Characterization of ethylene biosynthesisCharacterization of ethylene biosynthesis and its regulation during fruit ripening in kiwifruit Actinidia chinensis ‘Sanuki Gold’kiwifruit, Actinidia chinensis ‘Sanuki Gold’

Sandra Casimiro Gonzáles

Juan Carlos Dávila Romero

James Euler Villar

Conceptos Previos.

BIOSÍNTESIS DE ETILENO

MET

SAM

ACCETHSAM

ACS

ACO

Conceptos Previos.MECANISMO DE ACCIÓN DEL ETILENO

EN PRESENCIA DE ETILENO

EN PRESENCIA DE 1‐MCP

MECANISMO DE ACCION DEL 1‐MCP

Conceptos Previos.RELACIÓN KIWI ‐ PRODUCCIÓN DE ETILENO.

• Rara vez produce etileno .p

• Biosíntesis desencadenada por:

– Presencia de etileno exógeno– Presencia de etileno exógeno.

– Daño físico.

Ataque de patógenos– Ataque de patógenos.

Conceptos Previos.1 – MCP.• Metil Ciclo Propano: olefina cíclica sintética.• Bloquea el acceso del etileno a sus receptoresBloquea el acceso del etileno a sus receptores.• El efecto varía según frutos, estadíos de madurez.• En tomates, peras, melones: retrasa la producción de

etileno; inhibe la expresión de ACS y ACO (biosíntesisetileno; inhibe la expresión de ACS y ACO (biosíntesisregulada por el sistema autocatalítico).

• En plátanos y duraznos: no presenta efecto (biosíntesis noregulada por el sistema autocatalítico)regulada por el sistema autocatalítico).

• No ha sido estudiada la duración de su efecto inhibitorioen presencia de etileno en frutos recien cosechados dekiwikiwi.

Materiales. KIWI.

• Actinidia chinensis “Sanuki gold”g

• Orígen: China

• Bajo contenido de azúcar• Bajo contenido de azúcar.

• Alto contenido de ácidos orgánicos.

Metodología. 1. DETECCIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ETILENO.

OBJETIVO:Conocer el tiempoen que se generail l

Jarra 1.3 lѲ incub. = 2h 

etileno en losfrutos maduros

1 ml gas

GC – FID: Detección de etileno

Metodología. 2. TRATAMIENTO CON PROPILENO.

OBJETIVO:Determinar lasensibilidad de labi í i d

96 DAP 143 DAP 154 DAP1 DAPMadurez comercial

Madurez comercial

Fruto j

66 DAPFruto j biosíntesis de

etileno ante laexposición alpropileno, en

comercial temprana

comercialjovenjoven

5000 µL/Lp p ,frutos de diferenteestado demadurez.

Bolsa 15 l15 frutas

5000 µL/Lpropileno

Incubar 12h/25°C12h/25 C

Abrir y evacuar aire

Reinyectar 5000 µL/Lpropileno Continuar el proceso 

hasta detectar la producción de etileno

Metodología.3. TRATAMIENTO CON 1 – MCP.

OBJETIVOS:1. Estudiar laregulación de laí i d il

Seleccionar frutos que producen etileno

síntesis de etileno.2. Determinar laconcentración de1‐MCP requerida

Bolsa 15 l15 frutas

Incubar 12h/25°C

qpara la supresiónde la actividad deetileno.

1 µL/L 5 µL/L 10 µL/L 100 µL/L

Metodología.4. EFECTIVIDAD DEL 1 – MCP.

Control150 DAP25°C

Tratamiento con 1‐MCP10 µL/L x 12h

Para todos los frutos:

5000 µL/L propileno

Jarra 1.3 l2 h incub.

1 ml gasGC – FID:

Detección de etileno

Conservar el fruto a ‐80°C

Extracción de RNAExtracción de RNAAnálisis de Expresión de Genes

Metodología.5. CLONACIÓN DE FRAGMENTOS DE DNA.

Fruto ‐80°C

Extracción de RNA

RNA + Oligo (dt)

Obtención de cDNA(primera cadena)

Amplificación de la Primera Cadena

Identificación de Clonación de genesIdentificación de fragmentos

(SAM, ACS, ACO)

RT – PCR + TAClonación de genes responsables de la 

biosíntesis de etileno

Metodología.6. ANALISIS DE GENES.

De cada muestra RNA (5 µg)

Electroforesis  1.2% Gel AgarosaGel Agarosa

Transferencia a membrana Hybond‐N+

Hibridización de los genes 

L d iLavados sucesivos 

Detección inmunológica 

CDP‐Star(sustrato quimioluminiscente) 

+ Exposición a HP‐CFg

(placa de luminiscencia) 

Resultados.

Respuesta de la fruta kiwi cosechada en diferentes etapas de desarrollo para eltratamiento con propileno para determinar la respuesta de la biosíntesis de etileno

Cosechada a etapa de explotación comercial

Niveles del pico deproducción de etilenodisminuye a medida que lafruta avanza en su madurezfruta avanza en su madurez

Resultados.

Supresión de la biosíntesis de etileno por 1‐MCP en el tratamiento de maduración delos frutos

Recolección de frutos en laetapa de madurez comercialpde 154 DAP y 4 días deexposición a propileno.

Control no produjoniveles detectables deetileno

Resultados.

La inhibición de la producción de etileno de 1‐MCP en el tratamientofruta madura

se observa después del día 2 antes de producir etileno

De manera constante

Coincide con producción de etileno

Se observa después de 5 días

Conclusiones.

1. El fruto no inicia la biosíntesis de etileno sinexposición previa a factores que desencadenanla reacción.

2 La sensibilidad de la biosíntesis del etileno ante2. La sensibilidad de la biosíntesis del etileno anteel tratamiento con propileno disminuye amedida que el fruto madura.

3. La biosíntesis del etileno está regulada por unaretroalimentación positiva (presencia deestímulos externos)estímulos externos).

4. El 1‐MCP aplicado en la cosecha, protege alfruto de los efectos del etileno.

Limitaciones de la Investigación.

• No se evalúan los compuestos volátiles.No se evalúan los compuestos volátiles.

• Se desconoce el comportamiento de los componentes volátiles y el flavor del frutocomponentes volátiles y el flavor del fruto.

• Ambiguedad en la interpretación del blotting.

Futuras Investigaciones en el Tema.

• Niveles de proteínas del receptor de etileno durante lafase inmad ra e al ar hasta la senescenciafase inmadura; evaluar hasta la senescencia.

• Efecto de otros inhibidores de etileno como laaminoetoxivinilglicina (AVG) o el ácidoaminoetoxivinilglicina (AVG) o el ácidoaminooxiacetico (AOA) que actúan como inhibidoresde enzimas bloqueando la conversión de SAM en ACC(Salisburry y Ross 2000)(Salisburry y Ross, 2000) .

• Influencia en la capacidad antioxidante y compuestosbioactivos, después de los tratamientos con propileno,, p p p ,1‐MCP y al 1‐MCP‐propileno al que será sometido elfruto de kiwi.