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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN CARRERA DE ESPECIALIZACION EN

BIOTECNOLOGIA INDUSTRIALBIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

FCEyNFCEyN--INTIINTI

Materia de Especialización CEBI_E11

RECUPERACIÓN Y PURIFICACIÓN DE MACROMOLÉCULAS

Docente a cargo: Mariano GRASSELLI

CEBI_E11_6 : Partición en dos fases acuosas

IDEA:

Extracción de productos no proteicos a partir de medios naturales o de caldos de cultivo mediante el uso de solventes orgánicos no miscibles con el agua (Ej. la extracción penicilinas de un cultivo de hongos).

Se llaman dos fases acuosas cuando el contenido de agua en cada fase es superior al 85-90%

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Microbiólogo holandés Beijerinck año 1896

Solución de agar + solución acuosa

concentrada de almidón son inmisibles

El sueco Albertsson en 1961

Desarrollo de los sistemas bifásicos acuosos

Ventajas:

– Económico

– Condiciones suaves de extracción

– Rápido

– Altos rendimientos

– Escalado sencillo

– Capacidad concentradora

Desventajas:

– Tediosa puesta a punto

– Factor de purificación intermedio/bajo

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Polímeros hidrosolubles capaces

de formar 2FA

• POLIETILENGLICOL (PEG)

• AGAR

• ALMIDON

• DEXTRANO (Dx)

• CARBOXIMETILCELULOSA (CMC)

• POLIPROPILENGLICOL (PPG)

• POLIVINILPIRROLIDONA (PVP)

• ALCOHOL POLIVINILICO (PVA)

• POLISACAROSA (FICOLL)

• HIDROXIPROPIL ALMIDON

• (marcas comerciales: REPPAL, AQUAPHASE)

• etc.

Polietilenglicol (PEG)

HO-CH2-CH2-(O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O) n-CH2-CH2-OH

– PEG 600

– PEG 4000

– PEG 8000

– PEG 20000

ATENCION: los polímeros no tienen un PM exacto (es una

distribución de PM)

Son diferentes moléculas !!!

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Componentes de los sistemas 2FA

• Tipo Polímero / polímero

– PEG-dextrán

– PEG-hidroxipropil almidón (PVP o PVA)

• Tipo Polímero/sal

– PEG-fosfato

– PEG-sulfato

– PEG-citrato

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

0 5 10 15 20 25 30

Pol2 %p/p

Pol1

%p/p Curva binodial

2 fases

1 fase

Ej.= Pol1=PEG Pol2=dextránEj. = Pol1=PEG Pol2=fosfato

Representación gráfica del fenómeno fisicoquímico

Cantidad total en el sistema completo !!

Cantidad total en el sistema completo !!

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Composición global del sistema

Sistema de 1 fase

[Pol1]

Sistema de 2 fases

[Pol1] = ((Pol1)FS * volFS + (Pol1)FI * volFI)/ (vol FS + vol FI )

NOTA: Tanto el Pol1 como el Pol2 se encuentran en las dos fases, sin embargo la concentración en una de las fases será muy superior a la otra con lo cual muchas veces se considera (y/o aproxima a) cero en la fase que se encuentra en menor concentración.

Parámetros de caracterización de

los sistemas 2FA

• 1er parámetro

– Curva binodial

• 2do parámetro

– Rectas de reparto (tie-line)

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Pol2 (%p/p)

Pol1 (%p/p)

Fase SUP

Fase INF

Diagrama de fases

Comportamiento de una proteína

en un sistema de 2 fases acuosas

concentración de P en la fase superior (Cs)

coeficiente de partición (KP) =

concentración de P en la fase inferior (Ci)

Las características moleculares que hacen que las proteínas se repartan diferencialmente en un sistema de 2FA son:

• PESO MOLECULAR• CARGAS ELECTROSTATICAS superficiales• HIDROFOBICIDAD superficial

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Las condiciones que pueden variarse para cambiar la constante de partición de una proteína son :

1) Tipo de polímeros que forman las 2 fases.

2) Concentración de los polímeros que forman las 2 fases.

3) Contenido de agua que acepta el sistema manteniendo las dos fases

Mayor contenido de agua quiere decir que los polímeros están mas concentrados

Como ejemplos generales podemos citar que:

En sist P/P a mayor cc de polímeros, la K se hace más extrema

4) Peso molecular de los polímeros que forman las 2 fases.

A mayor PM polímero la proteína tiende a salir de esa fase.

5) pH. es efectivo solo en los sistemas Polímero/Polímero

6) Temperatura.

Es efectivo solamente con algunos polímeros

termosensibles especiales donde la separación de fases

ocurre a determinada temperatura.

7) Fuerza iónica

8) Tipo de sales en cuya presencia se realiza la extracción

(por adición de otras sales. Por ej. NaCl) se utilizan como

modificantes de la constante K.

9) Unión de ligandos de afinidad a los polímeros.

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Partición de una proteína según PM

Sistema pol/pol

PEG 6000Dx 500

pH = pI de c/proteína

Partición de Ovoalbúmina c/ sales

Sistema pol/pol

PEG 6000Dx 500

Cloruros

SulfatosLi+

K +

Na +

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PROTEÍNA ORGANISMONro de

extraccionesFactor de purificación

Rendimiento (%)

Aspartasa E. coli 3 18 82

Formato dehidrogenasa

Candida

boidini3 4,4 78

FumarasaBrevibacterium

amonigenes2 22 75

Penicilin acilasa E. coli 2 10 78

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

0 5 10 15 20 25 30

Pol2 %p/p

Pol1

%p/p Rectas de reparto

Punto crítico

Son infinitas líneas paralelas entre sí que unen dos puntos de la binodial (se determinan experimentalmente).

Contenido de agua

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Cómo comparar dos sistemas de

2FA para la purificación de una

proteína?• Determinar

– K de la proteína de interés (KP)

– K de la o las proteínas contaminantes (KC).

Nota: es común utilizar en esta técnica una K que

representa a las proteínas contaminantes como una

sola, aunque este concepto no es correcto ya que cada

proteína tendrá un comportamiento individual diferente.

• Entonces el sistema ideal es

– KP>1 y KC<1

– o alternativamente KP<1 y KC>1.

Calculo del % de recuperación de

la proteína

Si definimos M como la masa de proteína,

MT = MS + MI

Además K = CS / CI = (MS / VS )* (VI /. MI)

Entonces

MI = (MS.* VI )/ (K * VS)

Considerando que MT = 100 %

100 % = MS + (MS.* VI )/ (K * VS)

100 % = MS (1 + VI / (K * VS))

% MS = 100 % / (1 + VI / (K * VS))

Recuperación en fase SUP

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2FA Sistema 1

Homogenato

PEG / salDesechos celulares / Otras proteínas / Ácidos nucleicos

Sal 2FA Sistema 2

FI

Otras proteínas / Ácidos nucleicosFS

FI

Producto

FS

Esquema de un proceso industrial

Los sistemas de dos fases tienen baja tensión superficial, => poca energía para mezclarlos ⇒el equilibrio se logra en minutos⇒La separación por decantación se logra en 30-90 min. (PEG/sal) y 2h-6h para PEG/dextran.

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Sistemas de mezclado continuo

Sistema de extracción centrífugo

continuo

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Sistemas de afinidad

PROTEÍNA LIGANDO DE AFINIDAD

Tripsina Diamino-difenilcarbamilo

Seroalbúmina Ácido graso

β-lactoglobulina Ácido graso

Histona / Miosina Äcido graso

3-oxo- esteroide isomerasa Estradiol

Formaldehído dehidrogenasa NADH

Formato dehidrogenasa NADH

Hemoglobina IDA-metal

Fosfofructokinasa Cibacron blue

Piruvato kinasa Cibacron blue

Hexokinasa Cibacron blue

Lisozima Red HE-3B

Prealbúmina Remazol yellow

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Esquema de un proceso con sistemas de afinidad

Como sacar los polímeros del

producto?

• El agregado de una sal al PEG generará otro sistema de dos fases que extraiga la enzima. Las sales se sacan por UF (o diálisis en lab.).

• Si el PEG es de bajo PM y la proteína alto PM se puede diafiltrar.

• Se puede precipitar la muestra con solvente o sales pero los precipitados siempre van a tener polímero contaminante.

• Extracción con intercambiadores iónicos previo ajuste del pH y fuerza iónica.

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Comportamiento de los

contaminantes más comunes

• Restos celulares Pueden quedar en ambas fases, en una, en la interfase o

sedimentar.

En gral. se concentran en la fase inferior.

• Los ácidos nucleicos y los polisacáridosSe concentran en la fase más hidrofílica

En gral. corresponde a la fase compuesta por dextran o las

sales.

Precipitación vs. Sistema de 2FA

El PEG además de ser utilizado para formar

sistemas de 2FA, también se usa para

precipitar proteínas. Entonces, como saber

que fenómeno esta ocurriendo?

Para diferenciarlos aplicamos concentraciones distintas de extracto a una solución de PEG.

–Si la concentración de la proteína de interés en el sobrenadante (o fase superior) se mantiene constante => precipitación

–En cambio si la concentración de la proteína responde linealmente con la concentración del extracto => sistema de 2FA.

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Sistemas con detergentes

Isooctanol2-etilhexil-sulfosuccinato

agua

Micelas reversas

Se reextrae de la fase orgánica con 1M de KCl

> Cantidad de proteínas

Proteínas q+ en micelas

Problemas: baja capacidad – se requiere baja fuerza iónica

Sistemas de extracción con

detergentes

Detergente: Triton X-100 / Triton X-114 (Cloud point 31 C)Polímero 2: Copolimero de Etileno y Propileno (EOPO)

Proteína de fusión: Hidrofobina-Endoglucanasa

Fase polímero (REPPAL) +

agua

Fase detergente +

agua