Diagnostic Bacteriologique Et Serologique de La Brucellose

Institut Pasteur D’Algérie

Collection Techniques Microbiologiques

Diagnostic Bactériologiqueet Sérologique de LaBrucellose Humaine

M.N OUAR-KORICHI

H.SENOUCI

K.RAHAL

EditionsPirates

2ème Edition 2005

BIOLOGIECLINIQUE

BACTERIOLOGIE

DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE ET SEROLOGIQUE DE LA BRUCELLOSE HUMAINE IPA 2éme édition 2005

1

Déjà parus dans la collection technique microbiologique :

M.N.OUAR KORICHI –M.N-H.SENOUCI-K.RAHAL Diagnostic bactériologique et sérologique de labrucellose. ANDS 1998.33 Pages.

R.BELOUNI-H.TALI MAAMAR-K.RAHAL étude cytobactériologique et biochimique du liquidecéphalo-rachidien. ANDS 2000.52 Pages.

A.BENSLIMANI-K.RAHAL : prélèvements génitaux. ANDS 2001.128 Pages.

A.S.MERAD- H.TALI MAAMAR-K.RAHAL : Diagnostic bactériologique et antibiothérapie desinfections oculaires. ANDS 2003.40 Pages.


2

SOMMAIRE

I-INTRODUCTION : 2

II-GENERALITES 4

II-1-Définition de la brucellose : 4

II-2-Mode de transmission à l’homme : 4

II-3-Physiopathologie de la brucellose : 4

II-4-Signes cliniques de la brucellose : 5

II-5-Etiologie Bactérienne : 5

III-Epidémiologie de la brucellose : 6

III.1-Epidémiologie de la brucellose dans le monde : 6

III.2-Epidémiologie de la Brucellose en Algérie : 6

IV-Précautions à prendre au niveau du laboratoire : 8

V-Diagnostic bactériologique de la brucellose : 9

V-1-Prélèvements : 9

V-2-Modalités de culture et d’incubation : 10

V-2-1-Prélèvements mono microbiens : 10

V.2.2-Prélèvements poly microbiens : 11

V-3-Conduite à tenir devant une culture positive 12

V.3.1-Examen macroscopique des cultures 12

V.3.2-Identification du genre : 15

V.3.3-Identification d’espèce : 17

V.3.4-Détermination des Biovars 19

IV-Test de sensibilité aux antibiotiques : 22

VII-Diagnostic sérologique de la Brucellose humaine 23

VII.1-Prélèvements (3.4) : 23

VII.2-Epreuve à l’antigène tamponné (Rose Bengale) 24

VII.3-Séroagglutination de Wright (SAW) 25

VII.4-Immunofluorescence indirect (I.F.I) : 27

VII.5-Détermination des IgG, IgA, IgM par ELISA 29

VII.6-Réaction de fixation du complément (RFC) : 31

VIII-Nouvelles techniques de diagnostic : 32

VIII.1-Sérodiagnostic rapide de Brucellose humaine : 32

VII.2-Polymérase Chain Réaction (PCR) (23.24.25) 33

Annexes 34

Bibliographie


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I-INTRODUCTION :

Selon le manuel de sécurité du laboratoire« WHO » de l’OMS (Anon, 1993 a)(1) etselon les normes AFNOR X42 -040 (2), labrucellose fait partie du groupe de risqueIII.

Les micro-organismes appartenant à cetteclasse représentent une menace réelle pourle personnel de laboratoire et présententun bas niveau de risque pour lacommunauté.

Ce degré de risque varie avec la virulencedu micro-organisme (B melitensis et B suissont les plus dangereuses pour l’homme etselon le nombre de bactéries dans leprélèvement. La b brucella est un germeaérobie strict se présentant sous forme depetits coccobacilles à gram négatif,immobiles non capsulés. La croissance à35 °C sur milieu gélosé est lente (48 henviron pour avoir des colonies).l’étudedes caractères métaboliques est trèsspécifique utilisant des tests propres àcette bactérie (uréase, lysotypie…)

La brucellose est l’une des maladies lesplus facilement acquises au laboratoire ;afin d’éviter toute contagion, il estindispensable de prendre certainesmesures et précautions pour unemanipulation sans risque. (1.2).


4

II-GENERALITES

II-1-Définition de labrucellose :

La brucellose est une pathologie qui aplusieurs noms : fièvre méditerranéenne,fièvre de malte, fièvre ondulante,mélitococcie.

C’est une anthropozoonose transmise àpartir de diverses espèces animales àl’homme qui est accidentel, soit par voiecutanéo-muqueuse (contact avec unanimal infecté ou par un objet contaminé)soit par voie digestive (ingestiond’aliments contaminés tels produits lactés,fromages…)

Seules 4 espèces sont pathogènes pourl’homme :

B melitensis B abortus B suis B.canis

Certaines professions sontparticulièrement exposées tels que lesagriculteurs, les éleveurs, les vétérinaires,personnel des abattoirs et des laboratoires.

Selon A Philippon « cetteanthropozoonose a des répercussionsimportantes aussi bien pour la santépublique que pour l’économie de la plupartdes pays en voie de développement.

Sa survenue chez l’homme dépend engrande partie du réservoir animal et laplus forte incidence d’infection chezl’homme a lieu si l’infection existe chez lemouton et la chèvre.

Brucella fait partie des agents potentiels deBioterrorisme.

II-2-Mode detransmission à l’homme :

Contact direct :

Pénétration du germe par voie cutanée oumuqueuse favorisée par des blessures oudes excoriations) avec des animauxmalades par les carcasses, produitsd’avortement (placenta, sécrétionsvaginales) ou encore par contact accidentelau laboratoire avec des prélèvements.

Inhalation de poussière de litière,d’aérosols contaminés dans un laboratoire,un abattoir ou une étable.

Contact direct :

Par ingestion d’aliments contaminés (laitcru, fromage frais de fabricationartisanal…) (3.4).

II-3-Physiopathologie dela brucellose :

La brucellose est une septicémie d’originelymphatique. Elle pénètre l’organisme parplusieurs voies : cutanée, digestive ourespiratoire, puis gagne par voielymphatique le premier relaisganglionnaire et s’y multiplie.

Elle essaime par voie lymphatique etsanguine pour coloniser les organes ayantune trame réticulo-endothélialeimportante (ganglions, moelle osseuse,foie, rate).

La répartition des décharges bactériennesse traduit par une fièvre ondulante.

Des localisations ostéo-articulaires,glandulaires, hépatospléniques ouneuroméningées peuvent survenir etcontinuer à évoluer pendant la phasesubaigüe.


5

Ces germes sont phagocytés plus ou moinsrapidement par les macrophages puisdétruits avec libération d’antigènes etd’endotoxine. Ce sont des parasites intracellulaires facultatifs du système réticulo-histiocytaire (splénomégalie,hépatomégalie). Il ya réponseimmunitaire par production d’anticorpspermettant le sérodiagnostic de la maladie.Leur rôle protecteur semble réel maissecondaire par rapport à l’immunitécellulaire.

L’immunité à médiation cellulaire estessentielle pour la défense de l’organismecontre l’infection. Les lymphocytes Trenforcent l’activité bactéricide desmacrophages qui détruisent les brucellasau sein d’un granulome spécifique.

II-4-Signes cliniques dela brucellose :

Apres une incubation de 1 à 4 semaines(inoculation conjonctival, pharyngé,cutanée), diffusion lymphatique vers lesganglions avec multiplication puisessaimage dans la circulation généraleavec septicémie,

La brucellose aigue septicémiqueest caractérisée par la fièvre ondulantesudoro-algique de début insidieux associéede myalgies, d’asthénie et d’arthralgie.

Brucellose sub aigue focalisée :avec apparition de foyers infectieux uniqueou multiples tels que l’atteinte ostéo-articulaire (spondylodiscite),neuroméningées, endocardites, orchi-épididymite et hépatosplénique.

Brucellose chronique : caractérisépar une symptomatologie générale typeasthénie avec ou non poly-algie.

II-5-EtiologieBactérienne :

Le genre Brucella comprend 6 espèces surla base des critères culturaux,métaboliques et antigéniques

Brucella melitensis (1.2.3 Biovars)trouvée chez la chèvre et le mouton

Brucella abortus (1.2.3.4.5.6.9)touche les bovins.

Brucella suis (1.2.3.4.5) trouvé chezle porc et le lièvre.

Brucella canis trouvée chez lechien.

Brucella ovis chez les ovins. Brucella neotomae chez les

animaux sauvages (chevreuil,caribou, renne).

Les 4 premières espèces sont pathogèneschez l‘homme.


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III-Epidémiologie dela brucellose :

III.1-Epidémiologie de labrucellose dans lemonde :

La brucellose est de répartition mondialeavec la notion de prédominance dans lebassin méditerranéen, encore l’Asie del’ouest.

III.2-Epidémiologie de laBrucellose en Algérie :

Les premières descriptions de la maladieen Algérie on été faites en 1885 par Cochezet en 1899 par Legrain.(7)

Durant la période allant de 1984 à 1990 :éclosion d’une importante épidémie debrucellose à Ghardaïa avec plus de 600 casdue à Brucella melitensis suite à laconsommation de fromage frais de chèvre(KEMARIA).

D’autres régions ont été touchées :Tlemcen, Sétif (7.8).

Durant la période allant de 1991 à 1998 :les régions touchées étaient : Ghardaïa, ElBayadh, Saida, Biskra, Khenchela, Naama,Bechar, Msila, Tébessa, Laghouat.(7)

Le diagnostic de brucellose en Algérie estessentiellement sérologique (épreuve àl’antigène tamponné, sérodiagnostic deWright et parfois IFI et ELISA).

L’IFI et l’ELISA sont réalisées uniquementà l’IPA

Les résultats d’une étude sérologiqueréalisée dans l’unité de sérologie(Laboratoire de Bactériologie Médicale,IPA) sur 1739 sérums entre 1994 à 2003montrent 19.03 % de sérums positifs. (VoirTableau I).

L’identification bactériologique de labrucella est rarement effectuée , soit parmanque de ballons d’hémocultures , soitpar manque de matériel de Bactériologieappropriés tels que hottes masques ,lunettes, incinérateur soit par manque delaboratoire de bactériologie dans la régionet enfin soit par crainte des techniciens delaboratoire , de la manipulation de ce typede prélèvements très contagieux.

Cela peut expliquer le faible nombre desouches isolées au laboratoire deBactériologie médicale de l’IPA durant lapériode allant de 1991 à 2004. (VoirTableau 2).

Tableau I : Résultat par années des sérums positifs(H Senouci, K Rahal)

Année Négatifs Total Positifs % de Positifs

1994 75 96 21 21.87

1995 75 87 12 13.79

1996 56 62 6 9.67

1997 114 127 13 10.23

1998 129 135 6 4.44

1999 54 56 2 3.57

2000 196 292 96 32.87

2001 210 256 46 17.96

2002 290 380 90 23.68

2003 209 248 39 15.72

Total 1408 1739 331 19.03

Figure Worldwide incidence of human brucellosis(http://infection.thelancet.com).

http://infection.thelancet.com


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Tableau II : Les espèces et les Biovars deBrucella isolés au laboratoire de l’IPA de 1994à 2004 (M .Lazri, K Rahal)

Espéce/Biovar Nombre de souches

Brucella melitensis 3 65

Brucella melitensis 2 01

Brucella melitensis * 03

Total 69

(* souches isolées en 1991.1993.1995 ayant perdu le caractère lisse :le Biovar ne peut être déterminé)

Ces souches ont été isolées de maladesprésentant une fièvre au long cours dans66 cas, 2 cas présentant une endocardite etun cas présentant un abcès fessier.

Dans 67 cas les souches ont été isoléesd’hémocultures et 02 souches ont étéisolées de pus.

Les 69 souches proviennent des régionssuivantes : Tlemcen (22 souches), El Oued(17souches), Constantine (06 souches).Béni Mered (05 souches), Oran et IPA (03souches chacun), Médéa et El Kettar (02souches chacun) et 01 souche pourGhardaïa, Tébessa, Laghouat, Batna,Berrouaghia, Msila, Sétif, Béni Messous,Ain Sefra.


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IV-Précautions à prendreau niveau du laboratoire :Tous les prélèvements bactériologiques(Hémoculture, Pus, LCR, Liquide synovial, produitsd’aspiration métastatique ostéo-articulaires, urines,crachat, Placenta, sécrétion vaginale et liquideséminale, liquide articulaire) provenant d’un sujetbrucellique peuvent contenir des brucelles.(1.3.4.5.9.12.13.16).

Ces prélèvements sont contagieux par voie cutanéo-muqueuse à travers les excoriations ou au niveaudes muqueuses buccales et nasales ou par voieaérienne et conjonctivale. (3.15).

Ces modes de transmission obligent le personnel dulaboratoire à prendre les précautions suivantes :

Manipulation des prélèvements sous hotteobligatoire avec filtration d’air : Hotte à fluxlaminaire vertical (2.3.16).

L’opérateur doit porter des vêtements deprotection : blouses, gants, lunettes de protection etmasque respiratoire.

Il est interdit de pipeter à la bouche (utilisation depoire ou tube de Guillemot).

Tous les instruments utilisés pourl’ensemencement : pipettes pasteur, seringuesdoivent être immergées dans des récipients en métalautoclavables contenant de l’eau de Javel.L’ensemble de ce petit matériel sera autoclavé puisincinéré et le récipient sera autoclavé.

L’ensemencement se fait à l’aide d’une anse deplatine, l’incinérateur d’anse est indispensable afind’éviter toute projection lors de la stérilisation.

Les boites de Pétri, le prélèvement et les produitscontaminés doivent être incinérés.

Stérilisation à la chaleur (autoclave ou Poupinel) detout matériel : Plateaux, tubes en verre aprèsutilisation.

L’emploi de pipettes cotonnée st indispensable afinde ne pas contaminer le système d’aspiration(poire).

On ne doit pas mélanger une suspensionbactérienne par aspiration et refoulement à traversune pipette. Il est recommandé de faire s’écouler leliquide le long de la paroi intérieure du tube.

Vu la contagiosité importante, le diagnosticbactériologique ne peut être fait qu’au niveau d’un

laboratoire doté d’une hotte afin d’éviter toutecontamination du personnel de laboratoire.

Le travail doit être effectué dans le calme ,les gestes doivent être lents, lemanipulateur doit être concentré sur sontravail.

Toute personne travaillant sur la Brucelladoit être suivi médicalement avec uncontrôle sérologique à des temps réguliers(tous les 6 mois).

Les personnes traitées par lesimmunosuppresseurs et les femmesenceintes ne doivent pas être exposées auxbrucelles.

Matériel indispensable

Hotte à flux laminaire vertical. Lunettes de protection. Masque. Gants. Incinérateur d’anses de platine. Autoclave. Incinérateur.


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V-Diagnosticbactériologique de labrucellose :

V-1-Prélèvements :

Modalités de prélèvement :

Hémoculture :

Examen fondamental qui doit êtrepratiqué avant toute antibiothérapie :

Les hémocultures ne sont positives quependant la période aigue de la maladie.

Elles sont toujours négatives dans lesbrucelloses chronique.(3)

Milieux utilisés :

Milieu diphasique : CASTANEDA oumilieu monophasique : bouillon citraté.

Matériel utilisé :

Gants, garrot. Antiseptique. Compresses, sparadrap. Flacons d’hémocultures. Dispositif de prélèvement.

Technique :

Se laver les mains, mettre des gants

Désinfecter les bouchons des flacons d’hémocultureà l’aide de l’alcool iodé.

Laver, rincer, sécher désinfecter le point de piqure àl’aide de l’alcool iodé. (Avant bras).

Après l’asepsie, ne toucher qu’avec des doigts gantésle site de ponction pour la palpation éventuelle.

Piquer le malade, laisser couler le sang jusqu’aurepère du flacon (environ 5 à 10 ml par adulte).

Oter l’aiguille du bras du patient, mettre unpansement compressif.

Faire au moins 03 flacons d’hémoculture dans les 24H à des temps différents.

Mettre une étiquette su r les flacons d’hémoculture yinscrire : le nom, le prénom du malade, l’âge, la dateet l’heure du prélèvement, la température du maladelors du prélèvement.

Accompagner le prélèvement d’une fiche derenseignements : (voir annexe)

Faire parvenir rapidement les prélèvements aulaboratoire afin de les incuber dans une étuve à35°C.

Si le prélèvement ne peut être acheminé aulaboratoire, le laisser à la température ambiante. Nejamais mettre une hémoculture au réfrigérateur.

Le diagnostic direct ne peut se faire que dans les casde brucellose aigue ou de brucellose subaigüefocalisée ; il est basé principalement surl’hémoculture : 03 hémocultures au minimumdoivent être réalisées.

Autres prélèvements :

Pus :

Abcès superficiel ou profond.

Matériel utilisé : seringue ou écouvillon.

Liquides de ponctions :

Selon les localisations secondaires,différents prélèvements peuvent êtreeffectués : LCR, Liquide articulaire, pus,liquide de ponction, secrétions vaginales.

Ces prélèvements sont aussi contagieuxque les hémocultures.

Faire les prélèvements après unedésinfection soigneuse.


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V-2-Modalités de culture etd’incubation :

V-2-1-Prélèvements monomicrobiens :

Hémoculture :

Doit être manipulée sous hotte à fluxlaminaire.

Matériel :

Boites de Pétri de gélose au sangfrais ou de gélose au sang cuit ouTSAYe (Trypticase Soy Agaradditionné d’extrait de levure)sèche.

Bocal contenant de l’eau de Javel. Pipettes pasteur. Anse de platine. Bec Bunsen. Incinérateur d’anse. Seringues. Alcool à 70°C. Lames. Jarres ou étuves à CO2.

Mode opératoire :

Désinfecter la surface de la hotte.

Mise en marche de la ventilation.

Faire sécher les boites de Pétri de gélose au sangfrais et de gélose au sang cuit ou TSAYe.

Préparer le bocal contenant de l’eau de Javel.

Préparer les pipettes pasteur.

Préparer l’anse de platine

Allumer le bec Bunsen.

Allumer l’incinérateur de l’anse de platine.

Apres 72 H d’incubation (1) : les hémocultures d’unsujet Brucellique sont examinés en réalisant unexamen microscopique après coloration (Gram ouBleu de méthylène) et une subculture sur milieugélosé.

Prélever à l’aide d’une seringue un volume de sangaprès désinfection du bouchon d’hémoculture àl’aide d’une compresse imbibée d’alcool à 70°C.

Déposer une goutte de sang dans chacun des milieuxgélosés (GSF et GSC) et sur 2 lames afin de réaliserdes frottis.

Jeter la seringue dans le pot d’eau de Javel.

Ensemencer par stries la goutte de sang sur le milieugélosé.

Incuber sous CO2 l’ensemble des boites de Pétri(Exigence en CO2 de B.abortus) à 35 °C.

Faire les 2 frottis, laissez sécher, fixer à la flamme àl’intérieur de la hotte.

Remarque :

On peut utiliser différents milieux :

Gélose au sang cuit, gélose au sang frais.(Voir annexe).

Milieu TSAYe parfois additionné de sérum. Dans certains cas (sujets ayant reçus une

antibiothérapie préalable, micro-organismes à croissance difficile) il seranécessaire de laisser les flacons incuber àl’étuve pendant 8 semaines.

Autres prélèvements :

Manipulation sous hotte

Ganglions lymphatiques, moelle osseuse,liquide de ponction articulaire, LCR, pusde foyers suppurés. Lorsque cesprélèvements sont liquides, ils doivent êtretraités comme le sang c'est-à-direensemencés dans des flacons à doublemilieu solide et liquide (CASTANEDA) ouà défaut Bouillon citraté.

Les prélèvements de tissus et notammentde ganglions lymphatiques sont broyés(Stomacher) et ensemencés directementsur milieu solide (TSAYe. GSF, GSC).

En général les colonies de Brucellaapparaissent à partir de ces prélèvementsen 2 à 4 jours.


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V.2.2-Prélèvements polymicrobiens :

Expectoration, sécrétion vaginales doiventêtre traitées.

02 techniques sont pratiquées

Culture sur le milieu sélectif de FARELL(préparation du milieu voir annexe).

Inoculation du prélèvement à 02 cobayes :en injectant par voie sous cutanée, lescobayes sont sacrifiés l’un à la 3émesemaine et l’autre 6 à 8 semaines aprèsl’inoculation.

Le sang est recueilli pour servir à l’épreuvede séroagglutination.

Les lésions macroscopiques sont notées,on utilise la rate et d’autres tissus pourfaire des cultures.


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V-3-Conduite à tenir devantune culture positive(suspicion de Brucella)(1.3.11.15.16).

Hotte-lunette-Masques Obligatoires +++

Observation des boites après 24 Hd’incubation : toute colonie apparaissantde manière distincte n’est pas uneBrucella.

La brucella apparait en un très léger tapissur le 1er cadran de l’ensemencement après24 H d’incubation. Elle donne de bellescolonies après 72 H d’incubation.

V.3.1-Examen macroscopique descultures (3.10.16)

Sur gélose au sang cuit : les coloniesapparaissent très fines (0.5 mm dediamètre après 48H-72H à 35°C sousCO2), elles sont grisâtres blanchâtreslégèrement bombées.

Sur gélose au sang frais de cheval :elles présentent les mêmescaractéristiques morphologiques que sur lagélose au sang cuit et elles sont nonhémolytiques.

Sur TSAYe : parfois additionné desérum : les colonies atteignent 0.5 mm dediamètre après 72 h d’incubation à 35°Csous CO2, elles sont transparentes,bleutées, légèrement bombées, elles ontparfois une couleur de Miel.

Sur Milieu de FARELL : les coloniessont transparentes de 05 mm de diamètre,celles-ci doivent être repiquées etensemencées sur une boite de Pétricontenant du TSAYe. (3.16).


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V.3.1.1-Examen de la culture à laloupe à Trans-Illumination-Oblique :(Technique acquise au laboratoire BrucellaINRA-Nouzilly)

Matériel : Technique utilisée pour lesgéloses transparentes (TSAYe, FARELL) :

Loupe Lampe à illumination oblique Culture Chambre noire.

Technique :

Poser la boite sur le porte objet lecouvercle vers le haut.

Faire la mise au point.

Interprétation :

Les colonies jaune-beige sont detype rugueux (Rought).

Les colonies bleutées sont de typelisse. (Smooth).


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V.3.1.2-Examen de la cultureaprès coloration au CrystalViolet :(Technique acquise au laboratoire Brucella INRA-Nouzilly)

Pour cette technique porter desgants

Préparer un bécher contenant uantiseptique.

Inonder la boite de TSAYeensemencée, avec du Crystal violet(préparation voir Annexe) :

Laisser agir 20 secondes. Aspirer le colorant à l’aide d’une

pipette montée d’une poire.

Interprétation :

Les colonies rugueuses (Rought)sont colorées en rose –violet.

Les colonies lisses (Smooth) serontde couleur blanche.

Remarque :

Le colorant étant toxique pour la culture, ilfaut repiquer les colonies lisses (Smooth)en les aspirant à l’aide d’un tube deGuillemot, en les mettant en suspensiondans 0.4 ml d’eau physiologique afind’ensemencer les boites.

V.3.1.3-Test d’agglutination àl’Acriflavine :

Technique :

C’est une agglutination sur lame. Mettre une goutte d’Acriflavine

1/1000 (voir annexe) en contactavec la culture (colonie).

Interprétation :

Les colonies sont rugueuses(Rough) : agglutination positive.

Les colonies sont lisses (Smooth) :agglutination négative.


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V.3.2-Identification dugenre :

1-Critères morphologiquesaprès coloration de Gram :

Très fins coccobacilles à gram négatif.

2-Uréase :

Elle est recherchée sur milieu gélosé deKristensen ou sur milieu de Ferguson(attention à ne pas faire tomber le tube).(3.16)

Technique :

Prendre une boite de Kristensen ou tubede Kristensen.

Prélever à l’aide de l’anse de platine laculture bactérienne.

Ensemencer richement en pastille dans uncadran ou en strie le long de la pente.

Lecture :

Hydrolyse de l’urée (apparition d’un halotrose autour de la culture).

Mentionner le temps d’hydrolyse de l’urée.

Remarque :

Pour le milieu de Ferguson, ensemencerrichement le milieu à l’aide de la culture,incuber.

Toute coloration ros e= Uréase Positive

Toute coloration orange = UréaseNégative.

Interprétation :

Uréase (+) :B.melitensis. B .suis,B.neotomae, B.canis.

Uréase (-) : B.ovis.

3-Recherche de l’oxydase :

Se fait sur papier Whatman imbibé duréactif N-N-dimethylparaphenylenediamine, ou utilisation des disquescommercialisés. (3.16)

Technique :

Préparer la solution de N-N-dimethylparaphenylene diamine.

Imbiber le papier Whatman de ce réactif.

Prélever la culture à l’aide d’anse deplatine.

Déposer la culture sur le papier.

Lecture (+) : coloration rose violette.

Interprétation :

Oxydase (+) : B.melitensis, B abortus,B.canis, B suis.

Oxydase (-) :B.neotamae, B ovis.

NB : B.abortus est oxydase (+) sauf B abortus biovar3 isolé au Sénégal et en Guinée Bissau.(1)


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Oxydase Uréase Besoinsensérum

B.melitensis + + -

B.abortus + + -*

B suis + + -

B neotamae - + -

B ovis - - +

B canis + + -

*Brucella abortus 2 nécessite du sérumlors de la culture.

Les autres caractères bactériologiquessont :

4-Réduction des nitrates ennitrites :

Technique :

Ensemencer richement un bouillon Nitrate(attention à ne pas casser le tube en verre),incuber sous CO2.

Lecture.

Rajouter les réactifs NR1 et NR2dans le tube.

Apparition de coloration rougedans le tube

5-Catalase

Technique :

Prendre une boite de Pétri videavec son couvercle.

Mettre une goutte d’eau oxygénéedans la boite.

Déposer une colonie dans la goutte.

Lecture :

Présence de bulles d’air : catalase (+).

Remarque :

Apres avoir lu la catalase, remettrele couvercle de la boite de Pétri.

Scotcher cette dernière avant del’incinérer.

6-Autres réactions :

Citrate de Simmons négatif. RM négatif, VP négatif. Indole Négatif. Aucune acidification des glucides

par les techniques courantes.


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V.3.3-Identificationd’espèce :

Se fait par Lysotypie

V.3.3.1-Lysotypie :(Technique acquise au laboratoire Brucella INRA-Nouzilly)

Détermination de la DCE pour lebactériophage Tb

Lysotypie avec le bactériophage Tb

1-Technique :

1er jour :

Le milieu

Milieu BAB2 (Blood Agar Base N°2)+ 5 % de Sérum de cheval.

Couler la gélose dans des boites de Pétrirondes, incuber une nuit à 37°C.

Les souches

Les souches à étudier ainsi que les souchesde référence sont ensemencées sur TSAYeen pente.

Souche 544 : B.abortus biovar 1 :ATCC 23488.

Souche 16M : B.melitensis biovar1 : ATCC 23456

Souche 1330 : B.suis biovar 1 :ATCC 23444.

Phages :

On utilise la DCE (dilution couranted’épreuve) pour les phages suivants :

Tbilissi (Tb) Izatnagar (Iz). Weybridge (Wb). Et R/C.

La DCE : c’est la dilution la plus élevéepour laquelle il ya lyse totale de la bactérie.


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2ème jour

Milieu :

On utilise une boite de BAB2 + Sérum parphage.

Souches :

Préparer la suspension bactérienne :

Mettre 0.4 ml d’eau physiologique dansdes tubes de Kahn.

Préparer la culture à l’aide d’anses deplatine.

Homogénéiser la culture dans l’eauphysiologique (en réalisant des rotationstrès lentes à l’aide de l’anse de platine surla paroi du tube).

Vortexer.

Prendre un écouvillon jetable : imbiber cedernier de la suspension bactérienne.

Ensemencer les boites en stries.

Phages :

A l’aide d’une pipette pasteur effilée,prélever la dilution de phages.

Déposer une goutte de cette dilution parstries.

Laisser sécher sur la paillasse.

Incuber sous CO2 (pour les souchesexigeantes).

Lecture après 24-48 H.

2-Interprétation :

Tb Iz Wb R/C

B.melitensis - + -(PL)

-B.abortus + + + +B.suis - + + -B.neotamae +(PL) + + -B.ovis - - - +B.canis - - - +

Abréviations :

PL : Pseudo Lyse Tb : Tbilissi Iz : IzatnagarWb : Weybridge

Les phages Tb, Iz, Wb lysent les soucheslisses.(Smooth).

Le phage R/C lyse les souches rugueuses(Rough)


19

V.3.4-Détermination desBiovars (3)

4 tests permettent l’identification desBiovars et confirment l’identificationd’espèce :

1. Exigence en CO2.2. Production d’H2S.3. Test aux colorants (Thionine-

Fuschine-Safranine).4. Agglutination à l’aide de sérums

polyclonaux A et M.

1-Exigence en CO2 :

Lorsqu’une souche est en coursd’identification, il faut systématiquementensemencer 2 boites de TSAY.L’une estincubée en atmosphère normale et l’autresous CO2.

Lecture :

Exigence en CO2 (+) : B abortus Biovar1.2.3.4.9 et B.ovis.

2-Production d’H2S :

Matériel :

Gélose inclinée de BAB2. Anse de platine Bandelettes imprégnées d’acétate

de plomb.

Technique :

Ensemencer la pente d’une gélose inclinéede BAB2 à l’aide d’une anse de platinechargée de culture (ensemencer en striesserrées du bas vers le haut).

Faire pénétrer dans le tube de BAB2ensemencé une bandelette imprégnéed’acétate de Plomb sans toucher à lagélose.

Refermer le tube après avoir pliélégèrement le papier.

Les tubes sont incubés selon l’exigence ounon de la souche vis à vi du CO2.

Lecture et interprétation :

Si l’extrémité inferieure du papierest noire (au moins 1 cm dehauteur) : réaction positive.

Si l’extrémité inferieure du papierest blanche : réaction négative.

Interprétation :

Réaction (+) :

B.abortus (1.2.3.4.9) B.suis(1). B.neotamae

Réaction (-) :

B.melitensis B.canis. B.ovis Les autres Biovars de B.abortus Les autres Biovars de B.suis.


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3-Agglutination à l’aide desérums polyclonaux A et M :

Principe :

Chaque Brucelle présente 2 typesd’antigènes A et M

Selon l’espèce et le biovar il yaprédominance de l’un par rapport à l’autre.

Les anticorps anti A et anti M sontobtenus en immunisant des lapins grâce àdes souches de B.abortus et B.melitensis.

Matériel :

Lames Anse de platine Boites de Pétri Sérums Pipette effilée.

Technique :

Diluer les sérums purs au 1/15 dans del’eau physiologique phénolée.

Prendre une lame, déposer à l’aide d’unepipette effilée une goutte de sérum A.

Prélever la culture à l’aide d’une anse deplatine et la déposer à coté du sérum.

Mélanger la culture dans le sérum.

Mettre la lame dans une boite de pétrilentement afin d’éviter toute projection.

Agir en faisant des mouvements derotation.

Faire de même avec le sérum M.

Lecture :

Agglutination (+) : Présenced’agglutinats.

Agglutination (-) : Suspensionopalescente : absence d’agglutinats.

Interprétation :

A+M- :B.abortus (1.2.3.6) etB.melitensis (2),B suis(1.2.3),B.neotomae.

A-M+ :B.melitensis(1), B.abortus(4.5.9), B.suis(5).

A+M+ :B.melitensis(3), B.suis(4).

Cette technique permet de séparer lesBiovars de B.melitensis.


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4-Test aux colorants(Thionine, Fuschine,Safranine) :

Principe :

Test de sensibilité ou de résistance dessouches de Brucella vis-à-vis desdifférentes concentrations de colorants

Technique :

1er jour :

Milieu :

6 flacons de BAB2 (=95 ml) + 5 ml desérum de cheval.

Sortir les solutions de fuschine, thionine,safranine du réfrigérateur afin qu’ellesatteignent la température ambiante.

3 flacons de gélose pour la thionine :

1er flacon : ôter 1 ml de gélose fondue et leremplacer par 1 ml de Thionine : 10 T.

2ème flacon : ôter 2 ml de gélose fondue etle remplacer par 2 ml de Thionine : 20 T.

2ème flacon : ôter 4 ml de gélose fondue etle remplacer par 4 ml de Thionine : 20 T.

2 flacons de gélose pour laFuschine :

1er flacon : ôter 1 ml de gélose fondue et leremplacer par 1 ml de Fuschine : 10 F.

2ème flacon : ôter 2 ml de gélose fondue etle remplacer par 2 ml de Fuschine : 20 F.

1 flacon de gélose pour la Safranine :

1er flacon : ôter 1 ml de gélose fondue et leremplacer par 1 ml de Safranine : 10 S.

Agitez les flacons afin de bienhomogénéiser le mélange.

Couler la gélose en boite, pré incuber unenuit à 37°C.

Souches bactériennes

Ensemencer les souches de référence(1330,16M, 544) et les souches à tester surdes géloses de TSAYe inclinées.

2ème jour :

Préparer les suspensions bactériennesdans de l’eau physiologique.

Ensemencer les boites de colorants enstries à l’aide d’écouvillons imbibés dans lasuspension bactérienne.(comme pour laLysotypie).

Ensemencer les boites dans l’ordre allantdu moins au plus concentré.

Remarque :le test des colorants estgénéralement fait en même temps que lalysotypie.

Interprétation :

B.melitensis : les 3 Biovars sont résistantsà la Thionine et à la Fuschine.

B.abortus : variable selon les biovars,resistant à la Thionine (3.5.6.9) résistantpour la fuschine (tous sauf le biovar 2).

Pour la Safranine à la concentration 100g/ml, la majorité des B.suis sont inhibéesor les B.melitensis et B.abortus ne sont pasinhibées.


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IV-Test de sensibilité auxantibiotiques :

CMI : les E tests sont conseillés pourtester :

La Tétracycline ou Doxycycline Rifampicine Gentamycine Streptomycine L’association Triméthoprim-

Sulfamethoxazol.(3.17).

Exemple: Aspects de culture de B. abortus, biovars 1, 2, 3, 4et 9 en présence de 20 µg/ml de F (à gauche) et T (à droite)


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VII-Diagnosticsérologique de laBrucellose humaine

Le diagnostic de la brucellose humaine estessentiellement basé sur des techniques desérologie.

VII.1-Prélèvements(3.4) :

Il est impératif et obligatoire de se munird’une paire de gants pour toutemanipulation de produits biologiques.

La recherche des anticorps anti-Brucella sefait sur des prélèvements de sérum etéventuellement sur du LCR dans lesformes localisées des atteintesneurologiques : le sang est centrifugépendant 10 minutes à 5000 tr/mn et lesérum est recueillis sous hotte puisdécomplémenté 30 mn à 56 °C dans unbain marie, par contre le LCR ne subitaucun traitement préalable.

La recherche des anticorps anti-Brucella sefait également dans le LCR.

Cette opération « hotte etdécomplementation » est facultative, maisrecommandée pour éviter toutecontamination.

Recommandations du laboratoire du PrBRUN (Arnaud Villeneuve-Montpellier).


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VII.2-Epreuve àl’antigène tamponné(Rose Bengale) : CardTest (EAT) :

Principe (3.4.10.18) :

C’est une réaction simple et spécifiqued’agglutination rapide sur lame en milieuacide utilisant une suspension de Brucellainactivée colorée par le rose Bengale.

Elle met en évidence les IgG et se positiveplus tardivement, elle est toute fois plussensible et reste plus longtemps positiveque l’agglutination de Wright.

Mode opératoire :

Sur un support pour agglutination (lamesde verre, microplaque, carton de Bristol)déposer cote à cote 2 gouttes d’un volumeégal : 30 ul de sérum à étudier ou 60 ul deLCR + 30 ul de l’antigène tamponné.

Mélanger avec un bâtonnet, en utilisant unpour chaque sérum.

La lecture est faite au bout de 4 minutesaprès agitation.

Résultat et interprétation :

Un sérum négatif se traduit par l’absenced’agglutination et un sérum positif setraduit par la présence d’agglutinationmême minime.

Ce test est utilisé pour le dépistage. Ilconvient donc de tester les sérums positifspar des réactions quantitatives.

Le test EAT se positive 7 à 10 jours après letest du SAW.


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VII.3-Séroagglutinationde Wright (SAW) (3.4.10.18)

Principe

Le sérodiagnostic de Wright utilise uneméthode d’agglutination avec commeantigène une suspension de Brucella tuéepar le formol et la chaleur.

Le sérum de patient contenant desanticorps anti brucella provoque uneagglutination qui se traduit par un voile àla surface de la cupule, tandis que le sérumne contenant pas d’anticorps se traduit parune sédimentation au fond de la cupule.

C’est une réaction d’agglutination qui sefait en microplaque et qui met en évidencedes immunoglobulines de type IgM.

Mode opératoire :

C’est une micro méthode qui utilisecomme antigène, un antigène prêt àl’emploi commercialisé par BIORAD(réactif utilisé au laboratoire de l’IPA).

Prendre une microplaque dans le sens dela largeur et distribuer dans la cupule A1190 ul d’antigène brucellique et de lacupule B1 à H1 100 ul d’antigène Brucella.

Ajouter dans la cupule A1 10 ul de sérum(dilution 1/20).

Transférer 100 ul de la cupule A1 dans lacupule B1, mélanger soigneusement etprélever 100 ul de la B1 et la transférerdans la cupule C1 et ainsi de suite jusqu’àla cupule H1.les derniers 100 ul sont jetés.

Agiter énergiquement la microplaque etl’incuber à 37°C pendant une nuit.

Apres une nuit ou 24 H sortir lamicroplaque et l’incuber à 37 °C pendantune nuit.

Apres une nuit ou 24 H sortir lamicroplaque de l’étuve et procéder à lalecture.

Lecture et interprétation :

Une réaction positive se traduit par uneagglutination en voile à la surface de lacupule.

Une réaction négative se traduit par unpoint au fond de la cupule : dépôt del’antigène Brucella..

Pour une dilution 1/80ème , celacorrespond à un titre de 120 UI/ml selonle tableau de correspondance. Un titre >ou = à 120 UI/ml dilution 1/80ème indiqueune brucellose aigue ou active. ce taux estgénéralement dépassé lors des brucellosesaigues.

Un titre < 120 UI/ml doit éveiller lasuspicion et justifier un sérodiagnosticquelques jours plus tard.


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Lecture d’uneséroagglutination de Wrighten microplaque :

Une microplaque permet de tester11 sérums de patients plus unsérum témoin positif. Cetteméthode en tubes utilise très peud’antigènes brucelliquescontrairement à la méthode entubes.

Exemple pour un sérum testé entube on utilise 2.5 ml d’antigènesde brucella, alors que dans laméthode en microplaque on utilise800 ul d’antigènes.

Elle est plus économique et facile àlire.

Tableau de correspondance desdilutions aux valeurs des unitésinternationales

Titre en

dilu

tion

1/20

1/40

1/80

1/160

1/320

1/64

0

1/1280

1/2560

Titre en

UI

30 60

120

240

48

0

96

0

1920

384

0

Avantages et inconvénients :

C’est une réaction qui se positive assez tôtdurant la maladie (10-15 jours : c’est laplus précoce) mais se négative vite.

Elle est positive surtout en phase aigue etsubaigüe d’où son intérêt.

L’inconvénient du test est sa nonspécificité (réactions croisée avec Yersiniaenterocolitica, Vibrio cholerae etFrancisella tularensis).

1/20 1/20 1/20

1/40 1/40 1/40

1/80 1/80 1/80

1/160 1/160

1/320

1/640

1/1280

1/2560


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VII.4-Immunofluorescenceindirect (I.F.I) :

Technique non standardisée (Laboratoirede Mr Braun Montpellier) :

L’I.F.I est réalisée après avoir préparé demanière artisanale des lames aulaboratoire.

Une dilution d’antigène de brucella (voirannexe) au 1/200 est effectuée dans del’eau physiologique phénolée à 0.5 % puisdistribuée à raison de 30 ul sur chaquecercle de la lame d’IFI.

Principe :

L’IFI est une réaction de sensibilité et despécificité de qualité très appréciable

E test est en outre recommandé dans lesformes tardives et chroniques de lamaladie car il met en évidence 3 classesd’immunoglobulines : IgM, IgA et IgG.

Mode opératoire

La technique est réalisée en utilisant 3 dilutions :1/10,1/20 et 1/40.

Si le sérum du patient se positive au 1/40 il faudrapousser les dilutions de ½ en ½ et ce jusqu’àl’extinction de la fluorescence.

Prendre une microplaque et faire les dilutionssuivantes :

1/10 : 180 ul de tampon PBS + 20 ul desérum pur du malade.

1/20 : 100 ul de tampon PBS + 100 ul desérum du 1/10

1/40 : 100 ul de tampon PBS + 100 ul desérum du 1/20.

Déposer 30 ul de chaque dilution de sérum dans lescupules correspondantes (voir figure N°1).

Dans un premier temps faire 3 dilutions du sérum :1/10,1/20,1/40 et distribuer selon la figure N°1 lesdilutions de sérums à raison de 30 ul dans chaquecupule.

Placer ensuite les lames dans une chambre humideet à l’abri de la lumière 30 mn à températurenormale.

Apres ce laps de temps, procéder au premier lavageen mettant les lames à laver dans un bec rempli au¾ de tampon PBS et en les plaçant verticalementdans un support pour lames pendant 10 mn.

Renouveler le lavage une seconde fois, rincer avecde l’eau distillée quelques secondes puis sécher leslames.

Préparer pendant le deuxième lavage les dilutionsau 1/100 des immunoglobulines

900 ul de tampon PBS (voir annexe)

100 ul de bleu d’Evans (voir annexe)

10 ul d’Immunoglobulines marquées à lafluorescéine IgM, IgA et IgG (voir annexe).

Lorsque les lames sont bien sèches déposer 30 ul dechaque immunoglobuline marquée à la fluorescéinedans les cupules correspondantes à cet effet etincuber les lames dans une chambre humide à l’abride la lumière pendant 30 mn.

Apres incubation procéder aux deux lavages commecité précédemment.

Rincer avec de l’eau distillée pendant une minute.

Sécher les lames et procéder au montage de la lameavec une solution de tampon + glycérine (voirannexe) et recouvrir d’une lamelle..

Lecture :

Lire les lames à l’aide d’un microscope àfluorescence avec un objectif X 50 ou avecun objectif X40.

Un sérum positif se traduit en observantune fluorescence verdâtre des bacilles deBrucella en forme de ballons de rugby.

Un sérum négatif se traduit par uneextinction complète de la fluorescence avecun fond rouge.

Si le sérum du malade est positif au 1/40 ilfaut pousser les dilutions de ½ au ½jusqu’à extinction complète de lafluorescence.


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Interprétation des résultats :

BrucelloseAigue

IgM >1/10

IgAnégatif

IgG > ou =1/40

BrucelloseSubaigüe

IgM1/10

IgAnégatif

IgG > ou =1/40

BrucelloseChronique

IgMNégatif

IgAnégatif

IgG1/40

Avantage et inconvénients :

Ce test se positive plus tardivement quel’agglutination de Wright.

Elle est très utile en cas de brucellosechronique car elle décèle encore desanticorps spécifiques alors que les autresréactions sérologiques se sont négativées.

Les anticorps persistent à un taux élevépendant 4 mois et déclinent pourdisparaitre en 18 mois.

L’IFI est souvent le seul test positif dans labrucellose subaigüe ou chronique.


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VII.5-Détermination desIgG, IgA, IgM par ELISA

(Technique non standardisée du laboratoire du Pr MBraun, Laboratoire Arnaud de Villeneuve deMontpellier).

Principe :

La technique ELISA repose sur uneméthode immuno-enzymatique dedétection qui permet de visualiser uneréaction antigène anticorps grâce à uneréaction colorée produite par l’action surun substrat, d’une enzyme préalablementfixée à l’anticorps.

Les puits de la microplaque sontrecouverts d’antigènes de Brucella(Brucella abortus) commercialisé pardifférents laboratoires.

Les sérums de patients et ceux des témoinspositifs sont incubés à 37°C.

Les anticorps spécifiques aux antigènes dela bactérie les reconnaissent et forment lecouple antigène-anticorps.

Matériel et réactifs (voirannexe) :

Antigénation ou coating desmicroplaques :

L’antigène utilisé pour le coating de la microplaque(adsorption de l’antigène aux parois de la cupule dela microplaque) est dilué au 1/7 dans du tamponantigène (voir annexe).

Cette opération consiste à déposer dans toutes lescupules de la microplaque un volume bien précis dela dilution de l’antigène brucellique (voir annexe).

Distribuer à l’aide d’une micropipette multicanaux200 ul de cette dilution dans toutes les cupules de lamicroplaque. Elles sont ensuite recouvertes etplacées à +4°C pendant une nuit.

Le lendemain les microplaques sont lavées 4 à 5 foisavec la solution de lavage (voir annexe) puis séchées

avec du papier buvard en veillant bien à ne paslaisser aucune goutte à l’intérieur des cupules.

Les microplaques sont ensuite envelopées dans dupapier aluminium en prenant soin d’inscrire la datede préparation et la nature de l’antigène.

Conserver à – 80°C.

Mode opératoire :

Les sérums de patients doivent etre dilués au 1/101dans du tampon lait (voir annexe) :

10 ul de sérum+1000 ul de tampon lait. Bienhomogénéiser au vortex.

Repartir dans la microplaque 200 ul de sérum diluédans 4 cupules réservées pour chaque sérum :IgT,IgG, IgA, IgM.

Mettre le témoin sérum dans les premières cupules.(A.B.C.D).

Incuber les microplaques 1 heure à 37°C.

Rincer après incubation les microplaques avec lasolution de lavage à raison de 4 cycles, puis lessécher en tapotant sur du papier buvard ou parcentrifugation.

Préparer les dilutions des immunoglobulinesmarquées à la phosphatase alcaline.

Dilution des Immunoglobulines :

Ig Totales au 1/4000 5 ul d’IgT + 20 ml de tampon.

IgA au 1/3000 5 ul d’IgA + 15 ml de tampon.

IgG au 1/6000 5 ul d’IgG + 30 ml de tampon.

IgM au 1/6000 5 ul d’IgM + 30 ml de tampon.

Distribuer 200 ul d chaque conjugué à l’aide d’unepipette multicanaux dans les cupulescorrespondantes.

Incuber 1 h à l’étuve.

Procéder de nouveau aux lavages à raison de 4cycles.

Sécher les microplaques comme dans la 1ère étape.

Préparer la dilution du substrat (4nitrophénylphosphate) et mettre dans toutes lescupules 200 ul de cette dilution (voir annexe).

Couvrir la microplaque avec du papier buvard etl’incuber 30 mn à 37°C.


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Faire la lecture à 490 nm de longueur d’onde, filtre800.

Interprétation des résultats :

La dégradation du substrat par l’enzymedonne une coloration jaune qui estproportionnelle à la quantité d’anticorpscontenus dans le sérum du patient.

Formule de calcul pourl’interprétation des résultats :

0.400 :DO témoin en IgG total x DO IgTotal du sérum (S1.S2.S3 etc.…)

Calcul du coefficient multi calibreur

0.400 : DO des immunoglobulines totalesdu témoin = coefficient multi calibreur.

Ce coefficient multi calibreur seramultiplié avec tous les DO des sérumsobtenus.

La densité optique de 0.400 a été obtenueà partir d’un panel de sérums humains.

Cette technique n’est pas standardisé .c’estpourquoi certains paramètres de laformule de calcul peuvent être modifiés(technique mise au point par le laboratoirede l’hôpital Arnaud de Villeneuve deMontpellier).

Normes :

Une DO < à 0.150 ….Négatif

Une DO > à 0.250….Positif.

Une DO > 0.150 et < 0.250 ….douteux

Remarque :

Il existe actuellement sur le marché desKits ELISA qui sont commercialisés pardifférents laboratoires allemands etaméricains.

Avantages et inconvénients :

Elle est recommandée pour des recherchesépidémiologiques ou épizootiques.

On observe des réactions croisées avec lesantigènes de Francisella tularensis, deYersinia enterocolitica O9, de Vibriocholerae, de Campylobacter jejuni.


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VII.6-Réaction de fixation ducomplément (RFC) :

C’est une réaction qui n’est plus utiliséepour le diagnostic sérologique de labrucellose humaine pour son manque desensibilité.

Utilité des méthodes diagnostiques enfonction du stade de la maladie (2004) :

Stade de lamaladie

Hém

ocultu

re

Wrigh

t

Rose B

engale

IFI et E

LIS

A

RF

C

IDR

*Aigue 3+ + +/- +/- +/- -

Subaigüe + 3+ 3+ 3+ 3+ +

Chronique - +/-

+/- + +/- 3+

*IDR : Intra Dermo Réaction

Cinétique d'évolution des anticorps


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VIII-Nouvelles techniquesde diagnostic :

VIII.1-Sérodiagnostic rapidede Brucellose humaine :

Principe (19. 20. 21) :

C’est un test permettant la mise enévidence d’IgM et d’IgG spécifiques deBrucella par une immunochromatographielatérale.

Sur une bandelette poreuse, l’antigèneBrucella est déposé en une ligne selon leprincipe d’immunochromatographielatérale.

Lors de l’analyse, les anticorps spécifiquesanti brucella (IgM et IgG) présents dans lesérum du malade migrent le long de labande et se lient à l’antigène de brucella(fraction liposaccharidique préparée àpartir de Brucella abortus) fixée sur unemembrane poreuse (Stick) en une lignepermettant la mise en évidence d’unebande.

L’addition d’un réactif de détection vapermettre la visualisation du complexeantigène-anticorps.

Remarque : il existe des bandelettes pourla détection des IgM et d’autres ladétection des IgG.

Technique :

Mettre une goutte du sérum dumalade à analyser dans la fenêtrede la bandelette.

Ajouter un réactif de détection. Attendre 10-15 mn.

(Voir Annexe en Anglais)

The Royal Tropical Institute (KIT) in Amsterdam has developed the Brucella IgM and IgG Flow assays for the rapid serodiagnosis of brucellosis in human.The Brucella IgM Flow assay is designed for the detection of Brucella-specific immunoglobulin M (IgM) antibodies, and the Brucella IgG Flow assay isdesigned for the detection of Brucella-specific IgG antibodies.

+4 +3 +2 +1 Négative Négative


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VII.2-Polymérase ChainRéaction (PCR) (23.24.25)

Le test de PCR est considérée plus sensibleque les ancienne s techniques dediagnostic, cependant la sensibilité et laspécificité de la PCR varient entre leslaboratoires et aucune standardisation dela technique n’existe actuellement (E.Navarro et coll 2004)(21)

L’intérêt : rapidité du diagnostic (quelquesheures) et elle est plus sensible que lesméthodes de diagnostic traditionnelles.

Inconvénient :

Aucune standardisation de la technique, laPCR varie en fonction des laboratoires(préparation du prélèvements différents,type de gène et méthodes de détectiondifférentes) (E. Navarro et coll 2004)(21)

Exemples :

Les chercheurs Zerva et coll 2001 (22) :préconisent un test de PCR qui amplifieune séquence de gènes protéiques de 31KD de Brucella abortus a partir de sérumde malade ou du sang total.

Les résultats de l’étude révèlent unmeilleur taux de positivité dans le sérumpar rapport au sang total.

Les chercheurs Morata et coll 2003 (23) :utilisent une PCR qui amplifie uneséquence de 223 bp, puis réalisent un testELISA au lieu d’une migration sur gel avecBromure d’éthidium.

Remarque :

IDR à la melitine : est intéressante pour lediagnostic de brucellose chroniquecependant l’allergène n’est pluscommercialisé.

Le vaccin anti brucellique à usagehumain n’est plus fabriqué depuisfin 1992.

Identification moléculaire de B. abortus (A) après PCRdu gène omp31M, B. melitensis; S, B. suis

Cliché INRA-Nouzilly

Identification moléculaire de Brucella après PCR du gèneomp25 et restriction (B)(EcoRV) ou non (A)A, B. abortus; M, B. melitensis; O, B. ovis

Cliché INRA-Nouzilly


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ANNEXE 1BACTERIOLOGIE

I-composition desmilieux

1-Gélose au sang cuit :

Peptone 10g Chlorure de sodium 5 g Extrait de viande 5g Agar 20 g Eau distillée QSP 1000 ml

Apres dissolution, ajuster le pH=7.8

Autoclaver 126 °C. Pendant 30 mn

Ajouter 5 % de sang de cheval ou demouton après avoir fait fondre le milieu.

La gélose de base ainsi que le sang sontcommercialisés par l’IPA.

2-Gélose au sang frais :

Même formule que la gélose ausang cuit

Additionner de 5 % de sang decheval ou de mouton quant lagélose atteint 50°C.

3-TSAYe (commercialisé parl’IPA) :

Biotrypticase 17 g Chlorure de sodium 5g Biosayase 3 g Dipotassium Hydrogénophosphate

2.5 g Glucose 2.5 g Agar 15 g Extrait de levure (Gibco) 1 g Eau distillée QSP 1000 ml

Préparation :

PH = 6.9 à 7.1

Apres dissolution, porter àébullition.

Autoclaver à 121° C pendant 30mn.

4-Milieu sélectif : Milieu deFarrell modifié (INRA Nouzilly)

Protéase peptone 15 g Extrait de foie digéré 2.5 g Extrait de levure 5g Chlorure de sodium 5g Agar 12 g Eau distillée 1000 ml.

Préparation :

Cette gélose est préparée puis autoclavée à121 °C.

Laisser refroidir jusqu'à 56°C.

Ajouter 5 ml de solution filtrée de sérumcontenant 20 % de dextrose dans 95 ml demilieu.

Ajouter les antibiotiques suivants :

Cycloheximide 100 mg/l Polymyxine B sulfate 25000 U. Vancomycine 20 mg Acide nalidixique 5 mg Nystatine 100 000 U

5-Préparation du milieu deKristensen

Pour 1 litre d’eau distillée :

Bacto-peptone 1 g NaCl 5g KH2PO4 2g Rouge de phénol 0.012 g Glucose ou Dextrose 1g Bacto-Agar 20 g.

Préparation :

Dissoudre à froid les produitschimiques dans un peu d’eaudistillée.


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pH à 6.8 Repartir en flacon de 50 ml. Stériliser 20 mn à 120°C. Rajouter 5 ml d’urée à 20 % (20 g

pour 100 ml d’eau distillée) filtrerà 0.45 U.

6-Milieu BAB2

Protéase peptone 15 g Liver digest ou viande foie digest

2.5 g Extrait de levure 5 g Chlorure de sodium 5 g Agar 12g

pH = 7.4

Autoclaver à 121°C pendant 20 mn.

7-Milieu TSB : BouillonTrypticase Soja

Bio trypticase 17 g Bio soyase 3g Chlorure de sodium 5 g Dipotassium hydrogenophosphate

2.5 g Glucose 2.5 g Eau distillée QSP 1000 ml.

Préparation :

PH : 6.9-7.1 Repartir le milieu dans des flacons

de 100 ml. Autoclaver à 121°C pendant 30 mn. Ajouter 15 % de Glycérol dans 100

ml de TSB.

II+Réactifs et colorants :

1-Préparation du Crystal violet :

Dans un bol avec broyeur (Pilon) :dissoudre 2 g de Crystal violet dans20 ml d’éthanol absolu.

Dissoudre 0.8 g d’oxalated’ammonium dans 80 ml d’eaudistillée.

Regrouper les 2 solutions (au total100 ml).

Diluer au 1/40 juste avant l’emploi.

2-Préparation de l’Acriflavine1/1000 :

0.1 g d’Acriflavine + 100 ml d’eaudistillée.

La solution est conservée à +4°Cpendant des années.

3-Préparation du réactifd’oxydase :

Prendre une pincée du réactif NN-dimethyl para Phénylène diamineet VP-hemioxalate salt l’introduiredans un tube à vis (12-18 ml) + 4-5ml d’eau distillée.

Agiter au vortex. Imbiber un morceau de papier

Whatman à l’aide de cette solution.

Remarque : la poudre doit être conservée à+4°C et manipulée sous hotte avec desgants.

4-Préparation de bandelettesd’Acétate de plomb : recherched’H2S (identification du biovar) :

Préparer de la solution à 10 %d’acétate de plomb :

Peser 10 g de poudre d’acétate deplomb, ajouter 100 ml d’eaudistillée.

Laisser sécher à l’air.(T° dulaboratoire)

Découper des bandelettes de 12 cmde long et de 1 cm de large.

5-Préparation des solutions descolorants (tests aux colorants) :

Thionine 0.1 % : Prendre 0.1 g deThionine pour 100 ml d’eaudistillée. Ou 0.05 g de Thioninepour 50 ml d’eau distillée.


36

Fuschine 0.1 % : Prendre 0.1 g deFuschine pour 100 ml d’eaudistillée. Ou 0.05 g de Fuschinepour 50 ml d’eau distillée.

Safranine 0.1 % : Prendre 0.1 g deSafranine pour 100 ml d’eaudistillée. Ou 0.05 g de Safraninepour 50 ml d’eau distillée.


37

Conservation des souchesde Brucelles :

Conservation de courtedurée : 2 mois environ(technique INRA Nouzilly Tours) :

Incuber 24 h à l’étuve à 35°C, desgéloses en pente inclinée de TSAYeafin de contrôler la stérilité.

Ensemencer la souche de brucellapar stries serrées tout au long de lapente d’une gélose inclinée deTSAYe à l’aide d’une anse deplatine.

Stériliser l’anse de platine dansl’incinérateur, puis dans la flammedu bec bunsen.

Incuber une nuit la gélose inclinéede TSAYe à l’étuve à 35°C.

Apres une nuit d’incubation,déposer les tubes bien refermésdans le réfrigérateur à +4°C.

Conservation de longuedurée : (technique Maison Alfort).

Préparer 100 ml de bouillonTrypticase Soja (TSB) additionnéde 15 % de Glycérol (voir annexe 7).

Bien mélanger avec la pipette,prélever 2 ml de cette solution dansun tube à hémolyse.

Prélever à l’aide d’une pipettepasteur le maximum de colonies àpartir d’une culture pure debrucella et ensemencer un tube àhémolyse contenant du TSB + 15 %de glycérol.

Repartir les 2 ml de la suspensionbactérienne dans 2 cryotubes à visextérieure.

Congeler à -20°C. Les souches peuvent être

conservées au moins 05 ans, il faut

éviter de les congeler et de lesdécongeler trop souvent.

Veillez faire pour chaque soucheplusieurs exemplaires et plusparticulièrement pour les souchesde référence appelées à êtreutilisées fréquemment.


38

Transport desprélèvements deBrucella :

Selon OMS 09-2004-DépartementMaladies transmissibles surveillanceet action (5)

Selon l’OMS-Sécurité sanitaire mondiale-Transport des substances infectieuses.

Considérations générales relatives auxamendements adoptés dans la 13ème

révision du règlement type des NationsUnies pour le transport des substancesinfectieuses.

Réduction des risques :

Les risques encourus par ceux quis’occupent du transport des substancesinfectieuses peuvent être réduits endifférents points de la chaine d’infectionpar emballages appropriés.

La clé de la maitrise efficace du risque etde sa réduction au minimum se trouvedans le choix de l’emballage le plusapproprié.

Un emballage approprié offre les barrièresphysiques nécessaires et suffisantes pouréviter une fuite du produit vers l’extérieur.

Le triple emballage comprend :

Un ou plusieurs récipients primairesétanches emballés dans un emballagesecondaire, de façon à ne pouvoir êtrebrisées percés ou à ne pouvoir libérer leurscontenus dans l’emballage secondaire.

Un emballage secondaire étanche protégépar un emballage extérieur solide.

Des matières de rembourrage et desmatériaux absorbants qui doivent êtredisposés entre le(s) récipient(s)primaire(s) et l’emballage secondaire enquantité suffisante pour absorber tout le

contenu du (des) récipient(s) de sorte quetoute fuite de substance liquide ne porterapas atteinte à l’intégrité des matières derembourrage ou de l’emballage extérieur.

L’utilisation du triple emballage permetd’assurer efficacement depuis des annéesle confinement des substancesinfectieuses.

Exemples de matières infectieusesclassées dans la catégorie A

Micro-organisme

Brucella abortus (cultures seulement)

Brucella melitensis (cultures seulement)

Brucella suis (cultures seulement).

Exemples de matières infectieusesclassées dans la catégorie B.

Matière infectieuse qui ne répond pas auxcritères de la classification dans lacatégorie A.

Les matières infectieuses de la catégorie Bdoivent être affectées au N° ONU 3373.

Nota : la désignation officielle de transportpour le N° ONU 3373 est « échantillons dediagnostic » ou « échantillons cliniques ».


39

FICHE DE RENSEIGNEMETS NOM :…………………………………

PRENOM : …………………………………

AGE : …………………………………

FONCTION : …………………………………

MALADE HOSPITALISE EXTERNE : …………………………………

LIEU D’HOSPITALISATION : …………………………………

MEDECIN TRAITANT : …………………………………

ADRESSE ET N° DE TELEPHONE : …………………………………

SITUATION FAMILIALE : …………………………………

ADRESSE PERMANENTE : …………………………………

FEMME ENCEINTE : OUI ◊ NON◊

SIGNES CLINIQUES

FIEVRE : OUI ◊ NON◊ DUREE : …………………………………

ARTHRALGIES: OUI ◊ NON◊ DUREE : …………………………………

SUEURS NOCTURNES: OUI ◊ NON◊ DUREE : …………………………………

TEMPERATURE : …………………………………

FRISSONS: OUI ◊ NON◊ DUREE : …………………………………

ASTHENIE: OUI ◊ NON◊ DUREE : …………………………………

AUTRES SIGNES………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

TESTS BIOLOGIQUES PRATIQUES ET RESULTATS :……………………………………………………………………………………….

NOTION EPIDEMIOLOGIQUES

PATIENT HABITANT EN MILIEU RURAL : OUI ◊ NON◊

SI OUI CITEZ LA REGION …………………………………

LE PATIENT A-T-IL DU BETAIL : OUI ◊ NON◊

SI OUI LEQUEL ?: …………………………………

Y’A-T-IL DES CAS D4AVORTEMENTS AU NIVEAU DU BETAIL ; …………………………………

Y’A T4IL UNE NOTION DE CONSOMMATION DE PRODUITS LAITIERS NON PASTEURISES (FROMAGE-LAIT) :…………………………………………………………………………………………………………

TRAITEMENT ANTIBIOTIQUE :

TRAITEMENT RECU: OUI ◊ NON◊

LESQUELS; …………………………………

LE TRAITEMENT ANTIBIOTIQUE EST IL SUPERIEUR OU INFERIEUR A 1 MOIS; …………………………………

DATE DU DEBUT ET DUREE DU TRAITEMENT : …………………………………

PRELEVEMENT :

NATURE DU PRELEVEMENT: …………………………………

NOMBRE DE PRELEVEMENTS: …………………………………

DATE DU PRELEVEMENT : …………………………………


40

ANNEXE 2

SEROLOGIE

Réactifs et matériels :

Réactifs

Antigène brucella fournis par leslaboratoires BIORAD code 63241 ouOXOID code 02.01.02260 (Ag Brucellamelitensis) et 02.01.02619 (B.abortus).

Antigène rose Bengale pour le testd’épreuve à l’antigène tamponnécommercialisé par BIORAD code 63231 ouBIOMERIEUX code 72691 (Brucella solidetest) ou OXOID code 02.01.02621.

Préparation des tampons pour ELISA :

1-Solution mère pour tamponoxygène et tampon substrat :

NaHCO3 (solution A) 84 g/l Na2CO3 (solution B) 106 g/l.

2-Tampon antigène PH 9.6

Solution A 70 ml Solution B 30 ml NaN3 0.2 g (pour conservation) Compléter à 1 l d’eau distillé.

3-Tampon substrat PH 9.6

Solution A.29 ml Solution B.20 ml MgCl2+6H2O 0.203 g NaN3 0.2 g Compléter à 1 l d’eau distillé.

4-Tampon Lait-Sérum PH 7.3

Il sert à la dilution des sérums etdu conjugué

Na H2 PO4-H2O 1.31 g Na2 H PO4-2H2O 7.208 g ou

Na2HPO4-2H2O 14.49 g

MgCl2,6H2O 0.203 g NaCl 8g Tween 20: 0.5 ml. NaN3 : 0.2 ml

Compléter à 1 l d’eau distillée.

5-Solution de lavage :

Nacl 8.5 g Tween 20 0.5 ml NaN3 0.2 ml Compléter à 1 l d’eau distillée.

6-Tampon lait :

1 g de lait Régilait (existant dans lecommerce) pour 10 ml de tampon sérum.

Préparation du substrat : 4Nitrophényl phosphate di sodium saltpeser 0.010 g dans 10 ml de tamponsubstrat PH 9.6.

Préparation du tampon PBS, Tween20 PH 7.4

NaCl 7.65 g Na2HPO4 0.72 g KH2PO4 0.21 g

Compléter avec 1 l d’eau distillée.

Solution de montage pour lamesd’IFI :

Utiliser 1 volume de glycérine pour 2volumes de tampon PBS.


41

Matériel utilisé pour les techniques :EAT, SAW, IFI, ELISA :

Plaques pour agglutination Agitateur pour microplaque Bain marie Bâtonnets ou à défaut pipettes

pasteur à extrémités non cassées. Micropipette de 100 ul avec

embouts. Micropipettes multicanaux de 200

ul avec embouts. Tubes de Kahn Portoirs métalliques Etuve à 37°C. Hotte. Lames Téflon cerclées pour IF. Microplaque en forme U Greiner

avec couvercle. Papier Buvard. Papier aluminium Microscope à fluorescence. Lecteur ELISA avec imprimante. Laveur de microplaque. Bacs et porte lames pour lavage des

lames d’IFI.


42

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Ed INRA, Paris .P190.

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44

RemerciementsNos remerciements vont à :

Pr Belkaid directeur de l’institut pasteurd’Algerie qui nous a permis d’editer cefascicule.

Mr JM Verger et Mme M Grayon dulaboratoire de Brucellose à l’INRA Nouzillyqui nous ont permis d’acquerir lestechniques bacteriologiques du diagnosticde la brucellose.

Mr Brun du laboratoire de sérologie de labrucellose humaine,laboratoire arnaudVilleneuve de Montpellier.

Nous tenons à remercier le personneltechnique (H Senouci et M Lazri) quimanipule les prelevements de brucelloseau laboratoire de bacteriologie médicaleHumaine.IPA.

Royal Tropical Institute / Koninklijk Instituut voor de Tropen (KIT) 3-9-2002

Brucella IgM / IgG Flow assay Brucella-specific immunoassays for use on human serum or whole blood samples

Instructions for use Intended use:

The Royal Tropical Institute (KIT) in Amsterdam has developed the Brucella IgM and IgG Flow assays for the rapid serodiagnosis of brucellosis in human. The Brucella IgM Flow assay is designed for the detection of Brucella-specific immunoglobulin M (IgM) antibodies, and the Brucella IgG Flow assay is designed for the detection of Brucella-specific IgG antibodies.

Introduction:

Brucellosis is a zoonosis caused by Brucella abortus, B. suis and B. melitensis. Clinical manifestations of brucellosis in human are variable and often are non-specific, and the diagnosis requires confirmation by laboratory testing. The Brucella IgM and IgG Flow assays provide an indirect measure for infection through the detection of specific antibodies. Specific IgM antibodies usually predominate early in the disease. Specific IgG antibodies may remain present for a much longer period and predominate in persistent infections and during relapse. The Brucella IgM and IgG Flow assays are relatively simple and rapid assays. The assays require neither special training, equipment nor electricity. Results are obtained in 10 to 15 minutes. The assays and the running fluid can be stored at +2° C to +25° C.

Principle:

The Brucella Flow assay is a one step immunochromatographic lateral flow assay. A lipopolysaccharide antigen (LPS) prepared from a culture of B. abortus is immobilised in a discrete line on a porous nitrocellulose membrane located in the test zone. The assay utilises a dried detection reagent deposited within the device. The mobile detection reagent consists of anti-human antibodies labelled with red colloidal gold particles. The Brucella IgM Flow assay uses anti-human IgM antibodies and the Brucella IgG Flow assay uses anti-human IgG antibodies. To perform the assay a serum sample is placed in the sample port. Running fluid is added to solubilize the detection reagent and to carry the serum molecules and detection reagent through the porous membrane in the test zone. Antibodies in the serum that are specific for Brucella attach to the LPS antigen and these antibodies will be stained by binding of the detection reagent. The presence of specific IgM antibodies will be revealed by the appearance of a red line in the test zone in the Brucella IgM Flow assay. A red line will appear in the test zone in the Brucella IgG Flow assay when specific IgG antibodies are present. If the sample does not contain Brucella-specific IgM or IgG antibodies, the sample and detection reagent will pass over the test zone and no line will appear in the test zone. With any sample a red line should appear in the control zone. The control ensures that the detection reagent is still active.

Test kit and labelling:

Brucella IgM Flow assays and Brucella IgG Flow assays are supplied as separate kits. Each kit contains 25 individually wrapped assay devices together with 1 bottle of running fluid, sufficient for the analysis of 25 serum samples. One plastic reusable pasteur pipet.

• Note: plastic devices are not labelled individually and should be marked “IgM” or “IgG” by the user Utensils not provided:

Micropipet and disposable pipet tips for application of serum Lancet and heparinised 50ul capillary for collection and application of whole blood.

Storage:

Brucella Flow kits should be stored at +4° C to +25° C, in a dry place and protected from direct exposure to sunlight for optimal performance. Individual devices may be stored at +25° C to +45° C for short periods.

Expiry date: The date of manufacturing is printed on the packaging. When stored properly tests may be used for at least two years after the date of manufacturing

Precautions:

Blood and serum samples should be handled with care as they are potentially infectious. Equipment and supplies for specimen handling should be treated accordingly. Used Brucella Lateral Flow devices, disposables and samples should be properly decontaminated and discarded.

Specimen collection:

Serum should be prepared in the same way as routinely performed for any serological assay. Freshly collected samples should be used. Serum samples stored at -20° C may be used as well. Whole blood samples may be collected by fingerprick with a lancet and a glass capillary coated with an anticoaggulant

Standard assay procedure for serum:

1. Remove a Brucella Flow assay device from the packaging and place on a bench top with the test window facing upwards. Mark IgM test “M” and IgG test “G”.

2. Spot 5µl of serum to the sample pad in the round sample port using a micropipet and a disposable pipet tip.


2

3. Immediately add 130µl running fluid to the round sample port. The running fluid may be added using a micropipet or using

the plastic Pasteur pipet provided. When using the Pasteur pipet just transfer enough running fluid to completely fill the round sample port. Keep the Pasteur pipet for later use.

4. You will see a colour moving across test and control zones. This shows that the test is working. 5. Read results at 10 to 15 minutes. 6. Results are stable for a further 10 to 15 minutes; thereafter false results may occur.

Standard assay procedure for whole blood :

1. Remove a Brucella Flow assay device from the packaging and place on a bench top with the test window facing upwards. Mark IgM test “M” and IgG test “G”.

2. Collect 10µl of whole blood from finger prick with the anticoagulant coated capillary. Place the tip of the capillary on the sample pad to make direct contact with the pad. The pad thus will drain the blood sample from the capillary

3. Immediately add 130µl running fluid to the round sample port. The running fluid may be added using a micropipet or using the plastic Pasteur pipet provided. When using the Pasteur pipet just transfer enough running fluid to completely fill the round sample port. Keep the Pasteur pipet for later use.

4. You will see a colour moving across test and control zones. This shows that the test is working. 5. Read results at 10 to 15 minutes. 6. Results are stable for a further 10 to 15 minutes; thereafter false results may occur.

Note: the use of whole blood instead of serum may give some background staining in the test window. However this does not influence the reading of the test result.

Interpretation of test results:

Brucella IgM Flow assay - A positive result is indicated by the presence of a line at the test zone and a line at the control zone. In brucellosis, specific

IgM antibodies usually are present during the first view months of illness. Specific IgM antibodies generally are not present in patients with persisting brucellosis. A positive result in the Brucella IgM Lateral Flow assay is consistent with acute brucellosis. Specific IgM antibody levels rapidly decline after treatment

- A negative result is indicated by absence of a line at the test zone and presence of a line at the control zone. Brucella IgG Flow assay - A positive result is indicated by the presence of a line at the test zone and a line at the control zone. Specific IgG antibodies

develop shortly after infection and may remain present months to years after infection. A positive result in the Brucella IgG Flow assay is consistent with active brucellosis. Specific IgG antibodies also may be formed during relapse.

- A negative result is indicated by absence of a line at the test zone and presence of a line at the control zone.

Negative Negative

The Brucella IgM and IgG Flow assays are complementary assays and the use of both tests increases sensitivity. In some patients specific IgM and IgG antibodies may be present at the same time. In other patients only one of these two antibody species may be present Limitations of use:

The sensitivity and specificity of the Brucella Flow assays depends on various factors including stage of disease and previous antibiotic usage.

Further reading of suggested literature: Young EJ An overview of human brucellosis. Clin. Inf. Dis. 1995; 21, 283-290. Smits HL, Abdoel TH, Solera J, Clavijo E and Diaz R. Immunochromatographic Brucella-specific immunoglobulin M and G lateral flow assays for the serodiagnosis of human brucellosis. Clin. Diagn. Lab. Immunol 2003;10:1141-1146. Irmak H, Buzgan T, Evirgen O, Akdeniz H, Demiroz AP, Abdoel TH and Smits HL. Use of a New, Simple and Rapid Diagnostic Test, the Brucella-IgM and IgG Flow Assays in the Serodiagnosis of Human Brucellosis in an Endemic Area in Eastern Turkey. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2004;70:688-694.

KIT Biomedical Research Tel: 31 20 5665470 Royal Tropical Institute / Koninklijk Instituut voor de Tropen (KIT) Fax: 31 20 6971841 Meibergdreef 39 [email protected] 1105 AZ Amsterdam www.kit.nl The Netherlands

4+ 3+ 2+ 1+


3

Brucella IgM / IgG Flow Assay Short protocol

Introduction The Brucella IgM / IgG Flow Assay consists of two tests one for the detection of specific IgM antibodies and one for the detection of specific IgG antibodies. The presence of specific IgM and IgG antibodies in the serum of patients with brucellosis depends on the stage of illness. Therefore the two tests should be used as complementary tests to increase sensitivity.

Storage

Brucella Flow kits should be stored at +4° C to +25° C, in a dry place and protected from direct exposure to sunlight for optimal performance. Individual devices may be stored at +25° C to +45° C for short periods.

Assay procedure A. Serum 1. Remove a Brucella Flow IgM Flow assay device from the packaging and place on a bench top with the test

window facing upwards. Mark “M” using a pencil or marker pen.

2. Remove a Brucella Flow IgG Flow assay device from the packaging and place on a bench top with the test window facing upwards. Mark “G”.

3. Using a micropipet and a disposable pipet tip spot 5µl of serum to the sample pad in the round sample port of the IgM Flow assay and spot 5ul of serum to the sample pad in the round sample port of the IgG Flow assay.

4. Immediately add 130µl running fluid from the bottle provided to the round sample port. The running fluid may be added using a micropipet or using the plastic Pasteur pipet provided. When using the Pasteur pipet just transfer enough running fluid to completely fill the round sample port.

5. Close bottle and store bottle and Pasteur pipet for later use. 6. You will see a colour moving across test and control zones. This shows that the test is working. 7. Read results at 10 to 15 minutes. Any staining observed at the test line should be considered positive. The

picture may be used for guidance. 8. Results are stable for a further 10 to 15 minutes; thereafter false results may occur. B. Whole blood 1. Remove a Brucella Flow assay device from the packaging and place on a bench top with the test window

facing upwards. Mark IgM test “M” and IgG test “G”. 2. Collect 10µl of whole blood from finger prick with an anticoagulant coated capillary. Place the tip of the

capillary on the sample pad to make direct contact with the pad. The pad thus will drain the blood sample from the capillary

3. Immediately add 130µl running fluid to the round sample port. The running fluid may be added using a micropipet or using the plastic Pasteur pipet provided. When using the Pasteur pipet just transfer enough running fluid to completely fill the round sample port. Keep the Pasteur pipet for later use.

4. You will see a colour moving across test and control zones. This shows that the test is working. 5. Read results at 10 to 15 minutes. 6. Results are stable for a further 10 to 15 minutes; thereafter false results may occur. Note: the use of whole blood instead of serum may give some background staining in the test window. However this does not influence the reading of the test result. Interpretation

A positive (�1+) in either or both assays is highly consistent with brucellosis. The sensitivity of the two tests combined for culture confirmed patients is almost 100%. The specificity is >95%.

4+ 3+ 2+ 1+ negative negative

Documents

Diagnostic Bacteriologique Et Serologique de La Brucellose