura 3- Acción de la GSHPx yde la vitamina E en elmetabolismo celular.

H O GSSG NADPH

G-6-P

G-6-PD

6-PGA NADP

6-P D

R-5-P NADPH

Figura 4-la GSHPx

Acción deen el ciclo

‘1Sistemasenzimáticos

Lípidosinsatu radas

E

4 ROOH

4/

HO22

GSH NADP

GSH-Px GSSG-R

redox.

Introducción

El papel bioquímico de la vitamina E es el de actuar como un antioxidante,

previniendoel dañooxidativo de los lípidossensiblesde las membranascelularesal disminuir

la formación de hidroperóxidos (Braun et aL, 1991). Esta vitamina presentaun papel

importanteen la protecciónde las membranascelularesdel dañoporlipoperoxidación(Turner

y Finch, 1991; Braun et aL, 1991).

Existe una importante interrelación entreselenio, vitamina E y los aminoácidos

sulfuradosen la prevenciónde algunasde las enfermedadesnutricionalescausadaspor su

deficiencia.Si la vitamina E previenela formaciónde hidroperóxidosde ácidosgrasos,y los

aminoácidossulfurados(como precursoresde la GSHPx)y el seleniosehallan involucrados

en la destrucciónde los peróxidos,estosnutrientespodríanproducir un efectobioquímico

muy similar, reduciendola concentracióntanto de peróxidoscomo de compuestosinducidos

por éstosen los tejidos (Blood et aL, 1986>. La protecciónfrente al daño oxidativo de las

proteínasno de membranasusceptibles,porel seleniode la dieta, pero no por la vitamina E,

podríaexplicarpor qué algunasenfermedadesnutricionalesrespondenal selenio,pero no a

la vitamina E. Por otro lado, determinadostejidos o componentesa nivel subcelularpodrían

no estar correctamenteprotegidos debido a que presentande forma inherente menores

cantidadesde GSHPx, inclusocon dietasadecuadas.El dañoproducido a estos tejidos se

veríaagravadopor dietascon alto contenidoen ácidosgrasosinsaturados,siendode esperar

que respondieranpositivamentea la administraciónde vitamina E. pero no a la de selenio.

Las variacionesen la actividadde GSHPxentredeterminadosórganoscomo hígado,corazón

y músculosesqueléticoy cardíacopodrían explicar las variacionesen la gravedadde las

lesionesentreespecies.

1.IX.h- TOXICIDAD DEL SELENIO

Como ya hemosreseñadoanteriormente,el seleniofue conocidoantespor sus efectos

tóxicos que por ser un nutrienteesencial(Gyang ci aL, 1984; Spallholz ti’ aL, 1990). Los

efectostóxicos en los animalesestánasociadosa lugarescon una alta concentraciónde

selenioen el suelo.Podemosdistinguir un efecto agudo,con sintomatologíaprincipalmente

nerviosa,y un efectocrónico, caracterizadoporemaciación,miopatíasy alopecias(Blood et

al., 1986; Koller y Exon, 1986).

39

introduccion

La selenotoxicosisestáligada a la existenciade una seriede plantasacumuladorasde

esteelemento.La existenciade estasplantas,pertenecientesa los génerosAstrogalus y

Oxyi’ropis, debenalertamossobrela probableapariciónde estapatología.Sonplantasque no

suelencreceren sueloscon bajoscontenidosen selenio,y, además,tienenla relativaventaja

de no serexcesivamenteatractivasparael ganadodebidoa sufuerte olor (Blood ci aL, 1986;

Bedwal ti’ aL. 1993).

Otras vías de intoxicación por selenio las constituirían la ingestión de residuos

industriales,asícomo unaposiblevía yatrogénicapor la costumbreactual de inyectarselenio

a los animalesparaprevenirenfermedadescomo la distrofiamuscularenzootica(Blood ei’ al.,

1986; BedwalesaL, 1993).

Independientementede la vía de entradadel excesode selenioen el organismo,el

mecanismode su efecto tóxico sedebea que esincorporadoen los amínoacidossulfurados

en lugar de azufre,y por tanto interfiereen los complejosenzimáticosen los queintervienen

estos aminoácidos(Bedwal et aL, 1993). El selenioreduce,además,las concentraciones

hepáticasde azufre y proteínasen ovejas; en estesentido,dietas con alta concentración

proteicaposeenun efecto protectorfrentea estaintoxicación (Blood ci aL, 1986).

En las intoxicacionesagudassuelenaparecerhalitosisaliácea,diarrea acuosa,fiebre,

taquicardia,posturasanormales,postracióny muerte de los individuos afectadospor fallo

respiratorio(Koller y Exon, 1986; Bedwal ti’ aL, 1993). Porsuparte, la forma crónicacursa

con adinamia, emaciación,pérdida de vitalidad, rigidez y cojeras. Otro síntoma de la

intoxicación crónica es la alopeciaparcial o total que puede aparecer.Las lesionesmás

frecuentesson congestiónhepáticay renal, con aparición de focos necróticosen hígado,

endocarditis,miocarditis y hemorragiasepicárdicas(Blood eta!., 1986; Koller y Exon, 1986;

Bedwal ti’ aL, 1993).

Aunque el selenio puede detectarsetanto en sangrecomo en leche y pelo de los

animalesafectados,no hemosencontradodemasiadosdatossobreestosúltimos parámetros.

Sin embargo,nivelessanguíneosde 3 ppm de seleniosuponenla apariciónde enfermedad

clínica.Por otraparte, tambiénpuedeencontrarseunaleve anemiatantoen los casosagudos

como crónicos;en estesentido,valoresde hemoglobinapróximos a 7 g/dl suelenaparecer

40

ji

Introducción

asociadosa estaintoxicación.

En lo querespectaal hombre,las cantidadesnecesariasparaproducirintoxicaciónhan

sido durantemuchos años objeto de debate (Koller y Exon, 1986). Así, existen datos

contradictorioscomo son que en zonas dondese ingieren cantidadesde 4,99 mg/día la

selenosises endémica,y por otra partese han realizadoestudiosdondese han llegado a

ingerir 1,510 mg/díasin que aparecieransignosde la intoxicación (Koller y Exon, 1986), e

incluso existendatos sobreun hombrede 62 añosque tomó 1 mg de selenioen forma de

selenito sódicodurantedosañosantesde que aparecieranligeros síntomasde intoxicación

(Koller y Exon, 1986).

En cualquier caso, los síntomasde la intoxicación por selenioen el hombre son

halitosisaliácea,engrosamientoy fragilidad de las uñascon aparición de puntosblancoso

líneas longitudinales,pelo seco y frágil que se rompe con facilidad, enrojecimientoe

inflamaciónde la piel en la que puedenformarseampollaso incluso úlceras,y alteraciones

de tipo nerviosocomoconvulsionesy parálisis(Koller y Exon, 1986; Bedwal ti’ aL. 1993).

La apariciónde estossignosdependede la intensidadde la selenosis.

1.IX.c- DEFICIENCIA EN SELENIO

Debido a que es más fácil que se produzcaestaalteración, se conocenmejor las

alteracionesde los animalesdomésticosdebidaso, al menosasociadas,a una deficienciade

selenio y/o vitamina E. Normalmenteestas manifestacionessuelen estar asociadascon

determinadosfactorespredisponenteso desencadenantes,como por ejemplo consumode

ácidosgrasosinsaturadoscon la dieta, ejercicio inhabitual y crecimientodemasiadorápido

en los animalesjóvenes(Blood ti’ aL, 1986). Estasenfermedadessuelen agruparsebajo el

epígrafe de “enfermedadesasociadasa carenciasde selenio-vitaminaE”, puestoque en su

mayoría pueden ser prevenidasmediante una con~ecta administraciónde uno o ambos

elementosen la dieta (Bínod ci al.. 1986).

Como sedijo, un correctoaportede selenio-vitaminaE es importantey su deficiencia

puedeprovocardiversasalteraciones(Braunet al., 1991)de entrelas que podríamoscitar las

siguientes(Blood ci a1, 1986; Koller y Exon, 1986; Hassanti’ aL. 1990), aunquepa’a su

41

Introduccion

estudiomás detalladodebamosremitirnos a un tratadode patología:

1-distrofiasmusculares:son,probablemente,los problemaspatológicosmásconocidos

debidosa las deficienciasen selenio/vitaminaE en la dieta. Puedenafectara distintas

especies,y tanto a los músculoscardiacoscomo a los esqueléticos.En algunoscasos

puedenproducirparálisispor lesionessimétricasde la espinadorsal.La másconocida,

con casi todaseguridad,es la ‘enfermedaddel músculoblanco’ en los rumiantes;

2- hepatosisdietética: esta forma suele apareceren cebaderosde cría intensiva de

ganadoporcino, en los que se utilizan piensoscon escasasconcentracionesen estos

elementos;

3- alteraciones de la respuesta inmune: esta es la alteración de más reciente

conocimiento.Serátratado con cierta profundidaden el siguientecapítulo; y,

4- otrasalteraciones:problemasen la reproducción,retenciónde membranasfetales

y mayor fragilidad eritrocitaria.

Estasalteracionesestáncausadaspordietasdeficientesen selenioo selenio-vitamina

E, junto con la posiblepresenciade factorescondicionantes,como una excesivacantidadde

ácidosgrasospoliinsaturadosen la dieta. Prácticamentela totalidadde estasenfermedadesque

aparecende forma naturalhan podido serreproducidasde formaexperimentalusandodietas

deficientesen selenio y/o vitamina E; y a la inversa,las lesionespuedenser prevenidas

mediantela suplementacióncon selenioy vitamina E (Blood er aL, 1986).En determinadas

circunstanciasseha podidocomprobarquela incorporaciónde cantidadesexcesivasde ácidos

grasospoliinsaturadosha resultadoser un factor importanteen la enfennedadexperimental.

Parecequela presenciade estosácidosgrasosen la dietacausaríaunadeficienciaen vitamina

E, por la actuaciónantioxidantede ésta.

Puedenexistir interaccionesentreel selenioy otros elementostraza (Blood et al.,

1986; Van Vleet et aL, 1977, 1981; Hill, 1975). Las lesionesdebidasa las deficienciasen

selenioy vitaminaE puedenserreproducidasen lechonesy patosalimentadoscon cantidades

excesivasde cobalto,plata,telu¡-o,zinc y vanadio(Van Vleet eraL, 1981).La suplementación

42

lntroduccion

con selenio-vitaminaE puedeconferir protección frente a la cardiomiopatiainducida por

cobalto (Van Vleet ti’ aL, 1977).

En el hombre,una deficienciaen seleniotambiénproducealteraciones,siendola más

importante la enfermedadde Keshan (Koller y Exon, 1986; Bedwal ci aL, 1993). Esta

enfermedades una cardiomiopatíaque puede acabarcon la vida del enfermo,pero que

respondebien a la terapiacon selenio.De forma general,cursacon alteracionesmusculares,

así como aumento de las actividadesGOT, GPT y CK en sangre. Este mismo autor,

basándoseen estudiosepidemiológicos,afirma que la deficienciaen selenioes un factor a

tener en cuentaen las enfermedadescardiovascularesdel hombre, ya que pareceque la

incidenciade hipertensiónesmás alta en zonascon deficienciaen selenioque en las que su

concentraciónes la adecuada(Koller y Exon, 1986). Porotra parte, igual que pareceocurrir

en los animales,la deficienciaen seleniono seexpresaa no ser que exista algún factor

predisponenteo desencadenante,como el estrés(Koller y Exon, 1986), y debeser tenida en

cuentaen casode SIDA, síndromede Down y enfermedadde Crohn (Bedwalet al., 1993).

Los datos disponibleshastael momento,sugierenque tanto el seleniode la dieta,

como los aminoácidossulfuradosy la vitamina E actuaríande forma sinérgicaprotegiendo

los tejidos de un daño oxidativo. Es evidenteque la GSHPx,quedependedel seleniode la

dieta, juegaun papelimportanteen la detoxicaciónde los peróxidoslipídicos reduciéndolos

a compuestoshidroxi de los ácidosgrasosno tóxicos,mientrasque la vitamina E prevendría

de la formaciónde hidroperóxidosde ácidosgrasos.La presenciade altos nivelesde ácidos

grasosinsaturadosen la dieta, aumentaríalos requerimientosde vitamina E, produciéndose

la oxidación tisular con la consiguientedegeneracióny necrosistisular, sobretodo en los

casosen que coexistaun escasoaportede seleniocon la dieta.

1.IX.d- SELENIO Y SISTEMA INMUNE

Esteapartadode las funcionesbiológicasdel selenioes el de descripciónmásreciente

y el que centra, en la actualidad,el gruesode las investigaciones,hastael punto de que

Spallholz ci aL (1990) llega a citar 82 referenciasacerca del papel del selenio en la

inmunidad entre 1972 y 1989. Todos los autores parecen estar de acuerdoen que la

suplementaciónde la dietacon seleniotiene efectosbeneficiosossobrela respuestainmune,

43

Introducción

y que, por el contrario, la deficiencia de este elemento provoca alteraciones en ésta (Koller

y Exon, 1986; Spallholz ti’ aL, 1990; Turner y Finch, 1991)

La primera referencia de que el selenio jugaba algún papel en la respuesta inmune data

del año 1959 (Spallholz ti’ al?, 1990) cuando McConnell observa como el te inoculado

subcutáneamente en perros era incorporado en la fracción proteica de sus linfocitos. A éste

le siguieron varios descubrimientos en este sentido, entre los que podemos citar (Spallholz

ci al., 1990) la descripción por primera vez del efecto antiinflamatorio de una fracción, que

posteriormente se vio estaba formada por selenio; el hallazgo de la GSHPxen los leucocitos

humanos; y, la disminución de la actividad de esta enzima en mujeres con la enfermedad

crónica granulomatosa.

Sin embargo, la primera referencia específica acerca de selenio y respuesta inmune,

se produce en 1972 (Spallholz et aL, 1990) cuando Berenshtein observa cómo la producción

de anticuerpos en conejos inoculados con toxina diftérica fue mayor tras una segunda o,

incluso, una tercera inoculación en los animales tratados con selenito sódico que en los

respectivos controles no tratados. A partir de este descubrimiento los trabajos que relacionan

selenio y sistema inmune se han visto aumentados en gran número tal como puede verse en

la excelente revisión de Spallholz ti’ aL (1990). En este sentido, la disponibilidad de selenio

en la dieta afecta a todos los componentes del sistema inmune (Kiremidjian-Schumacher ti’

aL, 1992), tanto a la función de los polimorfonucleares neutrófilos, como a la proliferación

linfocita¡-ia, mecanismos de citotoxicidad y de producción de anticuerpos (Reffert Stabel ci

aL, 1989; Sordillo et aL, 1993) entre otros.

Dado que existe una relación directa entre la tasa de selenio y actividad de GSHPx,

es preciso hacer referencia a la actuación de ésta respecto al Sistema Inmune. Se ha podido

comprobar que la GSHPxse encuentra en la práctica totalidad de las células que derivan de

la médula ósea, esto es, eritrocitos, linfocitos, monocitos, e incluso en las plaquetas, así como

en los órganos principales del sistema inmune como médula ósea, timo, hígado, bazo,

glándulas linfoides, e incluso en el intestino. No debemos olvidar que este último es uno de

las principales puertas de entrada de elementos extrañosa~ organismo.

Las funciones de esta enzima con respecto al sistema inmune son:

44

InIn ducciin

1- reducción de los peróxidos orgánicos e inorgánicos que se forman durante el

metabolismo general;

2- metabolismo de los hidroperóxidos que se forman en las rutas de la lipoxigenasa

y de la cicloxigenasa a partir del ácido araquidónico; y,

3- reducción del peróxido de hidrógeno, así como del anión (Y formados durante la

explosión oxidativa en la fagocitosis.

l.IX.d.1- Influencia sobre la función fagocitica

Una vez llegadosal foco inflamatorio o infeccioso los monocitos y macrófagos

eliminan todo aquelloque puedaresultardañinoal hospedador.Paraello englobanal agente

extrañoincluyéndolodentrode unavacuolaensucitoplasma,vacuolaque esconocidacomo

fagosoma. Las células fagocíticas presentan una gran riqueza en lisosomas en su citoplasma.

orgánulosque fusionansus membranascon las del fagosomaliberandosu contenidoen su

interior, que pasa a denominarse fagolisosoma. De esta manera en el interior del fagolisosoma

existeun ambienteácido, íico enenzimasquedestruyeneseagenteextraño,peroademásese

ambienteesrico en unaseriede metabolitosde oxigeno(H,02 y O; entreotros)que facilitan

esalabor tóxica del fagolisosoma(Fig. 5>.

Vemos,pues,cómoexistegran cantidadde compuestosde oxígenoque actúancomo

antimicrobianos. Sin embargo estos productos son también tóxicos para la célula, y, por tanto,

si ésta fuera incapaz de detoxicar estos productos se produciría un daño a sí misma. Entre los

responsables de evitar esos daños a las membranas se encuentran tanto la GSHPxcomo la

vitamina E. Es de destacarque en los leucocitosla actividadGSHPx es mayorque en los

eritrocitos, lo que indica que esta enzima actúa también en los fenómenos de fagocitosis

(Erskine et aL, 1987).

Una deficiencia en selenio produce una menor actividad GSHPx y un fallo en la

fagocitosis de Candida (Erskine et aL, 1987; Turner y Finch, 1991), fallo que parece ser

debido a una disminución en la capacidad fungicida más que a una alteración en la capacidad

45

macrófago

REORGANIZACIONTI SU LAR

elastasa, colagenasa,hialuronidasa, factor ________________

estimulante fibroblastos

Figura 5- Resumendel papel del

macrófago en larespuesta inmune.

tomado de Roitt,I.;Brostoff,J.; Male,d.

“Immunology” (1985).Gower Medical Publishing.

Londres.

INFLAMACIONFIEBREILt, Pg

ACTIVAC IONLIN FOGITA A ¡A

presentaciónAgIL1

MICROBICIDA

reactivos de oxígeno

DAÑO TISULAR

reactivos deoxígeno

ANTITU MORAL

TNF, proteasas

Introducción

de ingeriria (Serfass y Gauther, citado por Miller, 1985). Aunque estos mismos autores no

parecenponersede acuerdoen cuantoa si la actividadbactericidaseencontraríaafectada,los

primeros afirman que se encontraría disminuida ante determinadas bacterias como ocurre con

S. aureus y neutrófilosbovinosdeficientes,mientrasquefrenteaProteusmirabilis no se vería

afectada. Por el contrario, Turner y Finch (1991), basándose en los trabajos de diversos

autores, llegan a afirmar que la actividad bactericida podría no verse afectada en animales

deficientesen selenioy vitaminaE, lo queen nuestrojuicio es,cuantomenos,una afirmación

comprometida a la vista de la bibliografía existente sobre el tema. En cualquier caso los fallos

funcionalesde los neutrófilosde animalesseleniodeficientespodríanrestaurarsemediantela

administración de pequeñas cantidades de selenito sádico (citado por Turner y Finch, 1991),

duranteun escasoperíodode tiempo.

La fagocitosis produce un aumento en el consumo de O, que es reducido por la

NADPH oxidasaa otras formasque resultanmásbactericidas,pero que también resultan

perjudicialesparalas membranascelularesal producir la peroxidaciónlipídica de los ácidos

grasospoliinsaturados.La deficienciaen selenio implicaría unas cantidadesmenoresde

OSHPx,lo que influiría sobrela capacidadcelular de detoxicarH,0,, lo que conllevaríaun

aumentode los peróxidoslipídicos, que inhibirían la ruta de las hexosasmonofosfato,que

inhibiría, a su vez, la regeneración de la NADPHa través de esta ruta y por tanto acabaría

produciendo una limitación en la capacidad bactericida de los neutrófilos (Gyang ci al., 1984;

Erskine et al., 1989). Pero ademásel NADPH es necesariopara reducir nuevamentela

glutation peroxidasaoxidada al detoxicar los peróxidos de hidrógeno,que en estaforma

oxidadaesinactivaa estosefectos(Gyangti’ al., 1984).

Por otra parte, algunos autores afirman que las rutas de la ciclooxigenasa y de la

lipoxigenasaen el metabolismodel ácidoaraquidónicosonseleniodependientes,y, por tanto,

podríanapareceralteracionesen la función reguladorade los macrófagospor alteraciónde

determinadosmetabolitosderivadosdel ácidoaraquidónicocomopor ejemplolaPOE,,la F,~,

y el leucotrienoB4 (Erskinees al., 1989; Eskewes al., 1989).

IJX.d.2- Influenciasobrela producción de anticuerpos

Existen descripciones sobre cómo el aporte de selenio extra en la dieta de ratones llega

47

ji

ini roduccitn

a provocar un aumento de entre 7 y 30 veces (según cantidad suplementada) en la producción

de anticuerpos(Miller, 1985>. Sin embargo,estasalteracionesen la producciónde anticuerpos

parecen estar condicionadas por la edad del individuo (citado por Turner y Finch, 1991). Así,

pollos de dos semanas mantenidos con una dieta deficiente en selenio o selenio-vitamina E

mostraron títulos menores frente a eritrocitos de oveja, sin embargo, si los animales tienen

una semana más, sólo los mantenidos con deficiencia en selenio-vitamina E mantuvieron esa

menor producción de anticuerpos. Otros autores citados por Turner y Finch (1991) han

empleado ratones y han observado que si son mantenidos con deficiencias en selenio se

produce disminución de la respuesta con IgG. pero no con IgM, lo cual indicaría que lo que

resulta particularmente sensible a esa deficiencia serían los linfocitos T-colaboradores. Para

poder observar una disminución de la producción de la IgM se tendría que mantener esa dieta

hasta la segunda generación (Turner y Finch, 1991), aunque si se utiliza una dieta deficiente

en selenio-vitamina E esa producción se ve alterada con mayor rapidez (Turner y Finch,

1991).

Por otra parte, las cantidades de selenio suplementadas en la dieta que producen una

mayor producción de anticuerpos, también están condicionadas a la especie del receptor, edad,

sexo y naturaleza del antígeno. Por ejemplo, Turner y Finch (1991) citan que las cantidades

de selenioen la dietaque producenun aumentode los títulos frentea eritrocitos de ovejaen

ratones jóvenes son inhibitorias en machos, pero no en hembras; asimismo, afirman que esa

elevaciónque seobservaen ratonesy cerdosjóvenesno seve en animalesmayores,y que

una dosis de selenito sódico en la dieta de corderos, que había dado los mejores resultados

frente a la toxina tetánica, dio unos resultados muy pobres cuando el antígeno empleado fue

el virus de la parainfluenza-3o Corynebactcrium.pseudotuberculosis.En este sentido estos

mismosautoresafirmanqueuna microdeficienciaen seleniono implica una menorrespuesta

de anticuerpossiemprequelos nivelesde vitaminaE semantengannormales(Turner y Finch,

1991). Otros autores (Blodgett es aL, 1986) afirman que el aumento en la producción de

anticuerposen animalessuplementadoscon selenioen su dieta, se produceúnicamentehasta

una determinada cantidad de este elemento, que ellos cuantifican en 0,9 mg/Kg. por encima

de la cual la tasa de anticuerpos desciende.

Sin embargo,existenautoresqueafirman no haberencontradodiferenciasen las tasas

de anticuerpos de animales alimentados con una dieta deficiente en selenio y animales

48

ini roduccion

alimentadoscon cantidadesadecuadasde esteelemento(ReffertStabel ti’ aL, 1989). Aunque

estos mismos autoresafirman que esto podría ser debido a que la deficiencia en selenio

provocadano fuera lo suficientementeintensapara ello. Por otra parte, estos autoressi

encuentrandiferenciasen las tasasde anticuerposel día 17 postinfecciónentre animales

deficientes y los controles, debido posiblemente a que los primeros tendrían una peor

eliminación del patógeno (en este caso P. haemolytica),y, portanto, sefavoreceríaunamayor

estimulación antigénica de los linfocitos B.

Estos mismos autores mezclan animales deficientes y no deficientes inoculados y no

inoculadoscon P. ltatrnoíytica, y observancómo los títulos de anticuerposen los animales

deficientes son superiores que los observados en los animales suplementados. Lo cual podría

ser debido a que los animalesdeficientespresentaríanmayor susceptibilidadfrente a una

infección bacteriana secundaria que los suplementados, o bien, a que la suplementación con

selenio acaba provocandouna disminución de la respuestainmune. Esto último está de

acuerdo con lo afirmado por otros autores (Murray y Murray, 1985), quienes llegan a la

conclusión que la deficiencia en selenio aumenta la supervivenciade ratones frente a

Plasmodiumbergeii, Listeria monocytogcneso frenteal virus de la pseudorrabia.

También Droke ti’ al? (1989) menciona la posibilidad de que se produzca algún tipo

de inmunosupresión en animales suplementados con selenio, ya que encuentran niveles muy

bajos de seroconversión en sus experiencias con P. hae¡nolvtica,aunqueno seextiendensobre

este panicular. Sí encuentran un aumento de las tasas de IgG frente a este agente aunque no

aprecian mejoría en el estado sanitario de los terneros tratados, lo cual podría ser debido a

las interaccionesde otros agentesresponsablesdel complejorespiratoriobovino.

1.IX.d.3- Influencia sobre la función secretora de las células del sistemainmune

Tanto los linfocitos como los macrófagos secretan una serie de sustancias que actúan

comomediadoresquímicosde la respuestainmune(Fig. 5). De entreéstoslos másconocidos

son las interleuquinas1 y 2. Las cantidadesde estassustanciassecretadaspor células de

animales delicientes y normales no presenta diferencias importantes (Kiremidjian-Schumacher

esal., 1990, 1992; Sordillo es al., 1993), porlo que estosautoresafirman que la secreción de

estos mediadores no es dependiente de los niveles de selenio existentes en el Organismo.

49

Introduccion

Por otra parte, parece existir un aumento en la producción de TNF-a en animales

suplementados (Kiremidjian-Schumacher er al., 1992), aunque estos autores responsabilizan

del mismo al aumento de macrófagoscitotóxicos en los animales suplementados.Sin

embargo,no parecehaberdatos del efecto de la deficienciaen seleniosobremediadoresel

TNF o las interleuquinas6 y 8 (Sordillo tt aL, 1993). Estas sustancias, con un importante

papel en los fenómenos de inflamación, podrían desempeñar también funciones quimiotácticas

sobre los neutrófilos, y podrían verse afectados por los niveles de selenio en el organismo.

En definitiva, no parecenexistir datos concluyentesy, por tanto, ésto necesitaaún ser

estudiadocon mayor profundidad.

1.IX.d.4- Influencia sobre la capacidad proliferativa de los linfocitos T y B

Una vezeí antígenoesprocesadopor los macrófagos,seunea las moléculasde clase

1 ó II del Complejo Mayor de Histocompatibilidad existentesen la superficie de los

macrófagos y son presentados a los linfocitos T, lo cual constituye la primera señal para la

activación de estasúltimascélulas(Fig. 5). Estemismoefectolo puedenrealizar,entreotras,

determinadaslectinas mitogénicas vegetales como la concavalina-A (Con-A) y la

fitohemaglutinina (PHA). Sin embargo, para que se produzca la estimulación máxima es

necesariala presenciade un factor de co-estimulacióncomo la ILí. Como respuestaa esa

estimulación,una subpoblaciónde linfocitos T produce 1L2, mientrasotra subpoblación

expresa receptores para esa última. Finalmente, la unión entre la 1L2 y sus receptores provoca

unaseñalparaque las célulasque poseenestosreceptorescomiencena proliferar.

Utilizando mutágenos específicos para los linfocitos T, como la concavalina A (Con

A) o la fitohemaglutinina(PHA), seha comprobadoqueen poííosy animalesmonogástricos

la deficienciaen selenioprovocaunamenorrespuestade las célulasT (Turnery Finch, 1991;

Kiremidjian-Schumacheret aL, 1992). Esta menor respuestade los linfocitos T seve mucho

másdisminuidasi la deficienciaesen selenioy vitaminaE, e incluso esmásevidenteen este

casoque la alteraciónqueseproduceen la respuestade los linfocitos T a causade unamenor

ingestade alimento (citado por Turner y Finch, 1991).

Como los niveles de ILI y 2 no se ven afectadosde forma diferente por una

deficienciao suplementacióncon selenio,y ademásla función presentadorade antígenosde

50

Introducción

los macrófagosno seencuentraalteradatampoco(Kiremidjian-Schumacherti’ al., 1990),esta

menorrespuestapuedeserachacadaalas célulasaccesorias.Estos autores(Ro>’ et al., 1992)

han observadocómo, efectivamente,esta alteración de la respuestablastogénicade los

linfocitos T sedebea que la expresiónde los receptoresde 1L2 seencuentraalterada,hasta

el punto de que en caso de deficiencia estaexpresiónsc lentifica en gran medida. Esta

lentificación sedebea que en casode deficienciaen seleniose producenun menornúmero

de receptoresde alta afinidad (Roy ti’ aL, 1993), primandolos de baja afinidad ya que el

númerode receptoressemantieneconstanteindependientementedel selenio(Roy esal., 1993;

Sordillo ni al?, 1993), por lo que se necesita un tiempo mayor para alcanzar la concentración

umbralnecesariaparacomenzarla proliferaciónde los linfocitos T.

También se han utilizado mutágenos específicos de los linfocitos B como el

lipopolisacárido (LPS) de E. cali, con el que seha podido observaruna menorrespuestaen

animalesdeficientesen selenio-vitaminaE (citado por Turner y Finch, 1991).

Sin embargo,pareceque esta respuestaa mutágenospor parte de los linfocitos

dependede la edad,ya que mientrasque ovejasadultasmantenidascon una dieta deficiente

en selenioy vitaminaE presentanuna buenarespuestaa PHA, no ocurrede igual maneraen

corderos,en los que sí seproduceun fallo en la respuestade linfocitos T (citado porTurner

y Finch, 1991).Estosmismosautoresexponenunahipótesisa esterespecto:en ovejasadultas

los microorganismosexistentesen el rumenposeenunascantidadesdeseleniomuy altas,que

podrían ser puestasa disposición de las células inmunocompetentescuando ésto ft¡ese

necesario.

Esta alteración en la proliferación de los linfocitos, puede ser detenidae incluso

invertidamediantela inyecciónde selenito sódicoal animal o la adición de ésteal medio de

cultivo de las células.Esto indicaríaque el fallo radicaríaen el ambientecelular másque en

la célula en sí (citado por Turner y Finch, 1991). Pero otros autoreshan advertido de la

posibilidad de que aparezcanaberracionescromosómicascuandose administraselenio en

cantidadessuperioresa las necesarias;las cantidadesnecesariaspara que los linfocitos

presentenuna mayor respuestason de 1 ng/ml de medio de cultivo, con cantidadesde 10

ng/ml sealcanzauna meseta,y con 1 pg/ml se produceuna espectacularcaída(Citado por

Turner y Finch, 1991). Incluso se señalaque la adición de 6 ng Se/ml al medio de cultivo

51

introducción

provocala apariciónde un 13% de células aberrantes,porcentajeque llega al 40% si las

cantidades añadidas son de 600 ng/ml.

1.X- SELENIO Y RESISTENCIA A ENFERMEDADES INFECCIOSAS

Hemosvisto como la deficienciaen selenioprovocala disminuciónde la respuesta

inmune en cadauno de sus aspectos,pero veremosahoralo que ocurrecuandotodos estos

mecanismosactúanconjuntamente.

La suplementacióncon selenio-vitaminaE durante los periodos de gestación y

lactación en cerdaspodría disminuir las pérdidaspor el síndromemastitis-metritis-agalaxia

porcino (Whitehair,citado porMiller, 1985).Erskine ti’ al? (1987) describeque la leche de

los animales suplementadoscon selenio y vitamina E presentabanrecuentoscelulares

menoresque los no suplementados,y que estosanimalesresistíanmejor a las infecciones

mamariaspor Streptococcusagalactiae y Si’aphylacoccusaureus. Además,las mamitis en

estos animales tenían una menor duración, así como una menor gravedad de los signos

clínicos. Estos autoresafirman que estehechose debe a que en los animalesdeficientesse

produceunamenoractividadGSHPx,y esto implicaríaunamenoreficaciabactericida,sobre

todo si la bacteriaingeridapresentaalgún mecanismoparadegradarlos peróxidosformados

durante la fagocitosis.

Lo expuestoanteriormentesevio confirmadocon estudiossobremamitis provocadas

por E. ccli (Erskine ti’ aL, 1989).Estosautorescomprobaroncómo,nuevamente,los animales

suplementados con selenio y vitamina E presentaban menos problemas de mamitis por este

agentepatógenoque los no suplementados,siendo menor la frecuenciade apariciónde la

mamitis y también menor la duración de la misma. Atribuyen este hecho a una mejor

movilización de los neutrófilos desdeel torrente circulatorio, y a una mayor capacidad

fagocitica de los neutrófilos observadain vitro. Los neutrófilos de vacas deficientes

demostraronuna menor capacidadbactericidatanto frentea CarnUda albicanscomo frente

a 8. aureus.Sin embargo,en estudiosrealizadospor el mismo autor con posterioridadno

llega a estamisma conclusiónsobre el efecto del selenio en las mamitis por S. aureus

(Erskine eS al., 199<)), ya que en esteestudiono vio diferenciasentreel grupodeficiente y

el suplementado,aunquejustifica esto en que mientrasque en las mamitis por E. ccli son

52

Introducción

bastantefrecuenteslas formasagudasde la enfermedad,en las producidaspor S. aureusno

lo son tanto, y ademásesteúltimo presentauna mejor adaptacióna la mama.

Porotro lado, Braun ci aL (1991) confirma la mayorgravedadde las mamitis en los

animales selenio deficientes, ya que la suplementación con selenio produce un aumento del

númerode leucocitosque llegan a la glándula, y, por tanto, a un aumentode la fagocitosis

queproduceun descensoen el númerode bacteriasviables.

Tambiénen otrasenfermedadestransmisiblesseapreciauna mejor respuesta,como

ocurre en los poííos con la coccidiosis (Colnago er al., 1984a). Estos autoresdescriben

cambiosen el númerode leucocitoscirculantesen poííos inmunizadosinfectadoscon distintas

especiesde Eirneria cuandoselessuplementala dietacon selenio.Asimismo observancómo

una suplementaciónconselenioy vitamina E produceun aumentoen la gananciade pesode

poííos no inmunizados frente a E. tenella, así como una disminución de la mortalidad

(Coinagoesal., 1984b).Estamejorade la respuestainmune pareceafectara los mecanismos

de defensageneralfrentea infestacionesprimarias.Llegan incluso a exponersu sospechade

que estasmejorías sondebidasa un aumentode la fagocitosis.

Sin embargo,la concentraciónde seleniono tiene incidenciasobrela infestaciónpor

Haernanchuscantari’us en oveja(Jelinek eS al?, 1988), aunqueel mismo autor lo atribuyea

que las ovejasselenio-deficientesutilizadasen su experienciapresentaronamplias reservas

de a-tocoferol,que podría habercompensadola deficienciaen selenio. Por otra parte, la

utilización de dietassuplementadascon seleniosí parecentenerinfluenciasobrela infección

por Seipulina hyodysenteriae, anteriormenteincluida en el géneroTi-eponerna,(Teige ci al.,

1984), ya que la resistenciaa esteagentefue mayoren los grupossuplementadosque en el

no suplementado.Si bienhemosde señalarla apariciónde un resultadocuandomenoscurioso

muy similar al descritopor Blodgett ti’ aL (1986) en producciónde anticuerpos,ya que el

grupo al que se administró la cantidad más alta de selenio no presentó diferencias

significativas con el no suplementado, lo que nos confirma la sospecha de que el aporte de

selenioporencimade determinadascantidades(0,8-0,9mg/Kg) no producebeneficioalguno.

Con lo expuestohastael momentoparececlaro que la deficienciaen selenioafecta

a 1-a función de los neutrófilospolimorfonuclearesasociadaa los cambiosfisiológicos en los

53

ini roduccion

niveles de GSHPx. Los neutrófilos de vacas mantenidasexperimentalmentecon dietas

deficientes en selenio presentan un menor consumo de oxigeno, así como menores actividades

de GSHPxqueen el casode neutrófilosde vacascon una dietanormal (Erskine ti’ aL, 1987,

1989). Estemismoautorha comprobadoquela deficienciaen selenioprovocala disminución

en la producción de leucotrieno B4, un metabolito de la lipooxigenación del ácido

araquidónicopor los netrófilosqueademásactúacomoun potentequimiotácticoy estimulante

quimiocinético paralos neutrófilos,lo que provocauna disfunción de éstos (Erskine ti’ al?.

1989).

Estoscambiospuedenhacerqueun animal deficienteseamássensiblea enfermedades

infecciosas,aunquepor el momento no pareceexistir pruebaalgunaacercade una mayor

incidenciao gravedadde enfermedadesinfecciosasentreanimalesnaturalmentedeficientes

en selenioo vitaminaE. Los neutrófilosde animalesdeficientespierdenpartede su capacidad

parafagocitaralgunosmicroorganismos,aunqueno esconocidala relevanciaque éstopueda

teneren las infeccionesnaturales.

En resumen,podemosafirmar que unadeficienciaen seleniosetraduceen una menor

capacidaddel sistema inmune, y. por tanto, en una mayor susceptibilidadpara padecer

enfermedades.

54

2. OBJETIVOS

Objetivos

2.OBJETIVOS

Ya hemosapuntado anteriormente que la listeriosis precisa de una serie de factores

predisponentes.Estos factoresconducena un estadode inmunodeticienciamás o menos

acusado,bien por la existenciade un estadopatológicosubyacente,por actuaciónmédicao

de forma fisiológica. Sin embargo,estosfactoresconocidosno soncapacesde explicar todos

los casosque seproducen,esdecir, debenexistir otros factorespredisponentesdesconocidos

por el momento como tales. Entreestosúltimos cabría incluir los estadosde deficiencias

nutricionales tanto las que cursan en forma manifiesta, que haría fácil estableceruna

correlacióncausa-efecto,como las microdeficiencias,es decir, todo aquél estadoen el que

existeuna deficienciade un determinadoelementoque no essuficientecomoparaprovocar

alteracionesvisibles.

A pesarde los puntososcurosexistentestodavíaen la patogeniade la listeriosis,existe

un convencimientogeneralde que la principal vía de transmisiónes la oral, ya que en los

últimos brotes ocurridos en el hombre y los animales la infección se ha producido a través

de alimentos.Sin embargo,la mayoríade los autoresprefiereutilizar la vía intragástricacomo

vía experimentalde infecciónal requerirdosisalgo inferioresque la vía oral. Consideramos

como vía oral aquellaen que el individuo ingiere las listerias con el aguao el alimento,

permitiendoel contactode las bacteriascon todo el tracto digestivo.

Además,los datosepidemiológicosexistentesmuestranuna mayor prevalenciadel

serovar4h que del 112a en los brotes, aunqueno existendatos que confirmen una mayor

frecuencia de aislamientos de 4b que de l/2a de muestras ambientales.

Por todo lo expuesto,decidimosinvestigar,utilizandoel modeloexperimentalmuríno:

1- las repercusionesqueunamicrodeficienciaen selenioy vitaminaE podríateneren

la susceptibilidada la listeriosis,paralo que comparamosanimalesdeficientesy no

deficientes;

2- la dinámica de la infección y la mortalidad por vía oral, en comparación con la vía

endovenosacomoreferenciay con la vía intragástrica;

56

.1,

Ohjcti <O,s

3- la repercusiónen la infecciónque podríatenerla inoculaciónoral con una única

dosiso con dosisrepetidasduranteun cierto períodode tiempo;

4- la existenciade diferenciasen la infecciónpor vía oral con los dos serotiposmás

frecuentesen los brotesde listeriosis (4b y l/2a).

5?

3. MATERIAL Y METODOS

Material y nétodos

3.1- MATERIAL

Para la realizacióndel presentetrabajo utilizamos el material generalpropio de un

laboratoriode microbiología,esdecir, placasde petri, tubos de ensayode distintostamaños,

tubos estériles de polipropileno, matraces,mecheros,asasde platino, gradillas, pipetas

ordinariasde distintasmedidas,pipetasPasteur,pipetasautomáticasdosificadorasde volumen

variable (de (1 a 1 mí, y de 0 a 200 pl) con sus puntasdeshechablesrespectivas,frascosde

vidrio, probetas,filtros estérilesde 22 pm de un solo uso, etc. Asimismo, hemosutilizado

jeringasestérilesde 1 ce (insulina)con sus agujasparalas inoculacionesendovenosas.

En cuanto a los aparatos empleados,también han sido los de uso rutinario en un

laboratoriode microbiología,comoautoclaves,estufasde incubación,cámarade refrigeración,

arconescongeladoresde -20 y -800C, centrífugas,baños-maría,balanzas,microscopioóptico,

agitadores-calentadoresmagnéticos,etc.Entretodosellos,debemosresaltarel usode una lupa

estereoscópicaWild 376788, básicaa la hora de reconocerlas presumiblescolonias de

listerias, así como el de un homogeneizadorStomacherLUL Tipo 0480 que nos facilitó la

labor de homogeneizaciónde las muestras.

3.11- MEDIOS DE CULTIVO

- Caldo para la obtención del inóculo

Brain Heart Infusion (BW) (Difeo) 37 g

Agua destilada 1000 ml

Una vez disuelto el medio se separanunos 100 ml a otro matraz,y seesterilizana

1210C 15 minutosambosmatraces.

- BHI Agar (medio de recuento)

BHI (Difeo) 37 g

Aga 15 g

Agua destilada 1000 ml

59

Material y métodos

Se disuelvenperfectamentetanto el BRI corno el agar en el agua y seesterilizan a

1210C 15 minutos.Trasla esterilizaciónsedejaenfriarel medio hastaunos 45-500C

y sedistribuye en placasde petri.

- Listeria SelectiveAgar Medium modifled (LSAMm)

BHI (Difco) 37 g

Cloruro de litio 15 g

Esculina 0,75 g

Citrato amónico-férrico 0,5 g

Acriflavina 5 mg

Polimixina 10 mg

Ceftazidima 20 mg

Telurito potásico 40 mg

Agar 15 g

Agua destilada 1000ml

En 90<) ml de agua se disuelvenlas cantidadesindicadasde BRI, cloruro de litio,

esculina,acriflavina y agar; mientras que en los 100 ml restantesse disuelveel citrato

amónico-férricoen otro matraz.Estosmatracesseesterilizana 1210Cdurante15 minutos,tras

lo cual sedejanenfriarhastaunos500C, semezclany seañadenlos restantescomponentes.

A continuaciónseprocedea su distribuciónen placasde petri.

3.111-SOLUCIONES

- Solución salina

Cloruro sódico 9 g

Agua destilada 1000 ml

- Solución de polimixina

Sulfato de Polimixina B (Sigma) 1 g

60

Material y métodos

Agua destilada 100 ml

De estasolución seañaden1 mIlL de LSAMm.

- Solución de ceftazidima

Ceftazidima sódica pentahidratada (Glaxo) 2 g

Agua destilada 100 ml

Para preparar1 L de LSAMm sele añaden1 ml de estapreparación.

- Solución de telurito potásico

Telurito potásico 4 g

Agua destilada 100 ml

Se utilizaba 1 ml para preparar 1 L de LSAMm.

- Solución tamponada de formalina

Formol 37-40% (Panreac) 10<) ml

Fosfato sódico dibásico anhidro (Merck) 0.8 g

Fosfato disódico anhidro (Fluka) 1,3 g

Agua destilada 900 ml

- Solución de gelatina-alumbre

Solución A: Gelatina (Panreac) 2,25 g

Agua destilada 50<) ml

Solución B: Timol (Merck) un cristal

Detergente (Mistol) dos gotas

Alumbre crómico ¡ KCr(504t. 1 2H20]

61

Material y métodos

(Merck) 0,733 g

Agua destilada 19,3 ml

Se preparala solución A a 55-600C y, una vez disuelta la gelatina, se añadela

soluciónB.

- Solución de Hematoxilina de Mayer

Hematoxilina (Merck) 1 g

Agua destilada 1000 ml

Yodato sódico(Merck) 0,2 g

Alumbre potásico[(S04)2KAl.1 2H20] (Merck) 50 g

Acido cítrico (C. Erba) 1 g

Hidrato de cloral (C. Erba) 50 g

Disolver el alumbre en el agua,añadir y disolver la hematoxilina.A continuación

añadir el yodato sódico, el ácido cítrico y el hidrato de cloral y agitar hastasu total

disolución.La soluciónresultantepresentaunacoloraciónrojo-violeta,y semantieneestable

durantevarios mese.Es importanteseguirel ordendado en su elaboración.

- Solución de eosinaal 1%

Eosinaamarillenta 1 g

Agua destilada 100 ml

Acido acético 2-3 gotas

3.1V- CEPAS

Para la realizacióndel presente trabajo hemosutilizado, básicamente,una cepa de L.

monacytagenesde origen clínico denominadaP-14B,pertenecienteal serovar4b. Estacepa

fue aisladaa partir de un enfermode listeriosis duranteun pequeñobrote humanoocurrido

en Valencia en 1989 (Vázquez-Bolandti’ aL, 1991).

62

Matecial y i~tétodos

Para los estudiosde patogenicidadcomparadase utilizó, además,la cepatipo de L.

nwnocyi’ogenes 1/2a NCTC 7973.

3.V- ANIMALES DE EXPERIMENTACION

Los animales utilizados para la presenteexperiencia fueron ratones de tipo Swiss de

la estirpeCD- 1, criadosen nuestrolaboratorio.Las edadesde estosanimalesoscilaronentre

las 10 y las 12 semanasal inicio de cada experimento, lo que significa un pesoaproximado

entre 20 y 25 gramos/ratón.

3.VI- ALIMENTO Y AGUA DE BEBIDA

3.VI.a- RATONES NORMALES

El pienso empleado para la alimentación de los animales normales fue un pienso

comercialelaboradopor la casaInterfaunaIbérica S.A., cuyacomposición,facilitada por el

fabricantees:

Cenizas 58 g/Kg

Grasa bruta 21 »

Proteínabruta 145 »

Fibra bruta 50 »

Carbohidratos 59 »

Energíadigestibleen MJ/Kg 123

En cuantoa las cantidadesde selenioy vitamina E. éstasfueron de 0,09 mg/g y de

9<) UIJKg respectivamente.

El aguaempleadaparaestosratonesfue aguacorriente.

3.VI.b- RATONES DEFICIENTES EN SELENIO Y VITAMINA E

El piensoutilizado paraobtenerratonesdeficientesen selenioy vitamina E fue un

63

Malerial y métodos

pienso especialsuministradopor PanlabS.L., con menosde 0,03 mg/Kg de selenioy no más

de 8 mg/Kg de vitaminaE.

El aguaempleadaparaestosanimalesfue aguaultrapura (MilliQ) suplementadacon

cloruro sódico(2,8 g/]) y glucosa(5 g/l).

Para saberel tiempo necesariopara obtener animales deficientesserealizaron análisis

de selenioen hígado durantevarias semanas.De esta manera,observamosque tras seis

semanas con esta dieta las concentraciones de selenio én este órgano eran muy inferiores a

la de los animalescontrol, sin que se observaransíntomaalguno de la deficiencia, ni se

pudieraobservaralteraciónhistológicaalguna.Tambiénserealizaroncontrolesconsistentes

en compararel tiempo necesarioparaqueseprodujerahemólisis evidenteen una muestrade

sangre.Estetiempo fue siemprede 48-72horasmenosen los deficientesque en los controles

utilizados.

3.VII- OBTENCION DEL INOCULO

La cepa utilizada era sembrada en BHI Agar y se incubaba a Y/0C durante 18-24

horas,tras estaincubaciónse comprobabala purezadel crecimientomedianteobservación

macroscópicay tinción de Gram. A continuación,seinoculabaun matrazcon 100ml de BHI

que se incubabaen agitaciónorbital otras 18-24horasa 370C.

Estematrazera utilizado parainocularotro con 9<30 ml de BHI, despuésde comprobar

medianteuna tinción de Gram su pureza.También este matraz se incubabaa 370C en

agitaciónorbital durante18 horas.Transcurridoestetiempo se centrifugabaa 10000 g. De

estamanerapretendíamosobtenerlas bacterias,por lo que despreciábamosel sobrenadante.

El sedimentoeraresuspendidoen soluciónsalinaestérily nuevamentecentrifugadoa lOOOOg

paraeliminar todo el medio.

Nuevamentedespreciábamosel sobrenadanteconservandoel sedimento,que era

resuspendidoen 80 ml de solución salinaestéril. Una vez resuspendidoel sedimentoera

alicuotado en tubos estériles de polipropileno (2 ml/tubo) y almacenado en congelación a -

800C hastael momentode serutilizado.

64

1

rg 9~o

~ci

EN

Ococ\J

4?

<-5clE

NO

a

<~

,~

EI~

O)oo

LO

(tOr

(~x

..JC\1

1

oe’E

NO

o,1

oo’o

1-

a,0c2

a)0

6oNoO

1-

-EoooO-o0ÑO

1-Ea)oE

Material y actodOs

Antesde su congelaciónserealizó un recuentode las bacteriasasí obtenidas,paralo

cual serealizabandiluciones decimalesde la suspensiónde bacterias~,~sembtandose100 iaL

de las que seestimabanadecuadasen BRI Agar. Estosrecuentosdieron siempreun resultado

muy similar, que osciló entre lxlO’0 y i3xlO~0 UFC/ml. Paraasegurarnosque la congelación

a -800C no afectabade forma importantea nuestrasbacterias,realizamoslos recuentos

despuésde la congelaciónsiguiendo la misma metodologíaya reseñada.Los resultados

obtenidosno variaronsustancialmentede los obtenidosantesde la congelación.

De forma esquemáticapuede verse el proceso en la figura 6.

3.VIII- INOCULACIONES

3.VIII,a- INOCULACIONES ENDOVENOSAS

Dos díasantesde la inoculaciónse descongelabaun tubo de inóculo y se realizabaun

recuentodel númerode bacterias/mí,mediantedilucionesdecimalesy siembrade 10<) pl en

BHI Agar. De estaforma podíamossaberel númerode bacteriasque habíaen los tubos

congelados, y preparar el inóculo cada vez con la dosis lo más exacta posible.

El día de la inoculación se descongelabael númerode tubos necesariossegúnel

recuentorealizadocon anterioridad,y se hacíanlas diluciones necesariasparaobtenerlas

dosisrequeridascon gran exactitud.

Para poder inocular las concentracionesrequeridas se inocularon 100 pL de una

suspensióncon una concentraciónde bacterias10 vecesmayor a la requeridaen la vena

dorsaldel apéndicecaudal de los ratones(figura 7).

Porotra, paite, los ratonescuya inoculaciónno fue perfectafueron desechados,lo que

aumentala fiabilidad del experimento.

3.VIII.b- INOCULACIONES ORALES

Tambiénen este caso se descongelabaun tubo de inóculo vados días antes de la

66

Material y métodos

inoculación,parapoderhacerun recuentodel númerode bacteriaspor ml existentesen el

inóculo. La metodologíaempleadafue la misma que la expuestaen el apartadoanteriorde

inoculacionesendovenosas,esdecir, mediantedilucionesdecimalesy siembrade 100 pl en

BHI Agar.

El día de la inoculación sedescongelabael número de tubos necesariosy sepreparaba

la cantidad necesariade inóculo, administrándosecomo agua de bebida. El inóculo se

mantuvoduranteunanoche,tiempo tras el cual secambiabanlos biberones,siemprevacíos,

porlos deaguanormal.En los casosde inoculacionesrepetidasdurantevariosdías,el inóculo

era renovadodiariamente(figura 8).

Para calcular la cantidad de inóculo por ratón y día medimos la cantidad de agua

bebida por un ratón durante vados días en distintas épocasdel año, según nuestras

estimacionesesacantidadfue de unos5 ml/ratón y día.

3.IX- SACRIFICIOS Y OBTENCION DE LOS ORGANOS

Los ratonesfueron sacrificadosmedianteinhalación de eter etílico, procediéndose

inmediatamentea la recogidade los órganosa estudiar.Paraello en primer lugarseabríala

piel de la zonaventral desdela unión de las ramasde la mandíbulahastala región inguinal,

a continuaciónseabríala musculaturaabdominalpor la línea blancahastala última costilla.

Una vez abierta la cavidadabdominalseretirabael paqueteintestinal haciaun lado, y, con

ayudade una jeringa de insulinaen ocasionesheparinizada,serecogíahasta1 ml de sangre

de la vena cavainferior (imagen 1). Estasangrenos servíaparacomprobarsi los animales

deficienteslo eran realmenteal compararel tiempo de hemólisisde éstosy los controles.

Con la sangreya recogida,procedíamosa la obtencióndel resto de muestrasen el

siguienteorden.

- Bazo;

- Hígado;

67

o

Figura 7-Inoculaciónintravenosa

(4b).

0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 mJ

5 mI/ratón ‘

Figura 8-Inoculaciónpor vía oral.

Sol, madre lOx dilución

deseada

0.1 ml

Sol, madre Diluciónc~’ deseada‘4~~•~

5 ratones/grupo

de muestras.

Figura 10- Cálculode la OLSO por vía

intravenosa (4b).D= de fici enles

bazohígadoa mesenlérteosp. digestivog, submandibularorofaríngeesófagoencéfalo

9- Sacrificio yFiguratoma

lo

lo

DOSIS7

lo6,5

6

5,5lo

5

lo4,5lo4lo a,s

lo3

lo

102.5

E

Material y métodos

- Ganglio mesentérico;

- Aparatodigestivo: en primer lugarse cortabaa la altura de la ampollarectal y del

cardias,extrayendotodo eí estómagoe intestinoconjuntamentea unaplacade petri

estéril, y, a continuación,serecogíacadamuestrade forma independiente.

1- estómago;

2- intestinodelgado,que eracortadoen trozosmáspequeñosparafacilitar su

homogeneización;

3-intestino grueso,al igual que el delgado,también se cortó en trozos mas

pequeños.

- Gangliosubmandibular,conjuntamentecon las glándulassalivaressituadasen esa

región.

- Región orofaríngea:para recogeresta zonacortábamoslos músculosde la zona

inferiordel cuelloa la alturade susinsercionesen las ramasmandibulares,extrayendo

la lenguahastallegar a la faringe. De estaforma se pretendíatomar unaporción de

las formacioneslinfoides del anillo orofaringeo.

- Esófago.

3.X- CALCULO DE LA DOSIS LETAL 5<> (DL50) POR VíA ENDOVENOSA

Paraestecálculoseinocularon,porvíaendovenosa,diez. lotes de 5 ratonesdeticientes

y 5 no deficientescadauno, con distintas dosis.Las dosisempleadasfueron: l0~, 106.5, 106,

~ lOt ~ 10~, ~ í<V y 1025 UFC/ml (figura 10).

Estoslotes fueron observadosdurante10 días,anotándoseen cadamomentoel número

de muertospor dosis.En los animalesmuertosseprocedióa realizaraislamientode listerias

a partir del hígado,bazoy encéfalo,ya que sólo considerábamoscomomuertospor listeriosís

>71

Material y métodos

aquellosen los que seconsiguióaislamientode algunode éstosórganos.

La extracción de los órganos se realizó tal como se explica en el apartado

correspondiente.

Los órganos una vez extraídoseran introducidos en bolsas de homogeneización

estériles.Estasbolsashabíansido pesadaspreviamente,con lo que con una nuevapesaday

medianteuna sencilla operaciónaritméticapodíamosconocerel pesodel órgano. Una vez

pesadose homogeneizabaen un Homogeneizadortipo Stomacher,y se diluían los órganos

al 1:10 (p:v) en soluciónsalinaestéril. A partir de estaprimeradiluciónserealizabannuevas

diluciones decimalesy se sembraban100 microlitros en placasde LSAMm que eran

incubadasa 370C durante48 horasantesde procederal recuentode las colonias.De esta

sencillamanerapodíamosconocerla cantidadde listeriasexistentesen un gramodel órgano

en cuestión.

Utilizamoscomo medio de aislamientoLSAMm, ya que al existir la posibilidadde

tenerquerealizaraislamientosa partir de animalesmuertosla probabilidadde quecrecieran

bacteriascontaminanteserabastantealtasi utilizábamosmediosgenerales.Porotraparte,esto

tambiénevitó el crecimientode bacteriascontaminantesen los cultivos a partir de intestino.

Unavez conocidoel númerode animalesmuertospor dosisseprocedióal cálculo de

la DL5O, esdecir, aquelladosis en la que moriríanel 50% de los animalesinoculados.Para

estecálculoutilizamosel métodode Karber (Schmidt y Emmons,1989). Estemétodoutiliza

la siguientefórmula:

<I.og de la dilución más aila utilizada)-

suíía del ‘4 dc. mortalidad

en cada diiución iog del faclor

0.5 ) x ( óe dilución 1loo

3.XI- ESTUDIOS DE MORTALIDAD POR VíA ORAL CON DOSIS UNICA

Paraestosestudiosseinoculabancuatrogruposde 48 ratonescon las dosisa estudiar,

22

Matehal y ¿lodos

100 y ío~ UEC/ml, incluyendodos grupo/dosis,uno de deficientesy otro no deficiente.Una

vez inoculadosse les dabasu piensoy aguacorrespondiente,y se les observabadurante10

días.Con los muertosseprocediótal y comoserefleja en el apartadoanterior (figura II).

3.XII- ESTUDIO DE MORTALIDAD POR VIA ORAL CON DOSIS REPETIDAS

En estecaso seutilizaron seis gruposde 48 ratonescadauno, de los cualestres eran

de deficientesy los otros tresde no deficientes,que fueron inoculadosde la siguientemanera

(figura 12):

lote 1- ut UFC/ml 4 días;

lote 2- ío9 UF~/ml 7 días; y,

lote 3- ío~ UFC/ml 10 días.

En todos los casosel inóculo era preparadodiariamente,de tal maneraque en los

bebederossólo seponíala cantidadnecesariaparaun día

El estudioseprolongó durantediez días desdela última toma del inóculo. Sólo se

tomaronen consideraciónaquellosratonesmuertosque dieron un cultivo positivo a partir de

hígado.

3.XIII- SEGUIMIENTO DE LA INFECCION POR VIA ENDOVENOSA

Con estosexperimentosse pretendíaconocerla dinámicade la infección en los dos

tipos de ratones(deficientesen selenioy vitamina E y no deficientes)ante una infección

experimental.Paraello se inocularonlotes de 24 ratonesde cadatipo con las DL50 de cada

tipo (l0~~ y ío~~ UFC/ml respectivamente).Tras la inoculaciónsesacrificaronlos ratonesa

los siguientestiempospost-inoculación:30 minutos, 12 y 24 horas,y 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y

1<) días (figura 13). El númerode ratonessacrificadoen cadatandafue de dos,de los cuales

se realizaroncultivos a partir de hígadoy bazo.

Los órganoseranextraídosde forma aséptica,e introducidos en bolsasde plástico

estérilesquehabíansido pesadaspreviamente.De nuevosepesabanlas bolsas,ahoracon el

73

DOSIS

1O

1O a

Figura 11-Mortalidad por vía

oral con dosis única(4b).

D= ótIicie,~tes

DOSIS YTIEMPO

10 4 días

10 7díasa

10 lOdías

D

48 ratones/grupo

48 ratones/grupo

Figura 12- Mortalidadpor vía oral con dosis

repetidas (4b).D= deficientes

4,5lo 5,5lo30 mm.

12 h24 h2d3d4d5d6d7d8d9d10 d

Figura

D

24 ratones/grupo

13- Seguimientode la infección

por vía endovenosa.0= deficientes.

Material y métodos

órganoen cuestiónen suinterior, y medianteuna simple operaciónaritméticacalculábamos

el pesodel órgano extraído.Una vez conocidoestedatose homogeneizabacon ayudadel

Stomachery sediluía al 1:10(p:v), realizándosesiembrasapartir de dilucionesdecimalesdel

homogeneizado,paraver, no sólo la presenciao no de listerias, sino podercuantificarésta

presencia.

3.XIV- SEGUIMIENTO DE LA iNFECCION POR VIA ORAL

3.XIV.a- SEGUN LA VIA DE INOCULACION EMPLEADA

Paraesteestudioseutilizaronlas vías oral e intragástrica.Parala primeraseprocedió

exactamenteigual acomosehadescritoen la experienciadel seguimientode la infecciónpor

vía oral, esto es, se administró el inóculo con el agua de bebida. En el caso de la vía

intragástricase utilizó una sondade extremoromo paradepositarel inóculo en el estómago.

Como control de la correctainoculaciónse realizaroncultivos de pulmónde los animales

sondados.

El inóculo empleado fue de io~ UFC Lm/ml, en amboscasos,y las muestrasfueron

recogidasa las 6, 12, 24 h, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 díaspost-inoculación.Estasmuestras

fueron hígado, bazo, ganglios mandibular y mesentérico, región orofaríngea,esófago,

estómago,intestinodelgadoy grueso.

El número de ratones fue de 44 animalespor grupo, no se emplearonanimales

deficientes (figura 14). En cada momento se sacrificaron 4 animales/grupomediante

inhalación de eter etílico, de los cuales2 se destinaronal estudio microbiológico y 2 al

estudiohistopatológico.

IXIV.h- SEGUN LA CEPA EMPLEADA

En estecasoseinocularondos cepasdeL. monocysogenes(P-14B y l/2a)porvía oral

únicamente.Como en los casosanterioresla inoculación se realizó medianteel aguade

bebida,y la dosisinoculadafue de iO~ UFC/ml (figura 15).

76

9

10

6h1224k oral2d3d4dBd3d7d3d9dlo d

Figura 14-Comparación de lainfección por las

vías oral eintragástrica (112a).

o10

6h1224k 4b2d3d4d5dCd 44 ratones/grupo7d3d9d 1/2a10 d

Figura 15-Comparación de lainfección con los

servares 112a y 4b.

44 ratones/grupo

Mater4al y métodos

Seutilizaron44 ratones/cepa,tampocoen estecasoseemplearonanimalesdeficientes.

Tanto los tiempospost-inoculacióna los que sesacrificaron,como el métodode sacrificio,

como las muestrasrecogidasfueron los mismosque en el caso antenor.

3.XIV.c- SEGUNDOSIFICACION: UNICA O REPETIDA

Para estaexperienciase emplearondos lotes de 48 animalesdivididos en cuatro

gruposde 24 ratones,dos de deficientesy dos de controles.Los cuatrogruposbebieronun

inóculo de IO~ UFCImI, pero mientrasqueel lote 1 lo hizo únicamenteduranteun día,el lote

2 lo hizo durante7 días.Los tiempos a los que seprocedióal sacrificiode animalesfueron

1, 3, 6,11 y 16 días desdela última inoculación(figura 16).

Se sacrificaron5 animalescadavez, aexcepciónde la última en que se sacrificaron

4. De los 5 animales3 fueronmuestreadosparamicrobiologíay 2 parahistología,mientras

queen el último sacrificiosólo se muestrearon2 paramicrobiologíamanteniéndoselos otros

2 parahistología.Las muestrastomadasy su procesamientofue el mismo que en los casos

anteriores.

3.XV- SEGUIMIENTO DE LA INFECCION POR VIA ORAL EN RATONES

DEFICIENTES/NO DEFICIENTES

3.XV.a- ESTUDIO DE LA INFECCION POR VIA ORAL CON DOSIS UNICA

En estecaso empleamosdos grupos de 54 ratones,uno de deficientesy otro de

control, que bebieronun inóculo de l0~ UFC/ml duranteun día. Los sacrificiosserealizaron

a los siguientestiempos post-inoculación:30 mm, 6, 12 y 24 h, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11

y 16 días (figura 17).

Se sacrificaroncuatroanimalesporgrupocadavez,de éstosdos fueronutilizadospara

microbiología y los dos restantespara histopatologiae inmunohistoquimica.El muestreo

realizadofue más amplio que en el caso anterior, tomándosemuestrasde bazo, hígado,

gangliomesentérico,gangliosmandibulares,región orofaríngea,esófago,estómago,intestino

delgadoe intestino grueso.

78

II

9

lo idía9

10 7 días

Días desdela última toma

ola infección

según el tiempode bebida del

inóculo.

1361116

24 ratones/grupo

Figura 16-C mparación de

D= deficientes

10 54 ratones/grupo

30 mmCh

24h N2d D3d4dCdCd7dAd9d

10 dlid Figura 17- SeguimientolSd de la infecciónpor vía

oral con dosisúnica(4b).

0= deficieíítes

o

10 7d~as

1Días desde

6 ¡a úhíma toma1116

Figura 18-Seguimiento dela infección por

vía oral condosis repetidas

(4b).0= def¡ceííles

24 ratones/grupo

Maledal y métodos

Una vezrecogidaslas muestrasfueronprocesadasde la misma maneraqueen el caso

anterior.

3.XV.b- SEGUIMIENTO DE LA INFECCION POR VíA ORAL CON DOSIS

REPETIDAS

La mecánica seguida para esta experiencia fue similar a la empleadapara el

seguimientocon dosisúnica.Seutilizaron dosgruposde ratones,uno de ratonesdeficientes

y otro de no deficientes,de 24 animalescadauno. Cada grupo recibió un inóculo de l0~

UFC/ml durante7 días.

Los tiempos de sacrificios fueron 1, 3, 6, 11, 16 díascontadosdesdela última toma

de inóculo (figura 18). Se sacrificaron5 animalesde cadagrupocadavez, tres de los cuales

semuestrearonparamicrobiologíay los dos restantesparahistopatologia.

Las muestrasrecogidasy su procesamientofue idéntico al realizadocon dosisúnica.

3.XVI- ESTUDIO HISTOPATOLOGICO

3.XVI.a- PREPARACION DE LAS MUESTRAS

Paralelamenteal estudio microbiológico serealizó un estudio histopatológico de las

muestras. Para lo cual los órganos destinados a este efecto eran fijados en formalina

tamponada.

A continuación,los órganosfuerontalladosparaorientardefinitivamentesu superficie

de corte.Paralo cual, seobtuvieronbloquesde tejidos de 0,5 cm de espesormediantehojas

de bisturí. Tras el tallado de las muestrasse colocaronen cassettesespecialesen las que

pasaron el proceso de inclusión.

Las cassettesconteniendolas muestrasseintrodujeronen un procesadorde tejidospara

su inclusión en parafina.La pautaseguidafue:

81.

Material y métodos

Alcohol etílico 50% 3 h

Alcohol etílico 70% 2 h

Alcohol etílico 80% 1 h

Alcohol etílico 96% 2 h

Alcohol etílico 100% 1 1 h

Alcohol etílico 100% II 1 h

Metil benzoato 30 mm

Benceno1 45 mm

BencenoII 30 mm

Parafina1 2 h

Parafina11 4 h

ParafinaIII 1 h

El pasofinal de la inclusión consistió en la formación de bloquesagrupandolas

muestí~asy orientándolaspara obtenerlos mejorescortes. Este procesose realizó en una

unidad formadorade bloquesmedianteel empleo de moldes metálicosconteniendolas

muestrasya orientadasen parafinalíquida a 600C (parafina III) y que se depositaronsobre

una placa fría sobrela que la parafina solidifica rápidamente.El molde se separó y los

bloquesde tejidos pasarona ser procesadosen el microtomo.

Antes de efectuarlos corteshistológicoslos portasfueron tratadoscon una solución

de gelatina-alumbreparaevitarel desprendimientode la muestradurantela realizaciónde las

técnicasinmunohistológicas.Paraello:

1- se sumergieronlos portaobjetosen NaOH lN (solución acuosaal 4%)

duranteuna nochea 600C;

2- a continuaciónselavaronen aguacorriente15 minutos;

3- sesumergieronen ClH lN 5 minutos;

4- volvieron a serlavadosen aguacorriente 15 minutos;

5- se introdujeron en la solución de gelatina-alumbrea 600C durante 15

minutos; y,

6- sesecarony dejarona cubierto.

82

III

Material y métodos

Los bloques fueron cortados en un microtomo de rotación y cuchillas de acero

desechables(Biocut 3100). Se obtuvieroncortesde 3 pm de grosorque fueron depositados

en un bañode aguacaliente(370C)que permitierala dilataciónde la parafinahastaalcanzar

la superficieque teníaen el bloque.Estoscortesse recogieronen portastratadoscon gelatina-

alumbre,y sedejaronsecaruna nochea 370C.

3.XVI.b- ESTUDIO HISTOLOGICO

La valoración de las lesiones en las muestrasse realizó con el método de la

hematoxilina-cosinasegúnel siguienteprotocolo:

1- desparafinare hidratar;

2- tinción con la soluciónde hematoxilina2-10 minutos;

3- lavadoen aguacorriente20 minutos;

4- tinción con la soluciónde eosina1 minuto;

5- alcohol de 96’ 1 minuto;

6- deshidratarcon un cambio rápidoen alcoholde 960, y dos de 5 minutosen

alcohol absoluto;

7- aclararen xileno, doscambiosde 5 minutos; y,

8- montaren Eukitt.

Con esta técnicase consiguenobservar las membranascon un color azul, y los

citoplasmasen tonos de rosa

3.XVII- DETERMINACION DE LA CONCENTRACIONDE SELENIO

Las determinacionesde las concentracionesde selenio,tantoen los ratonesdeficientes

comoen los controles,serealizaronen muestrasde hígadotomadasal azara distintostiempos

de sacrificios. La concentraciónde selenio fue cuantificada por espectrofotometríade

absorciónatómicaporgeneraciónde hidruros,trasunadigestióncompletade las muestrasen

reactor a presión en horno microondas.Estos análisis fueron realizaron por ITSEMAP

SEGURIDAD AMBIENTAL S.A. en sus laboratorios.

83

Malerial y rn6iodos

3.XVIII- VALORACION DE LA DEFICIENCIA EN SELENIO EN FUNCION DEL

GRADO DE HEMOLISIS

La deficienciaen selenioprovoca una mayor fragilidad en las membranasde los

eritrocitos,lo que se traduceen una mayor facilidad parasu ruptura(Koller y Exon, 1986;

Boyney Arthur, 1990;Bedwal et al. 1993).Segúnesto, la sangrede animalesdeficientesse

hemolizaráantesque la de animalesno deficientes.Conesto ideamosun sistemaparavalorar

la existenciade deficienciasegúnel gradode hemólisisobtenidodurantelos 4 primerosdías

desdesu obtención,tal y como puedeapreciarseen la tabla 6. Paralo cual seextrajo sangre

de la venacavainferior de los ratones,con ayudade una jeringade insulina heparinizada,y

se introdujo en tubos que se mantuvierona 40C durante4 días,observándoloscadadía.

3.XIX- ESTUDIO ESTADíSTICO

Se realizó un estudio de significaciónestadísticade los resultadosobtenidoscon

animalesdeficientesy no deficientes,para lo cuál se realizó un análisis multivariantede

medidasrepetidascon el programaestadísticoSAS.

84

Días 1 2 3 4

Deficientes + ++/±±± +++/±+++

No deficientes + ++

ausencia toia~ de heinólisis

+ hemólisis débil

++ ligera henótisis

I-+± hen,óiisis evidente

++++ hemólisis total

Tabla6- Valoración de la deficienciaen selenioen función del gradode hemólisis,

4. RESULTADOS Y DISCUSION

Resultados y discusión

4.1- VALORACION DE LAS CONCENTRACIONES DE SELENIO EN HíGADO

Para valorar la posible deficiencia en selenio se realizó la determinaciónde su

concentraciónen el hígado de los ratones muestreadosmedianteespectofotometríade

absorciónatómica.Se utilizó la determinaciónen hígadoporqueconsideramosquelos valores

hepáticosde selenioson másestablesque los séricos,no estandosometidosa fluctuaciones

dependientesdel estadode hidratacióno ingesta.Los resultadosde estasdeterminaciones

puedenverseen la tabla7. En ella sepuedeapreciarcómo estosvalorestuvieronun máximo

de 3,93 mg/Kg, un mínimo de 0,94 mg/Kg con una mediade 2,151 mg/Kg paralos grupos

control; y 0,606,menosde 0,015 y 0,192 mg/Kg respectivamenteparalos alimentadoscon

la dieta deficiente.

La mayoríade los autoresconsultadosutilizan comovalor de referenciade seleniosu

concentraciónen suero,lo que permitela repeticióndel muestreo.Sin embargo,Blood ci al.

(1986) señalaunosvaloresde selenioen hígadoparael ganadovacunode 0,9 a 1,75 mg/Kg

en el caso de animalesnormales(animalescon cantidadesfisiológicasde selenio),y de 0,07

a 0,6 mg/Kg en el caso de animales deficientes.Estos intervalos concuerdancon los

resultadosobtenidospor otros autores(JelinekeS aL, 1988; ZacharaeS al., 1993)que han

llevadoa cabosusexperimentosen la especieovina.Estosautoresencuentranvaloresde 1,06

mg/Kg en el casode los animalescontrol y de 0,12 mg/Kg en los deficientes,en el casodel

primero; y de 0,9 a 1,2 mg/Kg y, aproximadamente,0,2 mg/Kg respectivamenteen el caso

de los deficientes,en el caso del segundoautor citado.

Porel contrario,los resultadosexpuestospor autoresquehan estudiadolos efectosde

la deficienciaen selenioen cerdos(Van Vleet eSal?, 1981; TeigeeSal., 1984) no concuerdan

con los descritospor los autoresanteriores.Probablementeello sedebaal uso de unaespecie

animal distinta. El primer autor encontróvalores de 0,15 mg/Kg en el hígado de cerdos

mantenidoscon un piensonormal; por su parte,el segundoencontróvaloreshepáticosde 0,05

mg/Kg en el casode animalesdeficientes.

A pesarde las diferenciasexpuestas,se puedeobservarque las concentracionesde

selenio en hígadoen los asiimalesdeficientesen estenutriente,independientementede la

especieutilizada, seencuentraentreel 10 y el 15% de la concentraciónhalladaen los hígados

87

¡ Concentracioneshepáticasde selenio(mgfKg)

Deficientes No deficientes

Máximo 0,606 3,93

Mínimo <0,015 0,94

Media 0,192 2,151

Tabla 7- Concentracioneshepáticasdetectadaspor espectofotometríade absorción atómica (ITSEMAPAMBIENTAL SA.)

.1.

Resultados y discusion

de los animalesutilizados como control, no superandoestos niveles en ningún caso. En

nuestrosexperimentosse obtienenproporcionessimilares,puestoque las concentracionesde

selenioen hígadoen el casode los animalesalimentadoscon la dietadeficientees,en todos

los casos,inferior al 10% de las concentracionesobtenidasen los controles.Porestemotivo

creemosquesepuedenconsiderarcomo deficientesen selenioa los animalesmantenidoscon

la dieta deficiente en selenioy vitamina E siguiendola pautaestablecida.

Estosvaloresseobtuvieronde maneraconstantetras 6 semanasde alimentacióncon

dieta deficiente en selenioy vitamina E, momentoen el que se dabainicio a los distintos

experimentos.A modo de valoracióncualitativa, y de fácil realización,establecimosuna

relaciónentrela concentraciónde selenioenel sueroy la rapidezcon quesehemolizabanlos

hematíes,tal y comosedescribeenel apartado3.XVIII.

Con estaspremisasseestablecióla duracióndel aportemínimo de pienso deficiente

en selenio-vitaminaE paraobtenerde forma seguraratonesdeficientesen seis semanas,lo

que seconfirmó cualitativamente(hemólisis) y cuantitativamente(determinaciónmediante

espectofotometríade absorción atómica) en cada experimento.El aporte de esta dieta

deficientecontinuódurantecadaexperimentosin queseprodujeranvariacionessignificativas

respectoa los valoresobtenidostras las 6 primerassemanas,por lo que podemosconsiderar

quela tasade seleniose mantuvoprácticamenteuniformea lo largo de todo el estudio.

Es importanteseñalarque la valoración histológica no reveló ninguna alteración

muscular,ni en músculoesqueléticoni en miocardio,como tampocoen ningúnotro tejido de

los animalesdeficientes.No seapreciaron,en consecuencia,diferenciasentrelos deficientes

y no deficientesa estenivel.

En definitiva, los animales sometidos a dieta deficiente en selenio-vitaminaE

presentaronuna deficienciade seleniode tipo subelínico,únicamentedetectablemediante

valoracióninstrumentalespecífica,y que, por tanto, puedecalificarsecomo microdeficiencía.

90

Resultadosy discusión

4.11- ESTUDIOS DE MORTALIDAD

4.ILa- DL50 VtA ENDOVENOSA

Los resultados obtenidos se muestranen la tabla 8. Como puede apreciarsela

mortalidadpor vía endovenosaentrelos animalesdeficientesesmayorque en el caso de los

controles.En estosúltimos esnecesarioalcanzardosisde ío~~ parapoderllegar a observar

algún muerto (40%); sin embargo,a partir de esa dosis se alcanzacon cierta rapidezuna

mortalidaddel 100% (106.5). Porsu parte,en los deficientesseobservamortalidaddesdedosis

relativamentebajas(10~~).

Con los datosrecogidos,y aplicandoel métodode K~irber (Schmidty Emmons.1989).

podemoscalcular una DL50 para los animales deficientesde ~ y de 105.65 para los

controles.EstaDL50, enel casode los controles,no difiere de la encontradaporotros autores

(Vázquez-Bolandy Berche,resultadosno publicados)paraestamisma cepade Listeria y de

ratones,por lo que la consideramosuna buenareferencia.

Los resultadosobtenidosestablecenuna diferenciaentrela DL50 paradeficientesy

no deficientesde cercade un logaritmo,lo queconsideramossuficienteen cuantoaestablecer

un criterio de mayoro menorsusceptibilidadpor estavía entreambosgrupos.

Las DL50 obtenidasparacadagrupo se usaronparalos estudiosde seguimientode la

infecciónpor vía endovenosa.

4.II.b- MORTALIDAD POR VtA ORAL CON DOSIS UNICA

Los resultadosde esteexperimentosepuedenobservaren la tabla9a. Enella se puede

apreciar cómo la mayor mortalidad se produce con la dosis de 1010 Lm/ml, tanto en

deficientescomo en no deficientes(56,25y 18,75%respectivamente),mientrasque cuando

se utiliza una dosis de io~ Lm/ml las mortalidadesdesciendenentre un 59,25% en los

deficientes(22,92%) y un 66,7% en los no deficientes(6,25%). La influenciade la dosis

sobrela mortalidades menor en el caso de los animalesdeficientesque en el de los no

deficientes,debidoa queen los primeroslos mecanismosresponsablesde la respuestainmune

91

Dosis/ratón N0 ratones N0 muertos % muertos

102.5

Deficientes 5 0 0

Controles 5 0 0

10~Deficientes 5 0 0

Controles 5 0 0

lo”Deficientes 5 1 20

Controles 5 0 0

ío’Deficientes 5 0 0

Controles 5 0 0

Deficientes 5 3 60

Controles 5 0 0

Deficientes 5 2 40

Controles 5 0 0

Deficientes 5 4 80

Controles 5 2 40

106Deficientes 5 5 100

Controles 5 4 80

106.5Deficientes 5 5 100

Controles 5 5 100

10’Deficientes 5 5 100

Controles 5 5 100

Deficientes:7-{ [(500/I00)~0,5]x0,51= 4.55 ~ DL5O= l0<’~

Controles: 74 [(320¡100)-05]xO,5}=5,65 ~ OLSO= io~~

Tabla8- Mortalidadesobtenidaspor vía endovenosacon Lm 4b en ratonesdeficientesy no deficientes.

Dosis N0 ratones N0 muertos % muertos

lotoDeficientes 48 27 56.25

Controles 48 9 18,75

í o9Deficientes 48 11 22,92

Controles 48 3 6,25

Tabla9a- Mortalidadpor vía oral con dosisúnicade Lm 4b.

Dosis/T.b. N0 ratones N0 muertos % muertos

l0~ 4 díasDeficientes 48 16 33,33

Controles 48 7 14,58

l0~ 7 díasDeficientes 48 19 39,58

Controles 48 10 20,83

Deficientesío~

10 días Controles

48 12 25

48 8 16,67

Tabla9b- Mortalidadpor vía oral con dosisrepetidasde Lm 4b.

Resultadosy d,scus,on

seencuentranalterados,tal y cómoseexpusoen el apartado1.IiX.d.

En cuantoa las diferenciasentrelastasasdemortafldadobtenidasen deficientesy no

deficientes,tambiénsepuedenapreciardiferenciasimportantesindependientementedeladosis

utilizada. Así, la inoculaciónde dosisde io~ bm/ml suponenunatasade mortalidadinferior

en un 72,7% en los no deficientes(6,25%) con respectoa la obtenidaen los deficientes

(22,92%);y con ío’~ LmIml esareducciónesdel 66,7% (18,75 y 56,25%respectivamente).

Todo ello parece representaruna posible influencia de la deficiencia en selenio en la

susceptibilidada la listeriosis, tal y comosediscutiráen el apanado4.X.

4.H.c- MORTALIDAD POR VIA ORAL CON DOSIS REPETIDAS

Esteexperimentofue enfocadoaestudiarel efectode dosisrepetidasen la mortalidad

por vía oral. Como puedeapreciarseen la tabla 9b, existe una relación directa entre la

mortalidady el númerode repeticionesde una misma dosis.Así, la mayormortalidad,tanto

en deficientescomo en no deficientes,seobtiene dosisde iO~ Lm/ml durante7 días, 39,58

y 20,83%respectivamente.Cuandola misma dosisse administradurante4 días seproduce

una reducciónde la mortalidadhastavaloresde 33,33%en los deficientesy 14,58% en los

no deficientes.El empleode una dosismenor(lOa LmIml) duranteun períodode tiempode

10 días, produce una menor mortalidad en ambos grupos,pero si en los deficientes la

mortalidadpermanecepordebajode la obtenidacon í0~ Lm/ml durante4 y 7 días (25, 33,33

y 39,58%respectivamente),no ocurreigual en el casode los no deficientes,en los que esta

mortalidad es superior a la encontradacon 1(9 Lm/ml durante4 días (16,67 y 14,58%

respectivamente),aunqueestamínimadiferencia(aproximadamente2 logaritmos)no parece

serrelevante.

A nuestrojuicio, estosresultadossugierenla existenciade un efectoacumulativo,en

el sentidode que una dosis de 108 Lm/ml durante10 días producemayor mortalidaden

ambosgruposque una única de ío~ Lm/ml, siendoidénticala dosis total inoculada.Esto es

especialmentemarcadoen el caso de los no deficientes,con mortalidadesde 6,25% (1x109

Lm/ml) y 16,67 (10x108 LmIml), lo que representaun incrementode la mortalidadde un

166,72%.

94

Resultadosy discusión

En el caso de las dosisrepetidasen el tiempo, las diferenciasentredeficientesy no

deficientesdesciendena medidaque aumentael númerode repeticiones,así con 1(9 Lm/ml

durante4 días se obtiene un incremento de la mortalidad de 128,6% en el caso de los

deficientes,si aumentamosa 7 díasel periodode inoculacióneseincrementoesde tan sólo

un 90%, y si utilizamos 108 Lm/ml durante10 días el incrementono superael 50%.

Los estudiosexperimentalessobrelisteriosisque utilizan la inoculaciónpor vía oral

sesirven por lo generalde dosismuy elevadas,del ordende itl’0 ó i09 Lm/ml (Golnazarian

a aL, 1989; Notermansy Chakraborty,1992),en tomasúnicascomopautamás extendida.

Este sistemapermite reproducir, de forma más o menos constante,la infección e incluso

producirlaenfermedadclínica.Nuestrosresultadosconfirmanlaproducciónde laenfermedad

medianteel empleode dosisaltaspor vía oral, pero además,sugierenla posibleexistencia

de un efectoacumulativocon el que seobtienenmortalidadessuperioresutilizando la misma

dosistotal pero fraccionadaen varias tomas.

Estefenómenoacumulativoya ha sido descritopor nuestrogrupo en referenciaa la

respuestaserológicafrente a inoculacionescon L. nwnocytogenespor vía oral a dosis de

incluso í0~ Lm/ml (Lópeza aL, 1992).En esteestudiosedemostróel desarrollode unatasa

detectablede aglutininasmedianteinoculacionesrepetidasde la citadadosis. Estarespuesta

inmunerevelaun contactoentreL. nwnocytogenesy el sistemainmune del hospedador,y, por

tanto, de una ciertadiseminaciónextraintestinal,controladapor el hospedador,en razóndel

bajo númerode L. rnonocytogenesque lo logran.

La posibleexistenciade un efecto acumulativo podría tenerimportancia desdeun

punto de vistaepidemiológicoy experimental.En el primercaso seríarelevanteen cuantoa

que en condicionesnaturalesla infección se producea partir de alimentoscontaminadosen

los que las tasasde L. monocytogenesraramentealcanzanlos valoresempleadosen estudios

experimentales(l0~ ensilado). Sin embargo,un aporte reiteradopodría traducirseen el

desarrollode la enfermedadaunque el número de L. monocvtogenesen el alimento sea

relativamentebaja.En cuantoa las repercusionesen el ámbitoexperimental,podríaplantearse

la necesidadde establecerpautasde inoculaciónen basea aportesdiarios reducidos,pero

prolongadosduranteun periodo de tiempo relativamentelargo.

95

Resultadosy discusion

Podríaespecularsecon la posibilidadde que aportessucesivosde listerias pudieran

ayudara dicho microorganismoa soslayarel efecto competitivo de las restantesbacterias

intestinales.Dehecho,L. monocytogenesha sidodescritacomouna pobrecompetidoraa este

respecto(Zachary Savage,citado por Golnazariana al. 1989; y porMarco et al., 1992b),

e incluso seha comprobadocómoL. nwnocytogenesúnicamenteproducelesionesintestinales

tras un bruscocambiodel ambientegastrointestinal(Ráczcitado por Marco et al.. 1992b).

De igual forma el posible efecto negativo del pH gástrico (Schlech, 1990) podría verse

disminuido en basea aportesrepetidosde L. mrnwcyrogenes.

La influenciareal de estosfactoresdebe,en cualquiercaso,sercontrastadamediante

nuevosestudiosencaminadosespecíficamentea valorarestoshechos,ya que nuestrosdatos

no sondeterminantesa esterespecto.

Parafinalizaresteapartado,queremoshacerreferenciaal hecho deque en ningunode

los experimentosde dosisúnicalos animalesmostraronmanifestacionesclínicasantesde una

semanapost-inoculación,lo quepareceapoyarla teoríade que,porvía oral, Listeria necesita

un cierto tiempoduranteel cualsemultiplicaríaen epitelio intestinal hastaalcanzarel número

necesarioparaatravesarla barreraintestinal y llegar a sus órganosdianas;esetiempo podría

verseafectadopor la dosis utilizada; así, la apariciónde signosclínicos es anterioren 24

horascon 1010 que con 1(9 Lm/ml, lo que pareceestaren consonanciacon que la infección

por listeriasporvía oral es dosis dependiente(Schlech,1990).

4.111-SEGUIMIENTO DE LA INI~’ECCION POR VIA ENDOVENOSA

4.III.a- DOSIS iO~~

Estadosisfue utilizadaporser la másaproximadaa la DL50 de los ratonesdeficientes

que pudimos obtener, ya que la pauta seguidatan sólo nos permite ajustarnosa medio

logaritmo. En la tabla 10 puedenapreciarselos resultadosobtenidosde los recuentosde L.

rnonocytogenesen hígadoy bazo, tanto en los animalesdeficientescomo en los controles.

Podemosobservarcómo los recuentosen bazo son muy similaresen ambosgrupos

a lo largo de casi todael experimento.En primer lugar seproduceun aumentode los

96

TPI

Deficientes No deficientes

Hígado Bazo Hígado Bazo

30 ni l,12x10’ 2,SSxJO’ tino’ 4,2x10’

12 h 2x102 2,3lxlO’ IxIO’ 4,25x10~

1 d 2,73x10’ 3,45xI0~ 3,07x10’ 323x10’

2 d 7,82x10’ 3,lSxIO’ 1,02x10’

3 d í,57x10’ 7,54x10~ 6x10’ 9,12x10’

4 d 5,SxIO’ 1,97x10~ 21102 8,3x10’

5 d 1,32x10’ l,45x10’ O 5,65x10’

6 d 4,4x10’ S,55x10 0 2,37x10’

7 d o I4x104 O I,65x10’

Sd 0 0 0 0

9d o O 0 0

lOd 0 0 0 0

Tabla 10- Resultadode los recuentosen hígadoy bazotras inoculaciónintravenosacon i0~ Lni

o

oNxm

oO

O~

~e

~C

iCM

—e14

«‘4

\¡/“

¡¡

te¿

ji~

1.KY

-{zbe

¡

.2u

•¡¡m

’I)

¡

OQ

bO

i~-

CCCD

—C

iCM

—

o,

fi~=

oIi

CCoz

7)

LO

A,/4.

7,

>7

,

‘o,

//

1‘o4)o4)ci

Ci

CMo

fioeoe.0EO)

.5eoO)

fioeO)

aO)

ao=O)

fioeO)

O)

O)

fioO)

O)

oII

a

fioO)cio)te

ozCe

‘ocioo)O-

CCO

Resultadosy discusión

recuentoshastael día2 pi, y a partir de esemomentoseproduceun descensoen los mismos

hastadesaparecerel día 8 en amboscasos(gráfica lb).

En líneasgenerales,nuestrosresultadoscoincidencon los expuestospor Goosenset

al. (1988),segúnlos cualeslos recuentosobtenidosa partir del bazo de ratonessusceptibles

y resistentesa la listeriosis eranprácticamenteiguales.Este y otros autorescitadospor él,

opinanque esto se debeaque en el bazono seexpresaunarápidaresistenciaa la listeriosis,

apareciendoéstaa partir del día4; opiniónque parececonfirmarsepor los trabajosde Conlan

y North (1994),en los que se afirmaque los neutrófilosno lisan las célulasinfectadasen el

bazocomo parecenhaceren el hígado,quedandoen esteórganolas listerias a resguardode

las células fagocíticas.Esto coincide con por lo expuestopor otros autores(Archinal y

Wilder, 1988a;Hof y Hefner, 1988;Cossarty Mengaud,1989),quienesafirmanque tras una

inoculaciónintraperitonealo intravenosaseproduceun aumentode los recuentosen bazo

hastael día 3 pi, produciéndosea continuaciónun descensode esosrecuentosque llevan

hastael control de la infección por parte del hospedador.La aparición más lenta de esa

resistenciaparece,asimismo,confirmarseporel hecho de que en nuestrosdos grupos los

recuentosde listeriasen esteárganono comienzaa descenderhastadespuésdel día 2.

En el hígado,el númerode bacteriasaisladasa los 30 minutospi fue mayor en los

controlesqueen los deficientes,a continuaciónseproduceun descensoenel númerode los

recuentosobtenidosen ambos grupos a las 12 horas pi, para a partir de ese momento

aumentarel día 1 pi; esteaumentoes mayoren el caso de los deficientesque en el de los no

deficientes (graf. la). Desde el día 1 pi los recuentoscomienzana descenderhasta

desapareceren los no deficientesel día 5 pi; por su parte,en los deficienteslos recuentos

desciendenlevementehasta producirse un nuevo incrementoel día 6 pi, tras el que

desaparecenel día 7 pi. Estosresultadosson semejantesa los expuestospor otros autores

(Cossarty Mengaud,1989), segúnlos que tras una inoculaciónintravenosaseproduceun

aumentodel númerode listeriasen hígadohastael día 2 6 3 pi, a partir de los queseproduce

una inactivaciónde las bacteriasy la recuperacióndel hospedador.

En los deficientesse observanmayoresrecuentosen hígado, así como un mayor

tiempode permanenciade los microorganismosen éste,probablementedebido a un fallo en

la respuestainmune tal y como discutiremosen el apartadoIX. Por otra parte, esemayor

99

Resultadosy discusion

tiempo de permanenciaaumentalas posibilidadesde generalizacióny de mortalidad,lo que

podría explicar las diferencias de mortalidad observadascon esta dosis, 60 y 0% en

deficientesy no deficientesrespectivamente(tabla 8).

Otropuntoa destacares la disminuciónde listeriasobservadoa las 12 horaspi en los

dosgrupos.Consideramosqueestedescensosedebea la actuaciónde los neutrófilosdurante

las primerashoras de la infección hastala llegadade los macrófagosy linfocitos T, tal y

como apuntanalgunosautores(Conlany North, 1991, 1993, 1994). Estedescensoes más

enérgicoen el casode los animalescontrolesqueen los deficientes,lo cual, probablemente,

seadebidoa una menoreficacia de estascélulasen los últimos a la hora de poderinstaurar

una correctarespuestaala infección.Menoreficaciaquedebemosasumirseadebidaal único

factor quediferenciaambosgrupos,estoes la deficienciaen selenioy vitamina E, tal como

sereflejaen 4.X.

En cuantoal aumentoobservadoen los recuentosa partir de hígadode los animales

deficienteslos días 5 y 6 (gráfica la), y a la luz de los resultadosobtenidoscon la dosis de

1 0~’, y que se exponenen el siguienteapartado,consideramosque podrían debersea una

segundageneralizacióna partir de los focosproducidosen la infección inicial.

En líneas generales,nuestros resultadosen el hígado también parecenestar en

consonanciacon los expuestospor Goosenset al. (1988),quien afirma que los recuentosen

hígado fueron mayoresen el caso de los ratonessensiblesa la listeriosis que en los

resistentes.Además, este autor también señala que en los animales resistentesla

sensibilizaciónde los linfocitos T se produceen un tiempo menorque en los sensibles.La

desapariciónmás rápida de las listerias en los no deficientespodría debersea esta

sensibilizaciónmás tempranade dichoslinfocitos.

Observandolas gráficasla y b, podemosver cómo las listerias tardanmás tiempo en

desaparecerdel bazoque del hígado,observaciónrealizadaasimismopor otros autores(Hof

y Hefner, 1988;Cossarty Mengaud,1989),debidoa unamayorrapidezen el establecimiento

de los mecanismosde defensaen el hígadoque en el bazo(Goosenset al., 1988; Cossarty

Mengaud, 1989), a un mayor tropismo de L. monocytogenespor el bazo (Hof y Hefner,

1988), o a que los neutrófilosno actúan de la misma forma en ambosórganos(Conlan y

1 0(.)

Resultadosy discusión

North, 1994).

Los resultadosestadísticosconfirmanla existenciade diferenciassignificativasen los

recuentosobtenidosa partir de hígadoentrelos deficientesy no deficientes(P<0,05).

4.III.b- DOSIS iO~~

Estadosisseescogióen virtud de ser la másaproximadaa la DL50 calculadaparalos

ratonesno deficientesque podíamosobtenermediantelas pautasutilizadas.La tabla II

muestralos resultadosde los recuentosde L. monocytogenesa partir hígadoy bazo de los

gruposcontrol y deficiente,inoculadoscon estadosis.

Tal y como puedeverse en la citada tabla, a los 30 minutos pi los recuentosson

ligeramentesuperioresen el bazo de los controlesqueen el de los deficientes.Sin embargo,

a partir de esemomentoexistendiferenciasentreambosgrupos,al producirseun aumentode

las listeriasaisladashastael día 1 pi, tal y como ocurrieracon la dosisde l0~, siendoéste

mayor en el caso de los deficientes.El aumentode los recuentosen el bazo durantelas

primeras24 horaspareceestaren consonancia,asimismo,con lo expuestopor Archinal y

Wilder (1988a).

Entrelos días2 y 4 pi seproduceun levedescensoen los recuentosde ambosgrupos,

aunquelas diferenciasentreellosson de casiun logaritmo (gráfica2b). El día 5 pi seproduce

un segundoaumento,muchomás acusadoen los deficientesque en los no deficientes,para

a partir de entoncesdescenderhastadesapareceren amboscasosel día 8 pi. Estesegundo

aumento parececonfirmar una reactivaciónde la infección inicial, que seríacontrolada

muchomásrápidamente.Es importanteseñalarquela existenciade esesegundoaumentode

los recuentosno aparecereflejadaen ningunade las citasbibliográficasconsultadas,ya que

la mayoríade los estudiossuelenacabarel día 4 pi. Asimismo, essorprendentela aparición

de estepico cuandolos recuentosseencuentrandescendiendo,sin que hayamosencontrado

otra explicaciónque una posibleliberaciónde listerias a partir de focosdondesehubiesen

acantonadodurantela infección inicial.

Estosresultadosdifieren de los observadospor Goosensaal. (1988), quienesno

101

Deficientes No deficientesHígado Bazo Hígado Bazo

30 m 5,25x10’ 4.75x10’ 1.36x10’ 7,SSxlO’

12 h 1,78,10’ 1,5~10’ 72h10’ 1.07x10’

1 d 3,32x10~ 4,36x10~ 2h10’ l,29x10’

2 d 1,9x10’ 1,24x10’ 2,62,10’ 2,09,10’

3 d 1,36,10’ 3,59,10’ 5,12x10’ 4,95x104

4 d i,io’ R,65x10’ 2,10’ I.34x10’

5 d 3,2x10’ 4.52,10’ 8,77,10’ 2,35,10’

6 <1 s,ssxio’ 9,2,10’ 0 3,10’

7 d 0 1,37,10’ 0 9í10’

o O o o

9d o 0 o o

lOd o O O O

‘fabla 11- Resultadode los recuentosen hígadoy bazotras inoculaciónintravenosacon itt’ Lm

oN.0o-ebL

‘ouCC‘oo

oo

o’o

‘ooz

‘oof

‘eo’

4

o.uC

io’

o’

eo’~

0‘o

o

u,~

5’oO’~.0

Ci

uts.

CC‘oo

OO

i‘o

‘oib

4C

iCQ

—O

o

51~o4

)

‘oSn

ÚEO)

‘e‘oao)>CCo‘e‘oO

)o‘oC1fl4

)‘oO

-‘oO

)CCo‘o4

)‘ooO)

O-

CCoO)

O)

oCci

OO

Ci

‘oO

.CO

ti4

Ci

03—

O

Resultadosy discusión

encontrarondiferenciasen ratonessensiblesy resistentesentrelos recuentosdurantelas 72

primerashorastras inocular hasta9x105 L. monocytogenes/ratónpor esta vía. Quizásesa

diferenciaseadebido,tal y comoreferimosanteriormente,a unamayor resistenciade la cepa

de ratonesutilizada por nosotrosa la listeriosis.

En el hígadoserepitela observacióninicial hechaen el bazo,esto es,el númerode

bacteriasaisladasa los 30 minutos es mayor en los controles que en los deficientes.

Asimismo, seobservaunareduccióndel númerode L. monocytogenesaisladoalas 12 horas;

reducción ésta, aunquemuy similar, ligeramentesuperior en los deficientesque en los

controles.A las 24 horasesenúmeroes ya un logaritmomayor en los segundos(graL 2a).

Por otra parte, mientrasque en los controles los recuentosse mantienenprácticamente

constanteshastael día 3, e incluso desciendenligeramenteel día 4, en el caso de los

deficientestodavíaaumentanun logaritmo antes de iniciar ese descenso.El día 5 puede

observarsecómo seproduceun aumentode los recuentosde listeriasaisladas,muy similar

al observadoen el bazo, y que podría responderde igual forma a una reactivaciónde la

infeccióninicial. Esteaumentoparecesermásimportantequeel observadoenel bazo,puesto

que en ambosgrupos el aumentoen el caso del hígadoes de alrededorde 4 logaritmos,

mientrasque en el bazoes aproximadamente2 logaritmosen los deficientesy de menosde

uno en los controles(graL 2a y b).

Por último, hemosde destacarque los deficientestardanúnicamente24 horasmás

que los controlesen eliminar las listeriasde hígado, lo que podría tal vez serdebido a que

a dosis próximas a la DL50 las diferenciasentre deficientes y no deficientes no sedan

apreciables,y el comportamientode ambosgruposseriamuy similar, lo que implicaríaque

existe un número de listerias lo suficientementeelevado para rebasarla capacidadde

respuestainmune,estéo no alterada.

La reactivación de la infección observada,parece ser dependientede la dosis,

apareciendoa partir de dosisletalesy no siendoobservadaen dosissubletales(tabla 10). Esta

seríala causapor la queno seobservaen los no deficientescon la dosis de ~ que para

estegrupo es subletal, y si en cambio al utilizar la dosis de ~ lo que también parece

confirmar las diferenciasde mortalidadencontradasen amboscasos(tabla 8).

104

Resulíadosy discusión

La existenciade estareactivacióny las diferenciasde recuentosde casi2 logaritmos,

podría relacionarsedirectamentecon las diferenciasen cuantoa mortalidadobservadascon

estadosisen animalesdeficientesy no deficientes,quesondel 80 y el 40% respectivamente.

Ademásello implicada,en nuestraopinión,quelos estudiossobrela listeriosisdeberíantener

una duraciónsuficiente(en nuestrocaso 10 díaspi) parapodercontemplarestefenómeno.

Tal y comoreflejamosen el casoanterior,seobservacómoexisteunamayortardanza

en desaparecerlas listerias del bazo que del hígado, y que lógicamentetendría la misma

explicaciónexpuestaen el apartadoanterior.

Nuevamente,los resultados estadísticosconfirman la existenciade diferencias

significativasentreambosgruposde animales(P<0,05)con la dosisutilizadade ío~’~ porvía

iv.

4.1V- SEGUIMIENTO DE LA INFECCION POR VTA ORAL CON DOSIS UNICA

4.IV.a- CON LISTERIA MONOCYTOGENES4b

Los resultadosobtenidosdel aislamientoen órganosde listerias inoculadasporvíaoral

en ratonesdeficientesy no deficientesson los expuestosen las tablas12 y 13. En ellas se

puedeobservarun retrasode 24 horascon respectoa la vía intravenosaparapoderaislarlas

de hígadoy bazo; ese tiempo podría ser el necesariopara traspasarla barrera intestinal,

alcanzary, eventualmente,multiplicarseen los órganoslinfoides regionales,a partir de donde

llegan a hígadoy bazo, tal y como seexplicó en el apartado4.II.c.

En la mucosadeltractodigestivoúnicamenteseencontraronlesionesen las placasde

Peyer. En éstasse observó,tanto lesión evidentecomo bacteriashastael día 6 pi en los

deficientes.Las lesiones más graves mostraron, de forma predominante,una reacción

inflamatoriapurulenta,que afectabasiemprea las áreascúpulade las placasde Peyer,entre

el epitelio y los folículos linfoides (imágenes7, 8,9. 10 y 11). En algunoscasosesteepitelio

de las Placasde Peyerse presentabaulcerado.Las lesionesencontradasen los animalesno

deficientesfueron muy similaresa las descritasen los deficientes,aunquela inflamación fue

más ligera, y secircunscribióúnicamentea los días2 y 3 pi.

105

ti).4z

oCCC

rree

---4CC

44CC

C

44

rre

uu,e

j

00<u~

o

e

ee-

000<o,00

000<o’O

N

OOOZ

VVVi

>>><U~

‘o

S

SS

~-

000<

....4

..~>~

>>>><

>>>4

‘oO

CCCoe

a

-u

,

00

—.~

——

00<ej

sssC

<50<uyVi

ee>4

444

0

00

00

<5000

o~

,

2—

~~~

00<0C

..4

<5>4‘o.< 0N

00<U

No

,-e

j

00<U

Nre—

00

00

0000’

OOO<<<4

444

ttt~ay<5.~o

uuu,

Oc

—~oo

uy

<5~eju

,0<o,

00

00

t’o

Z

‘‘oSC

<52o’—

<504‘oe-

<504‘oo,

<50<ej

‘o<‘o

e~0<

Vi-

33<O

OO

OO

O

Eo

<<

¿2

00<

Vi

ay

—o

,

CC

oo,

—

000

00

0

..0~

<52~4

<5~CC0’

<5t~5

ffl2

0<—>4re

00

‘‘eCiSn

e~

.4,;

oc

e~

<¿>4CC

<5fleieej

——eej

~o

a

eeen

~-cti—

.c~

~e

~

‘et

‘e‘fl

-e~O

‘efto

‘e00

‘eQN

‘eO—

——‘-O—

E.5CCo

•‘e

•C

iO

)e‘C

iC

iC

iC

ieoO

)

¡C

i

O-

oo-CC

o‘eCi

Ci

O)

oCiCC

O)

O)

O)

teO)

‘eCC

O)

Ci

oCi

O-

O)

‘eoCi

CitÉO-

‘oCCoCiCC

itoCiO)

CC

oCiO)

Ci

O)O)

O-

CC

oo)‘eC

CO

)

tiCi

.0Ci

OO

Oa

OO

aa

Oe

.a

aa

tÉ—

0<>4

0<>4

0<

0<

0<

>4

0<

><O

o-,

e-

e-

oc

ze

>e

-u

,O

~V

ie

>—

——

4¿

—-~

——

ej

e-

‘o

a<

5<

5b

a—o

aa

~—

.4—

—>4

0<>4

SC

0<0<

0<0<

-<

4-

--

.4re

~e>-

—SC>

SC

—t

oc—

—

<<

5<

5<

5<

5<

¿<

5<

5a

o—

——

o—

—O

—‘O

~0<

>4

0<0<

~—

.4o<

20

—Z

~a

ej

—O

UN

—C

CV

N—

.V

i>4

u,

0<e

-.4

4)

ree

-—

jre

.4re

4

0

<5<5

ea

ao

aa

>4>4

•<><

o<o,

,;,;

,;a

Oca

O)—

ej.e-

ej4

—re

eja

~~

é<5~

<5<

5<5

oa

——

OO

aa

aa

oe>

reVN

O-SC

VN

<5<5

<5<5

<5<5

E~

-z‘~

—2

aa

oa

ao

Ze

je-re

—<

ne-

>4o’e-

e>SC

<4ej

0’~

ejtÉ

a

a,;

oa

oa

~<5

<5

aa

ao

aa

oa

—re

-V

ire

tÉe

>

oa

o5

O—

—~

oa

aa

a0<

0<0<

.0e>

00re

QC

C—

-0~

a

Oa

<5‘e

ao

a—

aO

OO

OO

OCC

Ci

3<0<

tÉCC

O

.0

E.0

.0-~

‘e‘e

‘e‘e

-~‘e

‘e‘e

‘e‘e

o~

ti—

—en

—~

tiCt

t50—

~QN

O—

‘e—So

Eo

CC

CCO‘eE‘Ci

Ci

CiCi

Ci

OO)

oCi

O-

oo-CC

o‘eCi

CiO)OCi

CC‘uCiO)

O)

SnO)

‘eoCiCe

O)

CioL.oO)

‘eCCoCi

Ci

tÉO-

‘oitoCi‘o-‘E.2Ci

O)

LooCici

CiO)

0)

O-

o0)

‘eo‘e5CiO)

enCi

.0Ci

Fi

SCibCi

03

5—

o2

4>o

’

04

¡SC

4,e-

-CO

~1:103

-.•

YuCC

‘s~—

[..~ll±>il~ffl~wil~

-~—

Oo’

u,

e-O

ib—

ev

ibib

1;42o,

u,

04

e-

Á-

Cci

05Ci

‘e

oo

ou0

CCrn

ozofs

u’O

6

~0-e

ibIt

‘e

a

ce

-eo’CC

ceC

Cos

of

oO’u

-—-4

--4bEceoci

<o-E

Ci

—~

oó

03—

—5’4>

.0—

O

EO

o’

—.~

4)

o‘e

o’

zCCC

=Ci

-0

=‘e

itO’

CCo<o

‘eCi

.2o1

Ci

03

ito‘eCi

O

O)

o‘oO)

Ci

oO-

4)

‘e‘-1o4)

Ci

CC

o4>

0o)

O-

‘oOo>

Cici

O)CC

CCo

Ci

zO)C

i

of‘e

CC

o4>

4)

CoCCC

ciO

)4.

.—‘ID

O’

en

03

-r

e-

ON-cO-ecebE0

-4

ce

OO

’S

CID~

Coib

‘C

i03

—O

o

uCCo’

OO

O’

CC

O-

CO

ib~

Ci

Da—

00

u1’-o01o

Oo

,o>

e-

<oib

—eD

03—

o

o‘oUD

a)

tÉ-

oza

—A

—o>

eo,

Ao,

t45

•o,

5

oU)a)¡04

a)oa)obLs•0ti)o

—5

o>o,

ci

~4

—5

oo’

Co

A

o>4

—A

oo,

o,

¡

-N-4.0-4cf,o‘0CioO)

Ci‘OO

)

CiO)

ooCC4)bE

-eO)

“eotÉOCi

CC

oCiE)

Ci

O)

O)

O-

CCoO)

‘eCiO)

Resultadosy discusión

Es de destacarque aunqueel númerode listeriasque consiguenatravesarla barrera

intestinal es relativamenteescaso(Marco et aL, 1992b), pero suficiente para infectar el

epitelio intestinal y las placasde Peyer,tal y como afirman distintosautores(Gaillard et al.,

1987a;Domingo et aL, 1992; Marco et al., 1992b;Czuprynski, 1994),donde realizaríauna

primeramultiplicación que le permitiría adquirir un númerosuficienteparaque la acciónde

los macrófagosno seadefinitiva (Gaillard etaL, 1987a,1987b),pasara los ganglioslinfáticos

regionalesy, desdeahí, alcanzarel hígadoy el bazo (Golnazarianet al., 1989),dondebien

seríacontroladala infección,o bien, tras un nuevoperíodode multiplicación,sediseminaría

por el hospedadordando lugar a nuevosfocos en órganos distintos a los mencionados

(Schlech, í990; Marco a aL, 1992b).Esta primeramultiplicación en célulasepitelialesha

sido observadapor otros autoresutilizando cultivos celularesde la líneaCaco-2(Gaillard a

aL, 1987b; Bercheu aL, 1988).

Una vez atravesadala mucosadigestivalas listeriaspodríanseguirvarios caminos:o

bien generalizarsepor vía sanguínea,bien porvía linfática, o bien por vía linfohematógena.

Nuevamente,la rápidaapariciónde listerias en los gangliosmesentéricos,con respectoal

hígadoy bazo (graf. 3d), parececonfirmar lo expuestopor otros autores(Golnazarianni al.,

1989; MarcoaaL, 1991, 1992a;Low y Donachie,1991)en el sentidodequela víautilizada

es la segunda.Llama poderosamentela atenciónla desapariciónde las listerias másrápida

de los gangliosquede sus tramosrespectivosde tubo digestivo (gral’. 3c y d, 4a, b. c, d y e).

En el caso de los ratonesdeficientes,la infección, entendidacomo la presenciay

multiplicación de listerias en el hospedador,seprolongaen el tiempo, apareciendoantesen

hígado,y tardandomásen desaparecer,a lo que se añadela obtenciónde recuentosmayores

en hígadoy bazo. Por otra parte,en estesegundocaso,se puedeobservarun leve aumento

de los recuentoshaciael día 7 en el hígadoy 8 en el bazo,que podría corresponderse,al

igual que sucedieraen la vía iv, con una posiblereactivación(gral’. 3).

Además,debemosreseñarcómo la cinéticade la infección (grál 3 y 4) essimilar en

ambosgmpos,si bien los valoresde los deficientesseencuentran,por lo general,porencima

de los de los controles,lo que esespecialmentevisible en las gráficasde hígadoy bazo (3a

y b). Por otra parte,la recuperaciónde L. rnonocytogenesa partir de órganosinternos y tubo

digestivocesaantesen el casode los no deficientes,excepciónhechadel estómago.

Y16

Resultadosy discusión

Es de destacarla rápidaapariciónde listeriasen los ganglioslinfáticos muestreados,

incluyendo el ganglio submandibular(graf 3), ya que el que aparezcanenel mesentéricoa

las 6 horas,y posiblementeantesdeesetiempo,no deberíaextrañarnosal utilizar el intestino

como puertade entrada.Esteresultadodel gangliosubmandibular,podríaindicar laexistencia

de otrapuertade entradaen el tractosuperiordel aparatodigestivo,posiblementelas tonsilas,

algo ya sugeridopor nuestrogrupode trabajoen otrosestudios(Briones,1990; Lópezetal.,

1993), ya que consideramosdescartableque esto se deba a la posibilidad de una

generalizaciónde la infecciónporapareceren estelugarantesqueen hígadoy bazo,además

de que estosgangliosrecogenel drenajede toda la zonaorofaríngea.Lamentablementeno

sepudoevidenciarhistologicamentelas tonsilasde los ratones,por lo que nosfue imposible

confirmarla utilizaciónde estasformacioneslinfoides comopuertade entradaal hospedador.

Sin embargo,se realizó un pequeñoexperimentoadicional con la intención de

compararla dinámica de la infección de L. monocytogenesen ganglio submandibularen

animalesinoculadospor vía iv con la observadapor vía oral. Siguiendola misma patita que

la utilizadaen los estudiosde seguimientoporvía iv (4.Ill.b), se muestrearonlos ganglios

submandibularesde ratonesinoculadospor estavía con dosisde 1V Lmlratón hastael día

5 pi. Los resultadosobtenidos(no mostrados)reflejabanuna dinámicay tasade recuperación

a partir de dicho órganosimilar a la retiejadaen la gráfica 3c, pero con un retrasode 48

horas hastaobtenerlos primeros aislamientos.A nuestrojuicio, este retraso nos permite

sustentar,suficientemente,la idea de que en la inoculaciónpor vía oral podría haberuna

penetracióna nivel del tracto digestivo superior,ya que aparecenantes en estaestructura

cuandola inoculaciónespor vía oral que cuandoserealizapor via xv.

Otros autores(Raez,citado porGaillard et al., 1987a)han señaladola posibilidad de

que las listeriaspenetrena travésde otrasmucosascomo la corneal,bronquial o conjuntival.

por lo que no seríaextrañola utilización de la mucosadigestiva a diferentesniveles. Sin

embargo,a la vista de nuestrosresultados,esta, llamemos,puerta superiorpareceser de

menorimportanciacuantitativaque la mucosaintestinal,ya quetanto los valoresencontrados

comoel tiempo que tardanen desaparecerlas listerias de esteganglio es menorque en el

caso del ganglio mesentérico.Sin embargo,es de gran trascendenciacualitativa, ya que

suponesoslayarla acciónde los ácidosgástricos,lo que podríarestarimportanciaal posible

efectodel pH gástricorespectoal establecimientode la infección. Además,representauna

117

:1

Resultadosy diseusson

grave carenciaen aquellosestudiosque se sirven de la vía intragástrica(ig) como vía de

inoculaciónfrentea la vía oral (Lópeza al., 1993).

Desdeel punto de vistahistológico las lesionesencontradasen los ganglioslinfáticos

mesentéricos,en ambosgrupos,fueronligeraslesionesmultifocalesde tipo piogranulomatoso

(PMNSy macrófagos)desdeel día2 hastael 4 pi. Estaslesionesseencontrarondistribuidas

de forma constantepor las áreasT-dependientesde la cortezadel ganglio. La mayoría de

estaslesionesse encontraronasociadasa la presenciade listerias. Hay que notarque, de

formageneral,el gradode inflamaciónen las placasde Peyerno secorrespondiócon cambio

histopatológiconotableen hígado,bazoo ganglioslinfáticos mesentéricos.

En lineasgenerales,nuestrosresultadosen bazoy gangliosmesentéricosseasemejan

bastantea los expuestospor Audurier et al. (1981)durantelos 3 primerosdías. Este autor

utilizó la vía oral con tres cepasde L. nwnocyrogenes4b obteniendoun aumentode los

recuentosen esosdías; sin embargo,nosesimposiblehacercomparacionesmásallá de ese

tiempo al interrumpir sus resultadosen ese punto. En nuestrocaso, los aumentosen los

recuentosson muy similares,aunquecon valoresalgo inferiores a los encontradospor este

autor. Estasdiferenciaspodríanserdebidasa la utilización decepasdistintas.Los resultados

obtenidosen el bazoconcuerdan,también,con los ya citados(Archinal y Wilder. 1988a;

Cossarty Mengaud,1989),y en estecasomásexactamentequeen la vía iv. Así, por vía oral

el incrementodel númerode listeriasen bazoseproducehastael día3, e incluso4 en el caso

de los deficientes.Esto parececonfirmarunamismadinámicade infecciónseacualseala vía

de inoculaciónempleada,aunquecadavía sediferenciapor el tiempoquetardaen controlarse

esainfección. En estesentido,porvía oral el númerode listerias en hígadoy bazo escero

hastael día 1 pi, mientrasqueen intravenosaesya alto en las primerashorasdebidoa la falta

de filtro intestinal.

En cuanto a los resultadosobtenidos del hígado, el hecho de que las listerias

desaparezcan4 díasantesen los controlesqueen los deficientes,podríaestarrelacionadocon

una másprontasensibilizaciónde los linfocitos T, tal y comoseñalanotros autores(Goosens

ce aL, 1988), esta activación debe suponersealteradaen los deficientes,tal y como se

estudiaráen el apartado4.X.

118

.1 E

Resultadosy discusión

Paradójicamente,aunqueseobtuvieronrecuentosen todos los órganosmuestreados,

tan sólo se detectaronlesiones histológicas significativas en el hígado de los animales

deficientes.Las lesionesobservadasconsistieronen microabscesosdistribuidos de forma

aleatoriapor el parénquima,en algunasde las cualesse pudieron observarlisterias. Las

lesionesdescritasse observaronlos días 2 y 3 pi. El resto de los órganosestudiadosno

presentólesiónalgunadurantela expenencia.

Finalmente debe reseñarseque las diferencias observadasen las gráficas fueron

estimadascomo significativastras el estudioestadísticorealizado,presentandoun valor de

p<o,05.

4.IV.b- CON LISTERIA MONOCYTOGENES112a

Los resultadosde la infeccióncon l/2a porvía oral puedenobservarseen la tabla 14.

Los valoresobtenidosen tubo digestivo son realmentebajos,no superandolos ío~ Lm/g en

el intestinogrueso,de donde, además,desapareceen 48 horas; respectoa otros tramosdel

tubo digestivo,exceptuandoesófago,los recuentossonprácticamentetestimoniales,e incluso

no selograronrecuperarlisteriasapartir de estómagoni intestinodelgado.Nuestrosdatosno

nos permitenexplicar la razónde estehecho,peroen cualquiercasodemuestranuna escasa

capacidadde supervivenciade esteserovaren tracto digestivo.

Pese a todo ello, existe una cierta diseminaciónextraintestinal.reflejada en los

recuentosobtenidosa partir de gangliosy órganosinternos.Segúnestosresultados,la cepa

de l/2a utilizadapresentaun poder infectivo muy bajo,ya que su tiempo de permanenciaen

los órganosno es superiora los 4-5 díasen ningún caso.

4.IV.c- COMPARACION DE AMBOS SEROTIPOS

Si comparamoslos resultadosobtenidoscon los dos serotiposutilizados en nuestros

experimentos(tablas13 y 14, y gráf. 5 y 6), podemosobservarcómo la cepade 4b escapaz

de permanecermás tiempo tantoen órganosinternoscomo en el tubo digestivo,mientrasque

la presenciade l/2a en esteúltimo esprácticamentetestimonial; asimismo,los recuentosen

todoslos casosson superiorescon 4b quecon la cepade 1/2a empleada.Todo lo cual, en el

119

ti)VVVNree

j

>>><re<

4

<5—

~O

OO

OO

Oo

a

‘ea

aa

aa

aa

aa

aa

o

‘‘o‘oo)a

aa

aa

aa

aa

aa

O

<oa

aa

eee-re

.—a—

000<rea

aa

aa

a

ooa

>>>4ej

aa

ao

ao

aa

aa

‘oO)

EtÉ

ao

..4ejej

004—

..4—

00<e.

oa

aa

..0CCtÉ0

0——

<5

<5

o’e>

——rre

aO

aa

a

.0

OO

O>><rs

<5,;CC

<5——ee-o,e

j

Oa

aa

a

>>4e‘o

‘‘eCitúSn

aeej

<.

22

—

aa

aa

ao

aa

.Ci

.0Q

‘ecg

“een“e

“e‘e‘.0

‘et~-‘e00

‘e~

‘e2

E06EoO

)

Ci

o<CiO-

o00

CCo‘eCiCi

ooCiLoo)C

iO

)O

)O

)

‘eoCi

CC

O)

oO-

O)

“eCC

oCi

túO-

‘o‘ooCi

VN

-‘E¡

itoCi

O)

oCiO)

Ci

O)

¡O

)5

-itoO

)

‘eo‘eCi

‘oO)

0±

Ci

.0Ci

<o

ib

Oc

03-o)

orn

—Itcg

o’

c~

t‘e

e-.0

0

<o

f-4

CO

ce0

st

LI,ej03o0,o,It

‘Co

50ib

‘7—

<»1<’03oib

e-s

oCO

—C

i0

3-o

c

ce

-4-o-eceIt03

s-oCI).0

.2--4ceO0

<o

o’,

ev4-t

03>

0

Ci

tiE

o’—

oO)

St

CoO

e-.0

5-

<ot

LIDC

i‘OO

)—

Ci

5.,C

i

03

‘oOo

O)

Ci

<o

~ib

Cj

.40

-4.50e-

CIDCi

-Co

<o“-5

CCOCiCitÉ<oc‘OC

iO

)‘oOC

iO

)C

i

CCOO)

‘eCi

O)

o,03

-‘e

•C

i

O)

“e

.0C

i‘OO

)

EOuIt

0

a[.

01

O)5.

CC01o

Oo

’<o

e-

st

ibC

jcg

—o

03O

O)o

OO

bt~

<oib

c’b0

30

oce

-oo-4ce

O)4>.CCSCo

Co

’

01

O)

CL.CC01o

O0

,50

t-<o

CO—

C03

—a

oo’-

•0ti)

,0a)so

tÉ-

o5-o

N4>¡

~5.

oU)a)

a)

—o

4

4Y

0.5•0

.5

>0Citi.0

-.

oCi

-‘oLoa0

0

Ci

‘O‘uCi

Ci

O)

oCiCCCi

o‘oO)

tú

‘eo.0Ci

Ci

O)

CCoCi

O)

O)

O)

O-

‘oo0)

‘e‘ECi

0)

‘eCi

‘OO)

EouSo

oa)

-4

Y

SÉ‘oti)o

‘0

ID

1~~~

Resultadosy d,scus,on

caso de 4b. aumentaríalas posibilidadesde producir una infección y, en consecuencia,el

desarrollode la enfermedady eventualmentela muertedel hospedador.

En estesentidono debemosolvidarunagrandiferenciaentrelos serotiposempleados,

y expuestapor Kaufmann(citado por Mainou-Fowleru al., 1988),segúnel cual la cepade

l/2a NCTC 7973 resultaser un serotipocon infección no persistente,mientrasque 4b silo

es; las cepaspersistentesserianaquellasque trasinoculaciónintravenosapodríanseraisladas

de bazoa los 6 día pi, mientrasque las no persistentessedanrápidamenteeliminadasy no

podríandetectarseen bazoa los 6 días pi. Aunqueesteestudiose realizó utilizando la vía

endovenosa,nuestrosresultadosconfirman estasobservacionesporotra vía.

Paraconcluir,nuestrosresultadosparecenconfirmarla ideaexistentesobreuna mayor

virulenciade el serotipo 4b, basadaen datos epidemiológicos,expresadapor otros autores

(Barbouru aL, 1992; Broschu al., 1992; Tabouretu al., 1991). Esto podríaexplicar la

mayorfrecuenciade apariciónde esteserotipofrentea l/2a en los brotes de listeriosis tal y

como se expusoen el apartado1.JV.c,dondeseseñalaronporcentajesde apariciónde entre

un 62-64%y un 13-15%respectivamente(Gouletet al., 1989; McLauchlin, 1990), e incluso,

más ampliamente,de un 92% para los serovaresdel grupo4 frente al 8% restantepara el

grupo 1/2 en nuestropaís (GómezMampaso,1993).

4.V- SEGUIMIENTO DE LA INFECCION POR VTA INTRAGASTRICA

Estavía ha sido consideradapor algunosautores(Barbouru al., 1992)como la más

natural para la infección con Listeria, ademásde haber sido utilizada en numerosas

infeccionesexperimentalespor vía <‘oral (Schlech, 1990). En nuestrocasoúnicamentese

realizó con el serovarl/2a, puestoque la gran mayoríade los estudiospor estavía sehan

realizadocon esteserovar,y al haberencontradodiferenciasen el comportamientoentrelos

serovaresutilizados en la vía oral se pretendíaver la posible existenciade diferenciasal

utilizar distintasvías de inoculacióncon estacepa,que ademásesla cepatipo de la especie.

Los resultadosobtenidospor estavía puedenobservarseen la tabla 15. Entreéstos

llamala atenciónla presenciade listeriasen la región orofaringeay en esófagodesdelas 6

horaspi, asícomo su persistenciaen pequeñascantidadesen estaszonashastalos días 6 y

123

Iii

tÉ

o’a~—

000<~cl

000<oco,re

~a

aa

aa

aa

O

‘ea

a000<

aa

aa

aa

aa

a

‘oO)

aa

aa

>>4—a

aa

aa

aa

‘0O)

Ci>4

.j

<5C

i<5‘~

<500

<5>>>4e

aa

aa

a

o

<5—

<5<5

oo’<5

<5<5

<5e-a

aa

a

itEtú

aa

aa

accl

aa

aa

aa

CCtú

aa

aa

aa

<Oa

aa

aa

.0

aa

—

<5—o

eee-SC

<5-—

000<rl

aa

0a

a

‘‘eCitú.0

aa

———..4—

<5e-a

aa

aa

aa

e.0

,.~

ti

-c~0±

“eti“een

‘e‘eLtN

‘eSo

-eho‘eOC

‘eQN“e

E06Ci

cgoO)

Ci

O)

túCi

Ci

Ci

O-

oo--

o-CoCi

“EO)

oCi

‘oO)

CiO)

O)

O)

‘eoCi

CCO)

Ci

oCi

O-

0)

‘eCCoCiCitú5-

‘0itoCi‘o‘oCis

O)”’

‘o44

0

Ci’

Ci—

~O-

CCo

02

0)

e

Co

)“en

fCiR

CC0)0

.

Sr

.2ID

E-.>

st

oo‘O)

.5O)

o(IDa)

O>

St

a..O

~<o

~—

ibej03--e

St~

‘e

Ito4>

e-‘It01It0.

<oib—

ce.0-e~ce

.0UDO—4

-4ce

oO

01‘0<O

)0.>CC01O

oo’

<o

e-<o

oj

01‘~

0O)O’-a

Ob<o

a.-<o

ib

soibev03o

<o

’

St<o

It“ee

-

‘<o

41•1

y,

ySL

O

/4</>

5<‘0<

oNce

.0

01-o

.-O

)0.-CC01O

o¡

—¡ o

o’<o

e-st

ibev

03—

oo

0~~~~

:ev

>0

3

—o.’

4,

-

—C

iev

cg

Ci

tiEOIt

Ci

oO)

¶4>’.

It‘C

i

<ItCi

00It

1-

ItOC

i‘OO)C

i

CiCCOCCOCiCitÉO-

‘OCiO)

‘ooCiO)

Ci

O)O)

O-

‘o—

OIt

—0.

0)

O‘e-‘E

5<C

i

-~O

)0<

‘e•0<

Ci

‘0o

00Eou4>.‘C

i

<oibejcgoo’

<o

¡eva.-

aso

y¡

00

<->

it

4’—

4c.D

y‘0

~.’

laej

Da—

O

St

It

“e

5<‘~0O

)0.-CC0>

¡ao~

<oe-

st

it—

ev03

—o

oev03o

O

‘0o>.

0.

<~

0—

orl)a)a)

U.5

1.E

oa)

‘e

Itso

5

o‘oUDEz~

yo

‘0

.7<

y.,,

i

O

‘y

O’--

O~00.O

otÉ44

‘oUD

y

a)

e-o5-

o

5

tiECi

oO)O)

oCi‘OO)C

iC

iO)oCiCCC

i

o‘oO)

túo.0CoCi

E)‘o2CiO

)C

i

CCoO)

“e1-‘6Ci

O)

-eCi‘OO)C

i

CoEouOC

~0It

00

15

0<SL

Resultadosy discusión

5 respectivamente.Estapresenciapodríaser debidaa la propia técnicade inoculación,que

suponeen muchoscasos,unacasiinapreciable,peroexistenteerosiónde la mucosaesofágica,

y a que la retiradade la sondaimplica el depósitode una ciertacantidadde inóculo en el

tracto digestivo superior, cuyo epitelio, levementealterado,permite a Listeria una mejor

colonización,hechodemostradohistológicamentepor Domingo (comunicaciónpersonal).No

seobtuvieronrecuentosde pulmonesa partir de ninguno de los animalesmuestreados,datos

no reflejadosen la tabla 15 ni en las gráficascorrespondientes,por lo quepodemosconsiderar

quela inoculaciónserealizócorrectamente.

Por otra parte, también llama la atenciónel aislamientode listerias a partir de

estómagoe intestinodelgado,los días 3 y 1 respectivamente.A esterespectodebemosdecir

que estosaislamientosfueron realizadosúnicamenteen uno de los ratonessacrificadosese

día, y podría debersea la existenciade factoresindividuales, o a una mala prácticade la

inoculación,sin que podamosexplicarestehecho.

Sin embargo,los recuentosde intestinogruesosonsimilaresa los que seobtienencon

esta misma cepa por vía oral, lo que confirma el bajo poder de colonización intestinal

señaladopor otros autores(Marco et al., 1992b).

Segúnnuestrosresultados,se obtienen recuentosmayoresen bazo que en hígado,

siendo ademásla persistenciamayor en el primeroque en el segundo(graf. 7). Además,los

recuentosmayoresseobservanentrelos días3 y 4 en ambosórganos,lo que concuerdacon

otros autores(Barbour a al., 1992; Bracegirdlea al., 1992; Domingo et aL, 1992). Sin

embargo,algunosde estosautores(BarbouretaL, 1992;Bracegirdleu aL, 1992)afirmanque

no seaíslancantidadesimportantesde Listeria a partir de hígadoy bazo hastalos 3-4 días

de unainoculaciónintragástrica,aunquesegúnnuestrosresultadospodemosencontrarlisterias

en hígadoy bazo a las 24-48 horas post-inoculación,lo que parececonfirmar resultados

anterioresobtenidospor nuestrogrupo(Domingo et al., 1992)

4.VI- COMPARACION DE LAS VIAS ORAL-INTRAGASTRICA

Los resultadosobtenidosporambasvíasson muy similaresen hígado,bazoeintestino

grueso,tal como sepuedeapreciaren las gráficas7a, 7b y 8e; sin embargo,los resultados

127

II

Resultadosy diseusion

obtenidosen ganglios,estómagoe intestinodelgadodifierenengranmedida(gráficas7c, 7d,

8c y Sd). Por otra parte,los resultadosobtenidosen orofaringey esófago(gráficas8a y 8b)

puedendebersea la posible erosiónocasionadapor la sonday al depósito de inóculo

producido al retirarla, tal como se explicaen el apartadoanterior. En definitiva la vía ig

ofreceresultadosmenosconsistentesquelos obtenidosporvía oral y, en consecuencia,la vía

ig no pareceseruna elecciónacertadacomovía de inoculaciónya que:

- la utilización de sondalesionael epitelio esofágico;

2- seproduceun depósitode inóculo en la zonaerosionadaal retirar la sonda;lo que,

unido a lo anterior,implica una colonizacióndel epitelio de la orofaringey esófago;

3- presentauna mayorcomplejidadque la vía oral;

4- requiererealizarcontrolesde pulmónparaasegurarla correctainoculación;

5- no esequivalenteal modo naturalde infección.

Nuestrosresultadosconfirman lo ya expuestopornuestrogrupode trabajo (Lópezet

al., 1993), al no encontrarmejoraalgunaal utilizar la vía ig con respectoa la vía oral, ni

siquieraparaobteneruna mejor respuestahumoral.Por tanto, contrariamentea lo expuesto

pordiversosautores(Barboura al., 1992)que considerana la vía intragástricacomola más

naturalen todos los sentidos,porquealterael contactode Listeria con las zonaslinfoides del

tracto digestivo superior,queintervienen,segúnnuestrosdatos,en el procesode penetración

de estosmicroorganismosen el hospedador.Además, de no presentarmejora algunacon

respectoa la vía oral, esde mayorcomplejidadal tenersequeadministrarel inóculo con una

sondaindividualmentea cadaanimal, y depositade hecholisteriasen orofaringe,ademásde

lesionar el epitelio esofágico,falseandolos resultados.Otro factor que desaconsejasu

utilización es la necesidadde realizarrecuentosde los pulmonesde los animalesinoculados

paraasegurarnosla correctainoculación(Marco a aL, 1992b>.

4.VII- SEGUIMIENTO DE LA INFECCION POR VIA ORAL CON 1O~ 7DIAS

Las tablas16ay 16b nos muestranlos resultadosobtenidoscon la dosisde ío~ Lm/ml

administradasdurante7 días. En estastablas puedeobservarsecómo los valores de los

deficientesson ligeramentesuperioresa los obtenidosen el caso de los controles,si bien

pareceque el comportamientoen amboscasosfuera muy similar (gráficas9 y 1<)). En este

128

¡ ¡¡ ¡ ¡

.4

<5ze-e>

000*

ee-

0*re

aa

.4

UUNr

<5qej

aa

a

‘‘0~E)0<UN

00

E)

——

SC<O<O

>4e

j

.4<

L.0

EO

.4~re

re

00

‘oE)

Etú

<5—0<VNoc

00*a

a

..0‘otú

<5

<5

~‘~

e-re

cl—

oa

..0

<500

’0

*

<5<50—

a

““eCitú.0

<5

2—

0<.?~

Ore

VVVN—

<5—0<0*

o

sso

Sn

-tcg

“e~“eS

o“e—

‘e

~i)

—

UUUNVN00

..~SCSCSC

aa

a

“e000<e

j—re

...40*~

~a

‘‘oSC

—

‘0

<5>4<<O

eej

aa

~<

5<5~

‘~E

<Oo

aa

a

CC~E~i)

22a

aa

o

‘otú

ej

~

o<5

0*

e

aa

SSn

5,~VN

~<O

20

0.4

‘e‘C

ie

Sn

~

‘oO)

eO)

O)

SnO)Ci

,0CCO)

CiO)

O)S

t0)

‘eoCi>0

Ci

‘oO)

Ci

O)

O)S

tO

)“e‘oO

)C

ioCiO-

Ci

O)

i06O-

CCCoo‘eC

ioO

)

Ci

O-

oCi

‘oO)CiCitúO-

‘oCCoCi

CC‘EC

iO

)CC2C

iO

)C

iO)O

)UcCCoO

)‘eo5‘oO

)‘oO

)

‘0C

i—

o.00$

.0

<o‘a

Oe,

‘04=

,-

0.

-0

aLo

-O

CIDz

r1~o’

Srz

<oC

i

“e‘e0.

e-o

0.•—

st

-4b0Uo”

itt

O

o<oibce

-4

-ev‘-4

03oc0.

—It

ce

o,o

ct

rO<o

‘Co

CID

so---‘e

1’—Ci

0*‘ee)

2É.o

2o

—0.

<4—’

0O

)Ci

-eo

0.—

‘0.0

OE

<o

~1-

“e“e

e-06

o<o

0.o

‘2‘a

‘oev

CiO)

oCi

a‘ooO)Ci

<Oso-1—

.ev

Io,<o

e-0.

¡—e

-

<oo

½0*

-ev

ce

/1~

½“

1I4

~Q

Un

.2¡

00

00

,<o

e-<o

00

*—

‘ootÉCi

E)

CCoCi

O)

Ci

2>O)

OsO

)O

-0.

ito‘e

0)

‘0‘eC

iO)

“e0.

Ci

O)

‘eCi

a—O>EouQ

N

+

01¾

.O

)rL.CC01o

.9’..cg

OO

b<o

5..so

ib0’

03—

O

oNce-ootce‘-4ce

oo’

st

e-

<oib

0*ev

03—

a

-t.

be‘0<u0..CCU

.aa

<oa..

<o‘a

0*c.D

cg—

a

(O

¡O

‘O

4/

-O

~0~

“ea4

E)O-

.0¡

.5:

O<4~o

‘o0±

EE)“e

06Ci

OO)

Ci

‘oO)

Ci

Co

O)

oCi

YCC-E)tú

“esCi

E)CCOCiE)

CCoE)

o“e

U.—“eC

io

o>-E)-“e

.04

Ci

.0.5

‘0e

—O)

o>CCO

>

O‘e

OUo

.0.5‘0

c.5so

~.0

OUDa)a)

zY1

o‘eCCo)‘e‘e

zY1

oCC5.-

‘oU)a)1-CC

5-‘o>-

LooCC

‘OO

O

SÉ‘oUD0

FI

Resultadosy discuston

sentido,pareceque en los deficientesla penetraciónde listeriassealargaalgomásque en los

controles,como indicanlos recuentosobtenidosde los ganglios,en los que no desaparecen

las listeriashastadespuésdel día 3; mientrasqueen los controlesla penetraciónacabaantes

de ese día.

Otro hechoque pareceavalar la tesis de un mayor tiempode permanenciaen el caso

de los deficientes,esque los recuentosno desaparecendel intestinogruesohastadespuésdel

día 6 en éstos,y antesde esedíaen el casode los controles.

Si comparamoslos resultadosobtenidosconunaúnicainoculación(gráficas3 y 4) con

los obtenidoscon la inoculaciónrepetidadurante7 días (gráficas9 y 10), podemosobservar

que los animalesinoculadosparecencontrolar la infecciónentrelos días5 y Y pi en ambos

casos.Estosresultadosno secorrespondencon los criterios expuestospor diversosautores

(Galsworthy, 1987; Marco et aL, 1991), quienesproponenuna posible alteración de la

capacidadde la respuestainmune del hospedadorderivadade la existenciade lesionesen los

órganoslinfoides y de un efecto inmunosupresorde la propiaL. monocvrogenes.Nuestros

datos demuestranque, en amboscasos,la infecciónes controladaen el mismo periodode

tiempo, lo que revelaque el estatusinmunitario de los animalesno seencuentraalterado.Sin

embargo,esnecesarioresaltarque la ingestiónrepetidade listeriasdurante7 díasaumentaría

las posibilidadesde que se produjera infección, lo que podría concordarcon la mayor

mortalidadobservadacon estapautade inoculación,aunquea diferenciade lo que ocurríaen

la vía iv no podemosestableceruna relación directa entreestehecho y la cinética de la

infecciónobservada.

4.VIII- DEFICIENCIA EN SELENIO Y VITAMINA E Y SUSCEPTIBILIDAD A LA

LISTERIOSIS

Laexistenciade mortalidadesmayoresen el casode los animalesdeficientes,asícómo

que, en general,los recuentosobtenidosde órganosinternosseanmayoresen éstosy quelas

lesioneshistológicasseantambiénmás intensasen los deficientes,nosinclina a pensaren una

mayor susceptibilidada la listeriosisen el caso de estosanimales.Dicha susceptibilidadse

deberíaa los siguientesfactores:

¡32

II

Resultadosy discusión

- alteraciónde la función fagociticade neutrófilosy macrófagos;

2- menorexpresiónde receptoresde 1L2 en los linfocitos;

3- menorpresentaciónde antígenopor partede las célulascorrespondientes.

Estosresultadosse encuentranen clara contradiccióncon los expuestospor Murray

y Murray (1985),segúnlos cualesla deficienciaen selenioconferidauna mayorresistencia

a la listeriosis, disminuyendo la mortalidad en ratones. Sin embargo, estos autores

suplementaronla dieta con vitamina E; que, comoya hemosapuntado,puedeactuarcomo

sustitutodel selenio,suavizandolos efectosde su deficiencia.Además,no secomentani la

cantidadde selenioen la dietadeficiente,ni el tiempoquetardaronlos ratonesenconvertirse

en deficientes.Por tanto, podríahaberocurridoque los ratonesno fuerandeficientesen el

momentode la experiencia,y la mayor resistenciafueradebidaa otro fenómenodistinto a

la deficienciaen selenio.

Los mecanismosde resistenciaa la listeriosis son muy complicados,tal y cómo

apuntamosen el apartado1.V.b de la introducción.Debemosrecordarque la resistencia

naturala la listeriosisradicaenla capacidadde estableceruna respuestainflamatoriaasociada

acélulas1 sensibilizadas(Archinal y Wilder, 1988a),cuyo fallo encualquierade susestadios

previosseriael responsablede un aumentode la susceptibilidada padecerestaenfermedad.

Al inicio de la infección, las primerascélulasfagociticasen llegar al hígadoson los

neutrófilos,enestatempranallegadade los neutrófilospareceestarinvolucradael TNF-alfa

(Mielke eral., 1993).Estostienenla misión de evitar la propagaciónde la infección,paralo

cual destruiríanlos hepatocitosinfectados,dejandolibres las listeriasque seencontrabanen

su interior, y que así quedanexpuestasa la acción de los macrófagosy monocitos(Conlan

y North, 1993, 1994). Por tanto la acción de estascélulas es de vital importancia parael

hospedador,ya que limitan el crecimientoinicial en los hepatocitos,ademásde dejar las

listerias expuestasa la acción de los macrófagosy monocitos. Duranteuna deficienciaen

selenioy vitamina E, las funcionesfagociticasde los neutrófilosse encuentrantan alteradas

como las de los macrófagos(Gyanga aL, 1984; Erskine a aL, 1989), por lo que es muy

posible que la acción limitante realizadapor ellos se encuentredisminuida. Esto último

133

Resultadosy discusión

facilitaría la formaciónde focosinfecciososprincipalmenteen hígadoy bazo,en los cuales

las listerias semultiplicaríanantesde la llegadade los monocitos/macrófagosa partir de las

24-48horas post-infección, lo que pareceestar en total acuerdo con los resultados expuestos

en la tabla 11.

Una vez englobadaslas listerias en el fagosomase produceuna acidificación del

mismo (Chastelliery Berche, 1994). Estaacidificaciónresultaindispensableparaque pueda

actuarla Listeriolisina O (LLO), cuyo pH óptimo de actuaciónes5,5 (Bercheet al., 1988;

Cossarty Mengaud, 1989). Además,el fagosomaes un medio carentede hierro, lo que

estimulaaún más la secreciónde estacitolisina (Bercheet al., 1988).Mediante la acciónde

éstala bacteriaconsigueliberarsedel fagosomaantesde que resultedañada,y multiplicarse

en el citoplasma,dondeel ambienteresultamenosdañinoparaestasbacterias,y dondepor

añadiduraexistedisponibilidadde hierro (Bercheetal., 1988;Cossarty Mengaud,1989).Esta

multiplicación resultaesencialparala inducciónde una inmunidadmediadapor linfocitos T

(Bercheet al., 1987; Brunt et al., 1990; Chastelliery Berche, 1994),y explicapor qué esta

inmunidadno seobtienecon bacteriasmuertas.

El númerode bacteriasque consigueescapardel fagosomaantesde la fusión de éste

con el lisosomaresulta muy pequeño(Chastelliery Berche, 1994), pero suficiente para

producir las alteracionesposteriores.Estasbacterias,unavez multiplicadasen el citoplasma,

son capaces de moverse mediante un mecanismoactina-dependientee infectar células

adyacentes(Tielney y Tielney, 1993; Chastelliery Berche, 1994) sin necesidadde salir al

medio extracelular,lo que las expondríaal sistemainmune del hospedador.

Conjuntamentecon la acidificacióndel fagosomase producela explosiónoxidativa

en el fagosoma,mediantela que seaumentanconsiderablementelos compuestosde oxígeno

(peróxidos principalmente)que sirven como mecanismobactericida general, aunque no

parecentenerdicho efectoen la listetiosis(Harrington-Fowleret al, 1981; Higginbothamu

al, 1992).

Por tanto, al liberarsedel fagosomaes muy posibleque estasbacteriasdesencadenen

la muerte del macrófagopor un mecanismosimilar a la apoptosis (Greenspany Aruoma,

1994; Zychlinski u aL, 1994),quele imposibilitaríapararealizarsu misióncomo presentador

134

II

Resultadosy discusión

de antígenos.Pero la presentaciónde antígenostambiénpareceverseafectadapor la LLO

(Cluff a al., 1990); según este autor, la LLO puede inhibir esta función, evitando la

estimulaciónde los linfocitos T, y, por tanto, la activaciónmacrofágica.En el caso de la

deficienciaen selenioy vitamina E ya hemosexpuestoque las membranasde lascélulasse

encuentranafectadaspor defecto de GSHPx, y que ello implica una mayor facilidad de

Listeria parasalir del fagosoma.Estasalidaestáacompañadapor liberaciónde LLO, lo que

finalmenteimplicaríauna mayorcantidadde LLO en la célula,que podríainhibir la función

presentadorade antígenos.

Por otra parte,se ha descritoque en los animalesdeficientesen seleniola expresión

de receptorespara la 1L2 en los linfocitos T se encuentradisminuida (Kiremedjian-

Schumacherez’ aL, 1990, 1992; Roy a al., 1992, 1993).Estadisminuciónen la expresiónde

estosreceptoresconllevaríauna menoractivaciónde linfocitos T, y estamenor activación

linfocitaria implicaríauna menorproducciónde linfoquinasy, porello, unamenoractivación

de macrófagos.No debemosolvidarqueson los macrófagosactivadoslos responsablesde la

eliminación de las listerias (Harrington-Fowleret aL, 1981), y un retrasoen su activación

permitidauna mayormultiplicación de las listerias,lo quetendríacomo consecuenciael que

el individuo tuvieraque enfrentarsea un númeromayor de éstasal queinicialmentetendría

que haberhechofrente,y que, por tanto, el procesoadquirieseuna mayor gravedad.

Además, en el caso de una deficienciaen seleniose produce una disminución de

GSHPx,y, por tanto, sedisminuyela detoxicacióndel H202 cuyascantidadesaumentan.Esta

menorconcentraciónde GSHPxconlíevaunamenorcantidadde glutationoxidado,que para

su reducciónnecesitabael pasode NADPH a NADP, lo queimplica unareduccióndel NADP

disponible.En líneasgeneralesuna deficienciaen selenionos conducidaal mismopunto de

partida que los mecanismosdescritos para la apoptosis (Greenspany Aruoma, 1994;

Zychlinski u aL, 1994) ya que el excesode productosde oxigeno conlíevala alteraciónde

la membranamediantesu peroxidacióny acciónde fosfolipasas,y, como resultadode ello,

a la alteracióndel equilibrio del Ca2, rotura de las membranas,alteracióndel ADN celular,

y, finalmente, la muertecelular. La alteracióndel equilibrio del Ca2~ puedeverse agravada

en los casosde deficienciaen a- tocoferol (Eskewa aL, 1989), por lo que en nuestrocaso

la propiadeficienciacolaboradacon los fenómenosconducentesa la muertecelular.

135

Resultadosy discusión

Vemos,pues,cómo la deficienciaen selenioproduceuna alteraciónen la respuesta

inmune de base celular por un fallo en la presentaciónde antígenospor parte de los

macrófagos,y por un fallo en la activación de los mismosal estardisminuidala expresión

de los receptoresparala 1L2. Hemosseñaladoanteriormentequelos factoresque influyen en

la resistenciaa la listeriosis sebasanen la capacidadde establecerunarespuestainflamatoria

efectiva, la capacidadde los macrófagospara evitar el crecimiento bacterianoen los

momentosinicialesde la infeccióny el tiempoque setardeen instaurarunarespuestainmune

adquiridamediadapor células (Archinal y Wilder, 1988a, 1988b); todos estosmecanismos

se encuentranalteradosen los individuosseleniodeficientes,y, poreste motivo, resultarían

mássusceptiblesa la listeriosis,puestoqueestospatógenosencontraríanmayoresfacilidades

para su viabilidad en estoshospedadores.

136

¡¡ i

5. CONCLUSIONES

.1 L~ Iii

Conclusiones

PRIMERA

En el modelo experimentalmurino, los animalesdeficientesen selenioy vitamina E

presentanmayorsusceptibilidada la listeriosis,valorableen indicessuperioresde mortalidad

y en mayoresrecuentosde bacteriasa partir de órganosinternosque los gruposcontroles.

SEGUNDA

La deficienciaen selenioy vitamina E, incluso inaparente(no valorableclínica ni

histopatológicamente),podría ser consideradacomo un factor predisponenterespectoa la

listeriosis.

TERCERA

La presencia de Listeria monocytogenes, cuando es inoculada por vía oral,

simultaneamenteen los gangliossubmandibularesy mesentéricos,y con anterioridada su

recuperacióna partir de bazoe hígado,sugierela existenciade variaspuertasde entradade

estemicroorganismoen el tracto digestivo.

CUARTA

La mortalidadregistradacon la misma dosistotal inoculadaporvía oral esmayor si

ésta se fraccionaen varias tomas que si se administra en una única toma. Puestoque el

desarrollode los casosde listeriosisestáasociadoal consumode alimentoscontaminadoseste

efecto acumulativo podría tener relevancia desdeun punto de vista epidemiológico y

experimental.

OUINTA

Los recuentosde bacteriasobtenidosa partir de bazoe hígadomuestranun segundo

incrementoentre el 50 y 80 día post-inoculación,lo que sugiere la existencia de una

reactivacióntardíade la infección,cuyo tiempo de aparicióny magnitudseríadependiente

de la dosisy de la vía de inoculaciónempleada.

138

Conclusiones

SEXTA

El seguimientode la infección tras inoculaciónintragástricaofreceresultadosmenos

consistentesquelos obtenidosmedianteinoculaciónporvía oral, porlo queéstaúltimaparece

másadecuadaparareproducirexperimentalmentela enfermedad,ya quereproducemejor las

condicionesnaturalesde la infección.

SEPTIMA

Cuandoseinoculanlos serovares4b y l/2a a las mismasconcentracionesporvía oral,

con el serovar4b seobtienenrecuentosmásaltos y prolongadosen intestino, bazoe hígado.

Estehechopodríajustificar la mayor frecuenciade casosde listeriosis de origen alimentario

debidosal serovar4b.

139

¡ ¡ ¡• L ¡

6. RESUMEN

Rcsurnen

6. RESUMEN

En el presentetrabajosehaestudiadoen el modeloexperimentalmurino la influencia

de la deficienciaen selenioy vitaminaE en la susceptibilidada la listeriosis.Paraello sehan

realizadoestudiosde mortalidad,estableciéndoselas tasasde mortalidad por vía oral con

dosis únicasy repetidas,asícomo las DL50 por vía intravenosa.Asimismo, seha estudiado

lacinéticade la infecciónporvía orale intravenosa,medianterecuentosde L. rnanocytogenes

a partir de órganosinternosy tracto digestivo; se ha comparadoademás,la cinética de la

infección utilizando las vías de inoculaciónoral e intragástrica,el efectode dosisrepetidas

frente a dosis únicaspor vía oral, y la infección por vía oral entrelos serovares4b y 1/2a.

De los distintos experimentos,se han obtenido resultadosque indican una mayor

susceptibilidada la listeriosis en el caso de la citada deficiencia; que se recuperaL.

rnonocytogenesa partir de gangliosmesentéricosy submandibularesen las primerasfasesde

la infección, lo que sugiere distintos puntos de entradaa partir del tracto digestivo,

probablementeestructuraslinfoides (placasde Peyer,tonsilas,etc.); y que en la listeriosis

experimentalpareceexistir unareactivacióntardía,cuyo tiempode apariciónseríadependiente

de la dosis y la vía de inoculación.Asimismo, se ha podido comprobarque la vía oral

presentaevidentesmejorasrespectoa la intragástricaa la hora de realizarestudios~~sobrela

listeriosis;así como que la administraciónde una misma dosis fraccionadaen variastomas

produce una mayor mortalidad que si se administra en una única toma. Finalmente, la

inoculaciónpor vía oral de los serovares4b y l/2a demostróque con el serovar4b se

obtienenrecuentosmás altos y prolongadosen intestino, bazoe hígadoque en el caso del

serovarl/2a.

141

7. BIBLIOGRAFIA

I3íbliografía

ALLERBERGER,E. y GUGGENBICHLER,1. P. (1989).Lisíeriosisin Austria: reponof anoutbreakin 1986.ActaMicrobiol. Hung. 36, 149-152.

ARCHINAL, W. A. y WILDER, M. 8. (1988a).Susceptibilityof HRS/Jmice lo listeriosis: macrophageactivity.Inilecí. lmmun. 56< 6113-MS.

ARCHINAL, W. A. y WILDER, M. 5. (1988b).Susceptibilityof HRS/Jmice to listeriosis:Dynainics of infection.lnfect. linmun. 56, 607-612.

ARMSTRONG, 0. (1985).L. monocvtogenes.En ‘<Principies andpracticesof infectiousdiseases”(eds.Mandel, O.L., Douglas.R. O. y Bennet,J. E.), pp. 1177-1 186. Ed. Wiley & Sons,Nueva York.

AIOJDURJER,A., PARDON, P., MARLY, J., LANTIER, F. y LOULEGUE, J. (1981). Mesurede la virulencechezla sourisde dilférentesbactériesappartenantau genreListeria. Ann. Inst. Past. Immunol. 1320, 191-200.

AUDURIER, A., TAYLOR, A. O., CARI3ONNELLE, B. y MCLAUCHLIN, J. (1985), A phageíyping systembrListeria monocyíogenesami lis usein epidemiologicalsiudies.Clin. Invest, Med. 7, 229-232.

BACKAIL, K. A. y SCHOLZ, R. W. (1919). Referentevalueslot a fleid tesílo esúmateinadequateglutaihioneperoxida.seactiviry andseleniuni statusin theblood of cattle. Ant 3. Vet. Res.40, 733-738.

BARBOUR, A., RAMPLINO, A. y HORMAECHE,C. (1992). The infectivity of Listeriamonocyto~enesfollowinginíragastricinoculation into mice.Proc.Xliii InternationalSymposiumon dic Problemsof Listeriosis(Copenhagen)235-236.

BARLOW, R. M. y MCGORUM,E. (1985).Ovinelisterial encephalitis:analysis,hypoíbesisandsynthesis.Va. Rec.116.233-236.

BEDWAL, R. 8., NAIR, N., SHARMA, M. P. y MATEUR, R. 8. (1993>. Selenium-iísbiologicalperspectives.Mcd.lIyp. 41, 150-159.

BERCHE, P., GAILLARD, J. L. y RICHARD, 8. (1988). Invasivenessand intracellular growth of Listeriamonocytogenes.tnfect. Suppl.2, 145-148.

BERCHE, P., GAILLARO, J. L., SANSONETI”I, P., GEOFFROY, C. y ALOUF, J. E. (1987>. Towardsa belterunderstandingof dic molecularmechanismsof intracellulargrowth of Listeria monocyro~=enes.Ann. Insí. Past.Microbiol. 138, 242-245.

BERENGUER, J., SOLERA, .1., DIAZ, M. D., MORENO, 5., LOPEZ-HERCE,1. A. y BOUZA, E. (1991).Listeriosisin patienísinfeaedwith human immunodeficiencyvirus. Rey. tufecí. fis. 13,115-1190

BILLE, J. (1988). Epide¡niology of human listexiosis in Europe.Conferenciaexpuestaen el SIM. California. USA.2-5 Octubre.

BLANCO, M., FERNANDEZ-GARAYZABAL, 1. E., DOMINGUEZO L., BRIONES, V., VAZQUEZ. J. A.,BLANCO, J. L., GARCíA, .1. A. y SUAREZ, 0. (1989>. A technique for dic direcí identiticadon ofhaernoly¡ic-paíhogenlisíeria on selectiveplating media.Leí. Appl. Microbiol. 9, 125-128.

BLANCO, M. M., DOMíNGUEZ, L. y VAZQUEZ, j. A. (1993). Listeria: Deteccióne identificación.En “Listeriaen alúnentos.ConferenciaConsenso”,PP.61-80. Ed. M0 Sanidady Consumo.León.

BLENDEN, D. C., KAMPELMACHER, E. 1-1. y TORRES-ANJEL,M. . 1. (1987), Zoonosisupdate.Listeriosis. J.Am. Va. Mcd. Assoc. 191, 1546-1552.

143

B <él Lognsfía

BLENDEN, D. C. y SZATALOWICH, E. T. (1967).Ecologicaspectsof listeriosis.1. Am. Vet. Mcd, Assoc. 151,1761-1766.

BLODGEYI?, Di,, SCHURIG, 6. 6. y KORNIEGAY, E. T. (1986). linmunornodulationin weanling swine witlidietaryselenium. Am. J. Vet. Res. 47, 1517.1519.

BLOOD, O. C., RADOSTITS,O, M. y HENDERSON,J. A, (1986). “Veterinarymedicine”, Di. BailhiéreTindail.Londres.

BOYNE, R. y ARTHUR, J. R. (1990).Anaemiaami changesin erythrocytemorphologyassociatedwith copperandseleniumdeficienciesand dietaryrestriction iii rats. Res. Vet ,Sci, 49, 151-156.

BRACEGIROLE, P., FIIZGEORGE, R. B., WEST, A. A. y BASKERVILLE, A, (1992). A study of thepathogenesisof virulent and aviruíent strainsof Listeria monocyto2eneswbcn infectedvia intragastricor aerosolroutes.Proc. XIth InternationalSymposiumon the Problemsof Listeriosis(Copenhagen)241-242.

BRACKET, R. E. (1988), Presenceaudpersistanceof L. monocytogenesin food ami water. FoodTechuol. April,162-164.

BRAUN, U., FORRER,R., FURER,W. y LUIZ, H. (1991). Seleniumandvitainin E in blood seraof cowsfromfarmswith increasedincidenceof disease.Vet. Rec. 128, 543-547.

BREED, R. S., MURRAY< E. 6. 0. y SMITh, N. T. (1957),En “Bergey’sManualof DeteminativeBacteriology”,PP. s~~-sgg~Ed, The Wihliams & Wilkins Co. Baltimore.

BRIONES, V. (1990), Estudio de un método indirectoparael diagnóstico de la listeriosis,Tesis Doctoral, Fac,Veterinaria,13CM.

BRIONES, V. (1993). Factoresdel hospedadorquedeterminanla susceptibilidada la listeriosis.En “Listeria enalimentos,ConferenciaConsenso”,PP. 95-100.Ed. M” Sanidady Consumo.León.

BRIONES, y., BLANCO, M. M., MARCO, A,, PRATS,N., EERNANDEZ-GARAYZABAL, 1. E., SUAREZ,6.,DOMINGO, M. y DOMíNGUEZ,L. (1992).Biliary exeretionas possibleorigin of Listeriamonocytogenesiii fecalcarricrs. Am. 1. Vet. Res. 53, 191-193.

BROSCH.R., CATIMEL, B., BUCHRIESER,C. y ROCOURT,1. (1992).Viruleneeevaluadonof L. monocytogeness¡rains, isolatedfrom humans,foodandanimais in immunocompetentmice,Proc.XIth InternationalSymposiuinonLhe Prohlemsof Lísteriosis(Copenhagen>95-96.

BRIJNT, L. M., PORTNOY,D. A. y UNANNE, E. R. (1990). Presentationof Listerialnonoeytogenestu CD8+ Tcelis requiressecretionof hemolysinanó intracellularbacterial growth. J. linmunol. 145, 3540-3546.

BRYNER, J., WIlEY, 1. y VAN DER MAMEN, M. (1989>. Researchof listeriosis in rnilk cows willxintramammaryinoculation of Listeriamonocyto~enes.Acta Microbiol. Hung. 36< 137.140.

BURN, C. 6. (1935). Characteristiesof a new speciesof dic genusListerella obtainedfroin human sources.1.Bacteriol. 30, 373-

BURN, C. G. (1936). Chinical asid paihological featuresof an infection causedby a new pathogenof the genusListerella. Am. i, Pathol. 12, 341-348.

CAIN, D, B. y MCCANN, V. L. (1986). An unusualcaseof cutaneoushisteriosis.J. Clin. Microbiol. 23, 916-977.

JzJ4

II

Biblk¡gr$fi¡’.

CARVAJAL, A., SAMUELSSON,5,, ROTHGARDT<N. 1>. yFREDERIKSEN,W. (1989).TheIrcatmncurof Listeriamonocytogenesinfectionsin Che CentralNervousSystem.Acta Microbiol. Hung. 36. 159-164.

CHANDRA, R. K. (1985>.Effeet cfmacro-ami micronutrientdeficienciesami excesseseninnunneresponse.FeodTechnol.Fcb,, 91-93.

CHANDRA, R. K. (1989>. Nutritional regulationof immunity and risk of illness. Indian J. Pediatr.56, 607-611.

CHARLTON, K. M. y GARCíA, M. M. (1977). Spontaneouslisteric encephalitisand neuritis iii shecp.Lightmicroscopicstudies.Vet. Pathol. 14, 297-313,

CHASTELLIER, C. 14. y BERCHE, 1’. (1994).Pateof Listeria monocvto2enesin murine macrophages:evidencefor simultaneouskilling and surviva] of intracellularbacteria.Infect. Immun. 62, 543-553.

CHEERS,C., MCKENZIE, 1. E. C., PAVLOV, H., WAID, P. y YORK, J. (1978). Resistanceami suscep¡ibilityofmice to bacterialinfection: courseof listeriosisin resistantor susceptiblemice. Infect. Irnmun. 19, 763-770.

CHEERS,C. y STANLEY, E. R. (1988). Macropliageproductionduring murine listeriosis: Colony-StimutatingFactor 1 (CSF-l) and CSF-I binding celís in genetically resistaintand susceptiblemice. Infect. Irnmun. 56<2972-2978.

CLEGO,E. 6. (1975).Listerieinfectionand thegenitalsystem.Proc.VItb InternationalSymposiumen the Problemsof Listeriesis, (Nottingham)145-155.

CLUFE, C. N., GARCíA, M. y ZIEGLER, H. K. (1990). Intracellularbemolysin-producingListeriarnonocvto2enesstrains inhibit macrophage-mediatedantigenprocessing.Infect. imniun. 58, 3601-3612

COLNAGO, 6. L., JENNSEN,L. 5. y LONG, P. L. (1984a).Effect of seleniumon periphemlhicod lcucocytesofchikensinfeeted with Eimcria. Poultry Sci. 63, 896-903.

COLNAGO, 6. L., JENNSEN<L. 5. y LONG, P. L. (1984b).Effect of seleniumandvitamin E en Che developmentof inimunity te coccidiosisin chikcns. Poultry Sci. 63, 1136-1143.

CONLAN, J. W. y NORTH, R. J. (1991).Neutrophil-mediateddissoíutionof infectedhos¡celís asadefensestrategyagainsta facultative intracellularbacteriuro.J. Exp. Mcd. 174, 741-744.

CONLAN, J. W. y NORTH, R. J. (1994).Neutrophilsare essentialfor earlyanti-Listeriadefensein the liver. butnot in dic spleenor peritonealcavity, as revealedby a granulocyte-depletingmonoclenalantibody.J. Exp. Mcd. 179,259-268.

CONLAN, W. y NORTE,R. (1993).Neutrophil-mediatedlysis of infectedhepatocyíes.MM News 59. 563-567.

COOPER,R. E., DENNIS, 5. M. y HARRIS, J. 0(1973).Fractionatienof Listeriamonocytogcnesserotype5. Am.1. Vet. Res. 34, 1093-1099.

COSSART, P. y MENGAUD, J. (1989). Listeria rnonocytogenesa niodel systemfor the molecullar study ofintracellular parasnxsmMcl Exol Mcd. 6, 463-424

COX, L. i. (1989). Preventionaudcontrol of Listeriain dic foed industry.En “Feotibornelisleriosis”, PP. 100-120.Ed. Behr’s Verlag GmbH & Co. RFA.

CIJMMINS, C. 5. y HARRIS, E. (1956).The chemicalcompositionof dic ccli wall in sornegrarn-pcsilivebacteria

145

Bibliografía

asid jis pessiblevalueasa (axonemiecharacter.J. Gen. Microbiol. 14, 583-600.

CZUPRYNSKI, C. J. (1994). Host defenseagainstListeria monecytoaenes:implications for foed safety. FeodMicrobiol. II, 131-147.

CZIJPRYNSKI, C. J., CANONO, E. P., HENSON, E M. y CAMPBELL, P. A. (1985). Genetically deterniinedresiscancete listeriosisis asseciatedwith increasedaccumulaúenof inflamatoryneutrophylsaudmacrophageswhichhaveenhancedlistericidal activity. lmmunol, 55, 511-518.

DECKER, C. F., SIMON, O. L., DIGIOLA, R. A. y TUAZON, C. U. (1991).Listeria rnonocytogenesinfections iii

patienis with AIDS: reportof Vive casesami review. Rey. Infecí. Dis. 13(3), 413-417.

DEHAUMONT, PO (1993).Listeriamenecytogenesel alimentationenFrance.En Listeriaen alimentos.ConferenciaConsenso,PP. 39-53. Ed. M0 Sanidady Consumo.León.

DESCHRYVER-KECSKEMETI,K.; BANCROFT,G. it; BOSMA, O. C.;BOSMA, M. J. y UNANUE, E. R. (1988).Pathologyof Listeriainfectionin murineseverecembinedimmunodefmcieney:a studyby immunohistochemistryandelectrenmicroscopy.Lab. Invesí. 58, 698-705.

DIJKSTRA, R. O (1987).Listeriosisiii animals:clinical sigus,diagnosisandtreatmení.En Listeriosis. Reunióndela OMS, Veí. Med. Hefte 5/1987,

DIJKSTRA, R. G. (1981).The ocurrenteof L. monocytegenesin surfacewater of canaisand lakes, in ditchesofenelarge polderaud in dic effluentsandcanalsof sewagetrealmeníplant. Proc. VIIIth International Symposiumen te Problernsof Lisíeriosis (Madrid>.

DOMINGO, M., MANCEBO, J., BLANCH, L., COLL, P., NET, A. y NOLLA, J. (1986).Meningitis por Listeriamonecyíogenesen adultos.Estudiode 10 casos.Rey. Esp. Microbiol. Clin. 178, 158-163.

DOMINGO, M., MARCO, A,, PRATS,N., ALTIMIRA, 1., BRIONES, V., BLANCO. A. y DOMINGUEZ, L.(1992). Intragastrieinoculationof Listeriamonocytogenesin Che meuse.Proc.Xfth IntemationajSyrnposiu¡nen dicProblemsof Listeriosis(Copenhagen)247-248.

DOMINGO, M., MARCO, A, J., PRATS, N. y ALTIMIRA, .1. (1993). Patogeniay patologíacomparadade lalisteriosis.En Lisíeria en alimentes.ConferenciaConsenso,PP. 157-162.Ed. M0 Sanidady Consumo.León.

DOMíNGUEZ, L. (1982>.Aislamientoe identificaciónbacterianaenel géneroLisíeria(Pirie 1940).TesisDoctoral,Fac. Veterinaria,U.C.M.

DROKE. E. A. y LOERCH, S. C. (1989).Effects of parenteralseleniumasid vitainin E en perfonnance.hcalrhandhumoralimmuncresponseof steersnew te te feedlotenvironmení.J. Anim. Sel. 67, 1350-1359.

DUMONT. J. y COTONI, L. (1921). Bacille semblableá celui du reugeldo pote rencontrédaus le LCR. dunméningitiquc.Ann. Insí. Pasí.35, 625-633.

EMILE, 1. y BAZIN, C. (1975).Listeria neuromeningitisin Che adulÉ. Proc. VIth InternationalSympcsiuínen theProblemsof Listeriesis(Nottingharn)pp. 164-172.

ERREBO-LARSEN,1-1. y JENSEN,1. (1979>.Ocurrenceof hovine mastistiscausedby L. monoc’vte2enes.Proc.VIItli InternationalSymposiumen te Preblcmsof Listeriosis(Sofia), pp. 211-219.

ERSKINE, R. 1., EBERHART, R. 1., GRASSO, P. i. y SCI-IOLZ, R. W. (1989). Induction of Eseherichiaccli

146

Bibliografía

mastitis in cows fed selenium-deficientor selenium-supplememeddiesis. Am. 1. Vet. Res. 50, 2093-2100.

ERSKINE, R. J., EBERHART, Ii. J., HUTCIIINSON, L, J. y SCHOLZ, R. W. (1987). Bleod seleniumconcentradonsand glutadiioneperoxidaseactivities in dairy herdswith high and10w somaticcelí ceunts.JAVMA190, 1417-1421.

ERSKINE, R. J., EBERHART, R. J. y SCHOLZ, R. W. (1990). ExperimentallyinducedStanhvlococcusaureusmastitis in selenium-deficientaud selenium-supplementeddairy cows. Am. J. Vet. Res. 51, 1107-1111.

ESKEW, M. L., ZARKOWER, A., SCHEUCHENZUBER, W. J., BURGESS, J. R., SCHOLZ, R. W.,HILDENBRANDT, 6. y REDDY, C. C. (1989).Effects of inadequatevitamin E and/erseleniumnutritionen sihereleaseof arachidonieacid metabolitesin rat alveolarmnacrophages.Prostaglandins38, 79-89.

ESPAZE,E. P., GAIJTREAU, D., CATIMEL, B., MIEGEVILLE, A. E., ROCOURT,J. y CORTWU,A. L. (1989).An epidemiologica]survey of humanlisteñosisiii Franceduring 1987 using serotyping amI phage-typing.ActaMicrobiol. IIung. 36, 231-234.

FARBER, J. M. y PETERKIN< P, 1. (1991). Listeriamenocvtegenesa foed-bemepaChegen.Micrebiel. Rey. 55,476-511.

FENLON. D. R. (1985). Wild birds and silageas reserveirsof Listeria in Che agricultura] environment.J. ApplBacteriol. 59, 537-543.

FERNANDEZ-GARAYZABAL, J. F. (1984). Microorganismosdel géneroListeria (Pirie 1940) en leche naturalypasterizada.TesisDoctoral.Fac. Veterinaria,U.C.M.

FERNANDEZ-GARAYZABAI, J. F., DOMINGUL?, L., VAZQUEZ,J, A., BLANCO, J. L. y SUAREZ,6. (1986).Listeriamonecvtogenesdansle lail pasteurisé.Can.1, Micrebiol. 32, 149.

FLEMINO, D. W., COCHI, 8. L., MACDONALD, K. L., BRONDUM, 1., RAYES, P. 5., PLIKAYTIS, B. O.,HOLMES, M. O,, AUDURIER, A., BROOME, C. y. y REINGOLO, A. L. (1985). Pasteurizedmilk as a vehicleof infectien iii an eutbreakof listeriosis.New Eng. J. Med. 312, 404.

GAILLARO, J. L., BERCHE, P., MOUNIER, J., RICHARD, 5. y SANSONETTI, P, (1987a). In vitre model ofpenetrationasidintracellulargrowth of Listeriamonocytogenesin the humanenterocyte-likecelí line Caeo-2.Infecí.Immun. 55, 2822-2829.

GAILLARD, j. L., BERCHE,P., MOUNIER, J., RICHARD, 8. y SANSONETTI, P. (1987b).Penetrationof Listeriamonocvtogenesinto Che bosea crocial stepof die infectiousprocess.Ann. Inst. Pasí. Microbiel. 138. 259-264.

GALSWORTHY, 5. B. (1987). Role of the eclI surfacein virulence of Listeria menocytegenes.Ann. InsÉ. Pas!.Microbiol. 138, 241.284.

GARCíA, 1. A., DOMINGTJEZ, L., BRIONES, y., BLANCO, M.. FERNANDEZ-GARAYZABAL, J. E. ySUAREZ. G. (1990). Revisionof Che ntigenic stn~ctureof genusListeria. FEMS Micrebiol. Let. 67, 113-120.

GILL, D. A. (1933).Circling disease:a meningeenceplialitisof sheepin New Zealand.Notes en a new specicsofpatbogenicorganisrn.Austral. Vet. J. 89, 258-270.

GILL, O. A. (1937). Ovinebacterialencephalitis(Circling disease)anódic bacteria]genusListerella. Austral. Vel.3. 13, 46-56.

GITTFR, M. (1979).Listeriamenecvte~enesinfectionin bovine aborden.Proc. VIlth lnternatioiíalSymposiunien

147

Bibliografía

Che Problemsof Listeriosis (Sofia) pp. 193-204.

GITTER, M. (1985).Listeriosisin farmn animalsin GreatBritain. En <‘Isolation and identification of miaoorganismsof medical andveterinary importante” (eds. Collins, C. E. y Grange,LI. M.), Pp. 191-200. Ed. AcadeiniePress.Londres.

GITIER, M.< STEBBINGS< R. Sil., MORRIS,1. A., I-IANNAM, D. y HARRIS, C. (1986y Relantioshipbetweenovine listeriosis andsilage feeding. Vet. Rec. 118, 207-208.

GOLNAZARIAN, C. A., DONNELLY, C. W., PINTAURO, 5. J. y HOWARD, D. B. (1989). Comparisonofinfectiousdoseof Listeria monocytogenesF5817as determinantfor normal versuscompromisedCS7Bl/6j mice.1. FeodProt. 52, 696-701.

GOOSENS,P. L., MARCHAL, G. y MILON, 6. (1988).Early influx of Listeria-reactiveT lympbocytesin liverof mice geneticallyresistantte listeriosis,J. Inununol. 141, 2451-2455.

GOULET, y., ESPAZE, E., BASTIDE, 1. y REVIERE, 1. (1989). Human listeriosis in France in 1987. ActaMicrobiol. Hung.36, 173-176.

GOMEZ MAMPASO, E, (1993). Listeriesis humana:grupos de riesgo y portadores.En “Listeria en alimentos.ConferenciaConsenso’,PP. 141-144.114. M” Sanidady Consume.León.

GOMEZ MAMPASO, E., TERUEL, J. L., CASCALES, P., GARCíA MARTIN, F., BAQLJERO, F. y ORTUÑO,J. (1987).Portadoresfecalesde Listeria y transplanterenal.Rey. Esp. Microbiol. Clin. 2, 99-101.

GRAY, M. L. y KILLINGER, A. U. (1966). L. monocvtogenesandlisterie infections.Bacteriol. Rey. 30. 309-373.

GREENSPAN, H. C. y ARUOMA, 0. 1. (1994). Oxidative sterss andapoptosisin HIV infecrion: a role for

plant-derivedmetabeliteswidi synergisticantioxidant activity. Immunol. Today 15, 209-213.CTROVES,R. O. y WELSI-IIMER, 1-1. 1. (1977>.Separationof padiogenicfrom apathogenicListeriamenocvtogenesby diree in vitre reactions..1. Clin. Microbiol. 5, 559-563.

GYANG, E. O., STEVENS, 1? B., OLSON, W. G., TSITSAMIS, 5. D. y USENIK, E. A. (1984). Effects ofseleniuxn-vilaminE injection en bovinepolyrnorphonucleatedleukocytesphagocytosisandkilling of Ssiaphylococcusaureus.Am. j. Vet. Res.45, 175-177.

HANG< C. E., GILL, R. G., BABCOCK, 5. K., LAFFERTY, K. J., BELLGRAU< 1). y WEIL, R. (1987).Cyclosporine-inducedtolerance requires aníigenscapableof initiating an immune response.J. Immunol. 139,2947-2949.

HARRINGTON-FOWLER, L., HENSON. P. M. y WWDER, M. 5. (1981). Fate of Listeria monocvto~enesinresidentandactivatedmacropliages.Infect. linmun. 33, 11-16.

HASSAN, 5., EAKKARA]NEN, J., JONSON,L. y TYOPPONEN,J. (1990). Histopathologicaland biochemicalehangesassociaedwith seleniumaud vitaminE defíciencyin chieks. LI. Vet. Mcd. 37, 708-720.

IIIGGINBOTHAM, J. N., LIN, T. L. y PRUETT,5. B, (1992). Effcct of macrophageactivationenkilling of Listeriamonocvtogenes.Rolesof reactiveoxygenor nitrogeninterniediates,ratesof phagocytosis.aud relentionof bacteriain eridosomes.Clin. Exp. linmunol. 88, 492-498.

HILL, C. II. (1975). Interrelationshipsof selenim witb other trace elcments.Fed. Proc. 34, 2096-2100.

148

Bibliografía

l-iLRD, O. W. (1987>. Reviewof evidenceter zeonotielisteriosis.3. of FoedProt. 50, 429-433.

HIRO, D. W. y GENIGEORGIS,C. (1990).Listeriosisin foedanimals:clinical signsaixd livestock as a potentialseurceof direct (nenfoodborne)infection ter humans.En ‘<FoodbomeListeriosis” (eds.Miller, A. J <Smith, J. L,y Somkusii, G. A.), pp. 31-39.lid. Elsevier. Amsterdam.

HO, J. L., SHANDS, K. N., FRIEDLAND, O., ECKIND, P. y FRASER,D. W. (1986). An outbreakof 4b-íypeLmonocytegenesinfection involving patiensisfroin cigiit Bostonhespitals.Ascii. Intern. Mcd. 146, 520.

HOF, E. y HEFNER, P. (1988). Pathogenicityof Listeria monecvto~enesin comparisonte odierListeria species.Infect. Suppl.2, 141-144.

HÚLPHERS,0. (1911).Lefvernekrosheskanin ersakadal en ej fórnt beskrifvenbakterie.Sven.Vot. Tidskrift. 2,265-273.

HYSLOP,N. 5. 0. (1975).Epidemielogieaudirnmunelegicfactorsin listeriosis.Proc.VICh InternationalSymposiumen die Problemsof Listeriesis ~Nottingham).

IVANOV, 1. (1957>.Listériosechezles ovins el les eaprins.Buil. Oíl. mí. Epiz. 48, 511-583.

IVANOV. 1. (1962). Untersuchungenaher dic ListeriosederSehafeinBulgarien. Monaths. Veterinaenned.17,729-736.

IVANOV. 1. (1975). Establishmentof non-motile swains of Listeria monecvto~enestype 5. En “Preblemsoflisteriesis” (ed. Woedbine,M.), PP. 18-26.LeicesterUniversity Press

JAMES, 5. M., FANNIN, 5. L., AGEE, B. A., GALL, B., PARKER,E., VOGT, LI., RUN, O., WILLIAMS, J., LIEB,J.,PRISDERGAST,T., WERNER,5. E. y CHIN, J. (1985).Listeriosisoutbreakasseciatedwith Mexican-style-cheeseiii California. Morbid. Mortal. Weekly Rept. 34, 357.

JELINEK, P. D., ELLIS, T., WROTH, R. E.. SUTHERLAND, 5. 5., MASTERS. H. O. y PETTERSON,D. 5.(1988).Theeffectof seleniumsupplementationen ixnmunity, andsitie establishmentof an experimentalHaemonchuscontortusinfection, in weanerMerino sheepfed a low seleniumdiet. Austral. Vet. 1. 65. 214-217.

JONES,D. (1975).A numericalsiaxonomic studyof coryneformandrelatedbacteria.1. Gen. Microbiol. 87, 52-96.

JONES, D. (1988). Re placeof Listeria amonggrain-positivebacteria.Infect, Suppl.2, 85-88.

JONES, O., COLLINS, M. O., GOODFELLOW, M. y MINNIKIN, D. E. (1979). Chemical studies in dicclassifieasiionof Che genusLisíeria ami pxobably related bacteria. Proc. VIlth International Symposiumen CheProblemsof Listeriosis(Sofia) PP. 17-24.

JONES,O., FERESIJ,5. E. y COLLINS, M. 0. (1986). Classificationandidentification of Listeria, Brochodirix audErysinelothrix, En Listeria-Listeriosis” (eds.Courtieu, A. L., Espaze,E. P. y Reynaud,A. 119, PP. 29-34. Ed.Universidadde Nantes.Nantes.

JITRADO, R. L., FARLEY, M. M., PEREIRA, E., HARVEY, R. C., SCHUCHAL A.. WENGER, j. ~. ySTEPHENS,D. 5. (1993). Increasedrisk of meningitisandbacteremiadue te Listeria monocytogenesin patieníswitt humanimmunodefxciencyviros. Clin. Infect. 1)is. 17, 224-227.

KAMPELMACHER, E. H. y JANSEN, N. (1975). Ocurrenceof L. monecvtoeenesin effluents. Proc. VIChInternationalSymposiumen Problemsof Listeriosis (Nottingham).

149

Bib~iografís

KAMPELMACI-IER, E. E. y NOORLE JANSEN, E. M, (1969). Iselation of L. menocytogenesfroin fecesofctinicalty healtbyhumausandanimais.Zbl. Bát. 1 Att Orig. 221, 353-359.

KANDLER, O. y WEISS,N.(1986).Regular,nonsporinggram-positiverods.En “Bergey’sManualof DeterminativeBacsieriology” (eds. Sueath,P. U. A., Muir, N. 8., Sharpe,M. E. y Holt, 1. Ci.), Pp. 1208-1209.Ed. The Wittiams& Wilkins Co. Baltimnere.

KAUTTER, O. A,, SILVERMAN, 5. 5., ROESSLER,W. G. y DRAWDY, J. F. (1963). Virulence of L

.

rnonocytogenesfor experimentalaniimals.5. of Infect. Dis. 112< 167-180.

KIREMIDJIAN-SCHUMACHER, L., ROY, M., WISHE, E. 1., COHEN, M. W. y STOTZKY, G. (1990). Seleniumand immnuneccli functions.I.Effect en lymphocyte proliferationasid productionof interleukin 1 and interleukin 2.P.S,E.B.M.193, 136-142.

KIREMIDJIAN-SCHUMACHER,E., ROY, M,,WISHE< 11.1.,COHEN,M. W. y STOTZKY, Ci. (1992).Regulationof cellular immuneresponsesby seleuium.Biot. TraceEtemeutsRes. 33,23-35.

KOLLER, L. D. y EXON. J. H. (1986).TIte wo facesof selenium-defxciencyand texieity- aresimilar iii animaisami mart. Can. 1. Vet. Res. 50, 297-306.

KONGSHAVEN, P. A. L. y SKAMENE, E. (1984).Tiie roleof naturalresistancein protectionof Che murine hostfrom listeriosis. Clin. Invest. Med. 7, 253.

KOS, W. L., KOS, K. A. y KAPLAN, A. M. (1984). Impaired function of inimune reactivity te Listeriainonecytegenesin diet-fed mice. Infect. Immun. 43, 1094-1096.

KRATZ, 5. 5. y KIJRLANDER, R. J. (1988).Characterizationof Che pasiternof infkunatoryeclI influx andcyíokineproduction during tIte murine iiest responsete Listeria monocytegenes.J, Immunol. 141, 598-606.

KUHN, M., KATHARIOU, 5. y GOELLIEL. W. (1988).Hernolysin supportssurvivalhutnot entryof tIte intsacellularbacteriumListeria monocvto~enes.Infect. Immun, 56, 79-82.

LALLEMANO, A. y., GAILLARO, D. A,, PARADIS, P. E. y CHIPPAUX, C. G. (1992).Fetal listeriosisduringChe secondtrimesterof gestation.Pediatr.PaChel.12, 665-671.

LARSEN, 5. A. y SONES,W. (1972).Evaluationandstandardizationof un agglutinationtestterhuman listeriosis.Appl. Microbiol. 24, 101-107.

LARSON,8. (1979).Cíinicaldifferencesin neenatallisteriosisacquiredin uteroversuseflramaternally.Proc.VllthInternationalSympesiumen tIte Problemsof Listeriosis (Sofia) PP. 170.172.

LEE,W. IR. y MCLAIN, 0. (1986). ImprovedlIsteriamonoeyyogenesselectiveagar.Appl. Environ.Microhiol. 52.1215-1217.

LENNON, D., LEWIS, B., MANTELE, C., BECROFT, 0., DOVE, E., FARMER, K.. TONKIN, 5., YEATS. N..STAMP, R. y MICKELSON, K. (1984). Epidemicperinatallisteriosis.Pediat. Infeo. Dis. 3, 30.

LOESSNEROM. j. y BIJSSE,M. (1990). Bacteriophagetyping of Listeria species.Appl Enviren. Microbiol. 56,1912-1918.

LOPEZ, M. B.; BRIONES, y.; FERNANDEZ~GARAYZABAL, J. F.; BLANCO. M. M.; GARCíA, J. A.;DELGADO.M. C.; DOMINGO, M. y DOMIIÑGUEZ, L. (1992). Serologicalresponsein rabbits te oral inoculationwitii Listeria monocytogenes.Proc. XIth InternationalSymposiumen tIte Problenmsof Listeriosis (Copenhagen)

150

bibLiografía

LOPEZ, M. B,; BRIONES,V.; FERNANDEZ-GARAYZABAL, J. E.; VAZQUEZ-BOLAND, J. A.; GARCíA, LI.A.; BLANCO, M. M.; SUAREZ, G. y DOMINGUEZ, L. (1993). Serelegical responsein rabbits te Listeriamonocvtogenesafter oral er intragasuleineculation.FEMS Immunol. Med. Microbiel. 7, 131.134.

LORBER B (1990>. Clin. listeriosis- implicationsfor padiogenesis.En ‘Feedbornelisteriosis” (eds.Miller, A. J.,Smidi, 5. L. y Semkuti,Ci. A.), pp. 41-49. Ed. ElsevierAmsterdam.

LOVETY, 1. (1988). Isolatienand identificatienof Listeriamonocvtogenesin dairyproducis.5. Assoc.0ff. Anal.Ciiem. 71, 658-660.

LOVETT, 5. (1989).Listeria monocvto2enes.En “Feedbernebacterialpathegens”(cd. Doyle, M. 1’.). Ed. MarcelDekker Inc. NuevaYork.

LOW, J. C. y DONACHIE, W. (1991).Clinical andserumantibody responsesof lambs te infection by Listeriamonocysiogenes.Res. Vet. Sci. 51, 185-192.

LOWRY, P. D. y TIONG, 1. (1988).The incidenceof Listeriamonocvtogenesin meatandmeatproducís: factorsaffeetingdistrubinien,Proc. 34xb InternationalCongressof Meat SejenceandTechnology,Brisbane, Australia.

LUFT, B. 1. y REMIINGTON, 5. 5. (1982). Effect of pregnancyen resistancete Listeria menoeviogenesandTexoplasmagondii infectionsin mice. Infect. Iimmun. 38, 1164-1171

MACDONALD, T. T. y CARTER,P. E. (1980).Celí-mediatedimmunity te intestinalinfection. Infect. linmun. 28,5 16-523.

MAINOU-FOWLER, T., MACGOWAN, A. P. y POSTLEHWAITE, R. (1988). Virulence of Lisíeria spp.:CeuNeof infection in resistantandsusceptiblemice. J. Mcd.Microbiel. 27, 131-140.

MANDEL, T. E. y CHEERS,C. (1980).Resistanceandsusceptibility of mice te bacterialinfectien:histopathologyof listeriosis in resissiantandsusceptiblestrains.Infect. Immun. 30, 851-861.

MARCO, A., DOMINGO, M.. PRATS, N., BRIONES, y., PUMAROLA, M. y DOMíNGUEZ, L. (1991).Pathogcnesisof lympiioid lesionsin murine experimentallisteriosis.J. Comp. PaChol. 105, 1-15.

MARCO, A., DOMINGO, M., RUBERTE, J., CARRETERO,A., BRIONES, V. y DOMíNGUEZ, L. (1992a).LymphaticdrainageofLisíeria monocyto~enesandindian ink inoculatedin Che peritonealcavity of tIte meuse.Lab.Anim. 26. 200-205.

MARCO, A., PRATS,N., RAMOS, II. A.. BRIONES, V., BLANCO, M., DOMíNGUEZ, L. y DOMINGO, M.(1992b).A inicrobiological,iiistepadiologicalandimnmunohisíolegicalstudyof Che intragastrieinoculationof Lisíeriamonocytogenesin mice. 1. Comp. Padiol. 107, 1-9.

MARTE, E. U. (1988a).Diseasecharactetisriesof L. monocytonenes.FoedTeciinol. April. 165-168.

MARTH, E. H. (1988b).Ocurrenceof Listeriain foods: milk anddairyproducts.Conferenciaexpuestaen el SIM.Red Lien Inn, California, USA. 2-5 Octubre.

MCLAUCHLIN, J. (1987).Listeriamonecytebenes,recentadvancesin dic taxonomyandepidexniologyof listeriosisin humans.J. Appl. Bacteriol. 63, 1-11.

MCLAUCHLIN, 1. (1990).Distributionof serovarsof Listeriamonecvie2encsiselatedfrom diffcrent categoriesofpaticntsw¡Ch listeriesis.Eurep. 3. Comp.Microbiol. Infect. Dis. 9, 210-213.

151

II,

Bibliografía

MERO, E. y STEUER, W. (1981).Ocurrenceof L. monocyto~enesin effluent of sewagetreatmentplantsand inreceiving body river water. Proc. VIIIth InternationalSymposiumen Problemsof Listeriosis (Madrid>.

MEYER, 1). 11., BUNDUKI, M., BELIVEAN, C. M. y DONNELLY, C. W. (1992). Differencesin invasionamiadherenceof Listeriamonocytogeneswidi mammaliangut celís. FoedMicrobiol. 9, 115-126.

MIELKE, M. E. A., EHLERS,S.y IIAUN, 11. (1993). Re roleof cytoklixes in experimentallisteriosis.Linmunobiol.189, 285-315.

MIKI, K. y MACKANESS, G. B. (1964). TIte passivetransferof acquircdresistancete Listeriamonocysio2enes.J.Exp. Med. 120, 93-103.

MILLER, E. R. (1985). Mineral x diseaseinteractions.1. Anim. Sci. 60, 1500-1507.

MILLER, J. K. y BURNS, J. (1970). Histopathologyof Listeriamonocytogenesafteroral feeding te mice. Appl.Microbiol. 19, 772-775.

MURRAY, E. Ci. D., WEBB, R. A. y SWANN, M. B. R (1926). A diseaseof rabbits characterizedby a largemononuclearleucocytosiscausedby Ititiierto undescribedbacillus Bacteriummonoeytoízenes.J, PatItel. Bacteriol.29, 407-439.

MURRAY, J. M. y MURRAY< A. B. (1985). Re effects of seleniumdeficiencyand repletion en bosÉ resistancelo infection. En “Trace elementsin man and animals”, Pp. 244-247.Ed. CommonwealChAgricultural Bureau.Cambridge.

NAKANE, A., MINAGAWA, T. y KATO, K. (1988a>.Endogeneustumor necrosisfactor (Cachectin)is essentialte host resistanceagainsíListeria monocysioQenesinfection. Infect. Immun. 56, 2563-2569.

NAKANE, A., MINAGAWA, T., YASULIA, 1., YU, C. y KATO, K. (19881,). Preventionby gammainterferenoffatal infection witii Listeria monocvto2encsin mice treatedwith cyclosporinA. Infect. lmmun. 56, 2011.2015.

NAKANE, A., MINAGAWA, T., KOHANAWA, M., CHEN, Y., SATO. H., MORIYAMA. M. y TSURUOKA, N.(1989). Interactionsbetweenendogeneusgammainterferon and tumor necrosisfactor in host resistanceagainsíprimary andsecendaryListeria monocytogenesinfections.Infect. Inimun. 57, 3331-3337.

NOTERMANS, 5. y CHAKRABORTY, T. (1992). Pasibogenicityof Listeria monocvto2enes:Protectionacquiredhy infection. Proc. Xliii InternationalSymposiumen tIte Problemsof Listeriesis (Copenhagen)78-79.

NYFELIYr, A. (1932>. Klinishe und experimentelleuntersuchungenUber die Mononucleosisinfectiosa. FoliaHaematol.Leipzig 47. 1-44.

ORTEL, 5. (1989a).Listeria-meningitisand -septicaemiain immunocompromisedpatients.Acta Microbiol. 1-Jung.36, 153-158.

ORTEL, 5. (1989b). Furrher results aud expenenceswith phage-iypingof Listeria. Acta Microbiel. 1-Jung. 36,2 19-224.

(JTTER, A. y BLAKEMORE. W. F. (1989).Observationsen tiie preseiiccof Listeriarnonocytouenesin axeus.ActaMicrebiol. líung. 36, 125-132.

PIRIE, J. 11. H. (1927). A new diseaseof veldt rodents.<‘Tiger River Disease”.Pubí. 5. African Insí. Mcd. Res. 3,163-186.

152

Bibliografía

PIRIE, J. II. H. (1940). Listeria: changeof naine for a genusof bacteria.Nature 145, 264.

POHJANVIRTA, R. y HUTTUNEN, T. (1985).Someaspectsof murineexperimentallisteriosis.Acta Vet. Scand.26, 563-580.

PORTNOY, D. A. (1992). Molecular determinansisof Listeria monocytogenespasitogenesis.Infect. Inunun. 60,1263-1267.

PRATS,N., BRIONES, y., BLANCO, M. M., ALTIMIRA, J., RAMOS, J. A., DOMINGUEZ, L. y MARCO, A.(1992a).Choroiditis andmeningitisin experimentalmurine infection witii Listeriamenocytoueues.Europ.J. Comp.Microbiol. Infecí. Dis. 11, 5-8.

PRATS, N., BRIONES,V., MARCO, A., DOMINGO,M., DOMINGUEZ, L., BLANCO, M. M. y ALTIMIRA, J.(1992b). Choreiditisandmeningitisare late tesleusin experimentalmurine infectionwiíb Listeriamenoeytogenes

.

Proc.XIth InternationalSymposiumen tIte Problemsof Listeriosis (Copenhagen)253-254.

PUNG, O. J., TUCKER, A. N.. VORE, 5. J. y LUSTER, M. (1985). Influence of estrogenen hostresistance:increasedsusceptibility of mice te Listeria monoevtonenescorrelatesválh depressedproductienof interleukin-2.Infect. Imniun. 50, 91-96.

RALOVICH, B. (1975). Seleetiveand enrichmentmedia te iselate Listeria. Lii “Preblemsof listeriesis’, ed.WOODBINE, M., Pp. 286-294.LeicesterIlniversity Press.

RALOVICH, B. (1984a).Listeriosis research.Presentsituatienandperspective.AkademiaiKiado, Budapest.

RALO VICH, B. (1984b).Wiiat is Cherole of food-stuffsin transportationof Listeria, En ‘Microbial associationnandinteractionsiii foed’, Pp. 99. Ed. AkadcmiaiKiado. Budapest.

REI-TERT STABEL, .1., SPEARS,J. W., BROWN, T. T. y BRAKE, 5. (1989). Scleniumeffects en glutathioncperexidaseandChe irnmuneresponseof stressedcalvesciiallengedwitb Pasteurellaheniolvtica,J. Anim. Sci. 67,557-564.

REISS, 1-1. LI.; POTEL, J. y KREBS, A. (1951). Granulomatosisinfantiseptica.Z. Gesantz.lun. Med. 6,1-7.

RIBIERE. O., COUTAREL, P., JARLIER, V., BOUSQUET,O., BALDERACCEI, U., LECOIJTURIER,J. 1’. yí’HERVET, F. (1990). Abeesdu foie a Listeria monocytoízenes.Chez une maladediabetique. PresseMed. 19<1538-1540.

RIDGWAY, E. .1. y BROWN, 1. M. (1989>.Listeriamonocyto~enesmeningitis1w tIte acquiredimmunodet0icieneysyndrome:iimitatiens of conventionaltyping methodsin tracinga foodborneseurce.LI. Infect 19, 167-171.

ROCOURT, LI. (1988). Taxonomyof die genusListeria. Infect. Suppl.2 16, 89-91.

ROCOURT, J., GRIMONT, F., GRIMONT, P. A. D. y SEELIGER,H. P. R. (1982). [)NA relatednessamoneserovaisof Listeriamonocvsiogenessensulato. Curr. Microbiol. 7, 383-388.

ROCOURT, LI. y SEELIGER, U. P. R. (1985). La listériose: une infectien hospitaliére?Méd. Mal. Infect. 12,72h725.

ROCOtJRT,LI. WEI-IMEYER, V. y STACKEBRANDT, E. (1987).Transferof Listeriadenitrificansteanewgenuslenesiagen.nev.as LIonesiadenitrifxcanscomb.nov. Ini. J. Syst. Bacteriol. 37, 266-270.

153

BLbLiografía

ROCOURT, J. y CATIMEL, u. (1989). International PhageTyping Centerfer Listeria: report for 1987. ActaMicrobiol. Hung. 36, 225-230.

ROCOURT,5., I3OERLIN, P., GRIMONT, F., JACQUET,C. y PIFFARETTI, J. C. (1992).Assignrnentof Listeriagravi audlissieriamurravite a singlespoecies,Listeriatzrayi, with areviseddescriptionof LisItria 2rayi. lnt. LI. Syst.Bacteriol.42, 171-174.

ROLL, J. T. y CZUPRYNSKI, C. 1. (1990). Hemolysin is requiredfor extraintestinaldisse¡ninationof Listeriaínonocytogenesin intragastrieallyinoculatedmice. Infect. lmmun. 58, 3147-3150.

ROY, M., KIREMIDJL4N-SCHUMACHER,L., WISI-IE, H. 1., COHEN,M. W. y STOTZKY, Ci. (1992).Lifecí ofseleniumen te expressionof high affinliy interleukin 2 receptors.PSOE.BOM. 200. 36-43.

ROY, M., KIREMIDHAN-SCHIJMACHER,L,, WISHE, 14.1.,COItEN,M. W. y STOTZKY, Ci. (1993).Seteniumsupplementationenhanceste expressionnof interleukin 2 receptorsubunitsand intemalizationof interleukin 2.P.S.E.130M.202, 295-301.

SAUNDERS, N. A., RIDLEY, A. M. y TAYLOR, A. Ci. (1989). Typing of Listeria monocyÉo~enesforepidemiologicalstudiesusingDNA probes.ActaMicrebiol. Hung. 36, 205-209.

SCHLECH, W. F. (1990).Listerb’ animalsandman: aspectsof virulence. En ‘Foodbornelisteriosis” (eds. Miller,A. J., Smit, 1. L. y Somkuti, G. A.>. Ed. Elsevier.Amsterdam.

SCHLECH< W. F., LAVIGNE, P. M., BORTOLUSSI, R. A., ALLEN, A. C., HALDANE, E. y., HIGHTOWER,A. W., JOHNSON,5. E., KING, 5. U.,NICHOLLS, E. S.y BROOME, C. V. (1983).Epidemielisteriosis;evidenteof transmisionby foed. New Eng. .1. Med. 308, 203.

SCHLECH, W. F., CHASE, D. P. y BADLEY, A. (1986).A mt model of Listeria monocytotienesinfection via Cheoral reute: developmentandeffect of tIte gastric acidity en infectivedose.Proc. 26th Anual ASM Meeting,NewOrícaus.

SCHMIDT, Ni, y EMMONS, R.W. (1989).GeneralprincipIesof laboratorydiagnosticmethodsfer viral. rickettsialandchlamydialinfections.En ‘Diagnostie proceduresfor viral, rickettsialandchlamydialinfections” (eds. Setimidt.N.J. y Ennnons,R.W.), Ed. AmericanPublic Healtii Association,WashingtonDC.

SCHUCHAT< A., SWAMINATHAN, B. y BROOME, C. V. (1991). Epidemielogy of human listeriesis. Cliii.Microbiol. ltev. 4,169-183.

SCHULTZ, E. W.; TERRY, M. C.; BRICE, A. T. y GEBHARDT, L. P. (1934). Bacteriologicalobservatiensen acaseof meningo-encepliajitis.PSEBM 3,1021-1023.

SEELIGERR, H. P. R. (1952). Zur áetiologie der Cimnulomatosis infantiseptica und pseudetuherkulóser.Erkrankungen.Dtsch.Med. Wochenschr.77, 587-

SEELIGER.H. P. R. (1961).Listeriesis.Ed. HatberPub. Co. NuevaYork.

SEELIGER, IR. PO R. <1975). TIte contenof listeriosis.En ‘Problemsof listeriesis” (cd. Weedbine,M.). PP. 1-3.LeicestertJniversity Press.

SEEIIGER,1-1. P. R. (1976).Notion actuellesur l<epidemiolegiede la listériose.Med. Mal. Infect. 8-Qbis, 6-14.

SEELIGER, 1-1. P. R. (1981>. Apatliogenelisterien: Listeria innocuasp. nov. (SeeligercÉ Scoofs 1977).Zeniralbí.Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. Abt.l Orig. ReiheA 249, 487493.

154

BibLiografía

SEELIGER, II. P. R. (1987). Classifxcationandpathogenicityof Listeria. In Listeriosis, Reuniónde la OMS, Vet.Med. Hefte 5/1987,

SEELIGER,H. P. R. y SULZBACHER, F. (1956). Antigenic relationshipsbetweenListeria menocvte~enesaudStanhyloceccusaureus.Can, J. Microbiol. 2, 220-231.

SEELIGER, 14. P. R. y WELSHIMER, 14. 5. (1974). Genus Listeria. En ‘Bergey’s Manual of DeterminativeBacteriology’ (eds. Buchanan,R. E. y Gibbons,N. E.), PP. 593-596.Ed. TIte Williams & Wilkius Co. Baltirnore.

SEELIGER,14. P. R. y HÓIRNE, K. (1979). Seotypingof L. monocvtogenesand related species.En ‘Methods inMicrobiology’ vol. 13, Pp. 31-49. lid. AcademiePress.Londres.

SEELIGER,14. P. R. y SCHOOFS,M. (1979). Serologicalanalysisof non-iiemolyzingListeria-strainbelongingtea speciedifferentfrom Listeriamonocvtogenes.Proc. VtIth InternationalSymposiumen sihe problemsof Listeriosis(Sofia) 24-28.

SEELIGER,H. P. R., ROCOURT, J., SCHRE’ITENBRUNNER, A., GRIMONT, P. A. D. y SONES,D. (1984).Listeria ivanovii sp. nov. mt. J. Syst. Bacteriol. 34, 336-337

SEELIGER, 14. P. R. y JONES, D. (1986). Genus Listeria Pirie 1940. En “Bergey’s Manual of SystematieBacteriology’ vel.2, PP. 1235-1245.Ed. Tiie Williams & Wilkins Co. Baltimore.

SERFASS,R. E. y GAUTHER, 14. E. (1975). Defectivemicrobicida] activity in glutathioneperoxidase-deficientneutropiiils of selenium-deficiensimts.Nature 255, 640-641.

SIDDIQUE, C. 14., MCKENZIE, B. E., SAPPI,W. J. y RICH, 1’. (1985). Ligiit nial electronmicroscopicstudy oftIte livers of pregnantmice infectedwitii Listeria monocvtogenes.Am. J. Vet. Res. 39, 887-892.SKOVGAARD, N. y MORGEN, C. A. (1988). Deteetionof Listeria spp. in faecesfroro animals, in feedsand inraw feodof animal origin. Int. J. FeodMicrobiol. 6, 229-242.

SORDILLO, L. M., HICKS, C. R., WIiLSON, R. y MADDOXO 5. (1993). Effects of seleniumstatusen bovinemononuclearcelí funetion.J. Vet. Mcd. 40, 615-623.

SPALLHOLZ, J. E., BOYLAN, L. M. y LARSEN, H. 5. (1990).Advancesin understandingseleniunisrole in tIteImmuneSystem.Annais of dic New York Academy of Sciences587, 123-139.

STAMM, A. M., DISMUKES, W. E., SIMMONS, B. P., COBBS, C. Ci., ELLIOT. A., BUDRICI-I, P. y HARMAN,14. (1982).Listeriosisin renal siransplantrecipiensis:repofl of aix oubreakaud review of 102 cases.Rey. lnfect. Dis.4, 665-684.

STELMA, Ci. N., REYES. A. L., PEELER,1. T., FRANCIS,D W, HUNL ¡ M., SI’AULDING, P. L., JOHNSON.LI. L. y LOVETr, J. (1987).Patiiogenicitytestfor Listeriarnonocvtogenesusing immunocomprornisedmice.5. Cliii.Mierobiol. 25, 2085-2089

STUART. 5. E. y WELSHIMER, 11. 1. (1973). Intagenerierelaednessof Listeria Pirie. mt. J. Syst. Bacteriol. 23.8-14.

STUART, 5. E. y WELSHIMER, J. 5. (1974). Taxonotnicreexanñnationof Listeria Pirie and transferof L. ~rayiand L. muxTayi te a new genusMurraya. mt. J. Syst. Bacteriel. 24, 177-185.

SUAREZ, Ci. (1991). Epidemiologíade la listeriosis.Analesde la Real AcademiaNacional de Medicina, lomoCVIII, pp=~

155

Bibtiogcafta

TABOURET, M., DE RYCKE, J., AUDURIER, A. y POUTREL, B. (1991). Padiogenicity of Listeriamonocvtogenesisolatesin immunecompromisedmice in relation te listeriolysin producrion.J. Med. Microbiol. 34,13-18.

TEIGE, LI., LARSEN, 14. J. y TOLLERSRUD, S. (1984). Swine dysentery:die influence of dietary seleniuxnenclinical and pathologicaleffectsof Treponemahyodysenteriaeinfection. Acta Vet. Scand.25, 1-9.

TILNEY, L. Ci. y TILNEY, M. 5. (1993). The wily waysof a parasite:inductien of actin asemblyby Listeria

.

TrendsMicrobiol. 1, 25-31.TURNER, R0 J. y HNCH, 5. M. (1991). Seleniumand site immuneresponse.Proc.Nut. See.50, 275-285.

VAN VLEET, 5. F., BOON,Ci. D. y FERRANS,V. J. (1981).Inductienof lessionsof seleniuin-vitaminEdeficiencyin weanling swinefed silver, cobalt, tellurium, zinc, cadmiun,andvanadium.Am. J. VeÉ. Res.42, 789-799.

VAN VLEET, J. F., REBAR, A. 14. y FERRANS,y. 5. (1977). Acute cobaltaud isoproterenolcardiotoxicity inswine: proteetionby selenium-vitaminE supplementationandpotentiationby stress-susceptiblephenotype.Am. J.Vet. Res. 38, 991-1002.

VAZQUEZ, J. A. (1989). Citolisinasde losmicroorganismosdel géneroListeria. TesisDoctoral.Fac. Veterinaria,1.1CM.

VAZQUEZ, J. A., DOMíNGUEZ, L., FERNANDEZ,J. F., BLANCO, J. L., GOMEZ-LUCIA, E., BRIONES. V.y SUAREZ, Ci. (1988). Serologicalstudiesen L. gravi and L. murravi. J. Appl. Bacteriol. 64, 371-378.

VAZQUEZ-BOLAND,J.A.;DOMIINGUEZ, L.; BLANCO, M.; ROCOURT,J.; FERNANDEZ-GARAYZABAL, j.F.;GUTIERREZ, CH.; TASCON, RL.; RODRIGUEZ-FERRI,E.?. (1992). Epidemielogic investigationof a silage-associatedepizeotieof ovine listeric encephalitis,using a new Listeria-selectiveenumerationmediumanépiiagetyping. Am. JO Vel. Res. 53, 368-371.

VAZQUEZ-BOLAND, J. A. (1984).Anticuerposproducidosenconejosinoculadoscondistintasespeciesdel géneroListeria. Tesinade Licenciatura.Fac.Veterinaria,U.C.M.

VAZQUEZ-BOLAND, 5. A., FERRER, D. y ROCOURT, J. (1991). Heterogeneidadde las cepasde Listeriamonocytogenesaisladasde un brotedelisteriosisbumanaocurridoenValenciaen 1989.Enf.Infec.yMicrobiol.Clin.9, 442-444.

WATKINS, LI. y SLEATH, K. P. (1981). Isolation and enumerationof L. menec~qogenesfroin sewage.sewagesludge andriver water.J. Appl. Bacteriol. 50, 1-9.

WEIS, LI. (1975). The incidenceof L. monocytogenesen plantsaud soil. Proc. VICh InternationalSympesiumenProblemsof Listeriosis(Nottiugham>.

WEIS, J. y SEELIGER. II. P. R. (1975). Incidenceof L. monocysiogenesin nature. AppI. Microbiol. 30. 29-32.

WELSI-IIMER, 1-1. J. (1968). Iselatienof L. monecytogenesfrom vegetation.J. Bacteriel. 95, 300-303.

WFLSI-IIMER. U. .1. y DONKER-VOET, .1. (1971).L. monocysio~enesin ¡‘ature. Appl. Microbiol. 21, 516-519.

WELSIIIMER, fi. LI. y MEREDITH. A. L. (1971).Listeriamurrayi sp.nov.: a nitrate-reducingmanniiol-fenneníingListeria. ¡¡u, 1. Sys¡. Bacteriol. 21. 3-7.

WILKINSON, E. LI. y JONES,0. (1977). A numericaltaxonemicsurveyof Listeria and relatedbacteria.LI. Gen.

156

BibIio¡’rafja

Microbiol. 98, 399-421.

WILKIINSON, T. R. y HALL, E. R. (1971). Survival of L. monocytogenesin experimentallyinfected mice. Appl.Microbiel. 21, 108-111.

ZACHARA, B. A., MIKOLAOJCZA, J. y TRAHKOWSKA, U. (1993).Effec of variousseleniumn(Se) inlakes OiltissueSe levelsaud glutathioneperoxidaseactivities in lambs.5. Vet. Med. 40, 310-318.

ZYCHLINSKY, A., KENNY, E., MÉNARD, R., PR VOST, M. C., HOLLAND, 1. E. y SANSONE’fTl, P. J.(1994). lpaB mediatesmacrophageapoptosisinducedby ShWellaflexneri.Mcl. Microbiel. 11, 619-627.

157