Enzimas de restrição ou endonucleasesEnzimas de restrição ou endonucleases de restrição de tipo II

DescobertaSistemas de modificação restrição

Como actuamAplicações 

Bacterial lysis after phage infectionacte a ys s a te p age ect o

Bacteriophage infection and plaque formation

Lysis plaques

Bacterial colonies

Sistemas de Restrição-ModificaçãoSistemas de Restrição Modificação

XX

YXAs bactérias resistem à infecção a novos fagos

O DNA fágico é digerido X YYX

O DNA fágico é digerido por enzimas bacterianasAs enzimas restringemo leque de hospedeiros à

X YYX

o leque de hospedeiros à infecção fágica

Modificação e restrição de um vírus, controlado pelo hospedeiro

Modificação do DNA Modificação do DNA METILAÇÃOMETILAÇÃOMETILAÇÃOMETILAÇÃO

1) Modificação do DNA METILAÇÃO1) Modificação do DNA- METILAÇÃO

2) Principal dador dos grupos metilo: SAM (S-adenosil metionina)) p g p m ( m )

SAMATP CH3 activo

S‐adenosil‐homocisteínaMetionina

3

HomocisteínaH2O

CH3

Exemplo de metilação

Metilações mais frequentesm6A‐ N6‐metiladeninam5C C5 metilcitosina

Metilações mais frequentes

m5C‐ C5‐metilcitosinam4C‐ N4‐metilcitosinahm5C‐ C5‐hidroximetilcitosinaC C5 hidroximetilcitosina

Sistemas de Restrição‐Modificação

Tipo I‐ ex sistema EcoKI, que só clivam DNA NÃO METILADOTipo II‐ consoante a enzima podem clivar DNA METILADO ou NÃO METILADOTipo IIITipo III

Sistemas de Restrição (endonucleases)ç ( )

McrA‐ C*CGGMcrB‐ G*CM C*AC C*AGMrr‐ C*AC   e   C*AG

Só CLIVAM sequências METILADAS

Sistemas de Modificação (metilases sítio‐específicas)

D (N6) G*ATCDam  (N6) G*ATCDcm (C5) C*CAGG   e    C*CTGG

SóMETILAMSó METILAM

Características das enzimas dos Sistemas de Modificação‐RestriçãoSistemas de Modificação‐Restrição

de tipo I, II e III

Sequências de reconhecimentodas enzimas de restrição

Tipo I

EcoAI GAGNNNNNNNGTCAEcoKI AACNNNNNNGTGCStySPI AACNNNNNNGTRC

Corte a mais de 1000 pb da sequência dereconhecimento que é bipartida e assimétrica

StySPI AACNNNNNNGTRC

Tipo II

EcoRI G/AATTCBalI TGG/CCAPstI CTGCA/G

Corte na, ou muito próximo da sequência  de reconhecimento que é frequentementePALINDRÓMICA e de 4 a 8 pb

Tipo III

EcoP151 CAGCAGEcoPI AGACCHinfIII CGAAT

Corte a 24‐26 pb a jusante da sequência dereconhecimento que é assimétrica e de 5 a 7 pb

Locais de corte, sequências de reconhecimento, locais de restrição

N‐ A, C, G ou T;  R‐ G ou A

PalíndromosPalíndromosPalíndromosPalíndromos

RADAR

MADAM IN EDEN I’M ADAM

ESOPE RESTE ICI ET SE REPOSEESOPE RESTE ICI ET SE REPOSE

5’‐GAATTC‐3’’ ’3’‐CTTAAG‐5’

Endonucleases de tipo IIEndonucleases de tipo II

• AccI Acinetobacter calcoaceticus

• AluI Arthrobacter luteusAluI Arthrobacter luteus

• BamHI Bacillus amyloliquefaciens H

• EcoRI Escherichia coli

• HaeIII Haemophilus aegyptiusHaeIII Haemophilus aegyptius

• Sau3AI Staphylococcus aureus 3A

Type II restriction enzymesType II restriction enzymes

Natureza das extremidades geradas após corte com as enzimas de restrição, é determinada pelo lado da ligação fosfodiéster onde ocorre o corte 

3’‐OH5’‐P5 P

Resultado da digestão do DNA com diferentes enzimas de restriçãoResultado da digestão do DNA com diferentes enzimas de restriçãoResultado da digestão do DNA com diferentes enzimas de restriçãoResultado da digestão do DNA com diferentes enzimas de restrição

Extremidades cegas e coesivas (ou salientes)( )

Extremidades 5’ e 3’projectadas

a 5’ do eixo de simetria a 3’ do eixo de simetria

As mesmas extremidades coesivas, produzidas pordiferentes enzimas de restriçãodiferentes enzimas de restrição

Sistema de modificação‐restrição das enzimas de tipo IISistema de modificação‐restrição das enzimas de tipo II(Exemplo)

A enzima de restrição cliva na sequência de reconhecimento:

…aactGAATTCtcgac……ttgaCTTAAGagctg…

…aactG AATTCtcgac……ttgaCTTAA Gagctg…

A metilase de EcoRI (M.EcoRI), cataliza a transferência de grupos metilo de SAM para as adeninas marcadas com * na sequência de reconhecimentoSAM para as adeninas marcadas com na sequência de reconhecimento

…aact G A *A T T C tcgac…*

A modificação da adenina (A*) para 6 metiladenina protege o DNA da

…ttga C T T *A A G agctg…

A modificação da adenina (A*) para 6-metiladenina, protege o DNA da clivagem pela EcoRI

Sistema de ModificaçãoSistema de ModificaçãoççMetilação Dam Metilação Dam 

M til ã D Gm6ATC ( il i ã N6 d d i N6 il d i )

1‐ Enzimas de restrição de tipo II (ex.), bloqueadas por metilação Dam

Metilação Dam: Gm6ATC     (grupo metilo na posição N6 da adenina: N6‐metiladenina )

ClaI G*ATCGAT

XbaI TCTAG*ATCXbaI TCTAG*ATC

MboI G*ATC

2‐ Enzimas de restrição de tipo II (ex.), não bloqueadas por metilação Dam

B HI GG*ATCCBamHI GG*ATCC

PvuI CG*ATCG

Sau3AI G*ATCA negrito‐ a sequência de reconhecimento da enzima de restrição de tipo II

Diferentes Diferentes padrões de metilaçãopadrões de metilaçãovsvsvsvs

diferentes sensibilidadesdiferentes sensibilidades de clivagemde clivagem

Uma sequência de DNA pode sofrer diferentes metilações, adquirindo diferentes padrões de metilação, consoante a especificidade das metilases da célulaEx.

Gm6ATC (Dam)GATm5CGATm4CGAThm5C

As enzimas de restrição podem apresentar diferentes sensibilidadesaos diversos padrões de metilaçãoEx: Sau3A1

CLIVA NÃO CLIVAGm6ATC

GATm5CGATm4CGAThm5C

Enzimas de restrição tipo II, Enzimas de restrição tipo II, com diferente sensibilidade à metilaçãocom diferente sensibilidade à metilaçãocom diferente sensibilidade à metilaçãocom diferente sensibilidade à metilação

DpnII não CLIVA CLIVA DpnIDpnII não CLIVA CLIVA DpnI

GATC Gm6ATC GATCCTAG CTm6AG CTAG

Sau3AI CLIVA

GATC Gm6ATC6CTAG CTm6AG

DpnI só corta sequência de reconhecimento quandometiladaDpnII “     “ “            “ “ “      não metiladaSau3AI “ “ “ “ “ metilada e não metiladaSau3AI                    metilada e não metilada

CLIVA

DpnI DpnII GATC

SÓ CLIVA NÃO CLIVANÃOCLIVA

GATC G*ATC

ilMetilase

As estirpes de Diplococcus pneumoniae que

GAT C

As estirpes de Diplococcus pneumoniae que produzem DpnI e DpnII terão que possuir padrões de metilação adequados à protecção da restriçãopor cada uma destas enzimas

Protecçãoda 

RestriçãoG*AT C

IsoesquizómerosIsoesquizómeros

1‐ Reconhecem a mesma sequência e clivam nos mesmos locais

AccIII TCCGGAAGGCCT Extremidades compatíveis com

XmaIBspEI TCCGGA

AGGCCT CCCGGGAGGCCT CCCGGGGGGCCC

2‐ Reconhecem a mesma sequência mas clivam diferentemente (geram extremidades diferentes)

Acc65I GGTACC XmaI CCCGGGCCATGG GGGCCC

KpnI GGTACC SmaI CCCGGGCCATGG GGGCCC

3‐ Reconhecem a mesma sequência mas apresentam diferente sensibilidade à metilação

DpnII e MboI não clivam G*ATC metilado vs Sau3AI cliva G*ATC metilado

DpnI cliva G*ATC metilado vs MboI não cliva G*ATC não metilado e ainda, após clivagem,geram extremidades diferentes

Metilação em organismos eucariotas‐ um outro significado biológico

• Mto variável consoante o organismo em causa. 

Ex. Drosophila‐ DNA não metilado

• Geralmente a metilação está associada a mecanismos de il i é isilenciamento génico

REGULAÇÃO EPIGÉNICAAlteração da expressão génica que não se deve a alterações na sequênciade DNA mas a algo que “a somar à sequência de DNA” influi a expressãode DNA, mas a algo que  a somar à sequência de DNA , influi a expressãogénica, como seja:

‐modificação de bases e proteínas (histonas)‐ factores proteicos que se ligam ao DNAp q g

Aplicação das enzimas de restrição de tipo II

DNA cloningg

DNA cloning• One of the most important goals of recombinant DNA technology is to

DNA cloning...• One of the most important goals of recombinant DNA technology is to 

clone a particular gene of interest or other DNA fragment of interest

• The approach used to clone a specific gene depends to a large degree• The approach used to clone a specific gene, depends to a large degree on:– the gene– what is known about it– what is known about it– objective 

• Among the several tools needed for cloning lets consider:Among the several tools needed for cloning, lets consider:– restriction enzymes– vector DNA– DNA ligaseDNA ligase– host cell

Isolating and cloning a DNA fragment

DNA ligase activityConstruction of a recombinant DNA molecule

VECTORS

• Central component of gene cloning experiments

• Two types of naturally ocurring DNA molecules:– Plamids – Bacteriophages

• Other constructed vectorsOther, constructed vectors– Cosmids– Phagemids

• Properties– Self‐replicatingSelf replicating– Unique restriction enzymes cleavage sites– Selectable marker– Easy to recover

Plasmídios• Geralmente moléculas de DNA circulares e cadeia dupla, com replicação independente do 

cromossoma bacteriano

• Podem existir em todos os tipos de bactériasp

• Papel importante na adaptação e evolução bacteriana

C difi t í i i d f t à él l• Codificam proteínas que na maioria dos casos conferem vantagens à célula

• Número variável de cópias

• Dimensões muito variáveis: 3kb‐200 kb

• Células bacterianas podem conter mais do que um tipo de plasmídio

• Grupos de incompatibilidade plasmídica

• Tipos de replicação dos plasmídios• Tipos de replicação dos plasmídios– Teta– Círculo rolante

• Importantes ferramentas em engenharia genética

Plasmids are small circular DNA molecules that are found inside some prokaryotic cells

Epissome

. 

Epissome

Type of plasmid Gene functions Examples

Resistance Antibiotic resistance Rbk of Escherichia coli andResistance Antibiotic resistance Rbk of Escherichia coli and other bacteria

Fertility Conjugation and DNA F of E coliFertility Conjugation and DNA transfer between bacteria

F of E. coli

Killer Synthesis of toxins that kill Col of E. coli, for colicin yother bacteria

,production

Degradative Enzymes for metabolism of TOL of Pseudomonas putida, g yunusual molecules

pfor toluene metabolism

Virulence Pathogenicity Ti of Agrobacterium tumefaciens, conferring the ability to cause crown gall disease on dicotyledonous plantsplants

Plasmídios construídos‐ um tipo de vector de clonagemImportantes ferramentas em engenharia genética

pBR322

pUC19

pCMV‐GLuc

Shuttle vector

Two different bacterial origins of replication: ‐ori pBR322 (ColE1, which is recognized in E. coli hosts)‐ ori pBC16 (which is recognized in B. subtilis hosts)

Plasmid DNA replication starts at oriPlasmid DNA replication starts at ori

Regulation of replication of ColE1 derived plasmidsRegulation of replication of ColE1‐derived plasmids

Rop protein dimer stabilizes the i iti l i i f RNA I d RNA II

RNA I and RNA II involved in the initiation of plasmidreplication that have a colE1 (or pBM1) origin

RNA I

Rop dimer

RNA III f tl F tl

initial pairing of RNA I and RNA II

RNA IIInfrequently Frequently

RNaseH

RNA I‐ RNA II duplex

RNA II inactivated for primer function

RNA II primes DNA synthesis

Replication:

No replicationReplication

Replication:‐Stringent ‐Relaxed

Low copy number plasmid (1‐2 copies)High copy number plasmid (>10 copies)

Coexistence of two plasmids of different Inc groupsCoexistence of two plasmids of different Inc groups

Unequal distribution of two plasmids

Each plasmid typeregulates its owncopy number

After division, both plasmids will replicate to reach their copy number

Curing of cells of one of two plasmids when they are members of the same Inc group 

Plasmid A

Plasmid B

Unequal distribution of two plasmid types

Plasmids regulateseach other’s replication

…Unequal distribution of  plasmids A and B

Cured of type A

The sum of the two plasmids will equal the copy number, but one may be underrepresented and lost in subsequent divisions. Eventually, most of  the cells will contain only one or the other plasmid.

Marcas importantes de um vector plasmídicovector plasmídico

Marca de resistência a um antibiótico para o qual a estirpeantibiótico para o qual a estirpehospedeiro é sensível

Bacteria cell transformationBacteria cell transformation

• Introduction of recombinant DNA molecules into a host (ex. E. coli)

• Different procedures: 

i d i (C Cl M Cl LiCl)– inducing competence (CaCl2, MgCl2, LiCl)

– electroporation

Transformed cells are isolated in SELECTION MEDIA

(a) Introduction of free DNA into bacterial cells (TRANSFORMATION)

Competent bacterial cells + Recombinant DNA plasmidCompetent bacterial cells    +    Recombinant DNA plasmid

SELECTION MEDIA

Recombinant DNA clones

Non‐recombinant DNA plasmid.Bacteria cells harbouring this plasmidwill grow, but won’t be recombinant clones

Ex. ANTIBIOTIC selection of plasmid DNA (recombinant and non‐recombinant)

Each colony a large number of cells results from one initial single cellEach colony, a large number of cells, results from one initial single cell

Cell divides and vectors are passed to progeny

Each colony is a CLONE, ie, contains identical copies of recombinant DNA molecules

Within the host, vector directs the copy number of recombinant DNA molecules

Características dos hospedeirosCaracterísticas dos hospedeirosvsvsvs vs 

metilaçãometilação

Ex.DNA recombinante amplificado numa estirpe Dam G*ATC 

MboI GATC não cliva G*ATCCTAG sequências metiladas CT*AGCTAG sequências metiladas CT AG

Sau3AI GATC cliva G*ATCSau3 G C c a G CCTAG sequências metiladas CT*AG

Características dos hospedeirosCaracterísticas dos hospedeirosvsvsvsvs

metilaçãometilação

Ex.DNA humano *CpGu a o CpG

Clonagem em estirpes (mutantes em Sistemas de Restrição)

mcrA‐ McrA‐ Cm5CGG

mcrBC‐ McrBC‐ Gm5CGh5CGN4CGN4C

Posso amplificar DNA humano numa estirpe de E. colimcrA‐ e mcrBC‐

e posteriormente clivá‐lo com MspI? E com HpaII? Porquê?

MspI e HpaII são isoesquizómeros, mas HpaII é bloqueada pela metilação em CG, realizada nos mamíferos e pelas enzimas de modificação Dcm.

M I ã é í l à til ã D til ã C G d íf iMspI‐ não é sensível à metilação, Dcm ou metilação CpG dos mamíferos, ie, Cm5CGG. No entanto não cliva em m4CCGG, m5CCGG, Cm4CGG e hm5Chm5CGG

HpaII‐ não cliva em Cm5CGG, m4CCGG, m5CCGG, Cm4CGG e hm5Chm5CGG

DNA librariesDNA librariesCollection of clones made of the original DNAg

Genomic DNA libraryandand

cDNA library

Construction of a genomic DNA libraryusing bacteriophage λ as a vector

Screening a recombinant library by hybridization

Shotgun cloning

Packaging into

Hybridization with aradiolabeled probe

phage particles

Bacteria infection

The appropriate phage plaque can then be

Collection of recombinant clones

isolated from the originalculture plate

C i f DNA libConstruction of a cDNA library

cDNA library is constructed with 

DNA l t DNAcDNA, or complementary DNA, 

which is 

synthetic DNA made from mRNA

with the use of 

reverse transcriptase

S th i f DNASynthesis of cDNA(in vitro)

mRNA purificationp

Synthesis of the double‐stranded DNA

Cloning cDNACloning cDNA

2 ASynthesis of the ds DNA

1mRNA purification

the ds DNA

mRNA is the template forthe synthesis of cDNAy

ssDNA molecule is used as a templatefor dsDNA synthesis

DNApolymerase I

2 BSynthesis of the ds DNAthe ds DNA

3Cloning cDNACloning cDNAResulting cDNA

ends in a hairpin loopwhich becomes a primer for DNA polymeraseI

Linkers

p y

The loop is then cleaved by S1 nuclease (which acts only on ss loop) 

Linkers

( y p)to produce a Ds cDNA molecule