Cloning and Expression of Randomly Mutated Bacillus subtilis α-Amylase Genes in

HB101Mohammed Rabbani, Hamid MirMohammad

Sadeghi, Fatemeh Moazen, Mehran Rahimi adn Golnaz Salehi

Daniel Mejía Arrieta

Jesús David Marulanda Uribe

Medicine Students III Semester

UPB

2011

Introduction and Majorities

Bacillus

•Its a grampositive bacillus (4-10 µm)

•They have rod form with straigth edges forming chains

•It can be strict aerobic or facultative anaerobic

•They can create extremely resistent spores to the enviromental changes

• The colouring used for the endospores is the Wirtz-Conklin tecnique

Introduction and Majorities

Subtilis

•It’s an ubiquitous bacterium commonly recovered from water, soil, air, and decomposing plant residue

•As a specie of the Bacillus, it can form an endospore providing protection against heat and dessication of the environment.

•It produces a variety of proteases and other enzymes that enable it to degrade a variety of natural substrates.

Introduction and Majorities

Amylase

•It´s a proteic hydrolytic enzime that allows the catabolism of the starch and others carbohidrates.

•Catalyzes the rupture of the glycosidics bonds α 1-4 producing dextrines and a mix of maltose, isomaltose and glucose.

•Three different forms: α, β and γ with a similar function

Introduction and Majorities

Amylase Genes

•Two types of amylase: Pancreatic and salivary.

•All genes in 1p21, which means are positioned in subregion 21 of short arm, chromosome 21

•Pancreatic genes: Type A: AMY2A Type B: AMY2B

•Salivary Genes: α type: AMY1A β type: AMY1B γ type: AMY1C

Introduction and Majorities

HB101

•HB101 competent Escherichia coli is a classic strain for general cloning purposes

•It contains the recA13 mutation that minimizes recombination and aids in insert stability.

•It carries too the hsdS20(rB- mB

-) restriction to prevent the cleavage of cloned DNA by restriction enzymes

Introduction and Majorities

Introduction and Majorities

Research Correlation

Introduction and Majorities

General Objective

Isolate the amylase genes from B. subtilis to mutate the DNA sequence with the PCR

error prone and determine a more functional and effective enzyme for industrial and economic proposes

Materiales y Métodos

Materiales y Métodos

Materiales y Métodos

Cultivo

Todas las cepas fueron cultivadas en medio de Luria-Bertani (LB):

•pH 7.2 ajustado con NaOH

•37 C°

•Centrifuga a 220 rpm

•Ampicilina 50 μg/ml a concentraciones finales idénticas en todos los platos.

Aplicación del Cultivo

•Son empleados para el aislamiento y mantenimiento de cultivos puros de bacterias y también son utilizados para la identificación de bacterias de acuerdo a sus propiedades bioquímicas y fisiológicas.

•Permiten la proliferación como tal de la cepa y de la mutación a realizar para facilitar el estudio y el análisis de los resultados obtenidos. Cimenta la base de crecimiento para el B. Subtilis

Materiales y Métodos

Materiales y Métodos

Extracción de DNA

Kit de preparación de alta pureza para PCR (roche):

•Las células se cosecharon en fase de crecimiento mediante centrifugación y suspendidas en el amortiguador PBS.

•Las células fueron tratadas con Lisozimas durante 30 minutos a 37 grados y luego

con proteinasa K a 72 grados durante 10 minutos.

•El DNA fue precipitado con 0.6 volúmenes de isopropanol y cosechados por

centrifugación

Aplicación de la Extracción del DNA

La purificación del DNA mediante su extracción permitió identificar el gen de la amilasa del B. Subtilis

y aislarlo para lograr su mutación y determinar nuevamente su acción catalítica como tal, a apartir de

los cambio logrados por la técnica del PCR.

Materiales y Métodos

PCR

Materiales y Métodos

Aplicación del PCR

•A partir del aislamiento del gen de la amilasa, su mutación aleatoria se dio por la técnica del PCR permitiendo la transformación a las cepas de E.coli.

•Los plásmidos que fueron digeridos NcoI/BamHI permitió el aislamiento y la inserción del gen en el vector pET-15b para luego transformarse como tal en el E.coli HB101 para su propagación y posterior reconocimiento.

Materiales y Métodos

Materiales y Métodos

Ensayo Enzimático

Aplicación del Ensayo Enzimático

•La comparación de la acción catalítica de ambos genes mediante el método del ácido dinitrosalicílico y las diversas condiciones de temperatura y concentraciones de carbohidratos.

•La evaluación de un minuto para la liberación de almidón permite determinar la potencia catalítica de la amilasa antes y después de su mutación, con las deliberadas conclusiones.

Materiales y Métodos

Materiales y Métodos

Enzimas de Restricción• Enzimas que reconocen y cortan secuencias especificas de

nucleótidos en el DNA.

• Esciden los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen.

• EcoRI  E = género Escherichia                    co = especie coli                    R = cepa RV 13                     I = primera endonucleasa aislada de esta cepa

• Pueden producir cortes romos y pegajosos

• Su sitio típido de restricción, es un palíndrome exacto de 4,5,6,7 u 8 bases, en donde se da la variación del tamaño del corte. Ej: Sitio reconocimiento de EcoRI es GAATTC

Aplicación de Enzimas de Restricción

•Resultan vitales para la localización del gen mutado y que su funcionalidad no se altere al insertarlo correctamente, generando varias bandas de agarosa en tal caso.

•Los cortes dados por las NcoI/BamHI permitió el aislamiento del gen y su posterior inserción en las cepas.

Materiales y Métodos

Resultados

ResultadosFigura 1

Amplificación gen de la α-amilasa BS168

A: Amplificación gen α-amilasa

•Línea 1: Marcador peso molecular DNA

•Línea 3: Producto PCR

B: Producto error-prone PCR del gene α-amilasa

•Línea 1: Marcador peso molecular DNA

•Línea 2-3: Productos error-prone PCR

•

A B

Resultados

Figura 2

Digestión del plásmido pET-15b que contenía la α-amilasa, por la enzima

de restricción EcoRI

•Línea 1: Marcador peso molecular

•Línea 2,3,4,5,6 y 7: Plásmido pET-15b digerido abarcando el gen de la α-amilasa con la enzima de restricción EcoRI

BDiscussions

Reference Statement Accomplished y/n

11. D. Hanahan The recombinant plasmids were transformed into E. coli XL1Blue and HB101, using the Hanahan protocol

 Yes

12. K. A. Laderman, K. Asada, T. Uemori et al.

The presence of -amylase gene was determined at 92°C using the 12/KI

method as described previously

 

Yes

14. M. Simonen and I. Palva

At present, about 60% of the commercially available enzymes are produced by Bacillus species, mostly being homologous proteins that are

naturally secreted in the growth medium such as alkaline proteases

as washing agent or amylases for the starch industry

 

No

15. F. Kunst, N. Ogasawara, I. Moszer et al.

The advantage of B. subtilis 168 over other bacterial strains has been

increased even more by the availability of the complete sequence

of the B. subtilis 168 genome

 

Yes

Final Conclusions

• We have concluded that different strains of diverse species like B. Subtilis in this case, provides more power and effectiveness in enzymatic process like the catabolism of the starch, according to the amylase.

• Proteing engineering techniques can improve the scientific research manipulating the DNA sequence for a better improvement in the proteic function of an enzyme, looking for different purposes.

• The error-prone PCR method could allow a benign mutagenesis of a target protein for clinical uses like medical treatments in diverse afectations, for example enzymatics mutations because of chromosomics defects.

• The correct use of the transformation vector HB101 and the restriction enzymes fulfill the objective of the improvement in an catalytic function to develop new methods and techniques in the scientific research for clinical purposes, leaving behind commercial and economics interestings.

Final Conclusions

Mapas Conceptuales

• Daniel Mejía

• Jesús David Marulanda

GRACIAS