A AGODI 25 Settembre 2013 [modalità compatibilità]

7/29/2019 A AGODI 25 Settembre 2013 [modalit compatibilit]

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Epigenetics is the study of heritable changes in gene

expression that occur without changes in DNA sequence(Wolffe and Guschin, 2000)

Epigenetic mechanisms are flexible genomic parameters that

can change genome function under exogenous influence

The patterns of epigenetic modifications can serve as

epigenetic markers to represent gene activity and expression


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Epigenetics refers to the study of changes in theregulation of gene activity and expression that

are not dependent on gene DNA sequence.

single genes or sets of genes, epigenomics refersto more global analyses of epigenetic changesacross the entire genome.


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Epigenetics, in a broad sense, is a bridge between genotype andphenotype - a phenomenon that changes the final outcome of a locus

or chromosome without changing the underlying DNA sequence

PHENOTYPE

GENOTYPE


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There are at least two kinds of epigenetic information

that can be inherited with chromosomes

1 - DNA methylation

2 - Changes in chromatin proteins, usually due to

modifications in histone tails

VARIAZIONI EPIGENETICHE


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Histone modifications

Histones can be modified by acetylation, methylation, phosphorylation,glycosylation, etc..(Suganuma and Workman, 2008)The most common modifications are acetylation and methylation of lysineresidues in the amino terminal of Histone 3 and Histone 4

Increased acetylation induces transcription activation, whereas decreasedacetylation usually induces transcription repressionMethylation of histones is associated with either repression or activation oftranscription, depending on the lysine residue position (Yan and Boyd, 2006)


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DNA methylationLa metilazione del DNA una modificazione post-replicativa del genoma,trasmissibile alla progenie (sia per mitosi, che per meiosi), che rientra nellambitodelle regolazioni epigenetiche della cromatina, in grado di modulare lespressione

genica e/o lintegrit del genoma, e dunque il fenotipo cellulare, in assenza divariazioni di sequenza nucleotidica

Consiste nel legame covalente di un gruppo metilico sul carbonio in posizione 5 ,

formazione di 5 metilcitosina (mC)


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S-adenosil metionina

DNA metiltransferasi


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Nel DNA umano, i residui di mC si concentrano in sequenze contenenti unnumero variabile di ripetizioni dinucleotidiche citosina-guanina (isole CpG),caratteristiche della regione 5 regolatoria di circa il 40% dei geni umani e disequenze ripetitive e trasposoniche disperse nel genoma

Il grado di metilazione delle isole CpG di sequenze geniche inversamenteassociato ai livelli di trascrizione in mRNA, per cui:lipometilazione si associa ad un aumento dellespressione genica,lipermetilazione si associa a silenziamento genico


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La metilazione del DNA implicata nella definizione degli aggiustamenti didosaggio genico, come osservato nellinattivazione del cromosoma X enellespressione di geni soggetti ad imprinting genomico, ossia trasmessiereditariamente con differente grado di metilazione (e dunque differentementeespressi) a seconda dellorigine materna o paterna

Espressione differenziata di

un gene a secondadell'origine parentale


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In humans, more than one-third of DNA methylation occurs inretrotransposons (Kochanek et al, 1993; Schmid, 1998), which represent

a large portion of the human genome (Bernstein et al, 2006)

Retrotransposons are mobile retroelements that utilize reversetranscriptase and RNA intermediates to relocate within the cellular

La metilazione delle isole CpG di sequenze ripetitive genomiche conattivit ricombinogenica e trasposonica ne silenzia lattivit, con effetto

stabilizzante sullintegrit genomica

Among these sequences, Alu and LINE-1 retrotrasposons are themost plentiful families representing approximately 30% of the humangenome (Babushok and Kazazian, 2007; Grover et al, 2004; Kazazianand Goodier, 2002) and are heavily methylated (Yang et al, 2004)

LINE repeat regions located on specific chromosomes have been shown tobe a consistent indicator of global methylation status


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Because of their high representation throughout the genome, Alu and

LINE-1 have been proposed as surrogate markers for estimatingglobal DNA methylation level (Weisenberger et al, 2005; Yang et al,2004), but growing evidence indicates that they could have specific anddistinct cellular roles (Wallace et al, 2008)

Methylation levels of LINE-1 are representative of genome-widemethylation status and play an important role in maintaining genomicstability and gene expression

LINE-1 retrotransposons have been shown to be hypomethylated in many

cancers, suggesting potential activation of LINE-1 in these cancers

retrotransposable sequences and has been suggested to havedeleterious effects on cells, initially through insertional mutations(Kazazian, 2004), and later by introducing genome instability throughdeletions and genomic rearrangements (Gilbert et al, 2002; Ostertag andKazazian, 2001; Wallace et al, 2008)


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Metilazione globaleLINE-1

Ipometilazione Ipermetilazione

Alterazione della stabilitgenomica per riattivazione

delle sequenze

trasposoniche

Silenziamento dellattivittrasposonica, con effetto

stabilizzante sullintegrit

genomica


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Metilazione gene-specifica

Ipometilazione

Promozione

dellespressione genica(Oncogeni)

Ipermetilazione

Silenziamento

dellespressione genica

(Oncosoppressori)


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Il DNA genomico progressivamente ipometilato durante lo sviluppotumorale, e ci contribuisce sia allinstabilit genomica, per riattivazione di

sequenze ricombinogeniche (Alu) e trasposoniche (LINE-1), che alla perditadi imprinting genomico per geni critici

Daltra parte, lipermetilazione di geni onco-soppressori un evento

Nella patologia tumorale sono state evidenziate sia una ipometilazioneglobale del DNA, che una ipermetilazione specifica di geni onco-soppressori e di microRNA

principale nella cancerogenesi (per definire i profili di ipermetilazionetumore-specifici stato coniato il termine Ipermetiloma)


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LINE-1

(Long Interspersed Nucleotide Element1)


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Lepigenoma fortemente influenzato dallet dellindividuo e dalle

esposizioni ambientali

-Let si associa ad una tendenza allipometilazione globale ed ilfenomeno sembra essere geneticamente controllato

-La dieta un importante modificatore dellepigenoma a causa, adesempio, del ruolo essenziale svolto dai folati come donatori di gruppimetile nel metabolismo delle unit monocarboniose

-Il consumo di alcool stato associato sia al silenziamento(ipermetilazione) di geni onco-soppressori nel tumore del colon, che adiperomocisteinemia per ridotta biodisponibilit dellacido folico, conconseguente interferenza sulle reazioni DNA metiltransferasiche(ipometilazione globale)

-Il fumo di tabacco stato associato sia ad ipometilazione di oncogni chead ipermetilazione di geni oncosoppressori


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In campo epidemiologico, sono stati recentemente pubblicati alcuni lavori

che potrebbero portare allo sviluppo di nuovi indicatori da utilizzare inprogrammi di monitoraggio degli effetti biologici

Epigenetics, genetics, and environmental health could be

integrated to create a new field ofepigenetic epidemiology

Environmental exposureand genetic variation

could be integrated bymodifying the epigenome


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The genetic polymorphisms that modify the effects of environmental exposures

are transmitted transgenerationally according to Mendelian genetics, and the traitdetermining effect modifications is generally assumed to follow the same geneticmodel as that of the levels of expression or function of the protein coded by thelocus of concernA second wellestablished area of interplay includes the direct effects of

environmental exposures on the genome, e.g., DNA damage and/or mutationsinduced by environmental exposures

Gene-Environment interactions

In principle, the effect-modification model should apply to epigene-environment

interactions as well as to gene-environment interactions


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Epigene-Environment interactions

Similarly to the effect modifications demonstrated or postulated for genetic

polymorphisms, epigenetic differences determining disease risk could makeindividuals less or more vulnerable to environmental insultsIn environmental studies, the flexibility of epigenetic states has generated agrowing interest in evaluating the direct alterations that environmental exposuresmay produce on epigenetic states, including changes in DNA methylation and

histone modifications


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Gold standard


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Il DNA cos pre-trattato pu essere valutato tramite PCR (polymerasechain reaction) con primers specifici per le sequenze metilate e nonmetilate, o mediante microarrayso in spettrometria di massa

La valutazione sia qualitativa (sequenza metilata vs non metilata) condefinizione dellepigenotipo della/e sequenza/e indagata/e, chequantitativa (% sequenze metilate vsnon metilate)

Possono essere caratterizzate sia la metilazione specifica a carico di unoo pi geni, che la metilazione complessiva, a livello genomicoIn questo caso la caratterizzazione pu essere sia indiretta, valutandocome surrogato il grado di metilazione di sequenze ripetitive disperse nelgenoma [sequenze Alu(circa il 10% del genoma umano) e LINE-1 (lunghi

elementi nucleari disseminati - famiglia 1; circa 17% del genoma umano)]che diretta ramite microarraysgenomici


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Epitect Bisulfite Sequencing Kit(Qiagen)

- starting material: DNA 1 ng - 2 g- good sensititvity for most applications- faster (cca 6 hours)

http://www1.qiagen.com/Products/Epigenetics/Epitect/EpitectBisulfiteKit.aspx?ShowInfo=1


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Clean-up


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PyroMark PCR Kit


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P i


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Primer


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M | 1 | 12| 13| 18| 19| 21|22|

~ 290 bp

M | 24| 41 | 43 | C | M |UM|K-|

Upon PCR amplification, uracil is

amplified as thymine while 5-MeC

residues remain as cytosines, allowing

methylated CpGs to be distinguished

from unmethylated CpGs by presenceof a cytosine "C" versus thymine "T"

residue during sequencing

Location of L1 pyrosequencing sites 1-3 CpG island region of the human L1 transposon (GenBank accession


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Location of L1 pyrosequencing sites 1-3. CpG island region of the human L1 transposon (GenBank accession

no. X58075, nucleotide position 1 to 1147)

Yellow highlights represent single CpG sites, and red highlights (Site1, Site 2 and Site 3) represent the CpG

sites analyzed by pyrosequencing. Horizontal arrows indicate the location of primers (F, forward primer; R,reverse primer; -bio, biotinylated primer)

The sequencing primer is underlined, the complementary strand was analyzed

Piyathilake et al., 2011

Forward primer (5-TTTTTTGAGTTAGGTGTGGG-3)

Reverse biotinylated primer (5-biotin-TCTCACTAAAAAATACCAAACAA-3)

pyrosequencing primer (5-GGGTGGGAGTGAT-3)

Dispensing Order: GTCGATTAGTAGTCAGTCGCT

Sequence to analyze: TYGATTTTTTAGGTGYGTTYGTTA (Y=C/T)


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Immobilization of PCR Products to

Streptavidin Sepharose HP Beads


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Chimica delsaggioPyrosequencing


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http://www.qiagen.com/media/product-tools/flash/Pyrosequencing/20120106/index.html

http://www.qiagen.com/Knowledge-and-Support/Videos-and-Virtual-

Demos/Videos/Pyrosequencing%20Cascade%20Reaction/


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In gruppi di lavoratori esposti a medie (61 g/m3, benzinai), basse (22g/m3, vigili urbani) e molto basse concentrazioni di benzene (6 g/m3,

impiegati, gruppo di controllo) sono state osservate associazioni significativetra livelli di esposizione a benzene e profili di metilazione al DNA in cellulelinfomononucleate del sangue periferico

Lesposizione era significativamente correlata ad ipometilazione delle

sequenze Alu e LINE-1 (riduzioni dell1% e del 2.3%, rispettivamente, perincrementi di concentrazione del benzene di 10 volte), e del gene MAGE-1(antigene 1 del melanoma; riduzione dello 0.5%) e ad ipermetilazione delgene p15INK4B (inibitore della chinasi ciclina dipendente; aumento dello0.35%)

Il gene H19 presentava una perdita dimprinting genomico nei soggetti amaggiore esposizione esposti ma non nel gruppo di controllo


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Dal punto di vista pratico, lapplicazione dei nuovi indicatori epigenetici

(epigenoma, epigenotipi) allo scopo di monitorare gli effetti biologici precoci ingruppi di lavoratori esposti ad agenti chimici/cancerogeni, richieder ulterioristudi di validazione, di tipo anche prospettico, per una migliore definizionedelle specificit rispetto sia allesposizione, che allendpointda prevenire

Occorre inoltre valutare e caratterizzare gli eventuali fattori di suscettibilit,che, a parit di esposizione, possono modificare le relazioni dose-risposta

In ogni caso, dato il coinvolgimento dei disordini della metilazione al DNA nellosv uppo e a pa o og a non so o neop as ca ma anc e egenera va, u

preventiva dei nuovi indicatori epigenetici potr essere rivolta agli effettiderivanti dallesposizione ad agenti cancerogeni, ma non solo

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