DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE DES INFECTIONS BRONCHO-PULMONAIRES

Institut Pasteur d’Algérie

Collection TechniquesMicrobiologiques

DiagnosticBactériologique des

infectionsBroncho-pulmonaires

N.Ramdani-Bouguessa

K-Rahal

Les éditions

Pirates

Année 2005

Les Fascicules deBiologie clinique

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2005Diagnostic Bactériologique des Infections Broncho-pulmonaires

Institut Pasteur d’Algérie

Techniques microbiologiques

DiagnosticBactériologique des

InfectionsBroncho-Pulmonaires

N.Ramdani-Bouguessa

K.Rahal

Année 2005

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PlanI-Introduction 03II-Rappel anatomique : 04III-Epidémiologie : 06III.1- Dans le monde : 06III.2-En Algérie 09IV. Définition et manifestations cliniques : 12V-Les agents étiologiques : 14VI- Le diagnostic Bactériologique 20VI.1-Les Prélèvements 20VI.2-L’examen direct 25VI.3-Culture 27VI.4-Identification bactérienne : 33VI.4.1- Streptococcus pneumoniae : 33VI.4.2-Haemophilus 37VI.4.3-M.catarrhalis : 38VI.5-Recherche de Chlamydiae, Mycoplasmes et Legionelles : 39VI.5-1-Les Chlamydiae 39VI.5.2-Mycoplasma pneumoniae 46VI.5.3-Legionella pneumophila : 51VI.5-Bordetella (voir fascicule IPA 2004) : 55Référence : 57Annexes 60

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I-Introduction :Les infections respiratoires posent un problème de santé publique, ellessont la deuxième cause de mortalité après les diarrhées chez l’enfant dansles pays en développement.Malgré leur origine virale dans environ 75% elles restent la première causede prescription d’antibiotiques.L’épidémiologie des germes responsables est variable selon les pays.L’infection respiratoire basse est définie comme une affection affectant leterritoire sous glottique de l’arbre respiratoire.Le diagnostic au laboratoire n’est pas systématique, il est cependantindiqué dans les cas suivants : Établir l’épidémiologie des agents pathogènes. Le diagnostic d’une infection respiratoire grave en milieu hospitalier(nosocomiale ou communautaire). Infections respiratoires survenant en terrain particulier tel que :mucoviscidose ou une pathologie immunosuppressive (hémopathiemaligne, Sida).Les techniques diagnostiques sont diverses du fait de la multiplicité desagents pathogènes, toutefois elles restent orientées par la clinique.Les prélèvements font appel à des gestes invasifs (hémoculture, aspirationbronchique) compte tenu de l’inaccessibilité du site infecté, ce qui est unfacteur limitant pour le diagnostic de routine de ces infections.

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II-Rappel anatomique :Les voies aériennes inférieures sont représentées par l’arbre bronchiquedont l’extrémité proximale est représentée par la trachée qui se subdiviseen deux branches souches, chacune pénétrant le poumon droit et gauche.Cet appareil est protégé par la cage thoracique.A l’intérieur des poumons, chaque bronche se ramifie en bronchessecondaires et tertiaires, elle-même se subdivise ultérieurement en de pluspetits conduits, les bronchioles qui s’achèvent par des sacs aériens appelésalvéoles.Les poumons sont enveloppés par une fine membrane appelée la plèvre quiest constituée de deux feuillets l’un viscéral et l’autre pariétal :Le premier tapisse le poumon et le deuxième la paroi thoracique.Une cavité virtuelle existe entre les deux feuillets dont la fonction estd’assurer la lubrification de l’interface, en diminuant le frottement entre lepoumon et la cage thoracique.À l’état normal l’espace pleural contient une faible quantité de liquidestérile, évalué chez le sujet sain entre 1 et 20 ml.

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III. Épidémiologie :

III.1- Dans le monde :Dans les pays développés S.pneumoniae, H.influanzae et M.catarrhalis sontles 3 principales bactéries isolées dans les pneumonies.Dans les pays en voie de développement S.pneumoniae, H.influanzae etS.aureus sont prédominants alors que M.catarrhalis est rare.Cette différence est liée aux conditions socio-économiques, au terrain sousjacent notamment la malnutrition faisant le lit de pneumonies graves àS.aureus et aux conditions climatiques.Il a été noté que M.catarrhalis était plus retrouvée dans les régions froides,la fréquence de cette bactérie peut être sous estimée en Algérie et donc nonidentifiée par manque de moyens (Galerie NH).D’autres agents étiologiques sont impliqués dans les pneumopathiessurtout en ambulatoire notamment Mycoplasma pneumoniae, Chlamydiapneumoniae et Legionella pneumophila, cette dernière survient surtoutchez les patients immunodéprimés alors que les deux premières sontretrouvées chez l’enfant âgé de plus de 3 ans.Les mycoplasmes sont responsables de 20 à 40 % des pneumoniescommunautaires chez le grand enfant et Chlamydia pneumoniae de 2 à 20%.Dans les pays en développement S.pneumoniae, H.influanzae et S.aureussont les 3 principales bactéries impliquées dans les pneumonies. Les virusétaient retrouvés dans 30 à 40 %.La part des chlamydiae n’est pas très bien documentée dans ces payscontrairement aux USA ou 30 à 35 % des pneumonies dans les 4 mois de viesont dues à C.trachomatis, en Argentine elle est impliquée dans 19.8 %, lacontamination se fait probablement lors du passage de la filière génitalematernelle. En Suède C.pneumoniae est responsable de 45 % despneumonies.

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Les agents étiologiques sont différents en fonction du type de l’infectionrespiratoire basse et du terrain du patient.III.1.1-Pneumopathies communautaire :Parmi les infections bactériennes > 90 % sont dues à :

Streptococcus pneumoniae. Haemophilus influanzae. Mycoplasma pneumoniae. Legionella pneumophila. Chlamydia pneumoniae.

III.1.2-Pneumopathies nosocomiales :Ces infections sont polymicrobiennes dans un tiers des cas. Les BGN sontresponsables dans 60 % et staphylocoques dans 40 %.Pour les pneumopathies nosocomiales précoces survenant moins de 5jours d’hospitalisation c’est la flore endogène du patient qui est impliquéenotamment : S.pneumoniae. H.influanzae.Pour les pneumopathies nosocomiales tardives survenant après le 5ème jourd’hospitalisation ce sont les bactéries hospitalières qui sont retrouvés : P.aeruginosa S.aureus. S.épidermidis. Klebsiella, Enterobacter, Serratia. Acinetobacter baumanii. Anaérobies.

III.1.3-Surinfection de bronchopathies chroniquesobstructives (BCPO) :

Streptococcus pneumoniae. Haemophilus influanzae. M.catarrhalis.

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S.aureus. K.pneumoniae P.aeruginosa.

III.1.4-Pneumopathie de l’immunodéprimé :Germes déjà cités dans les autres pneumopathies et les germesopportunistes : Pneumocystis carinii. Toxoplasma gondii. Cytomégalovirus CMV. Aspergillus. Candida. Cryptococcus. Mycobactéries.

III.1.5-Surinfections bronchiques au cours desmucoviscidoses :

Streptococcus pneumoniae. Haemophilus influanzae. S.aureus M.catarrhalis. K.pneumoniae P.aeruginosa. B.cepacia Mycobactéries. Nocardia Mycoplasmes. Coxiella Chlamydia.

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III.2-En AlgérieL’épidémiologie des infections respiratoires aigues (IRA) basses n’est pasbien documentée microbiologiquement en Algérie.Une étude réalisé sur les IRA basses virales entre 1983 et 1984 au CHUBéni-Messous avait retrouvé que les IRA représentaient 49 % des motifs deconsultation avec une nette prédominance de la localisation haute dans 88%, l’âge le plus touché est le nourrisson de moins de 24 mois.Les étiologies virales des bronchiolites durant cette enquête n’ont étérecherchées que sur 64 couples de sérums par immunofluorescenceindirecte réalisée au service de virologie de l’IPA.La fréquence des virus était de 31 % pour le virus parainfluanzae 3, de 66 %pour l’adénovirus et de 3 % pour le virus respiratoire syncitial (VRS).Le petit nombre d’effectif ainsi que l’absence de réalisation del’immunofluorescence directe expliquent que le VRS ne soit pas au premierrang.Une autre étude récente clinique et virologique réalisée sur lesbronchiolites du nourrisson entre novembre 98 et mars 99 dans 2 servicesde pédiatrie (Bab el oued et Bologhine) et où l’immunofluorescence directea été réalisée sur 125 aspirations naso-pharyngées.La fréquence des virus était de 68 % pour VRS, 2 % pour le virus influanzae,de 1.5 % pour l’adénovirus et dans 1.5 % des cas une association de deuxvirus a été retrouvée.L’analyse clinique de cette même étude a montré que la tranche d’âge laplus touchée était de 3 à 12 mois dans 76 % de la population infantileétudiée et que 63 % des nourrissons avaient reçu au préalable unantibiotique.Une étude au CHU de Béni-Messous portant sur les étiologies bactériennesdes IRA basses chez l’enfant hospitalisé entre 1996 et 2000, a inclus 174patients chez lesquels des hémocultures ainsi que des ponctions pleuralespour la culture et la recherche des antigènes solubles ont été effectués.

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La preuve bactériologique a été portée dans 40 % des cas, S.aureus,S.pneumoniae et H.influanzae étaient les plus fréquents (tableau 1).Les cultures étaient positives dans 28,6 % des cas pour les hémocultures etdans 64.5 % des cas pour les pleurésies.Tableau1 : Répartition globale des germes retrouvés dans lesinfections respiratoires basses chez l’enfant.

0-28 j 29 j-2ans

>2 - 5 ans > 5 ans TotalS.pneumoniae - 8 6 5 19H.influanzae - 8 1 1 10S.aureus 3 7 6 5 21P.vulgaris - 1 - - 1E.coli - 1 - - 1Streptocoques 1 3 1 1 5Anaérobies - - 2 - 2Une autre étude portant sur les suppurations pleuro-pulmonairescommunautaires et nosocomiales, menée par le service des anaérobies àl’institut pasteur d’Alger a recruté 108 prélèvements (95-96), dont lamajorité était des liquides pleuraux, 64 prélèvements étaient positifs.L’infection était mixte dans 53.1 % des cas, les anaérobies étaient retrouvésdans 39.5 % des bactéries totales isolées.Cette étude n’a toute fois pas séparé les infections communautaires desinfections nosocomiales.Quant aux pneumopathies nosocomiales, l’écologie microbienne dépend del’installation de la ventilation assistée.Classiquement on distingue les pneumopathies acquises avant le 5ème jourde ventilation et ou les germes responsables sont ceux de la flore endogèneet les pneumopathies acquises après le 5ème jour et qui sont dues auxbactéries nosocomiales.

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Une étude au cours de l’année 2003 à 2004 par le service demicrobiologique du CHU Mustapha Bacha retrouve sur un nombre de 51prélèvements distaux protégés (PDP) les bactéries suivantes.Tableau 2 : Répartition des bactéries dans les pneumopathiesnosocomiales :

Nombre Pourcentage %Entérobactéries 31 70.44Pseudomonas 29 65.9Acinetobacter 17 38.6S.aureus 5 11.3SCN 4 9Haemophilus 3 6.8Streptococcus 3 6.8

Les entérobactéries les plus fréquemment retrouvées étaient K.pneumoniaeet E.coli60 % des cultures étaient mixtes, l’association Pseudomonas etAcinetobacter était plus retrouvées (9 patients).

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IV. Définition et manifestationscliniques :L’infection respiratoire basse est définie comme l’infection de l’étage sousglottique de l’appareil respiratoire.Chez l’adulte les infections respiratoires basses se manifestent par desbronchites, pneumonies ou pneumopathies, et des suppurations pleuro-pulmonaires.Chez l’enfant notamment le nourrisson la bronchiolite est de loin la plusfréquente et est d’origine virale.La pneumonie ou pneumopathie est le plus souvent bactérienne.IV.1-Bronchites aigues :C’est l’inflammation de l’arbre trachéo-bronchique secondaire à uneagression le plus souvent virale. Elle débute par une toux douloureuse nonproductive puis associé à une expectoration avec parfois une fièvre.IV.2-Exacerbation aigue d’une bronchitechronique :La bronchite chronique est définie par l’association d’une toux et d’uneexpectoration 3 mois par an pendant au moins deux années consécutives.Elle est caractérisée par l’augmentation du volume de l’expectoration, de sapurulence et/ou de la dyspnée.Les bactéries les plus fréquentes sont : H.influanzae, S.pneumoniae etB.catarrhalis.IV.3-Les pneumonies :Sont caractérisées par l’absence d’infection associée des voies respiratoiressupérieures, la présence d’une polypnée > 25/mn et/ou d’une tachycardie >100/mn et/ou d’une fièvre >37.8°C, la présence d’anomalies auscultatoiresnotamment des râles crépitants.

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La pneumonie est dite communautaire lorsqu’elle est acquise enextrahospitalier ou au cours des 48 premières heures d’hospitalisation.L’agent causal reste méconnu dans plus de 50 % des cas, le pneumocoqueest le plus fréquent, H.influanzae à une fréquence plus faible avecM.pneumoniae, C.pneumoniae, les legionelles impliquées dans moins de 5% des cas en dehors des épidémies.IV.4-Les suppurations pleuro-pulmonaires :

L’abcès du poumon : associe un tableau de pneumopathie aiguefébrile avec douleur thoracique et altération importante de l’étatgéneral.L’expectoration purulente est rarement massive et abondante maisplutôt fractionnée.La pneumopathie aigue suppurée : correspond àl’apparition de foyers de nécrose au sein d’un pneumonique étendu, pas ouinsuffisamment traité ou traité par une antibiothérapie inadéquate.Les suppurations pleurales (pleurésies purulentes ouempyème), ce sont des infections de la cavité pleurale, caractérisées par laprésence entre les 2 feuillets de la plèvre, d’un épanchement franchementépais ou crémeux ou d’un liquide simplement louche, voir clair maisrenfermant toujours des polynucléaires plus ou moins altérés,caractéristiques du pus.Les agents étiologiques les plus retrouvés sont les anaérobies dans plus dela moitié des cas. D’autres bactéries sont impliquées, notamment lesentérobactéries, staphylocoques, Haemophilus et pneumocoques.

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V-Les agents étiologiques :

V.1-Les virus :Sont responsables dans 75 % des infections respiratoires parmi les agents : Myxovirus : responsable de formes épidémiques. Virus respiratoire syncitial : qui occupe la première place chezl’enfant. Virus influanzae A et B. Virus parainfluanzae 1.2.3.4. Adénovirus : responsable des formes sporadiques. Herpetoviridae : responsable des pneumopathies extensives graveschez l’immunodéprimé dont : CMV qui est l’agent le plus importantsuivi de HSV et VZV.

V.2-Les bactéries :3 catégories sont distinguées.Les pathogènes spécifiques facultatifs du fait de leur présence à l’état deportage dans les voies respiratoires :

S.pneumoniae. M.catarrhalis. H.influanzae. S.aureus. Anaérobies.

Les pathogènes spécifiques :

M.pneumoniae. Chlamydia pneumoniae. Chlamydia trachomatis (nouveau né) Chlamydia psittaci.

Les pathogènes opportunistes du fait de leur existence dans le milieuextérieur :L.pneumophila

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Mycobactéries atypiques, ces derniers sont exclus de l’étude.La fréquence de ces germes : varie en fonction de l’âge.

En effet chez l’enfant les pneumopathies ont pour étiologie quatrebactéries essentiellement : S.pneumoniae H.influanzae. M.catarrhalis. S.aureus. Les bactéries atypiques à l’exception de Chlamydia trachomatis sontretrouvées après l’âge de 3 ans et se situent après les quatre bactériessus citées.

Chez l’adulte la répartition des bactéries est par ordre décroissant : S.pneumoniae H.influanzae M.pneumoniae Ch.pneumoniae L.pneumophila Et plus rarement S.aureus, les bacilles gram négatif ainsi que lesbactéries anaérobies, ces dernières surviennent sur un terrainparticulier.

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V.2.1-Streptococcus pneumoniae :Diplocoque gram (+), lancéolé, cultivé sur milieu au sang, présente unehémolyse alpha et est sensible à l’optochine.La capsule est le support de 90 sérotypes dont les plus fréquents 23.14.6.9et le 19 dans les pays occidentaux.Dans les pays en développement y compris l’Algérie, les sérotypes les plusfréquents dans la pneumonie sont 1.5.7.L’évolution des pneumocoques à sensibilité diminuée à la pénicilline estcroissante, cependant les plus faibles taux sont notés dans les pneumonies :en Algérie il était en 2001 de 20 % pour la pénicilline et aucune résistancen’a été retrouvée pour l’Amoxicilline et le Cefotaxime.Dans le cadre du réseau de surveillance de la résistance bactérienne auxantibiotiques le taux global de pneumocoques de sensibilité diminuée à lapénicilline tous sites confondus, était de 45 % en 2004.Le support de cette resistance chromosomique par modification des PLP,les niveaux de resistance sont variables selon la molécule antibiotique(selon NCCLS 2002).Sensible Intermédiaire RésistantPénicilline < ou = 0.063mg/l 0.1 – 1 mg/l > ou = 2 mg/lAmoxicilline < ou = 2 mg/l 4 mg/l > ou = 8 mg/lCefotaxime < ou = 0.5mg/l 1 mg/l > ou = 2 mg/l

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V.2.2-H.influanzae :Bacille à gram (-), polymorphe, exigent en facteurs de croissance (hémine etextrait de levure), cultive sur milieu au sang cuit.La plupart des souches responsables de pneumopathies possèdentl’antigène capsulaire type b.Dans les pneumonies par aspiration de la flore nasopharyngée, c’estl’Haemophilus non b qui est le plus impliqué.Le taux de résistance dans le monde d’H influanzae est de 20-30 % pourl’ampicilline par sécrétion de B lactamase d’origine plasmidique et dansmoins de 2 % par modification de PLP ou par l’imperméabilité de lamembrane externe.En Algérie il existe peu de données sur les résistances aux antibiotiques decette bactérie isolée des infections broncho-pulmonaires.Une étude réalisée au CHU Mustapha durant l’année 2004 retrouve 33 % derésistance à l’ampicilline par sécrétion de bétalactamase.Dans le cadre du réseau national de la surveillance de la résistancebactérienne aux antibiotiques le taux global (tous sites confondus) derésistance d’H.influanzae à l’Ampicilline était de 24.7 % en 2004.V.2.3- M.catarrhalis :Bacille à gram négatif non exigent, résistant à l’ampicilline dans 90 %, parsécrétion de Bétalactamase d’origine plasmidique.Cette bactérie fréquente dans les pays développés est rare dans les pays envoie de développement.Elle est peut être sous-estimée par l’absence de moyens d’identification(galeries NH).V.2.3- S.aureus :Cocci gram positif non exigent, ayant un pigment jaune, sécréteur depénicillinase dans plus de 90 % des cas.

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Des pneumonies nécrosantes à S.aureus méthicillino-résistant d’originecommunautaire ont été décrites en Europe et aux états unis, bien que rareselles sont cependant graves à cause des lésions pulmonaires de nécrosedues à la sécrétion d’une toxine appelée leucocidine de Panton Valentine.V.2.4- Les Chlamydiae :Bactéries parasites intracellulaires à cycle complexe.C.psittaci retrouvé essentiellement chez les oiseaux et les mammifères,l’homme est infecté lors du contact avec ces animaux.C.trachomatis a un rôle limité dans l’infection respiratoire chez le nouveauné alors que C.pneumoniae est un pathogène presque exclusivement del’homme responsable de bronchites et pneumopathies atypiques.V.2.5- Les mycoplasmes :M.pneumoniae, bactérie dépourvue de paroi, exigeante en milieu nutritif etont besoin pour leur croissance de vitamines et de stérols et d’acides gras àlongue chaine.Cette bactérie occasionne des pneumopathies atypiques.V.2.6- Legionella pneumophila :Bacille à gram (-) exigent en milieu nutritif (Cystéine, extrait de levure etcharbon) responsable de pneumopathies atypiques survenant parinhalation d’air conditionné ou d’eau chaude contaminée par cette bactériequi est un commensal des eaux.Elle cultive en milieu légèrement acide, PH 6.9, la culture sur milieu « BufferCharcoal Yeast Extract » (BCYE) nécessite une incubation à 35°C sous CO2,les colonies apparaissent entre 3 et 7 jours, elles sont grises, muqueuses etpolymorphes et présentent un aspect en verre brisé.Il existe 39 espèces de Legionella correspondant à 59 sérotypesantigéniquement distincts.Dans le monde Legionella pneumophila de Sérogroupe 1 à 9 estresponsable de 85 % des légionelloses, le sérotype 1 est le plus fréquent.

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D’autres espèces sont aussi impliquées : L.micdadei, L.bozemanii, L.dumoffiet L.longbeachae.V.2.7- Les bactéries anaérobies :Elles sont responsables de 20 à 25 % des pneumonies communautaires etdans 80 % ds pneumonies par inhalation en milieu hospitalier.Les bactéries les plus fréquemment isolées sont : les Cocci à gram (+) :peptostreptococcus, les bacilles à gram (+) : Actinomyces et les bactéries àgram (-) : Prevotella, Fusobacterium.Ces bactéries sont souvent associées aux bactéries aérobies et aéro-anaérobies facultatives.V.2.8- BordetellaC’est un petit coccobacille Gram négatif, à coloration bipolaire qui présenteune capsule.Cette bactérie cultive en aérobiose sur milieu de Bordet et Gengou après 48h les colonies apparaissent sous forme de gouttelettes de mercure.Il existe 4 espèces :Bordetella pertussis : agent de la coqueluche qui est une maladieémergente, caractérisée par une toux coqueluchoide pouvant se compliquerd’une broncho-pneumopathie.D’autres espèces sont décrites notamment : B.parapertussis,B.bronchoseptica et B.avium.

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VI-Le diagnostic bactériologique :

VI.1- Les prélèvements :Plusieurs types de prélèvements peuvent être réalisés, leurs indicationsdépendent de l’état du patient et du germe suspecté.Tous ces prélèvements une fois réalisés doivent être acheminés dansl’heure qui suit au laboratoire.VI.1.1-L’expectoration :Du fait de la contamination par la flore buccale, son rendement est améliorépar une toilette buccodentaire, une émission après un effort de toux ouaprès une séance de kinésithérapie sans traitement au préalable, ou aprèsune fenêtre thérapeutique de 48 h.Le produit est recueilli dans un dispositif stérile et acheminé au laboratoiredans l’heure qui suit. Il est indiqué devant une bronchite, pneumonie oupneumopathie communautaire bénigne.VI.1.2-Méthodes invasives :Protégé ou non, les aspirations bronchiques, le lavage broncho-alvéolaire etle brossage bronchique sont plus fiables et impliquent un environnementmédicalisé.Ils sont indiqués dans les infections graves ou récidivantes ainsi que dansles pneumopathies nosocomiales sous ventilation artificielle.VI.1.2.1-Le brossage bronchique protégé :La technique de référence est le brossage télescopique sous fibroscopieselon la technique décrite par Wimberley, par utilisation d’un dispositifconstitué d’une brosse de nylon fixée à l’extrémité d’un guide métallique.Brosse et guide coulissent à l’intérieur d’un premier cathéter, lui mêmeplacé à l’intérieur d’un second cathéter, obturé par un bouchon depolyéthylène glycol.

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Cette brosse est glissée au travers d’un fibroscope et dirigée sous contrôlede la vue dans une petite bronche de 4ème ordre drainant le territoirepulmonaire radiologiquement suspect.Le cathéter interne est poussé, expulsant le bouchon et permettantd’avancer la brosse de quelques centimètres, pour réaliser le prélèvementdes secrétions.Apres cela e dispositif est retiré, la partie externe du cathéter interne estdésinfectée à l’alcool 70°, puis une fois sortie la brosse interne est coupéedans un tube stérile contenant 1 ml de soluté stérile isotonique afin d’évitersa déshydratation.Ce tube est agité pendant 2 minutes.On estime que la brosse ramène 0.01 ml de secrétions bronchiques. Leprélèvement doit être traité dans l’heure qui suit.VI.1.2.2--Le cathétérisme en double aveugle ouprélèvement distal protégé (PDP) :Cette méthode est utilisée chez les sujets sous ventilation mécanique ainsique chez les trachéotomisés, elle ne nécessite pas le recours au fibroscope.Un double cathéter lié à une seringue est introduit par l’oropharynx ou parl’orifice de trachéotomie et dirigé à l’aveugle vers les bronches, lessecretions bronchiques sont alors aspirées.Les 3 à 5 cm distaux du double cathéter protégé, après avoir été purgé avec1 ml de soluté salé isotonique sont coupés stérilement et placés dans untube stérile.Le prélèvement reçu au laboratoire contient la suspension (liquide de purgeet sécrétion) et le cathéter.Toutefois le cathéter est le plus souvent adressé au laboratoire sansliquide, ce dernier sera rajouté au laboratoire.

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VI.1.2.3- Le lavage broncho-alvéolaire :Apres introduction du bronchoscope et son blocage dans une bronchesegmentaire ou sous segmentaire, 50 ml de sérum physiologique sontinstillés en 5 à 6 fois puis aspirés pour recueillir les secretions.Le produit est recueilli dans un dispositif stérile, on estime que 20 à 60 %du liquide injecté est recueilli.Le lavage broncho-alvéolaire est surtout indiqué pour la recherche deschlamydiae et pour le diagnostic des pneumopathies nosocomiales chez lesmalades ventilés.ces prélèvements sont positifs dans 60 à 70 % des cas.Ces prélèvements sont acheminé dans l’heure qui suit pour éviter lapullulation des germes de la flore commensale, le clinicien doit noter si lafibroscopie est protégée ou non pour faciliter l’interprétationbactériologique quantitative.VI.1.2.4-Aspiration endotrachéale :Une sonde d’intubation est introduite au niveau de la trachée, les secrétionssont ensuite aspirées à l’aide d’une seringue reliée à la sonde.Cette méthode expose à a contamination par la flore bucco-salivaire, elle estutilisée lorsque les autres techniques invasives ne peuvent être utilisées.VI.1.3-Autres prélèvements :

VI.1.3.1-la ponction transtrachéale :D’indication limitée bien que ces prélèvements soient de grande qualitémicrobiologique, cependant des complications peuvent survenir telles que :hémorragie et surinfections.Le prélèvement se fait à l’aide d’une aiguille placée de façon à former 45°par rapport à la surface cervicale désinfectée chez un sujet allongé, le coudégagé en mettant un support sous les épaules.Un cathéter lié à une seringue est introduit à travers l’aiguille et lessecrétions ainsi aspirées.

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Cette méthode est impossible en cas de ventilation assistée, elle estindiquée dans les pneumopathies nosocomiales chez les chez lesimmunodéprimés, elle est toute fois remplacée par les prélèvements sousfibroscopie, moins traumatiques.VI.1.3.2-La ponction trans-trachéale à l’aiguille fine :Cette méthode est actuellement d’utilisation exceptionnelle dans lespneumopathies nosocomiales à cause des risques d’hémorragie et depneumothorax.Elle consiste à introduire une aiguille à travers le thorax en passant par laplèvre et aspirer le tissu pulmonaire.Une radiographie est nécessaire auparavant afin de localiser la partieinfectée à prélever. Cette méthode est contre indiquée chez les insuffisantsrespiratoires.VI.1.3.3-Ponction pleurale :La réaction pleurale n’est présente que dans 20 % lors des pneumopathies àpneumocoque et dans 80 % dans les pneumopathies à staphylocoques. Elleest d’une grande valeur diagnostique.L’empyème peut être isolé ou associé à une suppuration pulmonaire.Le prélèvement est recueilli par ponction à l’aiguille après une désinfectionde la région costale à l’aide d’une solution antiseptique.L’acheminement du prélèvement doit être effectué dans l’heure qui suit.VI.1.3.4-L’aspiration nasopharyngée :Elle est indiquée pour le diagnostic de la coqueluche et réalisée parl’intermédiaire d’une sonde nasopharyngée liée à une seringue.Cette technique est aussi utilisée pour le diagnostic de la pneumonienéonatale a Chlamydia trachomatis.

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VI.1.3.5-Ecouvillonnage de l’oropharynx postérieur :Est réalisé en frottant l’écouvillon au niveau de l’oropharynx postérieurpour la recherche directe de C.psittaci et C.pneumoniae.VI.1.3.6-L’hémoculture :Elle est indiquée devant une fièvre ≥ 39°C accompagnant une pneumonie.Le prélèvement est effectué aux pics thermiques après désinfection de lasurface à prélever et des mains du préleveur et en dehors de touteantibiothérapie.Une série d’au moins 03 flacons est prélevée dans des sites différents.Le type de flacons est de préférence le milieu biphasique (Castanéda) ou 5 à10 cc de sang sont inoculés par flacon.Ces derniers sont acheminés immédiatement à température ambiante.Le rendement de ces hémocultures est faible puisque seules 20 à 30 % despneumonies sont bactériémiques.VI.1.3.7-Le sérum :Prélevé à J1 après un intervalle de 2 à 3 semaines.Cette sérologie est valable pour la recherche d’anticorps anti-chlamydiae,anti-mycoplasme et anti-legionelles.Les 2 sérums seront congelés avant d’être traités en même temps.

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VI.2-L’examen direct :

VI.2.1-Examen après coloration :Deux colorations sont nécessaires pour les prélèvements de crachats,aspirations bronchiques, lavages broncho-alvéolaire, ponction trans-trachéales et liquides pleuraux : Une coloration au bleu de méthylène ou au May Grunwald Giemsa(MGG) permet d’apprécier la réaction cellulaire notamment laprésence de polynucléaires et de cellules épithéliales. Une coloration de gram pour apprécier la flore et sa prédominance.Ces deux examens sont d’un intérêt capital, ils permettent lors d’unprélèvement d’une expectoration de juger de sa qualité.Ainsi devant la prédominance de cellules épithéliales, peu de polynucléairest une flore polymorphe le prélèvement est salivaire et n’a pas d’intérêtbactériologique.Par contre devant la prédominance de polynucléaires et une floreprédominante, le prélèvement est alors mis en culture.

VI.2.2-Lecture et interprétation :Pour l’expectoration, la coloration au bleu de méthylène ou MGG estobservée à l’objectif X100.pour que le prélèvement soit accepté pour lamise en culture il faudrait que le nombre de cellules épithéliales soit <10cellules / champ et que le nombre de polynucléaires soit > 25/ champ.Le dénombrement est estimé en faisant la moyenne sur 10 champs.Cellules par champ

Classe Epithéliales Leucocytes1 > 25 <102 > 25 10-253 > 25 > 254 10-25 > 255 <10 > 25

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Les crachats de classe 1 et 2 sont fortement contaminés par la salive et nesont pas mis en culture.Les crachats de class 3 et 4 ont un nombre de leucocytes qui témoigned’une réaction inflammatoire mais sont contaminés par la salive.Les crachats de classe 5 sont les plus appropriés pour l’examenbactériologique ; ceux de la classe 4 sont acceptables.L’examen direct d’une aspiration broncho-pulmonaire après fibroscopiemontre des cellules bronchiques, macrophages et des polynucléaires.Il est noté qu’en phase d’invasion de l’infection, les polynucléaires peuventmanquer, c’est la culture qui confirmera le diagnostic.Interprétation de l’examen direct :

Absent : 0 bactérie et leucocyte. Rares : 1 bactérie ou 1 leucocyte pour 10 à 20 champs. Assez nombreux : 1 à 5 bactéries ou leucocytes par champs. Nombreux : 10 à 50 bactéries ou leucocytes par champs. Très nombreux : 150 à 200 bactéries ou leucocytes/champs.Cet examen direct est aussi capital lors des ponctions pleurales et deshémocultures.

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VI.3-Culture

VI.3.1-Prélèvements broncho-pulmonaires :Tous les prélèvements seront mis en culture après dilution pour une étudequantitative à l’exception de la ponction trans-trachéale et la biopsiepulmonaire qui seront directement ensemencées sur les milieux :VI.3.1.1- Expectoration, aspiration trachéale,aspiration bronchique non protégée :Le produit pathologique est dilué volume à volume avec le digesteur(Eurobio) afin de fluidifier les sécrétions.Une agitation au vortex ou à l’agitateur pendant 20 mn est nécessaire,certains auteurs préconisent de rajouter des billes de verre pour faciliter laliquéfaction des secrétions.Prélever 10 ul avec pipete et embout jaune stérile et les décharger dans 10ml d’eau distillée stérile.Mélanger à nouveau au vortex.Prélever 10 ul et étaler au râteau stérile sur les milieux :

Gélose au sang frais pour pneumocoques et autres streptocoquesincubés sous CO2. Gélose au sang cuit + polyvitex pour Haemophilus et Neisseriaincubée sous CO2. Gélose Columbia au sang frais pour les Anaérobies incubée enanaérobiose. Gélose Sabauraud additionnée de Chloramphénicol. En cas d’aspiration bronchique rajouter un milieu pour recherche deslégionellas (BCYE).La dilution finale ensemencée est estimée à 10 Bactéries/ml.

Lecture :Dénombrer le nombre de colonies identiques d’une même espècebactérienne X 10 Bactérie/ml .

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Le seuil de positivité est ≥10 bactéries/ml pour l’expectoration.Il est de 10 pour l’aspiration bronchique protégée.NB : le prélèvement de crachat peut être ensemencé directement sansdilution au préalable à l’aide d’une anse de 10 ul.L’isolement se fera en cadrans, la flore prédominante ayant cultivé jusqu’au3ème voir 4ème cadran sera prise en considération.VI.3.1.2-Interprétation de la culture quantitative d’uneexpectoration :Cette interprétation est délicate, elle doit en même temps être confrontée àla clinique et aux résultats de l’examen direct et de la culture.1er cas : au gram

Peu ou pas de polynucléaires. Nombreuses cellules épithéliales. Flore polymorphe.Prélèvement salivaire sans intérêt bactériologique pas de culture.

2ème cas : au Gram

Peu ou pas de polynucléaires. Peu ou pas de cellules épithéliales. Une forme bactérienne nettement prédominante ou exclusive.A la culture : une espèce bactérienne exclusive ou nettement prédominanteprésente en quantité significative : identification+antibiogramme etcompléter les renseignements cliniques (prélèvement fait en périodeinvasive de la maladie, la réaction inflammatoire n’a pas eu le temps de sefaire).

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3ème cas : au gramNombreux polynucléaires.Flore polymorphe.Culture non significative : renseignements cliniques : malade sousantibiothérapie.

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Recueil de crachat

Examen direct :

Bleu, Gram

= Appréciation de la qualité du prélèvement (cellulesépithéliales, polynucléaires)

Classe 1. 2. 3

Contamination salivaire

Classe 4, 5

Fluidification ou ensemencement àl’anse par la technique des quadrants

Mise en culture

GSF GSC + Polyvitex Gélose pour BGN

Demander un autre prélèvement

Identification et antibiogramme

Lecture

Seuil de pathogénicité= 10 Bactéries/ml

Flore dominante par culture pure

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VI.3.1.3- Prélèvement distal protégé : (PDP)Est réalisé en réanimation par cathétérisme en double aveugle, le cathéterest reçu dans un tube stérile. Ajouter 1 ml de soluté salé isotonique dans un tube, agiter au vortexpour homogénéiser les secrétions. Ensemencer 10 ul de la suspension sur les milieux sus cités et étalerau râteau. Apres incubation dénombrer les colonies. Le seuil de positivité est ≥10 UFC/ml soit 10 colonies sur une boited’une même espèce bactérienne.

VI.3.1.4- Lavage broncho-alvéolaire protégé :

Centrifuger le prélèvement pendant 5 mn à 2000 tr/mn. Jeter le surnageant. Faire un gram sur le culot. Ajouter 1 ml d’eau distillée stérile. Homogénéiser au vortex. Ensemencer 10 ul et étaler au râteau stérile sur les mêmes milieuxcités précédemment. Lecture Nombre de colonies X 100. Le seuil de pathogénicité est ≥10 UFC/ml soit 10 colonies d’unemême espèce bactérienne.

VI.3.1.5-Brossage broncho-alvéolaire :

Prélever à l’aide d’un écouvillon stérile une petite quantité dessecrétions pour le gram. Décharger la brosse dans 0.5 ml d’eau distillée stérile. Homogénéiser au vortex. Inoculer 10 ul de cette suspension et faire un étalement au râteaustérile sur les mêmes milieux cités précédemment. Lecture : nombre de colonies X 100.

Le seuil de positivité est ≥10 UFC/ml soit 10 colonies sur uneboite d’une même espèce bactérienne.

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VI.3.1.6-Ponction trans-trachéale, biopsie pulmonaire :Ces deux types de prélèvements seront ensemencés tels quels sans dilutionau préalable.La culture est ensemencée sur les mêmes milieux sus cités, toute bactériequi pousse sera prise en considération.VI.3.2-Ponction pleurale :Mise en culture sur les mêmes milieux, un enrichissement en bouillon esteffectué pour les bactéries aérobies (Todd Hewitt ou BGT) et pour lesbactéries anaérobies (TGY).VI.3.3-l’hémoculture :Mise en culture dés 6 h d’incubation avec des repiquages systématiques à18h, 72h et observation des flacons pendant 10 jours.L’interprétation sera guidée par l’espèce bactérienne pathogène stricte ouopportuniste, dans ce dernier cas le nombre de flacons positifs ainsi que lecontexte clinique (présence d’une pathologie sous jacente) guideront lediagnostic.

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VI.4-Identification bactérienne :

VI.4.1- Streptococcus pneumoniae :Examen direct :le pneumocoque est caractérisé par son aspect en diplocoque lancéolé enflamme de bougie, parfois en courtes chainettes à gram positif.La taille des Coccis est souvent plus importante à partir d’un prélèvementqu’à partir de la culture.

Culture :sous atmosphère enrichie en CO2 et après 24 h d’incubation sur gélose ausang frais les colonies apparaissent grisâtres plates avec un centreombiliqué entourées d’une hémolyse alpha, parfois les colonies sontgrosses et muqueuses.Sur milieu gélosé le pneumocoque doit être repiqué au bout de 48 h au delàde ce délai il s’autolyse après.La culture sur bouillon donne un aspect trouble homogène en 6 heures,dépassé ce délai la bactérie s’autolyse et n’est plus viable.

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Identification :

Test à l’Optochine :isoler une culture pure de pneumocoque sur gélose au sang frais, déposerau niveau du premier cadran un disque d’optochine (ethylcupréine),incuber sous CO2 pendant 24h, une zone d’inhibition > 15 mm permetd’identifier le pneumocoque si le diamètre de cette zone est < ou = 15 mm ,ilest nécessaire de compléter l’identification par le test de lyse audésoxycolate de sodium car il existe des streptocoques alpha hémolytiquesqui peuvent avoir un diamètre d’inhibition à l’optochine.Test de lyse :

Sur milieu liquide :Préparer 2 tubes de Kahn stériles.Distribuer dans chaque tube 0.5 ml d’une suspension bactérienne (depneumocoque) de densité optique entre 0.5 et 1 mac Farland.Une quantité égale (0.5 ml) d’une solution de désoxycolate de Na à 1 ou 2 %(la bile) est ajoutée dans un tube alors que 0.5 ml d’eau physiologique estrajoutée dans le deuxième tube. Incuber 2 heures à 35°C.Une réaction positive indiquant la présence d’un pneumocoque, semanifeste par un éclaircissement du tube contenant le désoxycolate de Naalors que l’autre tube reste trouble.Sur milieu solideDéposer une goutte de désoxycolate de Na à 1 ou 2 % sur des colonies bienisolées.La boite est ainsi posée sur une surface plate, couvercle vers le haut,pendant 15 mn soit à température ambiante, u incubée à 35°C en aérobiose.Une réaction positive se manifeste par une disparition des colonies ou leuraplatissement alors qu’une réaction négative laisse les colonies intactes.Il faudrait éviter les excès de solution qui favorisent le glissement descolonies ce qui pourrait être interprété comme positif par erreur.

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Sérotypage :« Quellung réaction » ou gonflement de la capsule :Le principe de ce tes est de mettre le pneumocoque en présence d’un poolde sérums puis d’un sérum spécifique du sérotype ou Sérogroupe.Une réaction positive se manifeste par un gonflement de la capsule visibleau microscope au contraste de phase.Cultiver une souche de pneumocoque en bouillon (BGT) pendant 2 à 4 h.Mettre sur une lame 10 ul de sérum, 10 ul de bouillon et 10 ul de bleu deméthylène dilué au 1/10 : bien homogénéiser, recouvrir d’une lamelle etlaisser environ 15 à 20 mn.Déposer sur la même lame un témoin négatif contenant 10 ul de bouillon et10 ul de bleu de méthylène.Observer au microscope à contraste de phase condensateur en position Hou 5 et au grossissement 40.Comparer toujours avec le témoin négatif ou on n’observe pas degonflement : la taille des bactéries est inchangée et la capsule invisible.Une réaction positive se manifeste par une capsule bien visible autour ducorps bactérien lequel est coloré en bleu.Procéder d’abord avec les pools de sérums, si la réaction est positive onutilisera alors le monovalent correspondant.

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Agglutination au latex :

Cette technique utilise des latex sensibilisés par des sérums. Il existedes pools et des monovalents. Le même principe est utilisé que pour le gonflement de la capsule enpassant par les pools puis les monovalents correspondants. L’agglutination doit être immédiate.

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VI.4.2-HaemophilusExamen direct :Coccobacille à gram négatif polymorphe, ce polymorphisme estcaractéristique surtout à partir du prélèvement.Culture :A partir de colonies suspectes brillantes parfois grisâtres et ne cultivant quesur gélose au sang cuit, un gram et un réisolement sont effectués.

Effectuer les tests rapides de catalase et oxydase qui sont positifs, cettedernière est tardive.

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Identification :L’identification se fera soit par l’ensemencement d’une galerie Api NeisseriaHaemophilus NH soit par la recherche des exigences en facteurs decroissance.Réalisé à partir d’une culture fraiche une suspension riche dans l’eauphysiologique, déposer 3 spots larges dans une boite Mueller Hintonsimple, sur chaque spot déposer un disque contenant les facteurs decroissance, facteur X, Facteur V et Facteurs V et X.Incuber à 35°C pendant 24 H sous CO2 et l’humidité.La lecture se fera en notant la présence ou l’absence de culture autour desdisques.Ainsi H.influanzae ne cultive qu’autour du disque contenant les 2 facteurs Vet X.Recherche du sérotype par agglutination au latex :Il existe 9 sérotypes de a à f, le plus fréquent étant le b.Le Sérotypage se fait à partir d’une culture de 24 h , prendre quelquescolonies et les mettre en contact d’une goutte de sérum spécifique, uneréaction positive se manifeste par une agglutination franche dans la minutequi suit.VI.4.3.M.catarrhalis :

Les colonies sont grisâtres non pigmentées grosses sur gélose au sangfrais et cuit. La recherche de la catalase et l’oxydase est positive. L’identification sera confirmée par galerie Api NH

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VI.5-Recherche de Chlamydiae, Mycoplasmeset Légionelles :

VI.5-1-Les Chlamydiae

VI.5.1.1-Prélèvements :Aspiration bronchiques ou lavages broncho alvéolaires ou alorsécouvillonnage oropharyngé seront réalisés.Si une culture doit être effectuée le prélèvement est mis dans un milieu detransport 2SP : tampon phosphate de potassium ou phosphate de sodium0.02 M additionné de saccharose 0.2 M.En attendant l’inoculation, le prélèvement peut être conservé à +4°C dansun délai < 48 h, au delà duquel il doit être congelé à -80°C.VI.5.1.2-Examen direct :Le frottis est réalisé sur lame à partir du prélèvement et fixé à l’acétone, unanticorps monoclonal marqué est rajouté, ainsi qu’un contre colorant, lebleu d’Evans.La sensibilité de cette technique est de 50 %.VI.5.1.3-Isolement :

Nécessité des cultures cellulaires telles que HeLa 229, HL, Hep2. Les inclusions cytoplasmiques sont mises en évidence après 72 h deculture grâce à un anticorps monoclonal spécifique de l’espèce et dugenre. L’isolement des Chlamydiae par la culture reste difficile et peurentable ; la mise en culture est la méthode de référence. Ces prélèvements sont agités dans 1.2 ml de milieu de transportliquide, 2SP : Phosphate de Potassium ou Phosphate de Sodium 0.02M additionné de saccharose 0.2M. Si la culture ne peu être effectuée immédiatement, le flacon estcongelé à – 70°C pendant une durée maximum de 20 j.

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Si la culture a lieu dans les 2 heures qui suivent le prélèvement, leflacon est conservé à +4°C.Mode opératoire :

Entretien des cellules McCoy :

Utilisation de flacons plastique Costar de 75 cm2. Les cellules sont maintenues à 37°C sous CO2 dans le milieu EAGLE. Lorsqu’un tapis cellulaire est constitué les cellules doivent êtretrypsinées. La trypsinisation consiste à rejeter le milieu nutritif, laver les cellulesau milieu de Hanks avant d’ajouter 10 ml de Trypsine pendant uneminute. La trypsine est ensuite jetée puis on rajoute quelques ml de EAGLEdans le flacon pour inactiver la trypsine. Les cellules sont mises en suspension par une agitation modérée etpeuvent être transférées dans un autre flacon.

Préparation des plaques pour l’isolement des Chlamydia :

Mise en suspension des cellules dans le milieu de EAGLE aprèstrypsination. Dénombrement de ces cellules sur Malassez après avoir rajouté lebleu de Trypan pour différencier les cellules mortes des vivantes. La concentration cellulaire est ensuite ajustée à 10 cellules par ml. Déposer 1 ml de cette solution dans chaque puis d’une plaque typeCostar de 24 puits contenant chacun une lamelle ronde en verre de 12mm de diamètre. Incuber la plaque pendant 24 h à 37°C sous CO2, le temps d’avoir unemonocouche cellulaire sur les lamelles.

Inoculation des prélèvements :

Les prélèvements congelés à -70°C seront décongelés comme suit : Rajouter 1 ml de milieu Eagle dans chaque flacon ainsi que quelquesbilles de verres stériles. Agiter vigoureusement au vortex pendant 1 minute. Rejeter le milieu de culture contenu dans chaque plaque.

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Repartir chaque suspension infectieuse dans 4 puits à raison de 0.5ml par puits. Centrifuger la plaque pendant une heure à 30° et à 1500 g. Incuber la plaque 2 heures à 37°C, sous 5 % de CO2. Aspirer l’inoculum et rajouter le milieu Eagle enrichi à raison de 0.5ml par puits. Incuber à 37°C sous 5 % de CO2 pendant 48 heures.

Coloration :C’est l’étape de révélation de la présence de Chlamydia dans les cellulesinoculés.Au May-Grunwald-Giemsa (MGG):

Prélever une lamelle par prélèvement. Laver dans une solution de PBS (phosphate Buffer Saline). La fixer pendant 10 mn à l’alcool méthylique. Colorer les cellules pendant 20 mn avec le mélange (MGG 1 ml,Giemsa 2 ml, tampon Giemsa 17 ml). Rincer à l’eau distillée. Déshydrater la lamelle dans des bains successifs d’acétone, acétonetoluène et Toluène. Lecture au microscope à l’objectif X 40 ou X 100 à l’immersion.

En immunofluorescence directe :

Technique plus sensible surtout lorsque le nombre d’inclusions estpeu élevé. Les lames sont recouvertes d’anticorps monoclonal anti-chlamydiamarqué à l’isothiocyanate de fluorescéine. Lecture au X40 ou au X100 : les inclusions apparaissent en vert surfond rouge.

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Passage sur une nouvelle culture cellulaire :Si le résultat est douteux après 48 h on réalise un second cycle. Recueillir les cellules restantes du prélèvement douteux. Jeter la moitié du milieu Eagle. Gratter les cellules des lames restantes avec une spatule métalliquestérile. Récupérer l’inoculum et l’agiter au vortex avec des billes. Traiter les cellules comme le prélèvement de départ et le contrôlepositif : il est possible d’introduire un contrôle positif dans chaquesérie qui sera une souche de chlamydia de référence ou isolée d’unmalade.

Résultat :

Apres lecture complète de la lame, la vue d’une seule inclusion signela positivité de la lame. Il est aussi important de vérifier l’emplacement de la lamelle positivesur la plaque car des contaminations d’une série par une autrefortement positive peuvent survenir.

Précautions à prendre :

Prélèvement recueillis dans le milieu de transport 2SP. Vérifier la bonne qualité des transports plastiques pour la croissancecellulaire. Vérifier la concentration de 5 % de CO2, une concentrationsupérieure acidifierait trop les milieux et entrainerait une sensibilitéinférieure des cellules. Verifier l’humidification de l’étuve à CO2 pour qu’il n’y ait pas dedessiccation des plaques.

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VI.5.1.4-Diagnostic indirect : deux sérums prélevés à 3 semaines. Réaction de fixation du complément : elle est surtout indiquée pourchlamydia psittaci mais elle est non utilisée pour chlamydiapneumoniae car peu sensible. Micro-immunofluorescence indirecte avec un antigène d’espèce et dugenre, c’est une technique spécifique et sensible. Un taux ≥1/512 est évocateur d’une infection active. En primo infection les IgM ≥1/16 apparaissent rapidement, les IgGapparaissent vers la 5ème semaine. En réinfection les IgG apparaissent rapidement, il n’ya pas d’IgM. Chez l’enfant il a été prouvé que les cultures positives n’étaient pastoujours corrélées à une sérologie positive à chlamydia pneumoniae.

A-Immunofluorescence indirecte : c’est la technique deréférence :

Principe :

Détecte les anticorps anti-Chlamydia trachomatis, pneumoniae etpsittaci de classe IgM et IgG. L’antigène de chlamydiae est soit entretenu au laboratoire sur culturecellulaire ou sur œuf soit fixé sur des lames prêtes à l’emploi sousforme de spot. Lorsque l’antigène est préparé sur œuf, la positivité d’une lame donneun aspect de ciel étoilé, alors qu’il est sous forme d’inclusions, sil’antigène est préparé par culture cellulaire.

Mode opératoire :

Décanter le sérum du malade et le décomplémenter 30 mn à 56°, ilpeut être conservé 2 jours à +4° ou congelé à -20°C. Diluer en demi en demi le sérum dans du PBS. Déposer à partir de la dilution 1/128 sur chaque spot d’une lameséche. Incuber à 37°C pendant 30 mn en chambre humide. Laver deux fois 5 mn au PBS.

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Déposer, sans sécher, une globuline de chèvre anti-immunoglobulinehumaine Totale marquée à l’isothiocyanate de fluorescéine (dilutionau 1/100 dans du PBS + bleu d’Evans au 1/10000). Incuber les lames 30 mn à 37 °C en chambre humide. Laver 2 fois 5 mn au PBS. Lecture au microscope à fluorescence.

Lecture et interprétation :Les résultats sérologiques doivent être confrontés à la clinique : Pour Chlamydia psittaci un titre d’IgG > 64 est considéré commepositif. Pour les pneumopathies de l’enfant la recherche des IgM estintéressante, la présence d’IgM à un taux ≥ 1/8 ou plus est considéréecomme positive et doit être confirmée par une 2ème sérologie. Chez le nouveau né en l’absence d’IgM, une réponse d’IgG 4 Xsupérieure à celle de la mère démontre l’infection (Ch. Trachomatis). I est donc important d’avoir le sérum de la mère et du nouveau né enmême temps. Pour Ch. Pneumoniae, u titre en IgM ≥ 32, un taux d’IgG ≥ 512 sont enfaveur d’une infection récente .par contre u taux d’IgG≥ 32 sansaugmentation significative est témoin d’une infection ancienne. D’oùl’intérêt de suivre la cinétique des anticorps dans le temps.

Précaution :

Risque de réaction faussement positive par un bruit de fondfluorescent. Tester les conjugués et surtout l’IgM sur des sérums de référence oudes sérums connus. Réaction faussement positives en IgM dues au facteur rhumatoïde ouà des anticorps anti noyaux. Pour éviter la chute des anticorps suite aux congélations etdécongélation, il est préférable de conserver les sérums à +4°Cpendant de courtes périodes.

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B-Autres techniques sérologiques :

Réaction d’immunopéroxydase : ne concerne que Ch. Trachomatis deplus il peut y avoir des réactions croisées avec Ch. Psittaci et acinétobacter.Réaction immunoenzymatique (ELISA) : ne détecte que les IgG de plusles antigènes utilisés manquent de spécificité.Amplification génique : la technique PCR est sensible et spécifique pourCh. Pneumoniae mais n’est pas encore généralisée.

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VI.5.2-Mycoplasma pneumoniae

VI.5.2.1-Prélèvements :

Les prélèvements les plus indiqués pour la mise en culture deC.pneumoniae sont : Prélèvement naso-pharyngé ou expectoration : le 1 er cas (parécouvillonnage) est préférable au second qui expose à lacontamination des milieux. Liquides d’aspirations bronchiques et lavages broncho-alvéolaires. Brossages endoscopiques. Liquides pleuraux et biopsies pulmonaires.Les conditions nécessaire à tous ces prélèvements est qu’ils devraientcontenir des cellules compte tenu de l’adhérence des mycoplasmes auxcellules.L’acheminement au laboratoire est immédiat, s’il est différé le prélèvementpeut être conservé à +4°C pour une durée ne dépassant pas 24 h ouquelques jours à -20°.Un prélèvement de sang est nécessaire pour l’étude sérologique.

VI.5.2.2-Examen direct : Non pratiqué vu l’absence de paroi, lestechnique d’IF n’ont pas donné de résultats concluants.VI.5.2.3-La culture :

La culture des mycoplasmes nécessite des milieux riches en élémentsnutritifs (sérums, extrait de levure, ADN). Il existe 2 milieux, le milieu d Hayflick liquide ou solide et le milieuSP4 liquide ou biphasique : les résultats du milieu SP4 sont lesmeilleurs. Ces milieux contiennent des inhibiteurs pour éliminer les bactéries decontamination (Bétalactamines, polymyxines et Amphotericine B). Les prélèvements effectues sur des écouvillons sont étalés sur milieusolide et déchargés sur milieu liquide.

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Les prélèvements liquidiens sont ensemencés directement sur milieusolide et dilués au 1/10e avant d’être ensemencés par quelquesgouttes sur milieu liquide. L’incubation se fait à 37°C sous 5 % de CO2.l’observation des milieuxest quotidienne pendant 3 semaines, toute contamination doit faireéliminer les cultures. Sur milieu gélosé, le développement de M.pneumoniae se traduit parl’apparition après 5 à 7 jours de colonies de très petite taille visibles àla loupe ou au microscope X10 et ayant un aspect « œuf sur plat ». La croissance en milieu liquide est visualisée par un virage du PH durouge au jaune ce qui témoigne de l’utilisation du glucose.

VI.5.2.4-IdentificationEn principe l’utilisation du glucose ainsi qu’une culture positive sur milieusolide suffisent à l’identification de M.pneumoniae, toutefois l’identificationpeut être confirmée par l’inhibition de a culture en présence d’un anticorpsspécifique ou par IFD sur culture, cette technique est de réalisation difficile.

Culture de M.hominis.Un gros plan montre les colonies en« oeuf au plat »,

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VI.5.2.5-Avantages et inconvénients :La culture st longue et fastidieuse, lorsqu’elle est positive elle confirme lediagnostic alors que sa négativité n’exclut pas l’infection à M.pneumoniae.Culture

Elle n’est pas effectuée en routine car longue et peu sensible. Les milieux utilisés contiennent du cholestérol et de l’ADN et del’extrait de levure soit en milieu liquide SP4 ou gélosé Hayflick. En milieu liquide c’est le virage du PH qui témoigne d’une culturealors qu’en milieu solde les colonies apparaissent en 5 à 7 jours avecun aspect d’œuf sur le plat.

Techniques directes :

Technique immunoenzymatique fondée sur la propriété d’adhésionde la protéine P1 bactérienne et utilisant des anticorps anti protéineP1 marquées à la peroxydase. L’amplification génique par PCR est sensible mais n’apporte pas undiagnostic de certitude compte tenu de la présence de mycoplasme àl’état de portage.

VI.5.2.6-Sérologie :La technique de fixation du complément permet de poser un diagnosticcertain lorsque le taux d’anticorps augmente 4 fois entre deux sérumsprélevés à 15 j d’intervalle.Les techniques immunoenzymatique permettent de détecter les IgM en 7 à10 jours.L’agglutination au latex :2 sérums sont nécessaires le premier au début de la maladie et l’autre 2 à 4semaines plus tard.A-Recherche des agglutinines froides :Leur présence s’explique par la production par le sujet infecté d’auto-anticorps (IgM) dirigés contre ses propres hématies dont les antigènes desurface sont altérés par les peroxydes libérés par M.pneumoniae.

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Ces agglutinines sont présentes entre 30 à 70 % et ne sont pas spécifiques,leur recherche n’est plus pratiquée.B-Réaction de fixation du complément :Consiste en la recherche des anticorps dirigés contre les antigènesglycolipidiques de la bactérie.Elle détecte les anticorps totaux et demande de titrages de l’antigène, ducomplément et des anticorps.Les anticorps fixant le complément apparaissent le 7ème jour de la maladieet persistent pendant plusieurs mois.Le diagnostic d’une infection récente est posé devant une augmentationsignificative des anticorps de 4 fois entre le premier et le 2ème sérum.Un taux de positivité de 64 sur un seul sérum ne permet pas d’affirmerl’infection récente.Des réactions faussement positives ont limité l’utilisation de cettetechnique.C-Immunofluorescence :L’antigène bactérien est utilisé soit directement soit sous forme de culotlavé et fixé sur lame : cette technique permet de rechercher les IgM et IgGmais sa principale difficulté réside dans le fait que des artefacts peuventêtre à l’origine de faux positifs étant donné que les mycoplasmes changentde forme cellulaire, il est parfois difficile de les reconnaitre.D.Technique ELISA :Permet de rechercher aussi bien les IgG que les IgM, c’est une méthodesensible et spécifique adaptée pour les analyses en série, détecte lesanticorps en 7 à 10 jours.La technique est identique aux techniques ELISA.E.Agglutination de particules de latex :

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Des particules de gélatine, sensibilisées par le composant de la membranecellulaire de la bactérie vont être agglutinées par des anticorps anti-M.pneumoniae présents dans le sérum, la technique est réalisée sur plaqueen U. Le sérum est recueilli après centrifugation puis décomplementaté à56°C pendant 30 mn. Reconstituer le lyophilisat de particules de latex sensibilisées et nonsensibilisées avec le diluant. Conserver au frais (2-10°) jusqu'à utilisation. Déposer 100 ul de diluant dans la cupule n°1, 25 ul dans les cupulesn°2 à 12. Ajouter 25 ul de l’échantillon à tester dans la cupule n°1l’homogénéiser. Prélever 25 ul de l’échantillon dilué et le transvaser dans la cupulen°2, continuer jusqu’à la cupule n°12 pour obtenir des dilutions de 2en 2. Déposer 25 ul de solution de particules non sensibilisées dans lacupule n°2 et 25 ul de solution de particules sensibilisées dans lacupule n°3 à 12. Tester en parallèle de la même manière le sérum témoin positif. Agitation sur agitateur automatique pendant 1 mn. Couvrir la plaque et laisser incuber à température pendant 3 heures.

Lecture :

Le contrôle négatif ne doit pas agglutiner. Les contrôles réactif, diluant et particules sensibilisées et nonsensibilisées doivent rester négatifs. Le contrôle positif doit titrer 320. Placer la plaque sur un visionneur ou sur une surface blanche. Une réaction positive est à partir d’un titre de 40 et plus.

Précautions à prendre :

Eviter la contamination du sérum et des réactifs. Eviter les vibrations lors de l’incubation de la plaque.

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VI.5.3-Legionella pneumophila :

VI.5.3.1-Prélèvement :Différents prélèvements peuvent être effectués : l’expectoration ou le plussouvent lavage broncho-alvéolaire (LBA) ou brossage, la biopsiepulmonaire, et parfois la ponction pleurale.L’acheminement au laboratoire est immédiat.VI.5.3.2-Examen direct :La technique d’immunofluorescence directe utilise un anticorpsmonoclonal. Elle consiste à étaler le prélèvement sur lame et à révéler laLegionella par des anticorps monoclonaux marqués à la fluorescéine.Cette technique est sensible dans 75 % et spécifique dans 100 % mais ne sepositive qu’au bout de 4 à 6 semaines.VI.5.3.3-Mise en culture :Elle n’est pas systématique et tend à être remplacée par des techniquesrapides.Les prélèvements effectués (LBA, expectoration, aspiration trachéale) sontexaminés au laboratoire.Si le prélèvement est fluide l’ensemencement se fera directement sanstraitement préalable.En présence de prélèvements plus épais il faudrait le fluidifier par undigesteur (voir technique expectoration).Pour les prélèvements contaminés tel que l’expectoration il est nécessairede décontaminer par acidification.Le prélèvement est traité volume à volume par une solution tampon à pH =2 (HCL 0.2 M, KCL) 30 minutes à température ambiante puis neutralisé parune solution de KOH à 0.01 N à pH = 11 (exemple : 0.5 ml de prélèvementsont rajoutés à 0.5 d’une solution à pH 2 , puis pour la neutralisation à 0.5ml d’une solution à pH 11).

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En cas d’échec de la décontamination par acidification seule, un chauffagedu prélèvement pendant 30 mn au bain marie à 50°C suivi d’uneacidification /neutralisation sont effectués.La culture se fait par ensemencement de 0.1 ml de prélèvement par boitepar un étalement au râteau.Deux boites du milieu BCYE (Buffer Chocolat Yeast Extract) sont utiliséespar prélèvement l’une contenant la cystéine et l’autre sans cystéine etincubées à 35°C sous 2.5 % CO2.Le milieu BCYE est additionné d’inhibiteurs en cas de prélèvementcontaminé (expectoration), polymyxine B (80 U/ml), cefamandole (4ug/ml), anisomycine (80 ug/ml) ou le mélange céfalotine (4 ug/ml),colistine (16 ug/ml) Vancomycine (0.5 ug/ml) et cyclohexemidine (80ug/ml).

Si le laboratoire ne possède pas d’étuve à 2.5 % de CO2 une cloche avec unebougie peut être utilisée ou alors une incubation à l’air.Les cultures sont examinés quotidiennement jusqu’à 10 jours, les coloniesgénéralement apparaissent en 3 à 4 jours.Les cultures sont examinées à l’aide d’une loupe binoculaire(stéréomicroscope au grossissement 30) pour la recherche de legionelles.Les colonies apparaissent sous l’aspect de verre fritté.Elles seront repiquées sur milieu BCYE avec ou sans cystéine.L’identification à partir de la culture est de 40 à 60 %.Les colonies suspectes sont des bacilles à gram négatif qui ne cultive pas surmilieu dépourvu de cystéine, la réaction catalase est positive, l’oxydase estinconstante, la gélatinase est positive et l’immunofluorescence directe estpositive.

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Les tests biochimiques ont peu d’intérêt en dehors de l’hydrolyse del’hippurate.VI.5.3.4-Diagnostic rapide :Plusieurs techniques sont proposées pour la recherche d’antigènes dans lesurines.La technique « Enzyme Immunoassay »(EIA) recherche l’antigène deLegionella dans les urines (Biotest), donne un diagnostic précoce sensible etspécifique.Principe :

Les anticorps monoclonaux regroupant tous les sérotypes sont fixésau fond des cupules. Les urines du malade rajoutées dans les cupules contenant des Agvont réagir avec les anticorps. Apres des lavages, un anticorps anti- L.pneumophila marqué à laperoxydase est rajouté. Le substrat est rajouté après des lavages ; Une réaction positive donne une coloration lue auspectrophotomètre.

Matériel nécessaire :

Pipettes de 100 ul. Incubateur 37°C. Laveur de microplaques. Spectrophotomètre 450 nm. Eau distillée.

Prélèvement :Urine prélevée dans un dispositif stérile gardée à T° ambiante pendant 24 h, peut être conservée 2-8°C pendant 14 jours ou congelée à -20°C.Le test :

Plaque contenant 12 cupules :1ère cupule : est le blanc, les cupules 2 et3 : contrôles négatifs, cupule 4 : contrôle positif. Distribuer à partir de la cupule 2,100 ul de prélèvement.

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Incuber à 37°C, 1 heure. Lavage 3 à 5 fois par la solution de lavage. Rajouter 100 ul d’antilegionella à chaque cupule. 3ème incubation 10 mn, T° ambiante et à l’obscurité. Rajouter 100 ul de solution d’arrêt dans chaque cupule, la colorationbleue des prélèvements positifs doit virer au jaune, s’il y a colorationverte il faut agiter les cupules jusqu’à sa disparition.

Lecture

Lecture à 450 nm. La DO du blanc et du contrôle négatif doit être < à 0.100. DO du contrôle positif doit être > à 0.600. Si ces conditions ne sont pas réunies il faut refaire le test. Un prélèvement est positif si la DO est > à 0.600.

Précautions :

Un traitement antibiotique peut diminuer le taux d’antigènes toutcomme un patient peut excréter l’antigène longtemps après saguérison. Une confrontation des résultats de la sérologie à la clinique estnécessaire.

VI.5.3.5-PCR :Non encore généralisée.

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VI.5-Bordetella (voir fascicule IPA 2004) :

VI.5.1-Prélèvement : le meilleur prélèvement est l’aspirationnasopharyngée.VI.5.2-Culture :Ensemencer deux boites de milieu de Bordet et Gengou une ne contenantpas d’antibiotique et l’autre contenant 40 ug/ml de cephalexine.Incuber à 35°C pendant 7 jours.Au bout de 2 à 3 jours, les colonies peuvent apparaitre, elles sont de 0.2 à 1mm arrondies à bords réguliers, surélevées à surface luisante et refletmétallique et entourées d’un halot d’hémolyse.B.pertussis a une culture plus lente que les autres espèces de Bordetella.VI.5.3-Identification :A partir de colonies suspectes effectuer des tests d’orientation à savoir, lacoloration de gram qui montrera des bacilles de gram négatifs, et lesréactions de catalase et oxydase qui sont positives.Réisoler en nappe sur 4 boites de Bordet et Gengou : une boite pour doserl’activité de l’adényl cyclase, l’autre pour la conservation de la souche, unepour l’antibiogramme et une pour le sérotypage.Isoler en stries une boite pour l’identification.Ensemencer une galerie Api 20 E, incuber 24 h : les caractères les plusimportants sont l’absence d’acidification des glucides, absence de nitrateréductase et d’uréase.L’identification directe par immunofluorescence à partir d’une suspensionbactérienne peut être réalisée.VI.5.4-Recherche de toxines et facteurs d’adhérencebactériens :

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À partir de culture bactérienne on effectue une suspension dense puis uneimmunofluorescence directe en utilisant des anticorps monoclonaux.VI.5.5-L’identification du sérotype :Se fera par immunofluorescence directe en utilisant des anticorpsmonoclonaux ou par agglutination.Les sérotypes 1.2 et 3 sont les plus fréquents.VI.5.6-Biologie moléculaire :

La PCR est utilisée pour a détection directe de B.pertussis à partir duprélèvement. Elle est aussi utilisée pour la recherche de la toxine. La caractérisation des souches épidémiques se fait par électrophorèseen champs pulsé.

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Références :1-Acheli.H et Arous O, étiologies bactériennes des suppurationspulmonaires (excepté mycobactéries):place des anaérobies. Mémoire envue d’obtention du diplôme d’ingénieur en Génie biologique. USTHB 19982-Baough, N.Ramdani-Bouguessa et N.Zidouni. Les pleurésies purulentes del’adulte observées dans un service de pneumologie d’Alger. Revue médicpharmaceutic .2000 : N°14 :39-42.3-Belabed.K. Étude des infections uro-génitales et pulmonaires àMycoplasmes : Thèse de doctorat en Sciences médicales, Constantine 1999.4-Carbonelle B, Denis F, Marmonier A, Pignon G, Vargues R : Bactériologiemédicale –Techniques usuelles. Editions SIMEP 1987.5-Costa Y, Mimoz A, Karim A, Cosseron M, Sami K et Jacques L : Etudecomparative quantitative entre examen microscopique et culture desprélèvements distaux protégés .Médecine et maladies infectieuses1996 :26 :618-23.6-Conférence de consensus sur les infections respiratoires .Médecine etmaladies infectieuses, 2000 :30 :568-580.7-Examen cytobactériologique des secrétions broncho-pulmonaires. Leréférentiel en microbiologie médicale, société française de microbiologieMédicale. 4ème édition 2004.8-Forgie IM, O’Neill KP L loyol, Evans N et al. etiology of lower respiratorytract infections in infant presenting at the hospital Pediatric InfectiousDisease J1991:10:33-41.9-Gendrel D, Cohen R, Bourillon A: Etiologies bactériennes des infectionsrespiratoires basses de l’enfant. Med Trop Péd 1999 : vol 2, hors série : 41-45.10-Hara K,Kohno S, Koga H, invasive technics for diagnosis of respiratoryinfectious diseases. Journal of infection and chemotherapy, 1996:1:166-176.11-Guizo N.isolation, identification and characterization of Bordetellapertussis.Dev Biol Stand.Base, 1997, 89:233-238.

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12-Guide national de la prise en charge des infections respiratoires aigues.Ministère de la santé.2002.13-Jarraud S, Reyrolle, Etienne J. Importance des nouvelles méthodes dediagnostic biologique dans la surveillance : l’exemple des legionelloses.lalettre de l’infectiologue, 1997, XII : 328-331.14-Jébrak G, Mangiapan G.Pneumopathies nosocomiales. La pressemédicale 1996 ; 25 :944-949.15-Kashuba A, Ballow C. Legionella urinary antigen testing: potentialimpact on diagnosis and antibiotic therapy. Diagnosis microbiologyInfectious Diseases, 1996; 24:129-139.16-Lazri M, Guizo N, Rahal K. Diagnostic bactériologique de Bordetellapertussis. Octobre 2004.Rapport fourni lors des journées d’évaluation duprojet OMS: surveillance de la résistance bactérienne aux antibiotiques.17-Le Freney : Chapitre Chlamydiae, Bordetella, Legionella. Edition 1994.18-lutte contre les méningites bactériennes purulentes. Rapport de l’ateliernational de consensus. Edition ANDRS 1998.19-Laalaoui SE, épidémiologie des infections respiratoires aigues dans unepopulation de référence. Thèse de DESSM, Alger 1994.20-Maoudj A, Adnane T, Gourari et coll.les bronchiolites du nourrisson :résultats d’une enquête virologique .communication orale, journée dePédiatrie sur les infections réspiratoires aigues, Alger le 19 octobre 1999.21-Ramdani N.Streptococcus pneumoniae : résistance et sérotypes chezl’enfant. Thèse de doctorat en médecine, Alger 2001.22-Ramdani N, Lazri M, Tali-Maamar H, Rahal K.Diagnostic bactériologiquede S.pneumoniae et surveillance de la résistance aux antibiotiques. Manueltechnique,2002.23-Ramdani-Bouguessa N, Rahal K, serotypes distribution andantimicrobial résistance of streptococcus pneumoniae isolated in Algeria,Algiers. Antimicrobial agents and chemotherapy, 2003, 2:824-826.

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AnnexesFiche technique Streptococcus pneumoniae :

I-Préparation du désoxycholate de sodium :

1-En milieu liquide :Préparer deux tubes de Kahn stériles.Distribuer dans chaque tube 0.5 ml d’une suspension bactérienne depneumocoque de densité 0.5 à 1 Mac Farland.Une quantité égale (0.5 ml) d’une solution de désoxycolate de sodium à 2 %(la bile) est ajoutée dans un tube alors que 0.5 ml d’eau physiologique estrajoutée dans le deuxième tube. Incuber 2 heures à 35°.Une réaction positive, indiquant la présence d’un pneumocoque, semanifeste par un éclaircissement du tube contenant le désoxycholate desodium alors que l’autre tube reste trouble.La solution de désoxycholate à 1% peut aussi être utilisée.2-En milieu solide :Déposer une goutte d’une solution de désoxycholate de Na à 10 % ou à 2 %sur les colonies. La boite est ainsi posée sur une surface plate, couverclevers le haut pendant 15 mn soit à température ambiante ou incubée à 35°Cen aérobiose.Une réaction positive se manifeste par une disparition des colonies ou leuraplatissement alors qu’une réaction négative laisse les colonies intactes.Il faudrait éviter les excès de solution qui favorisent le glissement descolonies ce qui pourrait être interprété comme positif par erreur.

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II-Les sérums et formule antigénique deS.pneumoniae :

1-Les sérums pour le sérotypage des pneumocoques :

Pool Type ou groupeA 1, 2, 4, 5,18*.B 3, 6, 8, 19.C 7, 20, 24, 31, 40.D 9, 11, 16, 36, 37.E 10, 12, 21, 33, 39.F 17, 22, 27, 32, 41.G 29, 34, 35, 42, 47.H 13, 14, 15, 23, 28.I 25, 38, 43, 44, 45, 46, 48.*Les groupes mentionnés en gras contiennent des sérotypes qui sont cités ci-dessous.

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2-Désignation des sérotypes et formules antigéniquesdes 90 sérotypes : (11)

Types Formules antigéniques Types Formule antigénique

1 1a 19C 19a, 19c, 19f, 7h.2 2a 20 20a, 20b, 7g3 3a 21 21a4 4a 22F 22a, 22b5 5a 22A 22a, 22c6A 6a, 6b 23F 23a, 23b, 18b6B 6a, 6c 23A 23a, 23c, 15a7F 7a, 7b 23B 23a, 23b, 23d7A 7a, 7b, 7c 24F 24a, 24b, 24d, 7h7B 7a, 7d, 7h, 7e 24A 24a, 24c, 24d7C 7a, 7d, 7f, 7g, 7h 24B 24a, 24b, 24h, 7h8 8a 25F 25a, 25b9A 9a, 9c, 9d 25A 25a, 25c, 38a9L 9a, 9b, 9c, 9f 27 27a, 27b9N 9a, 9b, 9c, 28F 28a, 28b, 16b, 23d9V 9a, 9c, 9d, 9g 28A 28a, 28c, 23d10F 10a, 10b 29 29a, 29b, 13b10A 10a, 10c, 10d 31 31a, 20b10B 10a, 10b, 10c, 10d, 10e 32F 32a, 27b10C 10a, 10b, 10c, 10f 32A 32a, 32b, 27b11F 11a, 11c, 11e, 11g 33F 33a, 33b, 33d11A 11a, 11c, 11d, 11 e 33A 33a, 33b, 33d, 20b11B 11a, 11b, 11f, 11g 33B 33a, 33c, 33d, 33f11C 11a, 11b, 11c, 11d, 11f 33C 33a, 33c, 33 e11D 11a, 11b, 11c, 11e 33D 33a, 33c, 33d, 33f, 3a12F 12a, 12b, 12d 34 31a, 34b12A 12a, 12c, 12d 35F 35a, 35b, 34b12B 12a, 12c, 12c, 12 e 35A 35a, 35c, 20b13 13a, 13b 35B 35a, 35c, 29b14 14a 35C 35a, 35c, 20b, 42a15F 15a, 15b, 15c, 15f 36 36a, 9e15A 15a, 15c, 15d, 15g 37 37a15B 15a, 15b, 15d, 15 e, 15h 38 38a, 25b15C 15a, 15d, 15 e 39 39a, 10d16F 16a, 16b, 11d 40 40a, 7g, 7h16A 16a, 16c 41F 41a, 41b17F 17a, 17b 41A 41a17A 17a, 17c 42 42a, 20b, 35c18F 18a, 18b, 18c, 18f 43 43a, 43b18A 18a, 18b, 18d 44 44a, 44b, 12b, 12d18C 18a, 18b, 18 e, 18g 45 45a19F 19a, 19b, 19d 46 46a, 12c, 44b19A 19a, 19c, 19d. 47F 47a, 35a, 35b19 19a, 19c, 19 e, 7h 47A 47a, 43b

48 48a

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3-Gamme de dilution pour les CMI et le screening test.

3.1-Gamme d dilution complète des CMI pour lesBétalactamines en milieu solide :

Concentration initiale concentration intermédiaireSolution Eau distillée

concentration finale enboite2000 mg/l (20 mg de poudre + 10ml d’eau distillée) 6.4 ml +3.6 ml 128 mg/l

1280 mg/l 2 ml + 2 ml : 640 mg/l 64 mg/l1 ml + 3 ml : 320 mg/l 32 mg/l0.5 ml + 3.5 ml: 160 mg/l 16 mg/l0.5 ml + 7.5 ml: 80 mg/l 8 mg/l80 mg/l 2 ml + 2 ml : 40 mg/l 4 mg/l1 ml + 3 ml : 20 mg/l 2 mg/l0.5 ml + 3.5 ml: 10 mg/l 1 mg/l0.5 ml + 7.5 ml: 5 mg/l 0.5 mg/l5 mg/l 2 ml + 2 ml : 2.5 mg/l 0.25 mg/l1 ml + 3 ml : 1.25 mg/l 0.125 mg/l0.5 ml + 3.5 ml: 0.63mg/l 0.063mg/l0.5 ml + 7.5 ml: 0.32mg/l 0.032mg/l0.32 mg/l 2 ml + 2 ml : 0.16 mg/l 0.016 mg/lCes concentrations sont obtenus après dilution au 1/10ème des solutions intermédiaires dans leMueller Hinton additionné de 5 % de sang de mouton.

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3.2-Gamme de dilutions pour le screening test de lapénicilline

Concentration initiale Concentration intermédiaireSolution Eau distillée

Concentration finale enboite16 mg de poudre + 10 ml d’eaudistillée 1600 mg/l

1600 mg/l 1 ml + 9 ml :160 mg/l160 mg/l 1 ml + 2 ml :80 mg/l80 mg/l 1 ml + 3 ml : 20 mg/l 2 mg/l0.5 ml + 3.5 ml :10 mg/l 10 mg /l0.5 ml + 7.5 ml :5 mg/l -5 mg/l 1 ml + 3 ml :1.25 mg/l 0.125 mg/l0.5 ml + 3.5 ml :0.63 mg/l 0.063 mg/lCes concentrations sont obtenus après dilution au 1/10ème des solutions intermédiaires dans leMueller Hinton additionné de 5 % de sang de mouton.Pour la pénicilline, seules les dilutions 0.063-0.125-1 et 2 mg/l seront testées.3.3-Gamme de dilutions pour le screening test àl’Amoxicilline et du Cefotaxime (174).

Concentration initiale Concentrationintermédiaire

Concentration finale en boite

20 mg de poudre + 10 ml d’eaudistillée 2000 mg/l -2000 mg/l 1 ml + 9 ml -200 mg/l 1 ml + 9 ml 2 mg/l20 mg/l 2 ml + 2 ml 1 mg/l10 mg/l 2 ml + 2 ml 0.5 mg/l

Ces concentrations sont obtenus après dilution au 1/10ème des solutions intermédiaires dans leMueller Hinton additionné de 5 % de sang de mouton.Pour l’Amoxicilline et le Céfotaxime, seules les dilutions 0.5, 1 et 2 mg/l seront testées.

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Fiche technique Chlamydiae :

I-Diagnostic direct

1-Equipements :

Flacons pastiques de 75 cm2 pour culture cellulaire (type COSTAR) ; Plaques de 24 puits pour culture cellulaire ; Lamelles rondes en verre de 1 cm de diamètre ; Billes de verre de 2 mm de diamètre ; Pipettes plastiques stériles de 1.5 et de 10 ml ; Seringues de 5 ml ; Agitateur de tubes type Vortex ; Centrifugeuse de plaques 24 puits, pouvant atteindre 1500 g ; Etuve à 37 °C et à atmosphère de 5-10% CO2 ; Microscope à équipement pour fluorescence ; Congélateur à -70°C ; Réfrigérateur à +4°C.

2-Réactifs et milieux de culture :

Milieu EAGLE MEM (entretien des cellules) ; Milieu de HANKS ; Trypsine ; Cycloheximide solution mère (actidione) ; Glucose à 10 % ; EAGLE enrichi (après inoculation) ; Tampon 2SP ; Milieu de conservation des souches : « 4SP » ; Bleu de Trypan

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Fiche technique mycoplasmes

1-Composition des milieux de culture :

Milieu liquide SP-4

La base

Mycoplasma broth base (Oxoid)………………………...3,5 g Tryptone (Difco)………………………………………………. 10 g Peptone (Difco)……………………………………………….. 5.3 g Glucose ………………………………………………………….....5g Rouge de phénol à 0.5 % …………………………………..20 ml. NaHCO3…………………………………………………………….2.2 g Levures à 25 % …………………………………………………35 ml Yeastolate (Difco) ……………………………………………..2g Eau distillé QSP …………………………………………………700 mlStériliser à 120 ° pendant 15 à 20 mn, pH=7.6

Suppléments stériles :

Milieu CMRL 1066 (X10) Difco ………………………….50 ml. Glutamine (X100) ……………………………………………..5 ml Sérum de veau fœtal……………………………….. ……….170 ml Colimycine………………………………………………………. 500 000 UI/L Ampicilline………………………………………………………..1g Rouge de Phénol (0.1%)………………………………….. 20 mlLe milieu diphasique a la même composition avec en plus 2 g d’agar purifié(Oxoid), il faut distribuer 3 ml de SP-4 gélosé et après solidification rajouter2 ml de milieu SP-4 liquide.

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Fiche technique Legionelles :

1. Composition du milieu de culture :

Buffer Charcoal Yeast Extract (BCYE):

Extrait de levure 10 g Charbon active 2g Agar 17g Tampon Aces (Acide N2-acétamido-2-amino-éthane-sulfonique) 10 g L-Cystéine HCL,2 H2O 0.4g Pyrophosphate ferrique soluble 0.25g KOH 1N 40g Eau distillée 1000 mlFiltrer (porosité 0.2) la cystéine et le pyrophosphate chacun séparémentdans 10 ml d’eau distillée stérile.Autoclaver les autres composants dans 980 ml d’eau distillée.Refroidir à 50°C et ajouter les composants filtrés.Ajuster à pH 6.9 +/- 0.05Milieu BCYE contenant des antibiotiques (BAB) :La composition est celle du milieu BCYE auquel sont ajoutés troisantibiotiques : Céfalotine 4 mg/l Colistine 16 mg/l Vancomycine 0.5 mg/lLes antibiotiques dissous chacun dans 1 ml d’eau distillée stérile, sontajoutés dans le milieu prêt à être coulé après ajustement du pH.

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2-Traitement des prélèvements contaminés paracidification-neutralisation :Acidifier par une solution HCL-KCL (0.2N), pH=2

KOH 0.01N 10.7 ml Eau distillée stérile qsp 100 ml

3. Test à l’hippurate :

A partir d’une culture de 24 à 96 heures de Legionella, réaliser uneémulsion dense dans 0.4 ml de milieu à l’hippurate stérile (hippuratede sodium à 1% en eau distillée) Laisser 18 à 24 h à 35°C. Ajouter 0.2 ml de ninhydrine Lire après 20 mn Une coloration violette signe une réaction positive.

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Légionellose-Diagnostic direct et culture

(LBA, Aspiration bronchique, Brossage bronchique, expectoration, liquide pleural,

biopsie pulmonaire)

BCYE sans Cystéine

35°-37°C 48 H minimum

Aérobiose 2.5 % CO2

BCYE + antibiotiquesBCYE

BCYE

Suspension en eau distillée stérile

Aspect macroscopique

Colonies

Identification de l’espèce et du sérotype

Immunofluorescence directe

Legionella

Absence de cultureCulture

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Fiche technique Bordetella

1-Milieu de Bordet et Gengou : en g/l1.1-Composition :

Protéose peptone 10g Infusion de pomme de terre 4.5g Chlorure de sodium 5.5g Agar 16g PH final = 6.7 +/- 0.2 QSP 1 litre d’eau distillée

1.2-Préparation :Faire liquéfier le contenu de chaque tube, en ramener la température à 45°-50°CAjouter stérilement : Sang de cheval = 10 à 15 %. Pénicilline = 10 unitésBien mélanger sans faire des bulles et couler en boites de Pétri.

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2-Identification des Bordetella :Test B.pertussisPhase I / Phase IV B.parapertussisPhase I / Phase IV B.bronchosepticaPhase I/Phase IV B.holmesii B.hinzii B.trematum B.aviumHémolyse + - + - + - + - - - -Croissance sur BGS + (3 à 4 j) + (2 à 3 j) + (1 à 2 j) +(2j) +(1j) + +Croissance sur Mac Conkay - + + + + + + +Oxydase + + + - + - +uréase - + + - - - -Nitrate réductase - - + - - +/- faible -utilization du citrate - - +/- faible - + + +/- faibleArginine Dihydrolase +/- - +/- - + +/-Ornithine décarboxylase - - - - + -acidification des carbohydrates - - - - - - -Mobilité - - - + - + + +Pigment sans brun sans brun sans jaunatre sansG+C % 67.7-68.9 68.1-69 68.2-69.5 61.5-62.3 66-67 64-65 61.6-62.6

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DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE DES INFECTIONS BRONCHO-PULMONAIRES