Comparao Das Tcnicas de PCR-RT e ELISA Para Diagnstico de HIV-1

5/6/2018 Comparao Das Tcnicas de PCR-RT e ELISA Para Diagnstico de HIV-1 - slidepdf.com

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Comparação das técnicas de PCR-RT e ELISA para diagnóstico de

HIV-1

Martins, C.M.; Oricchio, J.G.; Scalco, R.A.; Gouvêa, A.F.

Abstract

The Standardization of diagnostic techniques for HIV was extremely important to the

development of new prophylatics treatments and educational measures. HIV is a viral that

is transmited mainly by blood, sexual contact and mother-son. The methods most

commonly used for diagnosis (RT PCR and ELISA) were compared according to their

efficency, specificity and specially its indications and costs. Discussing the use of the tests

in clinical laboratories, blood banks and hospitals. Each test has its indications and itsadvantages.

Resumo

A padronização de tecnicas diagnosticas para HIV foi extermamente importante para o

desenvolvimetno de novos tratamentos e medidas profilaticas educacionais. O HIV é um

virus que se transmite principalmente por sangue, contato sexual e mãe-filho.

Comparamos os metodos mais utilizados para diagnostico de HIV (PCR RT e ELISA) de

acordo com sua efuiciencia, especificidade e principalmente suas indicações e custos.

Discutindo o emprego dos testes estudados em laboratorios de analises clinicas, banco

de sangue e hospitais. Cada teste possui sua indicação e suas vantagens.



1. INTRODUÇÃO

1.1 HIV – Human Immunodeficiency Virus.

O Vírus da Imunodeficiência Humana, conhecido como HIV (sigla originada do

inglês Human Immunodeficiency Virus ), é um vírus pertencente à família Retroviridae ,

subfamília Lentiviridae , gênero Lentivírus e causador da AIDS (nome derivado da sigla em

inglês para Síndrome da Imunodeficiência Adquirida).

A primeira indicação de que a AIDS poderia ser causada por um retrovírus foi feita

em 1983, no Instituto Pasteur, por Barre-Sinoussi.

Existem dois retrovírus capazes de levar à Síndrome de Imunodeficiência

Adquirida, o HIV-1 e o HIV-2. O HIV-1 é o mais comum, sem restrições geográficas,

portanto, encontrado em populações de todos os países. Já o HIV-2 tem sido descrito em

diferentes regiões do mundo, porém, sempre, em indivíduos que tiveram algum contato

com o continente africano ou sua população – evidenciando, assim, como sendo um vírus

originário da África, mas que, atualmente, não se restringe ao continente africano.

O HIV-1 possui as estruturas de um lentivírus, gênero que tem forma de cone e

possui núcleo composto por proteínas. No caso do HIV, a proteína é a p24. Seu genoma

está descrito em nove genes individuais e por duas estruturas idênticas, denominadas de

repetições terminais nas extremidades 3’ e 5’. (BENTWICH et al., 2000)

Figura 1 - Organização e Estrutura Genômica HIV – 1. Localização dos principais antígenos do vírus HIV, os

mais pesquisados em testes de detecção de antígenos e os antígenos responsáveis pela produção de

anticorpos detectados em testes de pesquisa de anticorpos.



A transmissão do vírus HIV é feita através do vírus livre ou pelo contato entre

células contaminadas. Por isso, a transmissão por contato genital é a mais frequente, pois

essa região do corpo costuma conter mais células epiteliais e de defesa, que são mais

contaminadas pelo vírus. Além disso, estudos mostram que estas células infectadas

transferem o vírus para as células epiteliais com mais facilidade na presença de líquidoseminal, pois o contato célula-célula é estimulado provavelmente por fatores presentes no

sêmen.

Relacionar-se com um parceiro contaminado sem preservativos, porém, não atesta

que tenha ocorrido a contaminação. A quantidade de células infectadas no fluido genital

também interfere na probabilidade de contrair o vírus, explicando, assim, as variações na

transmissão entre diferentes parceiros sexuais. Outras razões para alguns indivíduos não

serem infectados ainda estão sendo estudadas. Contudo, não ter sido infectado após umarelação sexual sem proteção não torna o indivíduo imune ao vírus, que pode ser

contaminado se for exposto a uma nova situação de risco – com o mesmo ou outro

parceiro. (MUCIACCIA et al., 2007)

Recentemente, um estudo mostrou que é necessária uma porta de entrada no

canal vaginal ou no canal anal, como lesões, aumentando as chances de transmissão.

Esta informação ajuda a explicar os altos níveis de contaminação entre heterossexuais na

África. No continente, são frequentes os casos de úlceras vaginais causadas por doenças

venéreas, que são associadas à transmissão de HIV.

A transmissão é totalmente influenciada pela quantidade de vírus presente em

certo fluido corpóreo de um infectado, e também pelo tipo de contato com este fluido.

Estudos epidemiológicos realizados em 1982 indicaram que as principais vias de

transmissão da AIDS são contatos sexuais e por sangue contaminado. A síndrome foi

descrita primeiramente como uma doença que atingia homossexuais e usuários de drogas

intravenosas, mas logo foi incluído o contato íntimo heterossexual como uma via de

transmissão. Atualmente, foi comprovado que as atividades heterossexuais são as

responsáveis pelo maior número de infecções pelo mundo.

Três principais conceitos de transmissão são mantidos até os dias de hoje: sangue,

contato sexual e mãe-filho. Outros fluidos corpóreos – como saliva, lágrimas, aspirado

bronco-pulmonar, urina, fezes, líquido sinovial e líquido amniótico – já foram testados,

mas a presença do vírus livre ou de células infectadas não foi detectada. Porém, já houvecasos relatados de transmissão do vírus via leite materno, principalmente quando a mãe é



infectada após o parto. Nesse caso, a carga viral do leite materno pode se elevar pela

falta de uma resposta imune antiviral substancial da mãe. (BENTWICH et al., 2000)

Nos anos anteriores aos exames de detecção de anticorpos anti-HIV, hemofílicos e

usuários de transfusões sanguíneas podiam ser infectados por sangue e produtos

derivados contaminados, como bolsas de sangue, fatores VII e IX. Com a prática de

exames de triagem do sangue, o risco de infecção por transfusão foi reduzido para cerca

de 1/225000 unidades transfundidas. As chances de infecção do receptor aumentam

substancialmente se o doador desenvolver AIDS de dois a três anos após a doação.

Estudos comprovam que a carga viral de um doador recém-infectado interfere

diretamente nas chances de contaminação do receptor.

Conhecendo a fisiopatologia da doença e as principais vias de transmissão, é

possível padronizar técnicas diagnósticas, detectar o vírus e, com isso, definir as medidas

profiláticas a serem tomadas. O desenvolvimento dessas técnicas melhora o controle da

transmissão do vírus, a triagem de doadores de sangue e derivados e, ainda, auxilia os

estudos de novos tratamentos e medicações para os infectados.

1.2 Testes utilizados para diagnóstico de HIV-1

Um dos métodos laboratoriais para detectar o HIV-1 em pacientes é a cultura do

vírus através do cocultivo de células mononucleares do sangue periférico, plasma ou

células ganglionares, com estimulação de Peripheral Blood Mononuclear Cells- PBMCs de

doadores não infectados. Em condições apropriadas, em um sistema de cultura in vitro , é

feita uma infecção viral explosiva, ocasionando a produção de milhões de virions . A

cultura é lida como positiva pela formação de sincícios (isto é, células gigantes,

multinucleares, resultantes da fusão célula-célula), detecção da atividade da transcriptase

reversa ou presença do antígeno p24 no sobrenadante da cultura, eventos estes que

traduzem replicação viral. (HOUN HY, et al,. 1987)

Este método tem um alto custo, exige uma equipe de técnicos treinados e

condições laboratoriais de isolamento e segurança (confinamento PII ou PIII). Além disso,

o resultado é demorado, pois só é conhecido após um intervalo que varia entre quinze e

trinta dias. Por isso, sua indicação, atualmente, vem se restringindo à área de pesquisaclínica. Essa técnica apresenta defeitos de reprodutibilidade ligados à variabilidade das



células mononucleares dos doadores. A seleção de cepas de replicação rápida, in vitro,

pode provocar um viés de medição. Devido a todos esses fatores, outros métodos têm

sido desenvolvidos para detecção da infecção pelo HIV, com o intuito de um diagnóstico

mais eficaz e prematuro. (ROUET et al., 2001),(ROUET; ROUZIOUX, 2007).

Atualmente, os testes mais utilizados no diagnóstico de HIV-1 podem ser divididos

em três tipos:

- Testes de detecção de anticorpos;

- Testes de detecção de antígenos;

- Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa – PCR-RT.

Estes testes são realizados de acordo com o caso de cada paciente, sendo

utilizados para diferentes etapas do diagnóstico e tratamento. (HECHT et al., 2002)

1.2.1. Teste de detecção de anticorpos

Testes de anticorpo são projetados especificamente para a rotina de detecção de

HIV em adultos. São baratos e muito precisos. Mas eles apresentam resultados falsos

negativos durante o período de janela imunológica, que varia de três semanas a seis

meses, a partir do momento da infecção até que o sistema imune produza quantidades

detectáveis de anticorpos.

O teste de detecção de anticorpo mais utilizado é o chamado ELISA (Enzyme-like

immunosorbant assay), que funciona com a detecção de anticorpos utilizando uma

conjugação de anticorpos, antígenos e enzimas.



Figura 2 - Esquema do método ELISA, mostrando sua placa sensibilizada com antígenos específicos que

se ligam nos anticorpos presentes na amostra. A cor da reação é alterada com um anticorpo marcado com

enzima.

Outro teste de anticorpos muito utilizado é chamado de “Western-Blot”. Mais

específico que o ELISA, esse teste usa eletroforese de proteínas de diferentes pesos

moleculares como anticorpos e proteínas polimerases. A interpretação deste teste é

baseada nos diferentes padrões das bandas que aparecem no gel da eletroforese. Um

paciente é considerado HIV positivo quando são observados mais de três padrões de

bandas condizentes a anticorpos anti-HIV.



Figura 3 - Gel "HIV - Western Blot" banding patterns. A primeira fita mostra o padrão dos antígenos virais

separados por peso molecular. A segunda fita mostra o padrão de um paciente considerado reagente. A

terceira fita mostra o padrão de um paciente considerado não reagente.

1.2.2. Testes de detecção de antígenos

Existem testes que, ao invés de buscar nas amostras os anticorpos produzidos

pelo paciente infectado, buscam epitopos ou parte do material genético do patógeno em

questão.

Para infectados pelo HIV-1, existe um teste chamado “p24 antigen assay”, que

busca exatamente uma proteína que compõe o vírus HIV chamada p24, sendo detectadas

todas as proteínas desligadas e livres no plasma do paciente. Este ensaio não é utilizado

com muita frequência para determinar se um paciente foi ou não infectado pelo vírus HIV,

pois os níveis de antígenos livres possuem muita variação, de acordo com a carga viral e

com os diferentes estágios da infecção pelo HIV.

A proteína p24 pode ser detectada na primeira fase da infecção, quando o vírus

ainda está na fase de replicação. A partir do momento em que o sistema imunológico do

paciente começa a produzir anticorpos, os níveis de p24 livres caem bruscamente e se

mantém baixos até o último estágio da doença, quando volta a ser encontrada uma

grande quantidade de p24 livre.



A pesquisa da proteína p24 é importante para o monitoramento desses pacientes,

podendo identificar em qual estágio o paciente se encontra da infecção, possibilitando,

assim, a criação de uma estratégia de tratamento mais específica para a sua doença e o

estágio em que ela se encontra.

Este teste também é utilizado para monitorar o funcionamento e a eficácia de

antivirais como o AZT (Zidovudine), ddI (didanosine) e ddC (zalcitabine). Se os agentes

antivirais estão se mostrando efetivos e eficazes, os níveis de p24 diminuem.

Pelo fato deste ensaio pesquisar o antígeno ao invés do anticorpo, ele é somente

utilizado como teste primário para diagnóstico de HIV em crianças com mais de dois

meses de idade. Nesses pacientes é mais eficaz a busca do antígeno do que a do

anticorpo, pois crianças não são boas respondedoras ao vírus HIV-1.

1.2.3. Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa – PCR-RT

Outro teste confirmatório para infectados com o vírus HIV-1 é o PCR-RT (Reação

em Cadeia Polimerase com Transcrição Reversa). Normalmente, é utilizado por

pesquisadores ou quando é necessária uma confirmação de uma amostra clínica. O

protocolo do exame se baseia na clonagem de uma sequência desenhada de DNA que

ocorre em ciclos.

Para utilizar esta técnica para diagnóstico de HIV, dois primers (sequências

idênticas de DNA contidas no material genético do vírus) são utilizados para sinalizar uma

região do DNA ou RNA do vírus. Esta região sinalizada será amplificada, ou seja, copiada

por várias vezes seguidas até criar, no final de 90 ciclos, um número de mais de um bilhão

de cópias do DNA alvo pesquisado.

Em cada ciclo da reação acontecem processos envolvendo enzimas, primers e

nucleotídeos livres. A enzima polimerase é a enzima responsável pela leitura e cópia da

sequência de DNA ou RNA sinalizada pelos primers .

O PCR-RT amplifica o material genético do vírus – ácido ribonucléico (RNA) ou atémesmo o ácido desoxirribonucléico (DNA) – nas células infectadas pelo HIV.



Diferentemente do ELISA e do Western Blot, o PCR-RT detecta os nucleotídeos do

próprio vírus, buscando diretamente a presença do vírus na amostra. Isso torna o teste

altamente específico, pois testa evidências diretas da existência do vírus e não a

existência de anticorpos contra este vírus.

O PCR-RT se diferencia dos testes que detectam antígenos, pois a técnica

consegue detectar o material genético do vírus dentro de sua célula hospedeira, o que os

outros testes que buscam antígenos não são capazes, pois só detectam os antígenos

livres (ou seja, fora das células).

Crianças recém-nascidas de mães infectadas podem carregar anticorpos contra o

vírus sem necessariamente carregar o vírus, o que causaria um falso positivo nos

resultados dos exames ELISA e Western Blot. Assim, o teste de PCR-RT se mostraria

mais adequado para esses pacientes.



2. OBJETIVOS

Comparar as técnicas de diagnóstico de HIV mais utilizadas, PCR-RT e ELISA,

quanto a sua eficiência, indicação e custo.



3. Discussão

3.1. PCR- RT

Utilizado como teste de confirmação para amostras tipadas como positivas pelo

ELISA, o PCR-RT é, atualmente, o teste mais utilizado para a busca de antígeno nas

rotinas de diagnósticos e nos centros de pesquisa. (CHRONISTER, 1995)

O PCR-RT consiste na busca de proteínas específicas e conhecidas do vírus a ser

pesquisado, amplificando sua quantidade de um para um bilhão de fragmentos de DNA

estudado. Desta forma, não existe a necessidade de uma resposta imunológica anterior

para se detectar a presença do vírus na amostra colhida, reduzindo, assim, a janela

imunológica e o tempo de invisibilidade do vírus.

Com a técnica de PCR qualitativo para HIV, é possível detectar a presença do vírus após

quatro dias de infecção (podendo variar de paciente para paciente). (PEREIRA et al.,

2002)

A partir da informação de que o PCR busca genes para proteínas específicas virais,

podemos contar, também, com uma avaliação quantitativa e não só qualitativa, ou seja, é

possível determinar a presença ou não do vírus e a carga viral, a fase da infecção e a

eficácia de tratamentos alternativos em testes.

O PCR-RT, acima descrito, é indicado para algumas situações diagnósticas:

confirmar o resultado do teste ELISA, caso tenha sido positivo; determinar a carga viral

em pacientes portadores do HIV; estudos feitos por laboratórios de pesquisa relacionados

ao vírus HIV.Além de ser usado em exames diagnósticos, o PCR-RT também tem a função de

purificar, amplificar e sensibilizar placas de ELISA com antígenos específicos que serão

utilizadas para detecção de anticorpos.

O exame conhecido como Golden Standard para HIV pela Organização Mundial da

Saúde é o Western Blottling. Mas quando uma amostra é titulada como positiva nestes

testes, a rotina dos laboratórios é utilizar das técnicas de PCR para confirmação do

diagnóstico.O PCR-RT é um teste relativamente caro, que exige uma mão-de-obra



especializada e equipamentos específicos para realização dos ciclos das reações. A

possibilidade de erros humanos é considerável, contando que são utilizados valores

baixíssimos de reagentes e amostras, sendo necessária a utilização de pipetas

extremamente precisas e muito bem calibradas. (REZENDE, 2002),(PEREIRA et al.,

2002),(PINHATA et al., 1994),(ROUET et al., 2001)(ZAZZI et al., 1993).

3.2. ELISA

O teste conhecido como ELISA, Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay, já é

descrito pelo nome, um imuno-ensaio utilizando ezimas e anticorpos anti-anticorpos

humanos, para detectar a presença de produção de resposta imunológica para

determinado vírus ou patógeno.

O ELISA, hoje em dia, é o exame mais realizado para detecção do vírus HIV em

laboratórios de rotina, bancos de sangue e hospitais em geral. É um teste extremamente

confiável, quando realizado nas condições predefinidas, de acordo com o procedimento e

ação do teste.

O ELISA é um teste que detecta o anticorpo produzido pelo paciente em resposta a

uma infecção do vírus a ser pesquisado. Essa produção de anticorpos leva algum tempopara ser suficientemente grande, a ponto de ser detectada em um teste de laboratório.

Esse período de invisibilidade do teste chama-se janela imunológica, que é fase em que o

exame não detecta a presença de anticorpos, que denunciariam a existência do vírus, e o

paciente infectado pode obter um falso negativo como resultado.

Nessas condições não podemos incluir esses falsos negativos como erros do teste

ou erros humanos, pois a janela imunológica varia de paciente para paciente, cada um

com sua resposta imunológica própria. (RIBEIRO et al., 1993)(PERRE, 2006).(REZENDE,2002)(MACHADO; COSTA, 1999)

Com essas informações, é possível perceber que o ELISA é um teste confiável,

desde que realizado com acompanhamento médico, estudo do caso e avaliação das

melhores opções de diagnóstico. Por exemplo: se um paciente relata situação de risco

ocorrida há sete dias e gostaria de realizar um teste para detecção de HIV, o ELISA é útil

para atestar se o paciente tinha ou não o vírus até a situação de risco. Porém, ele não

detecta se houve contaminação na ocasião apontada pelo paciente em um único teste.Para obter um resultado fidedigno sobre a situação do suposto paciente, é

necessária a realização de sucessivos testes ELISA, que podem se prolongar de trinta



dias a seis meses, até ser possível obter um resultado confiável de que o resultado

negativo do paciente não é devido à janela imunológica. (HOUN HY, et al,. 1987)

As principais utilizações do ELISA, hoje em dia, são para fins diagnósticos em

geral, em laboratórios de rotina e análises clínicas; em laboratórios de pesquisa; tipagem

de bolsas sanguíneas em bancos de sangue e em hospitais em geral.

3.3 Protocolo PCR-RT

3.3.1 Extração de RNA

Seguir protocolo específico para cada kit.

3.3.2 Síntese de cDNA

1. Num tubo de 500μl fazer a seguinte mistura:

Componentes Quantidade

Hexanucleotideos aleatórios 1 μl

RNA 100ng

DEPC – H2O q.b.p. 10 μl

Tabela 1

2. Incubar a 65ºC durante 5min e, posteriormente, colocar no gelo.

3. Preparar a mistura de reação de acordo com o número de reações a

fazer e agitar suavemente em vortex:

Componente Quantidade / 1 reacção Quantidade / 1 reacção

5x cDNA Synthesis Buffer* 4 μl

DTT 0,1M 1μl

DEPC-H2O 1μl

dNTP Mix 10mM 2 μl

RNaseOUT 40U/μl 1μl

ThermoScrip (15 U/μl) 1μl

Tabela 2 *agitar 5s em vortex antes de utilizar



4. Pipetar 10μl da mistura de reação para cada tubo de reação em gelo e

misturar com pipetagens sucessivas.

5. Transferir os tubos para o aparelho de PCR pré-aquecido à temperatura

apropriada para a síntese de cDNA e incubar com o seguinte programa:

25ºC, 10min → 50ºC, 50min → 85ºC, 5min. 6. Adicionar 1μl de RNase H e incubar a 37ºC durante 20min.

7. Guardar o cDNA a -20ºC.

3.3.3 PCR

1. Num microtubo de 1,5ml em gelo, preparar a seguinte mistura de reação

de PCR (“master mix”):

Componente Quantidade / Quantidade / 1 reação

Tampão de PCR (s/ Mg) 10x 5μl

MgCl2 50mM 1,5μl

dNTP Mix 10mM 1μl

Primer 1 10μM 1μl

Primer 2 10μM 1μl

Platinum Taq DNA Polymerase (5U/μl) 0,4 μl

Água ultra-pura 34,1 μl

Tabela 3

2. Num microtubo de 0,2ml misturar, em gelo:

Componente Quantidade

Padrão interno (2primer

pair/8competimer)

4μl

cDNA 2μl

Tabela 4

3. Transferir 44μl da “master mix” para o microtubo de 0,2μl e misturar

pipetando várias vezes com a micropipeta suavemente.

4. Ligar o aparelho de PCR e iniciar o programa de amplificação. Transferir os

microtubos preparados em 3 para o bloco de aquecimento do aparelho

somente quando a temperatura estiver a 94°C. Fechar a tampa e ajustá-la



para contatar com a tampa dos microtubos.

5. Programa de PCR:

94°C - 2min

55°C – 30seg72°C – 45seg 33x

94°C – 30seg

72°C – 5min

6. Analisar 10μl da mistura de PCR por eletroforese em gel de agarose 1,5%. (O’CONNELL,

2002)

3.4 Protocolo Elisa

Protocolos de execução variam muito de kit para kit. Materiais de empresas diferentes

podem apresentar protocolos diferentes.

Este teste consiste em uma placa pré-sensibilizada com o antígeno p24 (proteína

pertencente ao código genético do vírus que causa produção de anticorpo quando em

contato com o sistema imunológico do infectado), que será submetida ao plasma dopaciente a ser testado. Este antígeno presente na placa se ligara ao anticorpo presente

no plasma do paciente infectado, mudando a estrutura deste anticorpo.

Junto com o kit, existe um anticorpo especifico que se liga no complexo antígeno-

anticorpo deixando este complexo colorido.

É necessário analisar as concentrações das amostras em vista de evitar falsos

resultados por motivos de concentrações das amostras. Um exemplo de protocolo de

ELISA é descrito abaixo.Adicionar 1/10 de volume de solução de lysing à amostra e homogenizar com ajuda do

vortex. Incubar em 37°C por 1 hora. Lavar a placa três vezes com solução tampão. Fazer

as diluições padrões sugeridas para a amostra e pipetar 100µl da amostra lisada em cada

poço da placa. Selar a placa e incubar em 37°C por 2 horas ou durante a noite em 4°C.

Lavar a placa três vezes com solução tampão. Adicionar 8µl do soro de coelho anti-

p24 a 10.4 ml do diluente preliminar. Pipetar mais 100 µl da solução preliminar em cada

poço. Selar a placa e incubar em 37°C por 1 hora. Lavar a placa três vezes com soluçãotampão. Adicionar 40µl do anti-IgG de coelho marcado a 12 ml do diluente secundário e



pipetar 100 µl da solução em cada poço da placa. Selar a placa e incubar em 37°C por 1

hora. Lavar a placa três vezes com solução tampão. Pipetar 100 µl da solução carcaça

em cada poço da placa. Selar a placa e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos.

100 µl de stop solution em cada poço da placa e ler em 450nm. Referência em 650nm.

3.5 Sensibilidade e especificidade

Para se utilizar um teste diagnóstico, primeiramente, é necessário determinar os

índices de especificidade e de sensibilidade.

A especificidade de um teste é a capacidade que ele tem de detectar somente o

anticorpo/antígeno que se deseja pesquisar, excluindo reações cruzadas e ligações com

proteínas que não são específicas do teste. Fazendo isso, a probabilidade de um

diagnóstico falso positivo é reduzida, pois não há o risco de detectar anticorpos/antígenos

que não os que se têm a intenção de descobrir.

Já a sensibilidade é a capacidade que o teste possui de detectar quantidades

pequenas de anticorpo/antígeno presentes na amostra, diminuindo a probabilidade de

resultar em um falso negativo.

De acordo com os kits de ELISA e PCR-RT é determinado que esses são os doistestes com os maiores índices de especificidade e sensibilidade para detecção de HIV.

Esse ponto da discussão, portanto, constata a eficiência de ambos. (HOUN HY, et al,.

1987)

3.6 Reprodutibilidade (erro humano)

Um dos índices de certificação de um teste é a reprodutibilidade. Trata-se da

capacidade que um teste tem de obter os mesmos resultados a partir de amostras iguais,

estudadas por técnicos diferentes e em diferentes laboratórios. Dentro da

reprodutibilidade, há um ponto a ser discutido: o erro humano.

Os testes comparados neste trabalho possuem protocolos, métodos, reagentes e

suas quantidades bem distintos. Por isso, para evitar o erro humano, é indispensável que

os profissionais que lidam com ambos os testes sejam capacitados para tais funções.

Porém, o ELISA é um teste relativamente simples, normalmente realizado por

técnicos de laboratório de análises clínicas, sem a necessidade de que esse profissional

seja especializado no exame.



Já o PCR-RT requer mão-de-obra especializada, pelo fato de se utilizarem volumes

muito baixos de reagentes e haver grande risco de contaminação de amostras. Além

disso, o profissional que executa o PCR-RT precisa estar capacitado para interpretar os

padrões de bandas e gráficos gerados pela reação de PCR.

Esta diferença de mão-de-obra utilizada não interfere na reprodutibilidade de cadaum dos testes, pois os laboratórios que oferecem os serviços de PCR-RT, sem exceção,

precisam contratar profissionais capazes de realizar o procedimento eficazmente. Porém,

essas diferenças entre os protocolos fazem com que os custos de cada teste variem.

No ELISA, o laboratório precisa dispor de pouco material além do que está incluso

no kit adquirido, além de profissionais menos onerosos, pois não precisam ser

especializados. No PCR-RT, o laboratório necessita de aparelhos de última geração para

que a reação aconteça, reagentes mais específicos e caros e mão-de-obra especializada,portanto, mais cara.

3.7 Banco de sangue

A maioria dos bancos de sangue realiza uma rígida entrevista com os doadores

para controlar a qualidade das bolsas coletadas. O objetivo desse procedimento é

descartar a possibilidade de coletar sangue de um doador possivelmente contaminado ou

que esteve em situações de risco – como manter relações sexuais sem a utilização de

preservativos, consumo de drogas com agulhas compartilhadas ou a realização de

tatuagens e piercings (que podem ter sido feitos com material infectado).

Posteriormente, é realizada uma bateria de exames sorológicos para atestar a

segurança do material colhido, antes que ele seja armazenado no banco de sangue e, por

fim, transfundido. Entre esses exames, está a sorologia para HIV-1. O teste utilizadonessa pesquisa nos bancos de sangue é o ELISA imunoensaio anti-anti-p24 (já descrito

acima).

Porém, esse procedimento não pode ser considerado fidedigno. Seu resultado,

para ser confiável, depende de que o potencial doador tenha respondido à entrevista com

absoluta veracidade. Caso esse paciente, que omite sua exposição ao risco, tenha sido

contaminado, o teste sorológico não será capaz de detectar a presença do vírus. Isso

ocorre graças ao período de janela imunológica. Com isso, há o risco do banco de sangueliberar uma bolsa contaminada com o HIV para transfusões sanguíneas.



Atualmente, muitas pessoas utilizam os serviços do banco de sangue como um

laboratório gratuito de sorologias. Esse comportamento é comumente visto em São Paulo.

Após passar por situações de risco, pacientes procuram um banco para doação

interessados apenas nos resultados das sorologias.

Desconhecendo a janela imunológica do teste, o indivíduo omite informaçõesessenciais durante a entrevista, invalidando o resultado do exame. Com isso, ele origina

dois problemas. Primeiro, coloca um possível receptor de sangue em risco, pois uma

bolsa contaminada pode acabar sendo liberada para o uso. Além disso, acreditando em

um resultado falho, torna-se um potencial vetor de transmissão do vírus na sociedade.

Em um banco de sangue localizado no Estado de São Paulo foi realizada a triagem

de uma doadora, resultando todos os testes negativos. A bolsa então foi liberada para

transfusões. Alguns meses após essa doação, a mesma doadora retornou ao banco desangue para realizar outra doação e foi constatado na triagem como HIV positiva. Testes

de biologia molecular foram realizados na primeira amostra evidenciando que a primeira

bolsa, já transfundida, estava contaminada pelo vírus HIV.

Casos como esse, provam a necessidade da adaptação do setor de triagem dos

bancos de sangue com técnicas de biologia molecular para maior segurança do doador e

do receptor.



4. Conclusão

Com as informações discutidas acima, chegamos à conclusão de que os testescomparados são eficientes, reprodutíveis, sensíveis e específicos.

Porém, cada teste caminha em conjunto com uma serie de indicações e

acompanhamentos.

ELISA é o teste de escolha para detecção e triagem de pacientes com situações de

riscos, com a correta avaliação e acompanhamento médico, seguindo as indicações para

que não se obtenha falsos negativos devidos à janela imunológica do teste. Repetindo o

teste no minimo tes vezes no periodo de seis meses.

O PCR ainda é considerado um teste confirmatório, com um período de janela

imunológica reduzido. Deve ser usado em casos de pesquisas únicas (de uma só

amostra), onde não se pode saber se o paciente na data da coleta estava dentro do

período de janela imunológica.

O PCR é também utilizado na determinação da carga viral de pacientes HIV

positivos, sendo o único teste capaz de realizar este tipo de estudo quantitativo com tal

precisão.

Bancos de sangue deveriam, por questão de qualidade e precaução, utilizar a

biologia molecular na triagem das bolsas de sangue, mesmo com o aumento do custo

deste setor.



6. Referências Bibliográficas

BENTWICH, Z.; MAARTENS, G.; TORTEN, D.; LAL, A.A.; LAL, R.B. Concurrent infections

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CHRONISTER, C.L.; Serologic Confirmation of HIV Infection. American Academy of

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Comparao Das Tcnicas de PCR-RT e ELISA Para Diagnstico de HIV-1