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Université Paris Diderot et Paris Descartes Master de Sciences, Santé et Applications
Mention Génétique, 2ème année
Année universitaire 2009-2010
Etude du diagnostic de la trisomie 21
par séquençage haut débit de l’ADN fœtal circulant
dans le sang maternel au 1er trimestre de la grossesse
Capucine Hyon
Unité INSERM U781 Hôpital Necker-Enfants Malades
Tour Lavoisier 149 rue de Sèvres 75015 PARIS
Responsable : Pr Michel Vekemans ([email protected])
UMR 8030 CNRS-CEA-Université d'Evry Genoscope - Institut de Génomique du CEA
2 Rue Gaston Crémieux CP 5706
91057 Evry cedex Responsable : Jean Weissenbach ([email protected])
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RESUME
La trisomie 21 est la cause la plus fréquente de handicap d’origine génétique avec une
fréquence de 1/700 naissances. Plusieurs stratégies de diagnostic prénatal ont été développées mais la
sensibilité de ces tests de dépistage est au mieux de 80% en acceptant 5% de faux positifs. Le
diagnostic à l’heure actuelle repose donc toujours sur la réalisation d’un geste invasif avec le risque de
perte fœtale de l’ordre de 0.5 – 1%.
La présence de matériel fœtal circulant dans le sang maternel est connue depuis de
nombreuses années et différentes méthodes de diagnostic non invasif des aneuploïdies ont été
proposées. La plupart de ces méthodes sont basées sur la recherche de variations allèliques mais elles
ne sont pas toujours informatives et par conséquent ne sont applicables qu’à une petite partie de la
population.
D’autres études plus récentes ont rapporté la possibilité de réaliser un diagnostic non invasif
par séquençage haut débit de l’ADN libre circulant. Nous nous sommes intéressés à cette dernière
approche. Le principe repose sur la possibilité de mettre en évidence une augmentation du pourcentage
de séquences provenant du chromosome 21 lorsque de l’ADN d’un fœtus trisomique circule dans le
sang maternel.
Dans une étude préliminaire nous avons démontré que la présence d’ADN d’un fœtus
trisomique à différentes concentrations entraînait une augmentation du pourcentage de séquences
provenant du chromosome 21. Nous avons ensuite réalisé en aveugle, la détermination du sexe du
fœtus de grossesses évolutives à partir de l’ADN extrait du plasma maternel. Nous avons quantifié la
quantité d’ADN total et fœtal circulant, par PCR quantitative. Enfin nous avons utilisé 10 échantillons
provenant de grossesses évolutives dont le fœtus était disomique et de sexe masculin pour établir les
limites de confiance de notre population contrôle. En revanche, nous n’avons pas mis en évidence une
augmentation des séquences provenant du chromosome 21 pour le seul échantillon trisomique testé.
Plusieurs hypothèses peuvent être évoquées pour expliquer ce résultat.
En conclusion, il est nécessaire de poursuivre la recherche d’une part en séquençant à nouveau
l’échantillon provenant de la grossesse dont le fœtus est trisomique et d’autre part d’augmenter le
nombre d’échantillons normaux pour réduire les limites de confiance de notre population de référence.
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SOMMAIRE
I. INTRODUCTION ........................................................................................................................................................ 4
A. SYNDROME DE DOWN ...................................................................................................................................................... 4 1. Historique ............................................................................................................................................................... 4 2. Epidémiologie ......................................................................................................................................................... 4
B. DEPISTAGE ET DIAGNOSTIC ................................................................................................................................................ 5 1. Historique ............................................................................................................................................................... 5 2. Dépistage ............................................................................................................................................................... 5 3. Diagnostic .............................................................................................................................................................. 6
II. OBJECTIF DU TRAVAIL ............................................................................................................................................... 7
A. MATERIEL FŒTAL CIRCULANT DANS LE SANG MATERNEL ........................................................................................................... 7 1. Cellules fœtales circulantes .................................................................................................................................... 7 2. Acides nucléiques fœtaux circulant ........................................................................................................................ 8
B. METHODES DE DETECTION DES ANEUPLOÏDIES ....................................................................................................................... 8 1. Cellules fœtales circulantes .................................................................................................................................... 8 2. Acides nucléiques circulants ................................................................................................................................... 9
C. METHODE DE RECHERCHE ................................................................................................................................................ 10
III. MATERIELS ET METHODES ...................................................................................................................................... 11
A. RECUEIL DES PRELEVEMENTS ............................................................................................................................................ 11 1. Travail préliminaire .............................................................................................................................................. 11 2. Cohorte de patientes ............................................................................................................................................ 11
B. EXTRACTION DE L’ADN ................................................................................................................................................... 11 1. Travail préliminaire .............................................................................................................................................. 11 2. Cohorte de patientes ............................................................................................................................................ 11
C. QUANTIFICATION ADN TOTAL ET FŒTAL DANS LA COHORTE ................................................................................................... 12 1. Quantification de l’ADN total ............................................................................................................................... 12 2. Détermination du sexe fœtal et quantification de l’ADN fœtal ........................................................................... 12
D. SEQUENÇAGE HAUT DEBIT ............................................................................................................................................... 13 1. Principe ................................................................................................................................................................ 13 2. Préparation des banques ..................................................................................................................................... 13 3. Séquençage .......................................................................................................................................................... 14
E. ANALYSE BIOINFORMATIQUE ............................................................................................................................................ 15 1. Sélection des séquences ....................................................................................................................................... 15 2. Détection des fœtus trisomiques.......................................................................................................................... 15
IV. RESULTATS ............................................................................................................................................................. 16
A. TRAVAIL PRELIMINAIRE .................................................................................................................................................... 16 B. DETERMINATION DU SEXE ET QUANTIFICATION..................................................................................................................... 17 C. ANALYSE DE LA QUALITE DES BANQUES ............................................................................................................................... 20 D. ANALYSE DES SEQUENCES ................................................................................................................................................ 20
1. Détermination du %chrN ...................................................................................................................................... 20 2. Critères de validation des échantillons ................................................................................................................. 21
E. ETUDE DE L’ECHANTILLON TRISOMIQUE 21 ......................................................................................................................... 22
V. DISCUSSION ............................................................................................................................................................ 23
CONCLUSION ................................................................................................................................................................... 25
BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................................................................ 26
ANNEXES ......................................................................................................................................................................... 28
REMERCIEMENTS ............................................................................................................................................................. 34
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I. Introduction A. Syndrome de Down
1. Historique Dès le milieu du 19ème siècle les premières observations de patients présentant un retard mental
associé à une petite stature et une dysmorphie sont rapportées1,2,3. Dans les années qui ont suivies, une
description de plus en plus précise du Syndrome de Down est effectuée. A partir du moment où ce
syndrome est clairement identifié, il est alors possible d'étudier les facteurs de risque associés. En 1927,
Van Der Scheer4 puis Thurston et Jenkins5 en 1931, montrent le rôle de l'augmentation de l'âge des
parents dans l'apparition de ce syndrome. Et c'est en 1933 que Penrose6 précise que c'est l'âge maternel
et non l'âge paternel qui est déterminant dans la survenue.
Vingt ans plus tard, en 1954, Penrose précise qu'il doit exister d'autres facteurs favorisant
l'apparition du syndrome de Down7. A partir de ces observations, il propose des mécanismes de
survenue de la trisomie 21 : susceptibilité génétique, translocation chromosomique déséquilibrée ou
bien déséquilibre de facteurs hormonaux.
Grâce à l'évolution des techniques de cytogénétique humaine, Levan et Tjio détermine le
nombre exact de chromosomes chez l'homme. Et c'est en 1959, que Lejeune, Gauthier et Turpin
mettent en évidence la présence d'un chromosome 21 surnuméraire chez des patients présentant un
syndrome de Down8.
2. Epidémiologie Il y a en France environ 50 000
personnes trisomiques 21. On évalue la
fréquence à 1,4/1000, soit environ 1 pour 700
naissances9. Le sexe ratio est de 3 garçons pour
2 filles. L'incidence varie en fonction de l'âge
maternel. En effet, le risque augmente avec
l'âge maternel: <0,1% au dessous de 30 ans;
entre 0,1% et 1% entre 30 et 40 ans (0,2% à 34
ans, 0,5% à 38 ans, 0,7% à 39 ans); >1% au
dessus de 40 ans (5% à 46 ans, 15% à 50
ans)(Figure 1). L'âge maternel moyen est de 34
ans, en France. Il n'existe pas d'augmentation
de l'âge paternel pour un âge maternel donné.
Figure 1. Risque de trisomie 21 en fonction de l'âge maternel.
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B. Dépistage et diagnostic
1. Historique Le dépistage prénatal vise à fournir aux femmes et aux couples qui le souhaitent les éléments
d’information les plus objectifs sur le niveau de risque de trisomie 21 fœtale de la grossesse en cours. Il
comprend l’ensemble des techniques qui permettent de distinguer les femmes à risque élevé, à qui un
geste à visée diagnostique sera proposé, des femmes à bas risque. Un résultat supérieur au seuil de
risque choisi n’indique pas la présence d’un fœtus atteint mais ouvre la possibilité, de réaliser le
diagnostic par l’étude du caryotype fœtal, à partir des cellules fœtales prélevées par amniocentèse,
choriocentèse ou cordocentèse.
Depuis le milieu des années 1970, la France a mis en place différentes politiques d’accès au
diagnostic prénatal de la trisomie 21.
2. Dépistage
a) Marqueurs sériques du 1er trimestre et du 2ème trimestre Depuis 1997, le dépistage prénatal de la trisomie 21 fait l’objet d’un encadrement réglementaire
en France. Jusqu’en juin 2009, le dosage d’au moins deux marqueurs sériques (l’hCG ou la sous-unité
libre β-hCG et l’AFP ou l’œstriol) devait être proposé systématiquement à toute femme enceinte au
2ème trimestre de la grossesse. Il était réalisé entre les 15ème et 18ème semaines d’aménorrhée et
uniquement dans des laboratoires autorisés. Lorsque le risque estimé de trisomie fœtale était au-delà du
seuil de risque fixé à 1/250 au moment du dépistage, une amniocentèse pour caryotype fœtal était
proposée à la femme. Amniocentèse et caryotype fœtal étaient également pris en charge chez les
femmes de 38 ans ou plus, et en cas d’anomalie échographique.
Depuis juin 2009, la réalisation d’un dépistage prénatal de la trisomie 21 plus précocement dès
le 1er trimestre de la grossesse grâce au dosage de deux nouveaux marqueurs sériques (PAPP-A et
fraction libre de la β-hCG) est proposée.
b) Signes d’appel échographiques
(1) Au 1er trimestre Parallèlement aux marqueurs sériques du 1er et 2ème trimestre, l’échographie du 1er trimestre
s’est imposée progressivement comme un test de dépistage de la trisomie 21. La mesure de la clarté
nucale au premier trimestre rapportée à la longueur crânio-caudale est le principal signe d’appel
échographique au 1er trimestre de la grossesse.
D’autres signes échographiques peuvent également être recherchés tels que l’absence d’os
propre du nez, des anomalies du flux sanguin au niveau du ductus venosus ou bien une régurgitation
tricuspidienne.
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(2) Au 2ème trimestre L’échographie au 2ème trimestre de la grossesse, permet également de rechercher des signes
orientant vers le diagnostic de trisomie 21. Ceux-ci sont plus nombreux mais moins spécifiques. On
recherche par exemple des anomalies biométriques telles que la présence d’une nuque épaisse ou d’un
fémur court par rapport au pied. La présence d’une cardiopathie comme le canal atrio-ventriculaire est
un élément orientant vers le diagnostic. Il existe également des signes mineurs : anomalies des
extrémités avec la présence d’une clinodactylie ou une brachymésophalangie du 5ème doigt, des
anomalies de la face telles que l’absence des os propres du nez, la protrusion de la langue. On peut
aussi retrouver une brachycéphalie, une ventriculomégalie modérée, des kystes des plexus choroïdes ou
bien une artère ombilicale unique.
c) Recommandations de la HAS pour le dépistage L’arrêté du 23 juin 2009 (JO du 3 juillet 2009) fixe les règles de bonnes pratiques en matière de
dépistage et de diagnostic prénatal de la trisomie 21. Il prévoit désormais 3 possibilités de dépistage
avec dosage des marqueurs sériques maternels au 1er ou au 2ème trimestre de la grossesse :
- le dépistage combiné du 1er trimestre associant les marqueurs sériques maternels du 1er
trimestre (PAPP-A et βHCG libre) aux mesures échographiques
- le dépistage séquentiel intégré au 2ème trimestre associant les marqueurs sériques maternels
du 2ème trimestre (βHCG ou HCG totale et AFP +/- œstriol) aux mesures échographiques du 1er
trimestre
- le dépistage par les seuls marqueurs sériques maternels du 2ème trimestre
L’âge supérieur à 38 ans n’est plus aujourd’hui une indication du caryotype, sauf si la patiente
n’a pas eu accès au test de dépistage (1er ou 2ème trimestre) dans les temps.
3. Diagnostic Le diagnostic de trisomie 21 est effectué en période prénatale, à partir d'un prélèvement invasif,
soit de villosités choriales (prélèvement avant 15 SA) soit de liquide amniotique (prélèvement après 15
SA). Un geste invasif est proposé à toutes les femmes dont le risque est > 1/250 ou s'il existe des signes
d'appel échographiques.
Les villosités choriales sont étudiées de deux manières différentes : une étude directe, sans
culture permettant d'obtenir un résultat rapide et une étude après culture permettant de réaliser une
meilleure analyse des chromosomes.
Dans le cas des amniocytes, la culture est réalisée à la fois in situ et en flacons selon les
recommandations de l’ACLF (Association des Cytogénéticiens de Langue Française).
Le diagnostic peut également être effectué en période postnatale à partir d'un prélèvement de
sang.
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II. Objectif du travail La coexistence des stratégies de dépistage que nous venons de voir conduit, en France, à un
taux d’amniocentèses de l’ordre de 11 % soit 88000 grossesses pas an. Or ces examens diagnostics
invasifs sont à l’origine de pertes fœtales dont la fréquence est de l’ordre de 0.5 et 1 %. C’est pourquoi,
nous nous sommes intéressés à la recherche d’une méthode qui permettrait de réaliser un diagnostic
anténatal précoce et non invasif de la trisomie 21.
A. Matériel fœtal circulant dans le sang maternel
1. Cellules fœtales circulantes La présence de cellules fœtales circulantes dans le sang maternel a été énoncé par Chown10 en
1954 en présentant le cas d’une anémie fœtale liée au passage du sang fœtal dans la circulation
maternelle. Cette observation a ensuite été confirmée par Tomoda11 en 1964 qui a montré la présence
d’érythrocytes fœtaux dans la circulation maternelle à l’aide de marquages immunologiques basés sur
la présence d’hémoglobine F.
D’autres types cellulaires fœtaux présents dans la circulation maternelle ont été mis en évidence
et étudiés : les cellules trophoblastiques et les cellules lymphoïdes.
Les cellules lymphoïdes ont été mises en évidence dans la circulation maternelle par
Walknowska12 en 1964 : des cellules 46,XY ont été isolées à partir de cultures lymphocytaires
provenant de 21 femmes enceintes. Sur ces 21 femmes, dix-neuf ont accouché d’un fœtus de sexe
masculin. Cette découverte a permis de développer des méthodes de détection des cellules fœtales
basées sur la détection d’un antigène HLA paternel. Cependant, il a été montré que ces cellules
lymphoïdes fœtales pouvaient persister dans la circulation jusqu’à 27 ans après une grossesse ou une
fausse couche13, ce qui ne permet pas de les utiliser pour un diagnostic non invasif.
Les cellules trophoblastiques ont également été très étudiées car ce sont les cellules le plus
étroitement en contact avec la circulation maternelle. Les premières études ont porté sur la recherche de
séquences spécifiques du chromosome Y par PCR ou par Hybridation In Situ Fluorescente (FISH)14.
Ensuite l’utilisation de ces cellules a permis de faire le diagnostic prénatal non invasif de maladies
monogéniques telles que la β-thalassémie héritée du père. Ces cellules ont l’avantage de ne pas
persister dans la circulation maternelle après l’accouchement. Elles peuvent donc être utilisées pour
réaliser un diagnostic prénatal non invasif. Cependant dans le cas du diagnostic prénatal non invasif des
aneuploïdies l’existence de cellules multinucléées rend difficile l’analyse par des techniques de
cytogénétique moléculaire telle que la FISH (risque d’erreur lors de l’interprétation).
La quantité de cellules fœtales circulantes a été évaluée en moyenne à 19 cellules pour 16 ml de
sang [Min-Max : 0-91], représentant environ 7.8 pg/ml de sang15.
8
2. Acides nucléiques fœtaux circulant L’ADN fœtal libre circulant dans le sang maternel a été mis en évidence plus récemment, dans
les années 1990 par Lo16. Il est présent en plus grande quantité par rapport à l’ADN cellulaire dans le
sang maternel puisqu’il est évalué en moyenne entre 65pg/ml et 100pg/ml de sang. Il représente moins
de 10% de l’ADN total circulant17. En 2004, Li et al 18, ont étudié la taille des fragments d’ADN fœtal
présents dans la circulation maternelle. Ils ont conclu que la taille de ces fragments était généralement
inférieure à la taille des fragments d’ADN d’origine maternelle et qu’ils avaient une taille inférieure à
1 kb. Fan et al 19, en 2008, ont démontré que ces fragments avaient plus précisément la taille d’un
nucléosome. Ces caractéristiques peuvent être utilisées pour l’isolement des fragments d’origine fœtale
dans le but d’un diagnostic prénatal après migration sur gel d’agarose. Par ailleurs, des études ont
montré que la clairance de l’ADN fœtal circulant était extrêmement rapide puisque au-delà de
24 heures suivant la délivrance, l’ADN fœtal n’est plus détectable dans la circulation maternelle20.
La présence d’ARN d’origine fœtale a été démontrée en 2000 par Poon et al21. Ces ARN fœtaux
circulants ont été peu étudiés depuis.
B. Méthodes de détection des aneuploïdies
1. Cellules fœtales circulantes Différentes stratégies peuvent être utilisées pour réaliser un diagnostic prénatal non invasif à
partir de cellules fœtales, mais la première difficulté concerne l’isolement de ces cellules. La plupart
des protocoles d’enrichissement sont fondés sur l’utilisation d’anticorps dirigés contre les antigènes
membranaires des cellules fœtales (Fluorescence-activated cell sorting (FACS), billes
immunomagnétiques et Magnetic-activated cell sorting (MACS)). Ces protocoles comprennent
plusieurs étapes d’isolement qui peuvent endommager les cellules fœtales et donner lieu à des pertes
cellulaires significatives. En 2000, Vona et al 22ont mis au point une technique d’isolation des cellules
tumorales basée uniquement sur la taille cellulaire : Isolation by Size of Epithelial Tumor cells (ISET).
Puisque les cellules trophoblastiques ont également une taille plus grande que les cellules maternelles,
cette technique a également être utilisée pour l’isolation des cellules fœtales circulantes permettant
ainsi d’augmenter le nombre de cellules exploitables pour l’étude des aneuploïdies23.
a) Hybridation In Situ Fluorescente (FISH) La technique d’hybridation in situ fluorescente permet de mettre en évidence les aneuploïdies
sur cellules interphasiques en recherchant un nombre anormal de signaux pour le chromosome étudié.
Cependant, cette technique nécessite d’avoir un nombre élevé de cellules pour pouvoir être absolument
certains du diagnostic. Dans le cas des amniocentèses, l’ACLF recommande le compte d’au moins 100
noyaux pour le diagnostic des aneuploïdies dans le but de détecter une éventuelle mosaïque.
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b) CGH array sur cellule unique Fuhrmann et al, en 2008, ont montré la possibilité de réaliser le diagnostic de trisomie 21 sur
cellule unique provenant d’un patient. Le protocole reposait sur une première étape d’amplification
globale du génome puis la réalisation d’une CGH array (Comparative Genomique Hybridization array)
sur une lame à façon dont les BAC avaient été purifiés par électrophorèse en champ pulsé. Ils ont
comparé trois protocoles différents d’amplification : linker-adapter-mediated PCR (LA-PCR),
degenerate-oligonucleotide-primed PCR (DOP-PCR) et Amplification par l’enzyme Phi29. Ils ont
montré que seule la méthode d’enrichissement par la LA- PCR permettait de faire un diagnostic de
certitude.
2. Acides nucléiques circulants
a) Etude de variation allèlique Cette technique a porté aussi bien sur l’ADN fœtal circulant que l’ARN fœtal circulant.
Lo et al24, en 2007 ont travaillé sur l’ARN d’origine placentaire. Ils ont génotypé un SNP (Single
Nucleotide Polymorphism) et réalisé la quantification des transcrits du gène PLAC4 situé sur le
chromosome 21, exprimés de façon prévalente au niveau du placenta et dont une proportion passe dans
le plasma. La méthode implique l’extraction des ARNm à partir du plasma, l’amplification par
RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) d’un locus SNP sur le chromosome 21 et l’analyse quantitative
par spectrométrie de masse des produits d'amplification. Ils ont ainsi pu détecter 90 % des cas de
trisomie 21 avec une sensibilité de 96.5%. A noter qu’ils ont obtenu tout de même 2.98% de faux
positifs.
Cependant, ces techniques ne sont possibles que dans certaines populations. En effet il est
nécessaire de faire une étude des SNP et si le fœtus est homozygote pour les SNP étudiés, ces
techniques ne sont plus applicables. Des techniques de diagnostic non invasif n’étant pas basé sur les
variations allèliques ont donc été développées.
b) Séquençage haut débit Le développement des techniques de séquençage haut débit a permis de développer un test
diagnostic prénatal non invasif. Cette technique permet de séquencer plusieurs millions de fragments en
un seul run. Chiu et al25, ont montré en 2008, qu’il était possible d’utiliser ce nouvel outil pour réaliser
un test diagnostique non invasif des aneuploïdies telle que la trisomie 21. Ce test repose sur la
comparaison du pourcentage de séquences provenant du chromosome 21 pour un échantillon par
rapport à une population contrôle. Même si la quantité d’ADN fœtal est faible, le grand nombre de
séquences obtenu doit permettre de différencier une grossesse normale d’une grossesse où le fœtus
présente une aneuploïdie.
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c) CGH array La CGH array pour les diagnostics en période postnatale nécessite une grande quantité d’ADN
(500 ng à 1 µg). Nous avons vu que dans certaines conditions une CGH array pouvait être réalisée sur
cellule unique. Ceci permet donc de proposer une étude en CGH array à l’aide d’ADN fœtal libre
circulant. En utilisant les méthodes proposées par Fuhrmann, il doit être possible de mettre en évidence
des aneuploïdies.
C. Méthode de recherche Nous avons vu qu’il existait différentes stratégies pour réaliser un diagnostic prénatal non
invasif des aneuploïdies. Nous avons décidé de travailler sur une stratégie de diagnostic prénatal qui
pourrait ensuite être généralisée. L’objectif de ce travail est de montrer qu’il est possible de réaliser un
diagnostic non invasif des aneuploïdies, au premier trimestre de la grossesse (entre la 10ème et la 15ème
semaine de grossesse). La technique utilisant le séquençage haut débit nous paraît être la méthode
permettant d’obtenir les meilleurs résultats à condition d’optimiser les protocoles de séquençage pour
des quantités d’ADN très faibles.
11
III. Matériels et méthodes A. Recueil des prélèvements
1. Travail préliminaire Les prélèvements ont été effectués au début du deuxième trimestre de la grossesse chez des
femmes ayant un risque de trisomie 21 supérieur à 1/250. Une fois le résultat du caryotype du fœtus de
ces patientes obtenu, nous avons récupéré les cellules amniotiques d’un fœtus masculin disomique et
d’un fœtus masculin trisomique.
2. Cohorte de patientes Les échantillons ont été transmis par la maternité de l'hôpital Necker et de l'hôpital de Poissy-
Saint Germain. Les patientes présentant un risque combiné >1/250 se sont vues proposer un diagnostic
prénatal invasif, sur une biopsie de trophoblaste (avant 15 SA) ou sur amniocentèse (>15 SA) afin de
vérifier le caryotype. La participation à cette étude était proposée uniquement si la patiente avait décidé
de réaliser un prélèvement invasif. Les femmes acceptant de participer ont eu un prélèvement avant le
prélèvement invasif (amniocentèse ou biopsie de trophoblaste).
Chaque patiente a eu un prélèvement de sang effectué sur un tube EDTA d’une quantité
comprise entre 7 et 15 ml. Les échantillons ont été centrifugés dans les 24 heures à 1600g pendant 10
minutes puis le surnageant a été décanté et à nouveau centrifugé à 16000g pendant 10 minutes.
Le surnageant a ensuite été conservé à -80°C jusqu’au moment de l’extraction.
B. Extraction de l’ADN
1. Travail préliminaire L’ADN fœtal trisomique et disomique ont été extraits à partir de cultures de cellules
amniotiques par une méthode phénol-chloroforme selon le protocole joint en annexe (Annexe 1).
2. Cohorte de patientes Les données de la littérature sur l’ADN fœtal circulant montre que celui-ci est composé
essentiellement de courts fragments. Il était donc nécessaire de choisir une méthode d’extraction
favorisant le recueil de ces courts fragments dans le but d’augmenter la fraction d’ADN fœtal circulant.
Nous avons préalablement testé 2 kits d’extraction et nous avons retenu le kit NucleoSpin® Plasma XS.
Ce kit d’extraction permet d’isoler des fragments d’ADN circulant ayant une taille aussi petite
que 50 à 1000 pb. Deux protocoles sont proposés par le fabricant. Une comparaison préalable des deux
protocoles a montré une meilleure efficacité en terme de quantité d’ADN isolée, avec le protocole long.
De plus, afin d’optimiser le rendement de l’extraction, nous avons effectué trois passages de plasma sur
chaque colonne utilisée pour un échantillon selon le protocole recommandé par le fabricant (Annexe 2).
12
C. Quantification ADN total et fœtal dans la cohort e La quantification de l’ADN total et fœtal est faite en réalisant en parallèle, une PCR quantitative
en temps réel (RQ-PCR) pour un locus commun à la mère et au fœtus dans le cas de la quantification
de l’ADN total et une autre pour un locus spécifique du fœtus, le locus SRY pour les fœtus de sexe
masculin. Pour obtenir la quantité d’ADN fœtal, on compare ensuite la quantité déterminée pour le
locus SRY à celle obtenue pour le locus commun. Dans le cas où la grossesse est un fœtus de sexe
féminin, nous ne pouvons pas déterminer la quantité d’ADN fœtal présente dans le prélèvement.
1. Quantification de l’ADN total Pour le locus commun à la mère et au fœtus, nous avons choisi de quantifier le locus du gène de
l’albumine, puisqu’il est présent en une seule copie dans le génome haploïde.
La réaction de RQ-PCR a été réalisée dans un volume final de 25 µl contenant : 12.5µl de
TaqMan® Universal PCR Master Mix, 0.1 µl de BSA, 2µl de l’oligo Sens (5’-TGAAACAT
ACGTTCCCAAAGAGTTT-3’), 2 µl de l’oligo antisens (5’-CTCTCCTTCTCAAGAAAGTGTG
CATAT-3’), 0.25 µl de sonde marquée (5’-FAM- FGC- TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA-
TAMRA-3’), 5.65 µl de H2O et 2.5 µl de chaque échantillon. Les conditions d’amplification
comportent : une dénaturation initiale (95°C pendantt 10 mn) puis 50 cycles de dénaturation : 95°C
pendant 10 sec et 60°C pendant 1 min sur un appareil Applied Biosystem 7900 HT fast Real Time PCR
system. Chaque échantillon a été testé deux fois.
2. Détermination du sexe fœtal et quantification de l’ADN fœtal Pour déterminer le sexe du fœtus, nous n’avons pas choisi de faire de dosage d’un locus en
copie multiple (tel que DYS14). Nous avons décidé de n’utiliser que le locus du gène SRY situé sur le
chromosome Y en Yp11.31 pour déterminer en même temps le sexe fœtal et la quantité d’ADN fœtal
présente dans l’échantillon lorsque le fœtus est de sexe masculin. En effet, la technique est
suffisamment sensible pour détecter la présence d’une faible quantité d’ADN fœtal circulant.
La réaction de PCR quantitative a été réalisée dans un volume final de 25 µl contenant : 12.5µl
de TaqMan® Universal PCR Master Mix, 1.25 µl de TaqMan® Copy Number Assays 20X SRY
contenant l’oligo sens, l’oligo antisens ainsi que la sonde marquée par FAM-MGB (Hs01079437_cn,
Applied Biosystem), 8.75 µl de H2O et 2.5 µl de chaque échantillon. Les conditions d’amplification
sont identiques à celles de l’expérience précédente. De la même manière, chaque échantillon a été testé
deux fois.
13
Figure 2. Résumé de la technique de préparation des banques.
D. Séquençage haut débit
1. Principe Le séquençage haut débit est une technique permettant de séquencer plusieurs milliers à
plusieurs millions de fragments d’un génome, en même temps. Cette technique permet de diminuer
significativement les étapes de préparation avant le séquençage proprement dit. Il existe différentes
approches mais toutes ont pour objectif d'amplifier un brin d'ADN d'une banque de fragments et réalise
le séquençage à partir de ce brin amplifié. Pour cette étude, nous avons utilisé un séquenceur
Illumina/Solexa.
2. Préparation des banques
Pour pouvoir être séquencé, les fragments déposés sur la
« FlowCell » du séquenceur doivent être des fragments courts.
Pour l’étude préliminaire, nous avons réalisé une étape de
fragmentation.
En revanche, on sait que l’ADN fœtal circulant est
constitué en majorité de fragments inférieurs à 250 pb. Nous
avions donc décidé initialement de ne pas passer par une étape
de fragmentation de l’ADN extrait pour favoriser l’amplification des fragments d’origine fœtale.
Malheureusement, il existait dans nos premiers échantillons des fragments d’ADN ayant une
longueur supérieure à 10kb. Un essai de séquençage a montré que ces grands fragments perturbaient le
processus de séquençage. La décision de réaliser une étape de fragmentation a donc été actée.
La fragmentation a été réalisée sur un appareil CovarisTM S2 System. Le volume des
échantillons a été ajusté à 100µl avec du tampon d’élution puis placé dans l’appareil. Les échantillons
ont subi le traitement selon le protocole indiqué en annexes (Annexe 3).
Figure 3. Schéma de la préparation des banques.
14
Les fragments ainsi obtenus ont ensuite été préparés avec le kit NEBNext DNA Sample Prep
Reagent Set 1 (New England BioLabs inc.) selon les recommandations du fabricant après quelques
modifications (Annexe 4).
3. Séquençage
a) Amplification Avant l’amplification,
l’échantillon est dénaturé
pendant 5 minutes à température
ambiante dans les conditions
suivantes : 17 µl de tampon
d’élution EB, 2 µl de
l’échantillon à la concentration
de 10 nM et 1 µl de NaOH à 2N.
L’ADN dénaturé est ensuite
dilué dans du tampon
d’hybridation froid à une concentration finale de 15 pM. L’échantillon est ensuite déposé sur la Flow
Cell de la Cluster Station. Un tapis dense de primers complémentaires des adaptateurs est fixé sur la
Flow Cell (Figure 4.A). Des nucléotides non marqués ainsi que la DNA polymérase sont injectés dans
les canaux de la Cluster Station. Il se forme alors un pont entre une molécule simple brin fixée sur la
Flow Cell et un primer également fixé sur la Flow Cell (Figure 4.B). On obtient ainsi une molécule
d'ADN double brin ayant à chaque extrémité une terminaison libre et une terminaison attachée à la
surface du séquenceur (Figure 4.C). Une étape de dénaturation permet d'obtenir deux molécules simple
brin, fixées à la surface du séquenceur (Figure 4.D). Les étapes d'amplification sont répétées sur 35
cycles (Figure 4.E) permettant d'obtenir plusieurs millions de cluster d'ADN double brin.
b) Séquençage sur le Genome Analyzer La Flow Cell est ensuite déposée sur le Genome Analyzer. Pour initier le premier cycle de
séquençage, les 4 nucléotides marqués chacun avec un fluorochrome différent ayant une extrémité
bloquante, les primers et l'ADN polymérase sont injectés dans le séquenceur. Un laser excite ensuite les
nucléotides marqués qui se sont fixés (Figure 5.A). On obtient ainsi la première base de chacun des
clusters (Figure 5B). Avant de commencer le deuxième cycle de séquençage, l'extrémité bloquante est
retirée ainsi que le fluorochrome. La séquence est répétée sur 35 cycles. (Figure 5C. et 5D.). On obtient
ainsi plusieurs millions de fragments de 36 bases.
A B C
D E
Figure 4. Schéma général de l'amplification et des clusters.
15
E. Analyse bioinformatique
1. Sélection des séquences Un bilan permet d’avoir une évaluation de la qualité du run. Il dénombre en particulier le
nombre de clusters totaux, le pourcentage de clusters filtrés ainsi que le nombre de séquences valides. Il
permet également de déterminer la présence d’une contamination éventuelle, en faisant un premier
alignement d’environ 0.5% des séquences obtenues.
Toutes les séquences obtenues de 36 bases sont ensuite alignées sur le génome humain de
référence GRCh37 téléchargé sur le site www.ensembl.org (repeat-masked genome) en utilisant le
logiciel d’alignement SOAPaligner.
Seules sont conservées les séquences pour lesquelles :
1. il y a au maximum 2 mismatchs pour la séquence de 36 bases
2. la séquence est présente en un seul exemplaire sur le génome.
Une fois que les séquences uniques sont sélectionnées, on détermine le nombre de séquences
présentes pour chacun des chromosomes. On peut alors calculer le pourcentage de séquences pour
chaque chromosome (N) par rapport au nombre total de séquences obtenues (%chrN). Par exemple,
pour le chromosome 21, on note : %chr21.
2. Détection des fœtus trisomiques Pour la détection des fœtus trisomiques, nous avons tout d’abord déterminé la valeur moyenne
et la déviation standard du %chr21 d’une série de 10 échantillons correspondant à des fœtus
disomiques. Nous avons pu ensuite déterminer le z-score pour le chromosome 21 d’un échantillon X
donné. Le z-score correspond au nombre de déviations standard d’un échantillon par rapport à la
moyenne d’un groupe d’échantillons normaux :
%chr21 des standardDéviation %chr21 des moyenne - %chr21
chr21)(score-z(X)=
Figure 5. Schéma de la technique de séquençage sur le Genome Analyzer IIe Solexa.
A B
C D
E
16
IV. Résultats A. Travail préliminaire Nous avons réalisé le séquençage haut débit de 6 échantillons contenant une dilution croissante
d’ADN fœtal trisomique. Pour cela, nous avons utilisé un ADN fœtal disomique de référence
(0%TRI21) dans lequel nous avons dilué une quantité croissante d’ADN fœtal trisomique : 2,5%
d’ADN fœtal trisomique (2,5%TRI21), 5% (5%TRI21), 10% (10%TRI21), 25% (25%TRI21) et un
ADN d’un fœtus trisomique (100%TRI21). La figure 6 montre le pourcentage de séquences provenant
du chromosome 21 (%chr21) pour chacun de ces 6 échantillons. On remarque que l’augmentation de la
concentration en ADN s’accompagne d’une augmentation du %chr21. Lorsqu’on compare ces données
avec d’autres chromosomes (chromosomes 7, 12 et 14) on observe que pour ces chromosomes, le
%chrN reste quasiment identique quelle que soit la quantité d’ADN trisomique présente dans
l’échantillon. Nous avons choisi ces trois chromosomes pour comparer l’évolution du %chrN car ils
font partie de ceux qui ont une proportion de GC moyenne par rapport à l’ensemble des chromosomes
humains et qui n’ont pas un fort biais d’amplification25. Sur la figure 7, nous avons représenté le
%chr21 en fonction de la concentration en ADN fœtal trisomique. On note que le pourcentage de
séquences provenant du chromosome 21 est corrélée au pourcentage d’ADN trisomique présent dans
l’échantillon avec un coefficient de corrélation de r=0.9995 avec p<0.01. A partir de ces données, nous
avons décidé d’étendre l’étude à la cohorte de femmes enceintes.
Figure 6. Représentation du pourcentage de séquences du chromosome 21 pour les 6 échantillons ayant une concentration variable d'ADN fœtal trisomique.
Figure 7. Rapport entre le pourcentage de séquences du chromosome 21 et le pourcentage d’ADN trisomique dans l’échantillon.
17
B. Détermination du sexe et quantification La cohorte est constituée de 44 patientes qui ont consulté la maternité de Necker-Brune ou la
maternité de l’hôpital de Poissy et qui avaient un risque supérieur à 1/250. Le terme moyen auquel les
patientes ont été prélevées était de 13 semaines de grossesse +3 jours, avec un minimum de
11 semaines +5 jours et un maximum de 16 semaines de grossesse+ 1 jour.
L’ADN circulant a été extrait sur un volume de plasma moyen de 3.82 ml. Nous avons obtenu
une concentration d’ADN total allant de 5 pg/µl à 855 pg/µl avec une moyenne de 91 pg/µl.
Nous avons déterminé le sexe du fœtus par PCR quantitative du gène SRY. Sur les
44 échantillons, nous avons mis en évidence la présence de SRY dans 17 cas. Quinze échantillons ont
été considérés comme correspondant à un fœtus de sexe masculin. En effet, comme le montre le
tableau 1, il existe 2 échantillons (NCK-07 et NCK-12) pour lesquels nous avons mis en évidence la
présence de SRY mais à une très faible concentration, qui représente environ 0.5 % de l’ADN total
alors que pour tous les autres échantillons masculins, l’ADN fœtal représente au moins 3 % de l’ADN
total avec une moyenne de 14.8 %. Ces deux échantillons ont été considérés comme contaminés. Nous
avons confirmé nos résultats au vu du résultat du caryotype obtenu chez chaque patiente prélevée en
même temps.
Nous avons également analysé la concentration totale en ADN et la concentration en ADN
fœtal (pour les grossesses où le fœtus était de sexe masculin) en fonction du terme de la grossesse. Les
résultats sont rapportés dans les figures 8 et 9. La concentration en ADN total n’est pas corrélée au
terme de la grossesse (r=0.1989, p=0.21). En revanche, pour l’ADN fœtal, on peut voir que la
concentration augmente au cours de la grossesse. Le coefficient de corrélation est de r=0,4338 avec
p=0.09.
.
Figure 8. Rapport entre la concentration totale en ADN et le terme de la grossesse.
Figure 9. Rapport entre la concentration en ADN fœtal (pour les grossesses dont le fœtus est de sexe masculin) et le terme de la grossesse
18
Prélèvement
Terme (semaine
de grossesse)
Volume plasma
(ml)
Concentration ADN total
(pg/µl)
Concentration SRY (pg/µl)
% d'ADN fœtal Sexe
Volume final (µl)
Quantité ADN total (ng)
Rendement (ng/µL) Caryotype
IPP-4 13+6 3,36 57 0 - F 72 4,104 46 XX IPP-5 12+6 2,88 60 0 - F 64 3,840 46 XX IPP-6 13+1 3,36 78 0 - F 75 5,850 46 XX IPP-7 12+5 3,12 46 0 - F 72 3,312 46 XX IPP-8 11+5 3,12 71 2,1 2,96% M 69 4,899 46 XY IPP-9 13 3,36 27 0 - F 75 2,025 46 XX IPP-11 12+2 3,12 23 0 - F 68 1,564 46 XX IPP-12 12+5 3,36 117 0 - F 56 6,552 46 XX IPP-13 11+6 3,12 53 3,5 6,60% M 56 2,968 46 XY IPP-14 13+1 2,88 172 0 - F 56 9,632 46 XX IPP-15 - 3,36 58 0 - F 70 4,060 46 XX IPP-18 - 3,50 38 0 - F 50 1,900 47 XX+21
NCK-001 13+2 6,00 28 0 - F 100 2,800 46 XX NCK-002 15+4 5,20 96 0 - F 80 7,680 46 XX NCK-003 12+2 4,00 5 0 - F 80 0,400 46 XX NCK-004 13 4,00 95 0 - F 72 6,840 46 XX NCK-006 13+4 4,30 107 12,4 11,59% M 90 9,630 46 XY NCK-007 12+1 4,30 855 2 0,26% F 95 81,225 69 XXX NCK-008 13+5 3,60 68 12,0 17,65% M 81 5,508 12,8 46 XY NCK-009 13+6 3,60 94 12,0 12,77% M 81 7,614 18,4 46 XY NCK-010 14+1 3,60 66 6,1 9,24% M 81 5,346 18,3 46 XY NCK-011 13+4 4,30 66 14,0 21,21% M 90 5,940 12,4 46 XY NCK-012 13+5 4,30 166 1 0,66% F 90 14,940 46 XX NCK-013 14+1 2,60 146 39,8 27,26% M 50 7,300 34 46 XY NCK-014 13+3 3,30 87 17,5 20,11% M 68 5,916 15,6 46 XY NCK-015 14+1 3,50 105 0 - F 71 7,455 46 XX NCK-016 14 3,30 45 9,3 20,67% M 67 3,015 29,2 46 XY NCK-017 14+4 4,32 29 0 - F 75 2,175 46 XX NCK-018 14+4 4,32 86 0 - F 90 7,740 46 XX NCK-019 14+1 4,32 77 10,9 14,16% M 83 6,391 26,4 46 XY NCK-020 13+2 4,32 67 0 - F 93 6,231 46 XX NCK-021 13+3 4,32 148 0 - F 89 13,172 46 XX NCK-022 12+1 3,60 73 0 - F 77 5,621 46 XX NCK-023 14 4,32 80 11,2 14,00% M 89 7,120 36,2 46 XY NCK-024 13+5 3,60 106 0 - F 73 7,738 45 X NCK-025 12+5 4,32 45 0 - F 92 4,140 46 XX NCK-026 14+4 3,60 46 0 - F 78 3,588 46 XX
19
Prélèvement
Terme (semaines
de grossesse)
Volume plasma
(ml)
Concentration ADN total
(pg/µl)
Concentration SRY (pg/µl)
% d'ADN fœtal Sexe
Volume final (µl)
Quantité ADN total (ng)
Rendement (ng/µL) Caryotype
NCK-027 13+1 4,32 64 0 - F 94 6,016 46 XX NCK-028 13+6 4,32 23 2,8 12,17% M 92 2,116 12 46 XY NCK-029 13+5 4,32 42 0 - F 95 3,990 46 XX
NCK-030 16+1 4,32 96 0 - 92 8,832
47 XX+21 [70%]/ 46 XX
[30%} NCK-031 13+5 4,32 52 7,1 13,65% M 96 4,992 46XY NCK-032 11+6 4,32 74 0 - F 97 7,178 46XX POI-001 14+5 2,80 70 12,6 18,00% M 55 3,85 8,48 47,XY+21
Moyenne 13+3 3,82 91 11,55 14,80% 78 7,346 21,40 Min - Max 11,70 - 16,14 2,6 - 6 5 - 855 2,1 - 39,8 2,96 - 27,26 50 - 100 0,424 - 81,225 8,48 - 36,2
Tableau 1. Descriptif de la cohorte avec résultats de quantification de l'ADN plasmatique, proportion d'ADN fœtal et quantité d'ADN fragmentés avant séquençage.
20
C. Analyse de la qualité des banques Les banques préparées ont été quantifiées au Qubit pour évaluer le rendement obtenu lors de la
préparation. Les résultats sont regroupés dans le tableau 1. Nous avons obtenu une concentration
finale comprise entre 8.48 ng/µl et 36.2 ng/µl. Ces concentrations sont tout-à-fait satisfaisantes pour
pouvoir réaliser la technique de séquençage.
La détermination de la taille des fragments constituant la banque a été réalisée au moyen d’une
puce Agilent High Sensitivity. La qualité des banques préparées est sensiblement identique. La taille
des fragments constituant la banque va de 150 pb à 500 pb avec une taille médiane de 250 à 275 pb.
On observe une disparition des longs fragments (>2 kb) après l’étape de sonication (Figure 10.)
D. Analyse des séquences
1. Détermination du %chrN Pour chaque échantillon nous avons obtenu le nombre total de séquences et le nombre de
séquences uniques pour chaque chromosome. Nous avons pu déterminer le pourcentage de séquences
pour chacun des chromosomes (%chrN). Les données sont rapportées dans la figure 11 et le tableau en
annexe (Annexe 5).
Figure 10. Electrophoregramme d’une banque préparée à partir d’ADN libre circulant sans fragmentation àgauche et après fragmentation à droite.
Figure 11. Pourcentage de séquences (%chrN) pour chacun des chromosomes dans les 11 échantillons testés. (Les chromosomes sont rangés dans l’ordre de leur teneur croissante en GC).
21
Figure 12.Représentation de la profondeur de séquence (coverage) sur chacun des chromosomes pour les 11 échantillons étudiés.
On observe que le nombre total de séquences obtenu pour chaque échantillon est très variable.
Le nombre maximum de séquences est de 24 707 087 dans l’échantillon NCK-010 et le nombre
minimum est de 14 568 561 séquences dans l’échantillon NCK-014. Le pourcentage de séquences ne
correspondant pas au génome humain est également très variable, puisqu’il est de 59% pour
l’échantillon NCK-016 et de 81% pour l’échantillon NCK-010.
En revanche, le pourcentage de séquences pour chacun des chromosomes (%chrN), représenté
sur la figure 11, est relativement homogène d’un échantillon à l’autre. On note toutefois de plus
grandes variations pour certains chromosomes tels que le chromosome 4 qui a un faible %GC et le
chromosome 16 ou le chromosome 19 qui ont un %GC élevé, vraisemblablement en raison d’un biais
d’amplification.
2. Critères de validation des échantillons
a) Profondeur de séquence (coverage) Dans le but de déterminer un éventuel biais dans le séquençage d’un échantillon, nous avons
calculé la profondeur de séquence (coverage) pour chacun des chromosomes, qui se définit comme :
génomedu pb Nb
chrN pb Nbe x chrN seq Nbe coverage =
22
En l’absence de biais de séquençage, le coverage doit être sensiblement égal pour l’ensemble
des autosomes d’un même échantillon. Cependant, on sait qu’il existe un biais de séquençage pour les
chromosomes ayant un %GC élevé ou très bas. Nous avons représenté sur la figure 12, le coverage de
chaque échantillon pour chacun des chromosomes. On peut remarquer que le coverage pour les
autosomes est assez variable, d’une part d’un échantillon à l’autre puisqu’il va de 0.120 en moyenne
pour l’échantillon NCK-009 à 0.209 pour l’échantillon NCK-0010 et à l’intérieur d’un même
échantillon, en particulier pour l’échantillon NCK-009 avec un écart-type de 0.0192. On observe
également que les chromosomes pour lesquels le coverage est le plus variable sont identiques d’un
échantillon à l’autre, ce sont ceux ayant un %GC élevé.
b) z-score Nous avons également calculé un z-score pour chacun des autosomes des 10 échantillons
testés. Le résultat est représenté dans la figure 13. On constate que pour les échantillons NCK-009,
NCK-010 et NCK-014, le z-score est élevé en valeur absolue pour l’ensemble des autosomes. En
revanche, pour les autres échantillons, la valeur du z-score est proche de 0.
E. Etude de l’échantillon trisomique 21 Nous avons utilisé les 10 échantillons normaux pour constituer notre intervalle de référence.
Nous avons déterminé la moyenne du %chr (m%chr21) et la déviation standard (DS%chr21). L’ensemble
des %chr21 pour les 10 échantillons disomiques est représenté sur la figure 14.
A partir des données du %chr21 de chaque échantillon disomique, nous avons déterminé la
moyenne et la déviation standard du %chr21. Pour cette série de 10 échantillons NCK-008 à
NCK-028, la moyenne est de m%chr21 = 1.433 et la déviation standard de DS%chr21 = 0.0233.
On note la présence de grandes variations du %chr21 d’un échantillon à l’autre avec un
minimum de 1.399 pour l’échantillon NCK-010 et un maximum de 1,471 pour l’échantillon
NCK-009. Le z-score pour l’échantillon trisomique POI-001 est de -1.16 (Figure 15.). Pour une série
de 10 échantillons l’intervalle de confiance symétrique à 99% fondé sur la loi de Student donne une
Figure 13. Représentation du z-score pour chacun des autosomes pour les 11 échantillons étudiés.
23
valeur seuil du z-score de 3.25. Nous ne mettons donc pas en évidence d’augmentation du nombre de
séquences du chromosome 21 alors que le pourcentage d’ADN fœtal trisomique est de 18%.
V. Discussion La possibilité de réaliser un diagnostic prénatal non invasif des aneuploïdies semble possible
grâce à l’évolution des techniques de séquençage haut débit. Dans ce travail nous avons étudié la
possibilité de réaliser un tel diagnostic prénatal de la trisomie 21 en utilisant cette nouvelle approche.
Nous avons débuté par un travail préliminaire pour nous assurer que la présence d’ADN
trisomique 21 augmentait le pourcentage de séquences du chromosome 21. Nous avons montré que le
pourcentage de séquences provenant du chromosome 21 (%chr21) était corrélé au pourcentage
d’ADN trisomique dilué dans un échantillon contenant de l’ADN disomique.
Ensuite nous avons quantifié l’ADN fœtal circulant dans les échantillons de sang provenant de
grossesses dont le fœtus était de sexe masculin et nous avons démontré qu’il y avait suffisamment
d’ADN fœtal circulant ce qui devait permettre de mettre en évidence une différence significative entre
les grossesses disomiques et les grossesses trisomiques. Il est intéressant de noter que le pourcentage
d’ADN fœtal circulant dans le sang maternel était en moyenne de 14,8%. Ce chiffre est bien plus
élevé que celui habituellement rapporté dans la littérature (<10%)17. Cette donnée est importante. En
effet, si les échantillons provenant des grossesses dont le fœtus est de sexe féminin contiennent un tel
pourcentage d’ADN fœtal circulant, il devrait être possible de détecter correctement les fœtus
trisomiques. En outre, les prélèvements ont été réalisés très précocement au cours du 1er trimestre de
la grossesse, moment où la concentration en ADN fœtal circulant semble la plus basse. Pour les
échantillons prélevés à 11 semaines de grossesse, la concentration en ADN fœtal circulant était
Figure 14. Représentation du pourcentage de séquences du chromosome 21 pour les 11 échantillons testés.
Figure 15. Représentation du z-score pour les échantillons NCK-008 à NCK-028 ainsi que le z-score de l'échantillon trisomique POI-001.
24
supérieur à 2.5% ce qui, selon notre étude préliminaire, est suffisant pour observer une variation du
pourcentage de séquences. En outre nous avons été en mesure de détecter avec une très grande
confiance la présence d’un fœtus de sexe masculin. Cet enrichissement ADN d’origine fœtale peut
s’expliquer par l’utilisation de colonnes d’extraction permettant d’augmenter la capture des petits
fragments en particulier ceux compris entre 50 et 250pb. En revanche dans ce travail, nous n’avons
pas pu mettre en évidence une corrélation significative entre le terme de la grossesse et la
concentration en ADN fœtal (p=0.09). Cependant, en augmentant la taille de notre série, nous
devrions être en mesure de mettre en évidence cette corrélation.
Nous avons étudié la qualité des banques préparées pour le séquençage à l’aide d’une puce
permettant de déterminer la taille des fragments composant l’échantillon. Il est rapporté dans la
littérature que l’ADN libre circulant est naturellement fragmenté avec une taille inférieure à 1.5kb18.
Les fragments supérieurs à 1.5kb représentent environ 20% de l’ADN total circulant et concernent
uniquement l’ADN maternel. Dans un premier temps, nous avions choisi de ne pas réaliser l’étape de
fragmentation de l’ADN, dans le but d’augmenter la quantité de séquences d’origine fœtale.
Malheureusement, le séquençage de cet échantillon n’a pas été possible car le nombre de clusters
séquencés était seulement de l’ordre de quelques milliers contre plusieurs millions pour les
échantillons fragmentés. Nous pensons que la présence de grands fragments sur la FlowCell pourrait
entrainer une gêne stérique empêchant l’amplification des clusters. En résumé, même si l’ADN libre
circulant est déjà fragmenté, il est nécessaire de réaliser une étape de fragmentation préalable pour le
séquençage.
Pour le séquençage, nous avons montré dans l’étude préliminaire qu’il existait une forte
corrélation entre le pourcentage de séquences du chromosome 21 (%chr21) et la concentration en
ADN fœtal trisomique 21 dans l’échantillon. En revanche, nous n’avons pas été en mesure de mettre
en évidence une élévation du z-score pour notre échantillon provenant d’une grossesse dont le fœtus
était trisomique 21. Différentes hypothèses peuvent être formulées pour expliquer ce résultat négatif.
Une première hypothèse est liée à la qualité des échantillons normaux utilisés pour déterminer
l’intervalle de confiance de notre population de référence. En ce qui concerne le coverage des
autosomes dans les échantillons de l’étude préliminaire, nous avons observé une représentation
homogène. Le coverage moyen était de 0.176 et l’écart-type de 0.0077. Il existait donc une très faible
variation d’un échantillon à l’autre. En revanche, dans les échantillons provenant de notre cohorte de
fœtus normaux, nous avons vu que le coverage était beaucoup plus variable d’un échantillon à l’autre.
En effet, le coverage moyen était identique mais l’écart-type était de 0.0305. Nous avons croisé ces
données avec celles du z-score pour chacun des autosomes. On observe alors que les échantillons pour
lesquels le coverage moyen était plus élevé ou plus bas avaient une plus grande variation de z-score
pour chacun des autosomes. Par exemple, l’échantillon qui a le coverage le plus élevé (NCK-010) et
25
celui qui a le coverage le plus bas (NCK-009) sont ceux qui ont les z-score les plus variables pour les
autosomes. De la même manière, notre échantillon POI-001 a un z-score très variable d’un autosome à
l’autre. En regroupant toutes ces données, nous pouvons conclure que la qualité de nos échantillons
est très variable. Ceci se traduit donc par une forte variabilité au niveau du pourcentage de séquences
pour un chromosome donné (%chrN).
La deuxième hypothèse pouvant expliquer l’absence de différence significative dans le
pourcentage de séquences provenant du chromosome 21 entre l’échantillon trisomique et la population
contrôle est le manque de reproductibilité de la technique lorsque la quantité d’ADN est très faible. En
effet, dans l’étude préliminaire, un même ADN de référence a été utilisé pour 5 échantillons. Dans ces
conditions nous avons vu que les coverage étaient très semblables. Il est important de noter que pour
préparer ces banques, nous sommes partis d’une concentration de l’ordre de 5 à 10 ng/µl d’ADN. En
revanche, pour réaliser les banques provenant de la cohorte de patientes, nous sommes partis d’une
concentration d’ADN de l’ordre de 0,09 ng/µl. Malheureusement, nous n’avons pas pu pour l’instant
vérifier la reproductibilité concernant les échantillons provenant de la cohorte de patientes. En outre il
est nécessaire d’étudier à nouveau l’échantillon POI-001 afin de vérifier s’il n’existe pas un biais lié à
la faible quantité d’ADN présente initialement dans le prélèvement.
Enfin, le nombre d’échantillons étudiés pour établir l’intervalle de confiance de notre
population de référence disomique est petit. De même, nous n’avons testé qu’un seul échantillon
trisomique. Il serait donc nécessaire d’augmenter la série d’échantillons disomiques pour établir un
intervalle de confiance plus restreint et augmenter le nombre d’échantillons trisomiques.
Conclusion Ce travail a permis de démontrer qu’il y avait bien une augmentation du pourcentage de
séquences du chromosome 21 lorsque la quantité d’ADN fœtal trisomique augmente. En revanche,
nous n’avons pas réussi à mettre en évidence une augmentation significative du nombre de séquences
dans un seul échantillon provenant d’une grossesse dont le fœtus était trisomique. Ces résultats sont
tout de même encourageants compte tenu du petit nombre d’échantillons que nous avons pu analyser.
La poursuite de notre étude est nécessaire avant de conclure.
26
BIBLIOGRAPHIE
1 Esquirol JE: Des maladies mentales considérées sous les rapports médical, hygiénique et médico-légal. Baillere, ed 1838.
2 Séguin E: Traitement moral, hygiène et éducation des idiots et autres enfants arriérés ou retardés dans leur mouvements, agités de mouvements volontaires. Baillere, ed 1846.
3 Down JL: Observations on an ethnic classification of idiots. 1866. Ment Retard 1995; 33: 54-56.
4 Van der Scheer W: Beitrage zur Kenntnis der Mongoloiden Missbildung. Neur Psychiat und Psychol 1927.
5 Thurston L, Jenkins R: Order of birth, parental age and intelligence. University of Chicago Press. 1931.
6 Penrose LS: The relative effects of paternal and maternal age in Mongolism. J Genet 1933. 7 Penrose LS: Mongolian idiocy (mongolism) and maternal age. Ann N Y Acad Sci 1954; 57:
494-502. 8 Lejeune J, Gautier M, Turpin M: Etude des chromosomes de neufs enfants mongoliens. C R
Acad Sci 1959. 9 Sherman SL, Allen EG, Bean LH, Freeman SB: Epidemiology of Down syndrome. Ment
Retard Dev Disabil Res Rev 2007; 13: 221-227. 10 Chown B: Anaemia from bleeding of the fetus into the mother's circulation. Lancet 1954; 266:
1213-1215. 11 Tomoda Y: Demonstration of Foetal Erythrocyte by Immunofluorescent Staining. Nature
1964; 202: 910-911. 12 Walknowska J, Conte FA, Grumbach MM: Practical and theoretical implications of fetal-
maternal lymphocyte transfer. Lancet 1969; 1: 1119-1122. 13 Bianchi DW, Zickwolf GK, Weil GJ, Sylvester S, DeMaria MA: Male fetal progenitor cells
persist in maternal blood for as long as 27 years postpartum. Proc Natl Acad Sci U S A 1996; 93: 705-708.
14 Mueller UW, Hawes CS, Wright AE et al: Isolation of fetal trophoblast cells from peripheral blood of pregnant women. Lancet 1990; 336: 197-200.
15 Bianchi DW, Williams JM, Sullivan LM, Hanson FW, Klinger KW, Shuber AP: PCR quantitation of fetal cells in maternal blood in normal and aneuploid pregnancies. Am J Hum Genet 1997; 61: 822-829.
16 Lo YM, Corbetta N, Chamberlain PF et al: Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet 1997; 350: 485-487.
17 Lo YM, Tein MS, Lau TK et al: Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis. Am J Hum Genet 1998; 62: 768-775.
18 Li Y, Zimmermann B, Rusterholz C, Kang A, Holzgreve W, Hahn S: Size separation of circulatory DNA in maternal plasma permits ready detection of fetal DNA polymorphisms. Clin Chem 2004; 50: 1002-1011.
19 Fan HC, Blumenfeld YJ, Chitkara U, Hudgins L, Quake SR: Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood. Proc Natl Acad Sci U S A 2008; 105: 16266-16271.
20 Lo YM, Zhang J, Leung TN, Lau TK, Chang AM, Hjelm NM: Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma. Am J Hum Genet 1999; 64: 218-224.
21 Poon LL, Leung TN, Lau TK, Lo YM: Presence of fetal RNA in maternal plasma. Clin Chem 2000; 46: 1832-1834.
22 Vona G, Sabile A, Louha M et al: Isolation by size of epithelial tumor cells : a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulatingtumor cells. Am J Pathol 2000; 156: 57-63.
27
23 Vona G, Beroud C, Benachi A et al: Enrichment, immunomorphological, and genetic characterization of fetal cells circulating in maternal blood. Am J Pathol 2002; 160: 51-58.
24 Lo YM, Tsui NB, Chiu RW et al: Plasma placental RNA allelic ratio permits noninvasive prenatal chromosomal aneuploidy detection. Nat Med 2007; 13: 218-223.
25 Chiu RW, Chan KC, Gao Y et al: Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci U S A 2008; 105: 20458-20463.
28
ANNEXES Annexe 1. Extraction de l’ADN génomique à partir de liquide amniotique
1. Cultiver les cellules amniotiques en flacon de 75 cm2 (10 jours environ) à 37°C en atmosphère humide à 5% de CO2, selon le protocole en vigueur dans l’unité de DPN
2. Décoller les fibroblastes adhérents au flacon au moyen de trypsine - EDTA
3. Déposer 5 à 10 gouttes de la suspension cellulaire dans un flacon de 250 cm2 contenant 20 ml de milieu RPMI complet
4. Placer le flacon à 37°C en atmosphère humide à 5% de CO2.
5. Contrôler la pousse cellulaire jusqu’à obtention d’une culture dense. A l’observation à la loupe binoculaire, les cellules doivent être confluentes sans décollement spontané synonyme de mort cellulaire
6. Décoller les fibroblastes et les placer dans un tube conique de 12 ml
7. Centrifuger 5 min à 3500 tours/min et éliminer le surnageant par retournement ou aspiration
On obtient alors un culot qui peut être conservé au congélateur (-20°C)
8. Ajouter 500 µl de tampon de lyse des GB sur le culot
9. Ajouter 10 µl de Protéinase K à 10 mg/ml
10. Homogénéiser par retournement et incuber le tube une nuit à 37°C ou 4h à 54-56°C au bain-marie
11. Agiter pendant 10 min sur une roue
12. Centrifuger pendant 1 min à 4000 tours/min
12. Récupérer la totalité du surnageant (phase aqueuse contenant l’ADN) dans un microtube conique de 1.5 ml avec une liquipète stérile longue (Inscrire le tube les nom, prénoms et n° du prélèvement et couvrir de scotch)
13. Vérifier l’absence d’agrégats non digérés, si digestion incomplète rajouter 10 µl de Protéinase K et poursuivre 3 h à 56°C
14. Ajouter 500 µl de phénol et agiter pendant 5 min sur une roue située sous la hotte
15. Centrifuger pendant 10 min à vitesse maximum sur une microcentrifugeuse de paillasse et à température ambiante
16. Récupérer à nouveau la totalité du surnageant dans un microtube conique neuf de 1.5 ml
17. Ajouter 500 µl de chloroforme et agiter pendant 5 min sur une roue
18. Centrifuger pendant 10 min à vitesse maximum sur une microcentrifugeuse de paillasse et à température ambiante
19. Récupérer à nouveau la totalité du surnageant dans un microtube conique neuf de 1.5 ml (Inscrire le tube le n° du prélèvement et couvrir de scotch)
20. Ajouter 50 µl d’acétate de Na 3M
21. Ajouter 1 ml d’isopropanol
22. Agiter délicatement le tube en chaloupant (la méduse d’ADN se forme) et laisser 30 min à -20°C
23. Centrifuger 20 min à 13000 tours/min et à température ambiante
24. Eliminer délicatement le surnageant par retournement
25. Rincer avec 1 ml d’éthanol à 70%
26. Eliminer délicatement l’alcool par retournement en veillant à ne pas entrainer le culot d’ADN (centrifuger si nécessaire)
27. Rincer avec 1 ml d’éthanol 100% puis éliminer l’alcool par retournement délicatement
28. Laisser sécher 10 à 15 min à l’étuve à 56°C enveloppé d’un papier d’aluminium
29. Dissoudre le culot dans environ 300 à 600 µl de Tris – EDTA (T.E) pH8.0 afin d’obtenir une concentration finale en ADN comprise entre 200 et 300 µg/ml
29
Annexe 2. Protocole d’extraction de l’ADN plasmatique circulant avec le kit NucleoPlasmaXS
1. Dans un falcon de 15 ml mettre un volume X de plasma
2. Ajouter un volume X/12 de protéine K
3. Incuber à 37°C pendant 10 min
4. Ajouter un volume Xx1.5 de Binding Buffer, agiter le Mix
5. Transférer 620µl du Mix sur les colonnes (3 à 6 par échantillon)
6. Centrifuger à 6000 tr/mn pendant 30 sec puis à 13000tr/min pendant 5 sec
7. Répéter les étapes 5. et 6. 2 fois
8. Déposer 500 µl de Washing Buffer sur la membrane
9. Centrifuger à 13000 tr/mn pendant 30 sec
10. Déposer 250µl de Washing Buffer
11. Centrifuger à 13000 tr/mn pendant 3 mn, permet également le séchage de la membrane
12. Déposer 20µl d’Elution Buffer (Tris-HCl, pH=8.5, sans EDTA ) sur la membrane de chaque colonne
13. Laisser reposer une minute
14. Centrifuger à 13000 tr/mn pendant 30 sec
15. Réunir les éluats des différentes colonnes d’un même échantillon
16. Chauffer à 90°C pendant 8 mn dans le but d’évaporer les dernières traces d’éthanol
17. Conserver à -20°C jusqu’à l’étape de quantification
30
Annexe 3. Protocole de fragmentation de l’ADN libre circulant
Mode frequency sweeping Duty cycles 10% Intensity 5 Cycles per burst 100 Time 60 sec Number of cycles 10 Bath temperature 5-8°C
31
Annexe 4. Protocole de préparation des banques pour Solexa/Illumina
I. Réparation des fragments
1. Transférer les 100µl d’ADN soniqués dans un tube de 1,5 ml
2. Ajouter 12.5 µl de Phosphorylation Reaction Buffer 10X
3. Ajouter 4 µl Deoxynucleotide Solution Mix contenant 10 mM de chaque dNTP
4. Ajouter 1 µl de DNA Polymerase I
5. Ajouter 2.5 µl de T4 DNA Polymerase
6. Ajouter 2.5 µl de T4 Polynucleotide Kinase
7. Ajouter 2.5 µl de H2O
8. Incuber à 20°C pendant 30 minutes.
9. Purifier la réaction à l’aide des colonnes NucleoSpin®Extract II selon les recommandations du fabricant avec un volume final d’élution de 34 µl.
II. Ajout d’un A en 3’
10. Ajouter 5 µl de NEBuffer 2 for Klenow Fragment 10X
11. Ajouter 10 µl de dATP
12. Ajouter 1 µl d’enzyme Exo-Minus Klenow
13. Incuber la réaction à 37°C pendant 30 minutes
14. Purifier la réaction à l’aide des colonnes NucleoSpin®Extract II avec un volume final d’élution de 20 µl.
III. Ligation des adaptateurs
15. Ajouter 25 µl de Quick Ligation Reaction Buffer 2X
16. Ajouter 1 µl de d’adaptateurs PE 50 µM dilué à 1/50ème
17. Ajouter 4 µl de Quick T4 DNA Ligase
18. Incuber à 25°C sur un rotateur pendant 30 minutes.
19. Purifier la réaction à l’aide des colonnes NucleoSpin®Extract II avec un volume final d’élution de 40 µl.
IV. Enrichissement par PCR
20. Séparer l’échantillon dans 2 tubes à PCR puis dans chaque tube
21. Ajouter 20 µl de Pfx Amplification Buffer
22. Ajouter 1 µl de Primer PCR PE Sens à 10 µM
23. Ajouter 1 µl de Primer PCR PE AntiSens à 10 µM
24. Ajouter 2 µl de MgSO4 50 mM
25. Ajouter 2 µl de dNTP 10 mM
26. Ajouter 0.8 µl de Pfx Platinum Taq Polymerase Invitrogen
27. Ajouter 18.2 µl de H2O
28. Amplifications : dénaturation initiale pendant 30 sec à 98°C puis 15 cycles avec 10 sec à 98°C, 30 sec à 65°C et 30 sec à 72°C puis une élongation finale de 5 minutes à 72°C
29. Purification avec des billes d’exclusion de taille d’AMPure® d’Agencourt® selon les recommandations du faricant
30. Elution dans un volume de 30 µl avec du tampon d’élution
V. Analyse de la qualité de la banque
31. Doser sur le Qubit à l’aide du kit Qubit HS pour évaluer le rendement
32. Déposer 1µl de l’échantillon sur un bioanalyseur Agilent à l’aide de l’Agilent High Sensitivity DNA kit selon les recommandations du fabricant
32
NCK-008 NCK-009 NCK-010 NCK-011 NCK-013 NCK-014
Nombre
total de
séquences
22038997 24560241 24707087 23201784 17959242 14568561
No match 67% 81% 66% 65% 60% 64%
Nbe
Séquences %chrN
Nbe
Séquences %chrN
Nbe
Séquences %chrN
Nbe
Séquences %chrN
Nbe
Séquences %chrN
Nbe
Séquences %chrN
1 583362 8,26 381325 8,33 678384 8,18 661512 8,21 572005 8,15 405848 7,98
2 614286 8,69 385760 8,43 742921 8,95 703425 8,73 612935 8,73 450028 8,85
3 461168 6,53 287471 6,28 574922 6,93 531569 6,60 466298 6,64 352473 6,93
4 429094 6,07 264421 5,78 544836 6,57 501619 6,22 451703 6,43 358517 7,05
5 422957 5,99 266932 5,83 521643 6,29 481077 5,97 426514 6,07 324946 6,39
6 412594 5,84 255761 5,59 508104 6,12 477025 5,92 420363 5,99 317280 6,24
7 391993 5,55 255904 5,59 465887 5,62 449637 5,58 388081 5,53 283204 5,57
8 346903 4,91 223795 4,89 420673 5,07 398879 4,95 348202 4,96 257175 5,06
9 308726 4,37 199126 4,35 358043 4,32 344783 4,28 297660 4,24 213727 4,20
10 346229 4,90 225259 4,92 406670 4,90 396173 4,92 333085 4,74 233815 4,60
11 337727 4,78 217396 4,75 379436 4,57 375361 4,66 319903 4,56 225234 4,43
12 312017 4,42 197193 4,31 375635 4,53 356334 4,42 307464 4,38 227540 4,47
13 233032 3,30 146918 3,21 288729 3,48 269344 3,34 242279 3,45 189304 3,72
14 223218 3,16 146584 3,20 261857 3,16 252589 3,13 221246 3,15 159217 3,13
15 222656 3,15 143995 3,15 254400 3,07 250857 3,11 209032 2,98 146571 2,88
16 220667 3,12 152664 3,33 237611 2,86 246802 3,06 208212 2,97 132104 2,60
17 241185 3,41 161128 3,52 242696 2,93 263891 3,27 220354 3,14 141765 2,79
18 195851 2,77 122912 2,68 235540 2,84 225683 2,80 195476 2,78 144324 2,84
19 149516 2,12 118016 2,58 136775 1,65 166780 2,07 140269 2,00 81959 1,61
20 161046 2,28 106544 2,33 178434 2,15 183535 2,28 150182 2,14 98706 1,94
21 101195 1,43 67317 1,47 116034 1,40 113749 1,41 102023 1,45 71423 1,40
22 108590 1,54 79300 1,73 105970 1,28 119444 1,48 100807 1,44 59808 1,18
X 221746 3,14 166199 3,63 232826 2,81 269189 3,34 275484 3,92 202591 3,98
Y 20465 0,29 5863 0,13 28554 0,34 20778 0,26 11412 0,16 7608 0,15
Annexe 5. Tableau avec le nombre total de séquences obtenues, du nombre de séquences par chromosome et du %chrN.
33
NCK-016 NCK-019 NCK-023 NCK-028 POI-001
Nombre
total de
séquences
16386807 20459010 20655973 21750965 24642425
No match 59% 63% 61% 66% 63%
Nbe
Séquences %chrN
Nbe
Séquences %chrN
Nbe
Séquences %chrN
Nbe
Séquences %chrN
Nbe
Séquences %chrN
1 532580 7,99 605672 8,23 644741 8,29 599248 8,31 759533 8,70
2 582884 8,75 637343 8,66 672320 8,65 618420 8,58 793137 9,08
3 451525 6,78 484559 6,58 513301 6,60 475520 6,60 602846 6,90
4 441821 6,63 466710 6,34 489511 6,29 452834 6,28 551018 6,31
5 413739 6,21 445338 6,05 470766 6,05 432315 6,00 542636 6,21
6 405589 6,09 441500 6,00 458099 5,89 425900 5,91 537007 6,15
7 368804 5,53 405216 5,50 431743 5,55 402882 5,59 499696 5,72
8 332045 4,98 364618 4,95 380531 4,89 358327 4,97 444541 5,09
9 283219 4,25 314022 4,26 331843 4,27 308774 4,28 391384 4,48
10 315914 4,74 355072 4,82 371248 4,77 345902 4,80 443906 5,08
11 303219 4,55 339821 4,62 359919 4,63 332393 4,61 419358 4,80
12 297653 4,47 324259 4,40 338845 4,36 318294 4,42 399814 4,58
13 236992 3,56 250434 3,40 263947 3,39 242288 3,36 299377 3,43
14 208564 3,13 230909 3,14 245493 3,16 225646 3,13 284850 3,26
15 197334 2,96 222932 3,03 236973 3,05 222312 3,08 288866 3,31
16 190484 2,86 219922 2,99 236688 3,04 215476 2,99 283786 3,25
17 200230 3,00 233041 3,16 247118 3,18 229364 3,18 295197 3,38
18 187740 2,82 204383 2,78 214194 2,75 200339 2,78 247853 2,84
19 119641 1,80 148822 2,02 158812 2,04 144273 2,00 177878 2,04
20 137540 2,06 159726 2,17 168720 2,17 159480 2,21 204587 2,34
21 96254 1,44 105992 1,44 113026 1,45 102887 1,43 127867 1,46
22 87132 1,31 107785 1,46 113880 1,46 107590 1,49 138645 1,59
X 263470 3,95 283296 3,85 301988 3,88 275810 3,83 344505 3,94
Y 10149 0,15 12008 0,16 12903 0,17 12144 0,17 13295 0,15
Annexe 5(Suite). Tableau avec le nombre total de séquences obtenues, du nombre de séquences par chromosome et du %chrN.
34
REMERCIEMENTS
Unité INSERM U781 Michel Vekemans Arnold Munnich
UMR 8030 CNRS-CEA
Génoscope – Institut de Génomique du CEA Adriana Alberti Céline Orvain
Corinne Cruaud Karine Labadie Arnaud Couloux Patrick Wincker
Jean Weissenbach
Laboratoire d’Histologie Embryologie et Cytogénétique Marc Le Lorc’h Serge Romana
Michel Vekemans
Laboratoire d’Hématologie Daniel Leboeuf Marlène Garrido Patrick Villarese
Elizabeth Macintyre
