Embed Size (px)
Citation preview
Son macromoléculas.
El citoesqueleto mantiene su integridad.
Filamentos de actina y misiona forman contráctil del
musculo.
Hemoglobina transporta oxigeno, los anticuerpos
defienden de invasores.
Enzimas catalizan
reacciones:
Generan Energia. Sintetizan Biomoleculas.
Degradan. Replican Genes. Transcriben.
Procesan mRNA.
Sujetas a cambios físicos, refleja ciclo
de la vida.Proteína nace de la traducción,
Madura post traducción.
Envejece en la oxidación.
Muere cuando se degrada hacia los aminoácidos, que la componen.
Células, contienen miles de proteínas distintas.
Aislamiento de una proteína es desafío , múltiples técnicas de purificación
Cromatografía de columna• Columna la matriz fase extraordinaria consta pequeñas
cargadas en recipiente.
• Fritas permeables a liquido confinan dentro de espacio
permite que el liquido fluya a través de la columna.
• Se pueden separar cuentas de fase cubrir superficie con los
grupos acido.
Fracciones
Columna:
Fase
estacionariaMezcla:
Cromatografía liquida de alta
presión (HPLC)
Primera generación las matrices constaban polímeros de
oligosacárido entrelazado.
Tamaño grande perturbaba flujo y limitaba el área
superficie disponible.
Reducción tamaño de partículas ofreció potencial
resolución.
Crearon métodos manufacturar partículas de silicón,
tamaño perfecto.
Cromatografía de exclusión de
tamañoTambién llamado filtración en gel.
Separan las proteínas con base radio de Stokes.
Función masa y formula molecular, proteína alargada.
Los objetos se mueven torrente abajo, los que entran con
irregularidad retrasan a la corriente principal.
Proteína grandes entra
poros (proteína excluida)
Fluyendo y sale antes
(proteína incluida).
Cromatografía de intercambio
iónicoProteínas fase estacionaria interacciones de carga-
carga.
Proteína con carga positiva neta un PH adherirán con
grupo que tienen carga negativa: como carboxilatos o
sulfatos.
Proteína carga negativa adhiere
a grupo de carga positiva: aminas
terciarias o cuaternarias.
Proteínas no adherentes fluyen y
eliminan en el lavado.
Cromatografía de interacción
hidrofóbicaSepara proteínas con base en tendencia con matriz
estacionaria con grupo hidrofóbico:
(fenil sepharose, octil sephadex).
Las proteínas con superficies hidrofóbicas expuestas se
adhieren a la matriz de interacciones hidrofóbicas aumenta la
fase móvil de fuerza iónica alta.
Proteína no adherente se elimina al lavado.
Disminuye la polaridad al reducir concentración de sal.
Cromatografía de afinidad
Explota selectividad proteínas para
sus ligandos. Enzimas pueden
purificarse usando:
Sustratos.
Productos.
Coenzimas.
Solo proteínas que interactúan
con ligando inmovilizando se
adhieren.
Pureza de las proteínas se evalúa mediante
electroforesis de gel de poliacrilamida
Determina la pureza de proteína en gel de
poliacrilamida (PAGE) en presencia
detergente aniónico dodecil sulfato de sodio
(SDS).
Separa las biomoleculas cargadas base
cuales migran en campo eléctrico.
SDS y PAGE la acrilamida polimeriza y
entrecruza para formar matriz porosa.
El SDS por cada dos enlaces peptídicos,
causa polipéptido se desdoble.
Enfoque isoeléctrico (IEF)
Usan amortiguadores iónicos ¨anfolitos¨ y cambio
eléctrico generar gradiente de pH dentro de
poliacrilamida.
Proteínas migran región donde pH coincide con su
punto isoeléctrico. Carga neta de molécula es cero.
IEF usa con SDS-PAGE para electroforesis, separa
polipéptido con base en pi en dimensión.
La insulina consta de cadena:
A de 21 residuos
B de 30 residuos unidos enlaces disulfuro.
Sanger logro reconstruir esta secuencia completa, recibiendo
por este logro un premio Nobel en 1958
Frederick Sanger redujo enlaces disulfuro, separo cadena A y
B, dividió péptidos menor tamaño usando tripsina, quimotripsina
y pepsina.
Péptidos fueron aislados tratados con acido para hidrolizar
enlaces peptídicos de 2 o 3 aminoácidos.
Péptido relaciona con 1-floruro-2,4-dinitrobenceno (reactivo de
sanger).
Método de secuenciación de aminoácidos en
un péptido.
Pehr Edman introdujo fenilisotiocianato (Reactivo de Edman) para marcar de manera selectiva el residuo
amino terminal de un péptido.
En contraste con el reactivo de Sanger, el derivado feniltiohidantonia (PTH) puede generar un nuevo residuo
amino terminal
Como resultado de la longitud de lectura
para la secuenciación de Edman varia
desde 5 hasta 30 residuos de
aminoácidos, dependiendo de la cantidad
del péptido y la pureza del mismo.
Para determinar la secuencia completa de un polipeptido, una proteína debe de dividirse en péptidos de menor
tamaño usando proteasa o un reactivo como bromuro de cianógeno.
Por ultimo pasan por
la cromatografía liquida
de alta presión (HPLC)
de fase reversa para que
los péptidos se analicen
mediante la secuenciación
de Edman.
Los métodos de
secuenciamiento de DNA
permiten de manera
sistemática determinar las
secuencias de
polidesxorribonucleotidos.
Los secuenciadores de
automatizados pueden “leer”
secuencias de varios miles
de nucleotidos de longitud
El conocimiento del
código genético
permite determinar la
secuencia del
polipeptido codificado
simplemente al
traducir la secuencia
de oligonucleótidos de
su gen.
El numero de organismos para los cuales
se ha identificado la secuencia de DNA
completa de su genoma y puesto a
disposición de la comunidad científica son
cientos.
La información sobre la secuencia de
aminoácidos requerida para obtenerse usando la
técnica de Edmen pero en la actualidad la
espectrometría de masa ha surgido como el
mejor método para identificación de proteínas
• La sensibilidad, rapidez y versatilidad superiores de la MS han
remplazado a la técnica de Edman como el principal método para
determinar las secuencias de péptidos y proteínas.
• Mas sensible y tolerante de variaciones de la calidad de la
muestra.
• La MS puede usarse para analizar metabolitos, carbohidratos y
modificaciones postraduccionales, como fosforilacion o
hidroxilacion que añaden incrementos de masa fácilmente
identificados a una proteína.
• Son difíciles de detectar usando la técnica de Edman y son
indetectables en la secuencia de aminoácidos derivada de DNA.
• El análisis de péptidos y proteínas mediante espectrometría de masa
inicialmente tuvo obstaculizado por dificultades para volatilizar moléculas
orgánicas grandes.
• Se idearon técnicas fiables para dispersar péptidos, proteínas y otras
biomolecular grandes hacia la fase de vapor, fue posible aplicar la MS para
su análisis estructural y determinación de secuencias.
• La dispersión hacia la fase de vapor se logra mediante ionización de
electrospray y desorción y ionización laser asistida por matriz, también
conocida como MALDI.
• A medida que la gotita de liquido surge hacia la cámara de muestra, el
solvente se dispersa con rapidez y deja la macromolécula suspendida en la
fase gaseosa.
Figura 4-9 Tres métodos de uso frecuente para vaporizar moléculas en la cámara de muestra de un espectrómetro de masas.
• Aquí se emplea el equivalente de dos espectrómetros de
masas enlazados en serie, y ahora permite analizar mezclas
de péptidos complejas, sin purificación previa.
• Tales instrumentos en tándem a menudo se refieren como
MS-MS.
• El primer espectrómetro separo péptidos individuales con
base en sus diferencias de masa.
• Al ajustar la fuerza del primer imán, un péptido único puede
dirigirse hacia al segundo espectrómetro de masas, donde
se generan fragmentos y se determinan sus masas.
• De manera alternativa, pueden mantenerse en una trampa
ionica.
• Puede usarse para efectuar pruebas en muestras de
sangre provenientes de recién nacidos para detectar la
presencia y las concentraciones de aminoácidos,
ácidos grasos y otros metabolitos.
• Anormalidades de metabolitos pueden servir como
indicadores de diversos trastornos genéticos, como
fenilcetonuria, encefalopatía con acidemia etilmalonica
y acidemia glutárica tipo 1.
• La secuencia del genoma humano, el cuadro proporcionado por la
genómica sola es tanto estático como incompleto.
• Los genes se activan se desactivan, se sintetizan proteínas en tipos de
células particulares en momentos específicos del crecimiento o la
diferenciación, si como respuestas estímulos externos.
• Muchas proteínas pasan por modificaciones postraduccionales durante
la maduración hacia formas competentes desde el punto de vista
funcional.
• el cuerpo humano contiene miles de tipos de celulas, cada una de las
cuales contiene miles de proteínas, el proteoma
• Un objetivo de la proteómica es la identificación de proteínas cuyas
magnitudes de expresión se correlacionan con eventos importantes desde el
punto de vista médico.
• La determinación de los proteomas característicos de cada tipo de célula
requiere eficiencia máxima en el aislamiento y la identificación de proteínas
individuales.
• Si bien sólo es posible resolver alrededor de 1 000 proteínas en un gel
único, la electroforesis bidimensional plantea una importante ventaja por
cuanto examina las proteínas en sí.
• En un método alternativo, llamado Multidimensional Protein Identification
Technology (MudPIT), se emplean rondas sucesivas de cromatografía para
resolver los péptidos producidos a partir de la digestión de una muestra
biológica compleja.
• Se desconocen las funciones de una gran proporción de las proteínas
codificadas por el genoma humano.
• creación de micromatrices proteínicas para practicar pruebas de manera
directa respecto a las funciones potenciales de proteínas a una escala
masiva.
• avances recientes en bioinformática permiten a los investigadores comparar
secuencias de aminoácidos para descubrir indicios respecto a propiedades
potenciales, funciones fisiológicas y mecanismos de acción de proteínas.
• De este modo, la información acerca de las propiedades y la función
fisiológica de una proteína recién descubierta puede inferirse al comparar su
estructura primaria con la de proteínas conocidas.
