7/29/2019 Aerotaxis in Azospirillum

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J O U R N A L O F B A C T E R I O L O G Y , N o v . 1 9 8 2 , P . 6 4 3 - 6 4 90 0 2 1 - 9 1 9 3 / 8 2 / 1 1 0 6 4 3 - 0 7 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t 6 1 9 8 2 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g yV o l . 1 5 2 , N o . 2

A e r o t a c t i c R e s p o n s e o f A z o s p i r i l l u m b r a s i l e n s eRINA BARAK, ISRAEL NUR, YAACOV OKON,* AND YIGAL HENIS

D e p a r t m e n t o f P l a n t P a t h o l o g y a n d M i c r o b i o l o g y , F a c u l t y o f A g r i c u l t u r e , T h e H e b r e w U n i v e r s i t y o fJ e r u s a l e m , R e h o v o t 7 6 1 0 0 , I s r a e lR e c e i v e d 1 8 J u n e 1 9 8 2 / A c c e p t e d 2 8 J u l y 1 9 8 2

F i v e s t r a i n s o f A z o s p i r i l l u m b r a s i l e n s e a n d t w o o f A z o s p i r i l l u m s p p . , f r o mI s r a e l , r e s p o n d e d t o s e l f - c r e a t e d a n d p r e f o r m e d o x y g e n g r a d i e n t s b y f o r m i n ga e r o t a c t i c b a n d s i n c a p i l l a r y t u b e s a n d a c t i v e l y m o v i n g t o w a r d a s p e c i f i c z o n ew i t h l o w d i s s o l v e d o x y g e n . I n c r e a s i n g t h e o x y g e n c o n c e n t r a t i o n i n c a p i l l a r i e sc o n t a i n i n g p h o s p h a t e b u f f e r i n c r e a s e d t h e n u m b e r o f a t t r a c t e d b a c t e r i a a n dd e c r e a s e d b a n d v e l o c i t y . H i g h 0 2 c o n c e n t r a t i o n s a n d H 2 0 2 t e m p o r a r i l y r e p u l s e dt h e b a c t e r i a , c a u s i n g t h e f o r m a t i o n o f a b a c t e r i a l a r c a r o u n d t h e c a p i l l a r y m o u t h .T h e r e w a s n o b a n d f o r m a t i o n u n d e r a n a e r o b i c c o n d i t i o n s , a l t h o u g h t h e b a c t e r i ar e m a i n e d h i g h l y m o t i l e . E x o g e n o u s e n e r g y s o u r c e s w e r e u n n e c e s s a r y f o r a e r o -t a x i s i n A z o s p i r i l l u m s p p . T h e a d d i t i o n o f o x i d i z a b l e s u b s t r a t e s t o t h e c a p i l l a r ys l i g h t l y e n h a n c e d a e r o t a x i s , p o s s i b l y b y a c c e l e r a t i n g 0 2 c o n s u m p t i o n . A e r o t a c t i cb a n d f o r m a t i o n w a s a f f e c t e d b y p H , b a c t e r i a l c o n c e n t r a t i o n a n d a g e , i n c u b a t i o nt i m e , a n d r e s p i r a t o r y i n h i b i t o r s , b u t n o t b y t h e l a c k o f c o m b i n e d n i t r o g e n i n t h eg r o w t h m e d i u m . I t i s p r o p o s e d t h a t a e r o t a x i s p l a y s a r o l e i n t h e c a p a c i t y o fA z o s p i r i l l u m s p p . t o r e a c h a n e n v i r o n m e n t s u i t a b l e f o r N 2 f i x a t i o n .

A t t r a c t i o n t o w a r d o x y g e n ( a e r o t a x i s ) , f i r s td e m o n s t r a t e d b y B e i j e r i n c k ( 6 ) , s e e m s t o e x i s t i na w i d e v a r i e t y o f b a c t e r i a ( 5 ) . N e v e r t h e l e s s , i nc o n t r a s t t o e x t e n s i v e s t u d i e s o f c h e m o t a x i s ,r e l a t i v e l y f e w r e p o r t s o n a e r o t a x i s h a v e b e e np u b l i s h e d s i n c e t h e t u r n o f t h e c e n t u r y ( 1 , 2 , 4 , 5 ,7 , 1 2 , 1 8 ) . T h e p h e n o m e n o n w a s e x a m i n e d m o s t -l y b y m i c r o s c o p i c a n d m a c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n sa n d r e c e n t l y b y t e m p o r a l a n d s p a t i a l g r a d i e n ta s s a y s ( 1 2 ) .R e p o r t s o n t h e n i t r o g e n - f i x i n g b a c t e r i a , A z o -s p i r i l l u m s p p . , i n d i c a t e t h a t t h i s o r g a n i s m m i g h th a v e a n a e r o t a c t i c r e s p o n s e . N u r e t a l . ( 1 4 ) a n dO k o n e t a l . ( 1 6 ) f o u n d t h a t A z o s p i r i l l u m c e l l s ,g r o w i n g i n t e s t t u b e s i n a s e m i s o l i d m e d i u m ,d e v e l o p e d a n a r r o w g r o w t h p e l l i c l e b e l o w t h es u r f a c e . I n c r e a s i n g t h e a g a r c o n c e n t r a t i o nc a u s e d t h e p e l l i c l e t o m o v e c l o s e r t o t h e a i r -w a t e r i n t e r f a c e , t h u s i n d i c a t i n g t h a t A z o s p i r i l -l u m c e l l s s e e k l o w o x y g e n l e v e l s f o r g r o w t h . Ap r e l i m i n a r y s t u dy o f c h e m o t a x i s i n A z o s p i r i l l u mb r a s i l e n s e , w i t h t h e c a p i l l a r y a s s a y t e c h n i q u e( 3 ) , s h o w e d a t t r a c t i o n t o s o l u t i o n s w i t h o u t o x i -d i z a b l e s u b s t r a t e s , c o n t a i n i n g e i t h e r p h o s p h a t eb u f f e r o r s a l i n e a n d a l s o t o d i s t i l l e d w a t e r ( 1 6 ) .T h e s e f i n d i n g s s u g g e s t t h a t A z o s p i r i l l u m c e l l sa r e a t t r a c t e d t o t h e o x y g e n d i s s o l v e d i n w a t e r .We s t u d i e d t h e a e r o t a c t i c a c t i v i t y o f A . b r a s i -l e n s e u n d e r v a r i o u s g r o w t h a n d i n c u b a t i o n c o n -d i t i o n s b y u s i n g m i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n s a n dq u a n t i t a t i v e m e a s u r e m e n t s i n c a p i l l a r i e s .

MATERIALS AND METHODSB a c t e r i a l s t r a i n s . A . b r a s i l e n s e ATCC 2 9 7 2 9 ( C d ) ,i s o l a t e d f r o m r o o t s o f C y n o d o n d a c t y l o n ( 1 0 ) , w a su s e d i n m o s t e x p e r i m e n t s . I t w a s c o m p a r e d w i t hs t r a i n s S p 7 , S p l 3 , S p 5 l e , S p 8 l ( 9 ) a n d C d - 1 a n d C d - 3 ,i s o l a t e d i n I s r a e l ( 1 4 ) .M e d i a a n d g r o w t h c o n d i t i o n s . B a t c h c u l t u r e s w e r eg r o w n i n 1 0 0 - m i E r l e n m e y e r f l a s k s , e a c h c o n t a i n i n g 2 0m l o f s y n t h e t i c m a l a t e m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h0 . 0 5 % N H 4 C l a n d 0 . 0 1 % y e a s t e x t r a c t ( 1 7 ) . T h e f l a s k sw e r e i n o c u l a t e d w i t h b a c t e r i a f r o m a 2 4 - h - o l d s l a n tc u l t u r e a n d i n c u b a t e d i n a s h a k i n g b a t h ( 1 0 0 r p m ) f o r

2 0 h a t 3 0 C . U n l e s s o t h e r w i s e s t a t e d , b a c t e r i a u s e d i na e r o t a x i s t e s t s w e r e g r o w n i n b a t c h c u l t u r e .C o n t i n u o u s c u l t u r e s o f A z o s p i r i l l u m s p p . w e r eg r o w n a t 3 0 C i n a New B r u n s w i c k c h e m o s t a t ( m o d e lC 3 0 ) c o n t a i n i n g s y n t h e t i c m a l a t e m e d i u m s u p p l e m e n t -e d w i t h 2 g o f m a l i c a c i d p e r l i t e r . D i s s o l v e d 0 2 i n t h eg r o w t h m e d i u m w a s m e a s u r e d w i t h a n a u t o c l a v a b l eg a l v a n i c t y p e e l e c t r o d e ( D O - 8 1 ) .T a x i s m e d i u m , u s e d f o r w a s h i n g t h e c e l l s a n d f o ra e r o t a x i s m e a s u r e m e n t s , c o n t a i n e d 6 0 mM p o t a s s i u mb u f f e r ( p H 6 . 8 ) s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0 0 FM Na-EDTA.A e r o t a x i s a s y . A z o s p i r i l l u m c u l t u r e s , g r o w n t o a na b s o r b a n c e o f 0 . 1 t o 0 . 4 a t 4 2 0 nm ( 1 x 1 0 ' t o 3 . 5 x 1 0 8c o l o n y - f o r m i n g u n i t s p e r m l ) w e r e u s e d . B e f o r e s o m ee x p e r i m e n t s , b a c t e r i a w e r e c e n t r i f u g e d t w i c e a t 3 , 0 0 0x g f o r 1 0 m i n a n d r e s u s p e n d e d i n t h e t a x i s m e d i u m t ot h e i n i t i a l t u r b i d i t y . T h e a e r o t a x i s e x p e r i m e n t s w e r ec a r r i e d o u t b y u s i n g t h e A d l e r c a p i l l a r y a s s a y ( 3 ) , w i t hc a p i l l a r y t u b e s ( 1 J l ; 0 . 2 mm i n t e r n a l d i a m e t e r ; M o d u -l o h m I / S . C o p e n h a g e n , D e n m a r k ) f i l l e d w i t h t h e t a x i sm e d i u m . U n l e s s o t h e r w i s e s t a t e d , a l l e x p e r i m e n t sw e r e c a r r i e d o u t f o r 4 5 m i n a t 3 0 C i n f o u r r e p l i c a t e s .

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6 4 4 BARAK ET A L .T h e n u m b e r o f b a c t e r i a a c c u m u l a t e d i n t h e c a p i l l a r yw a s d e t e r m i n e d b y d i l u t i n g i t s c o n t e n t s i n s a l i n e a n dp l a t i n g p o r t i o n s o n s o l i d N - f r e e s y n t h e t i c m e d i u m ( 1 7 ) .B a n d v e l o c i t y w a s m e a s u r e d b y p l a c i n g a m i c r o m e t ri cr u l e r i n t o t h e o c u l a r p i e c e o f a m i c r o s c o p e .

A n a e r o b i c a e r o t a x i s a s s a y . O n e v a c c i n e b o t t l e ( 2 1m l ) f i l l e d w i t h 5 m l o f a w a s h e d A z o s p i r i l l u m s u s p e n -s i o n s u s p e n d e d i n t a x i s m e d i u m a n d a n o t h e r f i l l e d w i t h5 m l o f t h e t a x i s m e d i u m w e r e s e a l e d w i t h r u b b e rs t o p p e r s a n d f l u s h e d f o r 3 0 m i n w i t h O 2 - f r e e n i t r o g e n .A n a e r o b i c c o n d i t i o n s w e r e c o n f i r m e d b y a n o x y g e ne l e c t r o d e . A h y p o d e r m i c s y r i n g e ( 1 m l ) w a s u s e d t ot r a n s f e r t h e a n a e r o b i c s u s p e n s i o n , u n d e r a c o n t i n u o u ss t r e a m o f n i t r o g e n , i n t o a 2 5 - , l I c a p i l l a r y ( M o d u l o h mV S ) . T h e a n a e r o b i c t a x i s m e d i u m ( d i s s o l v e d 0 2 , 0 ) w a ss i m i l a r l y t r a n s f e r r e d i n t o a 1 - , u l c a p i l l a r y . B o t h c a p i l -l a r i e s w e r e s e a l e d w i t h C e l l o - S e a l ( F i s h e r S c i e n t i f i cC o . , P i t t s b u r g h , P a . ) . T h e o p e n e n d o f t h e s m a l l ( 1 - l I )c a p i l l a r y w a s t h e n i n s e r t e d i n t o t h e l a r g e r ( 2 5 - p u l ) o n e ,a n d t h e c o n n e c t i o n p o i n t w a s s e a l e d w i t h c e l l o - s e a l .T h e s a m e a s s a y t e c h n i q u e w a s u s e d f o r t h e c o n t r o l ,w i t h a n a e r o b i c b a c t e r i a l s u s p e n s i o n a n d t a x i s m e d i u m( d i s s o l v e d 0 2 , 1 2 0 p M ) . T h e n u m b e r o f b a c t e r i a a c c u -m u l a t e d i n t h e c a p i l l a r y w a s d e t e r m i n e d a s d e s c r i b e df o r t h e a e r o t a x i s a s s a y . No d i f f e r e n c e s i n b a c t e r i an u m b e r i n t h e c a p i l l a r y o r b a n d v e l o c i t y a n d s h a p ec o u l d b e d e t e c t e d w h e n t h e m o d i f i e d m e t h o d , u n d e ra e r o b i c c o n d i t i o n s , w a s c o m p a r e d w i t h t h e A d l e ra s s a y .

F I G . 1 . An a e r o t a c t i c b a n d f o r m e d i n a n A . b r a s i -l e n s e Cd s u s p e n s i o n l o c a t e d i n a c h a m b e r on a m i c r o -scope s l i d e ( x 2 5 0 ) . a b , A e r o t a c t i c b a n d ; a g , a g g r e -g a t e s ; e , e d g e o f t h e cover s l i p .

O x y g e n u p t a k e r a t e . T h e u p t a k e r a t e o f 0 2 i n t h eb a c t e r i a l s u s p e n s i o n w a s m e a s u r e d b y u s i n g a n M 5 3c h a m b e r a n d a n e l e c t r o d e ( Y e l l o w S p r i n g I n s t r u m e n t sC o . , Y e l l o w S p r i n g s , O h i o ) a n d a U 1 2 5 - M U n i c o r d e r( J a p a n ) . T h e r e a c t i o n m i x t u r e c o n t a i n e d 1 m l o f p o t a s -s i u m p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 ; f i n a l c o n c e n t r a t i o n , 6 0m M ) , 1 m l o f MgSO4 * 7 H 2 0 ( f i n a l c o n c e n t r a t i o n , 2 0m M ) , 0 . 2 m l o f o x i d i z a b l e s u b s t r a t e ( f i n a l c o n c e n t r a -t i o n , 4 0 m M ) , a n d 1 m l o f b a c t e r i a l s u s p e n s i o n . M e a -s u r e m e n t s w e r e c a r r i e d o u t a t 3 0 C f o r 1 0 m i n . T h eu p t a k e r a t e s w e r e e x p r e s s e d a s m i c r o l i t e r s o f 0 2 t a k e nu p p e r h o u r p e r m i l l i g r a m o f b a c t e r i a l d r y w e i g h t .

RESULTSR e s p o n s e o f A . b r a s i l e n s e t o d i s s o l v e d o x y g e nc o n c e n t r a t i o n . M i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n s o f a nA . b r a s i l e n s e Cd s u s p e n s i o n p l a c e d i n a m i c r o -

s c o p i c c h a m b e r ( 3 ) r e v e a l e d t h a t i n 1 t o 4 m i n t h eb a c t e r i a m i g r a t e d i n t o a s p e c i f i c r e g i o n , 0 . 5 t o 2mm f r o m t h e o p e n e d g e o f t h e c h a m b e r , f o r m i n ga d e n s e b a n d p a r a l l e l t o i t ( F i g . 1 ) . T h e b a c t e r i at h a t d i d n o t a r r i v e a t t h e b a n d a g g r e g a t e d . T h ef o r m a t i o n o f a g g r e g a t e s w a s m u c h f a s t e r o n t h es i d e o f t h e b a n d o p e n t o t h e a i r t h a n i n s i d e t h es u s p e n s i o n . A s i m i l a r b a n d f o r m e d s o m e d i s -t a n c e a w a y f r o m t r a p p e d a i r b u b b l e s i n t h es u s p e n s i o n a s w e l l a s i n s u s p e n s i o n s m e a r e d o na m i c r o s c o p e s l i d e u n d e r a c o v e r s l i p . F l u s h i n go x y g e n o v e r t h e c h a m b e r c a u s e d t h e c e l l s t of o r m a new b a n d f a r t h e r a w a y f r o m t h e e d g e .F l u s h i n g n i t r o g e n , o n t h e o t h e r h a n d , c a u s e d a na c c u m u l a t i o n o f b a c t e r i a o n t h e e d g e . A b o u t 5m i n a f t e r t h e o x y g e n o r n i t r o g e n f l o w w a s t u r n e do f f , t h e b a n d m o v e d t o i t s i n i t i a l l o c a t i o n .T h e r e s p o n s e o f A . b r a s i l e n s e C d t o d i s s o l v e do x y g e n c o n c e n t r a t i o n w a s s t u d i e d b y u s i n g t h eA d l e r c a p i l l a r y a s s a y ( 3 ) . C a p i l l a r i e s w e r e f i l l e dw i t h t h e t a x i s m e d i u m w h i c h h a d b e e n f l u s h e dw i t h o x y g e n o r n i t r o g e n a n d m e a s u r e d w i t h a n0 2 e l e c t r o d e , t h u s o b t a i n i n g t h r e e d i f f e r e n t c o n -c e n t r a t i o n s o f d i s s o l v e d o x y g e n . E a c h c a p i l l a r yw a s t h e n i n s e r t e d i n t o a m i c r o s c o p i c c h a m b e rf i l l e d w i t h t h e A z o s p i r i l l u m s u s p e n s i o n ( a b s o r -b a n c e a t 4 2 0 n m , 0 . 3 8 ) . M i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o ns h o w e d t h a t e x p o s i n g t h e c u l t u r e t o 5 0 , u M 0 2c a u s e d a d i f f u s e b a n d o f A z o s p i r i l l u m c e l l s t oe n t e r t h e c a p i l l a r y a f t e r a l a g p e r i o d o f 0 . 5 m i n a ta n i n i t i a l v e l o c i t y o f 5 0 0 p u m / m i n , w h i c h d e -c r e a s e d t o 2 0 0 p . m / m i n w i t h i n 3 0 m i n . T h e b a n dw a s v e r y d i f f u s e a t t i m e s , d i s p e r s i n g a f t e r a f e wm i n u t e s . W i t h 1 2 0 p . M 0 2 , a l a r g e , d e n s e a e r o -t a c t i c b a n d e n t e r e d t h e c a p i l l a r y a f t e r a 1 . 5 - m i nl a g p e r i o d a t a n i n i t i a l v e l o c i t y o f 2 1 5 p . m / m i n ,w h i c h d e c r e a s e d t o 1 0 0 p . m / m i n a f t e r 3 0 m i n .U p o n e x p o s u r e t o 2 4 0 p . M 0 2 , t h e c e l l s w e r ef i r s t r e p u l s e d a w a y f r o m t h e c a p i l l a r y m o u t h ,f o r m i n g a b a c t e r i a l a r c a r o u n d i t . T h e y t h e nm o v e d t o w a r d t h e c a p i l l a r y m o u t h , e n t e r i n g i t i na v e r y l a r g e b a n d a f t e r a 5 - m i n l a g p e r i o d . T h ei n i t i a l v e l o c i t y o f 1 2 5 p . m / m i n d e c r e a s e d t o 1 0 0p . m / m i n w i t h i n 3 0 m i n .

J . B A C T E R I O L .

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AEROTACTIC RESPONSE OF A . BRASILENSE 6 4 5b r a s i l e n s e Cd c u l t u r e i n a 2 5 - , u l c a p i l l a r y t u b es e a l e d a t b o t h e n d s r e v e a l e d t h a t t h e c e l l s r e -m a i n e d f u l l y m o t i l e f o r a b o u t 5 h a n d t h e ns l o w e d d o w n . I n a n a n a e r o b i c a e r o t a x i s a s s a y ,t h e b a c t e r i a r e m o v e d f r o m t h e 2 5 - , u l c a p i l l a r yi n t o a 1 - , u l c a p i l l a r y c o n t a i n i n g t h e a n a e r o b i ct a x i s m e d i u m ( d i s s o l v e d 0 2 , 0 ) , o n l y a t r a n d o m .T h e b a c t e r i a l c o u n t i n t h e c a p i l l a r y ( u s i n g as u s p e n s i o n w i t h a b s o r b a n c e a t 4 2 0 nm o f 0 . 1 5 )w a s o n l y 1 . 5 x 1 0 3 c o l o n y - f o r m i n g u n i t s , w h e r e -a s i n a n a e r o b i c a e r o t a x i s a s s a y w i t h t a x i s m e d i -um ( d i s s o l v e d 0 2 , 1 2 0 F M ) , a b a n d f o r m e d , a n d1 4 . 2 x 1 0 3 c o l o n y - f o r m i n g u n i t s w e r e c o u n t e d .O t h e r s t r a i n s o f A z o s p i r i l l u m , S p 7 , S p 1 3 , S p5 1 e , S p 8 1 , C d - 1 , a n d C d - 3 , w e r e m i c r o s c o p i c a l -l y e x a m i n e d . A l l w e r e a t t r a c t e d t o c a p i l l a r i e sc o n t a i n i n g t a x i s m e d i u m ( d i s s o l v e d 0 2 , 1 2 0 , u M )o r d i s t i l l e d w a t e r , a n d a l l m o v e d a l o n g t h ec a p i l l a r y i n a b a n d . T h e r e f o r e , a e r o t a x i s i s ag e n e r a l p r o p e r t y o f a l l s t r a i n s e x a m i n e d .F a c t o r s a f f e c t i n g a e r o t a x i s i n A . b r a s i l e n s e C d .M i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n s s h o w e d t h a t w a s h i n gc e l l s f r o m a b a t c h c u l t u r e w i t h t a x i s m e d i u m d i dn o t a f f e c t t h e i r m o t i l i t y . A l s o , n o s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s c o u l d b e f o u n d b e t w e e n t h e a e r o t a c -t i c a c t i v i t y o f w a s h e d a n d u n w a s h e d c e l l s .

T I M E ( m i n )F I G . 2 . R a t e o f A . b r a s i l e n s e C d a c c u m u l a t i o n i nc a p i l l a r i e s c o n t a i n i n g v a r i o u s 0 2 c o n c e n t r a t i o n s : 0 , 5 0, u M ; 0 , 1 2 0 , u M ; A , 2 4 0 I L M . T h e e x p e r i m e n t w a sc a r r i e d o u t t h r e e t i m e s , i n f o u r r e p l i c a t e s , a t 3 0 C w i t ha s u s p e n s i o n o f a n a b s o r b a n c e o f 0 . 3 8 a t 4 2 0 n m . T h e0 2 c o n c e n t r a t i o n s i n t h e c a p i l l a r i e s were o b t a i n e d b yf i l l i n g t h e c a p i l l a r i e s i m m e d i a t e l y a f t e r f l u s h i n g n i t r o -g e n o r o x y g e n i n t o t h e m e d i u m a n d m e a s u r i n g w i t h a n0 2 e l e c t r o d e .B a c t e r i a l c o u n t s i n c a p i l l a r i e s c o n t a i n i n g v a r i -o u s o x y g e n c o n c e n t r a t i o n s c o n f i r m e d t h e m i c r o -s c o p i c o b s e r v a t i o n s ( F i g . 2 ) . T h e n u m b e r o fa t t r a c t e d b a c t e r i a i n c r e a s e d w i t h i n c r e a s i n g o x y -g e n c o n c e n t r a t i o n . T h e i r e n t r a n c e t o t h e c a p i l -l a r y , h o w e v e r , w a s d e l a y e d .T h e b a c t e r i a l a r c t h a t w a s o b s e r v e d a r o u n dt h e c a p i l l a r y m o u t h w i t h 2 4 0 , u M 0 2 c o u l d b eo b t a i n e d i n t h e p r e s e n c e o f h y d r o g e n p e r o x i d e( 0 . 0 1 t o 1 . 2 % ) a s w e l l ( F i g . 3 ) . A r c s f o r m e d a s ar e s p o n s e t o H 2 0 2 f u r t h e r a w a y f r o m t h e c a p i l -l a r y m o u t h , a n d t h e i r m o v e m e n t t o w a r d i t w a ss l o w e r t h a n t h a t o f a r c s f o r m e d a s a r e s p o n s e t oo x y g e n . When a n A z o s p i r i l l u m s u s p e n s i o n ( a b -s o r b a n c e a t 4 2 0 n m , 0 . 3 8 ) w a s e x p o s e d t o 2 4 0, u m 0 2 0 . 0 5 % H 2 0 2 , o r 0 . 3 % H 2 0 2 t h e a r c sr e a c h e d t h e c a p i l l a r y m o u t h i n 5 , 1 1 , a n d 2 8 m i n ,r e s p e c t i v e l y . D i l u t i n g t h e m i c r o b i a l s u s p e n s i o ni n c r e a s e d a r c d i a m e t e r . T h e b a c t e r i a i n t h e a r cr e g i o n w e r e h i g h l y m o t i l e .M i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n s o f a n a n a e r o b i c A .

F I G . 3 . A b a c t e r i a l a r c o f A . b r a s i l e n s e Cd ( a b s o r -b a n c e a t 4 2 0 n m , 0 . 3 8 ) f o r m e d b y i n s e r t i n g a c a p i l l a r yw i t h 0 . 0 5 % H 2 0 2 i n t a x i s m e d i u m i n t o t h e s u s p e n s i o n .b , B a c t e r i a l a r c ; c , c a p i l l a r y t u b e .

V O L . 1 5 2 , 1 9 8 2

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TABLE 1 . E f f e c t o f s u b s t r a t e s o n 0 2 u p t a k e r a t e a n d a e r o t a x i s i n A . b r a s i l e n s e CdQ ( 0 2 ) w i t h N o . o f b a c t e r i a i ns u b s t r a t e / N o . o f c a p i l l a r y w i t hT r e a t m e n t a Q ( 0 2 ) b Q ( 0 2 ) w i t h b a c t e r i a i n s u b s t r a t e / n o . i na e r o t a x i s c a p i l l a r y ( 1 0 3 ) c a p i l l a r y w i t hm e d i u m a e r o t a x i s m e d i u m

W a s h e d c u l t u r e ( a b s o r b a n c e a t 4 2 0 n m , 0 . 1 8 ) 9 7 1 4 . 2W a s h e d c u l t u r e + 2 0 mM s o d i u m m a l a t e 1 1 5 1 . 3 9 1 7 . 4 1 . 2 2W a s h e d c u l t u r e + 1 mM s o d i u m a s p a r t a t e 1 4 3 1 . 4 7 2 6 . 5 1 . 8 6W a s h e d c u l t u r e + 1 mM D - a r a b i n o s e 1 4 7 1 . 5 0 2 4 . 0 1 . 7 0a T h e a e r o t a x i s e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t b y u s i n g c a p i l l a r i e s c o n t a i n i n g t a x i s m e d i u m ( d i s s o l v e d 1 2 0 0 2 ,, u M ) a l o n e o r w i th s u b s t r a t e s f o r 4 5 m i n a t 3 0 C i n f o u r r e p l i c a t e s .b O x y g e n q u o t i e n t [ Q ( 0 2 ) ] i s e x p r e s s e d i n m i c r o l i t e r s o f 0 2 p e r h o u r p e r m i l l i g r a m o f d r y w e i g h t .T h e h i g h e s t m o t i l i t y , r e s p i r a t i o n r a t e , a n d

a e r o t a c t i c a c t i v i t y w e r e o b t a i n e d b y u s i n g l o g a -r i t h m i c - p h a s e w a s h e d a n d u n w a s h e d c u l t u r e s .C e l l s a t t h e l o g a r i t h m i c p h a s e , w a s h e d a n d s u s -p e n d e d i n t a x i s m e d i u m f o r 2 4 h , w e r e l e s sa c t i v e , f o r m i n g a b a n d i n t h e c a p i l l a r y r a t h e rs l u g g i s h l y . B a c t e r i a a t t h e s t a t i o n a r y p h a s e ,g r o w n i n e i t h e r l i q u i d o r s o l i d m e d i u m , h a d a l o wr e s p i r a t i o n r a t e , p o o r m o t i l i t y , a n d u s u a l l y e n -t e r e d t h e c a p i l l a r y r a n d o m l y .S e v e r a l s u b s t r a t e s a t c o n c e n t r a t i o n s o f 0 . 1 t o1 0 mM ( L - s o d i u m g l u t a m a t e , L - s o d i u m a s p a r -t a t e , L - g l y c i n e , L - v a l i n e , L - t h r e o n i n e , L - a r g i -n i n e , L - m e t h i o n i n e , D L - g l u t a m i n e , L - h i s t i d i n e ,L - s e r i n e , f r u c t o s e , g a l a c t o s e , g l u c o s e , l a c t o s e ,s u c r o s e , a r a b i n o s e , s o d i u m s u c c i n a t e , s o d i u mm a l a t e , s o d i u m l a c t a t e , s o d i u m p y r u v a t e , a n ds o d i u m c i t r a t e ) w e r e a d d e d t o t h e t a x i s m e d i u m

7 5 l l

c r _ o- J- ja .( . )zw

0 2 0 4 0 6 0T I M E ( m i n )F I G . 4 . E f f e c t o f i n c u b a t i o n t i m e o n c e l l n u m b e r i nt h e c a p i l l a r y w i t h t a x i s m e d i u m ( d i s s o l v e d 0 2 , 1 2 0, u M ) a t t w o b a c t e r i a l c o n c e n t r a t i o n s . A b s o r b a n c e a t4 2 0 n m : 0 , 0 . 1 8 ; 0 , 0 . 3 8 ( s t a n d a r d d e v i a t i o n , 1 7 % ) .

( d i s s o l v e d 0 2 , 1 2 0 , u M ) a n d t e s t e d b y t h e c a p i l -l a r y m e t h o d f o r t h e i r c h e m o t a c t i c e f f e c t o n A z o -s p i r i l l u m s p p . A b a n d w a s f o r m e d w i t h a l l o ft h e m , b u t t h e n u m b e r s o f b a c t e r i a i n t h e c a p i l l a r -i e s w e r e o n l y 1 . 2 - t o 3 - f o l d t h o s e i n c a p i l l a r i e sc o n t a i n i n g t h e t a x i s m e d i u m a l o n e . T h e s e a r er a t h e r l o w r a t i o s c o m p a r e d w i t h c h e m o t a x i s i no t h e r b a c t e r i a ( 3 , 8 , 1 3 ) .T h e a d d i t i o n o f 1 mM m a l a t e , a s p a r a t a t e , o ra r a b i n o s e t o t h e A z o s p i r i l l u m c u l t u r e e n h a n c e dr e s p i r a t i o n r a t e s b y a b o u t 5 0 % ( T a b l e 1 ) . T h ea d d i t i o n o f t h e s a m e s u b s t r a t e s t o t h e t a x i sm e d i u m ( d i s s o l v e d 2 , 1 2 0 , u M ) i n c a p i l l a r i e si n c r e a s e d t h e n u m b e r o f a t t r a c t e d b a c t e r i a a ts i m i l a r r a t i o s .F i g u r e 4 s h o w s t h e e f f e c t o f i n c u b a t i o n t i m eo n a e r o t a x i s i n A z o s p i r i l l u m s p p . w i t h t w o b a c -t e r i a l c o n c e n t r a t i o n s a n d c a p i l l a r i e s w i t h t h et a x i s m e d i u m ( d i s s o l v e d 0 2 , 1 2 0 M ) . A t b o t h c e l lc o n c e n t r a t i o n s t h e n u m b e r w a s p r o p o r t i o n a l t ot i m e u n t i l a p l a t e a u w a s r e a c h e d . S i m i l a r c u r v e sh a v e b e e n o b t a i n e d f o r c h e m o t a x i s w i t h o t h e rb a c t e r i a ( 3 , 8 , 1 3 ) .T h e e f f e c t o f pH o n a e r o t a x i s w a s s t u d i e d b yu s i n g c a p i l l a r i e s c o n t a i n i n g p h o s p h a t e b u f f e r( d i s s o l v e d 2 , 1 2 0 , u M ; pH 6 t o 8 . 3 ; o b t a i n e d b yu s i n g d i f f e r e n t r a t i o s o f m o n o - a n d d i b a s i c p h o s -p h a t e s ) a n d a w a s h e d A z o s p i r i l l u m c u l t u r e ( a b -s o r b a n c e a t 4 2 0 n m , 0 . 1 ) s u s p e n d e d i n t h e t a x i sm e d i u m . T h e pH w a s t h e s a m e i n b o t h t h es u s p e n s i o n a n d t h e c a p i l l a r y . A e r o t a x i s w a su n a f f e c t e d a t pH v a l u e s o f 6 . 8 t o 8 ( F i g . 5 ) . C e l ln u m b e r d e c r e a s e d a t pH 6 t o 6 . 4 a n d w a s t o t a l l yi n h i b i t e d a t pH 8 . 3 . T h i s r e d u c t i o n i n t a x i sr e f l e c t s a m i c r o s c o p i c a l l y o b s e r v e d r e d u c t i o n i nm o t i l i t y .T h e r e s p o n s e o f A z o s p i r i l l u m s p p . a t d i f f e r e n tb a c t e r i a l c o n c e n t r a t i o n s w a s e x a m i n e d u n d e rb o t h a e r o b i c a n d a n a e r o b i c c o n d i t i o n s b y u s i n g am o d i f i c a t i o n o f t h e A d l e r a s s a y . U n d e r a n a e r o -b i c c o n d i t i o n s , w i t h s u s p e n s i o n a n d t a x i s m e d i -um ( d i s s o l v e d 2 , 0 ) , t h e b a c t e r i a e n t e r e d t h ec a p i l l a r y r a n d o m l y , a n d t h e i r n u m b e r w a s d i -r e c t l y p r o p o r t i o n a l t o t h e b a c t e r i a l c o n c e n t r a -t i o n ( F i g . 6 ) . When a e r o b i c s u s p e n s i o n a n d t a x i s

6 4 6 B A R A K E T A L . J . B A C T E R I O L .

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AEROTACTIC RESPONSE OF A . BRASILENSE 6 4 7

1 04t-J

zwc o

0 6 . 0 6 . 4 6 . 8 7 . 2 7 . 6 8 . 0 8 . 4pHF I G . 5. E f f e c t o f pH on a e r o t a x i s i n A . b r a s i l e n s eC d . T h e v a r i o u s pH v a l u e s were o b t a i n e d b y u s i n gd i f f e r e n t r a t i o s o f mono- a n d d i b a s i c p o t a s s i u m p h o s -p h a t e . T h e pH wa s c h a n g e d i n b o t h t h e c e l l s u s p e n s i o n( a b s o r b a n c e a t 4 2 0 nm, 0 . 1 ) a n d i n t h e t a x i s m e d i u m i nt h e c a p i l l a r y ( d i s s o l v e d 02, 1 2 0 , u M ) . T h e e x p e r i m e n twas c a r r i e d o u t a t 3 0 C f o r 4 5 m i n .

m e d i u m ( d i s s o l v e d 02, 1 2 0 , u M ) were u s e d , t h ec e l l s e n t e r e d i n a b a n d , t h e i r n u m b e r was d i r e c t -l y p r o p o r t i o n a l t o t h e b a c t e r i a l c o n c e n t r a t i o n upt o a n a b s o r b a n c e a t 4 2 0 nm o f 0 . 7 , a n d t h e n ap l a t e a u wa s r e a c h e d . T h e r a t i o b e t w e e n a z o s p i -r i l l a n u m b e r u n d e r a e r o b i c a n d a n a e r o b i c c o n d i -t i o n s wa s a b o u t 1 0 .T h e a d d i t i o n o f 1 0 mM K CN t o t h e A z o s p i r i l -l u m s u s p e n s i o n ( a b s o r b a n c e a t 4 2 0 nm, 0 . 1 5 ) d i dn o t a f f e c t m o t i l i t y , r e s p i r a t i o n , or a e r o t a x i s ( T a -b l e 2 ) . H o w e v e r , 1 5 mM KCN t o t a l l y b l o c k e dr e s p i r a t i o n a n d a e r o t a x i s , b u t m o t i l i t y r e m a i n e dh i g h f o r 2 h a n d t h e n s l o w e d d o w n . A l l c e l l u l a ra c t i v i t i e s were b l o c k e d b y 2 0 mM KCN. S o d i u m

0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8ABSORBANCE ( A = 4 2 0 nm)F I G . 6 . E f f e c t o f b a c t e r i a l c o n c e n t r a t i o n on aero-t a x i s i n A . b r a s i l e n s e C d . T h e e x p e r i m e n t was c a r r i e d

o u t b y u s i n g a m o d i f i c a t i o n o f t h e A d l e r c a p i l l a r y assayd e s c r i b e d i n t h e t e x t . 0, A n a e r o b i c s u s p e n s i o n a n dt a x i s m e d i u m ; 0, a e r o b i c s u s p e n s i o n a n d t a x i s m e d i -um ( d i s s o l v e d 02, 1 2 0 , u M ) .

a z i d e h a d no e f f e c t on A z o s p i r i l l u m s p p . a t ac o n c e n t r a t i o n o f 1 0 mM. A c o n c e n t r a t i o n o f 3 0mM, h o w e v e r , t o t a l l y b l o c k e d r e s p i r a t i o n , mo -t i l i t y , a n d a e r o t a x i s .E f f e c t o f g r o w t h m e d i u m c o m p o n e n t s . No d i f -TABLE 2 . E f f e c t o f r e s p i r a t o r y i n h i b i t o r s o n 0 2 u p t a k e , m o t i l i t y , a n d a e r o t a x i s i n A . b r a s i l e n s e Cd

B a n d ~ N o . i nI n h i b i t o r C o n c n ( m M ) Q ( 0 2 ) a M o t i l i t y Ban c a p i l l a r yf o r m a t i o n ( 1 O 3 )None 1 3 2 F a s t , m o r e t h a n 8 0 % o m o t i l e + 1 2 . 0KCN 1 0 1 3 2 F a s t , m o r e t h a n 8 0 % o m o t i l e + 1 1 . 7KCN 1 5 0 F a s t , s l o w e d down a f t e r 2 h O n l y r a n d o m 1 . 8KCN 2 0 0 S l o w m o t i l i t y , s t o p p e d a f t e r 5 m i n - 0A z i d e 1 0 1 3 2 F a s t m o t i l i t y + NDbA z i d e 2 0 1 0 0 F a s t m o t i l i t y + NDA z i d e 3 0 0 N o n m o t i l e - ND

a O x y g e n q u o t i e n t [ Q ( 0 2 ) ] i s e x p r e s s e d i n m i c r o l i t e r s o f 0 2 p e r h o u r p e r m i l l i g r a m o f d r y w e i g h t .b N D , N o t d e t e r m i n e d .

V O L . 1 5 2 , 1 9 8 2

7/29/2019 Aerotaxis in Azospirillum

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6 4 8 B A R A K E T A L .f e r e n c e s i n b a n d s h a p e a n d v e l o c i t y c o u l d b eo b s e r v e d i n a e r o t a x i s t e s t s o f A . b r a s i l e n s e Cdp r e v i o u s l y g r o w n i n t e s t t u b e s c o n t a i n i n g e i t h e rN - f r e e s e m i s o l i d m e d i u m ( 1 7 ) o r t h e s a m e m e d i -um s u p p l e m e n t e d w i t h N H 4 C l . B o t h m i c r o s c o p -i c o b s e r v a t i o n s a n d b a c t e r i a l c o u n t s s h o w e d t h a te x c h a n g i n g m a l a t e i n t h e g r o w t h m e d i u m f o rp y r u v a t e , l a c t a t e , o r s u c c i n a t e d i d n o t a f f e c ta e r o t a x i s .C e l l s t a k e n f r o m a c o n t i n u o u s c u l t u r e o f A .b r a s i l e n s e C d , g r o wi n g u n d e r a d i s s o l v e d o x y -g e n c o n c e n tr a t i o n o f 0 . 0 6 t o 0 . 1 4 a t m , r e s p o n d e dt o o x y g e n i n a m a n n e r s i m i l a r t o c e l l s f r o m ab a t c h c u l t u r e , b y f o r m i n g o n l y o n e b a n d i n t h ec a p i l l a r y . A z o s p i r i l l u m c u l t u r e s g r o w i n g a t ad i s s o l v e d o x y g e n c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 0 3 a t m r e -s p o n d e d m u c h f a s t e r t o o x y g e n f l u s h e d i n t o t h es u s p e n s i o n o r t o H 2 0 2 a n d f o r m e d t w o b a n d s i nc a p i l l a r i e s c o n t a i n i n g t h e t a x i s m e d i u m ( d i s -s o l v e d 0 2 , 1 2 0 , u M ) . T h e s e c o n d b a n d m o v e ds l o w l y f o r s o m e m i n u t e s a n d t h e n s t o p p e d b u td i d n o t d i s p e r s e . T h e r e a s o n f o r t h e a p p e a r a n c eo f t w o b a n d s i s n o t c l e a r ; i t m i g h t b e t h a t t h et h r e s h o l d r e s p o n s e o f t h e c e l l s t o o x y g e n w a sl o w e r b e c a u s e t h e y w e r e a d a p t e d t o a l o w o x y -g e n c o n c e n t r a t i o n , e n a b l i n g t h e m t o r e s p o n d t ot h e r e s i d u a l o x y g e n b e h i n d t h e f i r s t b a n d .B a c t e r i a g r o w n i n t h e c h e m o s t a t a t a d i s s o l v e do x y g e n c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 1 7 t o 0 . 1 8 a t m b e -h a v e d s i m i l a r l y t o b a c t e r i a f r o m b a t c h c u l t u r e sf o r t h e f i r s t 1 0 m i n a f t e r s a m p l i n g , b u t n o r e -s p o n s e t o w a r d o x y g e n c o u l d b e d e t e c t e d a f t e r -w a r d . T h e o x y g e n u p t a k e r a t e o f t h e c u l t u r e w a sz e r o , b u t d e s p i t e t h e a b s e n c e o f r e s p i r a t o r ya c t i v i t y , t h e c e l l s r e m a i n e d h i g h l y m o t i l e f o rs e v e r a l h o u r s . R e s p i r a t i o n c o u l d b e r e s t o r e d b yt h e a d d i t i o n o f m a l a t e o r s u c c i n a t e . R e s p i r a t o r ya c t i v i t y i n w a s h e d b a c t e r i a f r o m b a t c h c u l t u r e s ,o n t h e o t h e r h a n d , p e r s i s t e d f o r m o r e t h a n 2 4 h .T h e r e a s o n f o r t h i s b e h a v i o r o f A z o s p i r i l l u ms p p . u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s i s a s y e t u n k n o w n .

D I S C U S S I O NT h e r a p i d m i g r a t i o n o f a z o s p i r i l l a i n a m i c r o -s c o p i c c h a m b e r t o a s p e c i f i c d i s t a n c e a w a y f r o mt h e a i r - w a t e r i n t e r f a c e a n d t h e m o v e m e n t o f t h eb a n d u n d e r 0 2 o r N 2 f l o w s h o w t h a t t h e b a c t e r i aa c t i v e l y s e e k m i c r o a e r o b i c c o n d i t i o n s . Nur e t a l .( 1 4 ) r e p o r t e d t h a t A z o s p i r i l l u m s p p . i n o c u l a t e di n t o s e m i s o l i d m e d i u m i n t e s t t u b e s d i d i n d e e dp r e f e r l o w 0 2 l e v e l s f o r g r o w t h a n d m u l t i p l i c a -t i o n . T h e d i s s o l v e d 0 2 i n t h e b a n d a r e a i s v e r yc l o s e t o z e r o ( I . N u r , Y . O k o n , a n d Y . H e n i s ,u n p u b l i s h e d d a t a ) . A n o t h e r m e a n s o f r e a c h i n gm i c r o a e r o b i c c o n d i t i o n s i s t h e f o r m a t i o n o f a g -g r e g a t e s c o m p o s e d o f t h e b a c t e r i a t h a t d i d n o ta r r i v e a t t h e b a n d . O k o n e t a l . ( 1 7 ) a n d D o b e r e i -n e r a n d D a y ( 9 ) r e p o r t e d t h a t A z o s p i r i l l u m s p p .r e q u i r e d m i c r o a e r o b i c c o n d i t i o n s f o r N 2 f i x a -t i o n . T h e e x p e r i m e n t s i n t h i s w o r k i n d i c a t e t h a t

t h e b a c t e r i a p r e f e r r e d l o w 0 2 e v e n w h e n t h eg r o w t h m e d i u m w a s s u p p l e m e n t e d w i t h c o m -b i n e d n i t r o g e n a n d t h a t t h i s 0 2 l e v e l w a s r e a c h e db y a e r o t a x i s .I n c r e a s i n g t h e 0 2 c o n c e n t r a t i o n i n c a p i l l a r i e sc o n t a i n i n g t a x i s m e d i u m d e l a y e d b a n d f o r m a -t i o n , r e d u c e d b a n d s p e e d , a n d i n c r e a s e d t h en u m b e r o f a t t r a c t e d b a c t e r i a . A l s o , n o b a n d w a sf o r m e d u n d e r a n a e r o b i c c o n d i t i o n s . S i m i l a r c h e -m o ta c ti c r e s p o n s e s o f o t h e r b a c t e r i a t o v a r y i n ga t t r a c t a n t c o n c e n t r a t i o n s h a v e b e e n r e p o r t e d ( 3 ,1 1 , 1 3 ) . T h i s s u p p o r t s o u r a r g u m e n t t h a t t h ed i s s o l v e d o x y g e n i s t h e a t t r a c t a n t .T h e f o r m a t i o n o f a b a c t e r i a l a r c a r o u n d t h em o u t h o f a c a p i l l a r y c o n t a i n i n g H 2 0 2 s e e m s t ob e a r e p u l s i o n f r o m h i g h l e v e l s o f o x y g e n r e -l e a s e d b y t h e c a t a l a s e a c t i v i t y o f t h e b a c t e r i a ,r a t h e r t h a n f r o m t h e p e r o x i d e i t s e l f , a s s i m i l a rb e h a v i o r w a s o b s e r v e d w i t h h i g h l e v e l s o f o x y -g e n . S i m i l a r c h e m o t a c t i c r e s p o n s e s t o h i g h c o n -c e n t r a t i o n s o f a t t r a c t a n t s h a v e b e e n r e p o r t e d i nE s c h e r i c h i a c o l i ( 3 ) .A e r o t a x i s i n A z o s p i r i l l u m s p p . r e q u i r e d h i g hm o t i l i t y a n d a h i g h r e s p i r a t i o n r a t e , t h u s d e p e n d -i n g s t r o n g l y o n f a c t o r s a f f e c t i n g t h e s e a c t i v i t i e s :a g e o f t h e c u l t u r e , p H , a n d r e s p i r a t i o n i n h i b i -t o r s . T h e a e r o t a c t i c a c t i v i t y o f t h e c e l l s w a s a l s oa f f e c t e d b y i n c u b a t i o n c o n d i t i o n s , t i m e , a n d b a c -t e r i a l c o n c e n t r a t i o n , b u t i t w a s u n a f f e c t e d b ye x c h a n g i n g t h e c a r b o n s o u r c e i n t h e g r o w t hm e d i u m o r b y r e m o v i n g t h e c o m b i n e d n i t r o g e nf r o m i t . K CN h a s b e e n r e p o r t e d t o i n h i b i t a e r o -t a x i s i n S a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m ( 1 8 ) a n d S p i r i l -l u m v o l u t a n s ( 7 ) a l t h o u g h t h e e f f e c t i v e d o s ev a r i e d w i t h t h e o r g a n i s m . A z i d e i n h i b i t e d o x y -g e n u p t a k e i n S a l m o n e l l a s p . ( 1 8 ) b u t d i d n o tp r e v e n t a e r o t a x i s . T h e KCN e f f e c t c o n f i r m s t h es u g g e s t i o n o f T a y l o r e t a l . ( 1 8 ) a n d L a s z l o a n dT a y l o r ( 1 2 ) t h a t t h e o x y g e n r e c e p t o r f o r a e r o -t a x i s i s t h e t e r m i n a l o x i d a s e .An e x o g e n o u s s o u r c e o f e n e r g y w a s u n n e c e s -s a r y f o r a e r o t a x i s . M o s t b a c t e r i a e x a m i n e d b yB a r a c c h i n i a n d S h e r r i s ( 5 ) a n d S . v o l u t a n s ( 7 )r e q u i r e d o x i d i z a b l e s u b s t r a t e s f o r a e r o t a x i s .A z o s p i r i l l u m s p p . , h o w e v e r , w e r e c a p a b l e o fu t i l i z i n g a n i n t r a c e l l u l a r e n e r g y s o u r c e , p r o b a b l yp o l y - , - h y d r o x y b u t y r a t e . O k o n e t a l . ( 1 5 ) f o u n da p o l y - , 3 - h y d r o x y b u t y r a t e c o n t e n t o f u p t o 3 0 %o f t h e d r y w e i g h t o f A z o s p i r i l l u m c e l l s a n ds h o w e d , B - h y d r o x y b u t y r a t e d e h y d r o g e n a s e a c -t i v i t y . T h e a b i l i t y o f A z o s p i r i l l u m s p p . t o r e -s p o n d i n t h e a b s e n c e o f s u b s t r a t e s a l l o w e d t h i ss t u d y o f a e r o t a x i s w i t h o u t m a s k i n g t h e p h e n o m -e n o n b y c h e m o t a c t i c a g e n t s .T h e r e s u l t s p r e s e n t e d i n T a b l e 1 s u g g e s t t h a tt h e a c c e l e r a t e d r e s p i r a t i o n r a t e s c a u s e d b y t h es u b s t r a t e s l e d t o i n c r e a s e d o x y g e n g r a d i e n t sw h i c h i n t u r n i n c r e a s e d t h e n u m b e r o f a t t r a c t e db a c t e r i a . H o w e v e r , i t ma y a l s o b e a c h e m o t a c t i ce f f e c t , p a r t l y m a s k e d b y t h e a e r o t a c t i c r e s p o n s e

J . B A C T E R I O L .

7/29/2019 Aerotaxis in Azospirillum

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AEROTACTIC R ESPONS E OF A . B R A S I L E N S Et r i g g e r e d b y t h e u s e o f a n e n d o g e n o u s s o u r c e o fe n e r g y . N e v e r t h e l e s s , c h e m o t a x i s i n A z o s p i r i l -l u m s p p . c o u l d n o t b e m e a s u r e d b y t h e c a p i l l a r ya s s a y b u t c o u l d b e e x a m i n e d b y o t h e r m e t h o d si n w h i c h t h e a e r o t a c t i c r e s p o n s e w a s a v o i d e d( R . B a r a k , I . N u r , a n d Y . O k o n , u n p u b l i s h e dr e s u l t s ) .A l t h o u g h r e s p i r a t i o n a p p e a r s t o b e e s s e n t i a lf o r a e r o t a x i s , m o t i l i t y a l s o o c c u r r e d i n t h e a b -s e n c e o f o x y g e n u p t a k e . T h i s c o n c l u s i o n i sb a s e d o n t h e f o l l o w i n g o b s e r v a t i o n s . ( i ) KCN a ta c o n c e n t r a t i o n h i g h e n o u g h t o t o t a l l y b l o c kr e s p i r a t i o n ( 1 5 mM) d i d n o t a f f e c t c e l l m o t i l i t yf o r 2 h . ( i i ) I n t h e a n a e r o b i c a e r o t a x i s a s s a y ,b a c t e r i a p r e s e r v e d t h e i r m o t i l i t y f o r a t l e a s t 5 h .( i i i ) I n c e l l s g r o w n u n d e r h i g h l e v e l s o f 0 2 i n t h ec h e m o s t a t , r e s p i r a t i o n w a s b l o c k e d w h e n t h ec e l l s w e r e d r a w n f r o m t h e c h e m o s t a t , w h e r e a sm o t i l i t y w a s u n a f f e c t e d . S i m i l a r b e h a v i o r w a so b s e r v e d i n S . v o l u t a n s ( 7 ) .I n t h i s w o r k , a e r o t a c t i c a c t i v i t y w a s m e a s u r e df o r t h e f i r s t t i m e b y u s i n g t h e q u a n t i t a t i v e c a p i l -l a r y a s s a y ( 3 ) . T h e c u r v e s o b t a i n e d b y u s i n g t h i st e c h n i q u e f o r t h e e f f e c t o f p H , i n c u b a t i o n t i m e ,a n d b a c t e r i a l c o n c e n t r a t i o n o n a e r o t a x i s w e r ea n a l o g o u s t o t h o s e r e p o r t e d f o r t h e c h e m o t a c t i cr e s p o n s e o f o t h e r b a c t e r i a t o o r g a n i c c o m p o u n d s( 3 , 1 1 , 1 3 , 1 9 ) .

T h e a n a e r o b i c a e r o t a x i s a s s a y a l l o w e d a q u a n -t i t a t i v e c o m p a r i s o n b e t w e e n t h e n u m b e r s o fb a c t e r i a e n t e r i n g t h e c a p i l l a r y r a n d o m l y a n dt h o s e a t t r a c t e d t o o x y g e n . T h i s m a y b e u s e f u lf o r t h e s t u d y o f o x y g e n r e s p o n s e i n o t h e r o r g a -n i s m s w i t h s i m i l a r p r o p e r t i e s .T h e d a t a p r e s e n t e d i n t h i s w o r k i n d i c a t e t h a t ,a s i n o t h e r b a c t e r i a ( 5 ) , a e r o t a x i s p l a y s a r o l e i nt h e c a p a c i t y o f A z o s p i r i l l u m s p p . t o r e a c h a ne n v i r o n m e n t s u i t a b l e f o r g r o w t h . I t s e e m s t o b es p e c i f i c a l l y u s e f u l f o r t h e r h i z o s p h e r e b a c t e r i a o ft h e g e n u s A z o s p i r i l l u m u n d e r N 2 - f i x i n g c o n d i -t i o n s , w h e n m i c r o a e r o b i c c o n d i t i o n s a r e e s s e n -t i a l .

ACKNOWLEDGMENTST h i s r e s e a r c h w a s s u p p o r t e d b y g r a n t 2 4 7 6 / 8 1 f r o m t h eU S A - I s r a e l B i n a t i o n a l S c i e n t i f i c F o u n d a t i o n , a n d g r a n t 1 - 2 5 4 -8 0 f r o m t h e U S A - I s r a e l B i n a t i o n a l A g r i c u l t u r e R e s e a r c h a n dD e v e l o p m e n t F u n d ( B A R D ) .

LITERATURE CITED1 . A d l e r , J . 1 9 6 6 . C h e m o t a x i s i n b a c t e r i a . S c i e n c e 1 5 3 : 7 0 8 -7 1 6 .2 . A d l e r , J . 1 9 6 6 . E f f e c t o f a m i n o a c i d s a n d o x y g e n o nc h e m o t a x i s i n E s c h e r i c h i a c o l i . J . B a c t e r i o l . 9 2 : 1 2 1 - 1 2 9 .3 . A d l e r , J . 1 9 7 3 . A m e t h o d f o r m e a s u r i n g c h e m ot a xi s a n du s e o f t h e m e t h o d t o d e t e r m i n e o p t i m u m c o n d i t i o n s f o rc h e m o t a x i s b y E s c h e r i c h i a c o l i . J . G e n . M i c r o b i o l . 7 4 : 7 7 -9 1 .4 . A r m s t r o n g , J . B . , J . A d l e r , a n d M. M . D a h l . 1 9 6 7 . N o n -c h e m o t a c t i c m u t a n t s o f E s c h e r i c h i a c o l i . J . B a c t e r i o l .9 3 : 3 9 0 - 3 9 8 .5 . B a r c c h l l , O . , a n d J . C . S h e r r l s . 1 9 5 9 . T h e c h e m o t a c t i ce f f e c t o f o x y g e n o n b a c t e r i a . J . P a t h o l . B a c t e r i o l . 7 7 : 5 6 5 -5 7 4 .6 . B e U e r l n c k , M . W. 1 8 9 3 . U e b e r A t m u n g f i g u r e n b e w e g -l i c h e r B a k t e r i e n . Z e n t r a l b l . B a k t e r i o l . P a r a s i t e n k d . I n f e -k i o n s k r . H y g . A b t . 1 O r i g . 1 4 : 8 2 7 - 8 4 5 .7 . C a r a w a y , B . H . , a n d N . K . K r i e g . 1 9 7 4 . A e r o t a x i s i nS p i r i l l u m v o l u t a n s . C a n . J . M i c r o b i o l . 2 0 : 1 3 6 7 - 1 3 7 4 .8 . C h e t , I . , Y . Z i l b e r s t e l n , a n d Y . H e n i s . 1 9 7 3 . C h e m o t a x i s o fP s e u d o m o n a s l a c h r y m a n s t o p l a n t e x t r a c t s a n d t o w a t e rd r o p l e t s c o l l e c t e d f r o m l e a f s u r f a c e s o f r e s i s t a n t a n ds u s c e p t i b l e p l a n t s . P h y s i o l . P l a n t P a t h o l . 3 : 4 7 3 - 4 7 9 .9 . D o b e r e i n e r , J . , a n d J . M. D a y . 1 9 7 5 . A s s o c i a t i v e s y m b i o -s i s i n t r o p i c a l g r a s s e s : c h a r a c t e r i z a t i o n o f m i c r o o r g a n i s m sa n d d i n i t r o g e n - f i x i n g s i t e s , p . 5 1 8 - 5 3 8 . I n W. E . N e w t o na n d C . J . Nyman ( e d . ) , P r o c e e d i n g s o f t h e 1 s t I n t e r n a t i o n -a l S y m p o s i u m o n N i t r o g e n F i x a t i o n . W a s h i n g t o n S t a t eU n i v e r s i t y P r e s s , P u l l m a n .1 0 . E s k e w , D . L . , D . D . F o c h t , a n d I . P . T i n g . 1 9 7 7 . N i t r o g e nf i x a t i o n , d e n i t r i f i c a t i o n , a n d p l e o m o r p h i c g r o w t h i n ah i g h l y p i g m e n t e d S p i r i l l u m l i p o f e r u m . A p p l . E n v i r o n .M i c r o b i o l . 3 4 : 5 8 2 - 5 8 5 .1 1 . L a M a r r e , A . G . , S . C . S t r a l e y , a n d S . F . C o n t i . 1 9 7 7 .

C h e m o t a x i s t o w a r d a m i n o a c i d s b y B d e l l o v i b r i o b a c t e r i o -v o r u s . J . B a c t e r i o l . 1 3 1 : 2 0 1 - 2 0 7 .1 2 . L a s z l o , D . J . , a n d B . L . T a y l o r . 1 9 8 1 . A e r o t a x i s i n S a l m o -n e l l a t y p h i m u r i u m : r o l e o f e l e c t r o n t r a n s p o r t . J . B a c t e r i o l .1 4 5 : 9 9 0 - 1 0 0 1 .1 3 . M o u l t o n , R . C . , a n d T . C . M o n t d e . 1 9 7 9 . C h e m o t a x i s b yP s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a . J . B a c t e r i o l . 1 3 7 : 2 7 4 - 2 8 0 .1 4 . N u r , I . , Y . O k o n , a n d Y . H e n a s . 1 9 8 0 . C o m p a r a t i v e s t u d i e so f n i t r o g e n f i x i n g b a c t e r i a a s s o c i a t e d w i t h g r a s s e s i n I s r a e lw i t h A z o s p i r i l l u m b r a s i l e n s e . C a n . J . M i c r o b i o l . 2 6 : 7 1 4 -7 1 8 .1 5 . O k o n , Y . , S . L . A l b r e c h t , a n d R . H . B u r r i s . 1 9 7 6 . C a r b o na n d a m m o n i a m e t a b o l i s m o f S p i r i l l u m l i p o f e r u m . J . B a c -t e r i o l . 1 2 8 : 5 9 2 - 5 9 7 .1 6 . O k o n , Y . , L . C a k m a k c i , I . N u r , a n d I . C h e t . 1 9 8 0 .A e r o t a x i s a n d c h e m o t a x i s o f A z o s p i r i l l u m b r a s i l e n s e .M i c r o b . E c o l . 6 : 2 7 7 - 2 8 0 .1 7 . O k o n , Y . , J . P . H o u c h i n s , S . L . A l b r e c h t , a n d R . H .B u r r i s . 1 9 7 7 . G r o w t h o f S p i r i l l u m l i p o f e r u m a t c o n s t a n tp a r t i a l p r e s s u r e s o f o x y g e n , a n d t h e p r o p e r t i e s o f i t sn i t r o g e n a s e i n c e l l - f r e e e x t r a c t s . J . G e n . M i c r o b i o l . 9 8 : 8 7 -9 3 .1 8 . T a y l o r , B . L . , J . B . M i W e r , H . M . W a r r i c k , a n d D . E .K o s h l a n d , J r . 1 9 7 9 . E l e c t r o n a c c e p t o r t a x i s a n d b l u e l i g h te f f e c t o n b a c t e r i a l c h e m o t a x i s . J . B a c t e r i o l . 1 4 0 : 5 6 7 - 5 7 3 .1 9 . v a n d e r D r i f t , C . , J . D u l v e r m a n , H . B e x k e n s , a n d A .K r l j n e n . 1 9 7 5 . C h e m o t a x i s o f a m o t i l e S t r e p t o c o c c u st o w a r d s u g a r s a n d a m i n o a c i d s . J . B a c t e r i o l . 1 2 4 : 1 1 4 2 -1 1 4 7 .

V O L . 1 5 2 , 1 9 8 2 6 4 9