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BASES MOLECULARES BASES MOLECULARES DEL CÁNCERDEL CÁNCER
APLICACIÓN A LA APLICACIÓN A LA PATOLOGÍA TUMORALPATOLOGÍA TUMORAL
BASES MOLECULARES BASES MOLECULARES DEL CÁNCERDEL CÁNCER
APLICACIÓN A LA APLICACIÓN A LA PATOLOGÍA TUMORALPATOLOGÍA TUMORAL
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LOS LINFOMAS NO
HODGKIN
Jerónimo Forteza Vila
Jefe de Servicio y Catedrático de Anatomía Patológica
Hospital Clínico Universitario de Santiago
12 de Enero de 2009
Xátiva (Valencia)
LINFOMAS
1832183218321832AcuarelaAcuarela
Robert CarswellRobert CarswellAcuarelaAcuarela
Robert CarswellRobert Carswell
Classification of lymphoid neoplasms: the microscope as a tool for disease discovery.
Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Isaacson PG.
Blood (2008) 112: 4384-4499
Elaine Jaffe Nancy Harris Harald Stein Peter G. Isaacson
• Datos Clínicos
• Estudio Morfológico
• Estudio Inmunohistoquímico
• Estudio Molecular
DIAGNÓSTICO
Características moleculares de los linfomas
• Diagnóstico
• Pronóstico
• Terapéutica
Técnicas moleculares en el diagnóstico de linfomas
• ¿Es realmente esencial para el diagnóstico?– En el 90-95% de los casos, la morfología y el fenotipo
son suficientes
– Es esencial para el diagnóstico en el 5-10% de los casos
Bcl2Bcl2Bcl2Bcl2HEHEHEHE
Linfoma folicularLinfoma folicularLinfoma folicularLinfoma folicular
Técnicas moleculares y diagnóstico de linfomas
• ¿Qué cuestiones puede resolver?– Benignidad vs Malignidad (clonalidad)
• Proliferaciones de células B ambiguas• Linfomas de células T• Síndromes linfoproliferativos en pacientes
inmunocomprometidos
– Recaídas vs segundo linfoma (identidad clonal)– Tipos específicos de linfomas (translocaciones)
Técnicas moleculares en linfomas
• Estudios de clonalidad: reordenamientos de genes codificantes de receptores de antígenos
• Translocaciones (“clonality markers”)
Reordenamiento de genes codificantes de receptores de antígenos
• Proceso inmunológico
• Generación de variabilidad genética para obtener receptores diversos y específicos
• Proceso similar en células B y en T (Ig y TCR)
Reordenamiento específico de V(D)J para cada clon
• Policlonal • Monoclonal
Estudios de clonalidad: Métodos
• Southern blot: “gold standard”– Necesita buena calidad de ADN (Tejido
congelado)– Muy laborioso– Necesidad de material reactivo
• PCR: más práctico– Permite el uso de material fijado en formol e
incluido en parafina– Resultados en dos días– Más sensible
FR3FR3
mwmwMMPP C-C-
Electroforesis en gel de poliacrilamidaElectroforesis en gel de poliacrilamida
MonoclonalMonoclonal PoliclonalPoliclonal
Análisis de fragmentosAnálisis de fragmentos(Electroforesis por capilar)(Electroforesis por capilar)
FR3FR3
““Patrón de puercoespín”Patrón de puercoespín”
MonoclonalMonoclonal PoliclonalPoliclonal
FR3FR3
Análisis de fragmentosAnálisis de fragmentos(Electroforesis por capilar)(Electroforesis por capilar)
Reordenamiento en TCR por PCR
• Cadena TCR gamma
• Cadena TCR beta
PP MM C (-)C (-) PMPM
Electroforesis en gel de poliacrilamidaElectroforesis en gel de poliacrilamida
TCR1TCR1
Reordenamiento monoclonal
TCR2TCR2
Reordenamiento policlonal
Reordenamiento monoclonal
Reordenamiento policlonal
Análisis de fragmentosAnálisis de fragmentos
Recidiva vs. Segundo tumor
Linfoma de la zona marginal Linfoma de la zona marginal esplénicoesplénico
Tres años despuésTres años despuésAdenopatía cervical: LBCG con translocación en MYCAdenopatía cervical: LBCG con translocación en MYC
¿Transformación o segundo linfoma?
1ª biopsia (bazo)
2ª biopsia (ganglio)
Estudios de clonalidad por PCR: Limitaciones
• Resultados falso negativos
– Degradación del ADN
• Incluir un gen de control interno
– Hipermutación somática del gen IgH
• Linfoma folicular, células plasmáticas neoplásicas
– Abundante población acompañante policlonal
– Reordenamientos inusuales, interferencia con
segmentos translocados,…
• Resultados falso positivos
– Exceso de sensibilidad
– “Pseudo-clones”: Pobreza de células diana
– Baja resolución en electroforesis (gel de
agarosa)
• Usar poliacrilamida o electroforesis capilar
Estudios de clonalidad por PCR: Limitaciones
• Reordenamientos clonales tanto de los
genes Ig o TCR no es equivalente a
línea B o T.
• Infidelidad de linaje (Linfoma linfoblástico)
• Explansión clonal de células B en linfomas T
(LAI) o viceversa
Estudios de clonalidad por PCR: Limitaciones
¡Monoclonalidad no es ¡Monoclonalidad no es sinónimo de sinónimo de malignidad!malignidad!
- Inmunodepresión- Inmunodepresión
- Reacciones hiperinmunes - Reacciones hiperinmunes
(infecciones virales)(infecciones virales)
- Enfermedades autoinmunes- Enfermedades autoinmunes
- Enfermedad de Castleman- Enfermedad de Castleman
• BIOMED-2– PCR Multiplex (estudio de varias regiones en
la misma reacción de PCR)– Realizable y reproducible
– Linfomas B: 99% monoclonales– Linfomas T: 94% monoclonales– Lesiones reactivas: policlonalidad en la
gran mayoríavan Krieken et al. Leukemia (2007) 21: 201-206van Krieken et al. Leukemia (2007) 21: 201-206
Estudios de clonalidad por PCR: Estandarización
Técnicas inmunohistoquímicas características de alteraciones
citogenéticas
ALK1ALK1ALK1ALK1Cyclin D1Cyclin D1Cyclin D1Cyclin D1
Inmunohistoquímica como técnica molecular diagnóstica
Técnicas moleculares en linfomas
Características de las alteraciones citogenéticas
Anormalidades citogenéticas por FISH
• ¿Porqué es mejor el FISH?
• Aplicaciones en el diagnóstico de los linfomas
• No necesita células en cultivo
• Puede aplicarse a extensiones citológicas y tejido fijado en formol e incluido en parafina
Ventajas del FISH
Diagn Mol Pathol (2008) 17:59-63
Sondas “Dual-fusion”Patrón normal
Núcleo en Núcleo en interfaseinterfase
Cromosomas en metafaseCromosomas en metafase
Sondas “Dual-fusion”Patrón normal
Núcleo en Núcleo en interfaseinterfase
Cromosomas en metafaseCromosomas en metafase
Sondas “Dual-fusion”Translocación recíproca
Núcleo en Núcleo en interfaseinterfase
Cromosomas en metafaseCromosomas en metafase
Sondas “Dual-fusion”Translocación recíproca
Núcleo en Núcleo en interfaseinterfase
Cromosomas en metafaseCromosomas en metafase
Sondas “Break-appart”Patrón normal
Núcleo en Núcleo en interfaseinterfase
Cromosomas en metafaseCromosomas en metafase
Sondas “Break-appart”Translocación recíproca
Núcleo en Núcleo en interfaseinterfase
Cromosomas en metafaseCromosomas en metafase
Ventajas del FISH “split”
• Genes implicados en translocaciones con diferentes ‘partners’ (MYC, ALK, BCL6)
• No hay falsos positivos virtualmente– En contraste, señales de fusión falsas son
posibles debido a solapamiento nuclear
• Fácil evaluación
Linfoma folicular con translocación en BCL2 (sonda ‘break-apart’)Linfoma folicular con translocación en BCL2 (sonda ‘break-apart’)
Linfoma folicular Bcl2 positivoLinfoma folicular Bcl2 positivo
Ausencia de translocación en Bcl2 – Sonda ‘break-apart’Ausencia de translocación en Bcl2 – Sonda ‘break-apart’
Linfoma folicular Bcl2 negativoLinfoma folicular Bcl2 negativo
Translocación en BCL2
• 90 % de los linfomas foliculares
• 30% de los linfomas B difusos de célula grande
1 2 C+ C-
PCR Major Breakpoint Region
Crom 18
bcl-2Crom 14
IgH5’ 3’MBR
t(14;18) implicando al gen BCL2
PCR MBR PCRMBR+MCR
FISH
100%
50%
30-40%
FISH - BCL2: utilidad
• Hiperplasia folicular vs. Linfoma
• Linfoma folicular vs. Otros linfomas de patrón
nodular
• Linfoma B de células grandes: pronóstico (?)
t(11;14)• Linfoma del manto• Cr. 11: gen Ciclina D1• Cr. 14: gen IgH
PCR en región MTC (“Major Translocation Cluster”)
Sólo 50%!
C-C+
32
1
Linfoma del manto: Sonda ‘dual-fusion’ para t(11;14)Linfoma del manto: Sonda ‘dual-fusion’ para t(11;14)
Linfoma del manto Ciclina D1 positivoLinfoma del manto Ciclina D1 positivo
FISH – CCND1: utilidad
• Linfoma del manto
– Cuando hay problemas con la inmunotinción de la Ciclina
D1 (no debería de haberlos)
• Tricoleucemia
– Recordar que la Ciclina D1 puede ser positiva por
inmunohistoquímica pero negativa por FISH
(clinicopatológicamente es una enfermedad muy distinta)
Sangre periférica
CD22TRICOLEUCEMIA
- Pancitopenia- Aspirado seco- Marcada esplenomegalia- No hay adenopatías
B. Fallini (2007)
FISH – Translocaciones en MALT1
• Pronóstico (Linfoma MALT gástrico)– No respuesta a los antibióticos– Probable diseminación
• Detección: algunos RT-PCR; FISH (biopsias endoscópicas)
• Diagnóstico diferencial– Infiltrados reactivos– Otros LNH
Isaacson and Spencer Histopathology 1987
Linfoma MALT
“Discovery diseases. MALT lymphoma as a paradigm”
Jaffe ES, et al. Classification of lymphoid neoplasms: the microscope as a tool for disease discovery. Blood (2008) 112:4384-4399
Marshall BJ y Warren JR(Premios Nobel de Medicina en 2005)
Helicobacter Pilory (Warthin-Starry)
Reordenamientos de BCL6
• Gen en 3q27
• Sonda ‘Split’
• Utilidad:– Linfoma B de células grandes
(¿pronóstico?)
Linfoma B de células grandes Bcl6 positivoLinfoma B de células grandes Bcl6 positivo
Reordenamientos de MYC
• Característico del Linfoma de Burkitt
• Más frecuente: t(8;14)
• ‘Breakpoints’: alta variabilidad (PCR)
• FISH split: lo más útil
CD20
BCL6CD10
HE
MIB1EBER
MORFOLOGÍA Y PATRÓN INMUNOHISTOQUÍMICO EN EL LINFOMA DE BURKITT
FISH – Reordenamiento en MYC
• También útil:
– Como marcador de progresión (Aberración secundaria)
– Para la detección de LBCG con doble translocación (“double hit”): BCL2 + MYC
BCL-2 MYC
FISH
Linfoma B Difuso de Células Grandes con reordenamiento de BCL-2 y MYC
(Linfoma de la zona gris)
ALK split probeALK split probe
Translocación en ALK
• Usualmente los linfomas anaplásicos portan la t(2;5) – ALK/NPM
• Posibilidad de diversos patrones
ALK1ALK1
“INMUNOFISH”
• Estudios de clonalidad: PCR
• Translocaciones características: FISH
• Material de rutina (Fijado en formol e incluido en parafina)
• Técnicas útiles, pero deben ser interpretadas en el contexto clínicopatológico
Técnicas moleculares en el diagnóstico de linfomas no Hodgkin
Dave SS et al. Molecular diagnosis in Burkitt’s lymphoma.
N Engl J Med (2006) 354: 2431-2442
• Datos Clínicos
• Estudio Morfológico
• Estudio Inmunohistoquímico
• Estudio Molecular
DIAGNÓSTICO
Plasmocitoma (HE)
Linfoma de Burkitt
Facultad de Medicina (Universidad de Santiago
Gracias por vuestra atenciónGracias por vuestra atención