Upload
abulkhair-abdullah
View
2.801
Download
12
Tags:
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Terjemahan
Citation preview
BUKU
PELAJARAN
dari
RESEPTOR
FARMAKOLOGI
Edisi Kedua
Diedit oleh
John C. Foreman, D. Sc, FRCP
Departemen Farmakologi
University College London
Inggris Raya
Torben Johansen, MD
Departemen Fisiologi dan Farmakologi
University of Southern Denmark
Denmark
CRC PRESS
Boca Raton London New York Washington, DC
Library of Congress dalam Katalog KDT
Textbook reseptor farmakologi / diedit oleh John C. Foreman, Torben
Johansen. â € "
2nd ed.
p. cm.
Termasuk referensi bibliografi dan indeks.
ISBN 0-8493-1029-6 (alk. kertas)
1. Reseptor obat. I. Foreman, John C. II. Johansen, Torben.
RM301.41. T486 2003
615 '.7 â € "DC21
2002067406
Buku ini berisi informasi yang diperoleh dari sumber-sumber otentik dan
sangat dihormati. Materi dicetak ulang dikutip dengan izin, dan sumber
ditunjukkan. Berbagai referensi yang terdaftar. Upaya-upaya masih dilakukan
untuk mempublikasikan data yang dapat dipercaya dan informasi, tetapi penulis
dan penerbit tidak dapat bertanggung jawab atas keabsahan semua bahan atau
konsekuensi dari penggunaannya. Baik buku ini atau bagian apapun dapat
direproduksi atau ditransmisikan dalam bentuk apapun atau dengan cara apapun,
elektronik atau mekanik, termasuk fotokopi, microï ¬ lming, dan rekaman, atau
oleh penyimpanan informasi atau sistem pencarian, tanpa terlebih dahulu izin
tertulis dari penerbit. All rights reserved. Otorisasi untuk memfotokopi artikel
untuk keperluan internal atau pribadi, atau penggunaan pribadi atau internal speciï
klien, dapat diberikan oleh CRC Press LLC, asalkan $ 1,50 per halaman
difotokopi dibayarkan langsung kepada Copyright Clearance Pusat, 222
Rosewood Drive, Danvers, MA 01923 USA Biaya kode untuk pengguna Layanan
Pelaporan Transaksional adalah ISBN 0-8493-1029-6/03 / $ 0,00 + $ 1,50. Biaya
dapat berubah tanpa pemberitahuan. Untuk organisasi yang telah diberikan lisensi
fotokopi oleh CCC, sistem pembayaran yang terpisah telah diatur. Persetujuan
dari CRC Press LLC tidak memperpanjang untuk menyalin untuk distribusi
umum, untuk promosi, untuk membuat karya-karya baru, atau untuk dijual
kembali. Harus mendapat ijin tertulis dari CRC Press LLC untuk menyalin
tersebut. Langsung semua pertanyaan untuk CRC Press LLC, 2000 NW Corporate
Blvd., Boca Raton, Florida 33431.
Pemberitahuan Merek: Produk atau nama perusahaan mungkin merupakan
merek dagang atau merek dagang terdaftar, dan hanya digunakan untuk
identifïkasi dan penjelasan, tanpa ada maksud untuk melanggar.
Kunjungi CRC Press situs Web di www.crcpress.com
© 2003 oleh CRC Press LLC
Tidak ada klaim Pemerintah AS asli bekerja
International Standard Book Number 0-8493-1029-6
Perpustakaan Kongres Kartu Nomor 2002067406
Dicetak di Amerika Serikat 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0
Dicetak di atas kertas bebas asam
Kata pengantar
Selama sekitar empat dekade sekarang, kursus di reseptor farmakologi telah
diberikan di University College London untuk mahasiswa di mereka ï ¬ nal tahun
penelitian untuk gelar Bachelor of Science dalam farmakologi. Baru-baru ini, tentu saja
juga telah diambil oleh siswa membaca untuk Sarjana yang of Science di bidang kimia
obat. Para siswa mengikuti kursus telah mengandalkan untuk mereka membaca pada
berbagai sumber, termasuk surat-surat asli, ulasan, dan berbagai buku teks, tetapi tidak
ada teks tunggal dibawa bersama materi termasuk dalam kursus tersebut. Juga, hampir
terus-menerus sejak Program 1993, kami telah diselenggarakan untuk mahasiswa
pascasarjana dan pekerja riset dari pharmaceu- industri vertikal dari negara negara Nordik
dan Eropa. Dalam banyak kasus, murah hati ï ¬ dukungan keuangan dari Akademi
Penelitian Denmark dan Penelitian Nordic Academy telah membuat ini mungkin. Kursus-
kursus ini juga didasarkan pada surat bagi mahasiswa di University College London, dan
kami berterima kasih atas kritik konstruktif dari banyak siswa pada semua program studi
yang telah membentuk buku ini.
Edisi pertama buku yang disediakan teks tunggal untuk siswa, dan antusiasme
dengan yang diterima mendorong kami untuk bekerja pada edisi kedua. Ada sangat signiï
¬ bisa langkah maju sejak edisi pertama buku ini, terutama dalam biologi molekuler
reseptor. Kemajuan ini REI ¬, ected dalam bab-bab ditulis ulang untuk bagian buku ini
yang berhubungan dengan biologi molekuler. Pada saat yang sama, kami menyadari
bahwa dalam edisi pertama terlebih dulu kita termasuk terlalu banyak materi yang jauh
dari reseptor sendiri. Untuk memasukkan semua biologi seluler yang konsekuen pada
aktivasi reseptor benar-benar di luar cakupan buku apa pun. Oleh karena itu, kita harus
dihilangkan dari edisi kedua bahan di messenger intraseluler kedua seperti kalsium,
nukleotida siklik, dan fosfolipid. Edisi kedua sekarang berkonsentrasi pada membran sel
reseptor sendiri, bersama-sama dengan sinyal langsung mereka transduser: saluran ion,
heterotrimeric G-protein, dan tirosin kinase.
Para penulis bab-bab dalam buku ini telah terlibat aktif dalam mengajar berbagai
kursus, dan tujuan bersama kami telah memberikan pengenalan logis untuk mempelajari
reseptor obat. Karakterisasi reseptor obat melibatkan sejumlah pendekatan yang berbeda:
deskripsi kuantitatif ion dari studi fungsional dengan agonis dan antagonis, deskripsi
kuantitatif mengikat ligan untuk reseptor, struktur molekul reseptor obat, dan unsur-unsur
yang mentransduksi sinyal dari reseptor teraktivasi ke kompartemen intraseluler.
Buku ini dimaksudkan sebagai teks pengantar pada reseptor farmakologi tetapi
bacaan lebih lanjut memiliki telah disediakan bagi mereka yang ingin menindaklanjuti
topik. Beberapa masalah juga disediakan untuk pembaca untuk menguji pemahaman
mereka tentang materi dalam beberapa bab.
John C. Foreman
Torben Johansen
Para Editor
John C. Foreman, B.Sc., Ph.D., D. Sc, MB, BS, FRCP, adalah Profesor
imunofarmakologi di University College London. Dia juga telah menjadi Visiting Professor di
University of Southern Denmark, Odense, Denmark, dan University of Tasmania, Hobart,
Australia. Dr Foreman adalah Dekan Mahasiswa di University College London dan juga Wakil
Dekan Fakultas Ilmu. Dia Tutor Senior dari University College London 1989-1996 dan
Admissions Tutor Kedokteran 1982-1993. Dr Foreman dibuat sebagai Fellow dari University
College London Tahun 1993 dan menerima gelar Doctor of Science dari University of London
yang sama tahun. Dia terpilih untuk Fellowship dari Royal College of Physicians pada tahun
2001. Dr Foreman awalnya belajar kedokteran di University College London, tapi terputus
studinya di bidang kedokteran untuk mengambil yang B.Sc. dan Ph.D. dalam farmakologi sebelum
kembali untuk menyelesaikan derajat kesehatan, MB, BS, yang ia peroleh pada tahun
1976. Setelah magang di Rumah Sakit Distrik Peterborough, ia menghabiskan dua tahun sebagai
Visiting Instruktur Kedokteran, Divisi Clinical Immunology, Johns Hopkins University Sekolah
Kedokteran, Baltimore, MD. Dia kemudian kembali ke University College London, di mana ia
tetap pada staf permanen.
Dr Foreman adalah anggota dari Farmakologi Masyarakat Inggris dan Physiological
Society dan menjabat sebagai editor dari British Journal of Farmakologi 1980-1987 dan lagi dari
1997-2000. Ia telah menjadi associate editor imunofarmakologi dan merupakan anggota dari
dewan redaksi INI ¬, ammation Penelitian dan Farmakologi dan Toksikologi. Dr Foreman
memiliki disajikan lebih dari 70 diundang ceramah di seluruh dunia. Dia adalah co-editor
dari Textbook of Immuno-farmakologi, sekarang dalam edisi ketiga, dan telah menerbitkan sekitar
170 makalah penelitian, serta ulasan dan kontribusi ke buku-buku. Kepentingan penelitian
utamanya saat ini meliputi bradikinin reseptor dalam saluran pernafasan manusia hidung,
mekanisme aktivasi sel dendritik, dan kontrol sirkulasi mikrovaskular pada kulit manusia.
Torben Johansen, MD, dr. med., adalah Docent Farmakologi, Departemen Fisiologi dan
Farmakologi, Institut Biologi Kedokteran, Fakultas Ilmu Kesehatan, Universitas Southern
Denmark. Dr Johansen memperoleh gelar MD pada tahun 1970 dari University of Copenhagen,
menjadi seorang peneliti di Departemen Farmakologi dari Odense University di tahun 1970, dosen
pada tahun 1972, dan dosen senior pada tahun 1974. Sejak 1990, ia telah Docent
Farmakologi. Pada tahun 1979, ia adalah sesama penelitian mengunjungi selama tiga bulan di
Departemen Klinis Universitas Pharma-cology, Oxford University, dan pada tahun 1998 dan 2001
ia adalah seorang peneliti tamu di Departemen Farmakologi, Universitas College London. Pada
tahun 1980, ia melakukan magang di bidang ilmu kedokteran dan bedah di Odense University
Hospital. Dia memperoleh gelar Dr Med. Sci. pada tahun 1988 dari Odense University. Dr
Johansen adalah anggota dari Farmakologi Masyarakat Inggris, Fisiologis Society, Masyarakat
Skandinavia Fisiologi, Denmark Medical Association, Denmark Farmakologi Masyarakat,
Denmark Society for Farmakologi Klinik, dan Denmark Society for Hipertensi. Dia telah
menerbitkan 70 makalah penelitian dalam jurnal wasit. Kepentingan penelitian utamanya saat ini
Reseptor NMDA dalam substantia nigra dalam kaitannya dengan kematian sel dalam Parkinsonâ €
™ s penyakit dan juga ion transportasi dan sinyal dalam sel mast dalam kaitannya dengan pH
intraseluler dan regulasi volume.
Kontributor
Sir James W. Black, Nobel Laureate,
James Hitam Yayasan
London, Inggris Raya
David A. Brown, FRS
Departemen Farmakologi
University College London
London, Inggris Raya
Jan Egebjerg, Ph.D.
Aarhus University
London, Inggris Raya
Aarhus, Denmark
Steen Gammeltoft, MD
Departemen Biokimia Klinis
Rumah Sakit Glostrup
Glostrup, Denmark
Alasdair J. Gibb, Ph.D.
Departemen Farmakologi
University College London
Dennis G. Haylett, Ph.D. FRS Departemen Farmakologi
University College London London, Inggris Raya
Birgitte Holst Departemen Farmakologi University of Copenhagen Panum Institute Copenhagen, Denmark
Donald H. Jenkinson, Ph.D. Departemen Molekuler dan
Struktural Departemen Farmakologi Biologi University College London
IJsbrand Kramer, Ph.D. Bagian Biologi Molekuler dan
Seluler Eropa Institut Kimia dan Biologi Universitas Bordeaux 1 Talence, Prancis
Thue W. Schwartz, MD Departemen Farmakologi University of Copenhagen Panum Institute
Copenhagen, Denmark
London, Inggris Raya
Isi
Bagian I: Drugâ € "Interaksi Reseptor
Bab 1
Pendekatan klasik untuk Studi Drugâ € "Interaksi Reseptor ....................................... ..........3
Donald H. Jenkinson
Bagian II: Struktur Molekul dari Reseptor
Bab 2
Struktur Molekul dan Fungsi 7tm G-Protein-Coupled Reseptor ......................................... 81
Thue W. Schwartz dan Birgitte Holst
Bab 3
Struktur Ligan-Gated Saluran Ion ............................................... ..................................... 111
Jan Egebjerg
Bab 4
Struktur Molekul Reseptor Tirosin Kinase ............................................ ................ .......... 131
Steen Gammeltoft
Bagian III: Studi Ligan-Pengikatan Reseptor
Bab 5
Pengukuran langsung Obat Mengikat Reseptor ........................................... .................... 153
Dennis G. Haylett
Bagian IV: Transduksi Sinyal Reseptor
Bab 6
Reseptor Terkait dengan Ion Channels: Mekanisme Aktivasi dan Blok ........................... 183
Alasdair J. Gibb
Bab 7
G-Proteins..................................................................................................................... ........................213
David A. Brown
Bab 8
Transduksi sinyal melalui Protein Kinase Tirosin ............................................ ............... 237
IJsbrand Kramer
Bagian V: Reseptor sebagai Target Farmasi
Bab 9
Reseptor sebagai Farmasi........................................................................................................271
James W. Hitam
INDEX
............................................................................................................................. .......................................
279
CHAPTER 1
CLASSICAL APPROACHES TO THE STUDY OF DRUG-RECEPTOR
INTERACTIONS
PENDEKATAN KLASIK UNTUK KAJIAN INTERAKSI OBAT-
RESEPTOR
1.1 INTRODUCTION
The term (ISTILAH)
Reseptor digunakan dalam farmakologi untuk menunjukkan kelas
makromolekul seluler yang bersangkutan secara khusus dan langsung dengan
sinyal kimia antara dan di dalam sel. Kombinasi hormon, neurotransmitter, atau
utusan intraseluler dengan reseptor (s) hasil dalam perubahan aktivitas selular.
Oleh karena itu, reseptor tidak hanya harus mengenali molekul tertentu yang
mengaktifkannya, tetapi juga, ketika pengakuan terjadi, mengubah fungsi sel
dengan menyebabkan, misalnya, perubahan dalam permeabilitas membran atau
perubahan dalam transkripsi gen/ gen turunan.
Konsep ini memiliki sejarah panjang. Manusia selalu tertarik dengan
kemampuan luar biasa dari hewan untuk membedakan zat yang berbeda dengan
mencicipi dan mencium/mengendus.Tertulis sekitar abad 50 SM, Lucretius (di
De Rerum Natura, Liber IV) berspekulasi bahwa bau dapat disampaikan oleh hal
kecil, "benih" tak terlihat dengan bentuk tersendiri yang harus masuk ke sela
"ruang dan bagian-bagian" dalam langit-langit mulut dan lubang hidung. Dalam
kata-katanya:
Beberapa pastinya lebih kecil, beberapa lebih besar, mereka bisa jadi
segitiga untuk beberapa makhluk, persegi untuk orang lain, banyak bundar, dan
beberapa banyak sudut dalam banyak cara.
Prinsip yang sama saling melengkapi antara zat dan pengakuan keberadaan
mereka yang tersirat dalam prediksi John Locke dalam Essay Concerning Human
Understanding (1690):
Apakah kita tapi tahu mekanisme afeksi dari partikel rhubarb, hemlock,
opium dan seorang pria, sebagai pembuat jam apakah orang itu terbuat dari jam,
... kita harus bisa memberitahu sebelumnya bahwa rhubarb akan membersihkan,
hemlock membunuh dan opium membuat pria tidur .
(Di sini, mekanisme afeksi bisa diganti dalam penggunaan saat ini oleh pertalian
kimia.)
Mengetahui apa yg terjadi sebagaimana mereka seharusnya, ide-ide awal ini
hanya bisa diambil lebih lanjut, pada awal abad ke-19, ini menjadi mungkin untuk
memisahkan dan memurnikan masing-masing komponen bahan asli dari tanaman
dan hewan. Terkesan sederhana namun teknik canggih dari kristalisasi fraksional
memungkinkan alkaloid tanaman seperti nikotin, atropin, pilocarpine, strychnine,
dan morfin untuk diperoleh dalam bentuk murni untuk pertama kalinya. Dampak
pada biologi adalah langsung dan jauh jangkauannya, untuk zat ini terbukti
menjadi alat yang berharga untuk mengungkap fungsi fisiologis. Untuk
mengambil satu contoh, JN Langley membuat penggunaan besar kemampuan
nikotin untuk mengaktifkan terlebih dahulu dan kemudian memblokir saraf yang
berasal di ganglia otonom. Hal ini memungkinkan dia untuk memetakan distribusi
dan divisi sistem saraf otonom.
Langley yang juga mempelajari tindakan atropin dan pilocarpine, dan pada
tahun 1878 ia menerbitkan (dalam volume pertama dari Journal of Physiology,
yang ia dirikan) penjelasan tentang interaksi antara pilocarpine (yang
menyebabkan salvias/keluar air liur) dan atropin (yang menghambat tindakan
pilocarpine ini). Memantapkan dan memperluas karya perintis Heidenhain dan
Luchsinger, Langley menunjukkan bahwa tindakan menghambat yang dilakukan
oleh atropin dapat diatasi dengan meningkatkan dosis pilocarpine. Selain itu,
respon yang dikembalikan ke pilocarpine pada gilirannya bisa dihapuskan oleh
atropin selanjutnya. Mengomentari hasil ini, Langley menulis:
Ŗsaya pikir, tanpa terlalu terburu-buru, Kita mungkin menganggap bahwa ada
beberapa bahan atau zat di ujung saraf atau [saliva] sel kelenjar baik oleh atropin
dan pilocarpine yang mampu membentuk senyawa. Pada asumsi ini, maka,
senyawa atropin atau pilocarpine dibentuk menurut beberapa hukum di mana
relatif massa dan kesamaan kimia mereka untuk substansinya adalah faktornya.ŗ
Jika kita mengganti massal dengan konsentrasi, kalimat kedua dapat
berfungsi sebaik sekarang seperti yang tertulis, meskipun hakikat hukum yang
telah disimpulkan oleh Langley harus ada dan bukanlah untuk dirumuskan
(dalam konteks ilmu farmasi) sampai hampir 60 tahun kemudian. Hal ini
dipertimbangkan dalam Section1.5.2 bawah.
JN Langley mempertahankan ketertarikannya pada aksi alkaloid tanaman
sepanjang hidupnya. Melalui karyanya dengan nikotin (yang dapat mengkontraksi
otot rangka) dan curare (yang menghapuskan tindakan nikotin ini dan juga
menghambat respon otot untuk stimulasi saraf, seperti pertama kali ditunjukkan
oleh Claude Bernard), ia mampu menyimpulkan pada tahun 1905 bahwa otot
harus memiliki "zat menerima/reseptif":
Karena dalam keadaan normal baik nikotin dan curari menghapuskan efek
stimulasi saraf, tetapi tidak mencegah kontraksi dari yang diperoleh oleh stimulasi
otot langsung atau dengan injeksi yang memadai nikotin selanjutnya, dapat
disimpulkan bahwa baik racun maupun saraf impuls tidak bekerja secara langsung
pada substansi kontraktil otot tetapi pada beberapa substansi tambahan. Karena
substansi tambahan ini adalah penerima rangsangan yang mentransfer ke bahan
kontraktil, kita dapat menyebut hal itu sebagai subtansi reseptif otot.
Pada saat yang sama, Paul Ehrlich, yang bekerja di Frankfurt, telah
mencapai kesimpulan yang sama, meskipun dari bukti yang cukup berbeda. Dia
adalah yang pertama yang membuat kajian menyeluruh dan sistematis tentang
hubungan antara struktur kimia dari molekul organik dan tindakan biologis
mereka. Hal ini dimanfaatkan dengan baik dalam kerjasama dengan kimiawan
organik A. Bertheim. Bersama-sama, mereka menyiapkan dan menguji lebih dari
600 senyawa organologam dilengkapi dengan merkuri dan arsen.
Di antara hasilnya adalah pengenalannya ke kedokteran tentang obat-obatan
seperti misalnya Salvarsan yang beracun bagi mikroorganisme patogen yang
bertanggung jawab untuk sifilis, pada dosis yang memiliki efek samping yang
relatif kecil pada manusia. Ehrlich juga meneliti seleksi pewarnaan sel dengan zat
pewarna serta tindakan sangat kuat dan spesifik dari racun bakteri. Semua studi
ini meyakinkannya bahwa molekul biologis aktif harus terikat untuk menjadi
efektif, dan setelah perubahan waktu ia menyatakan ini dengan rapi dalam bahasa
Latin:
Corpora non agunt nisi fixata.*
In Ehrlichřs words (Collected Papers, Vol. III,Chemotherapy):
Dengan kata Ehrlich (Collected Papers, Vol III, Kemoterapi.):
Ketika racun dan organ sensitif pada hal itu tidak datang untuk melakukan kontak,
atau ketika kepekaan organ tidak ada, tidak akan ada tindakan. Jika kita berasumsi
bahwa keanehan dari toksin itu yang menyebabkan distribusi mereka
dilokalisasikan ke dalam kelompok khusus dari molekul toksin dan kekuatan
organ dan jaringan untuk bereaksi dengan racun terlokalisasi dalam kelompok
khusus protoplasma, kita sampai pada dasar teori sisi rantai saya. Kelompok
distributif toksin yang saya sebut "kelompok haptophore" dan organ kimia sesuai
protoplasma sebagai 'reseptor.' ... Tindakan Beracun hanya dapat terjadi bila
reseptor dipasang untuk jangkar dari racun yang hadir.
Saat ini, sudah diakui bahwa Langley dan Ehrlich layak menerima
penghargaan sebanding untuk pengenalan konsep reseptor ini. Di tahun yang
sama, ahli biokimia mempelajari hubungan antara konsentrasi substrat dan
kecepatan enzim juga datang untuk berpikir bahwa molekul enzim harus memiliki
sebuah "tempat aktif" yang mendiskriminasikan antara berbagai substrat dan
inhibitor. Seperti yang sering terjadi, untaian bukti yang berbeda telah berkumpul
untuk menunjuk pada sebuah kesimpulan tunggal.
Akhirnya, perlu dicatat ada dua pengertian yang mana para ahli farmakologi
masa kini dan ahli biokimia menggunakan reseptor istilah Pengertian pertama,
seperti dalam kalimat pembukaan bab ini, adalah mengacu pada keseluruhan
reseptor makromolekul yang mengangkut tempat pengikatan agonis. Penggunaan
ini menjadi umum sebagai teknik biologi molekuler yang mengungkapkan urutan
asam amino dan makromolekul sinyal yang lebih banyak. Tapi, para ahli
farmakologi terkadang masih menggunakan istilah reseptor ketika mereka hanya
memikirkan daerah tertentu dari makromolekul yang bersangkutan dalam
pengikatan agonis dan antagonis molekul. Oleh karena itu, reseptor okupansi
sering digunakan sebagai singkatan nyaman bagi sebagian kecil dari tempat
pengikatan yang ditempati oleh ligan. **
1.2 PEMODELAN HUBUNGAN ANTARA KONSENTRASI AGONIS
DAN JARINGAN RESPON
Dengan konsep dari pembentukan reseptor, para ahli farmakologi kemudian
mengalihkan perhatian mereka untuk memahami hubungan kuantitatif antara
konsentrasi obat dan respon suatu jaringan. Ini mensyaratkan, pertama, mencari
tahu bagaimana fraksi tempat pengikatan diduduki dan diaktifkan oleh molekul
agonis yang bervariasi dengan konsentrasi agonis, dan, kedua, memahami
ketergantungan atas besarnya respon yang diamati pada tingkat aktivasi reseptor.
Saat ini, pertanyaan pertama kadang-kadang dapat dipelajari secara
langsung menggunakan teknik yang dijelaskan dalam bab-bab selanjutnya, tapi ini
bukanlah pilihan untuk para ahli farmakologi saat ini. Juga, satu-satunya
tanggapan yang kemudian bisa diukur (misalnya, kontraksi bagian otot polos yang
utuh atau perubahan dalam laju denyut jantung) yang tidak langsung, dalam arti
bahwa banyak kegiatan sel yang terletak di antara langkah awal (aktivasi dari
reseptor) dan respon yang diamati. Untuk alasan ini, para pekerjanya saat ini tidak
punya pilihan selain untuk merancang pendekatan tidak langsung yang cerdik,
beberapa di antaranya masih penting. Ini didasarkan pada "model" (yaitu,
membuat asumsi tertentu tentang) dua hubungan yang disebutkan di atas dan
kemudian membandingkan prediksi model dengan perilaku aktual dari jaringan
yang terisolasi. Ini sekarang akan digambarkan.
1.2.1 Hubungan Antara Konsentrasi Ligan dan Reseptor Okupansi
Kita mulai dengan kemungkinan representasi paling sederhana dari
kombinasi suatu ligan, A, dengan tempat pengikatan pada reseptor, R:
Di sini, pengikatan dianggap sebagai reaksi biomolekuler dan k +1 dan k-1
masing masing adalah tingkat penghubungan konstan (M-1 s-1) dan tingkat
pemisahan konstan (s-1).
Hukum aksi massa menyatakan bahwa laju reaksi sebanding dengan produk
dari konsentrasi reaktan. Kami akan menerapkannya ke skema sederhana ini,
membuat asumsi bahwa keseimbangan telah tercapai sehingga tingkat di mana
AR terbentuk dari A dan R adalah sama dengan tingkat di mana AR terpisahkan.
Hal ini memberikan:
di mana [R] dan [AR] menunjukkan konsentrasi reseptor di mana tempat
pengikatan untuk A bebas dan ditempati, masing-masing.
Ini mungkin tampak aneh untuk merujuk pada konsentrasi reseptor dalam
konteks ini ketika reseptor seringkali dapat bergerak hanya pada bidang membran
(dan bahkan kemudian mungkin tidak lebih dari batas tertentu, karena banyak
jenis reseptor yang berlabuh). Tetapi, model ini dapat dirumuskan sama baiknya
dalam hal proporsi populasi tempat pengikatan baik yang kosong atau yang
ditempati oleh suatu ligan. Jika kita mendefinisikan pR sebagai proporsi bebas, *
sama dengan [R] / [R] T, di mana [R] T menunjukkan konsentrasi total reseptor,
dan pAR sebagai [AR] / [R] T, kita memiliki:
Karena untuk saat ini kita hanya konsentrasi dengan kondisi kesetimbangan
dan tidak dengan tingkat di mana kesetimbangan tercapai, kita bisa
menggabungkan k +1 dan k-1 untuk membentuk sebuah konstanta baru, KA = k-1
/ k +1, yang memiliki unit konsentrasi. KA adalah konstanta kesetimbangan
disosiasi (lihat Lampiran 1.2A [Bagian 1.2.4.1]), meskipun hal ini sering disingkat
baik konstanta kesetimbangan pemisahan atau konstan. Mengganti k +1 dan k-1
memberikan:
Karena tempat pengikatan tersebut adalah kosong atau ditempati, kita bisa
menulis:
Menggantikan pR:
Oleh karena itu, *
Ini adalah persamaan penting Hill-Langmuir. AV Hill adalah yang pertama
(pada tahun 1909) untuk menerapkan hukum aksi massa dengan hubungan antara
lig dan konsentrasi dan reseptor okupansi pada kesetimbangan dan tingkat di
mana keseimbangan ini didekati. ** The fisik kimia I. Langmuir menunjukkan
beberapa tahun kemudian bahwa persamaan yang sama (Langmuir adsorpsi
isotermal) berlaku untuk adsorpsi gas pada permukaan (misalnya, dari logam atau
arang).
Dalam menurunkan persamaan. (1.2), kita telah mengasumsikan bahwa
konsentrasi A tidak berubah sebagai ligan reseptor kompleks yang terbentuk.
Akibatnya, ligan dianggap hadir dalam kelebihan tersebut sedemikian rupa
sehingga hampir habis oleh kombinasi sebagian kecilnya dengan reseptor,
sehingga [A] dapat dianggap sebagai konstan.
Hubungan antara nominal dan [A] diprediksi oleh Persamaan. (1.2)
diilustrasikan pada Gambar 1.1. Konsentrasi A telah direncanakan menggunakan
linier (kiri) dan skala logaritmik (kanan). Nilai KA telah diambil menjadi 1 M.
Catatan dari Persamaan. (1.2) bahwa ketika [A] = KA, Par = 0.5; yaitu, setengah
dari reseptor yang ditempati.
Dengan skala logaritma, kemiringan garis awalnya meningkat. Kurva
memiliki bentuk memanjang dan S dikatakan sigmoidal. Sebaliknya, dengan
(aritmatika) skala linier untuk [A], sigmoidisitas tidak diamati, kemiringan
menurun sebagai [A] meningkat, dan kurva merupakan bagian dari hiperbola
persegi panjang.
GAMBAR 1.1 Hubungan antara tempat pengikatan yang ditempati dan
konsentrasi ligan ([A], skala linear, kiri, skala log, kanan), seperti yang
diperkirakan oleh persamaan Hill-Langmuir. KA telah diambil menjadi 1 M untuk
kedua kurva.
Persamaan (1.2) dapat diatur kembali ke:
Dengan Mengambil log, kita memiliki:
Oleh karena itu, plot log (par / (1 - Par)) terhadap log [A] harus memberikan garis
lurus dengan kemiringan satu.
Grafik seperti ini digambarkan sebagai alur Hill, lagi setelah AV Hill, yang
pertama untuk menggunakannya, dan ini sering digunakan ketika pAR diukur
langsung dengan ligan radiolabeled (lihat Bab 5). Dalam prakteknya, kemiringan
garis tidak selalu satu kesatuan atau bahkan konstan, seperti yang akan dibahas.
Hal ini disebut sebagai koefisien Hill (NH); Istilah kemiringan Hill/ Hill slope
juga digunakan.
1.2.2 Hubungan Antara Reseptor Okupansi Dan Respon Jaringan
Ini adalah yang kedua dari dua pertanyaan yang diidentifikasi pada awal
Bagian 1.2, di mana itu dicatat bahwa para ahli farmakologi yang paling awal
tidak punya pilihan selain menggunakan metode tidak langsung dalam upaya
mereka untuk menjelaskan hubungan antara konsentrasi obat dan respon jaringan
yang muncul daripadanya. Pada waktu itu dengan tidak adanya setiap sarana
untuk memperoleh bukti langsung mengenai hal ini, AV Hill dan AJ Clark
menjelajahi konsekuensi asumsi: (1) bahwa hukum aksi massa berlaku, sehingga
Pers. (1.2), yang diturunkan di atas, berlaku, dan (2) bahwa respon dari jaringan
linear terkait dengan reseptor okupansi. Clark melangkah lebih jauh dan membuat
asumsi sementara bahwa hubungan mungkin menjadi salah satu proporsionalitas
langsung (meskipun ia sangat menyadari bahwa ini adalah hampir pasti terlalu
menyederhanakan, seperti yang kita ketahui biasanya).
Harus ada proporsionalitas langsung, dan menggunakan y untuk
menunjukkan respon dari sebuah jaringan (dinyatakan sebagai persentase dari
respon maksimum dicapai dengan konsentrasi besar agonis), hubungan antara
okupansi * dan respon menjadi:
Menggabungkan ini dengan Persamaan. (1.2) memberikan ekspresi yang
memprediksi hubungan antara konsentrasi agonis dan respon dihasilkannya:
Hal ini sering diatur ulang ke:
Mengambil log,
Penerapan ungkapan ini (. Dan dengan implikasi Persamaan (1.4)) dapat
diuji dengan mengukur serangkaian respon (y) dengan konsentrasi yang berbeda
dari A dan kemudian menaruh log (y / (100 - y)) terhadap log [A] (plot Hill). Jika
Persamaan (1.4) berlaku, garis lurus dengan kemiringan 1 harus diperoleh. Juga,
adalah dasar asumsi harus benar, nilai perpotongan dari garis pada absis (yaitu,
ketika respon adalah setengah maksimal) akan memberikan perkiraan KA. AJ
Clark adalah yang pertama untuk menguji ini dengan menggunakan respon
jaringan yang terisolasi, dan Gambar 1.2 menggambarkan beberapa hasil. Gambar
1.2A menunjukkan bahwa Pers. (1.4) menyediakan nilai-nilai eksperimental yang
cukup cocok.
Juga, kemiringan Hill plot pada Gambar 1.2b yang dekat dengan penyatuan
(0.9 serambi katak, 0.8 rektus abdominis). Sementara temuan ini sesuai dengan
model sederhana yang telah digariskan, mereka tidak cukup membuktikan bahwa
itu benar. Memang, kemudian penelitian dengan serangkaian jaringan yang lebih
luas telah menunjukkan bahwa banyak hubungan respon konsentrasi- tidak dapat
dipasangkan oleh Persamaan. (1.4). Sebagai contoh, koefisien Hill adalah hampir
selalu lebih besar daripada kesatuan untuk respon dimediasi oleh saluran ion
ligand-gated (lihat Lampiran 1.2c [Bagian 1.2.4.3] dan Bab 6). Terlebih lagi,
sekarang diketahui bahwa dengan banyak jaringan respon maksimal (misalnya,
kontraksi otot polos pencernaan) dapat terjadi ketika agonis seperti asetilkolin
menempati kurang dari sepersepuluh dari reseptor yang tersedia, daripada mereka
semua seperti didalilkan dalam Pers. (1.3). Dengan cara yang sama, ketika agonis
diterapkan pada konsentrasi (biasanya disebut [A] 50 atau EC50) yang diperlukan
untuk menghasilkan respon setengah-maksimal, reseptor okupansi mungkin
sesedikit 1% di beberapa dari jaringan, * daripada 50% diharapkan jika respon
berbanding lurus dengan okupansi. Sebuah komplikasi tambahan adalah bahwa
banyak jaringan mengandung enzim (misalnya, cholinesterase) atau proses
serapan (misalnya, untuk noradrenalin) di mana agonis adalah substrat. Karena
itu, konsentrasi agonis di daerah bagian dalam dari jaringan yang terisolasi
mungkin jauh sangat kurang dari yang ada dalam larutan eksternal.
Oleh karena itu ahli farmakologi harus meninggalkan (kadang-kadang agak
enggan dan terlambat) tidak hanya usaha mereka untuk menjelaskan bentuk kurva
dosis-respons dari jaringan yang kompleks dari segi model sederhana yang
terlebih dahulu dieksplorasi oleh Clark dan dengan Hill, tetapi juga harapan
bahwa nilai konsentrasi agonis yang memberikan respon setengah-maksimal
mungkin memberikan bahkan perkiraan jumlah KA. Namun demikian, sebagai
hasil kerja Clark menunjukkan, hubungan antara konsentrasi agonis dan respon
jaringan umumnya memiliki bentuk umum yang sama ditunjukkan pada Gambar
1.1. Sehubungan dengan hal ini, kurva konsentrasi-respon sering dapat dijelaskan
secara empiris, dan setidaknya untuk pendekatan pertama, dengan ungkapan
sederhana:
Hal ini biasanya digambarkan sebagai persamaan Hill (lihat juga Lampiran
1.2c [Bagian 1.2.4.3]). Di sini, nH sekali lagi adalah koefisien Hill, dan y dan
ymax masing-masing adalah, respon yang diamati dan respon maksimum
konsentrasi besar dari agonis, A. [A] 50 adalah konsentrasi A di mana y adalah
setengah maksimal. Karena ini adalah konstan untuk hubungan konsentrasi-
respon yang diberikan, kadang-kadang dilambangkan dengan K. Sementara ini
aljabar yang lebih rapi (dan merupakan simbol yang digunakan oleh Hill), harus
diingat bahwa K dalam konteks ini tidak selalu sesuai dengan suatu konstanta
kesetimbangan. Memanfaatkan [A] 50 daripada K dalam Pers. (1.6) membantu
untuk mengingatkan kita bahwa hubungan antara
[A] dan respon di sini jadi digambarkan daripada dijelaskan dalam kerangka
model tindakan reseptor. Ini merupakan perbedaan penting.
Di mana K adalah konstanta kesetimbangan disosiasi. Oleh karena itu, plot
Bukit akan menjadi garis lurus dengan kemiringan n. Namun, model ini sangat
tidak mungkin untuk diterapkan. Kondisi ekstrim samping, beberapa contoh ada
reaksi kimia di mana tiga atau lebih molekul (misalnya, dua A dan satu R) harus
menggabungkan secara bersamaan. Penjelasan lain harus dicari. Salah satu
kemungkinan muncul ketika respon jaringan diukur secara tidak langsung, dalam
arti bahwa urutan peristiwa seluler link reseptor aktivasi respon yang akhirnya
diamati. Koefisien Bukit tidak mungkin kemudian menjadi kesatuan (atau bahkan)
konstan karena hubungan nonlinier dan variabel antara proporsi reseptor
diaktifkan dan satu atau lebih peristiwa yang mengikuti. Bahkan ketika itu adalah
mungkin untuk mengamati aktivasi reseptor secara langsung, koefisien Bukit
mungkin masih ditemukan tidak menjadi kesatuan. Hal ini telah dipelajari secara
rinci untuk saluran ion ligand-gated seperti reseptor nikotinat untuk
asetilkolin. Berikut aktivitas reseptor individu dapat diikuti karena terjadi dengan
mengukur arus kecil arus listrik melalui saluran ion intrinsik reseptor (lihat
Bagian 1.4.3 dan Bab 6). Pada menentukan hubungan antara respon ini dan
konsentrasi agonis, koefisien Hill diamati lebih besar dari kesatuan (khas 1,3-2)
dan berubah dengan konsentrasi agonis. Penjelasannya dapat ditemukan dalam
struktur kelas ini reseptor. Setiap makromolekul reseptor terdiri dari beberapa
(seringkali lima) subunit, yang kedua membawa situs mengikat untuk
agonis. Kedua situs tersebut harus ditempati untuk reseptor untuk menjadi aktif,
setidaknya dalam mode normal. Skema ini diperkenalkan dalam Bagian 1.2.3
kemudian harus dijabarkan:
Misalkan dua situs yang identik (terlalu menyederhanakan) dan bahwa pengikatan
pertama molekul agonis tidak mempengaruhi afinitas dari situs yang masih
kosong. Disosiasi konstan untuk setiap situs ekuilibrium dinotasikan
dengan K A dan konstanta kesetimbangan untuk isomer- isasi antara A 2 R dan
A 2 R * oleh E, sehingga [A 2 R *] = E [A 2 R]. Proporsi reseptor dalam keadaan
aktif (A 2 R *) kemudian diberikan oleh:
Ini memprediksi Bukit petak nonlinier. Kemiringan akan berbeda dengan [A]
sesuai dengan:
Ketika [A] kecil dalam kaitannya dengan K A, n H mendekati 2. Namun,
seperti [A] meningkat, n H cenderung menuju persatuan. Pada skema yang sama,
jumlah A yang terikat (dinyatakan sebagai fraksi, p terikat, dari maksimum
mengikat bila [A] sangat besar, sehingga semua situs yang diduduki) diberikan
oleh:
Alur Hill untuk berikatan akan nonlinear dengan koefisien hill yang didapatkan
dari:
Ini mendekati gabungan jika [ A] sangat besar maupun sangat kecil. Di
antaranya, nH mungkin bisa sebanyak 2 untuk nilai-nilai E yang sangat besar.
Sangat penting bahwa ini harus demikian meskipun nilai afinitas untuk langkah
pengikatan pertama dan kedua diasumsikan memiliki nilai yang sama, jika hanya
terdapat beberapa isomerasi dari reseptor untuk menjadi bentuk aktif. ini di
karenakan proses isomerasi meningkatkan jumlah total pengikatan dengan
memindahkan equilibria dalam Pers. (1.9) menuju sebelah kanan Ŕ ini adalah arah
bentuk terikat dari reseptor.
Sekarang kami mempertimbangkan apa yang akan terjadi jika pengikatan
molekul agonis pertama mengubah afinitas dari tempat kedua yang teridentifikasi.
disosiasi equilibrium konstan untuk pengikatan pertama dan kedua akan ditandai
oleh KA(1) and KA(2), berturut-turut, dan E digambarkan sebagaimana
sebelumnya.
Proporsi dari reseptor dan bentuk aktif (A2R*) kemudian didapatkan dari:
dan koefisien hill nH akan menjadi :
Hubungan tersebut akan dijelaskan lebih jauh pada Chapter 6 (lihat Pers. (6.4) dan
(6.5)).
Menggunakan skema yang sama, nilai dari A terikat didapatkan dari:
Alur Hill sekali lagi akan nonlinear dengan koefisien hill yang didapatkan dari:
Ini mendekati gabungan jika [ A] sangat besar maupun sangat kecil. Di
antaranya, nH mungkin lebih besar (diatas 2) atau kurang dari 1, tergantung pada
magnitude dan E dan pada nilai relative dari KA(1) dan KA(2). Jika, untuk
sederhana, kita atur E hingga 0 dan jika KA(2) < KA(1), maka nH > 1, dan
terdapat juga pendapat yang mengatakan bahwa akan jadi cooperativas positif.
cooperativas negative akan terjadi jika KA(2) > KA(1) dan nH akan < 1. Hal ini
akan dijelaskan lebih dalam pada Chapter 5 dimana alur dari Pers. (1.14) dan
(1.15) ditunjukkan (Gambar 5.3) untuk range yang lebih luas dari rasio KA(1) to
KA(2), dan dengan E menjadi 0.
1.2.4.4 Appendix 1.2D: Logits, Persamaan Logistic, dan hubungannya
dengan alur Hill dan Persamaannya
Transformasi logit dari variable p didefenisikan sevagai berikut:
Berdasarkan persamaan diatas, dapat dilihat bahwa alur Hill merupakan alur
dari logit (p) berlawanan dari konsentrasi logaritma. (meskipun demikian alur Hill
lebih sering menggunakan logs dasar 10 dari pada dasar e).
Sebagai catatan penting, pembedaan antara Hill persamaan dan persamaan
logistic, yang mana merupakan formula pertama di abad 19, sebagai maksud dari
penjelasan meningkatnya populasi dari waktu ke waktu. didefenisikan dengan
persamaan:
Disederhanakan menjadi:
maka,
jika kita menggambarkan kembali a sebagai Ŕloge K, dan x sebagai loge z, maka
dimana hal diatas merupakan bentuk dari persamaan Hill (lihat Pers. (1.8a)).
bagaimana juga, sebagai catatan bahwa Pers. (1.17) akan diperoleh dari dari
Pers.(1.16) hanya dengan mentransformasikan sati variable. hal ini juga
menjelaskan bahwa term persamaan logistic (atau kurva) dan Persamaan Hill
tidak boleh dianggap dapat ditukarkan. Untuk menjelaskan perbedaan, jika
variable bebas dari setiap persamaan di set ke angka nol, variable bebas akan
menjadi 1/(1 + e–a) pada Pers. (1.16) sebagai perbandingan dengan nol pada Pers.
(1.17).
1.3 KURUN WAKTU PERUBAHAN PADA PEMILIKAN RESEPTOR
1.3.1 Pendahuluan
Pada awalnya, pendekatan yang paling sedehana untuk menentukan
seberapa cepat suatu obat berikatan dengan reseptornya dijadikan patokan untuk
mengukur seberapa tingkat dimana obat itu bekerja pada jaringan yang telah
terisolasi, tapi kemuadian muncul dua permasalahan. yang pertama adalah
hubungan yang pasti antara efek pada jaringan dan proporsi dari reseptor yang
berikatan dengan obat yang tidak dapat dengan mudah diperkirakan, sebagaimana
seperti yang terlihat. Setengah dari jaringan hanya akan merespon sebagian dari
pengikatan pada reseptor. Kita dapat mengambil sebuah contoh aksi dari agen
tubocurarine penghambat neuromuscular pada kontraksi yang merupakan hasil
dari stimulasi pada suplai saraf motor untukotot skeletal in vitro. Saraf Phrenic
tikus yang biasa diguanakan sebagai percobaan. Hal ini karena transisi
neuromuscular normalnya memiliki batas margin aman yang besar, respon
berlawanan pada stimulasi saraf akan mulai rusak hanya jika tubocurarine
berikatan pada lebih dari rata-rata 80% dari area pengikatan pada nicotinic
asetilkolin pada otot superficial jaringan otot. Jadi, ketika kedua jaringan otot
sebagiannya rusak itu merupakan amplitude inisial, pengikatan pada reseptor oleh
tubocurarine pada permukaan serat adalah lebih besar dari 50%.
Masalah kedua yaitu tingkat dimana suatu ligand bekerja pada jaringan
terisolasi yang ditentukan oleh difusi molekul ligan melalui jaringan daripada
ikatannya pada reseptor. Sekali lagi sebagai contoh pada aksi dari tubocurarine
pada diaphragm terisolasi, perkembangan yang lambat dari reflex penghambat
tidak setingkat dengan pengikatan reseptor tetapi lebih buruk dari transmisi
neuromuscular dalam sebuah peningkatan angka serat otot individual sebagai
lambatnya tubocurarine berdifusi diantara paket serat ke dalam persiapan interior.
Lebih dari itu, sebagai sebuah molekul ligan individual yang melewati jauh
kedalam jaringan, itu mungkin saja terikat atau tidak sementara waktu (dan untuk
periode tertentu) untuk area yang bevariasi (termasuk reseptor). Pengikatan yang
berulang ini dan disosiasinya dapat berlangsung lambat dalam masuk dan keluar
dari jaringan. untuk alas an tersebut, besaran kinetic kini sering digunkan dengan
sel terisolasi (e.g., neuron bebas atau serat otot) atau meskipun sebuah patch dari
preparasi membran sel dan menguji secara langsung tingkat dimana suatu
kecocokan radioligan dapat berikatan, atau bentuk disosiasi, reseptor yang dibawa
oleh membrane. Tugas kami selanjutnya adalah mempertimbangkan apa kinetic
pengikatan yang dapat diharapkan pada kondisi tersebut.
1.3.2 PENINGKATAN PADA PENGIKATAN RESEPTOR
Pada diskusi sebelumnya, kita membahas model sederhana untuk kombinasi
dari sebuah ligan dengan area pengikatannya yang telah dijelaskan pada subbab
1.2.1 (Pers. (1.1)). berdasarkan perkiraan sebelumnya bahwa hukum penerapan
massa, pada tingkat dimana pengikatan reseptor (pAR) berdasarkan waktu
didapatkan persamaan dari:
Dengan kata lain, pada tahap ini tingkat dari perubahan pengikatan
sederhananya berbeda dengan tingkat dimana kompleks ligand-reseptor berubah
dan pada tingkat ini akan jatuh. Pada halaman sebelumnya, Pers. (1.18) terlihat
rumit untuk diselesaikan Karena terdapat tidak kurang dari 4 variabel.: pAR, t,
[A], dan pR. Bagaimanapun, kita tahu bahwa pR = (1 Ŕ pAR). Juga, kita
beramsumsi, sebagaimana seperti sebelumnya, bahwa [A] konstan; karena itu,
banyak A yang muncul dalam hubungan dengan angka dari area pengikatan yang
beberapa kombinasinya dengan area itu akan tidak mengunrangi konsentrasi
keseluruhannya. Oleh karena itu, hanya pAR adan t yang tersisa sebagai variable,
dan persamaan akan lebih mudah untuk digunakan.
Substitusi untuk pR,:
bentuk berurutnya,
Persamaan ini masih terlihat rumit, jadi kita akan menurunkan pangkat dari
pAR dan membuat substitusi selanjutnya konstan dalam persamaan.
maka,
Persamaan ini dapat disusun menjadi bentuk integral sederhana untuk
menentukan bagaimana pengikatan berubah berdasarkan waktu:
Integrasi,
Kini kita dapat memperkirakan bagaimana cepatnya pengikatan terjadi
setelah aplikasi pertama ligan, pada waktu 0 (t1 = 0). Pengikatan reseptor diawali
0, sehingga p1 adalah 0. setelah itu, pengikatan meningkat secara cepat dan akan
ditandai pAR(t) pada waktu t:
Maka,
mengganti a dan b dengan bentuk aslinya, sehingga:
dengan memasukkan k–1/k+1 = KA, kita dapatkan persamaan:
GAMBAR 1.3 Perkiraan waktu dari naiknya pengikatan reseptor berdasarkan
aplikasi dari ligand tampak pada tiga konsentrasi. Kurva terlihat menunjukkan
Pers. (1.22), dengan nilai 2. 106 M–1secŔ1 for k+1 and of 1 secŔ1 for k–1.
Ketika t sangat besar, ligand dan area pengikatannya akan menuju titik
equilibrium. Bentuk dalam kurung besar kemudian akan menjadi gabungan
(karena e–∞= 0) sehinnga,
Kemudian kita dapat menulis:
Ini merupakan hasil yang dibutuhkan. hal ini telah di gambarkan pada
Gambar 1.3 untuk tiga konsentrasi dai A. perlu dicatat bagaimana tingkat
pendekatan ke titik equilibrium meningkatkan [A] menjadi lebih besar. hal ini
dikarenakan kurun waktu ditentukan oleh (k–1 + k+1[A]). Kuantitas ini seringkali
digantikan oleh single konstan, karena itu Pers. (1.22) dan juga dituliskan sebagai
berikut:
atau
dimana
dimana (tau) merupakan waktu konstan dan memiliki unit waktu; time constant
and has the unit of time; (lambda) adalah nilai konstan, yang mana kadangkala
dituliskan sebagai kon (seperti pada Chapter 5) dan memiliki unit dari time–1.
GAMBAR 1.4 Perkiraan waktu dari penurunan pada aktivitas area pengikatan.
Garis kurva telah diramalkan Pers. (1.26), dengan kŔ1 menjadi 1 secŔ1 dan
pAR(0) menjadi 0.8. Skala linear untul r pAR(t) telah digunakan pada sisi kiri
dan logaritma pada sisi kanan.
1.3.3 PENURUNAN OKUPANSI RESEPTOR
Pada pembahasan sebelumnya, kita memiliki asumsi bahwa pengikatan
tidak berlangsung ketika ligan lebih dulu aktif. Itu merupakan langkah kedepan
untuk meluaskan derivasi untuk meprediksi bagaimana pengikatan akan berubah
seiring waktu meskipun jika hal itu tidak betul nol. kita mengubah batas dari
integrasi menjadi:
pAR(0) merupakan okupansi pada waktu 0, dan bentuk lainnya telah terlebih
dahulu dijelaskan. Persisnya langkah sama seperti yang sebelumnya kemudian
berdasarkan hasil tersebut untuk mengganti Pers. (1.22)
Kita dapat menggunakannya untuk menguji apa yang akan terjadi jika
ligand secara cepat dihilangkan. Hal ini seimbang untuk setting [A] ke angka nol,
pada waktu nol, dan p(∞) juga akan bernilai nol karena, keseluruhan kompleks
reseptor ligand akan terdisosiasi. Pers. (1.25) kemudian menjadi:
Hasil tersebut telah dijelaskan pada Gambar 1.4.
Waktu konstan, | , untuk kemunduran okupansi merupakan timbal balik
sederhana dari k–1. Hal yang berpengaruh adalah waktu paruh (t1/2). Ini adalah
saat dimana waktu dibutuhkan untuk quantitas (dalam contoh ini pAR(t)) untuk
mencapai setengahnya diantara nilai awal dan akhir dan didapatkan:
Sebagai contoh yang digambarkan pada Gambar 1.4 1.4, t1/2 = 0.693 sec.
Harap dicatat dan t1/2 memiliki unit waktu, sebagai perbandingan dengan timeŔ
1 untuk k–1.
Telah diasumsikan sebelumnya pada halaman pendahuluan bahwa terdapat
banyak area pengikatan yang memiliki rata-rata angka pengikatan yang akan
meningkat atau secara perlahan menurun seiring perubahan konsentrasi ligand;
aktivitas pada area bebas belum dipertimbangkan. Ketika ligand dihilangkan,
periode dimana sebuah area pengikatan bebas akan tetap berikatan, tentunya,
bertukar dari tempat ke tempat lain, sama halnya yang terjadi sepanjang waktu
dari atom bebae pada sampel yang diujikan melalui pembusukan radioaktif. Hal
tersebut dapat menunjukkan bahwa median waktu hidup dari okupansi dari area
bebas didapatkan dari 0.693/k–1. yang berarti waktu hidup adalah 1/k–1.
Pengenalan dari metode rekaman single-channel telah membuat hal ini mungkin
terjadi untuk memperoleh bukti langsung mengenai durasi okupansi reseptor (lihat
Chapter 6).
1.4 AGONIS PARSIAL
1.4.1 PENGENALAN DAN KONSEP AWAL
Pengembangan dari obat-obat baru pada dasarnya memerlukan bahan
sintesis dalam jumlah besar terkait struktur penyusunnya. Jika sebuah set agonis
dari bentuk ini diujkan pada jaringan tertentu, penyusunnya terkadang ditemukan
terbagi dalam dua kategori. Beberapa dapat menimbulkan respon maksimal pada
jaringan dan digambarkan sebagai full agonists dalam percobaan tersebut.
Ketegori lainnya yang tidak dapat menimbulkan respon maksimal, meskipun
memiliki konsentrasi yang tinggi, disebut dengan partial agonists. Contohnya
termasuk:
GAMBAR 1.5 menunjukkan kurva respon konsentrasi yang dibandingkan aksi
dari -adrenoceptor agonis parsial prenalterol dengan isoprenalin agonis penuh
pada range dari jaringan dan respon. Pada setiap kejadian, respon maksimal
menuju prenalterol lebih kecil, medkipun besar dari perbedaan sangat bervariasi.
Hal tersebut dapat diasumsikan bahwa agonis parsial tidak cocok dengan
respon dari agonis penuh karena agonis parsial gagal dalam berikatan dengan
semua reseptor. Hal ini dapat dengan mudah dijelaskan dengan menguji efek dari
kenaikan konsentrasi dari agonis parsial terhadap respon pada jaringan untuk
memperbaiki konsentrasi dari agonis penuh. Gambar 1.6 (kanan, diatas kurva)
menggambarkan percobaan untuk dua aksi agonis pada H2 Reseptor. Ketika
konsentrasi agonis parsial meningkat, respon dari jaringan akan menurun dari
angka terbesar yang dapat dilihat dari agonis penuh itu sendiri dan dan secara
cepat mencapai maksimal respon menuju agonis parsial. Implikasi dari hal
tersebut agonis parsial akan mampu bergabung dengan semua reseptor, dengan
ketentuan konsentrasi tinggi dibutuhkan, tetapi efek pada jaringan lebih sedikit
dari apa yang akan terlihat pada agonis penuh. Agonis parsial dalam beberapa hal
lebih kurang mampu untuk menimbulkan respon.
Pada percobaan dari Gambar 1.7 merujuk pada kesimpulan yang sama.
Ketika konsentrasi histamin sangat rendah dari konsentrasi relative terbesar dari
impromidin, keseluruhan respon akan dimiliki oleh impromidin. Bagaimanapun,
kurva respon konsentrasi pada konsentrasi histamin akan meningkat. Ini
dikarenakan adanya imopomidine yang mengurangi okupansi reseptor histamine
(pada semua konsentrasi) dan begitu pula sebaliknya. Ketika garis kurva tumpang
tindih, efek dari penurunan okupansi impromidin oleh histamine secara pasti
diluar jangkauan kontribusi dari okupansi reseptor histamine. Diluar hal tersebut,
rendahnya impromidin akan memberikan respon terhadap konsentrasi histamine.
Sekali lagi, implikasinya adalah bahwa agonis parsial dan bergabung dengan
keseluruhan reseptor tetapi lebih kurang mampu untuk menghasilkan respon.
Pendekatan klasik untuk mempelajari interaksi obat-reseptor
GAMBAR 1.5 Perbandingan hubungan log konsentrasi-respon untuk β-
adrenoreseptor-dimediasi tindakan pada enam jaringan penuh dan agonis parsial
(isoprenalin [lingkaran tertutup] dan prenalterol [lingkaran terbuka], masing-
masing). Ordinat menunjukkan respon sebagai fraksi dari respon maksimal untuk
isoprenalin. (Dari Kenakin, T. P. dan Beek, D., J. Pharmacol. Exp. Ther., 213,
406-413, 1980.)
GAMBAR 1.6 Interaksi antara agonis histamin penuh dan H2-reseptor agonis
parsial impromidine pada strip ventrikel terisolasi dari miokardium manusia.
Kurva konsentrasi-respon di sebelah kiri menunjukkan histamin saja, dan yang di
sebelah kanan menunjukkan respon terhadap impromidine yang bertindak dengan
sendirinya (terbuka kuadrat) atau di hadapan konsentrasi konstan (100 µM)
histamin (berlian terbuka). (Dari Inggris, T. A. et al., Br. J. Pharmacol., 89, 335-
340, 1986.)
GAMBAR 1.7 Kurva log konsentrasi-respon untuk histamin diterapkan sendiri
(lingkaran terbuka) atau dihadapan (kotak terbuka) dari konsentrasi konstan dari
agonis parsial impromidine (10 µM). kondisi jaringan dan eksperimental seperti
pada gambar 1.6. (Dari Inggris, T. A. H. et al., Br. J. Pharmacol., 89, 335Ŕ340,
1986.)
1.4.2 Mengungkapkan Tanggapan Maksimal Terhadap Agonis Parsial :
Kegiatan Intrinsik dan Efikasi.
Pada tahun 1954 farmakolog Belanda EJ ARIENS memperkenalkan
aktivitas intrinsik panjang, yang sekarang biasanya didefinisikan sebagai:
Untuk agonis penuh, aktivitas intrinsik (sering dilambangkan dengan α)
adalah kesatuan, menurut definisi, dibandingkan dengan nol untuk antagonis
kompetitif. Agonis parsial ini memiliki nilai antara batasan tersebut. Perhatikan
bahwa, definisi sepenuhnya deskriptif, tidak ada yang dianggap sebagai
mekanisme. Selain itu, intrinsik tidak boleh diartikan bahwa agonis yang
diberikan memiliki aktivitas karakteristik, terlepas dari keadaan eksperimental.
Sebaliknya, kegiatan intrinsik dari agonis parsial seperti prenalterol dapat sangat
bervariasi tidak hanya antar jaringan, seperti Gambar 1.5, tetapi juga dalam suatu
jaringan tertentu, tergantung pada kondisi eksperimental (lihat nanti diskusi).
Sebenarnya, senyawa yang sama dapat menjadi agonis penuh dengan satu
jaringan dan agonis parsial dengan yang lain. Untuk alasan ini, istilah efek agonis
maksimal mungkin lebih baik untuk kegiatan intrinsik.
Demikian pula, temuan bahwa sepasang agonis masing-masing bisa
mendapatkan respon maksimal dari sebuah jaringan (yaitu, mereka mempunyai
kegitan intrinsic yang sama, persatuan)tidak seharusnya dianggap untuk
meyiratkan bahwa mereka sama-sama mengaktifkan reseptor. Misalkan, jaringan
memiliki banyak reseptor cadang (lihat Bagian 1.6.3). Salah satu agonis mungkin
harus menempati 5% dari reseptor untuk menghasilkan respon maksimal,
sedangkan yang lain mungkin hanya membutuhkan 1% hunian. Terbukti, agonis
kedua lebih efektif, meskipun keduanya menjadi agonis penuh. Sebuah ukuran
yang lebih halus dari kemampuan agonis untuk mengaktifkan reseptor jelas
diperlukan, dan satu diberikan oleh RP Stephenson, yang menyarankan bahwa
aktivasi reseptor menghasilkan "stimulus" atau "sinyal" (S) yang dikomunikasikan
ke sel, dan bahwa besarnya stimulus ini ditentukan oleh produk dari apa yang
disebut efikasi (e) dari agonis dan proporsi, p, dari reseptor yang menempati. *
S = ep
Perbedaan yang penting dari konsep ARIENS tentang kegiatan intrinsik
adalah bahwa keberhasilan, tidak seperti kegiatan intrinsik, tidak memiliki batas
atas, selalu ada kemungkinan bahwa sebuah agonis dengan keberhasilan yang
lebih besar daripada senyawa yang mungkin ditemukan. Selain itu, usulan
Stephenson itu tidak terkait dengan asumsi spesifik tentang hubungan antara
reseptor hunian dan respon dari jaringan. (ARIENS, seperti AJ Clark, awalnya
memperkirakan proporsionalitas langsung, asumsi kemudian ditinggalkan.)
Menurut Stephenson,
Di sini, y adalah respon dari jaringan, dan eA adalah efektivitas agonis A. f
(SA) berarti hanya "beberapa fungsi SA" (yaitu, y tergantung pada SA dalam
beberapa cara yang belum ditentukan). Perhatikan bahwa, sesuai dengan
pemikiran pada saat itu, Stephenson menggunakan persamaan Bukit-Langmuir
untuk menghubungkan konsentrasi agonis, [A], untuk reseptor hunian, PAR.
Asumsi yang paling penting ini adalah mempertimbangkan kembali dalam bagian
berikutnya.
Untuk dapat membandingkan khasiat agonis yang berbeda yang bekerja
melalui reseptor yang sama, Stephenson mengusulkan konvensi bahwa stimulus S
adalah kesatuan untuk respon yaitu 50% dari maksimum yang dicapai dengan
agonis penuh. Ini sama dengan mendalilkan bahwa agonis parsial harus
menempati semua reseptor untuk menghasilkan respon setengah-maksimal yang
memiliki khasiat persatuan. Kita bisa melihat ini dari Persamaan. (1,27), jika
agonis parsial hipotetis kami harus menempati semua reseptor (yaitu, p = 1) untuk
menghasilkan respon setengah-maksimal, di mana titik S juga adalah kesatuan
(oleh konvensi Stephenson), maka e juga harus 1.
R.F Furchgott kemudian menyarankan penyempurnaan konsep Stephenson.
Menyadari bahwa respon dari sebuah jaringan untuk agonis dipengaruhi oleh
jumlah reseptor dan juga oleh kemampuan agonis untuk mengaktifkan mereka, ia
menulis:
Di sini, [R]T adalah total "konsentrasi" reseptor, dan ε (epsilon) adalah
efikasi intrinsik (jangan keliru dengan aktivitas intrinsik); ε dapat dianggap
sebagai ukuran kontribusi reseptor individu terhadap keseluruhan khasiat.
Kemanjuran agonis tertentu, seperti yang didefinisikan oleh Stephenson,
dapat bervariasi antara jaringan yang berbeda dengan cara yang sama seperti
kegiatan intrinsik, dan untuk alasan yang sama. Selain itu, nilai dari kedua
kegiatan intrinsik dan kemanjuran dari agonis dalam suatu jaringan tertentu akan
bergantung pada eksperimental.
* Tidak ada perbedaan yang dibuat di sini antara reseptor yang diduduki dan
diaktifkan. Hal ini adalah kunci penting, sebagaimana telah dicatat dalam Bagian
1.2.3, dan dibahas lebih lanjut di halaman berikut.
GAMBAR 1.8 Pengaruh carbachol di dua konsentrasi, 1 M (segitiga) dan 10
M (kotak), pada relaksasi otot polos trakea disebabkan oleh agonis parsial,
prenalterol, dan oleh agonis penuh, isoprenalin. Tanggapan diplot sebagai
sebagian kecil dari maksimum isoprenalin. (Dari Kenakin, T. P. dan Beek, D., J.
Pharmacol. Exp. Ther., 213, 406-413, 1980.)
Kondisi, seperti digambarkan pada Gambar 1.8. Relaksasi otot trakea dalam
menanggapi -adrenoceptor agonis isoprenalin dan prenalterol diukur pertama
dalam ketiadaan (lingkaran) dan kemudian di kehadiran (segitiga, bujur sangkar)
dari agonis muscarinic, carbachol, yang menyebabkan kontraksi dan sebagainya
cenderung untuk menentang -adrenoreseptor-dimediasi relaksasi. Oleh karena
itu, konsentrasi yang lebih besar dari -agonis dibutuhkan, dan kurva bergeser ke
kanan. Dengan isoprenalin, respon maksimal masih bisa diperoleh, meskipun
kehadiran carbachol pada konsentrasi baik. Pola ini sangat berbeda dengan
prenalterol. Ketidakmampuannya untuk menghasilkan relaksasi lengkap semakin
jelas di hadapan dari carbachol pada 1 M. Memang, bila diberikan dengan 10
M carbachol, prenalterol menyebabkan sedikit atau ada relaksasi, aktivitas
intrinsik dan efikasi (dalam penggunaan Stephenson) telah menjadi diabaikan.
Dengan cara yang sama, mengurangi jumlah reseptor yang tersedia
(misalnya, dengan menerapkan alkylating agen; lihat Bagian 1.6.1) akan selalu
mengurangi respon maksimal untuk agonis parsial. Sebaliknya, log kurva
konsentrasi-respon untuk agonis penuh pertama mungkin bergeser ke kanan, dan
respon maksimal akan menjadi lebih kecil hanya bila tidak ada reseptor cadang
yang tersedia untuk itu agonis (lihat Bagian 1.6.3). Sebaliknya, meningkatkan
jumlah reseptor (misalnya, dengan upregulation atau dengan sengaja overekspresi
gen yang mengkode reseptor) akan menyebabkan respon maksimal ke agonis
parsial untuk menjadi lebih besar, sedangkan log kurva konsentrasi-respon untuk
penuh agonis akan bergerak ke kiri.
1.4.3 INTERPRETASI AGONISM PARSIAL DALAM RANGKA ACARA
PADA INDIVIDU RESEPTOR
Konsep aktivitas intrinsik dan kemanjuran saja dijelaskan adalah murni
deskriptif, tanpa mengacu mekanisme. Kita sekarang beralih ke bagaimana
perbedaan dalam keberhasilan dapat dijelaskan dalam hal peristiwa molekuler
yang mendasari aktivasi reseptor, dan kita mulai dengan mempertimbangkan
beberapa bukti eksperimental yang telah memberikan bukti langsung sangat sifat
peristiwa ini.
Hanya setahun setelah kertas klasik Stephenson tahun 1956, J. del Castillo
dan B. Katz menerbitkan sebuah studi elektrofisiologi dari interaksi yang terjadi
ketika pasang agonis dengan terkait struktur yang diterapkan secara bersamaan
pada reseptor nicotinic di wilayah endplate skeletal otot. Temuan mereka bisa
menjadi yang terbaik dijelaskan dengan model untuk aktivasi reseptor yang
memiliki sudah diperkenalkan secara singkat dalam Bagian 1.2.3 (lihat (1.7)
khususnya Pers.). Dalam skema ini, reseptor diduduki dapat isomerize antara aktif
dan keadaan tidak aktif. Hal ini sangat berbeda dari model klasik Hill, Clark, dan
Gaddum di mana tidak ada perbedaan yang jelas dibuat antara pendudukan dan
aktivasi reseptor oleh agonis.
GAMBAR 1.9 Rekaman arus listrik menit (defleksi ke bawah) yang mengalir
melalui tunggal ligandgated saluran ion di wilayah junctional otot rangka katak.
Arus timbul dari transisi singkat reseptor nicotinic individual ke (saluran terbuka)
negara aktif dalam menanggapi adanya berbagai agonis (Ach = asetilkolin, SubCh
= suberyldicholine, DecCh = ester dicholine dari decan-1, 10 - asam dikarboksilat;
CCH = carbamylcholine). (Dari Colquhoun, D. dan Sakmann, B., J. Physiol., 369,
501-557, 1985. Dengan izin.)
Bukti langsung untuk tindakan ini adalah datang dari pengantar oleh E.
Neher dan B. Sakmann pada tahun 1976 dari single-channel teknik perekaman,
yang memungkinkan arus listrik menit melewati saluran ion intrinsik untuk
reseptor nicotinic, dan lainnya ion ligand-gated saluran, yang akan diukur secara
langsung dan ketika mereka terjadi. Untuk pertama kalinya menjadi mungkin
untuk mempelajari aktivitas reseptor individu dalam situ (lihat juga Bab 6). Ini
dengan cepat menunjukkan bahwa untuk berbagai agonis nicotinic, arus ini
memiliki amplitudo yang sama persis. Ini diilustrasikan selama empat agonis
seperti pada Gambar 1.9. Apa yang berbeda di antara agonis adalah sebagian kecil
dari waktu yang saat ini mengalir (yaitu, dimana saluran terbuka). Ini hanya apa
yang akan diharapkan dari skema Castillo-Katz del jika keadaan aktif (AR *) dari
reseptor diduduki adalah sama (dalam hal aliran ion melalui saluran terbuka)
untuk agonis yang berbeda. Namun, dengan agonis parsial yang lemah, reseptor
ini di negara * AR hanya sebagian kecil dari waktu, bahkan jika semua situs
mengikat ditempati.
Pertanyaan berikutnya yang perlu dipertimbangkan adalah interpretasi
keberhasilan (baik dalam arti tertentu diperkenalkan oleh Stephenson dan dalam
istilah yang lebih umum) dalam konteks model yang diusulkan oleh delCastillo
dan Katz.
1.4.4 THE DEL CASTILLO-KATZ MEKANISME: 1. HUBUNGAN
ANTARA AGONIS KONSENTRASI DAN FRAKSI RESEPTOR DALAM
BENTUK AKTIF
Tugas pertama kami adalah untuk menerapkan hukum aksi massa untuk
memperoleh hubungan antara konsentrasi agonis dan proporsi reseptor yang
berada dalam bentuk aktif pada kesetimbangan. Proporsi ini akan dilambangkan
dengan Par *.
Seperti dalam semua derivasi dalam bab ini, yang satu ini hanya
memerlukan tiga langkah. Yang pertama adalah untuk menerapkan hukum aksi
massa untuk setiap kesetimbangan yang ada. Yang kedua adalah untuk menulis
sebuah persamaan yang mengungkapkan fakta bahwa fraksi reseptor di setiap
kondisi yang dapat dibedakan harus menambahkan hingga 1 ("aturan
konservasi"). The del Castillo Skema-Katz dalam bentuk yang paling sederhana
(lihat Persamaan. (1,7) dalam Bagian 1.2.3) memiliki tiga kondisi seperti: R
(kosong dan tidak aktif), AR (tidak aktif, meskipun A adalah terikat), dan AR *
(terikat dan aktif). Fraksi yang sesuai reseptor dalam kondisi ini * adalah pR, Par,
dan Par *.
Menerapkan hukum aksi massa untuk masing-masing dua kesetimbangan
memberikan:
di mana KA dan E adalah konstanta kesetimbangan ditunjukkan dalam Pers.
(1,7).
Juga,
Kami sekarang dapat mengambil langkah ketiga dan terakhir. Apa yang kita
ingin tahu adalah Par *, jadi kita gunakan Pers. (1.29) dan (1,30) untuk
menggantikan pR dan nominal dalam Pers.
(1.31), memperoleh:
Ini adalah ekspresi kita butuhkan. Meskipun memiliki bentuk umum yang sama
seperti Bukit-Langmuir persamaan, dua perbedaan penting yang harus
diperhatikan:
1. Sebagai [A] meningkat, Par * cenderung tidak persatuan tetapi untuk
* Istilah "negara" daripada "kondisi" sering digunakan dalam konteks ini.
Namun, yang terakhir tampaknya lebih baik dalam pengantar akun. Hal ini karena
mekanisme Castillo-Katz del sering digambarkan sebagai "dua negara" model
tindakan reseptor, berarti di sini bahwa reseptor diduduki ada di dua yang berbeda
(meskipun menukar) bentuk, AR dan AR *, sedangkan tiga kondisi reseptor (R,
AR, dan AR *) harus diidentifikasi ketika menerapkan hukum aksi massa untuk
pengikatan ligan, A.
GAMBAR 1.10 Hubungan antara Par * dan [A] diprediksi oleh Persamaan. (1.32)
untuk berbagai nilai E (diberikan dengan tiap baris). Perhatikan bahwa sebagai E
naik di atas 10, kurva bergerak ke kiri meskipun nilai KA, yang kesetimbangan
disosiasi konstan untuk kombinasi awal A dengan situs mengikat, adalah 200
M untuk setiap kurva.
Dengan demikian, nilai E akan menentukan respon maksimal untuk A.
Hanya jika E adalah sangat besar dalam hubungannya dengan satu akan hampir
semua reseptor diaktifkan, seperti digambarkan pada Gambar 1.10, yang plot
Persamaan. (1.32) untuk berbagai nilai E.
2. Persamaan (1.32) memberikan proporsi reseptor aktif (PAR *), daripada
diduduki
reseptor (pocc = Par Par + *). Untuk mendapatkan hunian, kita dapat
menggunakan Persamaan. (1.30) untuk mengekspresikan
Par dalam hal Par *:
Hal ini dapat ditulis sebagai:
mana Keff, efektif kesetimbangan disosiasi konstan, didefinisikan sebagai:
Karena Keff berlaku untuk skema yang melibatkan lebih dari satu ekuilibrium
(lihat Persamaan. (1,7)), ini disebut sebagai konstanta kesetimbangan
makroskopik, untuk membedakannya dari mikroskopis kesetimbangan konstanta
KA dan E, yang menggambarkan kesetimbangan individu.
Hasil ini menunjukkan bahwa jika hubungan antara konsentrasi agonis dan
proporsi reseptor yang menempati diukur secara langsung (misalnya,
menggunakan radioligand mengikat Metode), hasilnya harus menjadi kurva
hiperbolik sederhana. Meskipun kurva describable oleh persamaan Bukit-
Langmuir, yang konstan untuk mengikat kesetimbangan disosiasi akan tidak KA
tapi Keff, yang ditentukan oleh kedua E dan KA.
1.4.5 THE DEL CASTILLO-KATZ MEKANISME: 2. INTERPRETASI
KEBERHASILAN UNTUK SALURAN ION LIGAND-GATED
Secara umum, mudah untuk melihat bahwa nilai konstanta E kesetimbangan
dalam Pers. (1.7) akan menentukan apakah ligan adalah agonis penuh, agonis
parsial, atau antagonis. Kami pertama kali ingat Konsep Stephenson bahwa respon
dari jaringan untuk agonis ditentukan oleh produk, S, dari efektivitas agonis dan
proporsi reseptor diduduki (lihat Persamaan. (1,27)). Untuk menghubungkan ini
dengan skema Castillo-Katz del, kita menulis ulang Persamaan. (1.33) untuk
menunjukkan hubungan antara proporsi reseptor aktif, Par * (yang menentukan
respon jaringan) dan total reseptor hunian:
PAR* = Pocc (1.37)
Dari sini kita bisa melihat bahwa istilah E / (1 + E) adalah setara, dalam arti
formal setidaknya, Khasiat Stephenson. Jika agonis diterapkan pada konsentrasi
yang sangat tinggi, sehingga semua reseptor yang diduduki, proporsi dalam
keadaan aktif E/ (1 + E). Jika agonis ini juga sangat efektif (Yaitu, jika E adalah
>> 1), proporsi reseptor aktif menjadi dekat dengan kesatuan, batas atas.
Pertimbangkan berikutnya agonis parsial hipotesis bahwa, bahkan ketika
menduduki semua reseptor (pocc = 1), menyebabkan hanya separuh dari mereka
berada dalam bentuk aktif (yaitu, Par Par = * = 0,5). Dari Persamaan. (1.37), kita
bisa melihat bahwa E harus menjadi kesatuan untuk agonis ini. Dalam skema
Stephenson, agonis seperti itu akan memiliki khasiat persatuan, asalkan respon
diukur merupakan indikasi langsung dari proporsi diaktifkan reseptor.
Kesadaran bahwa kemampuan agonis untuk mengaktifkan reseptor dapat
dinyatakan dengan cara ini telah menyebabkan minat yang besar dalam mengukur
konstanta laju (dua masing-masing untuk KA dan E, di sederhana)
yang menentukan tidak hanya nilai-nilai KA dan E tetapi juga kinetika tindakan
agonis. Single channel The teknik perekaman memungkinkan ini dicapai untuk
saluran ion ligand-gated, seperti yang dijelaskan dalam Bab 6. Catatan,
bagaimanapun, komplikasi bahwa reseptor tersebut umumnya membawa dua situs
mengikat untuk agonis, sehingga skema sederhana hanya dipertimbangkan,
Persamaan. (1.7), harus diuraikan (lihat Persamaan. (1.9) dalam Lampiran 1.2c
[Bagian 1.2.4.3] dan juga Bab 6).
Kesulitan yang dihadapi dalam pekerjaan tersebut, dan salah satu yang harus
dipertimbangkan dalam studi hubungan antara konsentrasi agonis dan aksinya,
adalah terjadinya desensitisasi. Tanggapan menurun meskipun kehadiran terus
agonis. Beberapa faktor dapat berkontribusi. Salah satu yang telah diidentifikasi
dalam pekerjaan dengan saluran ion ligand-gated adalah bahwa reseptor
ditempati oleh agonis dan dalam keadaan aktif (AR*) mungkin isomerize ke tidak
aktif, peka, negara, ARD. Hal ini dapat direpresentasikan sebagai:
KA E KD
A + R AR AR* ARD
(Tidak aktif) (Tidak aktif) (aktif) (Tidak aktif)
Sebagaimana dijelaskan dalam Bab 6, studi kuantitatif desensitisasi pada
saluran ion ligand-gated telah menunjukkan bahwa bahkan skema ini terlalu
menyederhanakan, dan perlu untuk menyertakan kemungkinan bahwa reseptor
tanpa ligan bisa eksis dalam keadaan peka.
Desensitisasi dapat terjadi dengan cara lain. Dengan reseptor G-protein-
coupled, dapat dihasilkan dari fosforilasi reseptor oleh satu atau lebih protein
kinase yang menjadi aktif setelah penerapan agonis. * Aktivasi ini kadang-kadang
diikuti dengan hilangnya reseptor dari permukaan sel. Pengurangan agonis-
induced dalam jumlah reseptor fungsional atas relatif jangka waktu yang lama
digambarkan sebagai downregulation. Reseptor upregulation juga dapat terjadi,
misalnya, setelah pemberian berkepanjangan antagonis in vivo.
1.4.6 INTERPRETASI KEBERHASILAN UNTUK BERTINDAK
MELALUI RESEPTOR G-PROTEIN
Beberapa studi yang paling mengungkapkan dari agonis parsial (termasuk
pekerjaan mani Stephenson) telah dilakukan dengan jaringan di mana G-protein
(lihat Bab 2 dan 7) memberikan hubungan antara reseptor aktivasi dan inisiasi
respon. Berbeda dengan situasi dengan "cepat" dengan reseptor saluran ion
intrinsik (lihat di atas), itu belum mungkin untuk mengamati aktivitas individu
Gprotein- reseptor ditambah (dengan pengecualian beberapa potensi yang terkait
dengan kalium saluran), namun cukup diketahui untuk menunjukkan bahwa
mekanisme yang kompleks. Interpretasi perbedaan khasiat untuk agonis yang
bekerja pada reseptor tersebut Sejalan kurang tertentu.
Model awal untuk aksi reseptor tersebut adalah sebagai berikut:
KA
A + R AR
KARG
AR + G ARG*
Di sini, kompleks agonis reseptor (AR) menggabungkan dengan G-protein
(G) untuk membentuk kompleks terner (ARG *), yang dapat memulai acara lebih
lanjut seluler, seperti aktivasi adenilat siklase. Namun, ini skema sederhana
(model terner kompleks) tidak sesuai dengan apa yang sudah diketahui tentang
pentingnya isomerisasi dalam aktivasi reseptor (lihat Bagian 1.2.3 dan 1.4.3), dan
juga gagal untuk menjelaskan temuan yang segera datang dari penelitian terhadap
reseptor bermutasi. Dalam semua model saat reseptor G-protein-coupled, aktivasi
reseptor dengan isomerisasi adalah diasumsikan terjadi sehingga model menjadi:
KA E
A + R AR AR*
(1.38)
KARG
AR* + G AR*G*
Di sini, kombinasi reseptor diaktifkan (AR*) dengan G-protein
menyebabkan kedua untuk memasukkan aktif negara (G*) yang dapat melakukan
respon jaringan melalui, misalnya, adenilat siklase, fosfolipase C, atau pembukaan
atau penutupan saluran ion. Dalam skema ini, apa yang akan menentukan apakah
agonis tertentu dapat menghasilkan penuh atau hanya respon terbatas? Misalkan
tinggi konsentrasi agonis yang diterapkan, sehingga semua reseptor yang
diduduki. Mereka kemudian akan didistribusikan di antara AR, AR*, dan AR* G*
kondisi, dimana AR*G* saja menyebabkan respon. Nilai-nilai dari kedua E dan
KARG kemudian akan mempengaruhi berapa banyak AR*G* terbentuk, dan
karenanya apakah agonis yang dimaksud adalah parsial atau sebaliknya. Pada
prinsipnya, masing-masing dua konstanta kesetimbangan
* Beberapa protein kinase yang spesifik untuk reseptor tertentu (misalnya, β-
adrenergik reseptor kinase [βARK], sekarang disebut sebagai GRK2) bisa
bervariasi dari agonist untuk agonis. Dengan analogi dengan saluran ion ligand-
gated, sangat menggoda untuk kira bahwa hanya E adalah agonis tergantung dan
bahwa afinitas aktif, AR*, keadaan reseptor untuk G-protein adalah sama untuk
semua agonis. Namun, dengan tidak adanya bukti langsung, ini harus tetap
merupakan pertanyaan terbuka. Perhatikan bahwa, dalam hal apapun, besarnya
respon mungkin juga tergantung pada ketersediaan G-protein. Jika tersedia sangat
sedikit, hanya sejumlah kecil Sejalan AR*G* dapat dibentuk, terlepas dari
konsentrasi agonis dan jumlah reseptor.
Demikian pula, jika beberapa reseptor yang hadir dalam kaitannya dengan
jumlah total G-protein, yang juga akan membatasi pembentukan AR*G*. Dengan
demikian, respon maksimal agonis dipengaruhi oleh jaringan faktor maupun oleh
KA, E, dan KARG. Hal ini dapat ditunjukkan secara lebih formal dengan
menerapkan hukum aksi massa ke tiga kesetimbangan ditunjukkan pada
Persamaan. (1.38). Hasilnya, dengan beberapa diskusi lebih lanjut, diberikan
dalam Lampiran 1.4B (Bagian 1.4.9.2).
Rumit meskipun skema ini mungkin tampak, mereka berada di
penyederhanaan fakta. Faktor yang belum dipertimbangkan termasuk:
1. Sangat mungkin bahwa beberapa reseptor yang digabungkan ke G-protein
bahkan tanpa adanya agonis.
2. Reseptor diaktifkan menggabungkan dengan G-protein dalam bentuk GGDP,
dengan konsekuensi bahwa guanosin trifosfat (GTP) dapat menggantikan
guanosin terikat sebelumnya difosfat (GDP). Sejauh mana hal ini dapat terjadi
akan dipengaruhi oleh lokal konsentrasi GTP.
3. Struktur G-protein heterotrimeric. Setelah aktivasi oleh GTP mengikat,
yang memisahkan trimer ke α dan subunit βγ, yang masing-masing dapat
menimbulkan tanggapan sel.
4. Aktivasi G-protein memiliki sifat siklus. The α subunit dapat menghidrolisis
GTP yang terikat untuk itu, sehingga memungkinkan heterotrimer untuk
reformasi. Masa pakai αGTP individu subunit akan bervariasi (lih. daya tahan
saluran ion terbuka).
5. Lebih dari satu jenis G-protein, masing-masing dengan tindakan seluler
karakteristik, mungkin hadir dalam banyak sel.
6. Beberapa reseptor G-protein-coupled telah ditemukan untuk menjadi
konstitutif aktif (lihat bagian berikut).
7. Hal ini dimungkinkan (meskipun belum terbukti) bahwa afinitas bentuk aktif
yang diduduki reseptor (AR *) untuk G-protein dapat bervariasi dari agonist untuk
agonis.
8. Bukti terbaru menunjukkan bahwa reseptor beberapa G-protein-coupled ada
sebagai dimer.
Pada prinsipnya, fitur ini dapat dibangun ke dalam model aktivasi reseptor,
meskipun besar jumlah parameter pakai membuat pengujian sulit. Beberapa
konstanta laju dan kesetimbangan harus diketahui terlebih dahulu. Salah satu
taktik eksperimental adalah untuk mengubah proporsi relatif dari reseptor dan G-
protein dan kemudian menentukan apakah kemanjuran agonis perubahan dalam
cara yang diharapkan dari model. Penemuan bahwa beberapa reseptor konstitutif
aktif telah memberikan lain pendekatan baru serta informasi tambahan tentang
fungsi reseptor, seperti sekarang kita akan lihat.
1.4.7 RESEPTOR KONSTITUTIF AKTIF DAN AGONIS TERBALIK
The del Castillo Skema-Katz (kesamaan, tentu saja, dengan model
sederhana dieksplorasi oleh Hill, Clark, dan Gaddum) mengandaikan bahwa
reseptor tidak aktif dalam ketiadaan agonis. Sekarang diketahui bahwa hal ini
tidak selalu begitu, beberapa jenis reseptor konstitutif aktif. Contoh termasuk
bermutasi reseptor bertanggung jawab untuk beberapa penyakit genetik
ditentukan. Dengan demikian, hipertiroidisme dapat hasil dari mutasi yang
menyebabkan reseptor untuk thyrotropin (TSH, atau thyroidstimulating hormone)
untuk aktif bahkan tanpa adanya hormon. Juga, varian reseptor yang secara
konstitutif aktif telah dibuat di laboratorium oleh situs-directed mutagenesis.
Akhirnya, berlebih sengaja reseptor oleh transfeksi gen reseptor-garis sel dan
bahkan laboratorium hewan telah mengungkapkan bahwa banyak "wild type"
reseptor juga menunjukkan beberapa aktivitas dalam ketiadaan agonis. Apa yang
mungkin menjadi mekanisme? Kemungkinan yang paling mungkin, dan satu yang
sesuai
Dengan apa yang telah dipelajari tentang bagaimana saluran ion bekerja,
adalah bahwa reseptor tersebut dapat isomerize
spontan ke dan dari bentuk aktif:
R R*
(Tidak aktif) (Aktif)
Pada prinsipnya, kedua bentuk dapat menggabungkan dengan agonis, atau
memang dengan ligan, L, dengan afinitas, seperti yang diilustrasikan pada
Gambar 1.11.
Misalkan L menggabungkan hanya dengan aktif, R, bentuk. Maka kehadiran
L, dengan mempromosikan pembentukan LR dengan mengorbankan spesies lain,
akan mengurangi proporsi reseptor di aktif, R *, besaran. L dikatakan agonis
terbalik atau antagonis negatif dan untuk memiliki negatif khasiat. Jika,
sebaliknya, L menggabungkan dengan bentuk R* saja, akan bertindak sebagai
konvensional atau positif agonis keberhasilan intrinsik yang sangat tinggi.
Menjelajahi skema lebih lanjut, agonis parsial akan mengikat kedua R dan
R* tetapi dengan beberapa afinitas khusus untuk satu atau yang lain dari dua
negara. Jika preferensi adalah untuk R, ligan akan menjadi agonis terbalik parsial,
karena kehadirannya akan mengurangi jumlah reseptor dalam keadaan aktif,
meskipun tidak sampai nol.
Seperti ditunjukkan dalam Bagian 1.10 (lihat solusi untuk Soal 1.4),
penerapan hukum massa tindakan untuk skema Gambar 1.11 memberikan
ekspresi berikut untuk sebagian kecil dari reseptor dalam keadaan aktif (yaitu, PR*
+ PLR*).
Di sini, E0 konstanta kesetimbangan didefinisikan oleh PR*/PR, KL
berdasarkan [L] PR / PLR, danberdasarkan [L] PR*/PLR*. Gambar 1.12 plot
hubungan ini selama tiga ligan hipotetis yang berbeda dalam afinitas relatif
mereka untuk aktif dan negara tidak aktif reseptor. Istilah α telah digunakan untuk
mengekspresikan rasio dari KL ke K*
L. Ketika α = 0,1, ligan merupakan agonis
terbalik, sedangkan bila α = 100, itu adalah agonis konvensional. Dalam contoh
ketiga, dengan ligan yang tidak menunjukkan selektivitas antara bentuk aktif dan
tidak aktif dari reseptor (α = 1), proporsi reseptor aktif tetap tidak berubah seperti
[L] (dan karena reseptor hunian) meningkat.
Ligan seperti ini, bagaimanapun, akan mengurangi tindakan baik
konvensional atau agonis terbalik, dan sebagainya berlaku adalah antagonis.
Lebih tepatnya, itu merupakan antagonis kompetitif netral. Jika besar
GAMBAR 1.11 Sebuah model untuk menunjukkan pengaruh ligan, L, pada
keseimbangan antara aktif dan bentuk aktif dari reseptor konstitutif aktif, R.
Perhatikan bahwa jika L, R, dan LR berada dalam kesetimbangan, dan juga L, R*
dan LR*, maka sama harus berlaku untuk LR dan LR* (lihat Lampiran 1.6b
(Bagian 1.6.7.2) untuk lebih lanjut penjelasan)
GAMBAR 1.12 Hubungan antara fraksi total reseptor dalam keadaan aktif (pR *
+ Par *) dan konsentrasi ligan ([L]) untuk reseptor konstitutif aktif. Kurva telah
ditarik menurut Eq. (1,39), menggunakan nilai berikut: E0 = 0,2, KL = 200 nM, α
= KL / = 0,1, 1, dan 100, seperti yang ditunjukkan. Perhatikan bahwa pada model
ini beberapa reseptor (sebagian kecil yang diberikan oleh E0 / (1 + E0) = 0.167)
yang aktif dengan tidak adanya ligan. * Kemungkinan bahwa depresi pada
aktivitas basal mungkin memiliki beberapa penjelasan lain (misalnya, aksi
penghambatan pada satu atau lebih peristiwa yang mengikuti aktivasi reseptor)
tidak boleh diabaikan. Jumlah antagonis kompetitif dari kelas farmakologis yang
sama (misalnya, β-adrenoreseptor bloker) hati-hati diuji pada baris jaringan atau
sel menunjukkan aktivitas konstitutif, beberapa akan ditemukan menyebabkan
peningkatan kecil dalam aktivitas basal. Mereka adalah, pada dasarnya, lemah
agonis parsial konvensional. Orang lain akan mengurangi aktivitas basal dan jadi
mungkin agonis terbalik dengan apa yang bisa menjadi besar tingkat keberhasilan
negatif.
Namun, beberapa senyawa semacam ini telah diidentifikasi, dan Gambar
1.13 menggambarkan efek satu di respon untuk kedua konvensional dan agonis
terbalik bertindak pada reseptor 5HT1A dinyatakan dalam baris sel.
Seperti dengan eksperimen dari Gambar 1.13, aktivitas konstitutif sering
diselidiki dalam berbudaya baris sel yang tidak normal mengekspresikan reseptor
untuk diperiksa tetapi telah dibuat untuk melakukannya oleh transfeksi dengan
gen coding untuk kedua reseptor asli atau varian mutasi dari itu. Itu jumlah
reseptor per sel (densitas reseptor) mungkin jauh lebih besar dalam situasi ini
daripada dalam sel yang mengekspresikan reseptor alami. Sementara berlebih
semacam ini memiliki keuntungan besar bahwa derajat kecil dari aktivitas
konstitutif dapat dideteksi dan dipelajari, perlu dicatat bahwa aktivitas konstitutif
sering kurang mencolok in situ daripada di sel transfected. Oleh karena itu,
sebagian tindakan agonis (konvensional atau inverse) dari antagonis mungkin jauh
kurang ditandai, atau bahkan diabaikan, bila dipelajari dalam jaringan utuh
sehingga antagonisme kompetitif sederhana diamati, sebagai dijelaskan dalam
Bagian 1.5.
Namun demikian, bukti bahwa beberapa reseptor memiliki aktivitas
konstitutif cukup untuk mempengaruhi fungsi sel in vivo bahkan tanpa adanya
agonis membuat perlu untuk memperpanjang model sederhana sudah dianggap
untuk aktivasi reseptor G-protein-coupled. Pada prinsipnya, reseptor dapat
sekarang ada di tidak kurang dari delapan kondisi yang berbeda (R, R*, LR, LR*,
RG, R* G, LRG, LR* G), yang terbaik diwakili grafis sebagai kubus dengan salah
satu kondisi pada setiap titik (lihat Gambar 1.14). Perhitungan proporsi reseptor
diaktifkan dan menduduki sangatlah mudah, jika panjang (lihat jawaban Soal 1.5
dalam Bagian 1.10). Menemukan proporsi dalam bentuk aktif lebih sulit jika
pasokan G-protein terbatas tetapi dapat dilakukan dengan menggunakan metode
numerik.
GAMBAR 1.13 Efek dari agonis konvensional, agonis terbalik, dan antagonis
netral pada aktivitas suatu konstitutif aktif G-protein-coupled 5HT1A reseptor.
Panel di sebelah kiri menunjukkan kurva konsentrasi-respon log untuk agonis
konvensional (lapangan terbuka) dan agonis terbalik (lingkaran terbuka). Tertutup
simbol menunjukkan bagaimana kurva berubah ketika antagonis (WAY 100.635
pada 10 nM) dimasukkan dalam cairan inkubasi. Perhatikan paralel, dan yang
sejenis, pergeseran garis. Panel di sebelah kanan menggambarkan efek dari
berbagai konsentrasi antagonis yang sama diterapkan sendiri (berlian terbuka)
atau di hadapan tinggi konsentrasi baik agonis konvensional (kotak tertutup) atau
agonis terbalik (lingkaran tertutup). Perhatikan bahwa antagonis dengan
sendirinya menyebabkan sedikit perubahan, menunjukkan bahwa ia tidak
memiliki preferensi untuk bentuk aktif atau tidak aktif reseptor. Sehubungan
dengan hal ini, konsentrasi tinggi antagonis menghapuskan respon terhadap kedua
jenis agonis (kurva konvergen). (Dari Newman-Tancredi, A. et al., Br. J.
Pharmacol., 120, 737-739, 1997
GAMBAR 1.14 Elaborasi dari model yang ditunjukkan pada Gambar 1.11, yang
direproduksi sebagai wajah depan kubus. Masing-masing empat elemen (R, R *,
LR, dan LR *) dapat menggabungkan dengan G-protein untuk membentuk RG, R
* G, LRG, dan LR * G, masing-masing. Dari jumlah tersebut, hanya R * G dan
LR * G menyebabkan respon jaringan. Wajah atas kubus menunjukkan negara
ligan yang terikat reseptor. Rincian lebih lanjut dapat ditemukan pada Bagian 1.10
(lihat solusi untuk Soal 1.5).
1.4.8 MENCOBA UNTUK ESTIMASI EFIKASI agonis parsial DARI
AKHIR TANGGAPAN DARI JARINGAN KOMPLEKS
Meskipun pengamatan fungsi reseptor pada tingkat molekuler (misalnya,
single-channel rekaman atau perubahan reseptor fluoresensi setelah pengikatan
ligan) menjadi semakin praktis, masih sering terjadi bahwa ukuran hanya tersedia
aktivasi reseptor adalah respon dari jaringan utuh. Ini bisa menjadi kontraksi atau
relaksasi sepotong otot polos, sekresi oleh kelenjar, atau perubahan dalam
sekejap. Bagaimana aksi dari agonis parsial terbaik akan ditandai dalam situasi
seperti ini? Jelas, aktivitas agonis maksimum (yang disebut intrinsik kegiatan;
lihat pembahasan sebelumnya) dan konsentrasi agonis yang menghasilkan
setengah maksimal respon yang agonis dapat menimbulkan adalah ukuran
deskriptif berharga. Seperti telah kita lihat, R.P. Stephenson mengambil hal-hal
lebih lanjut dengan mengandaikan bahwa respon terhadap agonis ditentukan
dengan produk dari kemanjuran agonis dan proporsi reseptor diduduki (lihat
Persamaan. (1.27)). Dia juga menggambarkan metode eksperimental yang
menjanjikan untuk memungkinkan khasiat agonis bertindak atas jaringan utuh
untuk dibandingkan. Prosedur ini kemudian diperpanjang oleh orang lain dan
cukup diterapkan secara luas. Sebuah contoh diberikan pada bagian antagonis
ireversibel.
Namun, seperti yang sudah dibahas, kini menjadi jelas bahwa hunian dan
aktivasi reseptor oleh agonis tidak setara, maka, penggunaan Stephenson dari
persamaan Bukit Langmuir untuk berhubungan konsentrasi agonis reseptor hunian
dalam Pers. (1.27) merupakan penyederhanaan yang berlebihan. Kami akhir tugas
dalam akun ini dari agonis parsial adalah untuk menguji kembali formulasi
Stephenson kemanjuran, dan Hasil eksperimen berdasarkan itu, dalam terang
pengetahuan baru tentang bagaimana reseptor berfungsi.
Langkah pertama adalah untuk menyusun kembali persamaan Stephensons
dalam hal total reseptor hunian (pocc, diduduki tapi tidak aktif ditambah diduduki
dan aktif). Mengambil kursus ini, dan dengan asumsi bahwa del Mekanisme
Castillo-Katz berlaku dalam bentuk yang paling sederhana (Persamaan (1.7)), kita
dapat menulis:
S = e* APooc(A) = e
*A (1.40)
Dimana Keff didefinisikan sebagai dalam Pers. (1.36) di Bagian 1.4.4. Sebelum
pergi lebih jauh, itu harus dibuat jelas bahwa modifikasi ini skema Stephenson
berangkat fundamental dari konsep aslinya yang efikasi dan afinitas dapat
dianggap sebagai jumlah yang dipisahkan dan berpotensi independen. Untuk
menekankan titik, simbol e* daripada e digunakan. Kami telah melihat di bagian
akhir.
GAMBAR 1.15 Memperkirakan efektivitas agonis parsial dengan
membandingkan kurva konsentrasi-respon dengan bahwa untuk agonis penuh
(lihat teks untuk rincian lebih lanjut).
bahwa makroskopik kesetimbangan disosiasi Keff konstan tidak hanya
ditentukan oleh nilai KA tetapi juga oleh E, yang secara langsung berkaitan
dengan keberhasilan. Dalam nada yang sama, baik efektivitas dan afinitas
makroskopik agonis bertindak melalui reseptor G-protein-coupled tergantung
pada jaringan faktor-faktor seperti jumlah relatif dan absolut dari G-protein dan
reseptor, serta pada konstanta kesetimbangan mikroskopis.
Dengan pemesanan ini dalam pikiran, kita selanjutnya akan
mempertimbangkan tiga pendekatan yang telah digunakan di masa lalu untuk
mengukur efektivitas agonis parsial bekerja pada sebuah jaringan utuh. Setiap
akan dianalisis dalam dua cara dengan rincian yang diberikan dalam Lampiran
1.4c (Bagian 1.4.9.3). Yang pertama adalah kepentingan sejarah saja dan
didasarkan pada formula awal Stephenson, seperti yang diungkapkan dalam Pers.
(1.27) (Bagian 1.4.2) dan dengan reseptor hunian diberikan oleh persamaan Bukit-
Langmuir di paling sederhana bentuk, yang kita telah melihat tidak memadai
untuk agonis. Analisis kedua mendefinisikan reseptor hunian karena semua
reseptor yang diduduki, aktif ditambah tidak aktif.
Dua yang pertama dari tiga metode mengandaikan bahwa pengukuran
dilakukan dengan tisu yang memiliki cadangan besar reseptor. Hal ini juga
diasumsikan bahwa agonis lengkap tersedia yang dapat membangkitkan respon
maksimal ketika menempati hanya sebagian kecil dari reseptor.
Metode 1. Kurva konsentrasi-respon yang dibangun untuk agonis penuh (A) dan
agonis parsial [P], efektivitas yang akan ditentukan (Gambar 1.15). Dua
konsentrasi yang membacakan kurva untuk agonis penuh. Yang pertama, [A] 1,
menyebabkan halfmaximal respon. Yang kedua, [A] 2, memunculkan respon yang
sama seperti yang terlihat dengan maksimal agonis parsial. Manfaat dari agonis
parsial diberikan oleh rasio [A] 2 sampai [A] 1 (Lihat Lampiran 1.4c, bagian A).
Metode 2. Tepat pengukuran dan asumsi yang sama dibuat seperti sebelumnya
(lihat lagi Gambar 1.15). Dari kurva konsentrasi-respon untuk agonis penuh dan
parsial, yang nilai [A] dan [P] yang mendapatkan respon yang sama dibaca off
untuk beberapa tingkat respon. Sebuah plot 1 / [A] terhadap 1 / [P] dibangun dan
harus menghasilkan garis lurus dari mana efektivitas agonis parsial dapat
diperoleh jika asumsi yang mendasarinya benar (lihat Lampiran 1.4c, bagian B).
Metode 3. Metode ini lebih umum daripada dua lainnya dalam arti bahwa hal
itu juga berlaku untuk agonis penuh, setidaknya pada prinsipnya. Misalkan kita
memiliki beberapa sarana yang dapat diandalkan untuk menentukan
kesetimbangan disosiasi konstan untuk kombinasi agonis dengan nya reseptor.
Salah satu prosedur yang telah digunakan di masa lalu adalah ireversibel Antag-
Furchgott yang metode onist, seperti yang dijelaskan dalam Bagian 1.6.4. Kita
kemudian dapat menerapkan hunian yang sesuai hubungan dengan menghitung
proporsi reseptor diduduki pada konsentrasi agonis yang menghasilkan respon
setengah-maksimal. Karena S kemudian kesatuan, menurut konvensi
diperkenalkan oleh Stephenson, kebalikan dari hunian ini memberikan nilai e
(dari Persamaan. (1.27)). Ini adalah dasar dari estimasi Furchgott tentang
kemanjuran histamin yang bekerja padaterisolasi hamster ileum (lihat Gambar
1.24 dalam Bagian 1.6.3.). Jelas, metode ini berdiri atau jatuh dengan validitas
prosedur yang digunakan untuk mengukur kesetimbangan disosiasi konstan dan
untuk menghubungkan konsentrasi agonis untuk hunian. Kita akan melihat dalam
Bagian 1.6.4 bahwa metode antagonis ireversibel Furchgott menyediakan
perkiraan, tidak, seperti yang pertama pemikiran, dari konstanta kesetimbangan
mikroskopis, KA, melainkan dari makroskopik konstanta kesetimbangan, Keff.
Oleh karena itu, tingkat hunian reseptor dihitung dari itu menggunakan Persamaan
bukit-Langmuir akan total hunian, aktif ditambah tidak aktif. Oleh karena itu,
khasiat dihitung dengan cara ini harus dianggap seperti yang didefinisikan oleh
Persamaan. (1,40) dan tidak Pers. (1.28), yang dirumuskan oleh Stephenson.
Apakah nilai-nilai keberhasilan yang diperoleh dengan cara ini berguna?
Mereka tentu ada pengganti untuk pengukuran, jika ini bisa dibuat, dari konstanta
kesetimbangan mikroskopis yang mengatur proporsi reseptor dalam bentuk
diduduki dan aktif. Juga, karena e* dipengaruhi oleh jaringan faktor (misalnya,
[G]T dan [R]T, serta E dan KARG untuk reseptor G-protein-coupled), tertentu nilai
dapat hasil dari beberapa kombinasi variabel-variabel ini, E, keseimbangan
isomerisasi konstan untuk pembentukan reseptor aktif, bukan satu-satunya
penentu. Oleh karena itu, nilai e* (Atau e) tidak dapat digunakan sebagai ukuran
yang dapat diandalkan E. Perbandingan e* nilai untuk agonis yang berbeda
bekerja pada jaringan tertentu lebih informatif karena faktor jaringan tergantung
seperti [G]T dan [R]T adalah sama. Rasio e* selama dua agonis kemudian harus
memberikan perkiraan rasio terbalik dari total hunian reseptor yang diperlukan
untuk mendapatkan respon tertentu. Namun, pertanyaan kunci tentang bagaimana
reseptor diduduki didistribusikan antara negara aktif dan tidak aktif tetap terjawab
dalam ketiadaan jenis lain bukti. Meskipun pentingnya besar Stephenson konsep
keberhasilan, kita harus menyimpulkan bahwa perkiraan numerik keberhasilan,
sebagai awalnya didefinisikan, dan didasarkan pada pengukuran respon dari
jaringan utuh, adalah sedikit lebih dari nilai deskriptif.
1.4.9 LAMPIRAN KE BAGIAN 1.4
1.4.9.1 Lampiran 1.4A: Definisi Agonis parsial
Istilah agonis parsial telah datang untuk digunakan dalam dua pengertian
yang sedikit berbeda. Yang pertama, seperti dalam akun, adalah untuk merujuk
agonis itu dalam sebuah jaringan tertentu atau organisme, di bawah kondisi
tertentu, tidak dapat menimbulkan efek sebagai besar (bahkan ketika diterapkan
dalam jumlah besar) seperti yang bisa agonis penuh bertindak melalui reseptor
yang sama. Yang kedua, lebih terbatas, penggunaan menambahkan kondisi bahwa
respon adalah submaximal karena tidak cukup dari reseptor ditempati oleh agonis
parsial dikonversi ke bentuk aktif.
Perbedaan dapat diilustrasikan dengan mempertimbangkan aksi
decamethonium pada nicotinic reseptor otot rangka. Seperti asetilkolin,
decamethonium menyebabkan saluran ion intrinsik reseptor ini untuk membuka,
sehingga konduktansi listrik dari wilayah endplate otot
serat meningkat. Namun, bahkan pada konsentrasi yang sangat tinggi,
decamethonium dapat tidak cocok konduktansi meningkatkan disebabkan oleh
asetilkolin. Ini bukan karena decamethonium jauh kurang mampu menyebabkan
reseptor untuk isomerize ke bentuk aktif, melainkan respon maksimal kecil
sebagian besar konsekuensi dari kecenderungan yang lebih besar dari
decamethonium untuk memblokir saluran ion reseptor nicotinic.
Oleh karena itu, decamethonium tidak akan dianggap sebagai agonis parsial
dalam arti kedua didefinisikan atas. Namun, jika dibandingkan dengan asetilkolin
karena kemampuannya untuk kontrak sepotong otot rangka, maka akan ditemukan
untuk menghasilkan respon maksimum yang lebih kecil sehingga akan
digambarkan sebagai agonis parsial pertama, lebih umum, masuk akal.
1.4.9.2 Lampiran 1.4B: Ekspresi untuk Fraksi G-Protein-Ditambah
Reseptor dalam Formulir Aktif
Penerapan hukum aksi massa untuk masing-masing tiga kesetimbangan
ditunjukkan pada Persamaan. (1.38) dan penggunaan aturan konservasi (lihat
sebelumnya) mengarah pada ekspresi * berikut untuk PAR*G*:
PAR*G* = (1.41)
Meskipun ini terlihat rumit, masih memprediksi hubungan hiperbolik
sederhana (seperti dengan Persamaan bukit-Langmuir, lihat Gambar 1.1 dan teks
yang menyertai) antara konsentrasi agonis dan proporsi reseptor di negara bagian
(AR*G*) yang mengarah ke respon. Jika sangat besar konsentrasi A diterapkan,
sehingga semua reseptor ditempati, nilai nominal PAR*G* asimtot ke:
Dengan demikian, efektivitas intrinsik** dari agonis dipengaruhi oleh KARG dan
[G]T serta, dari Tentu saja, oleh E.
Dalam menurunkan persamaan. (1.41), telah diasumsikan bahwa
konsentrasi G tidak jatuh sebagai konsekuensi dari pembentukan AR*G*. Ini akan
jadi jika konsentrasi total G, [G]T, sangat melebihi konsentrasi reseptor ([R]T),
sehingga konsentrasi G bisa dianggap sebagai konstan, kurang lebih sama dengan
[G]T. Tapi, bisa kita benar-benar menganggap [G] sebagai konstan? Misalkan,
sebaliknya, bahwa [R]T >> [G]T, bukan sebaliknya. Kemudian, Persamaan. (1.41)
harus diganti dengan:
PAR*G* = (1.42)
Respon maksimum sekarang akan menjadi:
sehingga efektivitas intrinsik agonis akan dipengaruhi oleh [R]T maupun oleh
KARG dan [G]T.
Jelas, akan lebih baik untuk menghindari kebutuhan harus membuat asumsi
tentang baik keajegan [G] atau ukuran relatif [R]T dan [G]T. Hal ini dapat
dilakukan untuk perancangan Persamaan. (1,38), dan hasilnya adalah ekspresi
agak lebih kompleks untuk konsentrasi AR*G*, yang diperoleh dari akar
persamaan kuadrat:
* Ungkapan ini berasal dalam Bagian 1.10, lihat solusi untuk Soal 1.3.
** Istilah ini telah semakin datang untuk dipekerjakan (seperti di sini) dalam arti
yang agak berbeda dari yang diperkenalkan oleh RF Furchgott (Bagian 1.4.2).
Dengan penggunaan yang lebih baru, keberhasilan intrinsik menunjukkan aktivasi
reseptor maksimum (sering dinyatakan sebagai fraksi dari reseptor dalam keadaan
aktif) yang dapat dicapai oleh agonis bertindak melalui mekanisme yang dapat
dirumuskan dan belajar di tingkat molekuler, seperti dalam contoh ini. Tujuan dari
redefinisi ini adalah untuk fokus pada reseptor itu sendiri dan mekanisme
transduksi terdekatnya (misalnya, aktivasi G-protein), bukan pada seluler
Peristiwa selanjutnya.
[AR*G*]2 Ŕ (Q + [G]T + [R]T)[AR*G*] + [R]T = 0 (1.43)
dimana
Q = 1 + (1 + )
Ini memprediksi hubungan antara nonhyperbolic [AR*G*] dan [A], serta
antara mengikat dan [A]. Secara umum, khasiat intrinsik ditentukan oleh E dan
KARG serta berdasarkan [R]T dan [G]T.
1.4.9.3 Lampiran 1.4c: Analisis Metode 1 dan 2 dalam Pasal 1.4.8
A. Analisis Metode 1 (Bagian 1.4.8) diusulkan untuk penentuan efektivitas agonis
parsial bekerja pada sebuah jaringan utuh:
Analisis mengikuti formulasi Stephenson efikasi, dan menggunakan asumsi nya
dan istilah. Untuk respon setengah-maksimal, S = 1 (dengan Stephenson
konvensi) dan Par ≈ [A] 1/KA. Pendekatan ini berlaku karena jika A menempati
beberapa reseptor (yaitu, [A] << KA), kemudian
Oleh karena itu, mengingat bahwa SA = eApAR, kita memiliki:
(1.44)
Ketika parsial agonis P menempati semua situs mengikat untuk menghasilkan
maksimal nya respon, PPR = 1. Oleh karena itu, stimulus (SP) disebabkan P
hanya eP. Dengan asumsi bahwa respon jaringan yang sama, apakah ditimbulkan
oleh A atau oleh P, sesuai dengan nilai yang sama dari S, kami dapat menulis:
SP = SA
ep = eA (1.45)
Membagi Persamaan. (1.45) dengan (1.44), kita memperoleh:
ep =
Analisis berdasarkan mendefinisikan stimulus sebagai produk keberhasilan (e*)
dan total reseptor hunian oleh agonis (yaitu, pocc).
Untuk respon setengah-maksimal, S = 1 (oleh Stephenson
konvensi) dan pocc (A) ≈ [A]1/Keff(A). Ini pendekatan depan karena jika A
menempati beberapa reseptor, maka
Oleh karena itu, mengingat redefinisi SA sebagai e* A pocc (A), kita memiliki:
1 = e*A (1.46)
Ketika agonis parsial menempati semua reseptor untuk menghasilkan respon
maksimalnya, pocc (P) = 1. Oleh karena itu, stimulus (SP) disebabkan
dengan P adalah e * P. Dengan asumsi bahwa jaringan yang sama
respon sesuai dengan nilai yang sama dari S, kita bisa menulis:
Sp = SA
e*p = e*p (1.47)
B. Analisa Metode 2 (Bagian 1.4.8) diusulkan untuk penentuan efektivitas
agonis parsial bekerja pada sebuah jaringan utuh:
Analisis mengikuti formulasi Stephenson keberhasilan. Sama seperti
sebelumnya, kita berasumsi bahwa SA = SP untuk
besarnya respon yang sama. Oleh karena itu,
eA e*p
Jika A menempati beberapa reseptor (sehingga [A] << KA;
lihat Metode 1), kita dapat menulis:
eA
Oleh karena itu, plot 1 / [A] terhadap 1 / [P] harus menyediakan garis lurus
dengan kemiringan eAKP / ePKA dan mencegat eA / ePKA. Rasio lereng untuk
mencegat harus memberikan perkiraan KP. Jika parsial agonis dapat
menghasilkan respon yang sama atau lebih besar dari 50% itu ke agonis penuh,
nilai eP kemudian dapat dihitung dengan menggunakan KP untuk bekerja di luar
proporsi reseptor diduduki oleh agonis parsial ketika memunculkan respon
setengah-maksimal, kebalikan dari ini hunian memberikan eP (karena S kemudian
kesatuan, oleh definition). Namun, jika agonis parsial dapat hanya menghasilkan
respon yang kecil, maka Metode 1 dapat diterapkan untuk memperkirakan eP.
Analisis berdasarkan mendefinisikan stimulus sebagai produk efikasi (e *) dan
total reseptor hunian oleh agonis, seperti sebelumnya. Kami lagi berasumsi bahwa
SA = SP, untuk hal yang sama besarnya respon. Oleh karena itu, Jika A
menempati beberapa reseptor (sehingga [A] <<
Keff (A), lihat Metode 1), kita dapat menulis: Oleh karena itu, plot 1 / [A]
terhadap 1 / [P] harus menyediakan garis lurus dengan kemiringan e * AKeff (P) /
e * PKeff (A) dan mencegat e * A / e * PKeff (A). Rasio lereng mencegat harus
memberikan perkiraan dari Keff (P). Nilai e * P kemudian dapat dihitung
seperti yang dijelaskan di sebelah kiri untuk eP.
1.5 TINDAKAN HAMBAT PADA RESEPTOR: I. DPT DIATASI
ANTAGONISME
1.5.1 GAMBARAN OBAT ANTAGONISME
Banyak obat yang paling berguna adalah antagonis: zat yang mengurangi
tindakan agen lain, yang sering agonis endogen (misalnya, hormon atau
neurotransmitter). Meskipun paling Mekanisme umum adalah kompetisi
sederhana, antagonisme dapat terjadi dalam berbagai cara.
1.5.1.1 MEKANISME TIDAK MELIBATKAN AGONIS RESEPTOR
MAKROMOLEKUL
1. Antagonisme kimia. Antagonis menggabungkan langsung dengan substansi
yang antagonized; reseptor tidak terlibat. Misalnya, pengkelat EDTA digunakan
untuk mengobati keracunan timbal (a khelat kurang beracun terbentuk dan
dikeluarkan).
2. Fungsional atau fisiologis antagonisme. The "antagonis" sebenarnya merupakan
agonis yang menghasilkan efek sebaliknya biologis untuk substansi yang
antagonized. Setiap substansi bertindak melalui reseptor sendiri. Lihat juga
langsung antagonisme (bawah). Sebagai contoh, adrenalin melemaskan otot polos
bronkus, sehingga mengurangi bronkokonstriksi yang disebabkan oleh histamin
dan leukotrien.
3. Antagonisme farmakokinetik. Di sini, "antagonis" efektif mengurangi
konsentrasi dari obat aktif di situs kerjanya. Misalnya, berulang administrasi
fenobarbital menginduksi peningkatan aktivitas enzim hati yang menonaktifkan
antikoagulan obat warfarin. Oleh karena itu, jika fenobarbital dan warfarin
diberikan bersama-sama, konsentrasi plasma warfarin berkurang, sehingga
menjadi kurang aktif.
4. Antagonisme tidak langsung. Antagonis bertindak pada kedua reseptor hilir
yang menghubungkan aksi agonis untuk respon akhir diamati. Misalnya, β-
adrenoreseptor bloker seperti propranolol mengurangi kenaikan detak jantung
yang disebabkan oleh tidak langsung bertindak simpatomimetik amina seperti
tyramine. Hal ini karena tyramine bertindak dengan melepaskan noradrenalin dari
ujung saraf noradrenergik, dan noradrenalin tindakan dirilis pada β-adrenoreseptor
untuk meningkatkan denyut jantung:
tyramine → pelepasan noradrenalin → aktivasi β-reseptor → respon
Kemungkinan lain adalah bahwa antagonis mengganggu peristiwa pasca-
reseptor lain yang berkontribusi pada respon jaringan. Misalnya, calcium channel
blockers seperti verapamil memblokir masuknya kalsium yang diperlukan untuk
mempertahankan kontraksi otot polos; karenanya, mereka mengurangi respon
kontraktil untuk asetilkolin. Beberapa ahli farmakologi lebih untuk
menggambarkan ini sebagai varian dari antagonisme fungsional (lihat di atas).
1.5.1.2 MEKANISME MELIBATKAN AGONIS RESEPTOR
MAKROMOLEKUL
1. Pengikatan agonis dan antagonis adalah saling eksklusif. Hal ini mungkin
karena agonis dan antagonis bersaing untuk situs pengikatan sama atau
menggabungkan dengan lokasi yang berdekatan yang tumpang tindih.
Kemungkinan ketiga adalah bahwa situs yang berbeda yang terlibat tetapi mereka
berinteraksi dalam sedemikian rupa sehingga agonis dan antagonis molekul tidak
dapat terikat pada reseptor makromolekul pada waktu yang sama. Jenis
antagonisme memiliki dua varian utama:
a. Agonis dan antagonis membentuk kombinasi hanya pendek-panjang dengan
reseptor, sehingga bahwa keseimbangan antara agonis, antagonis, dan reseptor
dapat dicapai selama kehadiran agonis. Interaksi antara antagonis dan situs
pengikatan adalah reversibel bebas. Oleh karena itu, aksi pemblokiran selalu dapat
diatasi dengan meningkatkan konsentrasi agonis, yang kemudian akan menempati
proporsi yang lebih tinggi mengikat situs. Hal ini digambarkan sebagai
antagonisme kompetitif reversibel (lihat nanti). Sebagai contoh, atropin kompetitif
menghambat aksi asetilkolin pada reseptor muscarinic.
b. Antagonis menggabungkan ireversibel (atau efektif sehingga dalam skala
waktu
aplikasi agonis) dengan tempat pengikatan agonis. Ketika reseptor cukup
memiliki telah ireversibel diblokir dengan cara ini, antagonisme ini dapat diatasi
(yaitu, tidak ada jumlah agonis dapat menghasilkan respon penuh karena terlalu
sedikit reseptor diblokir yang kiri). Perhatikan bahwa sebagian besar farmasi
sekarang menggambarkan ini sebagai ireversibel kompetitif antagonisme, yang
merupakan istilah yang digunakan dalam akun ini, yang lain menganggapnya
sebagai tidak kompetitif. Misalnya, phenoxybenzamine membentuk ikatan
kovalen pada atau dekat situs mengikat agonis pada α-adrenoreseptor,
menghasilkan antagonisme diatasi.
2. Antagonisme nonkompetitif terjadi ketika agonis dan antagonis dapat terikat,
pada saat yang sama, untuk wilayah yang berbeda dari makromolekul reseptor.
Hal ini kadang-kadang juga disebut sebagai allotopic atau alosterik antagonisme
(allotopic berarti "tempat yang berbeda" dalam Berbeda dengan syntopic, yang
berarti "tempat yang sama", karena catatan di alosterik, lihat Lampiran 1.6A
[Bagian 1.6.7.1]). Pada prinsipnya, antagonis kompetitif dapat berupa reversibel
atau
GAMBAR 1.16 Efek diprediksi dari tiga konsentrasi antagonis kompetitif
reversibel, B, pada log hubungan konsentrasi-respon untuk agonis. Perhitungan
rasio konsentrasi (r3) untuk konsentrasi tertinggi antagonis, [B] 3, diilustrasikan.
ireversibel. Sebuah contoh dari mantan adalah bahwa hexamethonium
reversibel mengurangi aksi asetilkolin pada reseptor nicotinic sel ganglion
simpatik dengan menghalangi saluran ion yang intrinsik dengan reseptor nicotinic.
Perhatikan bahwa istilah kompetitif kadang-kadang diperluas untuk mencakup
bentuk antagonisme yang tidak melibatkan agonis reseptor makromolekul (lihat,
misalnya, antagonisme langsung di bagian sebelumnya).
1.5.2 REVERSIBEL ANTAGONISME KOMPETITIF
Kita mulai dengan meneliti bagaimana antagonis kompetitif reversibel
(misalnya, atropin) mengubah hubungan konsentrasi-respon untuk tindakan
agonis (misalnya, asetilkolin). Sekarang ditemukan eksperimental bahwa
kehadiran antagonis seperti menyebabkan log konsentrasi-respon kurva untuk
agonis akan bergeser ke kanan, sering tanpa perubahan kemiringan atau respon
maksimal. Antagonisme ini diatasi, umumnya melalui berbagai konsentrasi
antagonis, sebagai diilustrasikan pada Gambar 1.16.
Luasnya pergeseran paling dinyatakan sebagai rasio konsentrasi, * yang
didefinisikan sebagai faktor dimana konsentrasi agonis harus ditingkatkan untuk
mengembalikan respon yang diberikan di hadapan dari antagonis. Perhitungan
rasio konsentrasi dilakukan sebagai berikut. Pertama, tertentu besarnya respon
yang dipilih. Hal ini sering 50% dari maksimum dicapai, tetapi pada prinsipnya
nilai apapun yang akan dilakukan; ** 40% telah diambil dalam ilustrasi. Dengan
tidak adanya antagonis, ini respon ditimbulkan oleh konsentrasi agonis, [A].
Ketika antagonis hadir, agonis konsentrasi harus ditingkatkan dengan faktor r
(yaitu, r[A]). Dengan demikian, untuk konsentrasi antagonis [B]3 pada Gambar
1.16, rasio konsentrasi r3 = r3[A]/[A]). Logaritma negatif dari konsentrasi
antagonis yang menyebabkan rasio konsentrasi x biasanya dilambangkan dengan
pax. Istilah ini diperkenalkan oleh H.O. Schild sebagai ukuran empiris dari
aktivitas antagonis. Nilai yang paling sering dikutip adalah pA2, di mana
* Atau dosis rasio - kedua istilah yang digunakan.
** Jelas itu masuk akal untuk menghindari ujung ekstrim dari jangkauan.
Rasio konsentrasi juga dapat diperkirakan dengan menggunakan leastsquares
Prosedur minimalisasi agar sesuai dengan persamaan Hill (lihat Bagian 1.2.2 dan
1.2.4.3), atau beberapa fungsi lain yang cocok, untuk masing-masing kurva
konsentrasi-respon. Hal ini juga memungkinkan paralelisme dari kurva yang akan
dinilai. Lebih lanjut kemungkinan adalah untuk cocok untuk semua kurva (yaitu,
dengan dan tanpa antagonis) bersamaan dengan mengasumsikan bahwa
persamaan Gaddum memegang (lihat halaman berikutnya) dan dengan
memanfaatkan persamaan Hill, atau fungsi lain, untuk berhubungan aktivasi
reseptor untuk diukur respon jaringan.
pA2 = -log [B] r = 2
Untuk menggambarkan notasi ini kita mempertimbangkan kemampuan
atropin untuk memblokir reseptor muscarinic untuk asetilkolin. Kehadiran atropin
pada konsentrasi hanya 1 nM membuat perlu untuk melipatgandakan konsentrasi
asetilkolin yang dibutuhkan untuk mendapatkan respon submaximal tertentu tisu.
Oleh karena itu, pA2 = 9 untuk tindakan ini atropin (-log (10-9) = 9).
Kami selanjutnya melihat mengapa pergeseran paralel dalam kurva terjadi,
dan pada saat yang sama kita akan memperoleh hubungan sederhana namun yang
paling penting antara jumlah shift, seperti yang diungkapkan oleh rasio
konsentrasi, dan konsentrasi antagonis. Kami akan menganggap bahwa untuk
kesederhanaan ketika jaringan terkena agonis dan antagonis pada saat yang sama,
kedua obat datang dalam keseimbangan dengan situs mengikat reseptor. Pada saat
tertentu, sebuah situs individu dapat ditempati oleh salah satu agonis atau
antagonis molekul, atau mungkin kosong. Relatif proporsi dari total populasi situs
mengikat ditempati oleh agonis dan antagonis diatur, seperti Langley duga (lihat
Pendahuluan (Bagian 1.1)), dengan konsentrasi agonis dan antagonis dan dengan
afinitas dari situs masing-masing. Karena agonis dan antagonis mengikat
reversibel, meningkatkan konsentrasi agonis akan meningkatkan proporsi situs
diduduki oleh agonis, dengan mengorbankan antagonis hunian. Oleh karena itu,
respons akan menjadi lebih besar.
Hukum aksi massa pertama kali diterapkan pada antagonisme kompetitif
dengan Clark, Gaddum, dan Schild pada waktu sebelum pentingnya aktivasi
reseptor dengan isomerisasi didirikan. Itu diasumsikan, karena itu, bahwa
keseimbangan antara agonis, antagonis, dan mengikat bersama mereka situs dapat
diwakili cukup hanya dengan reaksi:
A + R AR
B + R BR
Seperti ditunjukkan dalam Bagian 1.5.5, penerapan hukum aksi massa
terhadap kesetimbangan simultan mengarah pada ekspresi berikut untuk proporsi
dari situs mengikat ditempati oleh agonis:
PAR = (1.48)
Di sini, KA dan KB adalah konstanta kesetimbangan disosiasi untuk
pengikatan agonis dan antagonis, masing-masing. Ini adalah persamaan Gaddum,
dinamai J. H. Gaddum, yang pertama untuk mendapatkan dalam konteks
antagonisme kompetitif. Perhatikan bahwa jika [B] diatur ke nol, kita memiliki
Bukit-Langmuir Persamaan (Bagian 1.2.1).
Jika, sebaliknya, kita mengambil sebagai titik awal mekanisme Castillo-
Katz del untuk aktivasi reseptor (Lihat Persamaan (1.7)), tiga kesetimbangan
harus dipertimbangkan:
KA E
A+R AR AR*
Menerapkan hukum aksi massa (lihat Bagian 1.5.5), kita memperoleh
ekspresi berikut untuk proporsi reseptor dalam keadaan aktif:
PAR* = (1.49)
Di sini, KA dan E sebagaimana disebutkan dalam Pasal 1.2.3, dan KB,
seperti sebelumnya, adalah konstanta untuk kombinasi antagonis dengan situs
pengikatan kesetimbangan disosiasi. Jika [B] diatur ke nol, kita punya persamaan.
(1,32).
Persamaan (1,48) dan (1,49) mewujudkan hukum yang Langley
menyimpulkan harus berhubungan jumlah dari "senyawa" ia mendalilkan dengan
konsentrasi agonis dan antagonis (lihat Bagian 1.1). Namun, dalam rangka untuk
menerapkan hukum ini untuk masalah praktis memahami bagaimana kompetitif
antagonis akan mempengaruhi respon terhadap agonis, kita perlu membuat
beberapa asumsi tentang hubungan antara respon dan proporsi reseptor aktif.
Gaddum dan Schild diakui bahwa cara terbaik untuk melanjutkan adalah untuk
menganggap bahwa respon yang sama (katakanlah, 30% dari maksimum dicapai)
berhubungan dengan aktivasi reseptor yang sama dengan agonis apakah agonis
bertindak sendiri atau pada konsentrasi tinggi di hadapan antagonis kompetitif.
asumsi ini membuat tidak perlu untuk mengetahui bentuk yang tepat dari
hubungan antara aktivasi reseptor dan respon. Ini adalah kemajuan yang paling
penting, namun yang jelas mungkin tampak pada melihat ke belakang.
Kita sekarang dapat mempertimbangkan sebuah percobaan di mana respon
tertentu (misalnya, 30% dari maksimum) ditimbulkan pertama dengan konsentrasi
agonis, [A], bertindak sendiri dan kemudian dengan konsentrasi yang lebih besar
(r [A]), jika A diterapkan di hadapan antagonis. Di sini, r adalah rasio konsentrasi,
sudah didefinisikan. Karena Par * diasumsikan sama dalam dua situasi, kita
kemudian dapat menulis, dari Persamaan. (1.49): *
Di sini, sisi kiri memberikan fraksi reseptor dalam keadaan aktif ketika A
diterapkan pada perusahaan sendiri. Fraksi ini diasumsikan sama ketika respon
identik ditimbulkan dengan menerapkan agonis pada peningkatan konsentrasi (r
[A]) di hadapan antagonis pada konsentrasi [B] (sisi kanan dari persamaan).
Membagi setiap istilah di sisi kanan dengan r, kita memiliki:
Jika ekspresi di sebelah kiri dan kanan untuk mengambil nilai yang sama,
persamaan berikut harus memegang:
Oleh karena itu,
Ini adalah persamaan Schild, yang pertama kali dinyatakan dan diterapkan
pada studi antagonisme kompetitif dengan HO Schild pada tahun 1949. Ini
mungkin hubungan kuantitatif yang paling penting dalam farmakologi dan telah
terbukti berlaku untuk tindakan banyak antagonis kompetitif atas berbagai
konsentrasi. Meskipun awalnya berasal berdasarkan skema sederhana untuk
aktivasi reseptor dijelaskan dalam Bagian 1.2.1 dan 1.2.2, memegang sama untuk
del Castillo-Katz skema, seperti yang kita baru saja menunjukkan, serta untuk
model yang lebih kompleks di mana reseptor adalah konstitutif aktif.
Salah satu prediksi dari persamaan Schild adalah bahwa antagonis
kompetitif reversibel harus menyebabkan pergeseran paralel dalam log agonis
kurva konsentrasi-respon (seperti yang diilustrasikan pada Gambar 1.16; lihat juga
Gambar 1.18). Hal ini karena jika persamaan memegang, rasio konsentrasi,r,
Ditentukan hanya dengan nilai-nilai [B] dan KB , Terlepas dari konsentrasi dan
bahkan identitas agonis (asalkan bertindak melalui reseptor yang sama seperti
antagonis). Dengan logaritmik skala, nilai konstan r sesuai dengan pemisahan
konstan konsentrasi-respon kurva, yaitu, paralelisme, karena log ( r [A]) - log [A]
= log r + Log [A] - log [A] = log r , apa pun nilai [A].
Mungkin aplikasi yang paling penting dari persamaan Schild adalah bahwa
ia menyediakan cara memperkirakan konstanta kesetimbangan disosiasi untuk
kombinasi antagonis dengan nya situs pengikatan. Serangkaian agonis kurva
konsentrasi-respon didirikan, fi rst tanpa dan kemudian dengan meningkatnya
konsentrasi antagonis ini, dan diuji untuk paralelisme. Jika kondisi ini terpenuhi,
nilai ( r- 1) diplot terhadap konsentrasi antagonis, [B]. Ini harus memberikan garis
lurus dengan kemiringan sama dengan kebalikan dari KB.
Lebih biasanya, keduanya (r- 1) dan [B] diplot pada skala logaritmik (yang
Schild petak). Itu hasil harus menjadi garis lurus dengan kemiringan kesatuan, dan
mencegat di x sumbu menyediakan perkiraan log KB. Dasar pernyataan ini dapat
dilihat dengan mengekspresikan persamaan Schild dalam bentuk logaritmik :
log(rŔ 1) = log[B] Ŕ log KB```
(1.51)
Sebuah plot Schild (berdasarkan hasil eksperimen siswa kelas pada efek
atropin pada respon kontraktil hamster ileum ke asetilkolin) ditunjukkan pada
Gambar 1.17. Perhatikan bahwa garis lurus, dan kemiringannya dekat dengan
persatuan, seperti Pers. (1.51) memprediksi.
GAMBAR 1.17 Schild plot untuk aksi atropin dalam pertentangan aksi asetilkolin
pada kelinci-babi ileum. Setiap titik memberikan mean ± standard error dari mean
dari jumlah observasi ditampilkan.
Bagaimana mungkin nilai pA2 ditafsirkan dalam istilah-istilah ini? Jika
persamaanSchild dipatuhi, pA 2 kemudian memberikan perkiraan-log KB , Karena,
dari Persamaan. (1.51):
Istilah pKB bsering digunakan untuk menunjukkan-log KB.*
Untuk meringkas ke titik ini, antagonisme kompetitif reversibel memiliki
karakteristik sebagai berikut :
1. Tindakan antagonis dapat diatasi oleh suffi peningkatan koefisien dalam
konsentrasi agonis (yaitu, antagonisme ini dpt diatasi).
2. Di hadapan antagonis, kurva berkaitan log dari konsentrasi agonis dengan
ukuran respon digeser ke kanan secara paralel.
3. Hubungan antara besarnya pergeseran (seperti yang diungkapkan oleh
konsentrasi rasio) dan konsentrasi antagonis mematuhi persamaan Schild
1.5.3 APLIKASI PRAKTIS DARI STUDI REVERSIBEL KOMPETITIF
ANTAGONISME
Penelitian kuantitatif antagonisme kompetitif dengan metode yang baru saja
dijelaskan memiliki kegunaan penting:
1. The identifikasikation dan karakterisasi reseptor. Mengukur nilai KB untuk
aksi antagonis kompetitif baik ditandai dapat memungkinkan identifikasifi
kation dari jenis tertentu dari reseptor dalam persiapan jaringan atau sel.
Misalnya, jika jaringan adalah ditemukan untuk menanggapi asetilkolin, dan
jika respon antagonized oleh atropin dengan ap KB nilai sekitar 9, maka
reseptor yang terlibat cenderung muscarinic. Sebaiknya, lebih dari satu
antagonis harus digunakan, yang dapat memungkinkan subtipe reseptor untuk
diidentifikasikanfied. Misalnya, jika respon hanya disebutkan diblokir oleh
antagonis muscarinic pirenzepine dengan pKB dari 7,9-8,5, dan nilai yang
sesuai untuk antagonis himbacine ditemukan menjadi 7-7,2, maka reseptor ini
sangat mungkin dari M1 subtipe.
2. Penilaian antagonis kompetitif baru. Prosedur yang dikembangkan oleh
Gaddum dan Schild amat berharga bagi pengembangan antagonis kompetitif
baru. Contohnya termasuk H2 antagonis reseptor seperti cimetidine yang
mengurangi lambung sekresi asam (lihat di bawah), dan 5HT 3 antagonis
reseptor seperti ondansetron, yang dapat mengontrol mual dan muntah yang
disebabkan oleh obat sitotoksik. ini kompetitif antagonis, dan lain-lain, yang
ditemukan oleh pemeriksaan yang cermat dari hubungan antara struktur kimia
dan aktivitas biologis, sebagaimana dinilai oleh metode Gaddum dan Schild.
Memiliki ukuran yang dapat diandalkan perubahan affinity akibat
memodifikasi struktur kimia obat yang potensial memberikan ahli kimia obat
dengan kuat alat untuk menemukan senyawa dengan aktivitas yang lebih besar
dan selectivit.
3. Klasifikasi agonis. Pada pandangan pertama, ini mungkin tampak sebuah
aplikasi mengejutkan dari metode yang dikembangkan terutama untuk studi
antagonis. Namun, ingat bahwa hanya
* Perbedaan antara pKB dan pA2 halus tetapi dapat menjadi penting. pA2,
Sebagai Schild defined itu, merupakan empiris mengukur dari aksi antagonis,
tanpa mengacu pada teori. Hal ini dapat diukur apakah prediksi Schild persamaan
telah dipenuhi. Dengan demikian, mencegat dari plot Schild pada absis
memberikan perkiraan pA2 bahkan jika kemiringan garis tidak kesatuan. Namun,
jika garis adalah memadai defined eksperimen dan lurus (tapi memiliki
kemiringan yang tidak kesatuan, meskipun tidak berbeda signifi signifikan dari
itu), maka itu adalah umum, dan tepat, untuk membatasi lereng untuk persatuan.
Itu mencegat pada absis kemudian memberikan perkiraan bukan dari pA2 tapi pKB
, Sebagai defined atas. pKB dan pA2 bertepatan hanya jika lereng adalah persis
kesatuan dan tidak ada faktor rumit yang hadir. Jika kemiringan plot Schild
berbeda signifi signifikan dari kesatuan, sehingga persamaan Schild tidak
tahan,KB tidak dapat diperkirakan.
GAMBAR 1.18 Tanggapan hamster ileum untuk histamin (H) dan
pyridylethylamine (P) dalam ketiadaan dan Kehadiran diphenhydramine (D, pada
3,3 ng / ml). Pergeseran yang sama dalam baris (dari H ke H + D dan dari P ke P
+ D) menunjukkan bahwa kedua agonis bertindak pada reseptor yang sama. (Dari
Arunlakshana, O. dan Schild, H. O., Br.J. Pharmacol, 14, 48-58, 1959).
Rasio konsentrasi agonis muncul dalam persamaan Schild, bukan nilai yang
sebenarnya dari konsentrasi. Maka, agar antagonis kompetitif diberikan bertindak
difixed konsentrasi, rasio konsentrasi harus sama untuk semua agonis bertindak
melalui reseptor di mana antagonis bertindak. Jadi adalah mungkin untuk menguji
apakah suatu agonis baru bertindak pada reseptor yang diberikan oleh memeriksa
apakah rasio konsentrasi adalah sama untuk Novel agonis seperti itu untuk agonis
baik ditandai dikenal untuk bertindak di reseptor itu. Gambar 1,18, dari karya
Arunlakshana dan Schild, menggambarkan pendekatan. Hal ini dapat dilihat
bahwa diphenhydramine antagonis kompetitif, yang bertindak di H1-reseptor,
menyebabkan persis pergeseran yang sama (yaitu, rasio konsentrasi yang sama)
log konsentrasi kurva tion-respon untuk pyridylethylamine seperti untuk histamin.
Hal ini sangat menyarankan bahwa pyridylethylamine bertindak melalui reseptor
yang sama seperti histamin, meskipun hampir 100 kali lebih aktif sebagai agonis.
Penerapan prinsip-prinsip ini juga digambarkan oleh karya klasik JW Hitam
dan rekan, yang menyebabkan penemuan fiantagonis kompetitif rst bertindak di
H2-reseptor untuk histamin. Meskipun tujuan utama dari penelitian ini adalah
untuk mengembangkan senyawa yang akan mengurangi sekresi asam lambung
pada penyakit, banyak pekerjaan dilakukan tidak dengan jaringan sekretori tetapi
dengan dua terisolasi persiapan jaringan: hamster atrium dan uterus tikus. Ini
dapat digunakan karena mereka terbukti memiliki reseptor histamin dari jenis
yang sama (H2) Seperti dalam sekresi asam lambung. Juga, mereka tanggapan
terhadap histamin (tingkat peningkatan kontraksi atrium dan relaksasi rahim tikus)
yang lebih mudah diukur daripada yang sekresi lambung. Hal ini memungkinkan
sejumlah besar senyawa yang akan diuji.
Hasil yang sukses termasuk sintesis burimamide, yang first H2-receptor
antagonist untuk diuji pada manusia. Tabel 1.1 membandingkan kemampuannya
untuk memusuhi tindakan tiga agonis pada hamster atrium: histamin, 4
methylhistamine, dan 2-methylhistamine. Itu KB nilai-nilai yang hampir sama,
meskipun potensi yang berbeda-beda dari agonis, menunjukkan bahwa ketiga
agonis yang bertindak melalui reseptor yang sama (lihat butir 3 dalam daftar di
atas).
Tabel 1.2 menunjukkan bahwa nilai KB untuk blokade oleh burimamide dari
aksi histamin pada rahim tikus hampir sama seperti untuk hamster atrium, seperti
yang diharapkan jika reseptor dalam dua jaringan yang sama (lihat butir 1 dalam
daftar di atas). Sebaliknya, ketika burimamide diuji untuk tindakan penghambatan
terhadap H1-dimediasi tindakan kontraktil histamin pada hamster ileum,
ditemukan menjadi sekitar 40 kali lipat kurang aktif (sebagaimana dinilai oleh
jelas KB value). Selain itu, karakteristik penghambatan tidak lagi serupa dengan
prediksi antagonisme kompetitif. Dengan demikian, kemiringan plot Schild,
sebesar 1,32, adalah signifisignifikan lebih besar daripada satu. Selanjutnya,
ketika burima-mide telah diuji terhadap carbachol (karbamoil kolin), yang juga
kontrak guinea-pig ileum.
TABEL 1.1 Perbandingan Antagonisme dengan Burimamide dari
Tindakan
Histamin dan Dua Agonis Terkait di Guinea-Pig Atria.
Agonis
Histamine
4-Methylhistamine
2-Methylhistamine
EC50 pada Guinea Pig-
Atria (µM)
1.1
3.1
19.8
Disosiasi Equilibrium
Konstan (KB) untuk
blokir
Burimamide
(µM)
7.8
7.2
6.9
Sumber: Dari Black, JW et al, Nature, 236, 385-390, 1972
TABEL 1.2 Perbandingan Kemampuan Burimamide untuk Menghalangi
Tindakan Histamin di Guinea-Pig (G.-P.) ileum dan Atrium pada rat uterus
Jaringan
G.-P.atrium
(H2)
Rat uterus (H2)
G.-P.ileum (H1)
G.-P. ileum
agonis
Histamine
Histamine
Histamine
Carbachol
ns
(kemiringan Schild
Plot)
0.98
0.96
1.32
1.44
Jelas Disosiasi
Equilibrium
Konstan (KB) untuk
Pemblokiran Aksi
Burimamide
(µM)
7.8
6.6
288
174
Sumber: Dari Black, JW et al, Nature, 236, 385-390, 1972
GAMBAR 1.19 plot Schild untuk antagonisme noradrenalin oleh phentolamine,
terisolasi di membran cat. Nilai-nilai diplot adalah sarana (± SE) selama empat
sampai lima percobaan. Tertutup lingkaran, denervated membran pengerjap,
lingkaran terbuka, membran normal, b menunjukkan lereng. Kemiringan nilai
untuk membran normal dihitung untuk tiga konsentrasi terendah dan dua
konsentrasi tertinggi dari phentolamine. (Dari Furchgott, RF, Handbook of
Experimental Farmakologi, Vol. 23, 1972, hlm 283-335, berdasarkan hasil
Langer, SZ dan Trendelenburg, U., J. Pharmacol. Exp. Ther., 167, 117-142,
1969.)
Temuan ini menyarankan penjelasan dalam hal kehadiran di normal tetapi
tidak otot denervated dari mekanisme pengambilan neuronal (uptake1) untuk
noradrenalin. Proses ini serapan bisa sangat efektif sehingga, ketika noradrenalin
ditambahkan ke cairan mandi, konsentrasi dicapai di pedalaman persiapan
(terutama jika itu adalah relatif tebal) mungkin jauh kurang dari itu diterapkan.
Sebagai berdifusi noradrenalin di, sebagian diambil oleh saraf adrenergik,
sehingga gradien konsentrasi besar dipertahankan. Sehubungan dengan hal ini,
blokade uptake1 (misalnya, dengan kokain) dapat sangat mempotensiasi aksi
noradrenalin, seperti digambarkan secara skematik pada Gambar 1.20. Garis
paling kiri penuh menunjukkan kontrol kurva konsentrasi-respon untuk jaringan
adrenergically diinervasi. Garis putus-putus (ekstrim kiri) merupakan konsekuensi
dari menghalangi proses penyerapan, konsentrasi yang lebih rendah dari
noradrenalin sekarang cukup untuk mendapatkan respon yang diberikan * Garis
penuh pada sebelah kanan menunjukkan perpindahan kurva kontrol yang
disebabkan oleh penerapan phentolamine. , dan garis putus-putus hanya untuk kiri
menggambarkan efek memblokir penyerapan ketika phentolamine hadir.
Perhatikan bahwa garis putus-putus ini lebih dekat ke garis penuh daripada yang
terlihat dengan sepasang kurva di sebelah kiri. Hal ini karena pengaruh serapan
(yang merupakan proses saturable) pada konsentrasi lokal noradrenalin akan
secara proporsional lebih kecil ketika konsentrasi noradrenalin besar diterapkan,
seperti yang diperlukan untuk mengembalikan respon di hadapan phentolamine.
Oleh karena itu, rasio konsentrasi akan lebih besar jika uptake1 kurang, seperti di
jaringan kronis denervated.
contoh 2
Gambar 1.21, seperti Gambar 1.19, menunjukkan dua plot Schild, salah
satunya (lingkaran terbuka) berangkat sangat dari perilaku yang diharapkan.
Penyimpangan terjadi ketika noradrenalin adalah agonis dan lagi dapat
dipertanggungjawabkan dalam hal pengurangan konsentrasi lokal yang
disebabkan oleh proses uptake1
GAMBAR 1.20 kurva konsentrasi-respon hipotetis untuk menggambarkan
bagaimana proses uptake1 dapat mempengaruhi studi tentang antagonisme
noradrenalin oleh phentolamine. Dua baris penuh menunjukkan respon terhadap
noradrenalin, pertama dalam ketiadaan dan kemudian di hadapan phentolamine.
Jika percobaan ini diulang, tapi dengan proses serapan diblokir, garis putus-putus
akan diperoleh. Noradrenalin telah menjadi lebih aktif, dan phentolamine
sekarang menyebabkan pergeseran besar (bandingkan panjang dari dua panah
horisontal), seperti yang dijelaskan dalam teks.
Penyimpangan dari perilaku yang diharapkan juga akan terlihat saat
antagonis memiliki tindakan tambahan pada konsentrasi diperiksa. Contoh
disediakan oleh kemampuan reversibel tubocurarine antagonis kompetitif untuk
memblokir saluran ion yang terbuka saat reseptor nicotinic diaktifkan. Hal ini
dijelaskan dalam Bab 6, seperti komplikasi diperkenalkan oleh kehadiran pada
seperti saluran ion ligand-gated dari dua situs agonis mengikat yang mungkin atau
mungkin tidak memiliki afinitas yang sama untuk antagonis. Nonlinier Schild plot
dapat muncul dalam banyak cara lain. Salah satu penyebab adalah kegagalan
untuk memberikan waktu yang cukup untuk antagonis untuk mencapai
kesetimbangan dengan reseptor. Sebagaimana dibahas di Bagian 1.3.2, tingkat di
mana ligan menyeimbangkan dengan situs mengikat menjadi lebih lambat pada
konsentrasi yang lebih rendah (lihat Gambar 1.3). Oleh karena itu, jika paparan
yang terlalu pendek, rasio konsentrasi akan proporsional rendah pada konsentrasi
tersebut, dan plot Schild akan lebih tinggi di daerah ini dari yang diperkirakan.
Nonlinier Schild plot juga bisa terjadi ketika respon jaringan yang ditengahi oleh
lebih dari satu reseptor dengan afinitas yang berbeda untuk antagonis. Komplikasi
ini, dan beberapa lainnya, telah dijelaskan oleh TP Kenakin, yang account rinci
tentang analisis antagonisme kompetitif dianjurkan (lihat bagian Bacaan lebih
lanjut).
GAMBAR 1.21 Schild plot untuk antagonisme dengan propranolol dari tindakan
noradrenalin (lingkaran terbuka) dan isoprenalin (lingkaran tertutup) pada
kekuatan kontraktil atrium terisolasi marmot. × menunjukkan nilai yang diperoleh
dengan noradrenalin sebagai agonis tetapi dengan adanya kokain (20 M). (Dari
Furchgott, RF, Buku Pegangan Farmakologi Eksperimental, Vol 23, 1972, hlm
283-335, Berdasarkan hasil Berkedip, JR, Ann NY Acad Sci, 139, 673-685,
1967).
1.5.5 LAMPIRAN BAGIAN 1.5: PENERAPAN HUKUM MASSA AKSI
UNTUK ANTAGONISME KOMPETITIF REVERSIBEL
Analisis klasik antagonisme kompetitif, menyusul Gaddum dan Schild. Kita
mulai dengan asumsi bahwa baik agonis (A) dan antagonis (B) bergabung dengan
situs mereka mengikat menurut hukum aksi massa dan dengan cara yang dapat
diwakili oleh dua reaksi
Tugas kita adalah untuk mengetahui bagaimana proporsi reseptor ditempati
oleh agonis bervariasi dengan konsentrasi agonis dan antagonis. Equilibrium
diasumsikan. Menerapkan hukum aksi massa memberikan:
Antagonisme kompetitif di del Castillo skema-Katz untuk aktivasi reseptor
(lihat Bagian 1.2.3, Persamaan. (1,7)).
Reseptor isomerisasi ke bentuk aktif terjadi ketika situs pengikatan ditempati
oleh A tetapi tidak oleh antagonis B:
Menerapkan hukum aksi massa untuk masing-masing tiga kesetimbangan, kita
memiliki :
Seperti dalam Bagian 1.2.1, persamaan ini dapat ditulis ulang dalam hal
proporsi situs mengikat yang bebas (pR) atau diduduki oleh salah A (PAR) atau B
(pBR):
Sebuah reseptor individu baik kosong atau diduduki oleh agonis atau
antagonis molecule.Hence,
Kita perlu tahu Par, jadi kita gunakan Pers. (1,52) dan (1,53) untuk
menggantikan pR dan pBR dalam Pers. (1.54):
Di mana KB adalah konstan untuk kombinasi B dengan situs pengikatan
kesetimbangan disosiasi, dan KA dan E sebagai didefinisikan sebelumnya.
Persamaan ini dapat ditulis dalam bentuk pecahan reseptor dalam kondisi yang
berbeda:
Menjumlahkan fraksi reseptor, kita memiliki:
Mengganti mendapatkan PAR * memberikan:
1.6 TINDAKAN HAMBAT AT RESEPTOR: II. DIATASI ANTAGONISME
1.6.1 IREVERSIBEL ANTAGONISME KOMPETITIF
Dalam bentuk antagonisme obat, antagonis membentuk kombinasi bersama
abadi atau bahkan ireversibel dengan baik situs pengikatan agonis atau wilayah yang
berhubungan dengan itu sedemikian rupa sehingga agonis dan antagonis molekul
tidak dapat terikat pada waktu yang sama. Ireversibel dalam konteks ini berarti bahwa
pemisahan antagonis dari tempat ikatannya sangat lambat dalam kaitannya dengan
durasi aplikasi agonis. Ini merupakan kualifikasi penting karena laju disosiasi dapat
sangat bervariasi dari antagonis ke antagonis. Untuk beberapa, jam atau bahkan
berhari-hari mungkin diperlukan sehingga tidak ada penurunan berarti dalam hunian
selama 60 detik atau lebih yang agonis mungkin diterapkan. Orang lain mungkin
memisahkan lebih cepat dan surmountability blok kemudian akan tergantung pada
berapa lama agonis hadir dan juga pada seberapa baik respons terhadap agonis
dipertahankan dalam jaringan tertentu. Dalam kondisi fisiologis, agonis alami
(misalnya, neurotransmitter) dapat hadir untuk waktu yang sangat singkat memang -
hanya milidetik atau kurang untuk asetilkolin dilepaskan dari ujung saraf motorik
pada otot rangka. Ini tidak mungkin cukup lama untuk memungkinkan penurunan
yang cukup dalam reseptor hunian oleh antagonis kompetitif seperti tubocurarine,
yang karenanya akan efektif ireversibel pada skala Timen ini. Namun, jika interaksi
antara asetilkolin dan tubocurarine dipelajari dengan cara farmakologis klasik, di
mana kedua agen diterapkan untuk waktu yang cukup untuk ekuilibrium yang akan
dicapai, tindakan memblokir kemudian menunjukkan semua karakteristik dari
antagonisme kompetitif reversibel (meskipun dengan tambahan fitur yang
tubocurarine juga blok saluran ion terbuka). Sebuah contoh dari antagonis ireversibel
dengan tindakan yang sangat panjang (biasanya banyak jam) adalah
phenoxybenzamine, yang menghambat α-adrenoseptor dan, kurang potently, reseptor
H1-histamin dan muscarinic. Strukturnya ditunjukkan di bawah ini. Juga
digambarkan adalah benzilylcholine mustard, blocker ireversibel sangat aktif dan
selektif reseptor muscarinic.
Kedua senyawa tersebut adalah β-haloalkylamines, yaitu, mereka mengandung
pengelompokan:
di mana X adalah atom halogen. Sekali dalam larutan berair, agen tersebut cyclize
membentuk ion ethyleneiminium tidak stabil (Gambar 1.22). * Ion ini cenderung
memiliki afinitas yang lebih besar dari molekul induk untuk situs mengikat reseptor,
karena ikatan ion sekarang dapat terbentuk. Ketika dermaga ion ethyleneiminium
dengan situs pengikatan, dua hasil yang mungkin. Salah satunya adalah bahwa
setelah interval pendek, yang memisahkan ion dari situs. Yang lain adalah bahwa
cincin ethyleneiminium terbuka untuk menciptakan perantara yang reaktif, dengan
konsekuensi bahwa ikatan kovalen antara molekul obat dan situs mengikat dapat
dibentuk. Akibatnya, reseptor menjadi dialkilasi, seperti digambarkan pada Gambar
1.22. **
Kelompok-kelompok yang dapat dialkilasi dengan cara ini meliputi-SH,-OH,
=NH, dan-COOH, namun tidak semua antagonis ireversibel bertindak dengan
membentuk ikatan kovalen. Beberapa orang mungkin "cocok" tempat pengikatan
dengan baik sehingga kekuatan gabungan dari jenis lain dari interaksi antarmolekul
(ion, hidrofobik, van der Waals, ikatan hidrogen) yang ikut bermain pendekatan yang
dari link kovalen.
1.6.2 BEBERAPA APLIKASI ANTAGONIS IREVERSIBEL
1.6.2.1 Reseptor Pelabelan
Alkilasi semacam itu diilustrasikan pada Gambar 1.22, tetapi menggunakan
ligan radiolabeled, menyediakan sarana pelabelan situs pengikatan (s) makromolekul
reseptor. *** Jaringan yang terkena antagonis berlabel cukup lama untuk
memungkinkan dikombinasikan dengan sebagian besar reseptor. Hal ini kemudian
dicuci dengan larutan ligan bebas sehingga terikat atau antagonis longgar terikat
dapat berdifusi pergi, meninggalkan (idealnya) hanya reseptor kovalen berlabel.
Sebuah pendekatan yang terkait adalah dengan menggunakan label foto-afinitas. Ini
adalah senyawa yang tidak hanya afinitas untuk reseptor tetapi juga milik mogok
untuk membentuk penyerapan berikut antara reaktif energi cahaya dengan panjang
gelombang yang tepat. Sensitivitas cahaya semacam ini sering dapat dicapai dengan
melampirkan kelompok azido (-N3) ke molekul obat. Label foto-afinitas yang
dihasilkan diperbolehkan untuk menyeimbangkan dengan tisu atau membran
persiapan, yang kemudian terkena cahaya yang kuat. Hasil (untuk azida) adalah
pembentukan nitrene sangat reaktif yang menggabungkan dengan segera struktur
yang berdekatan (termasuk, diharapkan, para
GAMBAR 1.22 alkilasi dari reseptor oleh β-haloalkylamine.
mengikat wilayah reseptor), untuk membentuk ikatan kovalen, sehingga "tagging"
tempat pengikatan (s). * Ini dapat memberikan langkah pertama menuju isolasi
reseptor.
1.6.2.2 Menghitung Reseptor
Jika antagonis dapat radiolabeled, prosedur umum yang sama dapat digunakan
untuk memperkirakan jumlah reseptor dalam jaringan utuh, sepanjang kegiatan-
kegiatan tertentu (misalnya, radioaktivitas dinyatakan dalam jumlah material) ligan
dikenal. Sebuah contoh awal adalah penerapan 125I-atau 131I-berlabel α-
bungarotoxin untuk menentukan jumlah reseptor nicotinic di wilayah endplate otot
rangka. Hal ini menunjukkan bahwa kelemahan otot yang mencirikan myasthenia
gravis, penyakit yang mempengaruhi transmisi impuls dari saraf motorik ke otot
rangka, hasil dari pengurangan jumlah reseptor nicotinic. Sebuah varian dari teknik,
menggunakan α-bungarotoxin berlabel dengan kelompok neon, memungkinkan
reseptor untuk bisa divisualisasikan dengan mikroskop cahaya.
1.6.2.3 Percobaan Perlindungan Receptor
Tingkat di mana antagonis ireversibel menginaktivasi reseptor akan dikurangi
dengan kehadiran simultan agonis reversibel atau antagonis kompetitif yang bertindak
di situs pengikatan yang sama. Agen reversibel, oleh situs pendudukan, menurunkan
jumlah ireversibel diblokir dalam suatu periode tertentu, reseptor dikatakan ini bisa
menjadi alat yang berguna untuk karakterisasi obat serta reseptor "dilindungi.".
Misalnya, RF Furchgott (yang memperkenalkan metode) menguji kemampuan tiga
agonis (noradrenalin, adrenalin, dan isoprenalin) untuk melindungi terhadap agen
alkylating dibenamine (senyawa phenoxybenzamine seperti) diterapkan pada strip
aorta kelinci. Setiap agonis dilindungi respon terhadap dua lainnya. Dengan
demikian, setelah jaringan telah terkena dibenamine dengan adanya konsentrasi besar
noradrenalin, diikuti oleh periode cuci bebas narkoba, adrenalin dan isoprenalin serta
noradrenalin masih bisa menyebabkan kontraksi. Sama paparan dibenamine sendiri
dihapuskan respon terhadap aplikasi berikutnya dari masing-masing agonis yang
sama. Hal ini memberikan bukti bahwa ketiga agonis menyebabkan kontraksi dengan
bertindak pada reseptor umum (sekarang mapan untuk menjadi subtipe α-
adrenoseptor), yang pasti pada saat itu.
Contoh lain dari perlindungan reseptor, tetapi menggunakan antagonis
kompetitif daripada agonis, disediakan oleh kemampuan tubocurarine untuk
memperlambat terjadinya aksi pemblokiran α-bungarotoxin pada sambungan
neuromuskuler. Perhatikan bahwa tingkat perlindungan reseptor akan tergantung
tidak hanya pada konsentrasi relatif dan kedekatan satu antagonis reversibel dan
ireversibel, tetapi juga pada waktu yang diizinkan untuk interaksi mereka dengan
reseptor, seperti dijelaskan dalam Bab 5. Mengingat waktu yang cukup, antagonis
sepenuhnya ireversibel akhirnya akan menempati semua situs mengikat, bahkan di
hadapan konsentrasi tinggi ligan reversibel.
1.6.3 PENGARUH ANTAGONIS KOMPETITIF TAK DAPAT DIUBAH PADA
TANGGAPAN UNTUK AGONIS
Sebuah eksposur yang memadai jaringan ke sebuah hasil antagonis ireversibel
dalam antagonisme diatasi - respon tidak dapat sepenuhnya pulih dengan
meningkatkan konsentrasi agonis, diterapkan untuk periode biasa. Hal ini karena situs
mengikat individu, sekali tegas ditempati oleh antagonis, adalah "keluar dari
bermain," berbeda dengan keseimbangan dinamis antara agonis dan antagonis yang
merupakan karakteristik dari antagonisme kompetitif reversibel. Oleh karena itu,
biasanya dalam pekerjaan dengan antagonis ireversibel yang membentuk ikatan
kovalen untuk menerapkan senyawa untuk cukup lama untuk itu untuk menempati
fraksi yang dibutuhkan dari situs mengikat, dan kemudian untuk mencuci jaringan
dengan larutan obat bebas sehingga terikat .
GAMBAR 1.23 Pengaruh paparan 10-menit untuk dua konsentrasi senyawa
phenoxybenzamine seperti, dibenamine (DB), pada respon kontraktil strip kelinci
aorta ke adrenalin (epinefrin). (Dari Furchgott, RF, Adv Drug Res.., 3, 21-55, 1966.).
antagonis dapat menyebar jauh. Perubahan respon terhadap agonis sekarang dapat
dipelajari. Hasil percobaan semacam ini diilustrasikan dalam Gambar 1,23 dan 1,24.
Keluarga kurva konsentrasi-respon pada Gambar 1.23 menunjukkan efek dari
agen alkilasi pada respon kontraktil kelinci aorta adrenalin. Perhatikan penurunan
respon maksimal, keberangkatan dari paralelisme, dan fakta bahwa waktu pemaparan
serta konsentrasi antagonis telah diberikan untuk masing-masing kurva.
Gambar 1.24 menggambarkan pengaruh antagonis ireversibel sama pada
kontraktil respon dari ileum guinea-babi untuk histamin. Garis penuh adalah kontrol
konsentrasi-respon kurva, dan garis putus-putus menunjukkan konsekuensi dari lima
eksposur berturut-turut untuk 1 M dibenamine, dengan pengujian histamin setelah
setiap eksposur. Sebuah fitur mencolok adalah bahwa aplikasi pertama dari antagonis
menyebabkan pergeseran hampir sejajar kurva. Hanya setelah aplikasi lebih lanjut
dari dibenamine melakukan respon maksimal menjadi lebih kecil dengan cara yang
diharapkan (bandingkan Gambar 1.23). yang paling penjelasan yang mungkin adalah
sebagai berikut. Meskipun aplikasi pertama dibenamine diblokir banyak reseptor,
cukup tetap untuk memungkinkan histamin (meskipun pada konsentrasi yang lebih
tinggi) untuk menghasilkan penuh respon. Hanya ketika jumlah reseptor telah
berkurang lebih jauh oleh berikutnya aplikasi dibenamine ada penurunan yang berarti
dalam respon maksimal dicapai. Itu Implikasinya adalah bahwa dalam jaringan ini,
tidak semua reseptor harus ditempati oleh histamin dalam rangka mendapatkan
respon maksimal. Akibatnya, reseptor cadang yang tersedia, dan jaringan dikatakan
memiliki cadangan reseptor untuk agonis ini. Ini tidak, tentu saja, berarti kita
memiliki dua jenis reseptor, cadang dan digunakan, reseptor tidak berbeda. Namun,
hanya beberapa harus diaktifkan untuk menyebabkan besar atau bahkan respon
maksimal. Hal ini dapat terjadi ketika respon dari jaringan dibatasi bukan oleh jumlah
reseptor aktif tetapi oleh satu atau lebih peristiwa yang mengikuti aktivasi reseptor.
Untuk Misalnya, pemendekan maksimal sepotong otot polos dapat terjadi sebagai
respon terhadap kenaikan kalsium sitosol yang jauh lebih sedikit daripada yang dapat
diperoleh dengan mengaktifkan semua reseptor.
Situasi ini berbeda dengan agonis parsial (lihat Bagian 1.4.1). Inaktivasi salah
satu reseptor, misalnya, dibenamine atau phenoxybenzamine sekarang akan
mengurangi respon maksimal terhadap agonis parsial, tanpa pergeseran paralel awal
dalam log kurva konsentrasi-respon yang akan terlihat (misalnya, Gambar 1,24)
dengan penuh agonis jika jaringan memiliki cadangan reseptor substansial.
Adanya cadangan reseptor dalam banyak jaringan memiliki implikasi bahwa
nilai EC50 untuk agonis penuh tidak dapat memberikan bahkan perkiraan perkiraan
konstan untuk kombinasi dari agonis dengan situs mengikat kesetimbangan disosiasi,
sebagaimana telah disebutkan, ketika respon setengah maksimal, hanya sebagian
kecil dari reseptor dapat ditempati.
GAMBAR 1.24 Pengaruh blokade reseptor progresif dengan dibenamine pada respon
hamster ileum untuk histamin. Lima eksposur berturut-turut untuk 1 M dibenamine,
masing-masing selama 10 menit, digunakan, dan respon terhadap histamin diuji
setelah setiap eksposur. Hasilnya dianalisis seperti yang dijelaskan dalam Bagian
1.6.4, dan nilai q terdaftar untuk setiap kurva memberikan perkiraan fraksi reseptor
tersisa diblokir. Kurva putus-putus dibangun dari aslinya, kurva pra-dibenamine
dengan menyisipkan dengan perkiraan q, dan juga nilai KA ditampilkan, ke dalam
persamaan yang diatur dalam Pasal 1.6.4 (yang melihat, bersama dengan diskusi
terkait). (Dari Furchgott, RF, Adv Res Narkoba, 3, 21-55, 1966; Berdasarkan data
yang diperoleh oleh ARIENS, EJ et al, Arch Int Pharmacodynamie, 127, 459-478,
1960).
50% digambarkan dalam Clark asumsi tentatif proporsionalitas langsung antara
hunian dan respon. Jadi, farmasi harus mencari pendekatan lain untuk menentukan
afinitas reseptor untuk agonis penuh. Salah satu kemungkinan disarankan oleh
ketersediaan antagonis kompetitif ireversibel, dan ini adalah topik berikutnya yang
harus dipertimbangkan.
1.6.4 BISA ANTAGONIS KOMPETITIF IREVERSIBEL DIGUNAKAN
UNTUK TEMUKAN KESETIMBANGAN DISOSIASI KONSTAN UNTUK
AGONIS?
Karakteristik perubahan (lihat Gambar 1.24) dalam bentuk dan posisi agonis
konsentrasi-hubungan respon disebabkan oleh terbatasnya eksposur jaringan untuk
antagonis ireversibel menyarankan cara yang mungkin untuk memperkirakan
kesetimbangan disosiasi konstan untuk agonis. Itu pertama kali dijelaskan oleh R.F.
Furchgott. Prosedur eksperimental adalah membandingkan konsentrasi agonis yang
diperlukan untuk menghasilkan respon yang dipilih (katakanlah, 40% dari
maksimum) sebelum dan sesudah jaringan telah terkena\ antagonis ireversibel. Dalam
jaringan segar, respons ini ditimbulkan oleh konsentrasi yang kami hadirkan
berdasarkan [A], setelah antagonis telah bertindak, ini harus ditingkatkan untuk [A] '.
Fraksi reseptor dibiarkan bebas setelah penerapan antagonis dilambangkan dengan q.
(Jika hanya 10% dari reseptor tetap diblokir, q akan menjadi 0,1.) Kita sekarang
bertanya apa hubungan akan diharapkan untuk terus antara [A], [A] ', dan q.
Pertanyaan ini akan didekati dengan dua cara. Pertama kita ikuti Furchgott dalam
mengambil sebagai titik awal model yang paling sederhana untuk agonis tindakan,
yaitu Hill dan Clark (lihat Bagian 1.2.1 dan 1.2.2). Meskipun kami telah melihat
bahwa skema ini kekurangan kegagalan untuk membedakan antara pekerjaan dan
aktivasi reseptor, itu termasuk untuk kepentingan sejarah. Pendekatan kedua
didasarkan pada lebih realistis, jika masih dasar, representasi aktivasi reseptor. Ini
adalah del Castillo Katz Model (lihat Bagian 1.2.3 dan 1.4.4-1.4.6). Penerapan
metode Furchgott untuk reseptor G-protein-coupled adalah secara singkat dalam
Bagian 1.10 (lihat jawaban Soal 1.3).
Pendekatan klasik, mengikuti Furchgott, dan didasarkan pada pandangan awal
bahwa semua reseptor ditempati oleh agonis diaktifkan: Pertama, kita ingat salah satu
dari dua definisi sebelumnya Par, proporsi situs mengikat diduduki oleh A:
Di sini, NAR adalah jumlah reseptor di mana A menempati tempat ikatannya,
dan N mengacu pada jumlah. Oleh karena itu,
dari persamaan Bukit-Langmuir. Setelah antagonis ireversibel telah bertindak,
N reducedn ke QN, dan konsentrasi yang lebih besar dari agonis, [A] ', sekarang
harus diterapkan untuk mencapai nilai yang sama seperti sebelumnya NAR:
Furchgott kemudian melanjutkan untuk berasumsi bahwa respon dari jaringan
sebelum dan sesudah penerapan antagonis yang sama (submaksimal) sesuai dengan
yang sama reseptor hunian oleh agonis. Oleh karena itu, ia disamakan:
Oleh karena itu, plot 1 / [A] terhadap 1 / [A] 'harus memberikan garis lurus
dengan kemiringan 1 / q dan intercept dari (1 - q) / q.KA. Nilai q diperoleh
dari timbal balik lereng, dan bahwa KAdari (kemiringan - 1) / mencegat.
Analisis berdasarkan del Castillo-Katz model aktivasi reseptor (lihat Bagia
1.2.3 dan 1.4.4): Fraksi reseptor dalam keadaan aktif didefinisikan oleh:
Di sini, NAR adalah jumlah reseptor di aktif (AR *) berupa total N. Oleh karena
itu,
dari Persamaan. (1,32). Setelah antagonis ireversibel telah bertindak, N direduksi
menjadi QN, dan konsentrasi yang lebih besar dari agonis, [A] ', diperlukan untuk
mencapai nilai yang sama dari NAR * seperti sebelumnya:
Kami selanjutnya berasumsi bahwa respon yang sama (submaksimal) dari
jaringan sebelum dan sesudah antagonis sesuai dengan jumlah yang sama, NAR *,
reseptor diaktifkan. Jadi kita menyamakan:
Oleh karena itu, plot 1 / [A] terhadap 1 / [A] 'harus memberikan garis lurus
dengan kemiringan 1 / q dan intercept dari:
Nilai q diperoleh dari kebalikan dari lereng, dan KA / (1 + E) dari (kemiringan -
1) / mencegat.
Menerapkan analisis di kolom kiri untuk hasil Gambar 1.24, Furchgott
diperkirakan K A menjadi 10 µM untuk kombinasi histamin dengan reseptornya. Dia
menggunakan gurasi ini, dan nilai-nilai q diperoleh sebagai hanya dijelaskan, untuk
membangun kurva putus-putus dalam gambar. Ketidakpastian ini dekat dengan titik
percobaan, yang tentunya sesuai dengan prediksi dari pendekatan diambil. Sama
seperti tentu, hal ini tidak memberikan bukti yang menentukan bahwa baik
eksperimental atau anggapan teoretis yang mendasari hal itu benar. Sebuah asumsi
penting, dan salah satu yang Difi ¬ kultus untuk menguji, adalah bahwa antagonis
ireversibel telah ada tindakan lain selain untuk menonaktifkan reseptor yang
diteliti. Apakah, misalnya, telah mengganggu satu atau lebih dari langkah-langkah
yang link reseptor aktivasi respon yang diamati, pendekatan akan menjadi tidak
valid. Furchgott kemudian menunjukkan bahwa ini bukan komplikasi di bawah
kondisi yang digunakan.
Melanjutkan Furchgottâ analisis percobaan Gambar 1.24, kita perhatikan
bahwa, dalam jaringan segar, konsentrasi histamin yang diperlukan untuk
menghasilkan kontraksi maksimal setengah adalah sekitar 180
nM. Nilai K A diperkirakan 10µM, sebagaimana telah kita lihat. Furchgott diganti
angka yang pasti di Hilla persamaan Langmuir untuk mendapatkan nilai untuk hunian
reseptor yang diperlukan untuk memperoleh setengah respon maksimal. Ini datang
hanya 0,0177, menunjukkan cadangan reseptor besar. Furchgottâ adalah langkah
menggunakan nilai ini untuk mendapatkan perkiraan EFI ¬ berikan advokasi
histamin, di arti digunakan oleh Stephenson. Karena respon setengah-maksimal,
œstimulusâ Sebagai Dei ¬ ned oleh Stephenson adalah kesatuan, sehingga, dari
Persamaan. (1,27), EFI ¬ berikan advokasi adalah 1/0.0177 = 57, nilai yang diberikan
dalam Gambar 1.24 (lihat juga Metode 3 dalam Bagian 1.4.8).
Validitas perkiraan tersebut dan penafsiran mereka, bagaimanapun, sangat
bergantung pada kesesuaian model untuk aktivasi reseptor yang analisis
didasarkan. Hal ini penting untuk menghargai bahwa memuaskan ï ¬ t â €
œtheoreticalâ (titik-titik) baris pada Gambar 1.24 tidak memungkinkan satu untuk
membedakan antara dua model tindakan reseptor (Hill dan Clark vs del Castilloâ €
"Katz) yang telah digunakan untuk menganalisis hasil ini. Kedua model membuat
persis sama tentang prediksi bentuk hubungan antara [A], [A]ř , dan q. Juga,
penafsiran nilai q adalah sama untuk setiap model. Apa yang berbeda, dan ini adalah
isu utama, adalah bahwa penerimaan konsep bahwa reseptor harus isomerize ke
bentuk aktif membawa implikasi bahwa Furchgottâ ireversibel Metode antagonis
menghasilkan perkiraan makroskopik kesetimbangan disosiasi konstan (K eff = K A /
(1 + E), lihat Bagian 1.4.4) daripada dari kesetimbangan mikroskopis
konstan, K A, untuk Langkah awal mengikat. Hanya jika E adalah sangat kecil dalam
kaitannya dengan kesatuan (yaitu, A merupakan agonis parsial sangat lemah)
apakah K eff perkiraan untuk K. Perhatikan juga, bahwa pengukuran radioligand
mengikat langsung (dalam tidak adanya desensitisasi dan setiap komplikasi lain) juga
akan menghasilkan perkiraan K eff dan tidak K A. Mencari K A membutuhkan jenis
lain dari pengukuran dan sejauh ini telah dicapai hanya untuk saluran ion ligand-
gated mana metode pencatatan single-channel memungkinkan mengikat dan langkah
aktivasi harus dibedakan, seperti dijelaskan pada Bab 6.
Kesadaran bahwa Furchgottâ metode antagonis ireversibel
memperkirakan K eff * daripada K A memiliki implikasi yang mendalam untuk
perhitungan EFI ¬ berikan advokasi Sebagai Stephenson. Seperti yang telah kita
hanya dilihat, percobaan Gambar 1.24, yang telah dianalisa oleh Furchgott, telah
menyarankan bahwa ketika histamin menyebabkan kontraksi setengah-maksimal
hamster ileum, hanya 1,77% dari reseptor ditempati. Mengingat pembahasan
sebelumnya, ada kemungkinan bahwa gurasi mengacu pada total reseptor hunian oleh
agonis yaitu, œoccupied tapi inactiveâ ditambah œoccupied dan active. Oleh karena
itu, nilai â dari 57 (Kebalikan dari 0,0177) untuk EFI ¬ berikan advokasi histamin
yang ditunjukkan pada Gambar 1.24 harus dianggap sebagai berdasarkan
Persamaan. (1.40) daripada Persamaan. (1.27), sebagai Furchgott semula
dibayangkan. Keterbatasan kegunaan ini dari EFI ¬ berikan advokasi, e *, telah
dibahas dalam Bagian 1.4.8.
1.6.5 REVERSIBLE NONCOMPETITIVE ANTAGONISM
Dalam varian ini antagonisme diatasi, antagonis bertindak dengan menggabungkan
dengan terpisahsitus penghambatan pada makromolekul reseptor. Agonis dan
antagonis molekul dapat terikat pada saat yang sama, meskipun reseptor menjadi aktif
hanya jika situs agonis saja diduduki (Gambar 1.25). Ini kadang-kadang disebut
sebagai alosterik atau allotopic antagonisme (lihat Lampiran1.6A [Bagian 1.6.7.1]
untuk komentar lebih lanjut mengenai hal ini).
GAMBAR 1,25 antagonisme tidak kompetitif. Sebuah reseptor bergaya membawa
dua situs, salah satunya dapat menggabungkan dengan agonis (A) dan yang lainnya
dengan antagonis (B). Empat kondisi yang mungkin, hanya satu yang (agonis situs
diduduki, situs antagonis kosong, lihat kanan atas) aktif.
Di hadapan konsentrasi cukup besar antagonis seperti itu, penghambatan akan
menjadi dapat diatasi, terlalu sedikit reseptor tetap bebas dari antagonis untuk
memberikan tanggapan penuh, bahkan jika semua situs agonis ditempati. Titik di
mana hal ini terjadi dalam jaringan tertentu akan tergantung pada jumlah reseptor
cadang, seperti halnya dengan antagonis kompetitif ireversibel (lihat Bagian 1.6.3.).
Jika agonis penuh digunakan dan jaringan yang memiliki cadangan reseptor besar,
efek awal dari reversibel antagonis nonkompetitif akan bergeser log concentrationâ
Kurva respons ke kanan. Akhirnya, bila tidak ada reseptor cadangan tetap, maksimum
akan berkurang. Sebaliknya, tanpa reseptor cadangan, antagonis akan menekan
maksimal dari awal.
Jika kita menerapkan hukum aksi massa untuk bentuk antagonisme, proporsi
hambat situs ditempati oleh antagonis akan diberikan oleh Hilla persamaan
Langmuir:
Oleh karena itu, proporsi bebas antagonis akan:
Kita sekarang membuat asumsi tambahan berikut: (1) Setiap makromolekul
reseptor membawa satu agonis dan satu antagonis (penghambatan) situs. (2)
Pekerjaan dari situs penghambatan oleh antagonis tidak mengubah baik affnity situs
lain agonis atau keseimbangan antara aktif dan negara tidak aktif reseptor menurut
del Castilloâ skema Katz;
Namun, jika antagonis terikat, tidak ada respon terjadi kemudian bahkan jika reseptor
telah diisomerisasikan kebentuk aktif. (3) affinity untuk antagonis tidak terpengaruh
oleh pengikatan agonis.
Berdasarkan asumsi tersebut agak luas dan tidak sepenuhnya realistis, * fraksi
reseptor di AR * negara diberikan oleh Persamaan. (1,32), namun hanya beberapa
agonis-gabungan,diisomerisasikan, makromolekul reseptor bebas antagonis dan
dengan demikian dapat memulai respon. Untuk
GAMBAR 1.26 Efek dari antagonis nonkompetitif reversibel pada respon terhadap
agonis, A. Setiap set kurva telah dibangun menggunakan Persamaan. (1,55) dan
menunjukkan efek dari empat konsentrasi antagonis (5, 20, 50, dan
300 µM). K A, K B, dan E telah diambil menjadi 1, 10, dan 50 µM, masing-
masing. Untuk (A), respon telah diasumsikan berbanding lurus dengan fraksi reseptor
dalam keadaan aktif. (B) memiliki telah dibangun dengan menggunakan nilai yang
sama, tapi sekarang mengasumsikan adanya cadangan reseptor besar. Kondisi ini
telah dimodelkan dengan mengandaikan bahwa hubungan antara respon, y, dan
proporsi reseptor aktif diberikan oleh y = 1,01 µ aktif / (0,01 + p aktif), sehingga
respon setengah-maksimal terjadi ketika hanya di bawah 1% dari reseptor diaktifkan.
mendapatkan proporsi (p aktif) dalam kondisi ini, kita cukup mengalikan fraksi di
negara * AR oleh fraksi bebas antagonis:
GAMBAR 1.26 menunjukkan log concentrationâ € "kurva respon ditarik sesuai
ungkapan ini. Di A, respon telah diasumsikan berbanding lurus dengan p aktif, tidak
ada reseptor cadangan. Di B, reseptor cadang telah dianggap ada, dan sesuai
kehadiran relatif konsentrasi rendah antagonis menyebabkan pergeseran hampir
sejajar sebelum maksimum berkurang.
Awal perpindahan hampir paralel kurva pada Gambar 1.26B menimbulkan
pertanyaan apakah persamaan Schild akan dipatuhi di bawah kondisi ini. Jika kita
mempertimbangkan dua konsentrasi agonis yang memberikan respon yang sama
sebelum dan selama tindakan antagonis ([A] dan r [A], masing-masing, di
mana r adalah rasio konsentrasi) dan ulangi derivasi diatur dalam Bagian 1.5.2 (tapi
menggunakan Persamaan. (1,55) daripada (1,49)), kami bahwa ekspresi setara dengan
persamaan Schild adalah:
Di sini, K eff adalah sebagai dalam Bagian 1.4.4. Jika r [A] / K eff << 1 (yaitu,
jika proporsi reseptor diduduki oleh agonis tetap kecil bahkan ketika konsentrasi
agonis telah ditingkatkan untuk mengatasi efek antagonis kompetitif reversibel),
ungkapan ini mendekati ke:
Oleh karena itu, persamaan Schild akan berlaku, meskipun di atas rentang yang
terbatas konsentrasi yang ditentukan oleh reseptor cadangan. Selain itu,
nilai K B diperoleh dalam kondisi seperti itu akan
GAMBAR 1.27 Kurva digambar menggunakan Persamaan. (1.57) untuk
menggambarkan pengaruh tiga konsentrasi saluran terbuka blocker, C, respon
terhadap agonis yang bekerja pada saluran ion ligand-gated. Nilai 100 nM dan 100
dan 10 µM diambil untuk K A, E, C dan K, masing-masing. Panah vertikal
menunjukkan konsentrasi agonis menyebabkan respon setengah-maksimal dalam
ketiadaan dan kehadiran C pada 50 µM.
memberikan perkiraan kesetimbangan disosiasi konstan untuk kombinasi antagonis
dengan situs mengikat.
Konsekuensinya adalah demonstrasi dari persamaan Schild memegang pada
rentang kecil Konsentrasi tidak boleh diambil sebagai bukti bahwa aksi antagonis
kompetitif. Jelas, selebar praktis berbagai konsentrasi antagonis harus diuji, terutama
jika ada bukti kehadiran reseptor cadang.
Buka Saluran Blok
Studi tindakan saluran ion ligand-gated telah dibawa ke cahaya yang menarik
dan penting varian dari antagonisme nonkompetitif reversibel. Telah ditemukan
bahwa beberapa antagonis hanya memblokir saluran-saluran yang terbuka dengan
memasukkan dan occluding saluran itu sendiri. Akibatnya, antagonis menggabungkan
hanya dengan reseptor diaktifkan. Contohnya termasuk blok reseptor nicotinic
neuronal oleh hexamethonium, dan N-methyl-D-aspartate (NMDA) reseptor oleh
dizocilpine (MK801).
Antagonis tersebut menyebabkan perubahan karakteristik dalam log
concentrationâ kurva respon untuk agonis. Berbeda dengan apa yang diamati dengan
jenis lain dari antagonisme sejauh dipertimbangkan, nilai [A] 50 akan menjadi lebih
kecil daripada yang lebih besar di hadapan antagonis. Ini diilustrasikan pada Gambar
1.27 dan paling baik dipahami dalam hal del Castilloâ mekanisme Katz. Memasukkan
kemungkinan bahwa antagonis, C, hadir yang menggabungkan speciï ¬ Cally dengan
reseptor aktif, kita memiliki:
Oleh karena itu, reseptor memiliki empat kondisi: R, AR, AR *, dan AR * C,
yang hanya satu, AR *, aktif. Skema ini memprediksi bahwa pada kesetimbangan
proporsi reseptor aktif diberikan oleh:
Di mana K c adalah kesetimbangan disosiasi konstan untuk
kombinasi C dengan diaktifkan reseptor, AR *. Persamaan ini telah digunakan untuk
menggambar kurva yang ditunjukkan pada Gambar 1.27. Perhatikan bagaimana
[A] 50 menurun sebagai konsentrasi antagonis meningkat. Akibatnya, kombinasi dari
antagonis dengan AR * menyebabkan pergeseran ke kanan pada posisi
kesetimbangan yang lainnya disajikan dalam Persamaan. (1.56).
Perhatikan juga, konvergensi pada konsentrasi agonis rendah kurva diplot pada
Gambar 1.27. Antagonis menjadi kurang aktif ketika respon kecil, karena ada sedikit
reseptor dalam AR * formulir yang tersedia untuk menggabungkan dengan C. Sekali
lagi, berbeda dengan jenis lain dari antagonisme yang telah dijelaskan, tidak ada
perpindahan paralel awal kurva (bahkan jika banyak cadangan reseptor yang hadir),
dan persamaan Schild tidak pernah dipatuhi.
Beberapa antagonis menggabungkan kemampuan untuk memblokir saluran ion
terbuka dengan tindakan kompetitif di atau dekat situs pengikatan agonis. Sebuah
contoh yang baik ditandai adalah blocker tubocurarine nicotinic (Lihat Bab
6). Agonis juga mungkin terbuka channel blockers, sehingga membatasi respon
maksimal bahwa mereka dapat menimbulkan. Agen tersebut (misalnya,
decamethonium) sehingga dapat berperilaku sebagai agonis parsial saat diuji pada
jaringan utuh. *
Skema diilustrasikan pada Gambar 1,25 mengasumsikan bahwa situs aksesori
adalah penghambatan. Sekarang diketahui bahwa beberapa agonis (misalnya,
glutamat) hanya dapat efektif dengan adanya ligan lain (Misalnya, glisin dalam kasus
reseptor NMDA untuk glutamat) yang mengikat ke situs sendiri di reseptor
makromolekul. Glutamat ini kemudian disebut sebagai agonis primer, dan glisin
sebagai co-agonis. Pada prinsipnya, antagonis dapat bertindak dengan bersaing
dengan baik agonis primer atau co-agonis.
1.6.6 A MORE GENERAL MODEL FOR THE ACTION OF AGONISTS, CO-
AGONISTS, AND ANTAGONISTS
Kesadaran bahwa banyak reseptor menunjukkan beberapa tingkat aktivitas
konstitutif (yaitu, mereka dapat isomerize ke keadaan aktif bahkan tanpa adanya
agonis) menunjukkan lebih umum dan pada saat yang sama model yang lebih fisik
realistis untuk aksi antagonis kompetitif. Sekarang diilustrasikan pada Gambar 1.28
dan dapat dianggap sebagai perpanjangan langsung dari skema untuk aktivitas
konstitutif diperkenalkan dalam Bagian 1.4.7 (lihat Gambar 1.11). Dua ligan, A dan
B, dapat mengikat ke situs yang berbeda pada reseptor sehingga pada prinsipnya
keduanya bisa hadir pada saat yang sama, seperti yang ditunjukkan pada Gambar
1.25, yang merupakan titik awal untuk diskusi kita tentang antagonisme
kompetitif. Skema pada Gambar 1.28 mencakup jangkauan yang lebih luas
kemungkinan dan juga memiliki jasa yang menunjukkan mekanisme molekuler tidak
hanya untuk antagonisme nonkompetitif tetapi juga, seperti yang akan kita lihat,
beberapa pola lain dari kerja obat. Konsep yang mendasarinya adalah bahwa zat yang
menggabungkan dengan situs aksesori (allotopic, alosterik) dapat diharapkan untuk
mengubah keseimbangan antara negara aktif dan tidak aktif dari reseptor sehingga
mempengaruhi tindakan agonis.
Empat kasus membatasi skema umum akan dipertimbangkan. Masing-masing
mengandaikan bahwa A adalah konvensional, œpositiveâ agonis, yaitu, kehadirannya
meningkatkan proporsi reseptor aktif karena preferensial AFI ¬ nity untuk bentuk
aktif.
1. Ligan B memiliki jauh lebih besar AFI ¬ nity untuk tidak aktif (R, AR) daripada
aktif (R *,
AR *) menyatakan reseptor. Sedikit BR * atau * ABR terbentuk. Di hadapan besar
GAMBAR 1.28 Perpanjangan dua ligan, A dan B, dari skema untuk kegiatan
konstitutif ditunjukkan dalam Gambar 1.11, yang direproduksi sebagai wajah depan
kubus. Kami menduga bahwa A dan B menggabungkan dengan terpisah situs di
makromolekul reseptor, R, sehingga keduanya dapat hadir pada waktu yang sama
(tepi atas belakang wajah kubus). Negara aktif dan tidak aktif reseptor diwakili oleh
kanan dan sisi kiri wajah masing-masing.
Konsentrasi dari kedua A dan B, sebagian besar reseptor akan di aktif, ABR
Kondisi (atas, kiri, belakang simpul kubus). B kemudian bertindak sebagai antagonis
nonkompetitif (Lihat Gambar 1.29A).
2. Disosiasi konstanta kesetimbangan yang menentukan pembentukan ABR dan ABR
* begitu besar (yaitu, sesuai AFI ¬ nities sangat kecil) bahwa jumlah tersebut bentuk
ganda liganded diabaikan. Akibatnya, pengikatan A dan B adalah saling
eksklusif. Jika, di samping itu, AFI ¬ nity B untuk bentuk aktif dari reseptor yang
sangat rendah, B kemudian akan bertindak sebagai antagonis kompetitif (lihat
Gambar 1.29B). *
3. B mengikat terutama untuk negara-negara aktif dari reseptor (R * dan AR *) dan
dalam sedemikian rupa sehingga kompleks yang dihasilkan (BR * dan ABR *) tidak
aktif. Kurva diprediksi akan ditampilkan pada Gambar 1.29C. Buka blok saluran
(lihat Bagian 1.6.5) memberikan contoh (bandingkan Gambar 1.27).
4. Meskipun A mengikat R dan R *, posisi kesetimbangan antara A, R, dan R *
sekarang diasumsikan sedemikian rupa sehingga sedikit AR * terbentuk dalam
ketiadaan B. Namun, jika B juga hadir, banyak reseptor memasuki ABR aktif * CONI
¬ guration. Di bawah ini keadaan, B bertindak sebagai co-agonis untuk A; aktivasi
penuh memerlukan simultan Kehadiran A dan B (lihat Gambar 1.29D).
1.6.7 APPENDICES TO SECTION 1.6
1.6.7.1 Lampiran 1.6A: Sebuah catatan tentang alosterik Term
Alosterik telah datang untuk digunakan dalam reseptor farmakologi dalam
setidaknya tiga arti yang berbeda, membuat konsep Difi ¬ kultus untuk pemula
setidaknya. Para penggunaan utama adalah:
1. Untuk menunjukkan baik situs pengikatan selain itu untuk agonis atau ligan yang
bertindak dengan menggabungkan dengan situs lain ini. Misalnya, œallosteric
antagonistâ gallamine influences aktivasi dari reseptor muscarinic dengan mengikat
ke daerah yang berbeda (suatu œallosteric * Di sini, kompetitif didefinisikan sebagai
dalam Bagian 1.5.1.2 untuk memasukkan kemungkinan bahwa A dan B dapat
menggabungkan dengan berbeda situs mengikat yang berinteraksi sedemikian rupa
bahwa jika A hadir, B tidak bisa, dan sebaliknya. Pendekatan klasik untuk Studi
Drugâ Interaksi Reseptor
GAMBAR 1.29 Pengaruh ligan kedua pada hubungan antara konsentrasi agonis
([A]) dan proporsi reseptor aktif, seperti yang diperkirakan oleh skema yang
ditunjukkan pada Gambar 1.28. Setiap panel menggambarkan efek ligan tambahan,
B, pada empat konsentrasi µM) ditunjukkan dengan jumlah yang diberikan dengan
masing-masing garis. Untuk panel A, B, dan C, tapi tidak D, agonis telah
diasumsikan memiliki intrinsik berikan advokasi tinggi sehingga hampir semua
reseptor dapat diaktifkan dengan itu. Sebuah asumsi tambahan sepanjang adalah
bahwa konstitutif aktivitas reseptor rendah, sehingga tanpa adanya ligan, beberapa
reseptor yang aktif.
A. Di sini, ligan kedua, B, telah diasumsikan memiliki preferensial AFI ¬ nity
tinggi untuk bentuk tidak aktif reseptor. Hasilnya erat meniru klasik,
antagonisme kompetitif.
B. Kedua ligan A dan B telah diasumsikan untuk bergabung dengan reseptor
dalam hampir saling secara eksklusif. Akibatnya, A dan B berada dalam
persaingan, dan model kemudian memprediksi bahwa peningkatan
konsentrasi trations dari B menyebabkan pergeseran hampir paralel dalam
kurva.
C. Di sini, B diasumsikan untuk menggabungkan terutama dengan bentuk aktif
reseptor untuk membentuk kompleks (BR *, ABR *) yang sudah tidak
aktif. Sebuah contoh adalah tindakan blocker saluran terbuka. Perhatikan
konvergensi dari kurva pada konsentrasi agonis rendah (kontras dengan pola
yang diharapkan untuk antagonisme kompetitif, seperti dalam Panel A dan
seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1,26).
D. Untuk simulasi ini konstanta kesetimbangan untuk isomerisasi antara AR dan
AR * telah ditetapkan sehingga beberapa reseptor dalam keadaan aktif bahkan
di hadapan konsentrasi besar A pada perusahaan sendiri. Namun, dengan B
juga hadir pada peningkatan konsentrasi, kesetimbangan yang ditampilkan
pada Gambar 1.28 dialihkan menuju bentuk aktif sehingga respon maksimum
ke A naik ke titik di mana hampir semua reseptor dapat diaktifkan. Akibatnya,
B bertindak sebagai co-agonis. Perhatikan bahwa hal itu menyebabkan
aktivasi reseptor kecil ketika [A] kecil.
Kolom angka yang diberikan dengan setiap panel menunjukkan sebagian kecil
dari reseptor dalam setiap kondisi dikonsentrasi tertentu dari A ditunjukkan
oleh salah satu kurva. Nilai-nilai konstanta kesetimbangan digunakan dalam simulasi
yang tercantum dalam Tabel 1.4.
Sitea dari makromolekul reseptor. Beberapa penulis telah diperpanjang dengan
mendeskripsikan situs agonis sebagai œorthosteric. antagonisme alosterik dapat
dianggap sebagai bentuk non- antagonisme kompetitif DEI ¬ ned dan dibahas dalam
bab ini.
2. Untuk menggambarkan semua-atau-tidak ada transisi antara negara konformasi
berbeda enzim atau reseptor sebuah œallosteric transition. Sesuai dengan penggunaan
ini, ketetapan yang menggambarkan posisi keseimbangan antara negara
(misalnya, E 0 dalam skema Angka 1,11 dan 1,28) kadang-kadang digambarkan
sebagai alosterik konstan.
3. Untuk menunjukan mekanisme dimana posisi keseimbangan antara dua yang
berbeda bentuk perubahan reseptor di hadapan ligan (agonis atau antagonis) untuk
yang affinity berbeda.
Meskipun masing-masing penggunaan ini adalah konsisten diri dan dapat justiï ¬ ed,
mudah untuk melihat bahwa alosterik, jika dapat berarti hal yang berbeda untuk
orang yang berbeda. Sebagai contoh, aktivasi nicotinic dan reseptor muscarinic oleh
asetilkolin dapat dianggap sebagai contoh mekanisme alosterik Sebagai Dei ¬ ned
dalam penggunaan 3 di atas. Tapi, asetilkolin tidak bertindak melalui situs alosterik,
Sebagai dalam penggunaan 1. Jelas, istilah harus qualiï ¬ ed dalam konteks di mana
ia digunakan. Untuk lebih lanjut diskusi, lihat account oleh Colquhoun (1998), yang
menggambarkan asal-usul istilah dan evolusi cara digunakan.
Dalam upaya untuk mengurangi potensi kebingungan,
istilah allotopic dan syntopic telah disarankan sebagai sebutan untuk situs yang
berbeda dan situs yang sama, masing-masing, meskipun mungkin terlalu terlambat
untuk berharap untuk merasionalisasi penggunaan dalam konteks ini.
1.6.7.2 Lampiran 1.6b: Menerapkan Hukum Aksi Massa untuk Skema
Pertama asumsi adalah bahwa reaksi reversibel belas diwakili dalam Gambar
1.28 telah mencapai ekuilibrium. Dari konstanta kesetimbangan dua belas yang
menentukan berapa banyak reseptor dalam setiap kondisi, hanya tujuh perlu
diketahui, sisanya ditentukan oleh orang lain. Hal ini dapat terbaik dipahami dengan
kembali ke skema sederhana ditunjukkan pada Gambar 1.11. Menerapkan hukum
aksi massa untuk tiga dari empat kesetimbangan dalam skema itu, kita harus:
Oleh karena itu, untuk keseimbangan yang tersisa,
Kita bisa melihat bahwa nilai konstanta kesetimbangan keempat (untuk
isomerisasi antara bentuk aktif dan tidak aktif dari reseptor diduduki) ditentukan oleh
tiga lainnya, E 0, K L, dan K L *. Kembali ke skema Gambar 1.28 dan berpikir
tentang pilihan dari tujuh konstanta yang harus speciï ¬ ed, hal ini menguntungkan
untuk memisahkan tujuh menjadi tiga œprimaryâ dan empat œsecondaryâ
konstanta. Yang utama yang diambil untuk menjadi E 0, K A, B dan K, dan lain-lain
disajikan sebagai kelipatan dari mereka. Keempat pengganda yang diperlukan untuk
ini ditujukan a, b, d, dan g, untuk konsistensi dengan account sebelumnya skema ini
untuk aktivasi reseptor (lihat, misalnya, Colquhoun [1998] dan referensi di
dalamnya).
Tabel 1.3 menetapkan hubungan antara tiga primer dan keseimbangan lainnya
sembilan konstanta yang muncul pada Gambar 1.28. Tabel 1.4 daftar nilai-nilai
tertentu yang digunakan untuk menghitung set
Kurva yang ditunjukkan pada Gambar 1.29. Perhitungan tersebut dapat
dilakukan dengan beberapa cara, beberapa yang lebih baik untuk eksposisi dan lain-
lain membuat untuk evaluasi lebih mudah dengan spreadsheet. Pendekatan yang
mengikuti lebih , fleksibel, meskipun kurang ringkas, dibandingkan alternatif yang
diberikan dalam jawaban dalam Bagian 1.10 ke Soal 1.5 (Bagian 1.8).
Kita mulai dengan menggunakan hukum aksi massa untuk memungkinkan kita untuk
berhubungan fraksi reseptor di setiap dari berbagai kondisi (R *, * AR, BR *, * ABR,
AR, dll) untuk fraksi (p R) dalam keadaan tidak aktif (R) dengan kedua situs
mengikat kosong:
Juga,
Menggantikan p R *, p * AR, dll, dalam ungkapan ini, kita memiliki:
Oleh karena itu,
Ungkapan ini, bersama-sama dengan persamaan kesetimbangan massa hukum
hanya terdaftar, sekarang dapat digunakan untuk menghitung proporsi reseptor dalam
setiap kondisi atau kombinasi kondisi. Sebagai contoh, fraksi di negara aktif
diberikan oleh:
Menggantikan p R menggunakan Persamaan. (1.58) memberikan ekspresi yang
berkaitan fraksi reseptor dalam bentuk aktif dengan konsentrasi A dan B:
Ini telah digunakan untuk membangun set kurva pada Gambar 1.29. *
Dengan cara yang sama, proporsi reseptor di mana A menempati tempat ikatannya
diberikan oleh:
Menggunakan Persamaan. (1,58) untuk menggantikan p R, kita memiliki:
Menggunakan hubungan
Kita melihat bahwa hubungan antara konsentrasi A dan jumlah itu yang terikat harus
mengikuti Hilla persamaan Langmuir. K eff, makroskopik disosiasi konstanta
kesetimbangan, diberikan oleh: * Untuk panel C, bagaimanapun, hal aktif yang
dianggap p R * + p * AR, sesuai dengan hipotesis bahwa dalam hal ini BR * dan
ABR * tidak memberikan kontribusi terhadap respon.
Istilah dalam kurung besar dapat lebih besar atau kurang dari satu, tergantung pada
nilai-nilai dari enam konstanta. Oleh karena itu, kehadiran B dapat meningkatkan atau
mengurangi pengikatan A.
1.7 KESIMPULAN
Pemodelan aksi reseptor dengan cara yang diuraikan dalam bab ini
kemungkinan akan terus menjadi nilai. Secara khusus, memungkinkan tindakan obat
yang akan lebih baik dijelaskan, quantiï ¬ ed dan dianalisis. Ini tidak boleh dilupakan,
bagaimanapun, bahwa setiap kemajuan penting dalam pemahaman tentang reseptor
tindakan yang tidak datang dari pemodelan dan persamaan menulis melainkan dari
eksperimental teknologi baru- tehnik seperti metode radioligand mengikat, rekaman
single-channel, dan, terakhir, yang prosedur biologi molekuler yang memungkinkan
struktur reseptor menjadi tidak hanya ditentukan dengan cara yang tepat. Ini dan
lainnya uang muka yang dibahas dalam bab-bab berikutnya.
1.8 MASALAH
Soal 1.1
Sebuah antagonis kompetitif (B) diterapkan pada jaringan dan menghasilkan
konsentrasi rasio r B . Sedetik antagonis kompetitif (C) bekerja pada reseptor yang
sama menghasilkan konsentrasi rasio r C di bawah kondisi yang sama. Jaringan
tersebut selanjutnya terkena kedua antagonis bersama-sama, pada saat yang sama
konsentrasi trations seperti dalam aplikasi terpisah. Rasio konsentrasi sekarang
diamati r B + C . Apa Hubungan mungkin diharapkan untuk terus
antara r B , r C , dan r B + C ? (Asumsikan bahwa del Castilloâ "Katz mekanisme
aktivasi reseptor memegang dalam bentuk yang paling sederhana (Persamaan (1.7).)
Soal 1.2
Ketika mempelajari antagonisme kompetitif, kadang-kadang perlu untuk
memasukkan inhibitor serapan atau blocker ganglion dalam semua solusi mandi yang
digunakan. Jika senyawa ini memiliki di samping beberapa tindakan memblokir
kompetitif pada reseptor yang dipelajari, apa efek ini akan memiliki estimasi dari
konstanta kesetimbangan disosiasi untuk antagonis kompetitif?
Soal 1.3
Apa kuantitas akan Furchgottâ € ™ s metode antagonis ireversibel (Bagian 1.6.4)
memperkirakan jika reseptor diduduki, AR, harus ï ¬ rst isomerize ke bentuk kedua,
AR *, yang kemudian menempel ke yang lain entitas, seperti G-protein, dalam rangka
untuk memperoleh tanggapan (seperti dalam Pers. (1,38))? Asumsikan bahwa G-
protein hadir lebih besar dalam kaitannya dengan reseptor.
Soal 1.4
Turunkan persamaan. (1.39) dalam Bagian 1.4.7, yang mengungkapkan bagaimana
proporsi reseptor aktif bervariasi dengan konsentrasi ligan yang menggabungkan
dengan reseptor dengan aktivitas konstitutif.
Soal 1.5
Terapkan hukum aksi massa untuk bekerja di luar proporsi reseptor dalam bentuk
aktif ( p aktif ) untuk mekanisme untuk aktivasi reseptor ditunjukkan pada Gambar
1.14. Apa yang akan menjadi nilai EC 50 di bawah keadaan ini? (Asumsikan bahwa
respon diukur berbanding lurus dengan p aktif dan konsentrasi protein G dapat
dianggap sebagai konstan.)
1,9 RUJUKAN MATERI
Umum
Pekerjaan awal (Sekarang Terutama Tujuan Historical)
EFFIKASI
Contoh aplikasi praktis dari Schildâ pendekatan studi antagonisme
Contoh Tambahan analisis penyimpangan dari persamaan Schild
.
Penerapan antagonis ireversibel (percobaan perlindungan reseptor, berusaha
penentuan K A untuk agonis)
1.10 SOLUSI UNTUK MASALAH
Soal 1.1
Kami memiliki tiga situasi eksperimental untuk dipertimbangkan:
(1) dan (2) yang langsung (lihat Bagian 1.5.2), sedangkan (3) istirahat tanah baru.
Ketika B dan C diterapkan bersama-sama, seperti dalam (3) di atas, dan agonis A
juga hadir, kami memiliki empat kesetimbangan simultan (setidaknya secara prinsip):
Menerapkan hukum aksi massa:
Juga (lihat Bagian 1.5.2),
Dari persamaan tersebut,
Oleh karena itu, menyamakan aktivasi reseptor yang sama dengan agonis (di mana
diasumsikan bahwa tanggapan juga akan sama), dalam ketiadaan antagonis apapun
dan kemudian di hadapan simultan B dan C:
Hubungan ini telah sering digunakan untuk memperoleh bukti bahwa dua
antagonis bertindak di situs yang sama. Hal ini juga dapat diturunkan dengan
mengambil persamaan Gaddum sebagai titik awal daripada ekspresi berdasarkan del
Castilloâ mekanisme Katz.
Soal 1.2
Kami akan menggunakan B untuk menunjukkan antagonis kompetitif sedang
diselidiki dan C untuk mewakili substansi dengan beberapa tindakan memblokir
kompetitif yang hadir di semua solusi mandi yang digunakan dalam
percobaan. Ketika kurva kontrol ditentukan, jaringan terkena kedua agonis A dan C
zat pada konsentrasi [A] dan [C], masing-masing. Dengan asumsi ekuilibrium,
proporsi reseptor dalam keadaan aktif maka:
(Lihat Persamaan. (1,49).)
Ketika kompetitif antagonis B juga diterapkan, konsentrasi A harus ditingkatkan
dengan faktor r , rasio konsentrasi, untuk mengembalikan respons yang
sama. Proporsi reseptor di keadaan aktif maka:
(Lihat jawaban Soal 1.1.)
Dengan asumsi bahwa respons yang sama sesuai dengan aktivasi reseptor yang sama
dalam dua situasi(Yaitu, dengan dan tanpa B sekarang), kita dapat menulis:
sehingga
Oleh karena itu, plot Schild berdasarkan hasil percobaan tersebut akan memberikan
perkiraan bukan dari K B tapi K B (1 + [C] / K C ).
Problem 1.3
Berikut skema untuk aktivasi reseptor seperti yang ditunjukkan dalam Pers. (1.38) di
Bagian 1.4.6. Menerapkan hukum aksi massa masing-masing dari tiga kesetimbangan
memberikan:
Juga,
Menggunakan persamaan kesetimbangan hukum massa untuk
menggantikan p R , p AR , dan p * AR dalam ekspresi ini, kami memperoleh:
Telah diasumsikan di sini bahwa G hadir lebih sehingga jumlah konsentrasi
[G] T tidak jatuh lumayan ketika AR * G * terbentuk. [G] dalam persamaan hukum
massa kemudian dapat digantikan oleh [G] T.
Jika kita sekarang mempertimbangkan Furchgottâ analisis pengaruh antagonis
ireversibel pada respon untuk agonis dan membuat asumsi yang sama seperti di
Bagian 1.6.4, kita dapat menulis:
Di sini, sama seperti sebelumnya, [A] dan [A]ř adalah konsentrasi agonis A
yang menghasilkan sama respon (diasumsikan sesuai dengan konsentrasi yang sama
dari reseptor di aktif, AR * G *,bentuk) sebelum dan setelah penurunan total â €
œconcentrationâ € reseptor dari [R] T ke q [R] T .
Membatalkan E , [G] T , dan [R] T dalam pembilang, dan pembalik, kita
memperoleh:
Oleh karena itu, plot 1 / [A] terhadap 1 / [A]ř lagi harus memberikan garis lurus
dengan kemiringan 1 / q , dan kuantitas diperkirakan oleh (kemiringan slope-1) /
mencegat akan:
Ini hanya akan diperkirakan oleh eksperimen ligan mengikat langsung adalah
skema ini untuk reseptor pekerjaan dan aktivasi untuk menerapkan.
Soal 1.4
Model ini:
di mana kita melihat bahwa tiga kesetimbangan harus diperhatikan (keempat
ditentukan oleh posisi dari tiga lainnya, lihat Lampiran 1.6b). Menerapkan hukum
aksi massa untuk tiga kesetimbangan tersebut, kita memiliki:
di mana konstanta kesetimbangan E 0 , K L , dan K L * adalah sebagai arti dalam
Bagian 1.4.7.
Juga,
Dengan menggunakan ekspresi kesetimbangan hukum massa untuk
menggantikan p R , p R* , dan p LR dalam persamaan terakhir, kita memperoleh:
Dari ini, dan menggunakan sepertiga dari ekspresi kesetimbangan, kami juga
memiliki:
Kita ingin mengetahui fraksi total reseptor dalam keadaan aktif:
Derivasi ini telah mengikuti prosedur umum yang sama diterapkan di seluruh bab
ini. Lain rute, bagaimanapun, adalah instruktif:
Mengingat hanya istilah dalam kurung dan memanfaatkan tiga persamaan
kesetimbangan, kita memiliki:
Oleh karena itu, Persamaan. (1.39) telah diturunkan.
Soal 1.5
Di sini, model ini bentuknya mirip dengan yang dibahas dalam Lampiran 1.6b,
yang menggambarkan penerapan hukum aksi massa untuk skema (Gambar 1.28) di
mana setiap reseptor macromolecule membawa situs pengikatan terpisah untuk
masing-masing dua ligan. Namun, dalam mekanisme untuk aksi dari reseptor G-
protein-coupled diilustrasikan pada Gambar 1.14, hanya dua (R * G dan LR * G) dari
delapan kondisi kemungkinan reseptor aktif. Diagram di bawah mereproduksi
Gambar 1.14 dengan penambahan konstanta kesetimbangan 12:
Menggunakan pendekatan kedua diperkenalkan pada solusi untuk masalah terakhir,
kita dapat menulis fraksi reseptor aktif sebagai:
Dengan menggunakan hubungan yang diperoleh dari penerapan hukum aksi
massa ke kesetimbangan individu dalam skema (lihat Lampiran 1.6b), ini dapat
ditulis sebagai:
Penataan ulang dan memanfaatkan hubungan antara konstanta kesetimbangan
ditetapkan dalam Tabel 1.3 (lihat Lampiran 1.6b untuk lebih detail) memberikan
ekspresi kita butuhkan:
Dengan tidak adanya ligan L, Persamaan. (1.60) tereduksi menjadi:
Ini memprediksi aktivitas konstitutif reseptor G-protein-coupled. Perhatikan
ketergantungan pada konsentrasi efektif dari G-protein.
Jika konsentrasi L dibuat sangat besar, proporsi reseptor dalam keadaan aktif
naik ke:
Dengan asumsi bahwa kita cukup beruntung untuk berurusan dengan tanggapan
sederhana yang secara langsung sebanding dengan fraksi reseptor dalam kondisi aktif,
kita bisa melanjutkan untuk memprediksi EC 50 . Ini adalah konsentrasi L yang
menyebabkan respon meningkat dari nilai y min dalam ketiadaan L
untuk y min ditambah 50% dari kenaikan maksimum ( y maks - y min ) bahwa L
dapat menginduksi. Lebih formal, dan asumsi proporsionalitas langsung antara y dan
p aktif , kita bisa menulis:
Menggunakan Persamaan. (1. 60) dan ekspresi untuk p aktif (min) dan p aktif
(max) hanya diturunkan, kami bahwa nilai EC 50 diberikan oleh:
Dalam Lampiran 1.6b kami memperoleh ekspresi untuk makroskopik
kesetimbangan disosiasi konstan, K eff , untuk pengikatan ligan pada skema yang
sama seperti pada Gambar 1.14. Memungkinkan untuk perbedaan dalam
hal, K eff dan EC 50 terlihat menjadi identik.
ISI
2.1 Reseptor G-Protein-Coupled Merupakan sebuah Unifying Signal-Transduksi
2. 1.1 GTP Binding Protein Bertindak sebagai transduser antara Reseptor dan Efektor
2.1.2 Reseptor G-Protein-Coupled Terdiri superfamili Very Large Protein dengan
Tujuh Segmen transmembran .............................................. ......................... 83
2.1.3 Ragam Messenger kimia yang sangat berbeda Act melalui 7tm Reseptor
2.2 Reseptor G-Protein-Coupled Apakah Protein Bundle Tujuh-spiral Tertanam
dalam Selaput
2.2.1 Struktur X-Ray dari Rhodopsin ........................................ ...................................
84
2.3 Reseptor G-Protein-Coupled Apakah Terdiri dari Beberapa Keluarga
...................................... 84
2. 3.1 Banyak Reseptor 7tm Masih Reseptor Orphan ........................................ ...........
84
2.3.2 Subtipe Reseptor yang Bind Ligan Sama Memiliki Mei Evolved untuk
Beberapa Alasan, Beberapa Yang Masih Tidak Jelas ......................................... ........
87
2.4 Rhodopsin-Seperti Reseptor 7tm Apakah keluarga kuantitatif Dominan
...................... 88
2. 4.1 Lindung Disulï ¬ de Bridge Menciptakan Dua Loops ekstra dari Atas TM-III
2.4.2 Jaringan Loops relatif pendek dan Kesehatan Lindung Tampaknya Dua Domain
Intramolekuler ............................................ ............................. 89
2.4.3 Beberapa Reseptor Memiliki Disulï ¬ de-Kaya, Ligan-Binding, N-Terminal
2.4.4 glikosilasi Penting untuk Protein Folding dan intraselular
2.4.5 Residu prolin Lindung di Transmembranes Mungkin Fungsional Pentingnya
2.4.6 Interhelical Kendala melalui Jaringan Hidrogen-Bond dan Lainnya Interaksi
Nonhydrophobic ................................................ ..................................... 91
2.4.7 Sebuah Helix amphipathic intraselular Menghubungkan TM-VII yang
Palmityolation Situs
2.4.8 Agonis-Dependent Fosforilasi Alters Interaksi dengan intraselular Protein
2.5 Keluarga B Adalah Keluarga Perbedaan Glukagon / VIP / Kalsitonin 7tm
Reseptor ...................... 91
2. 5.1 Farmakologi Fenotip Tertentu Reseptor Family B Ditetapkan oleh Interaksi
dengan landai .............................................. ......................................... 93
2.5.2 Anggota dari Subfamili dari Reseptor Family B Apakah struktural Mirip
Molekul Adhesi untuk your .............................................. .........................................
93
2.6 Sebuah Keluarga Ketiga Reseptor Glutamat metabotropic dan chemosensors
........................ 93
2.6.1 Struktur X-Ray dari Domain Ekstraseluler Ligan-Pengikatan mGluR1 Dikenal
dengan dan tanpa Glutamat ............................................ .......................... 94
2.7 Reseptor 7tm Menjalani Dimer-dan oligomerisasi ......................................
............... 94
2.7.1 Keluarga C Reseptor Fungsi sebagai Homo-atau heterodimer
................................... 94
2.7.2 Fungsional Signiï ¬ signifikansi dari dimerisasi Lebih Jelas antara Reseptor
rhodopsin-Seperti .............................................. ................................. 96
2.8 Reseptor 7tm Apakah dalam Equilibrium Dinamis antara aktif dan tidak aktif
Konformasi
2.8.1 agonis dan agonis Inverse Apakah Properties Dasar Ligan Sendiri pada reseptor
tersebut
2.8.2 Mutasi Sering Pergeseran Equilibrium ke arah konformasi aktif ................ 98
2.8.3 TM-VI Terutama Tampaknya Menjalani Perubahan konformasi Mayor pada
Receptor
2.9 Reseptor 7tm Memiliki Beberapa Agonis Mode Binding ............................
............ 99
2.9.1 retina, Monoamina, dan Rasul Kecil lainnya Bind antara Segmen transmembran
................................................ .......................................... 99
2.9.2 Peptida Bind di Beberapa Mode dengan Situs Interaksi Mayor di Eksterior
2.9.3 Agonis Nonpeptide Bind di Bagian Deep Utama Ligan-Binding Celah
2.10 Antagonis Mei Mengikat Seperti Agonis atau Mereka Mei Bind Sangat Berbeda
........................................... 103
2.10.1 Antagonis monoamine Sering Bind Dekat Dimana Agonis yang Mengikat
(Isosterically)
2.10.2 Antagonis Nonpeptide Mei Bind Sebaliknya Berbeda dari Agonis ..............
103
2.11 Reseptor 7tm Tampak Fungsi di Kompleks Protein Bersama Lainnya
Protein Sinyal-Transduksi .................................. ................................................. 104
2.12 7tm Receptor Signaling Apakah Turned Off, atau Switched, berdasarkan
Desensitisasi Mekanisme
2.12.1 Reseptor 7tm terfosforilasi oleh Kedua Kinase Kedua-Messenger dan Speciï ¬
c Kinase Reseptor ............................................ ..................................... 106
2.12.2 Arrestin Blok Signaling dan Fungsi sebagai Protein Adaptor untuk clathrin
......... 108
2.12.3 Internalisasi Apakah Dilanjutkan dengan Target untuk Lisosom atau dengan
Daur Ulang .............. 108
2.13 Bacaan lebih lanjut
2.1 RESEPTOR G-PROTEIN-COUPLED MERUPAKAN SEBUAH
UNIFYING SIGNAL-TRANSDUKSI
2. 1.1 GTP BINDING PROTEIN BERTINDAK SEBAGAI TRANSDUSER
ANTARA RESEPTOR DAN EFEKTOR
Sudah pada tahun 1969 itu menyarankan oleh Martin Rodbell dan rekan kerja
bahwa serangkaian hormon, semua yang dirangsang adenilat siklase, bertindak
dengan mengikat speciï ¬ c reseptor ( diskriminator ), yang terkait dengan intraseluler
adenilat siklase (yang ampliï ¬ er ) melalui apa yang disebut transduser
sistem. Transduser umum untuk semua hormon ini kemudian ditandai sebagai salah
satu dari beberapa heterotrimeric guanin mengikat protein nukleotida, G-
protein. Dalam sinyal-trans- mekanisme produksi, aktivasi reseptor menyebabkan
pertukaran difosfat guanosin (PDB) dengan guanosin trifosfat (GTP) dalam G-
protein, yang kemudian menjadi aktif dan dapat merangsang intraseluler sistem
efektor sampai aktivitas GTPase yang mengarah ke hidrolisis GTP terhadap PDB,
yang ternyata sistem off lagi (lihat Bab 7). Selain adenilat siklase, sejumlah ampli
atau efektor sistem, seperti phospholipases dan phosphodiesterases, serta saluran ion,
diatur oleh subunit G-protein dalam sistem pengolahan sinyal canggih. Jumlah
hormon penerimaan tor dan reseptor untuk utusan kimia lainnya bertindak melalui G-
protein yang sekarang dikenal sangat besar. Hal ini jelas bahwa reseptor G-protein-
coupled merupakan salah satu produsen utama sinyal-transduksi sistem dalam sel
eukariotik.
2.1.2 RESEPTOR G-PROTEIN-COUPLED TERDIRI SUPERFAMILI VERY
LARGE PROTEIN DENGAN TUJUH SEGMEN TRANSMEMBRAN
Pada tahun 1983, rhodopsin, molekul cahaya-sensing yang mengikat kromofor
retina, adalah pertama protein-coupled molekul akan di kloning. Fitur struktural yang
paling mencolok ini photore-Ceptor adalah tujuh segmen hidrofobik diyakini
merupakan tujuh transmembran (7tm) heliks, dengan analogi dengan heliks
transmembran tujuh pompa proton, bacteriorhodopsin. Ketika reseptor adrenergik,
sebagai pertama neurotransmitter / hormon reseptor, dikloning, ini protein ternyata
mengejutkan homolog dengan rhodopsin, dan memiliki struktur keseluruhan yang
sama, dengan tujuh segmen transmembran. Kloning berikutnya dari banyak reseptor
yang berbeda dan karakterisasi dari genom manusia telah menunjukkan bahwa
reseptor 7tm merupakan superfamili terbesar protein dalam organisme kita. Meskipun
sebagian besar reseptor telah ternyata menjadi homolog dengan rhodopsin, beberapa
keluarga jauh terkait reseptor G-protein-coupled yang ditemukan, dengan hanya
terlihat, fitur struktural umum menjadi tujuh seg-hidrofobik Yang penting, telah
menjadi semakin jelas bahwa reseptor 7tm mungkin sinyal melalui G- protein-
independen jalur, dan oleh karena itu lebih cocok menggunakan nama reseptor 7tm
dari reseptor G-protein-coupled .
2.1.3 RAGAM MESSENGER KIMIA YANG SANGAT BERBEDA ACT
MELALUI 7TM RESEPTOR
Spektrum hormon, neurotransmiter, mediator parakrin, dll, yang bertindak
melalui G-protein- reseptor digabungkan mencakup semua jenis kurir kimia: ion (ion
kalsium yang bekerja pada paratiroid dan chemosensor ginjal), asam amino (glutamat
dan asam aminobutyric, atau GABA),monoamina (katekolamin, asetilkolin,
serotonin, dll), utusan lipid (prostaglandin, tromboksan, anandamide, endogen
cannabinoid, platelet-activating factor, dll), purin (ade- nosine dan adenosin trifosfat
[ATP]), neuropeptida (tachykinins, neuropeptide Y, endogen opioid, cholecystokinin,
polipeptida intestinal vasoaktif [VIP], dll), hormon peptida (Angio- tensin,
bradikinin, glukagon, kalsitonin, hormon paratiroid, dll), kemokin (interleukin-8 [IL-
8], RANTES, makrofag INI ¬, ammatory peptida 1 Ã ¡ [MIP-1 Ã ¡ ], dll), hormon
glikoprotein (Mu- Roid-stimulating hormone [TSH], follicle-stimulating hormone
[FSH], hormon luteinizing [LH] / chorionic gonadotropin, dll), serta protease
(trombin). Dalam sistem sensorik kita, G- reseptor protein-coupled terlibat baik
sebagai molekul cahaya-sensing di mata (rhodopsin dan protein pigmen warna) dan
karena beberapa ratusan reseptor bau yang berbeda dalam penciuman sistem, di
samping sejumlah besar reseptor rasa.
2.2 RESEPTOR G-PROTEIN-COUPLED APAKAH PROTEIN BUNDLE
TUJUH-SPIRAL TERTANAM DALAM SELAPUT
Masalah karakteristik struktur tiga dimensi dari reseptor G-protein-coupled oleh
kristalografi sinar-x atau resonansi magnetik nuklir (NMR) telah sangat Difi kultus
untuk memecahkan. Reseptor yang rumit protein membran yang Difi ¬ kultus untuk
memproduksi dalam Sufisien jumlah besar. Ketika mereka telah tersedia, telah Difi ¬
kultus untuk membuat mereka berguna membentuk kristal. Namun, berdasarkan
terutama pada analisis mikroskopis cryoelectron (elektron crystallogra- phy) kristal
dua dimensi dan sistematis elektron resonansi paramagnetik (EPR) studi spin-label
rhodopsin, sejumlah model molekul reseptor 7tm dikembangkan selama tahun 1990
yang ditambahkan ke sejumlah besar mutasi dan lainnya jenis data biokimia tersedia.
2.2.1 STRUKTUR X-RAY DARI RHODOPSIN
Pada tahun 2000, pertama struktur x-ray berdasarkan kristal tiga dimensi dari
reseptor 7tm adalah diterbitkan, menunjukkan sapi rhodopsin di aktif, negara gelap
dan memiliki bundel tujuh heliks erat sesuai dengan yang dijelaskan dalam sebagian
besar model molekul. Yang penting, 11 - cis -retina, kromofor atau ligan, terletak
hampir persis seperti yang diharapkan, jelas yang melekat LysVII: 10 di TM-VII
melalui basis linkage Schiff dan dari sini melewati antara TM-III dan TM-VI,
berjalan agak paralel sepanjang TM-III, yang memungkinkan cincin Ionone untuk
berinteraksi terutama dengan residu selama di TM-V dan TM-VI (Gambar 2.1 dan
2.2). Anehnya, ligan itu erat tertutup dari sisi ekstraseluler, tidak hanya oleh rantai
samping dari heliks transmembran tetapi juga oleh terdiri dari lembar dibentuk oleh
ekstraseluler lingkaran-2 (menghubungkan TM-IV dan TM-V), yang, seperti yang
diharapkan, diadakan ke atas TM-III oleh disulï ¬ de obligasi. Di sisi intraseluler,
lebih atau kurang tertata loop diamati, tapi bukannya loop antara akhir TM-VII dan
situs .almitoylation (lihat nanti), yang amphipathic tertata alpha helix (heliks VIII)
telah ditemukan berjalan sejajar dengan membran bawah TM-VII, TM-I, dan TM-II.
Struktur ini adalah ï ¬ rst gambar reseptor 7tm, tapi sayangnya hanya tidak aktif
negara. Perlu dicatat bahwa meskipun lebih struktur, termasuk konformasi aktif dan
Hormon / reseptor pemancar, akan tersedia di tahun-tahun mendatang, ini hanya akan
memberi kita gambar statis. Di masa depan, pertukaran dinamis antara konformasi
yang berbeda dari protein harus dipahami. Pertanyaan ini mulai dibenahi melalui
berbagai biofisik berarti misalnya, percobaan menggunakan spin-label atau uorescent.
2.3 RESEPTOR G-PROTEIN-COUPLED APAKAH TERDIRI DARI
BEBERAPA KELUARGA
Sebagian besar reseptor G-protein-coupled homolog dengan rhodopsin, namun
lainnya karak-keluarga tatively kecil serta beberapa reseptor individu tidak berbagi
salah satu struktur fitur umum untuk keluarga rhodopsin (Gambar 2.3). Yang paling
dominan ini adalah glukagon / VIP / kalsitonin keluarga reseptor, atau œfamily BA
(yang memiliki sekitar 65 anggota), dan glutamat metabotropic keluarga reseptor,
atau œfamily Ca (yang memiliki sekitar 15 anggota), serta keluarga frizzled /
dihaluskan reseptor. Dengan demikian, satu-satunya fitur struktural bahwa semua
reseptor G-protein-coupled memiliki kesamaan adalah bundel heliks tujuh-
transmembran.Namun demikian, sebagian besar reseptor non-rhodopsin-seperti
memang memiliki fitur struktural minor tertentu dalam com-mon dengan reseptor
rhodopsin seperti "misalnya, jembatan antara bagian atas TM-III dan tengah
ekstraseluler lingkaran-3, dan sekelompok residu dasar yang terletak tepat di bawah
TM-VI.
2. 3.1 BANYAK RESEPTOR 7TM MASIH RESEPTOR ORPHAN
Jumlah konsensus mengenai jumlah reseptor 7tm belum tercapai. Namun,
jelaslah bahwa di antara anggota dari dua keluarga besar, hampir setengah dari
reseptor masih anak yatim yaitu, ligan endogen belum identiï ¬ ed. Meskipun proses
de-orphanization menjadi lebih dan lebih efi sien ¬, diharapkan masih beberapa tahun
lagi sebelum ini ratusan reseptor yatim telah ditandai, termasuk menentukan ligan
mereka mungkin mengikat, jika ada. Setelah itu, peran fisiologis dan potensi
farmakologi dari banyak
GAMBAR 2.1 Sebuah pandangan sisi struktur prototipe G-protein-coupled, 7tm
reseptor rhodopsin. Itu struktur x-ray sapi rhodopsin ditunjukkan dengan garis-garis
abu-abu horisontal, yang menunjukkan batas-batas seluler membran lipid. Ligan
retina akan ditampilkan di ruang-ï ¬ Model lling sebagai awan di tengah struktur.
Tujuh transmembran (7tm) heliks ditunjukkan dalam bentuk pita padat. Perhatikan
bahwa TM-III agak miring (lihat TM-III pada akhir ekstraseluler dan intraseluler
helix) dan bahwa Kinks yang hadir dalam beberapa lainnya heliks, seperti TM-V (ke
kiri), TM-VI (di depan retina), dan TM-VII. Dalam semua kasus ini, ini Kinks adalah
karena adanya residu prolin baik dilestarikan, yang menciptakan titik lemah dalam
heliks struktur. Kinks ini diyakini penting fungsional dalam mekanisme aktivasi
untuk 7tm reseptor pada umumnya. Juga perhatikan amphipathic helix-VIII yang
terletak sejajar dengan membran di antarmuka membran.
GAMBAR 2.2 Sebuah pandangan atas struktur prototipe G-protein-coupled reseptor
rhodopsin 7tm. Itu struktur x-ray sapi rhodopsin ditampilkan sebagai dilihat dari
ruang ekstraseluler. Ujung ekstraseluler dari masing - masing transmembran heliks
itunjukkan. Perhatikan bagaimana ligan retina benar-benar tertutup oleh plugâ terdiri
dari struktur lembaran dibentuk oleh perpanjangan ekstraseluler N-terminal dan
ekstraseluler lingkaran-2. A garis abu-abu padat dari ujung ekstraseluler TM-III ke
untai di ekstraseluler lingkaran-2 menunjukkan lokasi struktural yang sangat penting
disulï ¬ de jembatan, yang dilestarikan tidak hanya di kalangan keluarga A,
rhodopsin-like receptors tetapi juga di antara semua reseptor 7tm (lihat teks untuk
beberapa pengecualian).
GAMBAR 2.3 Tiga keluarga utama mamalia G-protein-coupled reseptor 7tm pada
mamalia. Tidak urutan identitas jelas yang ditemukan antara rhodopsin-seperti
keluarga A, glukagon / VIP / kalsitonin keluarga B, dan glutamat metabotropic /
chemosensor keluarga C reseptor 7tm G-protein-coupled, dengan pengecualian dari
jembatan antara bagian atas TM-III dan tengah ekstraseluler lingkaran-2 (lihat
Gambar 2.2). Demikian pula, tidak ada identitas urutan jelas ada di antara anggota
dari tiga keluarga dan, misalnya reseptor 7tm rasa pahit, reseptor feromon V1R, dan
protein frizzled 7tm, yang semuanya baik diketahui atau diyakini reseptor G-protein-
coupled. Bacteriorhodopsins, yang tidak G-protein- protein ditambah tapi pompa
proton, sama sekali berbeda dalam hal urutan asam amino tetapi memiliki tujuh
heliks bundel diatur agak mirip dengan yang untuk reseptor G-protein-coupled.
GAMBAR 2.4 Bagian dari rhodopsin-like receptors 7tm. Hanya beberapa cabang
dari pohon ditunjukkan untuk menyoroti prinsip-prinsip tertentu. Urutan skala
kesamaan mulai dari tengah pohon tidak linear dan tidak dimulai dari nol. Semua
reseptor rhodopsin seperti setidaknya 15 sampai 20% homolog untuk Misalnya,
rhodopsin vs reseptor monamine atau rhodopsin vs reseptor peptida. Daerah yang
diarsir menunjukkan identitas lebih dari 70% urutan, yang mencakup sebagian besar
subtipe reseptor seperti, reseptor muscarinic dan reseptor endotelin. Namun, perlu
diketahui bahwa untuk subtipe ligan lain, seperti di Y neuropeptida dan reseptor
angiotensin, identitas urutan bisa sangat terbatas, meskipun mereka mengikat
endogen yang sama hormon atau pemancar dengan nanomolar AFI ¬ syarakat. Juga
mencatat bahwa subtipe reseptor tertentu tampaknya berasal dari cabang yang
berbeda (di sini, histamin, dopamin, dan angiotensin), menunjukkan evolusi
konvergen mungkin di mana reseptor mungkin memiliki œpicked upa ligan. target
obat baru yang potensial akan harus clariï ¬ ed. Dalam hubungan ini, perlu dicatat
bahwa peran fisiologis dan potensi farmakologis yang belum hanya ditandai dengan
tingkat yang wajar untuk reseptor beberapa, terutama karena kurangnya berguna,
selektif farmakologis alat. Ini adalah kasus bahkan untuk banyak subtipe reseptor
monoamine terkenal.
2.3.2 SUBTIPE RESEPTOR YANG BIND LIGAN SAMA MEMILIKI MEI
EVOLVED UNTUK BEBERAPA ALASAN, BEBERAPA YANG MASIH
TIDAK JELAS
Banyak hormon dan pemancar memiliki beberapa subtipe reseptor dan subtipe
lebih dari diharapkan dari studi fisiologis dan farmakologis klasik. Secara struktural,
ini subtipe reseptor mungkin atau mungkin tidak sangat mirip. Sebagai contoh,
sebagian besar subtipe dalam sistem monoamine atau, misalnya, endotelin ET-A dan
reseptor ET-B lebih dari 70 atau 80% identik dalam urutan asam amino mereka
(Gambar 2.4). Di sisi lain, beberapa anggota dari empat yang berbeda reseptor
histamin dan ï ¬ ve berbeda neuropeptide Y (NPY) reseptor hampir sama renggang
berhubungan satu sama lain karena mereka adalah untuk setiap rhodopsin-like
receptor 7tm lainnya (yaitu, sekitar suhu 25 - 30% identitas), yang berhubungan
dengan terjadinya residu umumnya dilestarikan dalam transmembran daerah. Namun,
subtipe reseptor yang berbeda, apakah atau tidak mereka sangat erat terkait di urutan
asam amino, biasanya semua mengikat ligan alami mereka dengan tinggi dan setara
Afinity, dan awalnya mereka identiï ¬ ed terutama melalui reaksi yang berbeda
dengan agonis sintetik atau antagonis. Dalam beberapa kasus, fungsional signiï ¬
signifikansi dari subtipe reseptor agak jelas; misalnya, subtipe reseptor sering
memberikan pemancar atau hormon kesempatan untuk pasangan melalui berbagai G-
protein dan dengan demikian mengaktifkan sistem efektor yang berbeda. Namun,
dalam banyak kasus, fungsional signiï ¬ signifikansi subclass reseptor lebih halus
misalnya, di mana subtipe hanya menampilkan sedikit perbedaan dalam sifat
desensitisasi atau perbedaan dalam kemampuan mereka menjadi konstitutif aktif
(lihat pembahasan di bawah).
GAMBAR 2.5 Beberapa karakteristik struktural dari keluarga rhodopsin-like A
reseptor 7tm. Residu yang terletak di heliks transmembran berbayang abu-abu terang.
Subunit dari heterotrimeric G-protein diyakini berinteraksi terutama dengan residu
yang terletak di segmen intraseluler, yang dinaungi abu-abu gelap. Dalam setiap
segmen transmembran, satu atau lebih residu tertinggal antara hampir semua anggota
keluarga. Residu sidik jari transmembran utama ini yang disorot: AsnI:18, AspII:10,
CysIII:01, ArgIII:26, TrpIV:06, ProV:16, ProVI:15, and ProVII:17. Struktural dan /
atau fungsional pentingnya bagian tertentu dari struktur reseptor ditunjukkan pada
gambar.
2.4 RHODOPSIN-LIKE RESEPTOR 7TM ADALAH KELUARGA
KUANTITATIF DOMINAN
Pola dasar G-protein-coupled reseptor rhodopsin. Serangkaian residu "sidik
jari", yang sebagian besar terletak di dalam segmen transmembran, telah tersimpan
antara reseptor rhodopsin-like, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2.5. Ini residu
sidik jari tersimpan pada 95 sampai 98% dari reseptor, dan setiap reseptor yang
diberikan akan berisi sebagian besar dari mereka. * Namun, di antara semua
rhodopsin-like reseptor G-protein-coupled tidak ada residu benar-benar tersimpan.
Yang paling kekal adalah satu ArgIII: 26 terletak di kutub intraseluler TM-III di
urutan KERING (hanya kurang dalam beberapa reseptor). Residu ini diyakini terlibat
dalam signaling untuk Gprotein (lihat pembahasan di bawah). Namun demikian,
beberapa fitur struktural membedakan antara subfamilies, misalnya, reseptor kemokin
dari reseptor rhodopsin-like lainnya.
2.4.1 JEMBATAN DISULFIDA YANG TERSIMPAN MENCIPTAKAN
DUA LOOP EXTRA DARI PUNCAK TM-III
Salah satu fitur yang paling sangat tersimpan antara reseptor 7tm adalah
jembatan disulfida antara Cys di atas TM-III dan a Cys terletak di suatu tempat di
tengah-tengah loop ekstraselular kedua. Lingkaran ini dengan demikian berubah
menjadi dua loop yang menghubungkan bagian atas TM-III dengan bagian atas dari
kedua TM-IV dan TM-V. Kedua loop ekstra mengikat TM-IV dan TM-V erat dengan
TM-III, yang umumnya dianggap kolom tengah dalam ikatan tujuh heliks. Dalam
rhodopsin, loop ini membentuk lembaran-β "tertutup" di atas kantung ikatan ligan di
mana retina berada (lihat Gambar 2.1 dan 2.2). Dalam MSH / adrenocorticotrophic
hormone (ACTH) dan cannabinoid CB1 dan CB2 reseptor, disulfide jembatan ini
tidak ada. Namun, dalam kasus reseptor MSH / ACTH, hanya dua residu hidrofilik
terpisah TM-IV dan TM-V, yang hanya merupakan cara lain untuk memegang TM-V
erat dengan sisa A-domain.
2.4.2 JARINGAN LOOP YANG RELATIF PENDEK DAN TERSIMPAN
BAIK TAMPAKNYA MENJELASKAN DUA DOMAIN INTRAMOLEKULAR
Terlepas dari kenyataan bahwa urutan asam amino reseptor 7tm agak kurang
tersimpan, terutama di luar segmen transmembran, panjang sebagian besar loop
adalah secara mengejutkan tersimpan baik. Loop yang menghubungkan TM-I dan
TM-II dan yang menghubungkan TM-II dan TM III pendek dan hampir sama panjang
dalam semua reseptor rhodopsin-like, meskipun perbedaan besar dalam urutan asam
amino yang sebenarnya (Gambar 2.6). Sebagaimana dibahas di atas, jembatan
disulfida tersimpan menciptakan dua loop pendek, yang menambatkan TM-IV dan
TM-V erat dengan tiga segmen transmembran. Kedua segmen transmembran C-
terminal, TM-VI dan VII TM-, juga dihubungkan dengan loop intraselular singkat
sekitar sepuluh residu (Gambar 2.6). Namun, loop menghubungkan TMV dan TM-VI
sangat buruk tersimpan dalam hal berurutan dan panjang dan sering relatif lama,
dalam beberapa kasus hingga beberapa ratus residu. Dengan demikian, tampak bahwa
reseptor rhodopsinlike secara struktural terdiri dari dua domain intramolekul
diselenggarakan bersama oleh jaringan loop yang relatif singkat: domain A-yang
terdiri dari TM-I sampai TM-V dan-domain B yang terdiri dari TM-VI dan TM -VII.
Bahkan, dua domain hipotetis dapat membentuk splitreceptor berfungsi penuh pada
co-ekspresi dua plasmid, yang masing-masing kode untuk salah satu domain.
GAMBAR 2.6 Panjang segmen intra dan ekstraseluler rhodopsin-like keluarga
reseptor. Kolom menunjukkan median segmen intra dan ekstraseluler dari 29
monoamine manusia dan 29 hormon peptida manusia atau reseptor neuropeptida. N-
panjang, N-terminal ekstensi ekstraselular, IC, intraseluler loop; EC, ekstraseluler
loop; C-panjang, ekstensi intraseluler C-terminal. Yang sangat kekal disulfida
jembatan dari ujung ekstraseluler TM-III ke tengah ekstraseluler lingkaran-2 (lihat
Gambar 2.2) membagi lingkaran ini menjadi dua loop, ditunjuk EC2A dan EC2B.
Perhatikan seberapa baik-tersimpan sebagian besar loop dalam hal jumlah residu
asam amino, yang tidak kasus untuk identitas urutan, kecuali intraseluler lingkaran-3,
yang lebih panjang dari yang lain dan yang bervariasi sangat panjang antara reseptor .
Ini bisa menunjukkan bahwa reseptor secara struktural dan fungsional mungkin
terdiri dari dua domain: A domain yang terdiri dari TM-I ke TM-V dan domain B
yang terdiri dari TM-VI dan VII-, masing-masing dihubungkan dengan singkat, dan
panjang namun tidak berurutan, loop baik tersimpan. (Angka ini didasarkan pada data
yang disajikan dalam Nielsen, SM et al., Eur. J. Biochem., 251, 217-226, 1998.)
Dalam rhodopsin, studi EPR telah menunjukkan periodisitas heliks jelas di
sebagian besar intraseluler lingkaran-3, kecuali untuk beberapa residu di tengah
(ditunjukkan dalam Gambar 2.5). Ini akan menunjukkan bahwa TM-V dan TM-VI
memperpanjang jalan ke sitosol dan hanya loop yang sangat singkat menghubungkan
dua ekstensi heliks. Namun, dalam kristal tiga dimensi, kebanyakan intraseluler
lingkaran-3 adalah loop yang agak terstruktur. Dengan demikian, dalam kasus ini, ada
kemungkinan bahwa studi EPR memberitahu kita sesuatu tentang "solusi" struktur
reseptor, yang mungkin tidak jelas dalam struktur sinar-x.
2.4.3 BEBERAPA RESEPTOR MEMILIKI DISULFIDE-KAYA, IKATAN-
LIGAND, DOMAIN N-TERMINAL
N-terminal segmen ekstraseluler cukup bervariasi baik panjang dan urutan.
Dalam subfamili reseptor yang mengikat glikoprotein hormon TSH, FSH, LH dan
chorionic gonadotropin, segmen ini sangat panjang dan berisi satu set sistein kokoh,
yang diharapkan dapat membentuk jaringan jembatan disulfida, sehingga
menciptakan definisi yang baik, domain globular yang homolog dengan faktor
transkripsi dengan struktur tiga dimensi yang jelas. Dalam subfamili ini reseptor,
hormon glikoprotein memperoleh sebagian besar energi yang mengikat mereka
dengan interaksi dengan domain N-terminal besar, yang dalam beberapa kasus,
bahkan dalam bentuk yang larut terpotong, mampu mengikat hormon.
2.4.4 GLIKOSILASI PENTING UNTUK PELIPATAN PROTEIN DAN
TRANSPORTASI INTRASELULAR
Hampir semua reseptor 7tm yang terglikosilasi. Biasanya beberapa urutan
pengenalan Asn-X-Thr/Ser untuk glikosilasi N-linked ditemukan di segmen amino-
terminal tapi kadang-kadang juga di tempat lain. Glikosilasi ini secara tidak langsung
penting bagi ikatan ligan atau fungsi reseptor. Namun, seperti halnya bagi sebagian
besar protein membran lain yang diungkapkan pada permukaan sel, glikosilasi
tampaknya menjadi modifikasi pasca-translasi, yang melalui pengenalan oleh protein
spesifik dalam retikulum endoplasma, calnexin, memastikan bahwa protein disimpan
dalam mesin ekspor seluler sampai benar-benar terlipat. Dari fungsi derajat calnexin
sebagai pendamping, "foldase," atau hanya protein retensi masih belum jelas. Bagi
banyak reseptor, fraksi yang relatif besar dari molekul tidak pernah sampai ke
membran plasma dalam sistem ekspresi heterolog. Ligan sintetik tertentu, disebut
sebagai molekular atau farmakologikal caperone, dapat, melalui difusi ke dalam
retikulum endoplasma, mengikat dan menstabilkan reseptor yang baru disintesis
tersebut dan membantu membawa mereka ke permukaan sel. Senyawa tersebut bisa
menjadi obat yang berguna (orphan) untuk mengobati penyakit yang disebabkan oleh
mutasi pada reseptor 7tm yang menyebabkan malfolding dan kurangnya ekspresi
permukaan reseptor yang dinyatakan fungsional, seperti, misalnya, dalam kasus
diabetes insipidus.
2.4.5 SISA PROLIN KOKOH DALAM TRANSMEMBRAN MUNGKIN
MEMILIKI KEPENTINGAN FUNGSIONAL
Karena cincin pyrolidine dari asam amino prolin melibatkan nitrogen backbone,
mencegah pembentukan salah satu ikatan hidrogen menstabilkan tulang punggung α-
helix. Dengan demikian, prolines jarang terjadi pada α-heliks dalam protein globular.
Namun demikian, residu prolin adalah salah satu residu sidik jari tersimpan baik di
beberapa heliks transmembran. Dalam bacteriorhodopsin, rhodopsin, dan protein
membran lainnya, prolines di beberapa tapi tidak semua kasus menyebabkan
kekakuan dalam heliks transmembran. Para prolines kokoh di TM-V, TM-VI, dan VII
TM-reseptor 7tm akan menciptakan "titik lemah" dalam heliks tersebut. Dengan
demikian, dapat dispekulasi bahwa residu prolin tersimpan memberi peran penting
dalam fungsi dinamis dari reseptor, mungkin dengan memfasilitasi pertukaran antara
konformasi yang berbeda dan / atau dengan membiarkan selain heliks transmembran
yang sangat stabil untuk "goyah" dalam rangka untuk mengasosiasikan dan
memisahkan ligan dan subunit G-protein. Dalam hal ini, perhatian khusus telah
terbayarkan untuk penyediaan: 15 di TM-VI, berkenaan dengan keterlibatan yang
penting dalam proses aktivasi. Namun, ProVII: 17 di TM-VII yang tersimpan baik
sangat mungkin juga akan terlibat dalam proses ini.
2.4.6 KENDALA INTERHELICAL MELALUI JARINGAN HIDROGEN-
BOND DAN INTERAKSI NONHYDROPHOBIC LAINNYA
Sama seperti protein larut, kemasan rhodopsin dan membran protein umumnya
terjadi interaksi throughhydrophobic dalam inti molekul. Namun, struktur sinar-x
rhodopsin menegaskan asumsi bahwa serangkaian residu kutub (misalnya, Asni: 18,
AspII: 10, dan AsnVII: 18), sering bersama-sama dengan molekul air interkalat,
membentuk jaringan ikatan hidrogen di pusat reseptor. Di beberapa reseptor, kation
(terutama Na+) akan memodulasi afinitas pengikatan agonis, mungkin karena
interaksi dengan jaringan-ikatan hidrogen ini terletak relatif jauh di tengah reseptor,
menghadap ke arah permukaan intraselular membran. Seperti kebanyakan ligan yang
mengikat baik ke luar bagian dari reseptor atau antara bagian luar segmen
transmembran, tergantung pada ukuran dan struktur kimia dari ligan (lihat di bawah),
efek dari kation dianggap alosterik di alam .
2.4.7 HELIX AMPHIPATHIC INTRASELULER MENGHUBUNGKAN TM-
VII KE TEMPAT PALMITOYLASI
Dalam struktur sinar-x rhodopsin, sebuah helix amphipathic berjalan sejajar
dengan membran dari ujung intraseluler TM-VII di bawah rangkaian tujuh heliks ke
sisi lain dari TM-I dan TMII. Pada titik ini, satu atau lebih residu Cys sering
ditemukan dan dikenal untuk menjadi subyek modifikasi posttranslasional dinamis
dengan residu asam palmitat. Seperti proses fosforilasi, proses palmitoylasi
tampaknya secara dinamis diatur oleh reseptor hunian dan juga terlibat dalam
fenomena desensitisasi. Kedua modifikasi pascatranslasinya dapat mempengaruhi
satu sama lain. Sebagai contoh, kendala konformasi yang diinduksi oleh palmitoylasi
dapat mengubah aksesibilitas situs fosforilasi tertentu. Seperti proses fosforilasi,
konsekuensi fungsional palmitoylasi juga tampak bervariasi dari reseptor ke reseptor.
2.4.8 FOSFORILASI AGONIS-DEPENDENT MENGUBAH INTERAKSI
DENGAN PROTEIN INTRASELULER
Seperti dijelaskan lebih rinci di bawah, ikatan agonis akan menyebabkan sinyal
serta fosforilasi Ser dan residu THr, terutama, tetapi juga, dalam kasus-kasus tertentu,
residu Tyr terletak di intraseluler lingkaran-3 dan pada perpanjangan C-terminal.
Modifikasi pasca-translasi ini mengubah afinitas reseptor untuk berbagai protein
intraseluler, termasuk arrestin, yang sterik mencegah mengikat Gprotein lanjut dan
berfungsi sebagai protein adaptor. Juga, interaksi dengan jenis protein perancah lain
seperti protein PSD-95-like, yang dipengaruhi oleh keadaan fosforilasi reseptor.
2.5 KELUARGA B ADALAH KELUARGA DISTINCT GLUKAGON / VIP
/ KALSITONIN 7TM RESEPTOR
Reseptor untuk serangkaian hormon peptida dan neuropeptida merupakan
keluarga terpisah reseptor Gprotein-coupled sering disebut keluarga B, anggota yang
tak seperti residu sidik jari klasik dari reseptor rhodopsin-like. Keluarga ini termasuk
reseptor untuk hormon yang terlibat dalam metabolisme kalsium (kalsitonin dan
hormon paratiroid [PTH]), metabolisme glukosa (glukagon, glucagon-like peptide I
[GLP-I]), pencernaan saluran-fungsi (secretin, lambung hambat polipeptida [GIP] ,
GLP-II), serta neurohormonnya yang terlibat dalam fungsi hipofisis (growthhormone-
releasing factor [GHRH], ACTH-releasing factor [CRF]), dan neuropeptida penting
(polipeptida intestinal vasoaktif [VIP], hipofisis adenilat siklase stimulasi peptida
[PACAP ]) (Gambar 2.7). Mengingat pentingnya fisiologis peptida ini, ada
kemungkinan bahwa reseptor keluarga ini akan menjadi target utama untuk
pengembangan obat nonpeptide di tahun-tahun mendatang.
GAMBAR 2.7 glukagon / VIP / kalsitonin keluarga B dari 7tm reseptor. Ke
kanan adalah pohon evolusi untuk reseptor keluarga ini. Daerah yang diarsir
menunjukkan identitas urutan 70%. Dua-heliks konformasi ligan menunjukkan
bahwa beberapa dari ligan peptida untuk reseptor keluarga B tampaknya memiliki
struktur sekunder umum pada aktivitas air rendah, sebagaimana ditentukan oleh
eksperimen NMR. Hanya beberapa dari residu sidik jari umum keluarga ini
ditunjukkan dalam model serpentine. Perhatikan bahwa anggota keluarga ini tidak
berbagi dari residu sidik jari transmembran dari keluarga rhodopsin-like, namun
mereka memiliki potensi untuk membentuk sebuah jembatan disulfida dari puncak
TM-III dan tengah ekstraseluler lingkaran-2. Sebagai reseptor rhodopsin-lilke,
anggota keluarga B juga telah tersimpan prolines di transmembranes mereka, tetapi
tidak pada posisi yang sesuai dengan prolines keluarga A.
Selain tujuh segmen transmembran mereka, fitur umum yang paling mencolok di
antara reseptor ini adalah domain ekstraseluler N-terminal besar mereka. Segmen ini
berisi satu set enam residu Cys tersimpan, secara masuk akal terinterkoneksi oleh
sejumlah jembatan disulfida, sehingga membentuk domain globular yang diduga
terlibat dalam pengikatan ligan. Dua residu Cys lain, di bagian atas TM-III dan di
tengah lingkaran ekstraseluler-2, juga disimpan dan bisa membentuk jembatan
disulfida mirip dengan yang ditemukan di reseptor rhodopsin-like. Pertama
ekstraseluler loop variabel panjang dan bisa sampai 30 residu panjang. Seperti di
keluarga besar rhodopsin-like, sejumlah residu prolin tersimpan di segmen
transmembran reseptor keluarga B (Gambar 2.7). Namun, dalam keluarga ini prolines
terletak di TM-IV, TM-V, dan TM-VI dan tidak dalam TM-VII. Dalam TM-V dan
TM-VI, prolines berada pada posisi yang berbeda dari prolines kokoh reseptor
rhodopsin-like. Semua reseptor dari keluarga ini merangsang adenilat siklase dan,
oleh karena itu, beberapa melalui protein Gs. Mekanisme perpasangan termasuk
molekul Gs muncul untuk dibagikan dengan reseptor rhodopsin-like, meskipun
kurangnya urutan homologi.
2.5.1 FENOTIPE FARMAKOLOGI TERTENTU RESEPTOR KELUARGA B
DITENTUKAN OLEH INTERAKSI DENGAN RAMPS
Anggota keluarga kecil fungsi satu-transmembran protein sebagai protein
pemodifikasi aktivitas reseptor (RAMPs), yang berinteraksi dengan reseptor tertentu
dari keluarga B: reseptor kalsitonin dan kalsitonin reseptor-like receptor (CRLR).
RAMPs melayani dua tujuan. Dalam kasus CRLR, mereka berfungsi sebagai
pendamping, memastikan bahwa reseptor ditargetkan pada membran sel bukan
terakumulasi dalam retikulum endoplasma. Kedua, CRLR dalam kompleks dengan
RAMP-1 berfungsi sebagai peptida gen terkait kalsitonin (CGRP) reseptor,
sedangkan CRLR dalam kompleks dengan RAMP-2 berfungsi sebagai reseptor untuk
peptida pengirim pesan lain, adrenomodulin. Reseptor kalsitonin tiba di permukaan
sel sendiri dan di sini mengikat hormon kalsitonin. Namun, ketika dinyatakan dalam
sel yang juga mengekspresikan RAMP-1, reseptor kalsitonin bukan berfungsi sebagai
reseptor amylin. Untuk saat ini, tampak bahwa RAMPs kita kenal sekarang agak
selektif untuk kalsitonin dan reseptor CRLR. Namun, pengamatan reseptor ini jelas
menunjukkan bahwa molekul, farmakologi fenotip dari reseptor tertentu dapat secara
dramatis dipengaruhi oleh interaksi dengan mitra protein lainnya (lihat nanti diskusi
tentang dimerisasi dan perancah / adaptor protein).
2.5.2 ANGGOTA SUBFAMILI RESEPTOR KELUARGA B SECARA
STRUKTURAL MIRIP DENGAN MOLEKUL ADHESI SEL
Sejumlah besar reseptor orphan (sekitar 40), karena terjadinya residu tersimpan
dalam domain tujuh heliks mereka, jelas milik keluarga B dan ditandai dengan N-
terminal domain ekstraselulernya yang sangat besar. Alih-alih karakteristik domain
peptide-hormone/neuropeptideikatan, segmen N-terminal dari reseptor ini klasik
terdiri dari, misalnya, sejumlah faktor pertumbuhan epidermal (EGF) domain
ditempatkan pada tangkai musin-seperti, seperti dalam reseptor EMR-1, EMR-2, dan
EMR-3 dan CD97. Namun, perpanjangan N-terminal lactophilin, misalnya, dihiasi
oleh domain adhesi sel lainnya seperti lektin-like domain. Hanya dalam beberapa
kasus memiliki ligan atau pasangan untuk adhesi / reseptor sel molekul diduga telah
diidentifikasi. Sebagai contoh, CD97 reseptor telah terbukti secara khusus
berinteraksi dengan CD55, yang bukan merupakan kasus untuk homolog EMRs.
Banyak dari adhesi / reseptor molekul sel diekspresikan pada leukosit, tetapi beberapa
juga diungkapkan, misalnya, dalam SSP.
2.6 KELUARGA KETIGA RESEPTOR GLUTAMAT METABOTROPIC DAN
CHEMOSENSORS
Anggota ketiga, keluarga struktural berbeda dari reseptor-G protein-coupled,
keluarga C, mengikat baik glutamat atau GABA, atau mereka bertindak sebagai
sensor kimia untuk ion kalsium atau komponen rasa (Gambar 2.3). Glutamat dan
GABA merupakan pemancar asam amino penting dalam sistem saraf, bereaksi baik
dengan saluran ion ligand-gated (lihat Bab 3 dan 6) dan dengan serangkaian reseptor
G-proteincoupled disebut reseptor glutamat metabotropic dan reseptor GABAB. Di
antara sensor kimia yang dikenal dengan pasangan melalui G-protein, sensor kalsium
dari paratiroid dan ginjal yang homolog dengan reseptor glutamat metabotropic.
Secara struktural, reseptor ini ditandai dengan memiliki N-terminal ekstraseluler
segmen yang sangat besar (500 sampai 600 residu) dan sering juga intraseluler
domain C-terminal sama besar dipisahkan oleh segmen transmembran tujuh. Segmen
transmembran dihubungkan dengan loop pendek dan berbeda dalam urutan yang
benar dari dua keluarga lainnya yang disajikan di atas. Menariknya, beberapa
informasi yang paling rinci yang tersedia mengganggu struktur anggota keluarga C
dibandingkan dengan reseptor 7tm lainnya, sehubungan dengan ikatan ligan, aktivasi
reseptor, reseptor dimerisasi, dan interaksi dengan perancah / adaptor protein (lihat
diskusi nanti).
2.6.1 STRUKTUR X-RAY IKATAN-LIGAND DOMAIN
EXTRACELLULAR DARI MGLUR1 DIKENAL DENGAN DAN TANPA
GLUTAMAT
Domain ekstraseluler besar reseptor keluarga C secara struktural terkait dengan
keluarga protein yang mengikat bakteri yang berfungsi sebagai transporter untuk
asam amino dan molekul kecil lainnya di seluruh ruang periplasmic. Analisis
struktural X-ray telah menunjukkan bahwa glutamat dalam mGluR1 mengikat dalam
celah interdomain antara yang disebut LB1 dan LB2 domain dalam cara yang mirip
dengan, misalnya, asam amino mengikat dalam protein transpor bakteri (Gambar
2.8). Ikatan didominasi oleh interaksi dengan residu kutub pada LB1 dan LB2, yang
dibawa ke dekat dengan penutupan celah antara LB1 dan LB2 - dua domain
"sandwich" ligan. Dalam dimer disulfida yang terhubung, masing-masing monomer
mengikat glutamat a. Tidak hanya mengikat ligan terkait dengan perubahan
konformasi dalam setiap monomer (penutupan celah mengikat ligan dalam domain
ekstraselular bi-lobed), namun perubahan konformasi utama juga terjadi antara dua
protomers sebagai dua LB2 yang terbawa, rata-rata , 26 Å dekat satu sama lain pada
saat pengikatan ligan. Karena seiring rotasi, residu hadir dalam dua LB2s yang ,
dalam keadaan tidak aktif, bentuk tak terligan, adalah 43 Å jauhnya dan, dalam
bentuk glutamat terikat, ditemukan hampir menyentuh satu sama lain (Gambar 2.8).
Bahkan, dua struktur kristal tak terligat ditentukan, dan salah satunya hampir identik
dengan bentuk glutamat terikat dalam hal interdomain dan interaksi intersubunit,
menunjukkan bahwa reseptor dapat mengadopsi konformasi aktif dengan sendirinya.
Dengan demikian, tampak bahwa reseptor berada dalam keseimbangan dinamis
antara terbuka dan bentuk tertutup, antara domain ligan mengikat dalam setiap
monomer, dan antara kedua monomer dari dimer hubungan disulfida. Ligan agonis
muncul untuk bertindak hanya dengan menstabilkan yang tertutup, konformasi aktif,
reseptor mengadopsi dengan sendirinya (lihat pembahasan di bawah ini tentang hal
umum dari tema ini). Bisa dibayangkan bahwa dua gulungan tujuh heliks masing-
masing monomer (yang belum menjadi bagian dari struktur sinar-x) ditahan terpisah
dalam bentuk terbuka tak terligat tapi dibawa dekat satu sama lain dalam aktif, bentuk
tertutup. Seperti penataan ulang struktur monomer dalam dimer preformed juga
ditemukan dalam sistem reseptor sitokin satu-transmembran seperti yang dijelaskan
untuk reseptor eritropoietin, di mana ligan mengikat dalam hasil cara yang sangat
serupa dalam penutupan kesenjangan spasial antara segmen transmembran dan
dibayangkan intraseluler, domain enzym terhubung.
2.7 RESEPTOR 7TM MENJALANI DIMER-DAN OLIGOMERISASI
Banyak bukti biokimia menunjukkan \ika tidak semua reseptor 7tm memiliki
kecenderungan kuat untuk teragregat baik dengan dirinya sendiri dan dengan reseptor
7tm lainnya, paling jelas terlihat di beberapa pita berberat molekul besar dari sodium
dodesil sulfat (SDS) gel. Pita-pita yang tidak berarti terbatas pada dimer seperti,
dalam banyak kasus, beberapa struktur oligomer tatanan yang lebih tinggi yang
diamati. Ini adalah poin penting untuk dipertimbangkan kapan korelasi fungsional
pembentukan dimer dibahas dalam reseptor C non-keluarga.
2.7.1 KELUARGA C RESEPTOR FUNGSI SEBAGAI HOMO-ATAU
HETERODIMER
Bukti struktural dan fungsional jelas menunjukkan bahwa keluarga reseptor C
berfungsi sebagai dimer, baik sebagai homodimers atau sebagai heterodimer.
Reseptor glutamat metabotropic dan sensor kalsium, seperti dibahas dalam Bagian
2.6.1, ditemukan sebagai dimer kovalen terhubung di mana ada jembatan disulfida
antara residu Cys yang terletak di lingkaran dalam domain ekstraseluler N-terminal
masing-masing monomer. Jembatan Disulfida ini tampaknya hanya berfungsi untuk
menahan monomer dalam jarak dekat, seperti loop yang begitu terstruktur sehingga
tidak terselesaikan dalam struktur sinar-x.
GABA reseptor B bukanlah reseptor 7tm tunggal melainkan sebuah heterodimer
yang dibentuk oleh dua reseptor 7tm dari keluarga C. reseptor GABA B-R1, yang
awalnya dikloning, mengikat ligan GABA, tapi ketika diekspresikan sendiri itu
adalah untuk sebagian besar dipertahankan dalam retikulum endoplasma, itu sinyal
buruk, dan tidak memberikan profil farmakologis yang tepat. Sebaliknya, reseptor
GABAB-R2 tidak mengikat ligan dengan sendirinya, namun reseptor ini berfungsi
sebagai pendamping yang menahan ekspresi permukaan sel dari subunit GABAB-R1.
Heterodimer menampilkan profil farmakologis yang benar sesuai dengan reseptor
GABAB dari SSP dan sinyal sebagai reseptor GABAB alam melalui saluran kalium,
yang bukan kasus untuk monomer. Sinyal ini, menariknya, dimediasi melalui subunit
R2. Dasar struktural untuk pembentukan dimer pada reseptor GABAB terutama
struktur coil-coil yang terbentuk antara segmen ekor C-terminal dari subunit R1 dan
R2.
GAMBAR 2.8 aktif (bawah) dan tidak aktif (atas) struktur dari domain ekstraselular
dari reseptor glutamat metabotropic mGluR1 dari keluarga C. Sebuah diagram
skematik serpentine menunjukkan keseimbangan dasar reseptor penuh antara
konformasi aktif dan tidak aktif dan lokasi bagian dari reseptor yang telah struktural
ditandai dengan dan tanpa ligan yang terikat, glutamat. Reseptor Keluarga B
umumnya berfungsi sebagai dimer - dalam kasus mGluRs, sebagai dimer disulfida-
linked, seperti yang ditunjukkan. Ikatan Ligan domain masing-masing adalah "fly-
trap" terdiri dari dua domain yang lebih kecil, LB1 dan LB2, yang ditemukan dalam
konfigurasi terbuka di keadaan tidak aktif tapi dekat sekitar dan distabilkan oleh ligan
glutamat dalam keadaan aktif . Perhatikan perubahan konformasi yang cukup besar,
yang terjadi tidak hanya di dalam tetapi juga antara dua domain ekstraselular dari
dimer. Beberapa residu yang lebih dari 40 Å terpisah dalam keadaan tidak aktif tetapi
saling berhadapan langsung dalam keadaan aktif ditunjukkan. Perubahan konformasi
antara dua bagian dari dimer di mGluR1 ini agak mirip dengan perubahan konformasi
yang terjadi antara monomer dari reseptor erythropoietin pada saat aktivasi, yang
membawa transmembran dan domain intraseluler ke dalam kontak dekat.
2.7.2 FUNGSI SIGNIFIKAN DARI DIMERISASI LEBIH TIDAK JELAS
ANTARA RESEPTOR RHODOPSIN-LIKE
Untuk sebagian besar anggota keluarga A, berbeda dengan reseptor keluarga C,
telah sulit untuk membuktikan bahwa dimerisasi, atau lebih tepatnya oligomerisasi,
memiliki konsekuensi fungsional dan itu, sebagai fenomena umum, terkait erat
dengan proses aktivasi seperti itu. Tidak ada keraguan bahwa homo dan hetero-
oligomerisasi reseptor 7tm merupakan fenomena umum seperti yang ditunjukkan
oleh, misalnya, co-immunoprecipisasi menggunakan berbagai kontrol yang tepat.
Beberapa penelitian menggunakan transfer energi lightresonance (baik dalam bentuk
fluoresensi [fret] atau bioluminescence [Bret]) telah meyakinkan menunjukkan bahwa
homo dan hetero-oligomer seperti yang ditemukan pada permukaan sel-sel hidup utuh
tanpa adanya ligan, yaitu , dimer / oligomer konstitutif terbentuk. Catatan,
bagaimanapun, bahwa tidak ada efek agonis terbalik telah ditunjukkan untuk
fenomena ini. Efek agonis pada konstitutif fret atau sinyal Bret tidak jelas, dan
bervariasi dari studi ke studi dan dari sistem reseptor ke sistem reseptor. Namun
demikian, dalam beberapa sistem reseptor, heterodimerisasi / - oligomerisasi telah
diamati, dengan profil farmakologi yang berbeda dari profil diamati pada homo-
oligomer dinyatakan dalam sistem ekspresi heterolog yang sama.
Keluarga prototipe reseptor A, rhodopsin sendiri, jelas berfungsi sebagai
monomer meskipun kejadian dalam kepadatan yang sangat tinggi dalam membran
peka cahaya, namun dapat dikatakan bahwa rhodopsin tidak boleh digunakan sebagai
contoh untuk reseptor pada umumnya karena memiliki persyaratan yang sangat
istimewa dalam hal sinyal karena fungsinya sebagai sensor cahaya ultra-cepat.
2.8 RESEPTOR 7TM ITU DALAM EKUILIBRIUM DINAMIS ANTARA
KONFORMASI AKTIF DAN TIDAK AKTIF
Struktur kristal mGluR1 secara jelas menunjukkan bahwa aktivasi reseptor 7tm
dapat terjadi melalui pertukaran antara dua konformasi utama protomers dalam dimer
preformed. Hal ini mungkin bisa mewakili mekanisme aktivasi untuk reseptor 7tm
pada umumnya. Tapi, diyakini bahwa perubahan konformasi dalam gulungan tujuh
heliks dikaitkan dengan aktivasi reseptor, yang jelas sangat penting dalam reseptor-
reseptor yang berfungsi sebagai monomer, yang bisa menjadi mayoritas. Yang
penting, rangkaian struktur mGluR1 memang menunjukkan bahwa konformasi aktif
tidak disebabkan oleh ligan mengikat per se, tetapi bahkan perubahan konformasi
sangat besar dapat terjadi secara spontan. Dengan demikian, konformasi aktif reseptor
tersebut tidak disebabkan oleh ligan, reseptor dapat melipat ke dalam konformasi
aktif dengan sendirinya. Reseptor adalah protein membran dinamis yang ada secara
alami dalam keseimbangan antara konformasi aktif dan inaktif. Jika sebagian kecil
dari populasi reseptor pada waktu tertentu dalam konformasi aktif tanpa kehadiran
ligan, maka 7tm reseptor harus menampilkan beberapa derajat aktivitas sinyal
konstitutif. Artinya, pada kenyataannya, kasus tersebut. Dalam sel transfected dengan
reseptor 7tm, tingkat yang sesuai pembawa pesan kedua intraseluler umumnya
meningkat, tanpa hadir agonis (Gambar 2.9). Selain itu, semakin tinggi tingkat
ekspresi reseptor, semakin tinggi tingkat pengantar pesan intraselular kedua. Tingkat
aktivitas konstitutif bervariasi dari reseptor reseptor. Beberapa reseptor, seperti virally
dikodekan 7tm onkogen ORF74, dapat menampilkan hingga aktivitas konstitutif
50%. Dalam reseptor lain, tingkat aktivitas konstitutif sangat rendah sehingga hampir
mustahil untuk ditunjukkan. Dalam reseptor asetilkolin nikotinat, saluran ion ligand-
gated, diperkirakan bahwa hanya satu dalam satu juta reseptor pada waktu tertentu
dalam konformasi aktif tanpa kehadiran ligan. Seperti tingkat rendah aktivitas
konstitutif tidak akan terdeteksi dalam reseptor 7tm. Namun demikian, reseptor 7tm
adalah, seperti saluran ion ligand-gated dan kebanyakan protein lainnya, protein
alosterik yang mematuhi prinsip dasar jenis bersama allosterynya dari Monod,
Wyman, dan Changeux, yaitu, mereka pertukaran antara konformasi yang berbeda
yang dapat distabilkan oleh ligan.
GAMBAR 2.9 agonism vs agonis terbalik dan antagonisme. Meningkatnya tingkat
pengantar pesan kedua dalam sel mengekspresikan reseptor 7tm ditampilkan.
Kegiatan sinyal konstitutif ini dapat berkisar dari terukur sampai 50% atau lebih dari
kapasitas sinyal maksimal, tergantung pada reseptor dan jumlah reseptor yang
diekspresikan oleh sel-sel. Agonis dan agonis terbalik adalah properti dari ligan
sendiri dalam interaksi dengan reseptor. Agonis akan meningkatkan tingkat pembawa
pesan kedua lebih lanjut, sedangkan agonis terbalik akan menurunkan secara spontan
tingkat peningkatan pembawa pesan kedua kembali ke tingkat sel untransfected.
Ligan yang menunjukkan keberhasilan sinyal kurang dari agonis penuh (yaitu, agonis
parsial dan agonis terbalik) akan berfungsi sebagai antagonis dalam kompetisi untuk
reseptor hunian dengan agonis penuh (perhatikan bahwa antagonisme bukanlah milik
ligan dengan sendirinya pada reseptor). Ligan netral sering kali, namun tidak selalu,
juga antagonis.
2.8.1 AGONISM DAN AGONIS INVERS SIFAT DASAR LIGAN MANDIRI
TERHADAP RESEPTOR
Dalam sistem di mana reseptor berada dalam keseimbangan dinamis antara
aktif dan bentuk tidak aktif, ligan yang mengikat reseptor akan menggeser
kesetimbangan ini ke satu sisi, tergantung pada afinitas relatif senyawa baik aktif
maupun konformasi inaktif . Dengan demikian, ligan disebut agonis baik karena akan
meningkatkan sinyal jika memiliki afinitas tertinggi untuk konformasi aktif atau
menurunkan aktivitas sinyal jika memiliki afinitas tertinggi untuk konformasi aktif,
ligan kemudian disebut agonis terbalik (Gambar 2.9). Sebuah ligan yang memiliki
afinitas yang sama untuk konformasi aktif dan tidak aktif, yang tidak terlalu sering
diamati, tidak akan menggeser kesetimbangan dan dengan sesuai tidak akan
mengubah sinyal dan disebut ligan netral (atau antagonis netral ). Dengan demikian,
agonis dan agonis terbalik adalah sifat ligan sendirian di reseptor, sedangkan
antagonisme adalah properti yang diamati dari ligan dengan adanya agonis. Di
hadapan agonis penuh, agonis terbalik, ligan netral, dan agonis parsial akan, ketika
bersaing untuk hunian reseptor dengan agonis penuh, membawa sinyal ke aktivitas
yang diamati dengan ligan ini saja, dan mereka semua akan sesuai fungsi sebagai
antagonis. Bahkan, ligan netral, secara umum, juga akan memusuhi efek agonis
terbalik dan membawa kembali sinyal ke tingkat konstitutif normal.
Perlu dicatat bahwa agonis terbalik hanya dapat dihargai dalam sistem reseptor
mana aktivitas konstitutif yang terukur dan karenanya dapat diamati menurun. Jadi,
antagonis netral dan agonis terbalik hanya dapat dibedakan dalam suatu sistem di
mana reseptor menunjukkan aktivitas konstitutif. Pada pengaturan in vivo, agonis
alam akan paling sering hadir, dan untuk semua tujuan praktis sulit untuk
membedakan antara agonis terbalik dan efek pada aktivitas spontan yang disebabkan
oleh nada dari ligan endogen pada reseptor.
Dalam model matematika yang digunakan untuk menjelaskan hubungan ikatan
dan aktivitas yang diamati, fenomena ini dijelaskan dalam apa yang disebut alosterik
terner Model kompleks Lefkowitz dan Costa dan versi selanjutnya dari buku ini.
Menurut model ini, bentuk sinyal utama reseptor adalah salah satu yang terjadi di
kompleks terner terdiri dari agonis, reseptor, dan G-protein. Kedua agonis dan G-
protein akan memiliki afinitas tinggi untuk bentuk "terisomerisasikan" dari reseptor.
Penting untuk dicatat bahwa dalam 7tm reseptor, agonis akan memiliki afinitas
signifikan lebih rendah untuk bentuk G-protein-uncoupled reseptor, yaitu, mereka
mengikat dengan cara G-protein-dependen. Hal ini menjadi semakin jelas bahwa
antagonis, pada kenyataannya, memiliki afinitas tertinggi untuk konformasi reseptor
G-proteinuncoupled. Dengan kata lain, agonis dan antagonis mengikat istimewa
untuk populasi konformasi yang berbeda dan saling melengkapi target reseptor
bersama mereka.
2.8.2 MUTASI SERING MENGGESER KESEIMBANGAN TERHADAP
KONFORMASI ACTIVE
Rupanya, hambatan struktural menjaga reseptor 7tm dalam konformasi inaktif
yang mencegah interaksi produktif antara urutan di bagian sitoplasma dari segmen
transmembran dan loop intraseluler dan G-protein. Gangguan dari kendala ini akan
menggeser kesetimbangan ke arah konformasi aktif dan menyebabkan aktivitas
spontan atau konstitutif. Dengan demikian, di beberapa reseptor jelas bahwa reseptor
ini sangat mudah bergeser ke arah aktif, sinyal konformasi, karena banyak yang
berbeda mutasi eksperimen diinduksi akan menghasilkan peningkatan sinyal
konstitutif. Misalnya, dalam beberapa reseptor pengenalan monoamin pada posisi
tertentu tepat di bawah TM-VI dari setiap 19 residu asam amino lain dari yang dipilih
oleh evolusi akan meningkatkan aktivitas konstitutif di atas tingkat normal. Meskipun
hot spot tertentu untuk lokasi mutasi menyebabkan aktivitas konstitutif tinggi
(misalnya, Asp dalam urutan KERING), mengaktifkan mutasi tersebut telah
ditemukan di seluruh struktur reseptor 7tm, termasuk loop ekstraselular. Secara
umum, bentuk sinyal aktif reseptor agak tidak stabil, yang telah diamati secara
langsung di reseptor fluorescently label dan juga tercermin dari rendahnya tingkat
ekspresi permukaan mutan konstitutif aktif.
Mutasi yang menggeser kesetimbangan ke arah bentuk konstitutif aktif akan
sering menyebabkan penyakit. Misalnya, mengaktifkan mutasi pada TSH atau
reseptor LH bertanggung jawab untuk pengembangan adenoma tiroid dan
perkembangan pubertas pada anak-anak kecil, masing-masing. Dalam kasus adenoma
tiroid, reseptor TSH normal dinyatakan dalam sekitarnya jaringan tiroid normal.
2.8.3 TM-VI TERUTAMA MUNCUL UNTUK MENJALANI PERUBAHAN
KONFORMASI UTAMA PADA RESEPTOR AKTIVASI
Beberapa jenis bukti biokimia dan biofisik menunjukkan bahwa TM-VI
melakukan perubahan konformasi yang paling penting selama induksi agonis aktivasi
reseptor. Misalnya, percobaan EPR menggunakan label berputar sistematis
diperkenalkan telah menunjukkan bahwa akhir intraseluler TM-VI bergerak keluar
dan jauh dari pusat reseptor. Bukti juga menunjukkan bahwa helix VI dapat menjalani
rotasi berlawanan selama gerakan ini. TM-VI hanya berinteraksi dengan TM-II, TM-
III, dan TM-V melalui interaksi van der Waals dan bukan interaksi-ikatan hidrogen.
Selain itu, bagian sitoplasma dari TM-VI bawah baik tersimpan penyediaan: 15 tidak
dikemas sangat efisien untuk segmen transmembran tetangga. Dengan demikian,
hambatan energi untuk gerakan rigidbody ini bagian dari TM-VI jauh dari gulungan
heliks tidak besar seperti umumnya dibayangkan pada protein padat. Ia telah
mengemukakan bahwa penyediaan: 15 sangat penting untuk mekanisme aktivasi dan
bahwa gerakan TM-VI terjadi sekitar ini titik lemah, atau sendi, di heliks.
Melalui gerakan yang disarankan dari TM-VI, spasi dihasilkan antara TM-III
dan TM-VI yang bisa diharapkan menjadi situs interaksi yang penting untuk bagian
dari G-protein, yang berinteraksi dengan ujung intraseluler TM-III, TM-V, dan TM-
VI, serta helix VIII horizontal (lihat Gambar 2.5). Pengikatan G-protein jelas
diketahui menginduksi tinggi afinitas agonis keadaan ikatan reseptor 7tm pada
umumnya. Pengikatan arrestin, agak mengherankan, seperti Gprotein tersebut, juga
menginduksi keadaan ikatan agonis afinitas tinggi, dan karena itu dapat dibayangkan
bahwa arrestin mampu menempati beberapa ruang yang sama di bagian intraseluler
dari reseptor sebagai G -protein. Ruang ini bisa antara TM-III dan TM-VI, sehingga
menstabilkan konformasi aktif sesama reseptor, yang tetap tidak memberi sinyal
karena G-protein dicegah membentuk dengan kehadiran arrestin.
GAMBAR 2.10 Ikhtisar pola yang berbeda dari ikatan ligan pada reseptor 7tm
ditunjukkan secara skematis pada model serpentine dua dimensi. Tampaknya ada
beberapa cara berbeda untuk ligan untuk mengikat dan mengaktifkan reseptor 7tm,
dibayangkan karena agonis ini terutama hanya berfungsi untuk menstabilkan
konformasi aktif, dimana reseptor dapat melipat ke dalam dengan sendirinya (lihat
Gambar 2.8 dan teks). Dalam reseptor trombin, ditunjukkan ke kanan, enzim
memotong segmen N-terminal dan dengan demikian mengungkapkan (kotak abu-
abu) oligopeptida, yang kemudian mengaktifkan reseptor yang sementara masih
secara kovalen tertambat ke domain transmembran.
2.9 RESEPTOR 7tm Memiliki Beberapa Mode Ikatan Agonis
Pada awalnya orang percaya bahwa akan ada "kunci" umum di semua reseptor
homolog 7tm, sesuai dengan identifikasi awal situs ikatan monoamina, di mana
semua agonis dalam beberapa cara akan cocok. Saat itu dibayangkan bahwa dalam
7tm reseptor yang berbeda kunci ini berada, selama evolusi, secara khusus dilengkapi
untuk mengenali agonis tertentu. Namun, seperti ditunjukkan secara skematis pada
Gambar 2.10, analisis mutasi dan cross-linking percobaan telah menunjukkan bahwa
ligan kimiawi sangat berbeda ternyata mengikat dalam mode agak berbeda.
Sayangnya, sebagian besar pengetahuan kita tentang interaksi ligan-reseptor masih
didasarkan pada percobaan kehilangan fungsi (yaitu, mutasi atau substitusi yang
merusak mengikat atau kopling). Sangat sedikit dari titik-titik yang diduga interaksi
pada faktanya telah dipelajari secara rinci besar menggunakan alternatif, metode
tambahan.
2.9.1 RETINA, MONOAMINA, DAN IKATAN PEMBAWA PESAN KECIL
LAINNYA ANTARA SEGMEN TRANSMEMBRAN
Pengikatan ligan ini tidak terjadi dalam "cekung groove" yang terletak di
permukaan protein reseptor seperti yang sering dibayangkan. Seperti dijelaskan
dalam Bagian 2.2.1, struktur sinar-x rhodopsin menunjukkan bahwa retina terikat
jauh di dalam struktur tujuh heliks dengan poin interaksi utama dalam TM-III dan
TM-VI, serta titik lampiran kovalen di TM- VII. Bahkan, rhodopsin berinteraksi pada
dasarnya dengan semua segmen transmembran. Yang penting, rantai samping dari
heliks transmembran menutupi molekul retina di semua sisi, dan tempat ikatan yang
ditemukan di dalam protein tersebut yang tengah, ditutupi oleh plug loop
ekstraseluler yang teratur (Gambar 2.1 dan 2.2). Dengan demikian, gerakan utama
bagian yang signifikan dari reseptor harus terjadi agar ligan untuk bergerak kedalam
atau keluar dari situs mengikat, yang tidak terjadi karena "back-isomerisasi" dari
retina terjadi pada sel lain. Ini agak analog dengan pengikatan hormon steroid dan
ligan lainnya di reseptor nuklir, di mana panjang, helix yang tertata meliputi saku
mengikat terletak hampir di tengah-tengah dari protein reseptor.
Monoamina muncul untuk mengikat dalam cara yang agak mirip dengan retina.
Dalam sistem katekolamin, interaksi spesifik dan langsung dari gugus amina ligan
dengan kelompok karboksilat dari residu asam aspartat benar-benar tersimpan dalam
transmembran segmen III (AspIII: 08) telah dibuktikan secara detail melalui
penggunaan gabungan biologi molekuler dan kimia obat. Interaksi diselidiki baik
dengan menghancurkan mengikat dan aktivasi reseptor dengan bermutasi Asp untuk
Ser (mengubah asam karboksilat dengan gugus hidroksil) dan dengan
menghancurkan pengikatan ligan dengan mengubah amina ke keton atau ester.
Berbeda dengan reseptor wildtype, reseptor mutan, yang memiliki residu sering
diperkenalkan di tempat aspartat di TM-III, ligan terikat dengan afinitas tinggi ketika
keton atau ester diganti amina. Dengan kata lain, interaksi spesifik antara amina dan
gugus karboksilat asam-reseptor dapat ditukar dengan jenis lain dari interaksi kimia
melalui kecerdasan, modifikasi pelengkap dari kedua ligan dan reseptor.
Dengan demikian, gambar yang disukai saat ini dari pengikatan isoproterenol
ke reseptor β-adrenergik adalah bahwa ligan mengikat dalam kantung yang berpusat
antara TM-III, TM-V, dan TM-VI. Amina ligan berinteraksi dengan kelompok
karboksilat-asam dari Asp tersimpan di TM-III, sedangkan cincin katekol yang
berorientasi melalui interaksi-ikatan hidrogen dengan dua residu serin pada akhir
ekstraseluler TM-V. Cincin itu sendiri mengalami interaksi aromatik-aromatik
dengan residu fenilalanin di TM-VI terletak satu putaran heliks bawah sebuah Asn,
yang mengarah ke interaksi hidrogen-ikatan dengan kelompok β-hidroksi (Gambar
2.11). Asetilkolin, histamin, dopamin, serotonin, dan lainnya amina diyakini
mengikat dengan cara yang sama dengan berinteraksi dengan residu terletak pada
posisi yang sesuai dan / atau tetangga di reseptor target mereka. Amina titik interaksi,
AspIII: 08, kekal antara semua reseptor monoamin dan juga ditemukan dalam,
misalnya, opioid, somatostatin, dan KIA reseptor.
2.9.2 PEPTIDA TERIKAT DALAM BEBERAPA CARA DENGAN SITUS
INTERAKSI UTAMA DI SEGMEN EXTERIOR
Hormon-hormon glikoprotein besar, seperti TSH dan LH, mencapai sebagian
besar energi yang mengikat mereka dengan interaksi dengan segmen N-terminal
besar reseptor mereka. Menengah dan kecil ukuran neuropeptida dan hormon peptida
seperti substansi P dan angiotensin biasanya juga memiliki poin utama interaksi
terletak di segmen N-terminal reseptor mereka, tetapi dengan tambahan titik kontak
penting dalam loop dan di bagian terluar dari segmen transmembran. Titik-titik
kontak, yang tersebar dalam struktur primer, tampaknya berada dalam jarak relatif
dekat spasial dalam model terlipat reseptor (Gambar 2.12). Dalam beberapa kasus,
hubungi poin untuk peptida juga terletak lebih dalam di reseptor. Misalnya,
angiotensin muncul untuk berinteraksi dengan residu Lys dalam posisi V: 05. Mutasi
dalam beberapa studi telah menunjukkan bahwa peptida besar seperti NPY harus
berinteraksi dengan residu yang mendalam di tengah reseptor, bahkan lebih dalam
daripada terletak saku monoamina-mengikat, namun ada kemungkinan bahwa hit
mutasi tersebut mempengaruhi pengikatan peptida tidak langsung. Untuk peptida
yang lebih kecil seperti TRH, tampak bahwa sebagian besar titik interaksi yang
berlokasi lebih dekat ke tempat titik kontak untuk monoamina ditemukan: di sama
dalam saku bagian dari celah ligan mengikat reseptor utama.
Protease diaktifkan reseptor PAR-1 sampai PAR-4, yang PAR-1 adalah
reseptor trombin dan PAR-2 dibayangkan reseptor Faktor-VIIA, adalah kasus yang
sangat menarik. Ligan untuk reseptor ini merupakan bagian dari perpanjangan N-
terminal reseptor. Enzim (misalnya, trombin) akan mengikat dan membelah dari
sebagian besar segmen ini ekstraseluler dan dengan demikian mengungkapkan baru,
gratis N-terminus, sebuah pentapeptide kecil yang masih kovalen terikat ke seluruh
reseptor. Ini kecil, ditambatkan peptida "ligan" akan mengaktifkan reseptor dengan
cara mengikat terutama ke bagian lain dari domain eksterior reseptor, termasuk sisa-
sekarang terpotong segmen N-terminal (Gambar 2.10). Dengan demikian, reseptor ini
memiliki terlindung atau dikurung peptida ligan sudah kovalen ditambatkan ke
ekstensi N-terminal. Bisa dibayangkan bahwa beberapa ligan peptida lainnya
(misalnya, dalam keluarga kemokin atau glukagon GLP-1 keluarga) bertindak
sebagai "pseudo-ditambatkan" ligan. Mereka akan, melalui pengikatan awal untuk
segmen N-terminal reseptor target mereka, menjadi ditambatkan dan kemudian,
melalui interaksi sekunder dengan domain utama reseptor, menyelesaikan proses
aktivasi.
GAMBAR 2.11 Binding situs untuk katekolamin dalam reseptor adrenergik. Residu
kontak utama untuk isoproterenol agonis ditunjukkan dalam hitam putih monoamina
agonis diyakini untuk berinteraksi terutama dengan AspIII: 08, serv: 09, serv: 12,
PheVI: 17, dan AsnVI: 20. Yang ditunjukkan interaksi antara gugus amina ligan dan
kelompok karboksilat-asam AspIII: 08 secara meyakinkan telah ditunjukkan oleh
modifikasi gabungan dari reseptor dengan modifikasi mutagenesis dan saling
melengkapi dari ligan yang dilakukan oleh kimia obat. (Dari Strader, CD et al., J.
Biol. Chem., 266, 5-8, 1991. Dengan izin.)
2.9.3 NONPEPTIDE AGONIS TERIKAT DI BAGIAN DALAM DARI CELAH
IKATAN-LIGAND UTAMA
Tidak banyak agonis nonpeptide yang belum tersedia, tetapi senyawa tersebut
telah dijelaskan - misalnya, dalam angiotensin, CCK, dan sistem reseptor opioid.
Bahkan, untuk beberapa reseptor, seperti somatostatin, ghrelin, dan melengkapi
reseptor C5A, pada dasarnya semua senyawa yang ditemukan oleh pemeriksaan
menggunakan tes mengikat adalah agonis. Sebaliknya, bagi mayoritas reseptor yang
senyawa yang ditemukan dengan cara ini, mereka adalah antagonis. Alasan untuk ini
tidak diketahui. Tidak ada studi pemetaan rinci agonis nonpeptide telah menunjukkan
saku mengikat yang sebenarnya, tetapi jelas bahwa peta hits mutasi jauh dari
bertepatan dengan bahwa dari peptida agonis yang sesuai dan bahwa agonis
nonpeptide muncul untuk mengikat dalam gulungan tujuh heliks. Mekanisme
mengikat dan aktivasi alosterik tersebut telah dengan jelas telah ditunjukkan untuk
agonis nonpeptide untuk reseptor glutamat metabotropic dan sensor kalsium, di mana
glutamat atau kalsium mengikat keluar dalam domain ekstraselular, sedangkan agonis
nonpeptide kecil mengaktifkan reseptor ini dengan mengikat dalam gulungan tujuh
heliks . Untuk substansi P NK-1 reseptor, sebuah saklar logam-ion mengaktifkan
telah dibangun antara TM-III dan TM-VII (residu III: 08 dan VII: 06) tanpa
mempengaruhi substansi P mengikat dan aktivasi (Gambar 2.12). Dalam kasus ini,
jelas pula bahwa reseptor yang sama dapat diaktifkan baik dengan mengikat peptida
sampai di ujung loop dan ekstraseluler dari heliks atau kecil, yang jelas-ion logam
mengikat mendalam antara heliks, yang cocok baik dengan mekanisme aktivasi
alosterik dijelaskan di atas.
GAMBAR 2.12 situs pengikatan berbeda untuk agonis dan antagonis nonpeptide di
NK-1 (substansi P) reseptor. (A) Titik kontak diduga untuk agonis alami, substansi P,
ditunjukkan pada lingkaran putih pada abu-abu yang terletak di bagian yang lebih
ekstraseluler dari celah-ligan mengikat utama. Lokasi dua residu, yang ketika
bermutasi menjadi residu mengikat logam-ion dapat membentuk saklar logam-ion
mengaktifkan, yang menunjukkan untuk ditempatkan satu putaran heliks bawah dua
poin interaksi untuk agonis peptida dalam TM-III dan TM-VII, masing-masing.
Dengan demikian, agonis oleh ligan tampaknya diperoleh terutama melalui stabilisasi
suatu konformasi aktif antara segmen luar TM-III, TM-VI, dan VII TM-. (B)
Diagram roda heliks menunjukkan residu kontak diduga untuk quinuclidine
nonpeptide antagonis CP96, 345 di putih abu-abu yang terletak di saku dari celah-
ligan mengikat utama. Situs ini mengikat secara struktural dan fungsional juga dapat
berubah menjadi saklar ion logam-antagonis melalui pengenalan ion logam-residu
yang mengikat, seperti yang ditunjukkan. Perhatikan perbedaan yang cukup besar
dalam situs mengikat untuk agonis dan antagonis, yang dalam kasus situs ion logam-
antagonis tidak memiliki tumpang tindih. Hal ini menunjukkan bahwa ligan bertindak
sebagai "alosterik kompetitif" ligan, bersaing untuk mengikat reseptor dengan cara
mengikat ke situs yang berbeda ditampilkan dalam konformasi yang berbeda dari
reseptor: sebuah konformasi aktif dan salah satu dari banyak konformasi aktif,
masing-masing (lihat juga Gambar 2.8) . Dengan cara ini, mengikat satu ligan tidak
termasuk pengikatan jenis lainnya. (Bagian A dari Holst, B. et al., Mol. Pharmacol.,
58, 263-270, 2000. Dengan izin Bagian. B dari Elling, CE et al., Nature, 374, 74-77,
1995. Dengan izin .)
2.10 ANTAGONIS MUNGKIN TERIKAT SEPERTI AGONIS ATAU
MUNGKIN MEREKA TERIKAT SECARA SANGAT BERBEDA
Awalnya diyakini bahwa antagonis kompetitif akan mengikat ke situs yang
sama sebagai agonis dan fungsi hanya dengan menghalangi pengikatan agonis pada
reseptor, namun, jelas hari ini bahwa antagonis, apakah atau tidak mereka berperilaku
dengan cara kompetitif klasik, dapat bertindak secara independen dari agonis.
Kebanyakan jika tidak semua antagonis adalah agonis terbalik, yang merupakan
properti itu sendiri independen dari kehadiran agonis, sebagai ligan menghambat
aktivitas konstitutif reseptor dan karena itu tidak hanya menghambat akses agonis
untuk reseptor. Sesuai dengan ini, tidak mengherankan bahwa antagonis sering
memiliki situs mengikat mereka sendiri, yang mungkin atau mungkin tidak
bertepatan dengan bahwa dari agonis yang sesuai.
2.10.1 ANTAGONIS MONOAMIN SERING TERIKAT DEKAT DENGAN
DIMANA AGONIS MENGIKAT (ISOSTERICALLY)
Banyak antagonis untuk reseptor monoamine secara kimiawi mirip dengan
agonis yang sesuai sehubungan dengan memperlihatkan nitrogen bermuatan positif.
Dalam sistem reseptor, agonis sering dapat dikonversi menjadi antagonis melalui
modifikasi kimia relatif kecil. Dalam sebagian besar sistem ini, telah dibuktikan atau
diasumsikan bahwa antagonis, seperti agonis, berinteraksi dengan Asp tersimpan di
TM-III dan bahwa mereka menempati banyak ruang yang sama, yang biasanya
menempati agonis, dalam saku antara TM-III, TM-V, dan TM-VI. Namun, beberapa
antagonis, banyak yang agonis parsial, telah terbukti memiliki titik interaksi
tambahan - misalnya, di bagian atas TM-VII. Jadi, antagonis untuk monoamina, yang
dalam banyak kasus juga antagonis kompetitif klasik, mengikat sebagian besar ke
situs yang sama sebagai agonis yang sesuai dan berfungsi sebagai antagonis
kompetitif isosteric.
2.10.2 ANTAGONIS NONPEPTIDE MUNGKIN TERIKAT AGAK BERBEDA
DARI AGONIS
Selama bertahun-tahun, analog peptida telah dikenal yang bertindak sebagai
antagonis atau agonis parsial. Properti antagonis diperoleh dengan substitusi dengan
asam D-amino, pengenalan ikatan peptida berkurang, atau penggantian dengan
conformationally dibatasi analog asam amino. Antagonis peptida tersebut berbagi
banyak situs mengikat mereka dengan agonis peptida alami dan oleh karena itu juga
antagonis kompetitif isosteric.
Baru-baru ini, senyawa nonpeptide telah dikembangkan untuk banyak sistem
reseptor peptida. Senyawa ini, yang biasanya ditemukan melalui pemeriksaan file
kimia, umumnya tidak menyerupai ligan peptida yang sesuai kimia. Namun
demikian, mereka bertindak sebagai antagonis spesifik dan sering bersaing untuk
ligan peptida pada reseptor peptida. Pemetaan situs mengikat bagi antagonis
nonpeptide telah mengungkapkan bahwa mereka sering mengikat agak berbeda dari
agonis peptida. Senyawa nonpeptide biasanya memiliki titik interaksi yang letaknya
relatif jauh di dalam saku antara TM-III, TM-V, TM-VI, dan VII TM-, sesuai dengan
mana agonis dan antagonis untuk reseptor mengikat monoamine (Gambar 2.12).
Sebagaimana dibahas di atas, banyak agonis peptida ternyata tidak mencapai ke
bagian bawah saku ini. Dengan demikian, dalam beberapa kasus, antagonis reseptor
peptida nonpeptide untuk dapat bertindak sebagai antagonis kompetitif alosterik,
mengikat epitop berbeda dari agonis, namun, dua ligan masih bersaing untuk hunian
reseptor. Kinetika kompetitif dalam kasus tersebut adalah akibat dari fenomena yang
mengikat satu ligan termasuk pengikatan ligan lainnya. Peptida agonis dan antagonis
mengikat nonpeptide saling eksklusif dan dengan demikian bersaing untuk seluruh
reseptor, meskipun belum tentu situs mengikatumum. Secara matematis, ini mirip
dengan model klasik mengikat kompetitif. Pola mengikat saling eksklusif mungkin
akibat dari fakta bahwa agonis dan antagonis istimewa mengikat negara konformasi
yang berbeda dari reseptor (yaitu, aktif dan konformasi aktif, masing-masing). Dalam
P reseptor substansi, tempat pengikatan antagonis nonpeptide bahkan telah diterima
oleh suatu situs pengikatan logam-ion tanpa efek pada pengikatan agonis. Dalam
reseptor mutan, ion seng telah menggantikan antagonis nonpeptide dalam
pertentangan baik mengikat dan fungsi substansi P. Hal ini diyakini bahwa senyawa
nonpeptide dan ion seng bertindak sebagai antagonis dengan memilih dan
menstabilkan suatu konformasi aktif dan bahwa mereka demikian mencegah
pengikatan dan tindakan agonis.
Meskipun kantong mengikat telah diidentifikasi selama beberapa ligan, hanya
dalam sedikit kasus bahwa interaksi spesifik antara bagian kimia khusus pada ligan
dan Sidechain tertentu reseptor telah diidentifikasi oleh bukti biokimia keras.
Sebagaimana dibahas di atas, pemetaan interaksi tersebut harus didasarkan pada nyata
gain-of-fungsi percobaan. Dengan demikian, kita masih mengejutkan jauh dari
mengetahui orientasi sebenarnya dari pembawa pesan alami dan obat-obatan dalam
kantong mengikat mereka.
2.11 RESEPTOR 7TM MUNCUL UNTUK FUNGSI DI KOMPLEKS
PROTEIN BERSAMA PROTEIN SIGNAL-TRANSDUKSI LAINNYA
Hal ini sering membayangkan bahwa reseptor 7tm melayang di membran
menunggu hormon untuk mengikat dan bahwa kompleks hormon-reseptor kemudian
harus berbenturan dengan tepat G-protein. Aktif G-protein subunit kemudian akan
berdifusi pergi untuk menghadapi sebuah molekul efektor hilir, yang misalnya akan
menghasilkan pembawa pesan kedua, yang pada gilirannya diyakini menyebar jauh
ke dalam sel untuk akhirnya menemukan sebuah molekul efektor hilir lebih lanjut.
Namun, tampak bahwa sebagian besar proses ini terjadi dalam kompleks preformed
protein sinyal transduksi, termasuk reseptor hormon diadakan di dekat oleh perancah
khusus atau protein adaptor. Contoh protein tersebut adalah yang disebut protein
multi-PDZ, yang menyatakan jumlah domain PDZ yang berbeda, masing-masing
mengikat protein sinyal transduksi yang berbeda, biasanya melalui urutan
oligopeptide C-terminal yang jauh. Dengan membawa sinyal protein berurutan
berdekatan, kecepatan, selektivitas, dan efisiensi tercapai karena keterbatasan difusi
dieliminasi. Kedekatan ini sangat penting dalam komunikasi saraf, di mana protein
adaptor menciptakan sinaps yang 7tm reseptor, saluran ion, dan protein sinyal
sitoplasma dilokalisasi dalam struktur fokus diskrit dalam membran, terkait erat
dengan sitoskeleton. Sejumlah besar protein yang terlibat dalam menciptakan
sinapsis, termasuk protein multi-PDZ seperti PSD-95 (postsynaptic density-95)
(Gambar 2.13).
Untuk reseptor keluarga C, pentingnya dan dasar struktural untuk interaksi
dengan adaptor intraseluler atau protein perancah telah ditandai dengan sangat rinci,
seperti isu pembentukan dimer agak jelas untuk reseptor ini. Keluarga utama protein
adaptor, yang menjamin penargetan sel dan fungsi sinyal yang benar untuk reseptor
glutamat metabotropic, appearto menjadi apa yang disebut protein Homer, yang
sebagian besar terdiri dari dua domain: (1) sebuah EHV domain N-terminal yang
dapat mengikat kedua ujung C-terminal mGluRs atau ke inositol-1 ,4,5-fosfat (IP3)
reseptor / ryanodine reseptor pada membran retikulum endoplasma, dan (2) leusin
motif ritsleting C-terminal yang bertanggung jawab untuk kumparan -coil interaksi.
Seperti ditunjukkan dalam Gambar 2.13, domain EHV akan mengikat ekor C-
terminal dari reseptor mGluR dan IP3 reseptor, dan homodimerizasi dari domain
kumparan-kumparan dari protein Homer kemudian akan memastikan dekat antara
kedua sinyal protein , yang tidak akan berada jauh dari satu sama lain dalam sel. Ini
adalah sistem yang dinamis, sebagai upregulasi protein Homer-1a, yang penting tidak
memiliki domain motif leusin ritsleting, akan bersaing untuk mengikat dengan
protein Homer bifunctional dan mengakibatkan terganggunya signa l
transductosomes.
GAMBAR 2.13 Contoh interaksi reseptor dengan adaptor dan perancah protein. (A)
Interaksi reseptor glutamat metabotropic dengan protein Homer, yang melalui EVH1
mengikat domain mereka baik ekor reseptor yang terletak di membran sel dan IP3
reseptor yang terletak di membran toko kalsium dari retikulum endoplasma. Melalui
ritsleting leusin domain dari protein Homer, dimerisasi Homers dalam struktur
kumparan-kumparan terjadi. Dengan cara ini, komponen utama dari mesin sinyal
transduksi yang diadakan di dekat untuk menciptakan mekanisme sinyal yang efisien
melalui protein G, fosfolipase C, dan IP3. (B) Sistem yang sama menunjukkan bahwa
upregulasi protein Homer-1a, yang hanya memiliki satu EVH1 domain dan tidak ada
ritsleting leusin domain, akan, melalui kompetisi, memecahkan hubungan erat antara
reseptor dan molekul sinyal transduksi hilir, di kasus ini IP3 reseptor. (C) Ilustrasi
bagaimana PSD-95 (postsynaptic density protein 95) melalui PDZ domain dapat
memegang kedua reseptor 7tm dan saluran ion ligand-gated di daerah sinaptik.
Seperti dengan banyak protein perancah lainnya, PSD-95 memiliki beberapa domain
mengikat yang berbeda, dalam hal ini tiga domain yang berbeda PDZ, sebuah SH3
domain, dan domain Guk. Sebagai PSD-95 dapat berinteraksi baik dengan PSD-95
protein lainnya serta dengan protein perancah lain dan dengan protein dalam
sitoskeleton, mikro-arsitektur kompleks sinyal transduksi dapat dibangun.
Diharapkan bahwa reseptor 7tm diberikan dalam sel yang diberikan akan dapat
berpartisipasi dalam tidak hanya satu tapi juga lebih dari satu jenis sinyal
transductosome. Dengan demikian, reseptor akan menampilkan yang berbeda
fenotipe farmakologi molekuler dalam hal sinyal dan mungkin juga dalam hal sifat-
sifat ligan mengikat. Sangat mungkin bahwa hal itu tidak akan menjadi proses yang
sederhana untuk reseptor untuk berpindah dari satu jenis sinyal kompleks yang lain,
dan dapat dibayangkan bahwa reseptor bahkan mungkin harus pergi melalui siklus
internalisasi dan daur ulang dalam rangka untuk mengubah sinyal mitra.
2.12 SIGNAL RESEPTOR 7Tm MATI, ATAU DIAKTIFKAN, OLEH
MEKANISME DESENSITISASI
Tujuh transmembran reseptor sinyal diatur secara ketat dalam rangka untuk
memungkinkan penyesuaian terhadap perubahan lingkungan dan sehingga dapat
beradaptasi dengan situasi stimulasi lanjutan dan melindungi sel dari overstimulasi.
Sejumlah proses yang berbeda yang terlibat dalam 7tm reseptor desensitisasi.
Fosforilasi reseptor oleh kedua kinase kedua-messenger dan apa yang disebut G-
protein-coupled reseptor kinase (GRKs) akan terjadi dalam hitungan detik, diikuti
dalam beberapa menit dengan pengikatan arrestin, yang mencegah mengikat G-
protein dan berfungsi sebagai adaptor untuk selanjutnya mengikat clathrin, dan
kemudian oleh endositosis (Gambar 2.14). Lebih downregulasi jangka panjang
dikendalikan melalui ekspresi gen reseptor diubah, yang akan terjadi dalam beberapa
jam.
2.12.1 RESEPTOR 7TM YANG TERFOSFORILASI OLEH KINASE
KEDUA KEDUA-MESSENGER DAN KINASE RESEPTOR KHUSUS
Fosforilasi adalah cara yang paling cepat desensitizing reseptor 7tm dengan
uncoupling itu dari G-protein, dibayangkan melalui mengubah sifat elektrostatik dari
daerah yang terlibat dalam Gprotein mengikat. Kinase kedua pembawa pesan-
diaktifkan PKA (protein kinase A, kinase cAMP-dependent) dan PKC (protein kinase
C, terutama diaktifkan oleh diasilgliserol [DAG]) akan memfosforilasi Ser dan residu
THR di intraseluler lingkaran-3 dan ekor C-terminal dari 7tm reseptor dekat TMVII
terlepas dari keadaan aktivasi reseptor. Kinase kedua-messenger karena itu terutama
yang terlibat dalam apa yang disebut desensitisasi heterolog, di mana stimulasi dari
satu jenis reseptor 7tm dapat menurunkan rasa mudah terpengaruh sejumlah reseptor
lain dalam sel yang sama. Menariknya, setidaknya untuk β2-adrenoreseptor,
fosforilasi PKA Gαs-dimediasi tidak hanya Memisahkan reseptor dari Gs tapi
rupanya sekaligus menggeser sinyal ke Gi.
Berbeda dengan kinase kedua pembawa pesan-diatur, para GRKs selektif
memfosforilasi agonis reseptor-diaktifkan 7tm dan dengan demikian meningkatkan
afinitas reseptor untuk protein signalblocking, arrestin. Target residu untuk GRKs
berada di intraseluler lingkaran-3, terutama di ekor C-terminal dan sering dalam
urutan asam. GRKs merupakan keluarga setidaknya tujuh protein yang terdiri dari (1)
suatu receptor ikatan domain N-terminal (sering termasuk domain RGS terlibat dalam
mematikan Gi dan fungsi protein Gq), (2) bagian tengah, domain kinase katalitik; dan
(3) membran C-terminal domain penahan. Dinamis dan diatur membran asosiasi
adalah bagian penting dari fungsi yang paling GRKs, karena membawa mereka ke
dekat dengan substrat mereka, reseptor. Pada GRK1 dan GRK7 (visual GRKs),
membran asosiasi dicapai melalui farnesylasi C-terminal urutan CAAX mereka. Pada
GRK2 dan GRK3, yang secara historis disebut kinase reseptor β-adrenergik (atau
βARKs) tapi yang sebenarnya didistribusikan secara luas dan bertindak pada banyak
reseptor 7tm, 125-asam amino domain homologi pleckstrin C-terminal khusus akan
mengikat subunit β-γ dari heterotrimeric G-protein dan dengan demikian
mengamankan dekat dengan membran-terkait kompleks reseptor-G-protein. GRK4
dan GRK6 adalah membran terkait bahkan tanpa adanya reseptor 7tm diaktifkan
melalui palmitoylasi, yang merupakan modifikasi posttranslasial diatur. Pengaruh
fosforilasi oleh GRKs tidak identik, karena keduanya GRK2 dan GRK5 akan
mengikat dan phosphorylate β1-adrenoreseptor, tetapi hanya GRK5 fosforilasi
menyebabkan reseptor uncoupling dari protein perancah PSD-95.
GAMBAR 2.14 Agonis-induced desensitisasi reseptor dan internalisasi.
Mengikat agonis akan menstabilkan konformasi aktif dari reseptor yang akan
berinteraksi dengan heterotrimeric G-protein, yang menyebabkan sinyal transduksi
(pojok kiri atas). Sinyal ini dimatikan oleh fosforilasi reseptor oleh GRK dan
mungkin PKA, yang meningkatkan afinitas untuk β-arrestin. fungsi β-Arrestin
sebagai protein adaptor sambungan ke clathrin dan AP2 (dilambangkan oleh
pentamers abu-abu), dan ini mendorong pembentukan lubang dilapisi (di tengah
gambar), yang mencubit off oleh GTPase tersebut, dynamin, sehingga vesikel
dilapisi. Vesikula bergerak secara intraseluler melalui jalur endocytotic, di mana
perubahan dalam lingkungan (termasuk, misalnya, pengasaman) menyebabkan ligan
disosiasi dan detasemen β-arrestin. Agonis ini passaged untuk degradasi, dan reseptor
dephosphorylated. Tergantung pada jenis reseptor, itu kemudian rusak atau baik,
lebih sering, didaur ulang kembali ke permukaan sel, siap untuk pertemuan baru
dengan agonis.
2.12.2 SIGNAL BLOK ARESTIN DAN FUNGSINYA SEBAGAI ADAPTOR
PROTEIN UNTUK CLATHRIN
Inaktivasi penuh 7tm reseptor sinyal dicapai melalui pengikatan salah satu
keluarga molekul arrestin, yang sterik menghambat pengikatan G-protein. Arrestins
adalah protein sitosol, yang, setelah agonis mengikat reseptor 7tm, translokasi ke
diaktifkan, reseptor terfosforilasi dalam beberapa menit. Perbedaan afinitas arrestin
untuk reseptor terfosforilasi vs Nonphosphorylated hanya 10 - sampai 30 kali lipat.
Meskipun elemen kunci untuk arrestin mengikat diyakini terletak terutama di
perpanjangan C-terminal dari reseptor 7tm, arrestins berinteraksi juga dengan
intraseluler lingkaran-2 dan -3. Arrestins secara struktural terdiri dari dua domain
utama, masing-masing terdiri dari tujuh terdampar β-sandwich yang diikuti dengan
ekstensi C-terminal. Mengikat reseptor dimediasi terutama melalui paling N-terminal
β-roti domain arrestin, sedangkan bagian Cterminal protein bertanggung jawab untuk
membawa reseptor untuk lubang clathrin berlapis dan peristiwa endocytotic
berikutnya. Dengan demikian, fungsi arrestin sebagai protein adaptor
menghubungkan reseptor ke subunit β2-adaptin dari heterotrimeric AP-2 adapter
kompleks dan untuk clathrin sendiri.
2.12.3 INTERNALISASI DIIKUTI PENARGETAN KE LISOSOM ATAU
DENGAN DAUR ULANG
Reseptor internalisasi melalui lubang berlapis clathrin membawa reseptor
melalui kompartemen endocytotic mana ligan biasanya akan memisahkan dari
reseptor karena pH rendah untuk akhirnya terdegradasi pada akhir endosomes dan
lisosom. diasingkan reseptor baik mengikuti rute yang sama dan nasib fatal seperti
ligan, yang merupakan kasus, misalnya, untuk reseptor protease-diaktifkan dengan
ligan ditambatkan mereka, atau reseptor dephosphorylated oleh reseptor spesifik
fosfatase dan kemudian didaur ulang ke membran vesikel daur ulang. Tingkat dan
kecepatan resensitizasi dan daur ulang bervariasi antara reseptor 7tm. Dalam
beberapa kasus, sinyal dari reseptor 7tm dapat beralih dari G-protein-mediated
signaling dengan protein microtubuleassociated (MAP)-kinase-mediated signaling
oleh proses internalisasi, namun dalam kasus lain, reseptor 7tm mungkin sinyal
melalui MAP kinase independen internalisasi.
2.13 BACAAN
Rhodopsin-like 7TM receptor structure
Ballesteros, J. A., Shi, L., and Javitch, J. A., Structural mimicry in G-protein-coupled
receptors: implications of the high-resolution structure of rhodopsin for
structureŔfunction analysis of rhodopsin-like receptors, Mol. Pharmacol.,
60(1), 1Ŕ19, 2001.
Palczewski, K., Kumasaka, T., Hori, T., Behnke, C. A., Motoshima, H., Fox, B. A.,
Le, T. I., Teller, D. C., Okada, T., Stenkamp, R. E., Yamamoto, M., and
Miyano, M., Crystal structure of rhodopsin: a Gprotein- coupled receptor,
Science, 289(5480), 739Ŕ745, 2000.
Teller, D. C., Okada, T., Behnke, C. A., Palczewski, K., and Stenkamp, R. E.,
Advances in determination of a high-resolution three-dimensional
structure of rhodopsin, a model of G-protein-coupled receptors (GPCRs),
Biochemistry, 40(26), 7761Ŕ7772, 2001.
Orphan 7TM receptor
Stadel, J. M., Wilson, S., and Bergsma, D. J., Orphan G-protein-coupled receptors: a
neglected opportunity for pioneer drug discovery, Trends Pharmacol. Sci.,
18(11), 430Ŕ437, 1997.
Wilson, S., Bergsma, D. J., Chambers, J. K., Muir, A. I., Fantom, K. G., Ellis, C.,
Murdock, P. R., Herrity, N. C., and Stadel, J. M., Orphan G-protein-
coupled receptors: the next generation of drug targets?, Br. J. Pharmacol.,
125(7), 1387Ŕ1392, 1998.
Family B and C 7TM receptors
Bockaert, J. and Pin, J. P., Molecular tinkering of G-protein-coupled receptors: an
evolutionary success, EMBO J., 18(7), 1723Ŕ1729, 1999.
7TM receptor dimerization
Bouvier, M., Oligomerization of G-protein-coupled transmitter receptors, Nat. Rev.
Neurosci., 2(4), 274Ŕ286, 2001.
Milligan, G., Oligomerisation of G-protein-coupled receptors, J. Cell. Sci., 114(pt. 7),
1265Ŕ1271, 2001.
7TM receptors in equilibrium between active and inactive conformations
Elling, C. E., Thirstrup, K., Holst, B., and Schwartz, T. W., Conversion of agonist site
to metal-ion chelator site in the beta(2)-adrenergic receptor, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 96(22), 12322Ŕ12327, 1999.
Gether, U., Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-
coupled receptors, Endocr. Rev., 21(1), 90Ŕ113, 2000.
Gether, U. and Kobilka, B. K., G-protein-coupled receptors. II. Mechanism of agonist
activation, J. Biol. Chem., 273(29), 17979Ŕ17982, 1998.
Kenakin T., Inverse, protean, and ligand-selective agonism: matters of receptor
conformation, FASEB J., 15(3), 598Ŕ611, 2001.
Lefkowitz, R. J., Cotecchia, S., Samama, P. S., and Costa, T., Constitutive activity of
receptors coupled to guanine nucleotide regulatory proteins, Trends
Pharmacol. Sci., 14, 303Ŕ307, 1993.
Ligand binding in 7TM receptors
Elling, C. E., Nielsen, S. M., and Schwartz, T. W., Conversion of antagonist-binding
site to metal-ion site in the tachykinin Nk-1 receptor, Nature, 374(2), 74Ŕ
77, 1995.
Kunishima, N., Shimada, Y., Tsuji, Y., Sato, T., Yamamoto, M., Kumasaka, T.,
Nakanishi, S., Jingami, H., and Morikawa, K., Structural basis of
glutamate recognition by a dimeric metabotropic glutamate receptor,
Nature, 407(6807), 971Ŕ977, 2000.
Schwartz, T. W., Locating ligand-binding sites in 7TM receptors by protein
engineering, Curr. Opin. Biotechnol., 5, 434Ŕ444, 1994.
Schwartz, T. W. and Rosenkilde, M. M., Is there a Ŗlockŗ for all Ŗkeysŗ in 7TM
receptors?, Trends Pharmacol. Sci., 17, 213Ŕ216, 1996.
Strader, C. D., Gaffney, T., Sugg, E. E., Candelore, M. R., Keys, R., Patchett, A. A.,
and Dixon, R. A. F., Allele-specific activation of genetically engineered
receptors, J. Biol. Chem., 266, 5Ŕ8, 1991.
7TM scaffolding and adaptor proteins
Milligan, G. and White, J. H., ProteinŔprotein interactions at G-protein-coupled
receptors, Trends Pharmacol. Sci., 22(10), 513Ŕ518, 2001.
Xiao, B., Tu, J. C., and Worley, P. F., Homer: a link between neural activity and
glutamate receptor function, Curr. Opin. Neurobiol., 10(3), 370Ŕ374,
2000.
7TM receptor desensitization
Ferguson, S. S., Evolving concepts in G-protein-coupled receptor endocytosis: the
role in receptor desensitization and signaling, Pharmacol. Rev., 53(1), 1Ŕ
24, 2001.
Krupnick, J. G. and Benovic, J. L., The role of receptor kinases and arrestins in G-
protein-coupled receptor regulation, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 38,
289Ŕ319, 1998.
Pierce, K. L., Lefkowitz, R. J., and Lefkowitz, R. J., Classical and new roles of beta-
arrestin in the regulation of G-protein-coupled receptors, Nat. Rev.
Neurosci., 2(10), 727Ŕ733, 2001.
3 Struktur Ligan-gated
Ion Saluran
Jan Egebjerg
ISI
3.2 Reseptor 4TM .................................................... ..........................................
112
3.2.1 Kloning Molekuler .......................................... ......................................... 112
3.2.2 Tiga-Dimensi Struktur ........................................................ ..................... 114
3.2.3 Lubang pori .................................................. ............................................ 115
3.2.4 Ligan-Binding Site .............................................. ..................................... 118
3.3 rangsang Reseptor Amino-Asam: 3TM Reseptor ........................................ 119
3.3.1 Kloning Molekuler ............................................. ...................................... 120
3.3.1.1 AMPA Reseptor ............................................. ....................................... 120
3.3.1.2 Reseptor kainate ............................................. ....................................... 122
3.3.1.3 NMDA Reseptor ............................................. ...................................... 122
3.3.1.4 Reseptor Orphan ............................................. ...................................... 124
3.3.2 Reseptor Topologi ............................................. .......................................
124
3.3.3 Ekstraseluler Bagian Reseptor: The Agonist Binding Site ....................... 124
3.3.4 Modifikasi posttranscripsional ............................................... .................. 125
3.3.5 Pori Region ............................................ .................................................. 126
3.3.6 intraselular Site of Reseptor ini .......................................... ............... 126
3.4 ATP Reseptor: 2TM Reseptor .............................................. .......................
127
3.5 Masalah
3.6 Bacaan lebih lanjut ........................................ ..............................................
129
3.7 Solusi untuk Masalah ............................................. ..................................... 129
3.1 PENDAHULUAN
Saluran ion ligand-gated merupakan glikoprotein integral yang melintang
membran sel. Semua molekuler ditandai saluran ion ligand-gated adalah kompleks
multisubunit. Saluran ion ligand-gated umumnya ada di salah satu dari tiga negara
fungsional: istirahat (atau tertutup), terbuka, atau peka. Setiap negara fungsional
mungkin mencerminkan banyak negara konformasi diskrit dengan sifat farmakologi
yang berbeda. Reseptor dalam keadaan istirahat, berdasarkan atas permohonan dari
agonis, akan mengalami transisi cepat untuk keadaan terbuka, disebut Gating, dan
sebagian agonis juga akan mengalami transisi ke negara peka. Karena negara peka
sering menunjukkan afinitas agonis lebih tinggi dari keadaan terbuka, sebagian besar
reseptor akan berada dalam keadaan peka setelah terpapar agonis berkepanjangan.
Reseptor memiliki tiga sifat penting: (1) mereka aktif dalam menanggapi ligan
tertentu, (2) mereka melakukan ion melalui membran sel dinyatakan kedap air, dan
(3) mereka memilih di antara ion yang berbeda.
Kloning molekuler, dikombinasikan dengan berbagai teknik yang berbeda, telah
mengungkapkan keberadaan setidaknya tiga keluarga struktural berbeda saluran
ligand-gated. Keluarga-keluarga ini dapat diklasifikasikan sebagai reseptor empat
transmembran (4TM), reseptor asam amino rangsang (3TM), dan adenosin trifosfat
(ATP) reseptor (2TM). Reseptor ini merupakan kelas utama saluran ion ligand-gated
dalam membran plasma. Reseptor lain, seperti capsaicinactivated vallinoid reseptor
(6TM), yang tidak ada ligan endogen telah diidentifikasi, sedangkan intraseluler C2 +
diaktifkan ryanodine reseptor, dan inositol 1,4,5-trifosfat (IP3 α-diaktifkan reseptor,
juga ligan- gated saluran ion tetapi tidak akan dibahas dalam bab ini.
3.2 RESEPTOR 4TM
4TM keluarga reseptor terdiri dari reseptor asetilkolin nikotinat (nAChR),
serotonin reseptor (5HT3 α, glisin reseptor, dan reseptor asam b-aminobutyric
(GABAA dan GABAC). Yang nAChRs adalah reseptor rangsang utama dalam otot
rangka dan sistem saraf perifer vertebrata. Dalam sistem saraf pusat, nAChRs hadir
dalam jumlah yang jauh lebih kecil dari reseptor glutamat. 5HT3receptors juga kation
selektif tetapi terletak secara eksklusif pada neuron. Glisin dan GABA adalah
neurotransmitter penghambatan utama. GABA menonjol dalam korteks dan
cerebellum, sedangkan glisin yang paling melimpah di sumsum tulang belakang dan
batang otak. Kedua ligan mengaktifkan arus klorida. Sebagian besar agonis juga
mengaktifkan reseptor G-protein-coupled.
3.2.1 KLONING MOLEKULER
Reseptor 4TM yang pentameric kompleks terdiri dari subunit dari 420 ke
55amino asam. Subunit menunjukkan identitas urutan 25-75%, dengan distribusi
yang sama dari hidrofobik dan hidrofilik domain (Tabel 3.1). Hidrofilik 210-230
asam amino domain N-terminal diikuti oleh tiga berjarak dekat hidrofobik dan diduga
domain transmembran, maka intraseluler lingkaran variabel-panjang, dan akhirnya
sebuah daerah transmembran diduga keempat sesaat sebelum C-terminus (Gambar
3.1). Dari empat calon daerah transmembran, bukti menunjukkan bahwa TM2 bentuk
ana-helix, sementara daerah hidrofobik lainnya lebih cenderung dilipat sebagai β-
sheet. Kloning molekuler telah menghasilkan identifikasi nAChR subunit otot α1, β1,
y, , dan e dan α2 struktural terkait saraf untuk α10 dan β2 untuk β4. neuronal
nAChR subunit α2 α4 untuk dapat berkumpul dengan β2 atau β4 dan menghasilkan
reseptor heteromeric fungsional , yang merupakan 7 sampai dengan 9 subunit dapat
menghasilkan reseptor homomerik fungsional, dan α10 subunit hanya membentuk
saluran fungsional dalam kombinasi dengan α9 subunit. Para nAChRs saraf merakit
sesuai dengan stoikiometri umum α2 β3 dengan subunit β antara subunit α (Gambar
3.2). Jelas, sifat-sifat reseptor tergantung pada komposisi subunit. Sebuah proses
perakitan yang tidak dikontrol dalam sel mengekspresikan lebih dari dua subunit
yang berbeda akan menghasilkan jumlah yang sangat besar jenis reseptor yang
berbeda. Setidaknya dalam sel otot di mana empat subunit yang berbeda disajikan
pada saat yang sama, subunit dirakit di urutan memerintahkan untuk mencapai
stoikiometri yang benar dan hubungan lingkungan.
GAMBAR 3.1 representasi Schematic dari topologi transmembran dari keluarga
reseptor 4TM. Hanya TM2 menunjukkan struktur α-heliks dalam studi mikroskopis
elektron, daerah TM tersisa dapat melipat dalam struktur lembar-β. Kedua N-
terminus (ditandai dengan NH2) dan C-terminus berada ekstrasel. Loop sitoplasma
antara TM3 dan TM4 variabel dalam ukuran dan berisi situs fosforilasi diduga.
Empat glisin reseptor subunit telah diidentifikasi: tiga subunit α dan subunit β
satu. Ketika dinyatakan dalam sistem heterolog, reseptor α homomerik menghasilkan
saluran fungsional, dan strychnine dan picrotoxin menghambat arus. Sebuah analisis
yang lebih rinci telah mengungkapkan bahwa subunit β, mungkin di stoikiometri α3
β2, diperlukan untuk menghasilkan sifat saluran mirip dengan saluran dipelajari
dalam neuron sumsum tulang belakang dewasa, sedangkan reseptor glisin embrio
lebih seperti reseptor α homomerik.
GAMBAR 3.2 Skema representasi dari organisasi subunit yang paling melimpah
kompleks reseptor heteromeric: (a) embrio otot nikotinat nAChR otot AchR memiliki
stoikiometri (α1) 2 βγε (dewasa), (b) AchR nikotinat neuronal, (c) reseptor glisin, dan
(d) GABA A reseptor. Lingkaran menunjukkan lokasi dari situs agonis mengikat pada
antarmuka antara subunit di nAChR dan GABA A reseptor. Alun-alun menunjukkan
lokasi situs pengikatan benzodiazepine. digambarkan GABA A reseptor Model
adalah model umum dengan setidaknya satu GABA dan satu situs pengikatan
benzodiazepin. Jumlah situs mengikat berbeda pada GABA A reseptor tergantung
pada stoikiometri akhir kompleks pentameric.
Keragaman GABA A subunit (Gambar 3.2D) tercermin dalam farmakologi yang
sangat kompleks. Ekspresi subunit dalam sistem heterolog menunjukkan bahwa
kombinasi α, β, dan γ dapat menghasilkan reseptor fungsional, menunjukkan bahwa
pembatasan dalam kombinasi subunit didefinisikan oleh tingkat ekspresi dan
mekanisme perakitan sel-dependent kemungkinan besar juga. ρ1 untuk ρ3 subunit
terutama co-merakit satu sama lain untuk membentuk GABA C reseptor.
Reseptor GABA dapat dimodulasi, dengan cara subtipe-selektif, oleh sejumlah
agen yang baik meningkatkan arus (benzodiazepin, barbiturat) atau mengurangi arus
(bicuculline, β-carbolines, picrotoxin). Situs pengikatan GABA sangat dipengaruhi
oleh subunit β, tapi ekspresi gabungan dengan subunit α diperlukan untuk ekspresi
fungsional yang signifikan. Kompleksitas farmakologi benzodiazepine diilustrasikan
oleh pengamatan bahwa α / β reseptor heteromeric tidak potensial oleh
benzodiazepin. Hal ini mengejutkan, karena silang percobaan ditugaskan situs
pengikatan benzodiazepin dengan subunit α. Hanya co-ekspresi subunit α dan β
dengan subunit γ menghasilkan reseptor yang potensial oleh benzodiazepin. Dengan
demikian, farmakologi benzodiazepin tergantung pada subunit α, tetapi dalam rangka
untuk memiliki implikasi fungsional, kompleks reseptor juga harus mengandung
subunit γ. Mayoritas reseptor GABAA mengandung α, β, dan subunit γ dengan situs
mengikat GABA dan benzodiazepin pada α-β dan α-γ interface, masing-masing.
Farmakologi reseptor akan tergantung tidak hanya pada tiga subunit tetapi juga pada
sisa dua subunit.
Kontribusi dari subtipe reseptor yang berbeda dalam aktivitas neuronal
merupakan masalah sangat kompleks. Kemajuan terbaru dalam genetika tikus telah
memberikan metode untuk menggunakan informasi rinci diperoleh oleh studi dari
reseptor rekombinan dalam sistem heterolog. Sebuah contoh yang elegan telah
penjelasan kontribusi dari berbagai GABAA α subunit pada spektrum yang luas dari
tindakan ditimbulkan oleh benzodiazepin klinis digunakan. Seperti disebutkan,
benzodiazepin mengikat pada antarmuka antara α dan subunit γ, tetapi benzodiazepin
dikenal menunjukkan selektivitas rendah di antara α1, α2, α3, dan α5 subunit. Studi
molekuler telah menunjukkan bahwa substitusi histidin-to-arginin dalam subunit α
menghapuskan interaksi benzodiazepine. Mengganti bagian dari gen pengkodean α1
subunit dengan-Nya-to-Arg mutan pada tikus menghasilkan tikus yang efek
benzodiazepine pada reseptor α1 mengandung dihilangkan. Pada tikus mutan, efek
dikenal benzodiazepin seperti myorelaxasi, gangguan motorik, anxiolysis, dan etanol
potensiasi tetap, sedangkan efek benzodiazepin lainnya seperti sedasi dan amnesia
tidak diinduksi, menunjukkan bahwa reseptor α1 mengandung berkontribusi terhadap
perilaku ini.
3.2.2 STRUKTUR TIGA DIMENSI
Para nAChRs otot rangka dan organ listrik ikan adalah yang terbaik ditandai
saluran ion ligandgated 4TM. Reseptor adalah kompleks kDa 290 terdiri dari empat
subunit yang berbeda dirakit menjadi heterolog (α1) 2β1γδ pentameric kompleks.
Dalam otot rangka, γ subunit embrio digantikan oleh subunit ε dalam jaringan
dewasa. Dalam mikrograf elektron dari situs sinaptik, dilihat tegak lurus terhadap
bidang membran, kompleks reseptor, dalam keadaan istirahat, muncul sebagai
partikel cincin seperti dengan diameter luar 80 Å dan ban dalam 20 sampai 25 Å.
Dilihat dari sisi (Gambar 3.3), reseptor tampak seperti silinder 125-Å-panjang
menonjol 60 Å ke celah sinaptik dan 20 Å ke dalam sitoplasma, dengan kepadatan
persegi seperti terletak di bawah ruang depan cytoplasmatic. Kation-budidayanya
jalur terdiri dari tiga bagian. Di bagian sinaptik, membentuk sebuah tabung berisi air
20 Å dan diameter 60 Å panjang. Bagian berikutnya, melintasi membran, dibentuk
oleh daerah lebih terbatas sekitar 30 Å panjang (pori-pori). Dekat tengah membran,
jalur menjadi terbatas di daerah di mana jalur tersebut akan diblokir bila saluran
ditutup (pintu gerbang). sitoplasma bagian dari jalur membentuk silinder 20 Å dan
diameter 20 Å panjang. Tutup pemeriksaan mikrograf elektron menunjukkan bahwa
masing-masing subunit memiliki heliks-α seperti segmen lapisan pori-pori. Segmen
ini terdiri dari dua heliks α dipisahkan oleh suatu ketegaran di sekitar titik tengah
menunjuk ke pori-pori (dalam keadaan istirahat), memberi pori-pori yang "jam pasir"
bentuk dengan ketegaran terletak pada titik yang paling terbatas. Ketika reseptor
diaktifkan oleh asetilkolin, masing-masing segmen heliks berputar, membuka pintu
gerbang. Dalam keadaan terbuka, pori-pori menyempit dari luar ke situs sitoplasma,
di mana diameter kira-kira 11 Å. Dengan demikian, lentur antara dua α heliks
memberikan cara yang efektif untuk mengubah bentuk dan ukuran pori-pori (Gambar
3.4)
GAMBAR 3.3 (a) Model reseptor 4TM. Model ini menunjukkan situs ligan
mengikat, bilayer membran, dan posisi saluran gerbang. (B) Elektron kepadatan peta
dari nAChR dalam profil sebesar 4,6 Data Å. Kerapatan elektron ditunjukkan melalui
penampang sebuah subunit α dan antarmuka antara subunit α lain dan subunit δ.
Asterisk menunjukkan situs pengikatan Ach diusulkan. (C) Model dari AchR
menunjukkan: (1) bahwa Ach memasuki ruang depan ekstraseluler sebelum mengikat
ke situs mengikat, (2) yang memasuki kation akan melewati vestibulum ekstraseluler,
pori-pori, dan pada situs sitoplasma akan disaring melalui pembukaan bermuatan
negatif dalam reseptor (courtesy of N. Unwin).
GAMBAR 3.4 orientasi TM2 heliks segmen di negara tertutup dan terbuka dari
saluran. Di sebelah kiri adalah pandangan dari dua dari lima heliks dari sisi, di mana
segmen heliks digambarkan sebagai dua heliks (batang) yang dipisahkan oleh
ketegaran mana leusin (elips) terletak. Di sebelah kanan, lima heliks dipandang dari
sisi sinaptik, di mana leucines akan memblokir pori-pori. Pengikatan agonis
menyebabkan segmen heliks memutar, dan wilayah tersempit kemudian dalam
keadaan terbuka di bagian sitoplasma dari pori-pori.
3.2.3 PORI RESEPTOR
Kemampuan saluran reseptor untuk melakukan ion, yang diukur sebagai
konduktansi (kebalikan dari resistansi) saluran, tergantung pada TM2. Percobaan
yang menunjukkan hal ini didasarkan pada pengamatan bahwa reseptor yang terbuat
dari Torpedo α, β, γ, dan subunit δ memiliki konduktansi yang berbeda dari reseptor
yang terbuat dari Torpedo α, β, γ, dan subunit δ betis. Ketika subunit δ chimeric di
bagian mana dari urutan Torpedo digantikan oleh urutan betis yang sesuai, yang
diekspresikan bersama dengan Torpedo α, β, dan γ subunit, itu menunjukkan bahwa
perbedaan keseluruhan dalam konduktansi dapat dikaitkan dengan wilayah TM2 .
Struktur wilayah TM2 jelas bukan α helix yang sempurna, namun asumsi
distribusi pentameric simetris α heliks memberi kita sebuah model struktural yang
berguna untuk menggambarkan lingkungan molekuler melalui mana ion harus lulus
ketika menyerap saluran reseptor. Karena distribusi simetris di sekitar pori-pori, asam
amino ditugaskan untuk posisi yang sama dalam keberpihakan urutan akan
membentuk cincin dalam model tiga dimensi (Gambar 3.5).
Petunjuk penting tentang bagaimana pori-pori diatur struktural diperoleh
dengan memeriksa distribusi dari residu diisi dan bermuatan dalam subunit nAChR
Torpedo. Seperti yang diharapkan untuk segmen hidrofobik, TM2 beruang tidak ada
residu dibebankan, namun, sejumlah residu bermuatan dan kutub yang terletak di
kedua ujung TM2 (Gambar 3.5). Menurut model 4TM, residu dibebankan dalam loop
TM1-TM2 akan berlokasi di pintu masuk ke pori-pori dari sisi cytoplasmatic,
sedangkan residu dibebankan dalam TM2-TM3 loop terletak di pintu masuk pori dari
sisi ekstraseluler. Karena nAChR melakukan kation, cincin bermuatan negatif
diharapkan untuk berbaris saluran dan menarik kation permeant ke pori-pori.
Memang, ketika jumlah dibebankan asam amino dalam cincin menengah berkurang
dari empat tuduhan negatif pada reseptor Torpedo asli, penurunan yang jelas dalam
konduktansi saluran diamati. Mutasi yang mengubah muatan dari cincin dalam dan
luar juga mengubah konduktansi tetapi pada tingkat yang jauh lebih rendah. Dengan
demikian, residu ini harus terkena lumen pori-pori, meskipun percobaan tambahan
menunjukkan bahwa cincin dalam dan luar lebih terlibat dalam mengatur akses kation
ke saluran daripada berada dalam kontak langsung dengan ion menyerap. Efek
optimal dari cincin bermuatan negatif pada saat ini adalah keseimbangan halus antara
menarik ion monovalen dan meningkatkan arus, di satu sisi, dan, di sisi lain, menarik
ion divalen yang mengikat residu dalam cincin dibebankan dengan tinggi afinitas,
sehingga mengurangi arus. Efek menangkal mungkin menjelaskan mengapa beberapa
subunit nAChR fungsional menyandikan asam amino bermuatan positif di posisi
cincin.
GAMBAR 3.5 Pengaturan TM2 urutan asam amino . Nomenklatur cincin
didasarkan pada urutan α7. Selektivitas menunjukkan muatan ion permeant. Mut1 dan
Mut2 adalah mutan situs-diarahkan (ditandai dengan tanda bintang) dari α7 subunit
(lihat teks).
Dalam GABA dan reseptor glisin, dimana ion permeant bermuatan negatif,
cincin bagian dalam tetap bermuatan negatif, dan luar adalah baik negatif atau netral.
Pertanyaannya, kemudian, adalah apa yang menentukan selektivitas ion saluran?
Sebuah keselarasan wilayah TM2 antara nAChR α7 subunit dan glisin dan GABA
subunit menunjukkan perbedaan asam amino di lima posisi yang melapisi pori, di
samping itu, asam amino tambahan hadir di ujung N-terminal dari segmen TM2 di
saluran anion-selektif (Gambar 3.5). Studi menunjukkan bahwa mutagenesis
substitusi asam amino yang melapisi pori-pori tidak mempengaruhi selektivitas
kation α7 nAChR (Gambar 3.5, Mut1), namun penyisipan prolin menjadi Mut1 di N-
terminus TM-II, seperti untuk GABA reseptor, mengubah saluran menjadi anion
selektif. Dengan demikian, pori-pori bisa ditembus untuk kedua kation dan anion,
akibatnya, selektivitas ion tidak terkait langsung dengan urutan asam amino dalam
pori-pori. Sedikit perubahan dalam posisi TM2 atau asam amino sekitarnya, namun,
tampaknya menentukan selektivitas ion.
Adalah penting bahwa kesimpulan berdasarkan studi mutagenesis sudah
dikonfirmasi oleh eksperimen lain, karena mutasi yang melibatkan residu di posisi
kunci untuk struktur atau fungsi mungkin memiliki efek tidak hanya sebagai akibat
dari perubahan di lokasi substitusi tetapi juga sebagai akibat dari nonlocalized
gangguan struktural dibuat untuk mengakomodasi perubahan itu. Bahkan, sebagian
besar residu menghadap lumen pori-pori juga diidentifikasi dalam label percobaan
menggunakan antagonis kompetitif dikenal untuk mengikat di pori-pori. Ketika
antagonis nonkompetitif [3H] klorpromazin itu photolabeled ke reseptor, asam amino
cross-linked yang terletak di serin, treonin, leusin dan cincin (Gambar 3.5). Bukti
untuk perubahan struktural dalam pori-pori diperoleh oleh antagonis trifluorometil-
iodophenyldiazirine yang, tanpa adanya agonis, cross-linked untuk asam amino setara
dengan valin dan cincin leusin. Namun, dengan adanya agonis, pola pelabelan meluas
ke treonin dan cincin serin, menunjukkan bahwa valin pusat, leusin, treonin dan
cincin mungkin sesuai dengan wilayah terbatas diamati dalam mikrograf elektron.
Leusin ini disarankan untuk menjadi gerbang pembentuk residu menunjuk ke pori-
pori dari ketegaran di TM-II. Hal ini didukung oleh studi mutagenesis, yang
menunjukkan bahwa substitusi leusin dengan asam amino yang lebih kecil
mempengaruhi kemampuan reseptor untuk menutup di negara peka.
3.2.4 TEMPAT IKATAN LIGAN
Untuk mempelajari sifat dari situs mengikat, penting untuk diingat bahwa
reseptor yang ada di sejumlah konformasi yang mungkin menunjukkan sifat mengikat
yang berbeda. Seperti disebutkan, afinitas untuk ligan dalam keadaan terbuka
biasanya jauh lebih rendah (10 - sampai 1000 kali lipat) dibandingkan dengan afinitas
untuk negara peka. Dengan demikian, dalam percobaan biokimia di mana reseptor
terkena ligan untuk jangka waktu yang lama, interaksi agonis reseptor akan
mencerminkan konformasi reseptor negara peka, sedangkan interaksi antagonis
mungkin mencerminkan konformasi baik keadaan istirahat atau negara peka.
Sebaliknya, evaluasi elektrofisiologi interaksi agonis mencerminkan konformasi-
afinitas rendah mengikat keadaan terbuka kecuali untuk mutan tertentu. Sebagai
contoh, dalam studi mutan α7 subunit yang cincin leusin (di pintu gerbang)
digantikan untuk asam amino yang lebih kecil, potensi untuk Ach diukur dalam
rekaman elektrofisiologi meningkat 150 kali lipat. Data bisa ditafsirkan sebagai leusin
mengganggu langsung dengan pengikatan Ach, namun single-channel konduktansi
negara diaktifkan pada konsentrasi rendah Ach berbeda dari negara-negara diaktifkan
pada konsentrasi yang lebih tinggi. Penjelasan alternatif adalah bahwa mutasi leusin
di gerbang tidak dapat menutup di salah satu konformasi di negara peka, yang
mengikat ACh dengan afinitas tinggi.
Wawasan ke dalam struktur tiga dimensi dari situs agonis pengikatan reseptor
4TM telah diperoleh dari perbandingan dengan struktur kristal protein asetilkolin
mengikat larut (AChBP) ditemukan di siput Lymnaea stagnalis. AChBP pameran
identitas urutan tertinggi dengan domain N-terminal nAChR α7 subunit (24%). Jelas,
perbandingan antara protein dengan identitas urutan rendah harus diperlakukan
dengan hati-hati. Namun, residu yang tersimpan antara anggota dari superfamili 4TM
yang hampir semua kekal dalam AChBP, dan sejumlah agonis dan antagonis
kompetitif juga mengikat AChBP, menunjukkan bahwa struktur keseluruhan
mungkin mirip. Pemeriksaan struktur tiga dimensi mendukung kesamaan struktural
(lihat di bawah).
Asetilkolin protein pengikat mengkristal sebagai kompleks pentameric, dengan
dimensi yang mirip dengan bagian ekstraseluler reseptor nicotinic (Gambar 3.6).
Subunit membentuk cincin, sehingga menghasilkan pori hidrofilik pusat, diamati
sebagai ruang depan ekstraseluler dalam studi mikroskopis elektron. Bagian tengah
dari masing-masing subunit dibentuk oleh sepuluh β-lembar, membentuk β-roti
(Gambar 3.6). Lima situs ikatan-ligand dalam kompleks pentameric yang terletak di
antara subunit, di mana lingkaran daerah, antara β-helai, bentuk satu sisi antarmuka
mengikat. Residu dari subunit garis berdekatan bagian lain dari situs mengikat, yang
terletak baik di daerah lingkaran dan di β-sheet. Semua residu yang terlibat dalam
mengikat ligan juga telah diidentifikasi dalam mutagenesis atau cross-linking
percobaan pada nAChR tersebut. Terlepas dari satu residu, semua residu ligan-
berinteraksi potensial tersimpan antara nAChR, namun, seperti yang diharapkan,
residu ini variabel antara kelas farmakologis yang berbeda dalam superfamili 4TM.
Pembentukan situs ligan mengikat pada antarmuka antara subunit yang berdekatan
memberikan penjelasan sederhana untuk keragaman farmakologis diamati pada
reseptor terbentuk dari subunit yang berbeda. Menariknya, residu tersimpan, yang
sebagian besar adalah hidrofobik, yang terlibat dalam mempertahankan struktur
keseluruhan dari subunit, lebih lanjut mendukung struktur tiga dimensi yang sama
dengan anggota dari superfamili 4TM.
GAMBAR 3.6 Struktur kristal protein asetilkolin-ikatan (AChBP). (A)
Kompleks, seperti yang terlihat dalam pori-pori yang dibentuk oleh subunit.
Kompleks ini terdiri dari lima subunit identik. Salah satu subunit disorot (seperti yang
ditunjukkan dalam insert), dan panah menunjukkan situs pengikatan agonis. (B) Lihat
dari agonis mengikat yang diusulkan dari situs pori (sepanjang panah di A). Struktur
ini karena kondisi kristalisasi, dikristalisasi dengan HEPES di situs pengikatan.
Ach rongga mengikat terletak sekitar 30 Å atas membran. Hal ini masih belum
jelas bagaimana pengikatan agonis mungkin mengaktifkan reseptor. Setidaknya dua
model yang berbeda telah diusulkan: (1) mengikat agonis mempromosikan sebuah
"intersubunit geser," di mana posisi relatif dari subunit perubahan, dan (2) perubahan
agonis-induced terjadi dalam subunit (intrasubunit), mungkin sebagai gangguan dari
loop antara β-lembar, yang mungkin dikirim langsung ke daerah pori atau tidak
langsung melalui perubahan di daerah-lembar β. Saat ini, bukti-bukti tidak cukup
untuk memutuskan antara ini atau model tambahan, namun subunit reseptor chimeric
yang berisi situs pengikatan agonis dari subunit 5HT3 dan daerah pori dari nAChR α7
subunit dapat diaktifkan dengan 5HT. Ini mendukung gagasan bahwa keseluruhan
struktur dan perubahan konformasi selama aktivasi anggota dari superfamili 4TM
sangat tersimpan. Selain itu, setiap subunit reseptor dapat dibayangkan sebagai
protein dua domain, dengan situs pengikatan agonis N-terminal dan daerah pori C-
terminal.
3.3 RANGSANGAN RESEPTOR ASAM AMINO: RESEPTOR 3TM
L-Glutamat bertindak sebagai neurotransmitter rangsang di banyak sinapsis
dalam sistem saraf pusat mamalia. Pengukuran elektrofisiologi dan penggunaan
berbagai agonis selektif dan antagonis menunjukkan bahwa reseptor glutamat yang
berbeda hidup berdampingan pada banyak neuron.
Eksogen agonis N-methyl-D-aspartate (NMDA) mengaktifkan reseptor yang
ditandai dengan kinetika lambat dan tinggi Ca2 + permeabilitas (lihat Gambar 3.8).
Selain glutamat (atau NMDA), reseptor ini memerlukan glisin sebagai agonis co.
Arus yang dilakukan oleh reseptor NMDA yang diblokir oleh ekstraseluler Mg2 +
dalam mode tegangan-dependent (Gambar 3.7). Pada membran istirahat potensial (-
70 mV), aktivasi saluran akan menghasilkan hanya dalam arus rendah karena
masuknya Mg2 + ion ke saluran akan memblokir arus. Afinitas untuk ion Mg2 + akan
menurun pada potensial membran negatif kurang sebagai pendorong listrik untuk
Mg2 + berkurang dan blok menjadi tidak efektif (Gambar 3.7).
Kelas lain dari reseptor glutamat ionotropic menunjukkan kinetika cepat dan,
dalam banyak neuron, sebuah Ca2 + rendah permeabilitas ketika diaktifkan oleh
glutamat. Selektif agonis α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-isoxazole propionat (AMPA)
mengaktifkan cepat desensitizing saat ini, seperti halnya glutamat, di sebagian besar
reseptor. Akibatnya, subtipe ini disebut sebagai reseptor AMPA. Kainate
mengaktifkan arus nondesensitizing bila diterapkan pada reseptor AMPA, tetapi
mengaktifkan arus fastdesensitizing pada jenis reseptor lain, reseptor kainate. Jenis
reseptor glutamat mengikat kainate dengan afinitas tinggi (Gambar 3.8). Selain tiga
kelompok reseptor ionotropic, glutamat juga mengaktifkan reseptor G-protein-
coupled disebut reseptor glutamat metabotropic.
Reseptor AMPA memediasi mayoritas neurotransmisi rangsang cepat dalam otak
mamalia. Kinetika cepat dan permeabilitas Ca rendah membuat reseptor ini ideal
untuk neurotransmisi cepat tanpa perubahan yang cukup dalam konsentrasi kalsium
intraseluler untuk mengaktifkan proses Ca2 +-tergantung. Reseptor NMDA adalah
co-dilokalisasi dengan reseptor AMPA pada banyak sinapsis, tetapi kinetika lambat
dari reseptor NMDA meminimalkan aktivasi reseptor glutamat setelah rilis
presynaptic tunggal di mana neuron cepat repolarizes, sehingga Mg2 + blok reseptor
NMDA. Namun, reseptor NMDA akan sepenuhnya diaktifkan setelah stimulasi luas
sinaps ketika aktivasi berulang reseptor AMPA membangkitkan depolarisasi cukup
membran postsynaptic untuk meringankan reseptor NMDA dari Mg2 + blok.
Penggunaan tergantung Ca2 + masuknya ini telah ditafsirkan menjadi salah satu
mekanisme yang mendasari untuk banyak proses saraf yang berbeda, termasuk
belajar dan memori.
GAMBAR 3.7 Hubungan Lancar-tegangan untuk N-methyl-D-aspartate (NMDA)
dan reseptor glutamat non-NMDA. (A) hubungan Lancar-tegangan dari reseptor
NMDA direkam di hadapan Mg2 +. Arus yang melalui saluran menjadi semakin kecil
pada potensial membran negatif akibat Mg2 + blok. (B) Ekspresi AMPA dan subunit
reseptor kainate menghasilkan baik linear (tipe I) atau (tipe II) hubungan arus-
tegangan dalam hati perbaikan, tergantung pada komposisi subunit reseptor. Jika
reseptor mengandung subunit diedit di Q / R situs (yaitu, GluR2 untuk reseptor
AMPA, GluR5R atau GluR6R untuk reseptor kainate), hubungan arus-tegangan
adalah linear. Reseptor terbuat dari subunit diedit sendiri atau dalam kombinasi
dengan satu sama lain dalam hati pameran perbaikan hubungan arus-tegangan.
3.3.1 KLONING MOLEKULER
Tujuh belas gen penyandi subunit reseptor glutamat telah diidentifikasi (Tabel
3.2). Ini subunit didasarkan pada identitas urutan dikelompokkan menjadi tujuh kelas
yang berbeda. Semua subunit memiliki profil serupa di plot hidrofobik dan mungkin
topologi yang sama dengan 400 - 500 - asam amino ekstraseluler N-terminal bagian
diikuti oleh wilayah 400-asam amino pengkodean domain transmembran (Gambar
3.9). C-terminus adalah intraseluler dan bervariasi dalam ukuran 50-750 asam amino.
reseptor glutamat subunit pameran, berbeda dengan reseptor 4TM, urutan variabilitas
tertinggi antara subunit pada daerah N-terminal, sedangkan domain transmembran
sangat kekal.
Masih belum bukti kuat pada stoikiometri dari kompleks reseptor. Berbagai
pendekatan telah ditunjukkan baik struktur pentameric atau tetrameric, namun data
yang lebih baru mendukung konfigurasi tetrameric (Gambar 3.10d), dan beberapa
bukti menunjukkan bahwa reseptor dapat diselenggarakan sebagai dua pasang.
3.3.1.1 Reseptor AMPA
GluR1 ke GluR4 subunit (juga bernama GluRA-GluRD) co-merakit satu
dengan yang lain tapi tidak dengan subunit dari kelas-kelas lain. Profil fungsional
reseptor kloning menunjukkan respon desensitizing ke AMPA, atau glutamat, tapi
respon nondesensitizing untuk kainate (EC50> 30 M), fitur mirip dengan penelitian
reseptor AMPA dari otak. Afinitas untuk AMPA dalam percobaan yang mengikat
juga menyerupai afinitas diamati dalam jaringan otak.
GAMBAR 3.8 kainate dan AMPA mengaktifkan respon saat yang berbeda dalam
kelas yang berbeda dan reseptor AMPA kainate: (a) reseptor AMPA, GluR1, (b) dan
(c) kainate reseptor, (d) glutamat + glisin aktivasi reseptor NMDA. Respon saat ini
ditandai dengan onset lambat dan mengimbangi dibandingkan dengan kainate dan
reseptor AMPA.
GAMBAR 3.9 (a) Diagram menunjukkan daerah reseptor glutamat yang
menunjukkan homologi urutan ke bakteri peri-plasma 2 protein yang mengikat asam
amino. (B) Skema representasi dari topologi transmembran dari reseptor asam amino
rangsang. Daerah ekstraseluler gelap menunjukkan dua lobus membentuk situs
pengikatan agonis. Daerah gelap mewakili elemen alternatif disambung (sandal /
kegagalan) di kelas reseptor AMPA. Situs diedit ditandai dengan kotak.
3.3.1.2 Reseptor kainate
Reseptor kainate terdiri dari subunit dari GluR5-GluR7 kelas dan kelas KA1-
KA2 subunit. Reseptor homomerik dari mantan kelas menghasilkan reseptor
fungsional dan mengikat kainate dengan afinitas dari 50 sampai 100 nM. KA1 atau
KA2 tidak menghasilkan saluran fungsional, tetapi reseptor mengikat kainate dengan
afinitas dari 5 sampai 10 nM. Homomerik GluR6 dan KA2 reseptor tidak diaktifkan
oleh AMPA, juga tidak mengikat AMPA. Menariknya, ketika mereka diekspresikan
bersama, reseptor AMPA heteromeric menanggapi.
3.3.1.3 Reseptor NMDA
Fungsional kompleks reseptor NMDA mengandung setidaknya satu NR1 dan
satu subunit NR2. Komposisi heteromeric menuntut dua agonis untuk aktivasi karena
glisin mengikat ke subunit NR1 dan glutamat mengikat subunit NR2. Subunit NR2
memiliki struktur dasar yang sama dengan subunit glutamat lain, kecuali untuk 400
besar - untuk domain C-terminal 630-asam amino. Banyak reseptor fitur seperti Mg2
+ blok, glisin sensitivitas, kinetika penonaktifan, dan konduktansi single-channel
berbeda, tergantung pada subunit NR2 co-merakit dengan NR1.
GAMBAR 3.10 (a) Skema ilustrasi dari model yang diusulkan untuk aktivasi
subunit. Mengikat agonis menstabilkan konformasi tertutup lobus dalam domain
mengikat. (B) Struktur co-kristal kainate dan bentuk yang larut dari domain ligan
mengikat GluR2. Backbone akan ditampilkan di "pita" format, dan residu dari asam
amino berinteraksi dengan kainate yang akan ditampilkan. (C) Ilustrasi agonis
menjembatani antara lobus. Arg485, Thr480, Pro478, dan Thr480 terletak di lobus A,
sedangkan Glu705, Ser654, dan Thr655 terletak di lobus B. (d) Model untuk aktivasi
reseptor. Aktivasi reseptor diusulkan untuk meminta aktivasi dari dua subunit, dan
aktivasi lebih subunit membuka saluran untuk tingkat konduktansi tinggi.
3.3.1.4 Reseptor Orphan
Dua subunit tambahan, δ1 dan δ2, telah diidentifikasi. Berdasarkan kesamaan
urutan, mereka milik keluarga reseptor glutamat, meskipun mereka tidak dapat
diaktifkan oleh glutamat atau yang umum agonis reseptor glutamat. Setidaknya dua
baris bukti mendukung pentingnya fungsional saluran ini: (1) KO genetik dari δ2
hasil dalam gangguan fungsi sel Purkinje cerebellum, dan (2) lurcher mutan tikus,
yang menunjukkan atrofi cerebellum yang signifikan, adalah hasil dari mutasi pada
bagian ekstraseluler dari segmen transmembran yang kedua yang membuat reseptor
konstitutif aktif.
3.3.2 Topologi RESEPTOR
Hasil dari sejumlah studi biokimia dan mutagenesis mendukung topologi tiga
transmembran dari reseptor glutamat. Daerah antara pertama dan kedua daerah
transmembran membentuk loop ulang peserta, dengan kesamaan struktural yang
diusulkan untuk P-lingkaran yang ditemukan di saluran tegangan-gated. Namun, loop
memasuki membran dari sisi cytoplasmatic di reseptor glutamat, sementara itu
terletak di sisi ekstraseluler dari saluran tegangan-gated. Transmembran nomenklatur
dalam literatur didominasi oleh awalnya diusulkan topologi empat transmembran
(Gambar 3.9).
3.3.3 BAGIAN DARI RESEPTOR EXTRACELLULAR: Tempat Ikatan Agonis
Urutan perbandingan antara reseptor glutamat dan protein lain mengungkapkan
bahwa bagian Nterminal reseptor menunjukkan tingkat rendah kesamaan urutan ke
bakteri periplasmatic ikatan protein leucine-isoleusin-valin, sementara wilayah N-
terminal M1 (130 asam amino) dan wilayah antara M3 dan M4 menunjukkan
kesamaan urutan ke protein lain bakteri: mengikat protein lisin-arginin-ornithine
(Gambar 3.9). Kesamaan urutan dan kemiripan segmen M1-M3 dengan wilayah pori
saluran tegangan-gated menunjukkan bahwa reseptor glutamat mungkin telah
berevolusi sebagai chimera dari dua modul evolusioner kuno. Telah diusulkan bahwa
subunit reseptor mungkin telah berevolusi dari penyisipan gen pengkodean segmen
pori menjadi pengkodean gen mengikat protein periplasmatic. Identifikasi reseptor
glutamat bakteri kalium-selektif, GluR0, hanya berisi domain mengikat berpotongan
dengan wilayah pori, sangat mendukung teori evolusi.
Urutan kesamaan dengan larut protein mengikat periplasmatic dan sejumlah
reseptor chimeric terbentuk antara AMPA dan reseptor kainate menunjukkan bahwa
bentuk yang larut dari domain pengikatan bisa direkayasa dengan mengganti segmen
M1-M3 dengan linker hidrofilik dan dengan truncating N -bagian terminal dan M4
dan ekor C-terminal. Ketika diperiksa, protein ini dipamerkan karakteristik
farmakologis yang sama seperti reseptor, dan itu mungkin untuk cocrystallize domain
mengikat GluR2 dengan ligan yang berbeda.
Strukturnya sangat mirip dengan protein yang mengikat periplasmatic. Struktur
keseluruhan dari domain mengikat adalah dua wilayah (disebut lobus A dan B) di
mana agonis mengikat antara lobus. Dalam kondisi terikat (bentuk apo), lobus
dipisahkan. Pengikatan agonis menstabilkan penutupan domain, yang dapat
digambarkan sebagai rotasi domain relatif satu sama lain, di mana tingkat rotasi
tergantung pada agonis. Kainate menginduksi rotasi 8 derajat, sedangkan agonis
seperti glutamat AMPA dan menginduksi penutupan ketat yang dihasilkan dari rotasi
20 derajat. Menariknya, antagonis seperti DNQX juga menginduksi penutupan lobus
tetapi hanya dengan 3 derajat, ternyata tidak cukup untuk membuka pori-pori.
Kekuatan yang menstabilkan penutupan bisa, untuk kesederhanaan, dibagi menjadi
tiga kategori yang berbeda dari kontribusi. Pertama, glutamat seperti bagian
ditemukan di semua agonis membentuk jembatan antara lobus (Gambar 3.10), dan,
kedua, struktur unik dari agonis, seperti cincin pirolidin dan isopropenil di kainate
(Gambar 3.10c), berkontribusi untuk mengikat selektif baik dengan interaksi
langsung dengan domain mengikat atau dengan membatasi konformasi gugus
glutamat. Akhirnya, kedekatan lobus dalam bentuk tertutup mempromosikan interaksi
langsung antara lobus.
Residu yang terletak di saku mengikat agonis sangat tersimpan. Antagonis
kompetitif dan agonis memilih antara reseptor NMDA dan AMPA yang / reseptor
kainate telah diidentifikasi, di mana AP-V dan NBQX atau CNQX adalah NMDA
yang paling umum digunakan selektif dan AMPA / antagonis reseptor kainate,
masing-masing. Namun, tingkat tinggi konservasi di saku mengikat telah membuat
identifikasi antagonis kompetitif subtipe-selektif sangat sulit. Akibatnya, hampir
semua senyawa selektif dikenal bertindak melalui mekanisme kompetitif - misalnya,
AMPA reseptor-selektif GYKI-53.655, cyclothiazide, yang potentiates reseptor
AMPA dengan cara sambatan-varian-dependent, atau poliamina, yang blok AMPA
dan kainate reseptor tergantung pada kehadiran subunit diedit (lihat di bawah).
Sebuah pertanyaan penting adalah bagaimana perubahan dalam domain
mengikat agonis mungkin disebarkan ke daerah pori dan menyebabkan pembukaan
saluran. Pengetahuan kita sangat terbatas, dan belajar terisolasi domain ligandikatan
memiliki keterbatasan yang jelas, namun, ada beberapa korelasi yang mencolok
antara tingkat penutupan dan modus aktivasi. Kainate, yang menginduksi penutupan
kecil, mengaktifkan arus nondesensitizing, sementara AMPA mengaktifkan lebih
besar tapi sementara saat sebelum masuk ke dalam keadaan peka (Gambar 3.8). Hal
ini telah mendorong hipotesis bahwa domain mengikat sebagian ditutup akan
menimbulkan pembukaan penuh saluran sementara domain mengikat tertutup (20
derajat memutar) akan menghasilkan keadaan peka. Menurut model ini, pembukaan
singkat yang disebabkan oleh AMPA atau glutamat mencerminkan transisi molekul
cepat dari konformasi terbuka negara mengikat bentuk tertutup rapat. Model alternatif
mengusulkan bahwa pembukaan saluran (konduktansi) meningkat sebagai domain
mengikat menutup, dan desensitisasi adalah hasil penyusunan ulang struktural antara
subunit. Hipotesis terakhir ini didukung oleh mutasi tunggal (L507Y di GluR3), yang
benar-benar menghapuskan desensitisasi. Dalam mutan ini, arus maksimal yang
ditimbulkan oleh glutamat atau AMPA adalah tiga besar daripada arus kainate-
induced. Dalam struktur kristal, L507 terletak pada antarmuka antara subunit. Selain
itu, aksi senyawa yang mengurangi tingkat desensitisasi, seperti cyclothiazide,
dipengaruhi oleh mutasi pada antarmuka subunit. Perlu diingat, bagaimanapun,
bahwa kedekatan antara domain mengikat larut sangat rendah dalam larutan, berbeda
dengan AChBP tersebut. Oleh karena itu, antarmuka diamati dalam kristal mungkin
sedikit berbeda dari interaksi dalam reseptor.
Karena reseptor glutamat dapat membentuk reseptor homomerik, sebuah
pertanyaan yang jelas adalah berapa banyak subunit harus mengikat ligan untuk
mengaktifkan saluran? Studi pada chimera nondesensitizing telah menunjukkan
bahwa aktivasi reseptor membutuhkan pengikatan dua agonis. Menariknya,
pengikatan agonis tambahan mengakibatkan konduktansi meningkat, menunjukkan
bahwa masing-masing subunit dapat diaktifkan secara independen dan dengan
demikian mengubah pembukaan saluran (Gambar 3.10d). Dalam rangka
menyelesaikan negara konduktansi yang berbeda, percobaan telah dilakukan di
hadapan antagonis perlahan memisahkan. Studi lebih lanjut diperlukan untuk
mengevaluasi pentingnya negara subconductance dalam ketiadaan antagonis. Jika,
memang, subunit diaktifkan secara independen dan pengikatan agonis hasil yang
lebih dalam meningkatkan konduktansi, kurva dosis-respons harus ditafsirkan dengan
hati-hati (lihat Masalah).
Ukuran saat agonis-diaktifkan tidak semata-mata tergantung pada tingkat
penutupan domain, seperti, terutama untuk reseptor NMDA, sejumlah situs modulator
telah terletak di bagian N-terminal reseptor. Ion seng menghambat reseptor NR2A
mengandung, sementara sejumlah senyawa, seperti ifenprodil, selektif menghambat
reseptor NR2B mengandung. Sebuah varian sambatan di bagian N-terminal NR1
mempengaruhi pH dan spermidine-sensitivitas reseptor. Modus tindakan dari
inhibitor kompetitif tidak jelas, walaupun beberapa studi menunjukkan bahwa mereka
mungkin berbagi mekanisme umum.
3.3.4 MODIFIKASI Posttranscripsional
Salah satu bentuk penting dari peraturan dicapai dengan varian sambatan
menunjukkan perbedaan fungsional dan regulasi diferensial. Misalnya, segmen 38-
asam amino sebelumnya TM-IV hadir dalam salah satu dari dua bentuk disambung
alternatif (disebut "flip" atau "gagal") di GluR1-GluR4. Amplitudo saat ini lebih kecil
di reseptor gagal dibandingkan dengan reseptor sandal. Ini mungkin menjadi
mekanisme yang bisa memungkinkan neuron untuk beralih dari gain rendah versi
flop ke reseptor high gain lain, hanya dengan splicing alternatif transkrip.
Bentuk lain dari regulasi yang mengedit dari transkrip RNA. Ketika GluR1,
GluR3, atau GluR4 dinyatakan secara individual atau dalam kombinasi, hubungan
arus-tegangan menunjukkan bentuk hati meluruskan, dan saluran reseptor yang
permeabel terhadap Ca2 +. Namun, jika subunit GluR2 merupakan bagian dari
reseptor, hubungan arus-tegangan adalah linear, dan saluran tidak tembus Ca2 +.
Situs-directed mutagenesis menunjukkan bahwa sifat saluran ditentukan oleh
perbedaan asam amino tunggal dalam diduga M2. GluR2 mengkodekan arginin (R)
pada posisi itu, sedangkan reseptor AMPA subunit lainnya menyandikan glutamin
(Q), maka nama Q / R situs. Analisis urutan genom mengungkapkan bahwa GluR2,
seperti pada reseptor AMPA subunit lainnya, mengkode glutamin (kodon GAC),
tetapi cDNA mengkodekan arginin (GGC) pada posisi itu. A-to-G transisi dikatalisis
oleh enzim yang mengenali elemen struktur RNA dalam transkrip GluR2 dan
kemudian secara khusus deaminates adenosin ke inosin (yang setara dengan G).
Kehadiran subunit diedit di kompleks reseptor mencegah interaksi dengan channel
blockers seperti Joro laba-laba racun dan philantotoxins. Selain editing di Q / R di
situs M2, GluR6 suntingan di dua lokasi di M2 yang juga mempengaruhi
permeabilitas Ca2 +. Hal ini menunjukkan M1 yang mungkin berkontribusi terhadap
pori-pori di reseptor glutamat.
Lain editing A-to-G, di sebuah situs yang ditunjuk situs R / G, dapat terjadi
segera sebelum segmen flip-flop di GluR2-GluR4. Flip-flop segmen mempengaruhi
laju desensitisasi, sedangkan laju pemulihan dari negara peka tergantung pada situs R
/ G di mana bentuk diedit, G, pulih lebih cepat dari bentuk diedit, R.
3.3.5 DAERAH PORI
Wilayah pori telah dipelajari secara ekstensif menggunakan metode
aksesibilitas sistein diganti (SCAM) mutagenesis dan dalam kombinasi dengan
pengukuran elektrofisiologi. Studi ini telah memberikan beberapa wawasan ke dalam
arsitektur dari reseptor glutamat pori, dan data untuk sebagian besar kompatibel
dengan keseluruhan struktur mirip dengan struktur tiga-dimensi dari mengkristal
saluran kalium KCSA. Pori-pori membentuk struktur mirip kerucut, di mana ujung
terletak di permukaan ekstraseluler dan wilayah M2 dimasukkan dari sisi
cytoplasmatic. Reaktivitas dari residu terletak hanya di N-terminal perubahan M1,
tergantung pada aktivasi reseptor, dan mutasi pada C-terminal bagian dari M3
membuat reseptor konstitutif aktif, menunjukkan bahwa pintu gerbang mungkin
terletak di cytoplasmatic permukaan, antara M1 dan M3.
Data eksperimental juga mendukung struktur yang mirip untuk wilayah M2 dan
P-elemen dalam KCSA, dimana bagian N-terminal bentuk M2 struktur α-heliks
terletak sejajar dengan dinding kerucut dibentuk oleh daerah transmembran. Struktur
α-heliks diikuti oleh struktur melingkar acak menunjuk ke arah pusat pori-pori.
Wilayah yang membentuk filter selektif untuk kalium dalam saluran KCSA, namun
kurangnya diskriminasi antara kalium dan natrium arus dalam saluran reseptor
glutamat berpendapat untuk struktur yang berbeda. Q / R situs (lihat di atas) terletak
di ujung loop masuk kembali. Posisi yang menentukan permeabilitas ion divalen
relatif terhadap ion monovalen. Posisi yang setara pada reseptor NMDA ditempati
oleh aspargine, yang terlibat dalam diskriminasi antara kedap Mg2 + dan ion Ca2 +
permeabel. Asam amino tambahan juga terlibat, tetapi mereka tidak berada pada
posisi setara pada NR1 dan subunit NR2, menunjukkan asimetri dalam pori-pori pada
posisi itu.
Daerah-daerah yang terlibat dalam kation anion vs selektivitas tidak didefinisikan
dengan baik, karena mereka adalah untuk nAChR tersebut. Namun, berbeda dengan
nAChR itu, residu dalam pori-pori berkontribusi terhadap selektivitas, sebagai
reseptor AMPA sepenuhnya terbentuk dari diedit atau reseptor kainate (misalnya,
memiliki R di situs Q / R) juga permeabel terhadap klorida.
3.3.6 TEMPAT INTRASELULAR DARI RESEPTOR
Potensiasi jangka panjang dan depresi sinapsis glutamatergic terlibat dalam
banyak model untuk fungsi dan perkembangan otak. Faktor kunci dalam plastisitas
adalah perubahan dalam AMPA dan kegiatan reseptor kainate diinduksi NMDA
setelah peningkatan reseptor-tergantung dari Ca2 + intraseluler konsentrasi. Bukti
kuat ada untuk keterlibatan dua mekanisme yang tergantung reseptor pada perubahan
dalam aktivitas reseptor. Reseptor glutamat adalah, seperti untuk saluran ion yang
paling, diatur oleh fosforilasi. Fosforilasi dan defosforilasi telah ditunjukkan untuk
mengubah baik kemungkinan untuk membuka dan distribusi berbagai negara
konduktansi. Mekanisme kedua melibatkan perubahan dinamis dalam jumlah reseptor
AMPA pada sinapsis. Keempat asam amino di bagian paling C-terminal GluR1-
GluR3 mengikat sejumlah penahan protein, di samping itu, GluR2 mengikat, pada
ekor cytoplasmatic, sebuah ATPase (NSF) yang terlibat dalam fusi membran.
Akibatnya, AMPA reseptor perdagangan pameran kinetika subtipe tertentu,
tergantung pada kehadiran GluR2 di kompleks reseptor.
3.4 ATP RESEPTOR: 2TM RESEPTOR
Ekstraseluler ATP telah ditunjukkan untuk mengaktifkan arus depolarizing
dalam jenis sel saraf dan non-saraf yang berbeda. Reseptor ini juga disebut sebagai
P2 reseptor. Reseptor selanjutnya dapat dibagi ke dalam reseptor P2Y G-protein-
coupled dan ion channelsP2X ligand-gated. Saat ini, tujuh reseptor P2X (P2X1-
P2X7) telah diklon (Tabel 3.3). receptorsexhibit antara 26 dan 50% identitas asam
amino secara keseluruhan, dengan tingkat tertinggi dari konservasi di daerah
ekstraseluler dan transmembran. P2X7 (juga disebut P2Z) adalah anggota yang paling
jauh dari keluarga.
Reseptor berbagai ukuran 379-595 asam amino. Reseptor memiliki dua wilayah
transmembran dengan intraseluler N-dan C-termini (Gambar 3.11). Analisis SCAM
ekstensif menunjukkan bahwa TM2 membentuk pori, dan glisin residu tersimpan di
tengah TM2 baris bagian tersempit dari saluran. Struktur pori dan lokasi gerbang
masih belum ditentukan.
Pendekatan yang berbeda telah digunakan untuk menentukan stoikiometri
reseptor. Saat ini, trimer adalah model yang disukai. Semua subunit kecuali P2X6
dapat membentuk reseptor homomerik fungsional, dan, kecuali untuk P2X7, semua
(saat diuji) subunit dapat membentuk kompleks heteromeric. Namun, in vivo,
perakitan tampaknya akan dipandu oleh mekanisme yang membatasi jumlah
kombinasi dibandingkan dengan kemungkinan teoritis.
Jumlah senyawa selektif yang bekerja pada subtipe P2X yang berbeda sangat
terbatas. Saluran P2X dapat dibedakan dari reseptor P2Y oleh banyak kinetika
mereka lebih cepat. Sifat kinetik, seperti desensitisasi, juga dapat digunakan dalam
rekaman elektrofisiologi untuk membedakan antara subtipe yang berbeda. Misalnya,
P2X1 dan P2X3 rasa mudah terpengaruh cepat pada konsentrasi ATP jenuh,
sementara P2X2 dan P2X4 rasa mudah terpengaruh sangat lambat. Namun,
desensitisasi umumnya bukan merupakan kriteria yang optimal untuk karakterisasi
dari reseptor. Pertama, mekanisme receptorindependent berbeda (fosforilasi,
mengikat protein, dll) mungkin mempengaruhi desensitisasi tersebut. Kedua,
desensitisasi sulit untuk mengukur secara akurat dalam sistem multisel dan dengan
metode selain elektrofisiologi. Ketiga, substates saluran yang berbeda mungkin
memiliki sifat yang berbeda desensitisasi.
GAMBAR 3.11 Skema representasi dari topologi transmembran dari adenosin
trifosfat (ATP) reseptor.
Reseptor P2X adalah kation selektif saluran, dan secara umum diasumsikan
bahwa selektivitas ion tersimpan untuk saluran tertentu. Studi pada P2X2, P2X4, dan
P2X7 reseptor, bagaimanapun, telah mengungkapkan pergeseran dalam selektivitas
ion setelah aktivasi reseptor berkepanjangan. Sebuah aplikasi agonis singkat
membuka pori saluran menjadi permeabel hanya untuk kation kecil, sedangkan
aktivasi lagi (ratusan milidetik ke detik) menginduksi konformasi pori permeabel
terhadap pewarna besar (> 630 Da). Semakin besar konformasi pori dapat diperoleh
oleh aplikasi berkelanjutan atau pulsa berulang. Menariknya, meskipun perubahan
ukuran pori, saluran tetap kation selektif. Perubahan serupa di tingkat konduktansi
telah diamati selama beberapa saluran lainnya, tetapi tetap harus menunjukkan
bagaimana umum fenomena ini dan apakah itu pameran agonis spesifisitas.
3.5 MASALAH
Soal 3.1
Model lazim reseptor untuk asam amino rangsang adalah kompleks tetrameric.
Seperti disebutkan dalam teks, ada bukti bahwa konduktansi saluran tergantung pada
jumlah subunit yang mengikat ligan. Memperkirakan nilai EC50 dan koefisien Hill
untuk kurva dosis-respons mengasumsikan bahwa pendudukan pada masing-masing
subunit memiliki nilai Kd dari 1 M, seorang nH dari 1, dan aktivasi yang
menginduksi transisi ke keadaan aktif independen dari keadaan lainnya subunit:
a. Pengikatan dua atau lebih agonis mengaktifkan negara yang melakukan arus
yang sama.
b. Mengikat pada dua subunit yang berdekatan diperlukan untuk membuka
saluran.
c. Seperti yang diusulkan, reseptor terdiri dari dua dimer dan hanya mengikat
pada kedua subunit dalam hasil dimer dalam aktivasi reseptor.
d. Mengikat pada dua subunit mengadakan saya saat ini, di tiga subunit, 2 saat ×
I, dan mengikat semua empat subunit, arus 3 × I.
Soal 3.2
Asumsikan perakitan reseptor asetilkolin nikotin (nAChR) subunit benar-benar
permisif. Berapa banyak reseptor yang berbeda dapat dirakit dalam sel
mengekspresikan α3, β2, dan β4? Grup reseptor sesuai dengan mana yang cenderung
memiliki serupa konduktansi single-channel dan / atau aktivasi kinetika.
3.6 BACAAN
Armstrong, N. and Gouaux, E., Mechanisms for activation and antagonism of the
AMPA-sensitive glutamate receptor: crystal structures of the GluR2 ligand
binding core, Neuron, 28, 165Ŕ181, 2000.
Brejc, K., van Dijk, W. J., Klassen, R. V., Schuurmans, M., van der Oost, J., Smit, A.
B., and Sixma, T. K., Crystal structures of an ACh-binding protein reveal the
ligand-binding domain of nicotinic receptors, Nature, 411, 269Ŕ276, 2001.
Corringer, P. J., Le Novere, N., and Changeux, J. P., Nicotic receptors at the
aminoacid level, Annu. Rev. Phamacol. Toxicol., 40, 431Ŕ458, 2000.
Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D., and Traynelis, S. F., The glutamate receptor
ion channels, Pharmacol. Rev., 51, 7Ŕ61, 1999.
Egebjerg, Schousboe, and Krogsgaard-Larsen, Eds., Glutamate and GABA Receptors
and Transporters: Structure, Function and Pharmacology, Taylor & Francis,
London, 2001.
Khakh, B. S., Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at
synapses, Nat. Rev. Neurosci., 2, 165Ŕ174, 2001.
Khakh, B. S., Burnstock, G., Kennedy, C., King, B. F., North, R. A., Seguela, P.,
Voigt, M., and Humphrey, P. P., International union of pharmacology.
XXIVC. Current status of the nomenclature and the properties of P2X
receptors and their subunits, Pharmacol. Rev., 53, 107Ŕ118, 2001.
Kuner, T., Beck, C., Sakmann, B., and Seeburg, P. H., Channel-lining residues of the
AMPA receptor M2 segment: structural environment of the Q7R site and
identification of the selective filter, J. Neurosci., 21, 4162Ŕ4172, 2001.
North, R. A. and Surprenant, A., Pharmacology of cloned P2X receptors, Annu. Rev.
Pharmacol. Toxicol., 40, 563Ŕ580, 2000
Rudolph, U., Crestani, F., and Mohler, H., GABAA receptor subtypes: dissecting
their pharmacological functions. Trends Pharmacol. Sci., 22, 188Ŕ194, 2001.
Sheng, M. and Lee, S. H., AMPA receptor trafficking and the control of synaptic
transmission, Cell, 105, 825Ŕ828, 2001.
3.7 SOLUSI UNTUK MASALAH
Soal 3.1
Hunian pada setiap subunit p = [L] / Kd + [L], di mana [L] adalah konsentrasi
ligan. Jika aktivasi subunit independen, seperti yang diasumsikan, jumlah subunit
diaktifkan pada kompleks reseptor akan mengikuti distribusi binomial, yaitu
kemungkinan untuk aktivasi n subunit adalah K4, NP4-n (1 - p) n. Saat ini akan
sebanding dengan:
a. 6 * p2 (1 - p) 2 + 4 * (p) 3 (1 - p) + p4, Kd = 0,62; nH = 1.70
b. 4 * p2 (1 - p) 2 + 4 * (p) 3 (1 - p) + p4, Kd = 0,84; nH = 1.57
c. 2 * p2 (1 - p) 2 + 4 * (p) 3 (1 - p) + p4, Kd = 1,17; nH = 1.56
d. 1/3 * (6 * p2 (1 - p) 2 + 2 * 4 * (p) 3 (1 - p) + 3 * p4), Kd = 1,67; nH = 1.23
Kd dan nH nilai-nilai yang diperoleh dengan menggunakan prosedur pas normal.
Soal 3.2
Jawabannya adalah delapan. Dalam representasi linear:
1. α3-β2-α3-β2-β2
2. α3-β2-α3-β2-β4
3. α3-β2-α3-β4-β2
4. α3-β4-α3-β2-β2
5. α3-β2-α3-β4-β4
6. α3-β4-α3-β2-β4
7. α3-β4-α3-β4-β2
8. α3-β4-α3-β4-β4
Kombinasi dengan stoikiometri serupa akan cenderung memiliki konduktansi
yang sama (misalnya, empat kelompok 1, 2-4, 5-7, dan 8), sedangkan pengaturan
subunit mungkin lebih penting untuk kinetika reseptor karena situs pengikatan agonis
berada antara α dan subunit β. Jika situs pengikatan diasumsikan antara subunit α dan
subunit β di sebelah kanan (dalam representasi ini linier), ada tiga kelompok: (1) 1-2,
2 × (α3 - β2), (2) 3 -6, (α3 - β2) (α3 - β4), dan (3) 7-8, 2 × (α3 - β2).
4 Struktur Molekul dari
Reseptor Tirosin Kinase
Steen Gammeltoft
ISI
4.1. Pengenalan....................................................................................................131
4.2. Keluarga Reseptor Tirosin Kinase .............................................. ............... 132
4.3. Identifikasi Reseptor Tirosin Kinase ............................................. .....132
4.4. Paradigma untuk Aktivasi Receptor Tyrosine Kinase ............................... 133
4.4.1. Aktivasi oleh dimerisasi ............................................... ....................... 133
4.4.2. Autofosforilasi tirosin ................................................ .................. 135
4.5. Studi Struktural Reseptor Tirosin Kinase ........................................... 136
4.5.1. Domain Ligan-Binding .............................................. ............................ 136
4.5.2. Domain Protein Kinase ............................................... ........................... 142
4.5.3. Struktur Receptor Tyrosine Kinase Aktiv......................................... 146
4.5.4. Reseptor Tirosin Kinase Inhibitor .............................................. ........... 148
4.6. Bacaan lebih lanjut ................................................ .....................................
149
4.1 PENDAHULUAN
Reseptor permukaan sel yang terlibat dalam transmisi sinyal ekstraseluler
melintasi membran plasma dan regulasi jalur sinyal transduksi intraseluler-mediasi
pembangunan dan komunikasi multiseluler dalam semua organisme hidup. Reseptor
ini mengikat berbagai macam ligan watersoluble, termasuk amina, asam amino, lipid,
peptida, dan protein. Untuk kenyamanan, mereka dapat diurutkan ke dalam empat
kelas utama dengan mekanisme yang berbeda sinyal: reseptor G-protein-coupled,
reseptor ion-channel, tyrosine kinase sitoplasma (CTK)-linked reseptor, dan reseptor
dengan aktivitas enzimatik intrinsik. Di kelas kedua, reseptor tirosin kinase (RTKs)
yang dominan, sedangkan reseptor adenilat guanylate dan serin / treonin kinase
reseptor kelompok kecil. Reseptor CTK-linked memediasi respon terhadap sitokin
dan hormon seperti erythropoietin (EPO), interferon, dan hormon pertumbuhan (GH).
RTKs mengikat berbagai faktor pertumbuhan dan hormon, seperti faktor
pertumbuhan epidermal (EGF), faktor pertumbuhan fibroblast (FGF), dan insulin.
Meskipun RTKs dan reseptor CTK-linked resmi milik kelas yang berbeda,
mekanisme signaling menunjukkan kesamaan mengenai dimerisasi reseptor dan
fosforilasi tirosin.
Para RTKs mengkatalisis transfer γ-fosfat adenosin trifosfat (ATP) terhadap
gugus hidroksil dari tyrosines pada protein target. RTKs memainkan peran penting
dalam pengendalian proses dasar yang paling, termasuk siklus sel, migrasi sel,
metabolisme sel, dan kelangsungan hidup, serta proliferasi sel dan diferensiasi.
Semua RTKs mengandung domain ikatan-ligand ekstraseluler yang biasanya
glikosilasi. Ligan-ikatan domain terhubung ke domain sitoplasmik oleh heliks
transmembran tunggal. Dalam reseptor dengan aktivitas enzimatik intrinsik, domain
sitoplasmik mengandung protein kinase tirosin tersimpan (PTK) inti dan urutan
peraturan tambahan yang dikenakan autofosforilasi dan fosforilasi oleh protein kinase
heterolog. Dalam reseptor CTK-linked, domain sitoplasma yang relatif singkat
berinteraksi melalui interaksi noncovalent dengan anggota Janus kinase (JAK)
keluarga CTKs. Terlepas dari kurangnya ikatan kovalen ke kinase, mekanisme kerja
reseptor ini biner sebagian besar menyerupai RTKs. Tujuan dari kajian ini adalah
untuk menggambarkan struktur molekul RTKs dengan penekanan pada konsep-
konsep umum yang mendasari aktivasi reseptor dan transduksi sinyal faktor
pertumbuhan, sitokin, dan hormon.
4.2 KELUARGA RESEPTOR TIROSIN KINASE
Upaya urutan genom organisme eukariotik telah mengungkapkan bahwa
sampai sekitar 20% dari 6200 sampai 32.000 gen penyandi di Saccharomyces
cerevisiae, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Arabidopsis thaliana,
dan Homo sapiens mengkodekan protein yang terlibat dalam transduksi sinyal,
termasuk reseptor transmembran , subunit G-protein, dan enzim sinyal yang
menghasilkan. Dalam genom manusia, lebih dari 520 protein kinase dan protein
fosfatase 130 melakukan kontrol reversibel fosforilasi protein. Kedua kategori enzim
dapat dibagi lagi menjadi tirosin-atau serin / treonin spesifik, berbasis pada
spesifisitas katalitik mereka. Selain itu, beberapa memiliki ganda kekhususan untuk
kedua tirosin dan serin / treonin, dan beberapa anggota keluarga kinase
phosphatidylinositol juga menunjukkan aktivitas protein kinase. Ada lebih dari 90
gen PTK dikenal dalam genom manusia; 59 menyandikan RTKs transmembran
didistribusikan di antara 20 subfamilies, dan 32 encode sitoplasma, nonreceptor
PTKS di 10 subfamilies. Penting untuk dicatat bahwa dari 30 gen pertumbuhan
suppresser dan lebih dari 100 onkogen dominan, protein kinase, di PTKS tertentu,
terdiri dari sebagian besar dari kelompok kedua. PTKS berevolusi untuk memediasi
aspek komunikasi multisel dan pembangunan di metazoa, di mana mereka terdiri dari
sekitar 0,3% dari gen. Mutasi somatik dalam kelompok yang sangat kecil gen
menyebabkan fraksi yang signifikan dari kanker pada manusia, menekankan
hubungan terbalik antara regulasi perkembangan normal dan oncogenesis.
Kelompok PTK mencakup sejumlah besar enzim dengan domain kinase terkait
erat yang secara khusus phosphorylate residu tirosin dan melakukan serin tidak
memfosforilasi atau treonin. Ini enzim, pertama dikenal di kalangan oncoproteins
retroviral, telah ditemukan hanya dalam sel metazoan, di mana mereka secara luas
diakui untuk peran mereka dalam transducing pertumbuhan dan diferensiasi sinyal.
Termasuk dalam kelompok ini adalah lebih dari 20 keluarga reseptor yang berbeda
terdiri dari membran-spanning molekul yang berbagi sama keseluruhan struktur
topologi. Semua anggota dari superfamili RTK memiliki domain ekstraseluler besar
dengan tingkat tinggi keragaman dalam urutan primer dan struktur tersier. -rantai
tunggal domain membran-spanning tidak menunjukkan konservasi antara berbagai
RTKs. sitoplasma domain berisi entitas katalitik terdiri dari PTK baik tersimpan.
Urutan asam amino menunjukkan homologi yang signifikan mencerminkan tersimpan
protein kinase lipat, secara umum, dan struktur PTK, pada khususnya. eukariotik
protein kinase superfamili dapat dibagi lagi menjadi keluarga yang berbeda yang
berbagi sifat struktural dan fungsional. Pohon filogenetik berasal dari penyelarasan
kinase-domain, urutan asam amino berfungsi sebagai dasar untuk klasifikasi. Dengan
demikian, satu-satunya pertimbangan kesamaan kinase-domain, urutan asam amino.
Kekhususan penentu sekitar situs phospho-akseptor tirosin telah ditentukan
oleh berbagai prosedur. Dalam PTK tes menggunakan berbagai substrat, ditetapkan
bahwa residu glutamat dari N-terminal atau C-terminal sisi akseptor sering disukai.
Substrat spesifisitas PTK domain katalitik telah dianalisis dengan skrining
perpustakaan peptida untuk prediksi peptida substrat yang optimal. Akhirnya,
bioinformatika telah diterapkan untuk mengidentifikasi situs phospho-akseptor dalam
protein PTKS dengan penerapan algoritma neural network.
4.3 IDENTIFIKASI RESEPTOR TIROSIN KINASE
Tiga puluh tahun yang lalu, reseptor untuk hormon polipeptida seperti insulin
dan GH diidentifikasi sebagai kegiatan mengikat dalam sel, membran, atau protein
membran dilarutkan menggunakan protein radiolabeled sebagai ligan. Namun,
transduksi sinyal dari reseptor ini tetap sebuah "kotak hitam" selama sekitar 10 tahun
sebelum kegiatan PTK mereka ditunjukkan. RTK pertama diidentifikasi fungsional
dan struktural adalah faktor pertumbuhan epidermal (EGF) reseptor. Stanley Cohen
dan rekan kerja mengisolasi reseptor EGF dan menunjukkan bahwa itu adalah
glikoprotein membran intrinsik dari 170 kDa, bahwa itu berisi situs pengikatan
spesifik untuk EGF, dan bahwa kegiatan PTK EGF-aktif adalah intrinsik ke reseptor.
Struktur utama dari reseptor EGF, ditentukan oleh kloning cDNA dan urutan reseptor
mRNA, PTK urutan lokal di bagian sitoplasma dari rantai polipeptida reseptor.
Mengikat ligan menginduksi dimerisasi reseptor EGF dan aktivasi cepat PTK dengan
autofosforilasi beberapa residu tirosin terletak di C-terminus reseptor. Ini residu
phosphotyrosine bertindak sebagai situs mengikat untuk Src homologi 2 (SH2)
domain atau phosphotyrosine-ikatan (PTB) domain dari berbagai sinyal protein.
Selanjutnya, RTKs milik 20 subfamilies telah diklon (Gambar 4.1). Struktur ini
sangat tersimpan dalam domain PTK katalitik tetapi menunjukkan variasi yang besar
dalam domain ekstraselular serta juxtamembrane dan C-terminal bagian dari domain
sitoplasmik. Klasifikasi RTK subfamilies didasarkan pada dasar-homologi urutan dan
persamaan dalam struktur sekunder. Sistein kaya domain, imunoglobulin-seperti (Ig-
seperti) domain, domain leusin kaya, cadherin-seperti domain, fibronektin tipe III
domain, EGF-seperti domain, dan kringle-seperti domain mencirikan bagian
ekstraseluler RTKs (Gambar 4.1) .
4.4 PARADIGMA UNTUK AKTIVASI RESEPTOR TYROSINE KINASE
Studi fungsi reseptor EGF didefinisikan dua paradigma umum dalam aktivasi
RTK dan transduksi sinyal. Pertama, RTKs diaktifkan oleh dimerisasi diinduksi oleh
pengikatan ligan. Dengan pengecualian dari keluarga reseptor insulin RTKs, semua
RTKs dikenal (misalnya, reseptor EGF atau faktor pertumbuhan platelet-derived
[PDGF] reseptor) adalah monomer dalam membran. Mengikat ligan menginduksi
dimerisasi reseptor, sehingga autofosforilasi domain sitoplasma mereka. Reseptor
insulin adalah disulfida-linked dimer dari dua rantai polipeptida membentuk α2 β2
heterotetramer. Insulin mengikat subunit α ekstraseluler menginduksi penataan ulang
dalam struktur heterotetrameric kuartener yang menyebabkan aktivasi dari PTK
intraseluler dan peningkatan autofosforilasi domain sitoplasma. Bentuk aktif reseptor
insulin dan RTK monomer keduanya dimer, dan mekanisme aktivasi reseptor
cenderung sangat mirip. Kedua, reseptor autofosforilasi menghasilkan situs
phosphotyrosine di bagian sitoplasma reseptor yang berfungsi sebagai docking situs
untuk mengikat SH2 domain dan domain PTB. Selain peran sentral dalam
mengendalikan aktivitas PTK, autofosforilasi tirosin RTK sangat penting untuk
perekrutan dan aktivasi berbagai sinyal protein. Kebanyakan situs autophosphorylated
tirosin berada di daerah noncatalytic dari bagian sitoplasma dari molekul reseptor.
Daerah ini termasuk ekor C-terminal, seperti pada reseptor EGF, dan wilayah insert
kinase, seperti pada reseptor PDGF. Interaksi antara SH2 domain dan motif
phosphotyrosine menyediakan mekanisme untuk perakitan dan perekrutan sinyal
kompleks oleh RTK diaktifkan. Dengan demikian, setiap RTK harus
dipertimbangkan tidak hanya sebagai reseptor dengan aktivitas PTK tetapi juga
sebagai platform untuk pengakuan dan perekrutan pelengkap spesifik protein
signaling.
4.4.1 AKTIVASI OLEH DIMERISASI
Selama dekade terakhir, kemajuan signifikan telah dicapai dalam memahami
dasar molekuler untuk dimerisasi RTKs. Studi biokimia ligan mengikat dan aktivasi
RTK telah menyebabkan hipotesis bahwa RTKs diaktifkan oleh dimerisasi (Gambar
4.2). Dasar molekuler yang tepat untuk pembentukan oligomer masih belum jelas,
namun. Studi struktur ligan dalam kompleks dengan domain reseptor-ikatan telah
memberikan wawasan tentang sifat mekanisme dimerisasi. Beberapa struktur kristal
dari reseptor di kompleks dengan ligan mereka telah dipecahkan, termasuk sitokin
serta reseptor faktor pertumbuhan. Ligan yang berbeda menggunakan mekanisme
yang berbeda untuk menginduksi dimer keadaan aktif RTK
.
\
GAMBAR 4.1 RTK superfamili. Gambar menunjukkan representasi skematik dari
struktur domain dari 20 RTK keluarga. (Courtesy of SUGEN, Inc)
GAMBAR 4.2 Reseptor tirosin kinase dimerisasi. Pengikatan ligan monomer atau
dimer ke RTK monomer mengarah pada pembentukan dan stabilisasi diaktifkan RTK
dimer. Domain sitoplasmik dari RTK adalah trans-terfosforilasi oleh PTK aktif.
Struktur kristal ligan monomer seperti GH dan EPO dalam kompleks dengan
reseptor masing-masing menunjukkan bahwa hormon ini bivalen dan ligan yang
mengikat secara bersamaan untuk dua molekul reseptor untuk membentuk 01:02
(ligan: reseptor) kompleks. Reseptor dimerisasi lebih stabil oleh interaksi reseptor-
reseptor tambahan.
Beberapa faktor pertumbuhan yang homodimers, seperti faktor pertumbuhan
endotel vaskular (VEGF) dan PDGF, dan memberikan dasar yang sederhana untuk
ligan-induced dimerisasi reseptor. VEGF reseptor yang berisi tujuh Ig-seperti domain
dalam domain ekstraselular mereka, yang hanya Ig domain 2 dan 3 diperlukan untuk
mengikat ligan. Struktur kristal VEGF dalam kompleks dengan Ig-seperti domain 2
dari reseptor FLT-1 VEGF memberikan pandangan ligan-induced dimerisasi reseptor.
Struktur menunjukkan bahwa satu molekul reseptor mengikat masing-masing dua
persimpangan antara VEGF protomers untuk menghasilkan sebuah kompleks yang
dekat dengan dua kali lipat simetris dan berisi dua protomers VEGF ditambah dua Ig-
seperti domain.
Fibroblast growth factor (FGF) adalah ligan monomer yang mengaktifkan
reseptor FGF dengan kerjasama dari molekul aksesori, heparin sulfat proteoglikan.
Struktur kristal dari FGF dalam kompleks dengan domain ligan-mengikat reseptor
FGF (terdiri dari Ig-seperti domain 2 dan 3) memberikan pandangan molekul reseptor
FGF dimerisasi. Setiap struktur menunjukkan 2:2 FGF: FGF reseptor kompleks, di
mana FGF berinteraksi secara ekstensif dengan Ig-seperti domain 2 dan 3 dan dengan
linker yang menghubungkan dua domain dalam satu reseptor. Dimer distabilkan oleh
situs pengikatan sekunder yang melibatkan interaksi antara FGF dan D2 dari reseptor
kedua di kompleks serta interaksi reseptor-reseptor. Berbeda dengan disulfida-linked
VEGF homodimer, dua molekul FGF di 02:02 FGF: FGF reseptor kompleks tidak
melakukan kontak apapun. FGF dan FGF reseptor tidak cukup untuk menstabilkan
dimer reseptor FGF pada permukaan sel. Heparin atau heparan sulfat proteoglikan
sangat penting untuk dimerisasi stabil FGF: kompleks reseptor FGF. Heparin
mengikat ke canyon bermuatan positif dibentuk oleh sekelompok terkena Lys dan
residu Arg yang meluas di domain D2 dari dua reseptor di dimer dan sebelah molekul
FGF terikat.
4.4.2 AUTOFOSFORILASI TIROSIN
Aktivasi RTKs dilakukan dengan autofosforilasi pada residu tirosin,
konsekuensi dari ligan-dimediasi dimerisasi (Gambar 4.2). Dua proses yang terlibat:
peningkatan aktivitas katalitik PTK dan penciptaan situs mengikat dalam domain
sitoplasmik untuk merekrut protein sinyal hilir. Secara umum, autofosforilasi
tyrosines di loop aktivasi dalam hasil domain PTK di stimulasi aktivitas kinase, dan
autofosforilasi tyrosines di juxtamembrane tersebut, kinase insert, dan wilayah
karboksil-terminal menghasilkan situs docking untuk domain modular yang
mengakui phosphotyrosine dalam konteks tertentu. Kedua modul phosphotyrosine
mengikat mapan hadir dalam protein sinyal adalah domain SH2 dan domain PTB.
Semua RTKs mengandung antara satu dan tiga tyrosines dalam aktivasi
lingkaran kinase, yang terdiri dari subdomain VII dan VIII dari protein kinase
katalitik inti. Fosforilasi tyrosines ini telah terbukti menjadi penting untuk stimulasi
aktivitas katalitik dan fungsi biologis untuk sejumlah RTKs, termasuk reseptor
insulin, FGF reseptor, reseptor VEGF, PDGF reseptor, Met (reseptor faktor
pertumbuhan hepatosit), dan TrkA (NGF reseptor ). Sebuah pengecualian utama
adalah reseptor EGF, yang autofosforilasi dari tirosin tersimpan dalam loop aktivasi
tampaknya tidak terlibat dalam signaling. Pergantian tirosin dengan fenilalanin tidak
berpengaruh pada aktivitas RTK atau sinyal hilir.
Pada prinsipnya, RTK autofosforilasi dapat terjadi dalam cis (dalam monomer
reseptor) atau trans (antara dua reseptor di dimer). Dalam kasus pertama, mengikat
ligan akan menyebabkan perubahan konformasi reseptor yang akan memfasilitasi cis-
autofosforilasi residu tirosin terletak di dalam atau di luar domain PTK. Dalam kasus
kedua, tidak ada perubahan konformasi harus jatuh setelah dimerisasi. Efek
kedekatan sederhana akan memberikan kesempatan yang cukup untuk trans-
fosforilasi tyrosines dalam domain sitoplasmik oleh RTK kedua.
Struktur kristal bentuk unphosphorylated dari reseptor insulin telah
memberikan rincian tentang mekanisme molekul dengan yang RTKs disimpan dalam
keadaan aktivitas rendah sebelum autofosforilasi tyrosines di aktivasi. Dalam struktur
reseptor insulin, salah satu dari tiga tyrosines di loop aktivasi, Tyr1162, terikat dalam
situs aktif, tampaknya dalam posisi untuk autophosphorylated (di cis). Namun,
Asp1150 dari PTK-tersimpan urutan Asp-Phe-Gly pada awal loop aktivasi tidak
dalam posisi yang tepat untuk mengkoordinasikan MgATP tetapi mengganggu ATP
mengikat. Ini konsisten dengan data biokimia untuk fosforilasi Tyr1162 (dan
Tyr1158 dan Tyr1163) terjadi di trans (oleh molekul reseptor insulin kedua). Selain
itu, substitusi Tyr1162 dengan hasil fenilalanin dalam peningkatan aktivitas kinase
basal konsisten dengan peran otoinhibitor untuk Tyr1162.
Struktur kristal dari PTK domain tris-terfosforilasi dari reseptor insulin
mengungkapkan peran fosforilasi lingkaran aktivasi dalam stimulasi aktivitas
katalitik. Autofosforilasi reseptor insulin membawa tentang reposisi dramatis loop
aktivasi. Konformasi dari insulin tris-terfosforilasi RTK aktivasi loop stabil sebagian
oleh interaksi yang melibatkan phosphotyrosines, terutama terfosforilasi Tyr1162,
yaitu hidrogen terikat pada arginin tersimpan pada awal loop aktivasi (Arg1155) dan
tulang punggung nitrogen amida dalam setengah latter dari loop. Dengan demikian,
reseptor insulin cis-dihambat oleh pengikatan Tyr1162 di situs aktif yang bersaing
dengan substrat protein tetapi tidak cis-autophosphorylated karena kendala sterik
yang mencegah pengikatan MgATP. Reseptor insulin adalah trans-diaktifkan oleh
molekul reseptor kedua yang phosphorylates Tyr1162. Faktor suhu (B-faktor) yang
diperoleh selama perbaikan kristalografi menunjukkan bahwa bagian-bagian dari
insulin terfosforilasi RTK aktivasi lingkaran cukup seluler, menunjukkan bahwa
keseimbangan antara beberapa konformasi ada dalam larutan. Sebuah subset dari
(misalnya, diamati dalam struktur kristal aktif RTK insulin) akan menghambat
substrat (protein dan ATP) yang mengikat, sedangkan konformasi lain (misalnya,
diamati dalam aktif insulin RTK struktur kristal) akan memfasilitasi pengikatan
substrat dan fosforilasi.
4.5 STUDI STRUKTUR RESEPTOR TIROSIN KINASE
4.5.1 Domain Ikatan-Ligand
Beberapa struktur domain ligan-mengikat RTKs telah dilaporkan dalam 10
tahun terakhir, menyediakan dasar untuk mekanisme dimerisasi pemahaman dan
ligan-reseptor spesifisitas (Tabel 4.1). Struktur meliputi reseptor untuk sitokin seperti
hormon pertumbuhan, prolaktin, dan eritropoietin, serta reseptor untuk faktor
pertumbuhan seperti insulin-seperti faktor pertumbuhan I, faktor pertumbuhan
fibroblast, faktor pertumbuhan saraf, dan faktor pertumbuhan endotel vaskular.
Secara umum, hanya subset dari domain di bagian ekstraseluler dari RTK terlibat
dalam mengikat ligan. Semua RTKs terdiri dari beberapa domain ekstraseluler yang
mewakili lipatan protein umum seperti sistein kaya, fibronektin-III-seperti, Ig-seperti,
dan EGF-seperti domain (Gambar 4.1).
GAMBAR 4.3 Pertumbuhan hormon reseptor. Monomer rekan GH dengan dua
monomer reseptor. Activated kinase JAK2 transphosphorylate reseptor JAK2 dan
GH, dan faktor transkripsi STAT terfosforilasi oleh JAK2.
Pengikatan GH dengan reseptornya diperlukan untuk regulasi pertumbuhan
manusia normal dan pengembangan, termasuk pertumbuhan dan diferensiasi otot,
tulang, dan sel-sel tulang rawan. GH reseptor, anggota dari kelas 1 hematopoietik
reseptor superfamili adalah reseptor transmembran single-pass yang tidak memiliki
wilayah kinase. Klasifikasi ini didasarkan pada kesamaan urutan dalam domain
ekstraselular, terutama yang pentapeptide sangat lestari, yang disebut "kotak
WSXWS," fungsi yang kontroversial. Signaling terjadi melalui JAK / sinyal
transduser dan aktivator transkripsi (STAT) jalur, di mana ligan-induced
homodimerizasi telah diusulkan untuk mempromosikan hubungan stabil JAK2,
dengan fosforilasi JAK2, reseptor, dan STAT (Gambar 4.3). Dalam kasus GH,
aktivasi melibatkan reseptor homodimerizasi dalam proses berurutan. Asosiasi
hormon dan satu molekul reseptor perantara 01:01 kompleks membentuk kompleks
terner aktif terdiri dari satu ligan dan dua molekul reseptor. GH mengikat baik untuk
reseptor GH dan reseptor prolaktin.
GAMBAR 4.4 Struktur kompleks antara domain GH dan ekstraseluler manusia
reseptornya. GH terdiri dari empat heliks α padat yang ditampilkan dalam abu-abu
gelap. Dua protein yang mengikat terdiri dari lembaran β dan mereka akan
ditampilkan dalam terang dan abu-abu menengah, masing-masing. PDB id: DHHR.
Angka-angka dengan struktur molekul yang dibuat menggunakan Molscript Program.
(Vos, AM dkk., Sains, 255, 306-312, 1992.)
Pemeriksaan struktur kristal kompleks antara hormon dan domain ekstraseluler
reseptor telah menunjukkan bahwa kompleks terdiri dari satu molekul GH per dua
molekul reseptor. GH adalah gulungan empat-helix dengan topologi biasa (Gambar
4.4). ikatan protein mengandung dua domain yang berbeda, mirip dalam beberapa
hal ke domain imunoglobulin. Kedua domain mengikat GH berkontribusi residu yang
berpartisipasi dalam mengikat GH. Dalam kompleks, kedua reseptor
menyumbangkan dasarnya residu yang sama untuk berinteraksi dengan hormon,
meskipun dua situs mengikat GH tidak memiliki kesamaan struktural. Selain
interface hormon-reseptor, permukaan kontak substansial hadir antara domain
karboksil-terminal dari reseptor. Luasan relatif dari area kontak mendukung
mekanisme berurutan untuk dimerisasi yang mungkin penting bagi transduksi sinyal.
Struktur kompleks 1:1 GH terikat pada domain ekstraseluler reseptor prolaktin
mengungkapkan bagaimana hormon dapat mengikat dua reseptor jelas berbeda.
Akhirnya, struktur kompleks terner antara laktogen plasenta yg berhubung dgn
domba dan domain ekstraselular dari reseptor prolaktin tikus menunjukkan bahwa
dua reseptor mengikat ke sisi berlawanan dari laktogen plasenta dengan semu dua
kali lipat simetri. Dua situs mengikat reseptor berbeda secara signifikan dalam
topografi dan karakter elektrostatik. Mengikat interface juga melibatkan ikatan
hidrogen yang berbeda dan pola kemasan hidrofobik dibandingkan dengan kompleks
reseptor GH struktural terkait. Erythropoietin adalah hormon glikoprotein yang
mengatur proliferasi, diferensiasi, dan pematangan sel erythroid. EPO reseptor adalah
anggota dari kelas 1 sitokin reseptor superfamili. Struktur kristal dari peptida EPO-
mimesis dan bagian ekstraseluler reseptor EPO mengungkapkan dimer asimetris
dengan dua protein yang mengikat EPO. Setiap monomer protein pengikat EPO
terdiri dari dua fibronektin-III lipatan (D1 dan D2) yang terhubung sekitar di sudut
kanan, seperti dalam reseptor sitokin lainnya (Gambar 4.5). Di kompleks ligan-
reseptor, ligan menginduksi pembentukan dimer dekat dari kedua D1 dan D2 domain
dipisahkan oleh 39 Å, sehingga daerah intraseluler menjadi substrat untuk fosforilasi
oleh dua molekul JAK2. Sebaliknya, struktur asli, unligated ikatan protein EPO
menunjukkan dimer berbentuk salib di mana ujung membran-proksimal domain D2
dipisahkan oleh 73 Å, dan D1 domain setiap titik monomer dalam arah yang
berlawanan. Gunting-seperti konfigurasi dimer terus ujung intraseluler cukup jauh
terpisah sehingga autofosforilasi JAK2 tidak dapat terjadi. Dengan demikian,
peristiwa fosforilasi lainnya, seperti pada domain sitoplasmik dari reseptor EPO,
tidak terjadi. Dua struktur reseptor EPO menunjukkan bahwa reseptor unligated akan
diri-asosiasi pada permukaan sel dan membentuk dimer tidak aktif. Binding EPO ke
dimer reseptor menginduksi konformasi aktif. Sebuah dimer diri terkait akan
menjelaskan bagaimana EPO bisa mengaktifkan secara efisien pada permukaan sel di
mana relatif sedikit reseptor (<1000) yang hadir. Tanpa beberapa pengelompokan
reseptor, bahkan sementara, monomer kompleks reseptor-erythropoietin akan lazim,
terutama dalam kelebihan EPO.
GAMBAR 4.5 Unligated dan diikat erythropoietin reseptor konfigurasi dimer.
Dengan tidak adanya ligan, domain D2 dan akibatnya domain sitoplasmik dari dua
reseptor monomer EPO yang berorientasi dengan 73-Å pemisahan antara mereka. Di
hadapan ligan, jarak antara dua reseptor monomer EPO berkurang menjadi 39 Å
sehingga aktivasi JAK2 dan Trans-fosforilasi JAK2 dan domain sitoplasmik dari
reseptor EPO dapat terjadi. (Dimodifikasi setelah Livnah, O. et al., Sains, 273, 464-
471, 1996. Dengan izin.)
Faktor pertumbuhan endotel vaskular adalah hormon yang menginduksi
proliferasi homodimerik o sel endotel dan angiogenesis melalui mengikat RTKs
tertentu. Dua RTKs telah dijelaskan: kinase reseptor domain (KDR) dan Fms seperti
tirosin kinase (FLT-1), yang keduanya terletak pada permukaan sel endotel vaskular.
Bagian ekstraseluler terdiri dari tujuh Ig domain, dan domain kedua dan ketiga dari
FLT-1 yang perlu dan cukup untuk mengikat VEGF dengan afinitas dekat-asli,
domain 2 saja mengikat hanya 60 kali lipat lebih kuat daripada tipe liar. Struktur
kristal kompleks antara VEGF dan domain kedua FLT-1 menunjukkan bahwa domain
2 berinteraksi dengan "kutub" dari dimer VEGF secara dominan hidrofobik (Gambar
4.6).
Mamalia FGF keluarga reseptor mencakup setidaknya empat produk gen yang
berbeda, dengan keragaman tambahan yang dihasilkan oleh splicing alternatif.
Sampai saat ini, 18 FGFs mamalia telah diidentifikasi dan telah terbukti terlibat
dalam pengendalian berbagai respons biologis yang sangat penting untuk
perkembangan dan kelangsungan hidup. Keempat reseptor afinitas tinggi, reseptor
FGF 1 sampai 4, terdiri dari domain ligan-mengikat ekstraselular yang berisi tiga Ig-
seperti domain (D1 ke D3), heliks transmembran tunggal, dan sebuah domain
sitoplasmik yang berisi kegiatan PTK. Dimerisasi reseptor merupakan langkah
penting dalam FGF sinyal dan membutuhkan heparin sulfat proteoglikan. Struktur
kristal FGF2 terikat dengan varian alami dari FGF reseptor 1 yang terdiri dari Ig-
seperti domain D2 dan D3 menunjukkan bahwa FGF2 berinteraksi secara ekstensif
dengan dua D domain serta dengan linker antara dua domain. Dimer ini distabilkan
oleh interaksi antara FGF2 dan D2 dari kompleks sebelah dan oleh interaksi langsung
antara D2 masing-masing reseptor (Gambar 4.7). Struktur kristal FGF1 dan FGF2
kompleks dengan ligan-ikatan domain D2 dan D3 dari FGF reseptor 1 dan 2
mengungkapkan penentu ligan-reseptor spesifisitas. Daerah sangat tersimpan reseptor
FGF termasuk D2 dan linker antara D2 dan D3 menentukan situs mengikat umum
untuk semua FGFs. Kekhususan dicapai melalui interaksi antara daerah N-terminal
dan pusat FGFs dan dua daerah loop dalam D3 yang memiliki splicing alternatif.
GAMBAR 4.6 Struktur kompleks antara VEGF dan FLT-1. Dua monomer VEGF
terdiri dari lembaran β paralel dan mereka akan ditampilkan dalam terang dan abu-
abu menengah, masing-masing. Dua salinan FLT-1 dalam abu-abu gelap. PDB id:
1FLT. (Wiesmann, C. et al., Cell, 91, 641, 1997.)
Struktur kristal dari terner FGF2-FGF reseptor kompleks 1-heparin terdiri dari
dimer dengan 02:02:02 stoikiometri. Dalam setiap 01:01 FGF: FGF reseptor
kompleks, heparin membuat banyak kontak dengan kedua FGF dan FGF reseptor,
sehingga memperlebar FGF-FGF mengikat reseptor. Heparin juga berinteraksi
dengan reseptor FGF di sebelah 01:01 FGF: FGF reseptor kompleks untuk
mempromosikan FGF reseptor dimerisasi. Kelompok 6-O-sulfat heparin memainkan
peran penting dalam mediasi kedua interaksi. Atas dasar struktur kristal adalah
mungkin untuk merancang analog heparin mampu aktivitas FGF modulasi.
Mengingat peran penting FGF bermain di angiogenesis dan pertumbuhan sel, agonis
heparin sintetis dan antagonis mungkin memiliki nilai terapi yang potensial.
Ephrin (Ef) reseptor terbagi dalam dua kelompok, A dan B, berdasarkan
kemampuan mereka untuk mengikat ligan (ephrins), yang dengan sendirinya protein
permukaan sel berlabuh ke membran plasma baik melalui
glycosylphosphatidylinositol (GPI) linkage (tipe A) atau sebuah daerah
transmembran (tipe B). Sinyal antara reseptor Ef dan ephrins umumnya melibatkan
interaksi sel-sel langsung dan sering mengakibatkan tolakan sel. Reseptor Ef
Vertebrata memiliki banyak fungsi dalam gerakan sel, pembentukan batas sel, dan
morfogenesis dari jaringan kompleks seperti otak dan sistem kardiovaskular.
Reseptor Ef adalah RTKs dengan wilayah ekstraselular, daerah membran-spanning
singlechain, dan daerah sitoplasma dengan domain PTK. Wilayah ekstraseluler terdiri
dari dua tipe III fibronektin mengulangi: daerah kaya sistein dan 180 tersimpan -
asam amino N-terminal globular domain, yang baik perlu dan cukup untuk
pengikatan reseptor untuk ligan ephrin mereka. Reseptor Ef mengikat ligan ephrin
mereka dengan afinitas tinggi dan dengan satu-ke-satu stoikiometri. Struktur kristal
dari domain amino-terminal dari reseptor lipatan EphB2 menjadi jellyroll kompak β-
sandwich yang terdiri dari 11 antiparalel β-helai. Menggunakan mutagenesis berbasis
struktur, loop diperpanjang yang penting bagi ligan mengikat dan spesifisitas kelas
telah diidentifikasi.
GAMBAR 4.7 Struktur kompleks dimer antara FGF2 dan FGF reseptor 1. Ig-seperti
domain 2 dan 3 dari dua FGF reseptor 1 molekul terdiri dari lembaran β paralel dan
mereka akan ditampilkan dalam medium dan abu-abu muda, masing-masing. Dua
molekul FGF2 terdiri dari seikat lembaran β yang ditampilkan dalam abu-abu gelap.
PDB id: 1CVS. (Plotnikov, AN dkk., Cell, 98, 641, 1999.)
Faktor pertumbuhan saraf yang terlibat dalam berbagai proses yang melibatkan
sinyal, seperti diferensiasi sel dan kelangsungan hidup, penghentian pertumbuhan,
dan apoptosis neuron. Peristiwa ini dimediasi oleh NGF sebagai akibat dari mengikat
untuk reseptor permukaan sel-nya dua, TrkA dan P75. TrkA adalah reseptor dengan
aktivitas PTK yang membentuk situs tinggi afinitas mengikat bagi NGF. Dari lima
domain yang terdiri dari bagian ekstraseluler, yang Ig-seperti D5 domain proksimal
membran perlu dan cukup untuk mengikat NGF. Struktur kristal NGF manusia dalam
kompleks dengan D5 domain TrkA manusia menunjukkan bahwa NGF dimer
mengikat dua reseptor dengan antarmuka yang terdiri dari dua patch dengan ukuran
yang sama (Gambar 4.8). Satu patch merupakan motif mengikat umum untuk semua
anggota keluarga, sedangkan patch kedua adalah khusus untuk interaksi antara NGF
dan TrkA.
GAMBAR 4.8 Struktur NGF di kompleks dengan domain ligan-mengikat reseptor
TrkA. Kedua monomer NGF terdiri dari lembaran β paralel dan mereka akan
ditampilkan dalam terang dan abu-abu menengah, masing-masing. Kedua TrkA D5
domain terdiri dari lembaran β yang ditampilkan dalam abu-abu gelap. PDB id:
1WWW. (Wiesmann, C. et al., Nature, 401, 184, 1999.)
Insulin-like growth factor I terlibat dalam kedua pertumbuhan normal dan
pengembangan banyak jaringan dan transformasi maligna. IGF-I reseptor adalah
molekul heterotetrameric terdiri dari dua rantai α dan dua rantai β dihubungkan oleh
ikatan disulfida. Rantai α ekstraseluler terdiri dari beberapa domain dengan wilayah
ligan mengikat terletak di amino-terminus. Rantai β terdiri dari domain pendek
ekstraseluler, domain transmembran, dan domain PTK sitoplasma. Struktur kristal
pertama tiga domain reseptor IGF-I, termasuk L1, sistein kaya, dan L2 domain,
menunjukkan bahwa setiap domain L terdiri dari tangan kanan β heliks beruntai
tunggal. Wilayah cysteinerich terdiri dari delapan modul disulfida-berikat, tujuh di
antaranya membentuk domain berbentuk batang dengan modul terkait dalam cara
yang tidak biasa. Tiga domain mengelilingi ruang tengah dengan ukuran yang cukup
untuk mengakomodasi molekul ligan. Meskipun fragmen (residu 1-462) tidak
mengikat ligan, banyak faktor penentu yang bertanggung jawab untuk mengikat
hormon dan ligan spesifisitas peta ke situs ini pusat.
4.5.2 DOMAIN PROTEIN KINASE
Struktur kristal dari domain PTK dari beberapa RTKs telah dilaporkan (Tabel
4.2). Ini mengikuti penentuan struktur beberapa protein serine / threonine kinase
terkait, yang pertama adalah siklik AMP-dependent protein kinase (PKA). Domain
PTK secara keseluruhan mirip dengan yang ada pada serin / treonin kinase (Gambar
4.9). Hal ini terdiri dari lobus amino-terminal, terdiri dari lima untai β-sheet dan satu
heliks α, dan C-terminal lobus besar yang terutama α heliks. ATP mengikat di celah
antara dua lobus, dan peptida substrat tirosin yang mengandung mengikat lobus C-
terminal. Beberapa residu sangat tersimpan dalam semua PTKS, termasuk beberapa
glycines dalam lingkaran nucleotideikatan, lisin dalam β-untai 3, asam glutamat di α
helix C, asam aspartat dan asparagin di loop katalitik, dan Asp-Phe-Gly motif pada
awal loop aktivasi. Protein kinase adalah mampu berbagai konformasi karena
fleksibilitas yang interlobe melekat yang memungkinkan untuk konformasi terbuka
dan tertutup. Namun, konformasi katalis kompeten umumnya merupakan struktur
tertutup di mana dua lobus menjepit bersama untuk membentuk situs pengikatan
nukleotida antarmuka dan catalytic sumbing. N-terminal lobus protein kinase terdiri
minimal dari lima untai β-sheet memutar (dilambangkan β1 ke β5) dan αC heliks
tunggal. Fungsi N-terminal lobus untuk membantu dalam mengikat dan koordinasi
ATP untuk transfer produktif dari γ-fosfat ke berorientasi oleh lobus C-terminal
substrat. Dalam hal ini, β-helai 1 dan 2 dan glisin-kaya menghubungkan bentuk
segmen flap fleksibel yang berinteraksi dengan basis adenin, gula ribosa, dan gugus
fosfat nonhydrolyzable ATP. Selanjutnya, jembatan garam invarian antara lisin rantai
samping di β-untai 3 dan asam glutamat rantai samping di helix αC
mengkoordinasikan β-fosfat dari ATP.
C-terminal lobus protein kinase terdiri minimal dari dua β-helai (β7 dan β8) dan
serangkaian heliks α (αD ke αI). Strands β7 dan β8 mencari ke daerah sumbing antara
N-dan lobus Cterminal mana mereka berkontribusi rantai samping yang berpartisipasi
dalam katalisis dan mengikat magnesium untuk koordinasi gugus fosfat ATP.
Aktivasi segmen, yang juga terletak di lobus katalitik besar, yang teratur dalam
struktur protein kinase di mana segmen aktivasi tidak terfosforilasi. Sisanya elemen
lobus C-terminal, termasuk heliks α αD ke αI, yang diperintahkan dengan baik, dan
kinase berakhir dengan αJ singkat. Aktivitas katalitik RTK dirangsang oleh
autofosforilasi tyrosines di aktivasi. Dalam keadaan unphosphorylated, RTK tidak
aktif.
Struktur kristal bentuk unphosphorylated dari RTK domain reseptor insulin,
FGF reseptor, reseptor VEGF 2, Tie2 reseptor, dan reseptor EphB2 memberikan
dasar molekuler untuk memahami bagaimana aktivitas katalitik direpresi sebelum
aktivasi reseptor. Masing-masing dari lima struktur RTK mengungkapkan mekanisme
yang berbeda dari inaktivasi. Aktivasi loop reseptor insulin berisi tiga situs
autofosforilasi tirosin. Dalam struktur kristal unphosphorylated reseptor insulin, salah
satu tyrosines terikat dalam situs aktif, hidrogen terikat pada asam aspartat tersimpan
dan arginin dalam lingkaran katalitik. Tyr1162 adalah tampaknya dalam posisi untuk
autophosphorylated di cis, tetapi asam aspartat lestari motif DFG (Asp1150) pada
awal loop aktivasi, yang terlibat dalam Mg-ATP mengikat, tidak diposisikan dengan
benar untuk katalisis (Gambar 4.9 ). Data struktural menunjukkan bahwa sebelum
autofosforilasi, Tyr1162 bersaing dengan substrat protein untuk situs aktif. Studi
biokimia mendukung mekanisme trans-fosforilasi untuk Tyr1162 serta Tyr1158 dan
Tyr1163 di aktivasi. Substitusi Fenilalanin dari Tyr1162 menghasilkan peningkatan
aktivitas katalitik RTK dalam ketiadaan insulin mendukung peran otoinhibitor untuk
Tyr1162.
GAMBAR 4.9 Struktur dari domain PTK dari reseptor insulin. N-terminal kinase
lobus terdiri dari satu heliks α dan lima lembar β yang ditampilkan dalam media abu-
abu dengan loop nukleotida-mengikat dalam abu-abu gelap. C-terminal kinase lobus
terdiri dari heliks α dan lembaran β yang ditampilkan dalam abu-abu terang dengan
loop katalitik abu-abu menengah. Aktivasi loop ditunjukkan dalam abu-abu gelap
dengan Tyr1162 abu-abu menengah. PDB id: 1IRK. (Hubbard, SR et al., Nature, 372,
746, 1994.)
Struktur kristal dari domain PTK FGF reseptor 1 telah ditentukan. Aktivasi
loop domain kinase reseptor FGF berisi dua situs autofosforilasi tirosin, Tyr653 dan
Tyr654, sesuai dengan Tyr1162 dan Tyr1163 pada reseptor insulin. Konformasi dari
unphosphorylated FGF RTK aktivasi lingkaran seperti yang terlihat dalam struktur
kristal secara signifikan berbeda dari yang ditemukan pada insulin RTK (Gambar
4.10). Dalam FGF RTK struktur, baik dari activationloop tyrosines terikat di situs
aktif. Sebaliknya, prolin pada akhir loop aktivasi dan terdekat residu tirosin-kinase-
invarian diposisikan untuk mengganggu pengikatan substrat tirosin. Selanjutnya,
berbeda dengan insulin RTK, awal loop aktivasi tidak menghalangi situs pengikatan
ATP di FGF RTK.
GAMBAR 4.10 Struktur dari domain PTK dari FGF reseptor 1. N-terminal kinase
lobus terdiri dari satu heliks α dan lima lembar β yang ditampilkan dalam warna abu-
abu menengah. C-terminal lobus terdiri dari heliks α dan lembaran β yang
ditampilkan dalam abu-abu terang dengan loop katalitik abu-abu menengah. Aktivasi
loop abu-abu gelap dengan Tyr653, Tyr654 dan Pro663 abu-abu menengah. PDB id:
1FGK. (Mohammadi, M. et al., Cell, 86, 577, 1996.)
Struktur kristal dari domain PTK dari VEGF reseptor 2 KDR mengungkapkan
persamaan dan perbedaan dengan insulin dan FGF RTKs. Reseptor VEGF (KDR dan
FLT-1), seperti reseptor PDGF, memiliki kinase insert yang besar antara heliks D dan
E di lobus karboksil-terminal. Kinase insert berisi beberapa situs autofosforilasi
tirosin yang berfungsi sebagai docking situs untuk protein SH2 domain. Upaya untuk
mengkristal VEGF RTK dengan insert gagal, tapi kristal protein kurang 50 residu
insert diperoleh. VEGF RTK memiliki dua situs tirosin autofosforilasi di loop
aktivasi, Tyr1054 dan Tyr1059, yang sesuai dengan Tyr1158 dan Tyr1163 pada
reseptor insulin. Namun, residu tirosin sesuai dengan otoinhibitor Tyr1162 pada
reseptor insulin tidak hadir dalam reseptor VEGF. Struktur kristal, ditentukan dalam
unligated, negara terfosforilasi, mengungkapkan posisi residu keseluruhan lipat dan
catalytic serupa dengan yang diamati dalam struktur tirosin kinase lainnya. Kinase
aktivasi lingkaran, autophosphorylated pada Tyr1059 sebelum kristalisasi, sebagian
besar teratur. Namun, sebagian dari loop aktivasi di sekitar tersimpan Pro1168
mengadopsi konformasi penghambatan yang sama seperti yang terlihat dalam struktur
unphosphorylated FGR RTK: wilayah ini menempati posisi inhibitor untuk mengikat
substrat. Ujung-ujung kinase bentuk insert struktur β-seperti, tidak diamati dalam
struktur tirosin kinase yang dikenal lainnya, yang kemasan dekat dengan kinase C
terminus. Struktur yang unik juga dapat terjadi pada anggota keluarga reseptor PDGF
lain dan dapat berfungsi untuk benar orientasi insert kinase untuk autofosforilasi
residu tirosin dan mengikat protein adaptor dalam struktur tirosin kinase lainnya.
Pada aktivasi loop kinase, autofosforilase pada Tyr1059
sebelum kristalisasi sebagian
besar teratur. Namun, sebagian aktivasi loop dari Pro1168
mengadopsi konformasi
penghambatan seperti yang terlihat pada struktur yang tidak terfosforilasi FGR RTK:
wilayah ini menempati posisi hambatan untuk binding substrat. Ujung dari
pemasukan kinase membentuk struktur seperti struktur α, β, tidak diamati pada
struktur tirosin kinase yang dikenal lainnya, yang terdekat dengan kinase C terminus.
Struktur yang unik juga dapat terjadi pada reseptor PDGF yang lain dan dapat
memberikan fungsi orientasi pada pemasukan kinase untuk autofosforilasi residu
tirosin dan mengikat protein adaptor.
Tie2 juga dikenal sebagai Tek) adalah RTK endotelium spesifik yang terlibat
dalam angiogenesis dan pemeliharaan pembuluh darah. Struktur Kristal domain RTK
dari Tie2 berisi katalitik inti, domain insert kinase, dan ekor C-terminal. Pengikatan
nukleotida Tie2 adalah sebuah konformasi hambatan, yang tidak terlihat oleh struktur
kinase yang lain, sedangkan lingkaran aktivasi mengadopsi "diaktifkan-seperti"
konformasi dalam ketiadaan fosforilasi. Tyr897
, terletak di N-terminal domain
kemungkinan kecil mengatur aktivitas Tie2 dengan mencegah dimerisasi
domain kinase atau dengan merekrut fosfatase ketika terfosforilasi. Aktivasi RTK
pada aktivasi Tie2 adalah proses yang kompleks yang memerlukan perubahan
konformasi dalam mengikat lingkaran nukleotida , aktivasi lingkaran, C helix, dan
ekor karboksil-terminal untuk ATP dan mengikat substrat.
Struktur kristal dari domain katalitik EphB2 dan wilayah paruh kedua
juxtamembran, termasuk dua situs fosforilasi Tyr604
dan Tyr610
yang bermutasi
fenilalanin, telah dipecahkan. Struktur dari domain katalitik sesuai dengan yang
umumnya diamati untuk protein kinase, yang terdiri dari dua lobus, lobus N-terminal
yang lebih kecil dan lobus C terminal yang lebih besar. Autoinhibitor EphB2 domain
katalitik mengadopsi konformasi tertutup yang dangkal menyerupai keadaan aktif
(Gambar 4.11). Wilayah juxtamembran EphB2 memerintah katalitik domain, terdiri
dari untai diperpanjang segmen Ex 1, sebuah turn tunggal 3/10 helix αAř dan turn
empat helix αBř. Unsur-unsur ini berhubungan erat dengan helix αC dari lobus
katalitik N-terminal dan juga berinteraksi secara terbatas dengan lobus C-terminal.
Segmen juxtamembrane mengadopsi konformasi heliks yang mendistorsi lobus kecil
N-terminal kinase domain dengan menerapkan kelengkungan pada helix αC.
Pasangan distorsi ini untuk distorsi lokal dalam elemen lobus N-terminal lain, paling
kritis loop kaya-glisin dan invarian jembatan garam. lisin-glutamat. Bersama-sama,
distorsi N-terminal tampaknya berpengaruh pada fungsi katalitik dengan dapat
mempengaruhi koordinasi gula dan fosfat kelompok yang terikat nukleotida. Dengan
kontak terbatas pada lobus bawah dari domain katalitik, segmen juxtamembrane yang
juga sterik menghambat aktivasi dari segmen mengadopsi konformasi produktif yang
menggambarkan keadaan aktif PTK. Bersama-sama, efek pada koordinasi nukleotida
dan aktivasi bentuk segmen dasar untuk autoinhibition dari EphB2 RTK oleh segmen
juxtamembran. Pada EphB2, dan kemungkinan besar Eph RTKs secara umum,
beralih ke keadaan aktif dikoordinasikan oleh fosforilasi di lokasi sangat dilestarikan
dalam kedua wilayah juxtamembrane dan katalitik domain. Fosforilasi EphB2 di
Tyr788 kemungkinan mempromosikan Urutan segmen aktivasi ke konformasi
katalitik kompeten. Sebaliknya, fosforilasi pada Tyr604
dan Tyr610
mungkin berfungsi
untuk mengacaukan struktur juxtamembrane dan menyebabkannya untuk
memisahkan dari domain katalitik. Hal ini akan memungkinkan untuk kembali dari
lobus N-terminal ke konformasi aktif terdistorsi.
4. 5. 3 STRUKTUR DARI AKTIVASI RESEPTOR TIROSIN KINASE
Struktur kristal terfosforilasi, bentuk aktif dari insulin RTK yang membentuk
kompleks dengan substrat peptidase dan sebuah analog ATP telah ditentukan.
Aktivasi lingkaran mengalami perubahan konformasi utama pada autofosforilasi
Tyr1158
, Tyr1162
, dan Tyr1163
dalam lingkaran., mengakibatkan akses tidak terbatas
ATP dan substrat protein ke situs aktif kinase (Gambar 4.12). Fosforilasi Tyr1163
(pTyr1163
) adalah kunci phospotirosine dalam menstabilkan konformasi dari aktivasi
lingkaran tris-terfosforilasi, sedangkan pTyr1158
telah melarut sempurna,
menunjukkan ketersediaan interaksi dengan sinyal protein hilir. YMXM mengandung
substrat peptide yang mengikat untai pendek antiparallel B ke ujung C-terminal
aktivasi lingkaran (loop), dengan metionin rantai samping menduduki dua kantong
hidrofobik pada lobus C-terminal kinase. Berdasarkan struktur tersebut menunjukkan
dasar molekul untuk aktivasi reseptor insulin melalui autofosforilasi, dan memberikan
gambaran ke substrat spesifik RTK dan mekanisme phosphotransfer.
GAMBAR 4.11 Struktur domain autoinhibited EphB2 PTK. Wilayah
jukstamembran terdiri dari dua heliks α yang bewarna abu-abu gelap dengan Tyr604
dan Tyr610 abu-abu sedang. Lobus N-terminal kinase terdiri dari satu heliks α dan
lima lembar β yang ditampilkan dalam media abu-abu dengan lingkaran pengikat
nukleotida dalam abu-abu gelap. Adenin dari AMP-PNP dalam abu-abu terang.
Lobus C terminal kinase terdiri heliks α dan lembaran β yang ditampilkan dalam abu-
abu terang. PDB id: IJPA (Wybenga-Groot, L. E, et al, Cell, 106, 745, 2001).
Insulin, seperti faktor pertumbuhan reseptor I berkaitan erat dengan reseptor
insulin. Aktivitas RTK dari reseptor IGF diatur oleh autofosforilasi antarmolekul di
tiga lokasi dalam loop aktivasi. Struktur kristal bentuk trisphosphorylated IGF-I RTK
domain dengan analog ATP dan substrat peptida tertentu menunjukkan
autofosforilasi yang menstabilkan aktivasi lingkaran dalam konformasi yang
memfasilitasi katalisis. Selanjutnya, struktur mengungkapkan bagaimana RTK
mengakui tirosin yang mengandung peptida dengan residu hidrofobik pada posisi
P+1 dan P +3. Secara keseluruhan pada aktivasi IGF-I, struktur RTK mirip dengan
struktur RTK insulin yang telah aktif, walaupun perbedaan urutan berpotensi
dimanfaatkan untuk desain obat antikanker.
GAMBAR 4.12 Struktur reseptor insulin tris-terfosforilasi. Lobus N-terminal
kinase terdiri satu heliks α dan lima lembar β yang ditampilkan dengan media abu-
abu dengan lingkaran binding- nukleotida dalam abu-abu gelap. AMP-PNP adalah
abu-abu terang dengan tiga residu fosfat abu-abu gelap. Lobus C-terminal kinase
terdiri dari heliks α dan lembaran β yang ditampilkan dalam abu-abu terang dengan
loop katalitik dalam medium abu-abu dan substrat peptida dalam abu-abu gelap.
(Hubbard, S. R., J. EMBO, 16, 5572, 1997.)
Kelompok lain memecahkan struktur kristal dari IGF-I RTK domain
terfosforilasi di duaresidu tirosin dalam loop aktivasi dan terikat ke analog ATP.
Ligan tidak dalam konformasi kompatibel dengan transfer fosforil dan loop aktivasi
sebagian teratur. IGF-I RTK terperangkap dalam setengah tertutup, sebelumnya
konformasi teramati . konformasi ini mungkin diperantarai oleh konformasi aktif dan
tertutup, konformasi aktif oleh insulin dan IGF-I RTKs.
4. 5. 4 INHIBITOR RESEPTOR TIROSIN KINASE
Reseptor tirosin kinase merupakan komponen penting dari jalur sinyal yang
mengontrol proliferasi sel dan diferensiasi. Peningkatan aktivitas RTK karena
mengaktifkan mutasi atau ekspresi berlebih yang mengimplikasikan kanker pada
manusia. Dengan demikian, inhibitor selektif RTKs memiliki nilai cukup. Meskipun
sejumlah senyawa telah diidentifikasi sebagai efektif inhibitor RTKs, mekanisme
molekuler yang tepat dimana agen ini menghambat aktivitas RTK belum dijelaskan.
Dua penelitian telah melaporkan struktur Kristal dari inhibitor RTK membentuk
kompleks dengan reseptor 1 FGF domain kinase tirosin. Satu kelas dari inhibitor
RTK didasarkan pada inti oxindole (indolinones). Dua senyawa pada kelas ini
menghambat aktivitas kinase dari reseptor FGF 1 dan menunjukkan spesifisitas
diferensial terhadap RTKs lainnya. Struktur kompleks mengungkapkan bahwa
oxindole menempati lokasi di mana adenin ATP mengikat, sedangkan gugus yang
memperpanjang dari residu kontak oxindole di daerah engsel antara dua lobus dari
kinase. Inhibitor spesifik yang lain dari reseptor 1 FGF menginduksi perubahan
konformasi dalam lingkaran binding nukleotida. Kelas lain dari inhibitor RTK
termasuk senyawa sintetis dari kelas pyrido-2, 3 -d-pirimidin yang selektif
menghambat aktivitas PTK pada reseptor FGF dan VEGF. Struktur kompleks dari
senyawa domain kinase dari reseptor FGF 1 menunjukkan tingkat tinggi permukaan
komplementaritas antara analog pirimidin dan ATP binding hidrofobik reseptor 1
FGF. Inhibitor adalah kandidat yang menjanjikan untuk terapi inhibitor angiogenesis
dan obat antiproliferatif yang akan digunakan dalam pengobatan kanker dan
gangguan pertumbuhan lainnya.
4. 6 BACAAN LEBIH LANJUT
de Vos, A. M., Ultsch, M., and Kossiakoff, A. A., Human growth hormone and
extracellular domain of its
receptor: crystal structure of the complex, Science, 255, 306Ŕ312, 1992.
Favelyukis, S., Till, J. H., Hubbard, S. R., and Miller, W. T., Structure and
autoregulation of the insulin-like
growth factor 1 receptor kinase, Nat. Struct. Biol., 8, 1058Ŕ1063, 2001.
Gammeltoft, S., Insulin receptors: binding kinetics and structure-function relationship
of insulin, Physiol. Rev.,
64, 1321Ŕ1378, 1984.
Gronborg, M., Wulff, B. S., Rasmussen, J. S., Kjeldsen, T., and Gammeltoft, S.,
StructureŔfunction relationship
of the insulin-like growth factor-I receptor tyrosine kinase, J. Biol. Chem., 268,
23435Ŕ13440, 1993.
Heldin, C. H., Dimerization of cell surface receptors in signal transduction, Cell, 80,
213Ŕ223, 1995.
Hubbard, S. R., Crystal structure of the activated insulin receptor tyrosine kinase in
complex with peptide
substrate and ATP analog, EMBO J., 16, 5572Ŕ5581, 1997.
Hubbard, S. R. and Till, J. H., Protein tyrosine kinase structure and function, Annu.
Rev. Biochem., 69, 373Ŕ398,
2000.
Hubbard, S. R., Wei, L., Ellis, L., and Hendrickson, W. A., Crystal structure of the
tyrosine kinase domain of
the human insulin receptor, Nature, 372, 746Ŕ754, 1994.
Hubbard, S. R., Mohammadi, M., and Schlessinger, J., Autoregulatory mechanisms in
protein-tyrosine kinases,
J. Biol. Chem., 273, 11987Ŕ11990, 1998.
Hunter, T., The Croonian Lecture 1997. The phosphorylation of proteins on tyrosine:
its role in cell growtH
and disease, Philos. Trans. Roy. Soc. London B (Biol. Sci.), 353, 583Ŕ605, 1998.
Jiang, G. and Hunter, T., Receptor signaling: when dimerization is not enough, Curr.
Biol., 9, R568ŔR571,
1999.
Kossiakoff, A. A. and De Vos, A. M., Structural basis for cytokine hormone-receptor
recognition and receptor
activation, Adv. Protein Chem., 52, 67Ŕ108, 1998.
Kuriyan, J. and Cowburn, D., Modular peptide recognition domains in eukaryotic
signaling, Annu. Rev.
Biophys. Biomol. Struct., 26, 259Ŕ288, 1997.
Livnah, O. et al., Functional mimicry of a protein hormone by a peptide agonist: the
EPO receptor complex
at 2.8 Å, Science, 273, 464Ŕ471, 1996.
Mohammadi, M., Schlessinger, J., and Hubbard, S. R., Structure of the FGF receptor
tyrosine kinase domain
reveals a novel autoinhibitory mechanism, Cell, 86, 577Ŕ578, 1996.
Pawson, T. and Scott, J. D., Signaling through scaffold, anchoring, and adaptor
proteins, Science, 278,
2075Ŕ2080, 1997.
Plotnikov, A. N., Schlessinger, J., Hubbard, S. R., and Mohammadi, M., Structural
basis for FGF receptor
dimerization and activation, Cell, 98, 641Ŕ650, 1999.
Schlessinger, J., Cell signaling by receptor tyrosine kinases, Cell, 103, 211Ŕ225,
2000.
BAGIAN III
STUDI RESEPTOR
PENGIKATAN-LIGAN
PENGUKURAN LANGSUNG PADA PENGIKATAN OBAT-RESEPTOR
5
Dennis G. Haylett
ISI
5. 1 Pendahuluan
5. 1. 1 Tujuan Studi Pengikatan Radioligand
5. 1. 2 Tatanama
5. 1. 3 Spesifitas Pengikatan
5.2 Model Pengikatan Radioligan
5. 2. 1 Saturasi
5. 2. 1. 1 Beberapa Situs Pengikatan
5. 2. 1. 2 Interaksi Situs
5. 2. 1. 3 Agonis
5. 2. 1. 3. 1 Aktivasi Reseptor Model del Castillo-Katz
5. 2. 1. 3. 2 Aktivasi Reseptor Model Ternary Kompleks
5. 2. 2 Studi Kinetik
5. 2. 2. 1 Pengukuran Konstanta Disosiasi, k-1
5. 2. 2. 2 Pengukuran Konstanta Disosiasi, k+2
5. 2. 3 Percobaan Kompetisi
5. 2. 3. 1 Hubungan antara K1 dan IC50
5. 2. 3. 2 Beberapa Situs Binding
5. 2. 3. 3 Link Reseptor G-Protein
5. 2. 4 Percobaan Retardasi
5. 3 Aspek Praktis Studi Pengikatan Ligan
5. 3. 1 Persiapan Reseptor
5. 3. 2 Radioligan
5. 3. 3 Kondisi Inkubasi
5. 3. 3. 1 Inkubasi Medium
5. 3. 3. 2 Suhu
5. 3. 3. 3 Lama Inkubasi
5. 3. 3. 4 Jumlah Jaringan
5. 3. 4 Metode Pemisahan Bagian Terikat Dari Ligan Bebas
5. 3. 4. 1 Penyaringan
5. 3. 4. 2 Sentrifugasi
5. 3. 5 Penentuan Pengikatan Non Spesifik
5. 4 Analisis Data Pengikatan
5. 4. 1 Plot Scatchard
5. 4. 2 Plot Lineweaver-Burk
5. 4. 3 Plot Hill
5. 4. 4 Analisis Percobaan Kompetisi
5. 4. 5 Analisis Data Metode Kuadrat Non Linear
5. 5 Relevansi Hasil Studi Pengikatan
5. 6 Masalah
5.7 Bacaan Lebih Lanjut
5. 8 Solusi Terhadap Masalah
5. 1 PENDAHULUAN
Dalam bab ini, kita melihat cara dimana pengikatan ligan dengan
makromolekul bisa langsung diselidiki. Meskipun sebagian besar pusat perhatian
pada interaksi obat-obatan dan hormon dengan reseptor, pendekatan yang dilakukan
di sini dapat diterapkan untuk setiap proses yang sama - misalnya, kombinasi obat
dengan saluran ion atau sistem transportasi membran. Pengikatan ligan, termasuk
obat, pada protein plasma telah dipelajari selama lebih dari 50 tahun, namun studi
pengikatan sangat sedikit dari protein (misalnya, reseptor) dalam membran sel yang
lebih baru, setelah menjadi layak hanya bila cocok ligan berlabel radioaktif menjadi
tersedia. Penelitian ketat pertama pengikatan obat pada reseptor oleh Paton dan Rang
(1965), yang menyelidiki pengikatan 3 H-atropin pada reseptor muskarinik dalam
otot polos. Penggunaan obat radiolabel pada studi pengikatan radioligand sekarang
menjadi umum dan bagi banyak produsen farmasi merupakan hal penting untuk
melakukan proses penyaringan, menyediakan sarana cepat menentukan afinitas obat
baru untuk berbagai reseptor. Pelabelan obat dengan radioisotope adalah hal menarik
karena sangat kecil jumlah, sering serendah 1 fmol, dapat mudah dan diukur akurat.
Reseptor farmakologi juga tertarik dalam pengukuran konsentrasi ligan dengan
fluoresensi, tapi ini, tentu saja, membutuhkan ketersediaan atau sintesis ligan dengan
gugus yang sesuai, dan saat ini metode ini memerlukan konsentrasi ligan jauh lebih
tinggi. Fluoresensi dilakukan, Namun, memiliki utilitas tertentu dalam percobaan
kinetik, dimana perubahan fluoresensi yang terjadi pada pengikatan adalah langsung,
yang memungkinkan pengikatan untuk terus dipantau.
5. 1. 1 TUJUAN STUDI PENGIKATAN RADIOLIGAND
Ini termasuk:
Pengukuran konstanta kesetimbangan disosiasi yang merupakan nilai tertentu
dalam klasifikasi reseptor dan dalam studi struktur / kegiatan hubungan, di mana
dampak perubahan struktur kimia pada afinitas dapat diketahui
Pengukuran asosiasi dan tetapan laju disosiasi
Pengukuran kepadatan reseptor, termasuk perubahan dalam kepadatan reseptor
yang terjadi di bawah kondisi fisiologis atau patologis yang berbeda. Contohnya
termasuk pengurangan densitas adrenoreseptor-B yang terjadi dengan penggunaan
β agonis dalam pengobatan asma (down-regulation) dan peningkatan
adrenoreseptor B di otot jantung sebagai respon tiroksin. Kepadatan reseptor dapat
diukur baik secara langsung dalam jaringan sampel atau dalam jaringan utuh
dengan kuantitatif autoradiografi. Autoradiografi, di mana gambaran tentang
distribusi radiolabel di bagian jaringan yang diperoleh dengan menempatkan film
fotografi dalam kontak dengan jaringan, telah memberikan informasi yang
berharga pada pendistribusian berbagai reseptor di otak. Positron emission
tomography (PET) dan Single-photon-emission computerized tomography
(SPECT) memanfaatkan ligan berlabel dengan emitter positron lainnya
(misalnya, C) atau emitter gamma yang digunakan untuk menyelidiki kepadatan
reseptor atau reseptor hunian oleh obat secara vivo.
Pengakuan dan kuantifikasi subtipe reseptor yang mungkin jika ligan
subtypeselektif tersedia
Penggunaan radioligands dalam pemurnian kimia reseptor. Di sini, radioligand
terikat memungkinkan reseptor untuk dilacak melalui berbagai langkah pemurnian
- misalnya, dalam fraksinasi eluen dari kolom pemisahan. Dalam percobaan
tersebut, penting untuk radioligand yang akan terikat ireversibel pada reseptor.
Akhirnya, dimungkinkan untuk mendapatkan beberapa informasi yang tak
terbatas mengenai mekanisme aksi agonis dari bentuk kurva pengikatan. Misalnya,
seperti yang dibahas kemudian, pengikatan beberapa agonis dipengaruhi oleh
guanosin trifosfat (GTP), segera menunjukkan keterlibatan dari G-protein dalam
mekanisme transduksi.
5. 1. 2 TATA NAMA
Dibandingkan dengan konvensi yang diadopsi untuk membahas hubungan
antara konsentrasi obat dan respon (Bab 1), Sebuah terminologi yang agak berbeda
telah berkembang untuk studi pengikatan ligan.
R : Situs pengikatan , paling sering reseptor sesungguhnya (tapi cukup sering dengan
istilah reseptor-diterapkan pada situs pengikatan)
L: ligan radiolebel yang mengikat secara langsung diukur, L bisa menjadi agonis
atau antagonis atau bahkan saluran blocker, dll
I : Sebuah inhibitor pengikatan L, I bisa menjadi agonis atau antagonis
B : Sering digunakan untuk menunjukkan jumlah radioligand terikat, Bmax,
Kapasitas pengikatan maksimum K1, K1 : Konstanta kesetimbangan disosiasi untuk
pengikatan L dan saya (konstanta afinitas s) Kd : Digunakan lebih umum untuk
konstanta kesetimbangan disosiasi ligan apapun
5. 1. 3 SPESIFITAS PENGIKATAN
Satu pertimbangan yang sangat penting dalam studi pengikatan adalah sejauh
mana pengikatan diukur dari radioligand mewakili asosiasi dengan reseptor atau situs
lain yang menarik. (Dalam studi fungsional, ini tidak sulit, karena respon hanya dapat
ditimbulkan oleh pengikatan agonis pada reseptor dan, untuk antagonisme kompetitif,
setidaknya, ada kemungkinan bahwa antagonis juga berikatan dengan reseptor.)
Selalu pada studi pengikatan, penyerapan radioligand dengan komponen jaringan
lainnya terjadi (kecuali, pengikatan dimurnikan, protein terlarut sedang diselidiki).
Pengikatan pada reseptor biasanya disebut pengikatan spesifik , sedangkan
pengikatan pada komponen non-reseptor disebut sebagai pengikatan non spesifik.
Pengikatan non spesifik mungkin disebabkan:
1. Ligan terikat ke situs lain dalam jaringan (misalnya, reseptor lain, enzim atau
membrane transpor). Sebagai contoh, beberapa antagonis muskarinik juga akan
mengikat reseptor histamine dan beberapa ligan adrenoreseptor juga akan
mengikat neuronal dan extraneuronal mekanisme penyerapan untuk noradrenalin.
Serapan tersebut mungkin akan dianggap benar "spesifik," tetapi tidak mengikat
kepentingan utama kepada penyidik. Tidak seperti sumber pengikatan non
spesifik, pengikatan ini akan saturable, meskipun mungkin diharapkan menjadi
afinitas rendah dan akan meningkat dalam mode sekitar linier selama rentang
konsentrasi ligan yang digunakan. Jika karakteristik pengikatan non spesifik
semacam ini yang mapan, dimungkinkan untuk menghilangkannya dengan
menggunakan selektif bloker (misalnya, dengan menggunakan inhibitor spesifik
dari proses serapan-1 noradrenalin).
2. Distribusi ligan ke dalam komponen lipid (misalnya, membran sel) atau
penyerapan ke dalam sel utuh atau vesikel membrane.
3. Ligan bebas yang tak lepas dari ligan terikat selama percobaan fase pemisahan,
termasuk ligan terikat dengan pelet filter atau terjebak dalam membran atau sel
selama sentrifugasi
Tidak seperti kategori 1 di atas, pengikatan non spesifik yang timbul dari
kategori 2 dan 3 akan nonsaturabel dan akan meningkat secara linear dengan
konsentrasi radioligand. Pengikatan non spesifik tipe 1, 2 dan radioligand terjebak
dalam pelet harus meningkat secara proporsional dengan jumlah jaringan yang
digunakan dalam reaksi pengikatan, pengikatan pada filter dan tidak Seharusnya
pada dinding tabung sentrifugasi. Jika penyidik beruntung, dalam pengikatan non
spesifik kategori 1 adalah linier selama rentang konsentrasi radioligand digunakan,
maka jenis pengikatan untuk semua kategori hanya bergabung membentuk satu,
komponen non spesifik. Pengikatan non spesifik biasanya diperkirakan dengan
mengukur pengikatan radioligand di hadapan agen yang diyakini mengikat selektif
pada reseptor, pada konsentrasi yang ditentukan untuk mencegah semua pengikatan
spesifik tanpa modifikasi yang cukup oleh pengikatan non spesifik mengikat (rincian
lebih lanjut dijelaskan pada Bagian 5.3.5).
5.2 MODEL PENGIKATAN RADIOLIGAND
Empat jenis studi ikatan-ligand akan dibahas: (1) saturasi, (2) kinetik, (3)
kompetisi,
dan (4) retardasi
5. 2. 1 SATURASI
Percobaan ini memeriksa pengikatan radioligand pada kesetimbangan langsung
dan dapat memperkirakan KL dan Bmax. Awalnya, kami menganggap reaksi
sederhana:
Ini merupakan pengikatan terisolasi dan akan berlaku untuk pengikatan
kompetitif antagonis (atau penghambat saluran) yang menghasilkan perubahan
struktural signifikan pada reseptor. (kasus ini untuk agonis harus menghasilkan
perubahan seperti ini, sering kali merupaka isomerisasi, untuk mengaktivkan). Ikatan
pada kesetimbangan diberikan oleh persamaan berikut (setara dengan Pers. (1.2)):
Atau,
Satuan B adalah pmol.mg protein-1, pmol.mg dry tissue-1, dll. Sebuah kurva B
dan [L] membentuk hiperbola persegi panjang, persis sama dengan kurva
menggambarkan reseptor hunian disajikan dalam Bab 1, Gambar 1.1. Mudah pada
poin ini untuk mempertimbangkan pengikatan non spesifik. Idealnya, pengikatan non
spesifik harus sepenuhnya independen dengan pengikatan spesifik, sehingga total
penyerapan radioligand oleh jaringan harus merupakan jumlah sederhana dari dua.
Jika kita bisa berasumsi bahwa pengikatan nonspesifik adalah fungsi linier dari
konsentrasi ligan, maka pengikatan yang diamati dapat diberikan oleh:
Dimana c adalah konstan. Hubungan antara total spesifik, dan pengikatan non
spesifik diindikasikan pada Gambar 5.1.
Dalam prakteknya, total dan pengikatan non spesifik diukur rentang konsentrasi L
yang
akan memungkinkan pengikatan spesifik dengan pendekatan kejenuhan. Analisis
percobaan saturasi untuk mendapatkan perkiraan KL dan Bmax dijelaskan kemudian.
GAMBAR 5.1 Pengikatan radioligand pada persiapan reseptor biasanya
melibatkan komponen non spesifik di samping komponen spesifik, pengikatan
reseptor. Pada prinsipnya, setidaknya, pengikatan spesifik dapat diperkirakan dari
total pengikatan (T) dengan mengurangkannya dengan pengikatan non spesifik (NS).
(Kurva adalah teoritis, dengan Bmax = 5,6 fmol.mg protein-1
,KL= 45 nM, dan c = 0,0083 fmol.nM-1
.)
Sekarang ini berguna untuk mengingat koefisien Hill, yang telah dibahas secara
rinci dalam Bab 1. Dalam studi pengikatan, koefisien Hill,nH umumnya merupakan
cara mudah untuk menggambarkan langkah-langkah plot pengikatan spesifik
terhadap log dari konsentrasi ligan, umumnya tanpa ada upaya untuk menentukan
mekanisme yang mendasari. Dalam kasus yang paling sederhana, sebuah plot
pengikatan spesifik terhadap [L] dianalisa yang cocok dari persamaan berikut (setara
dengan Persamaan (1.6).):
Untuk reaksi biomolekuler sederhana mengikuti hukum aksi massa, nH, akan
menjadi kesatuan. Jika nH lebih besar dari 1, plot pengikatan spesifik terhadap log [L]
akan menjadi curam, jika kurang dari 1, maka akan dangkal. Dalam keadaan ini, plot
Hill (lihat Bab 1) akan memiliki slop yang lebih baik dari satu.
5. 2. 1. 1 Beberapa Situs Pengikatan
Hal ini, tentu saja, sangat mungkin bahwa ada lebih dari satu jenis situs
pengikatan spesifik untuk radioligand. Sebagai contoh, subtipe reseptor mungkin ada
(subtipe reseptor 5HT, adrenoreseptor, dll) atau fungsi situs pengikatan sangat
berbeda. Beberapa reseptor ligan mungkin juga saluran bloker (misalnya,
tubokurarine) atau inhibitor serapan pemancar (misalnya, phenoxybenzamine).
Pertanyaan yang kemudian muncul, apakah situs berinteraksi atau tidak. Dalam kasus
ini hanya dua situs yang tidak berinteraksi, istilah tambahan hanya dapat ditambahkan
ke persamaan mengikat. Untuk jumlah pengikatan,
dimana subskrip 1 dan 2 menentukan dua situs (istilah lebih lanjut dapat ditambahkan
untuk komponen tambahan).
GAMBAR 5.2 Kurva teoritis untuk pengikatan spesifik persiapan radioligand
mengandung dua kelas situs pengikatan. Sebuah komponen berafinitas tinggi yaitu
Bmax dengan 25 fmol.mg-1
memiliki KL 20 nM. Komponen kedua, dengan Bmaks 45
fmol.mg-1
diberikan nilai KL bervariasi antara 20 dan 10.000 nM, seperti yang
ditunjukkan. Nilai KL untuk ke dua situs harus berbeda jauh sebelum dua komponen
menjadi jelas. (Data ditampilkan menggunakan skala konsentrasi baik linier dan
logaritmik.) Kurva tersebut untuk pengikatan spesifik tidak akan memanjang
menjadi hiperbola persegi panjang sederhana, meskipun dengan komponen yang
berbeda dapat dibedakan oleh mata akan tergantung pada perbedaan nilai KL dan
jumlah observasi serta keakuratannya. Teori kurva ditunjukkan pada Gambar 5.2.
untuk perbedaan yang relatif kecil pada nilai-nilai KL dari dua lokasi, kurva
tampaknya memiliki satu komponen, tetapi analisis akan menunjukkan koefisien Hill
rendah. Komponen terpisah yang terungkap lebih jelas ketika skala logaritmik
digunakan untuk konsentrasi radioligand. Dengan demikian, dua komponen yang
sangat jelas di panel sebelah kanan dari Gambar 5.2.
5. 2. 1. 2 INTERAKSI SITUS
Dalam beberapa kasus (misalnya, reseptor asetilkolin nikotin), situs pengikatan
diduplikasi pada subunit identik dimasukkan ke dalam protein multimerik, yang
memungkinkan untuk mengikat satu situs yang dapat mempengaruhi untuk mengikat
lainnya. Pada prinsipnya kedua tempat tersebut dapat berperilaku cara yang identik,
tetapi lebih mungkin penggabungan subunit ke multimer assimetrikal (sebuah
heteropentamer untuk reseptor nikotinik) memperkenalkan kendala yang
menyebabkan perbedaan afinitas untuk ligan. Yang paling penting adalah
kemungkinan bahwa kedudukan suatu situs oleh ligan akan meningkatkan atau
menurunkan afinitas untuk pengikatan lainnya (yaitu, menunjukkan kooperasi positif
atau negatif). Berikut ini memberikan representasi paling sederhana dari model dua-
pengikatan-situs:
Skema ini juga dibahas dalam Bab 1 (pada Lampiran 1.2C) dan dalam Bab 6.
Pada skema ini, dua binding site dianggap identik. adalah keadaan aktif
diproduksi ketika L adalah agonis. Bentuk kurva binding tergantung pada ukuran
relatif K1 dan K2. Ketika K1 > K2, kooperatifitas positif akan terjadi (yaitu,
pengikatan ke situs pertama akan meningkatkan kedua); ketika K1 < K2 ,
Kooperatititas negatif akan terjadi. Gambar 5.3 menggambarkan bentuk kurva
pengikatan diprediksi oleh Persamaan. (1.14) untuk berbagai rasio dari K1 ke K2.
Dalam percobaan, adalah mungkin bahwa pengikatan radioligand yang dihambat
tidak terjadi persaingan di lokasi umum, tetapi dengan inhibitor mempengaruhi
pengikatan jarak jauh melalui interaksi dengan bagian yang berbeda dari molekul
reseptor .
GAMBAR 5.3 Pengikatan radioligand untuk reseptor mengandung dua situs pengikat
identik (skema yang ditunjukkan pada Persamaan. (5.7) tetapi mengabaikan
isomerisasi). Pengikatan molekul ligan pertama diberi K1 dengan 20 nM. Nilai K2
untuk mengikat molekul ligan kedua diberikan rentang nilai untuk mewakili berbagai
tingkat kooperatititas, dari sangat positif (0,05 nM) ke sangat negatif (2000 nM).
Seperti digambarkan dalam A, untuk skala logaritmik konsentrasi, kooperatititas
positif mencuramkan kurva, sedangkan kooperatititas negatif membuatnya dangkal.
Dua komponen menjadi sangat jelas untuk nilai yang lebih besar dari K2. Dalam
panel B, skala konsetrasi linear telah diperluas untuk menunjukkan kaki S-berbentuk
kurva pengikatan, indikasi positif kooperatititas. Plot Hill C menunjukkan bahwa
dengan perbandingan besar positif kooperatititas nH mendekati 2 untuk
konsentrasi menengah radioligand, menjadi kesatuan pada kedua konsentrasi yang
sangat tinggi atau sangat rendah (lihat Persamaan. (1.15)).
5. 2. 1. 3 Agonis
Pembahasan sebelumnya dari percobaan saturasi dianggap sebagai langkah
pengikatan dalam isolasi, namun, untuk agonis agar menghasilkan respon jaringan,
harus ada perubahan dalam reseptor (isomerisasi) - Misalnya, perubahan konformasi
untuk membuka saluran ion integral atau untuk mempromosikan hubungan dengan
G-protein. Komplikasi yang timbul dengan agonis akan dibahas saat ini
5. 2. 1. 3. 1 Aktivasi Reseptor Model del Castillo-Katz
Model ini di bawah ini telah dibahas dalam Bab 1, Bagian 1.4.4 ke 1.4.5.
Dalam sebuah studi pengikatan ligan, pengikatan meliputi AR * serta AR. Persamaan
yang relevan kemudian adalah:
Dalam persamaan ini, A telah digunakan dalam preferensi untuk L untuk
menekankan bahwa agonis sedang dipertimbangkan. Persamaan mempertahankan
bentuk hiperbola persegi panjang, 50% hunian terjadi ketika [A] = KA / (1 + E). KA /
(1 + E) dengan demikian keseimbangan yang efektif konstan dan sesuai disebut
sebagai Keff. Hal yang penting untuk dicatat adalah bahwa pengukuran pengikatan
tidak memberikan perkiraan KA sendiri. Keff lebih kecil dari KA, sehingga langkah
isomerisasi meningkatkan afinitas (berlaku menempatkan reseptor pada tempat
utama).
Komplikasi lain adalah desensitisasi reseptor. Desensitisasi dari reseptor
asetilkolin nikotin dikaitkan dengan reseptor, terutama dalam bentuk aktif nya,
berubah secara spontan bentuk tidak aktif. Berikut ini adalah skema menggabungkan
kemungkinan kepekaan daerah reseptor
(Skema ini didasarkan model siklik desensitisasi Katz-Thesleff , dimodifikasi untuk
menggabungkan pengikatan dua molekul asetilkolin dan termasuk langkah
isomerisasi.) Jelaslah dari skema ini bahwa kompleks agonis reseptor terdiri dari
berbagai bentuk dan persamaan menggambarkan bahwa pengikatan yang sejalan
kompleks. Untuk reseptor asetilkolin nikotinik ditemukan bahwa pengikatan agonis
dengan reseptor peka (RD) dengan afinitas tinggi)
5. 2. 1. 3. 2 RESEPTOR AKTIVASI MODEL TERNARY KOMPLEKS
Model berikut telah diperkenalkan pada Bab 1 (Bagian 1.4.6):
ARX, tiga spesies bereaksi, adalah kompleks ternery. Skema ini sering
digunakan untuk menggambarkan tanggapan G protein mediasi, ketika X digantikan
oleh G, tetapi jelas merupakan penyederhanaan yang berlebihan. Untuk misalnya,
tidak termasuk lokasi tambahan diperkenalkan oleh pengikatan GTP atau guanosin
difosfat (GDP). Dari sudut pandang penelitian pengikatan ligan, kita perlu mencatat
bahwa pengukuran pengikatan akan mencakup baik AR dan ARX. Persamaan yang
memberikan konsentrasi terikat (AR + ARX) pada kesetimbangan kompleks (dan
dalam kasus respon pasangan G-protein juga harus memperhitungkan konsentrasi
reseptor dan G-protein, seperti dibahas dalam Bab 1, dan GTP dan PDB). Sebuah
fitur khusus dari pengikatan agonis pada reseptor yang bergabung dengan G proteins
adalah bahwa konsentrasi GTP akan mempengaruhi kurva pengikatan. Pengikatan
agonis sering menunjukkan komponen dengan afinitas tinggi dan afinitas rendah, dan
GTP ditemukan untuk meningkatkan proporsi pada daerah afinitas rendah. Ini akan
dipertimbangkan lebih lanjut ketika membahas percobaan kompetisi.
5. 2. 2 STUDI KINETIK
Kedua onset pengikatan, ketika radioligand ini pertama kali diterapkan, dan
offset ketika disosiasi dipromosikan, dapat dipelajari secara langsung. Persamaan
kinetik yang relevan berkaitan dengan Bimolekular sederhana interaksi ligan dengan
reseptor disajikan dalam Bab 1, Bagian 1.3.
5. 2. 2. 1 Pengukuran Konstanta Disosiasi, k-1
Untuk mengukur konstanta tingkat disosiasi, semua yang diperlukan, pada
prinsipnya, adalah pertama untuk mengamankan hunian dari reseptor oleh radioligand
dan kemudian untuk mencegah hubungan lebih lanjut, baik dengan menambahkan
agen bersaing dalam konsentrasi yang cukup atau dengan menurunkan [L] substansial
oleh dilusi. Jumlah obat yang terikat pada reseptor diukur pada waktu tertentu setelah
memulai disosiasi bersih dan, untuk model sederhana dibahas dalam Bagian 1.2 dan
1.3 dari Bab 1 yang akan menunjukkan penurunan eksponensial.
B0 dan Bt adalah jumlah terikat awalnya (pada t = 0) dan pada waktu tertentu (t)
setelah memulai disosiasi. Sebuah plot logeBt terhadap t adalah linier dengan
kemiringan -k-1 ; k-1 dengan demikian dapat diperkirakan langsung dari kemiringan
plot ini atau dapat diperoleh dengan nonlinier kuadrat-kurva pada Persamaan. (5.12).
Itu selalu diinginkan untuk kemiringan logeBt terhadap t untuk mendeteksi non-linear
yang mungkin mencerminkan beberapa situs pengikatan atau adanya lebih dari satu
tempat yang diduduki reseptor.
5. 2. 2. 2 Pengukuran Konstanta Disosiasi, k+2
Untuk reaksi biomolekuler sederhana yang melibatkan kelas tunggal situs
pengikatan, onset pengikatan juga harus mengandung istilah eksponensial. Demikian
di mana Bt adalah pengikatan pada waktu t, B ∞ adalah pengikatan pada saat
kesetimbangan, dan kon adalah onset laju konstanta. Namun, seperti yang ditunjukkan
dalam Bab 1, kon bukan merupakan ukuran sederhana k +1, melainkan:
Persamaan (5.15) dapat diubah menjadi bentuk linear:
dan kon dapat diperoleh dari kemiringan plot sisi kiri dari persamaan terhadap t.
Setelah kon diketahui, k+1 dapat diperkirakan setidaknya melalui tiga cara yang
berbeda. Pertama, perkiraan independen k-1 dapat diperoleh dari studi pemisahan
seperti dijelaskan di atas, di mana, dari Persamaan. (5.15), k +1 = (kon - k-1) / [L].
Kedua, kon dapat diukur pada beberapa konsentrasi L yang berbeda dan sebidang kon
terhadap [L] didasarkam pada Pers. (5.15), k +1 diberikan langsung oleh kemiringan.
Plot ini juga akan memberikan perkiraan k-1. Ketiga, adalah kemungkinan untuk
melakukan simultan nonlinier kuadrat-fit dari keluarga kurva onset (diperoleh dengan
menggunakan konsentrasi berbeda dari L), memberikan perkiraan k +1, k-1, dan Bmax
(Soal 5.2 memberikan kesempatan untuk menghitung konstanta laju peningkatan).
Dalam beberapa kasus pengikatan situs atau jika isomerisasi kompleks ligan-
reseptor , onset dan kurva akan mengimbangi multiexponential. Secara umum
diasumsikan bahwa pengikatan spesifik akan terjadi dengan cepat, dan ini tentu harus
jadi untuk penarapan sederhana dalam membran sel atau pelet. Namun, jika
pengikatan spesifik sangat cepat atau pengikatan nonspesifik sangat lambat (mungkin
mencerminkan penyerapan ligan oleh sel), maka waktu pengikatan spesifik juga harus
memperlihatkan kemungkinan penilaian yang akurat tentang terjadinya pengikatan
spesifik. Perhatikan juga, bahwa onset pengikatan ligan akan diperlambat dengan
adanya inhibitor, sebuah fenomena yang didapatkan pada percobaan retardasi
(dibahas dalam Bagian 5.2.4).
GAMBAR 5.4 Dalam ilustrasi ini dari sebuah percobaan kompetisi, konsentrasi
tetap radioligand, dengan tidak adanya inhibitor, menghasilkan pengikatan spesifik
B0. Pengikatan spesifik pada kompetitif inhibitor dilambangkan oleh BI. Jumlah
konstan pengikatan non spesifik diasumsikan ada. Konsentrasi inhibitor yang
mengurangi pengikatan spesifik sebesar 50% disebut sebagai IC50
5. 2. 3 PERCOBAAN KOMPETISI
Tentu saja, percobaan saturasi hanya mungkin bila bentuk radiolebel dari ligan
tersedia. Percobaan Kompetisi, di sisi lain, sangat berguna dalam memungkinkan
penentuan konstanta disosiasi untuk obat yang tidak berlebel yang bersaing untuk
situs pengikatan dengan ligan yang tersedia dalam bentuk label. Pendekatan ini telah
banyak diadopsi oleh industri farmasi sebagai sarana cepat menentukan afinitas
senyawa baru untuk reseptor khusus untuk itu suatu radioligand yang ditandai
tersedia.
Pada percobaan kompetisi, jumlah tetap radioligand, umumnya pada konsentrasi di
bawah KL, adalah diseimbangkan dengan persiapan reseptor pada berbagai
konsentrasi inhibitor yang tidak ditandai I. Dalam studi ini, jumlah radioligand terikat
biasanya diplot terhadap log [I]. Gambar 5.4 memberikan contoh untuk kasus
sederhana dimana radioligand dan inhibitor bersaing secara reversibel untuk situs
kelas tunggal. Dalam ilustrasi ini, tingkat konstan pengikatan nonspesifik belum
dikurangi, sedangkan di sebagian besar studi yang dipublikasikan itu akan. Jumlah
pengikatan non spesifik tentu saja bisa didefinisikan dengan menerapkan konsentrasi
tinggi inhibitornya, tetapi jika agen bersaing untuk pasokan pendek, mungkin untuk
menggunakan inhibitor karakteristik lain untuk tujuan yang sama. Dua fitur utama
kurva ini adalah posisi sepanjang sumbu konsentrasi dan kemiringannya. Posisi
sepanjang sumbu konsentrasi konvensional ditunjukkan oleh IC50, konsentrasi
inhibitor yang mengurangi pengikatan spesifik sebesar 50%. Diprediksi hubungan
(lihat juga pers. (1.48)) antara jumlah pengikatan spesifik pada I (BI) dan [I]
diberikan oleh:
Asalkan nilai untuk KL tersedia, adalah mungkin untuk menggunakan persamaan ini
untuk mendapatkan nilai untuk KI, kesetimbangan disosiasi konstan untuk inhibitor,
dengan nonlinier analisis kuadrat- dari kurva perpindahan. Atau, KI dapat dihitung
dari IC50, yang dapat diperoleh dengan interpolasi sederhana dengan mata dari plot
Hill atau dengan fitting kurva untuk persamaan dari jenis:
di mana B0 adalah pengikatan spesifik yang diamati tanpa adanya persaingan ligand
6. 2. 3. 1 Hubungan antara K1 dan IC50
B0 diberikan oleh persamaan (5.3):
dan, menurut definisi, ketika [I] = IC50, BI = 0.5B0, sehingga dari Persamaan. (5.17):
dengan pembatalan dan penataan ulang:
Istilah 1 + ([L] / KL) sering disebut sebagai koreksi Cheng-Prusoff. Hal ini jelas dari
analisis ini bahwa IC50 tidak memberikan perkiraan langsung KI kecuali [L]
sangat rendah, ketika IC50 cenderung ke KI. Sama seperti dengan percobaan saturasi,
situasi akan menjadi lebih rumit oleh kehadiran kelas yang berbeda dari situs
pengikatan (misalnya, subtipe reseptor) dan dengan keterlibatan G-protein dalam
pengikatan agonis.
5. 2. 3. 2 Beberapa Situs Binding
Pengaruh beberapa situs pengikatan pada kurva perpindahan akan ditentukan
oleh afinitas relatif dari radioligand dan penggantian agen untuk berbagai situs.
Mengingat situasi sederhana dimana radioligand untuk afinitas yang sama pada
masing-masing situs (misalnya, propranolol untuk adrenoreseptor-β), perpindahan
kurva untuk inhibitor akan menampilkan dua komponen hanya jika nilai KI untuk
pengikatan inhibitor untuk dua situs yang cukup berbeda dan jika pengukuran
perpindahan akurat dan membuat lebih dari satu rentang konsentrasi I (lihat Gambar
5.2 dan Bagian 5.4.4).
GAMBAR 5.5 Pengaruh GTP pada kurva pengikatan kompetisi isoprenalin dan
propranolol. Membran disiapkan dari L6 mioblas yang diinkubasi dengan 125I-
iodopindolol (50 pM) pada isoprenalin atau propanolol dengan atau tanpa 100 µM
GTP selama 90 menit pada suhu 25 °C. GTP tidak berpengaruh pada pengikatan
antagonis tapi menggeser kurva untuk perpindahan oleh agonis ke kanan (dengan
menghapuskan komponen pengikatan afinitas tinggi). (Digambar ulang menggunakan
data Wolfe, BB dan Molinoff, PB, dalam Buku Pegangan Farmakologi
Eksperimental, Trendelenburg, U. dan Weiner, N., Eds., Springer-Verlag, Berlin,
1988, bab 7.)
5. 2. 3. 3 Link Reseptor G-Protein
Seperti telah disebutkan, GTP mempengaruhi pengikatan agonis pada reseptor
pasangan G-protein, yang telah banyak diteliti karena cahaya itu bisa melempar pada
mekanisme kerja reseptor tersebut. Reseptor ini sering menunjukkan dua daerah yang
mengikat agonis dengan afinitas yang berbeda. Interaksi G-protein dengan reseptor
dibahas dalam Bab 7, dan di sini hanya perlu dicatat bahwa bentuk afinitas tinggi
reseptor bergabung dengan G-protein. Dalam model yang paling sederhana, ketika
GTP menggantikan GDP pada subunit α, G-protein pecah melepaskan α-GTP dan βγ
subunit, yang memediasi efek seluler agonis. Reseptor kemudian berdisosiasi,
kembali kepada daerah afinitas rendah. Oleh karena itu, dengan tidak adanya GTP,
proporsi yang signifikan dari reseptor akan berada pada daerah afinitas tinggi, tetapi
kehadirannya akan mengadopsi daerah-afinitas rendah. Hasil "pergeseran GTP"
diilustrasikan pada Gambar 5.5. Perhatikan bahwa ini hanya berlaku untuk
pengikatan agonis, seperti antagonis tidak mempromosikan sambungan pada reseptor
G-protein. Jika ada konsentrasi yang relatif rendah dari G-protein sehingga habis oleh
asosiasi dengan reseptor, maka kurva persaingan untuk agonis tanpa GTP mungkin
menunjukkan dua komponen, seperti pada gambar.
5. 2. 4 PERCOBAAN RETARDASI
Hal ini berguna untuk mempertimbangkan varian tertentu dari percobaan
pengikatan kompetitif yang telah digunakan terutama untuk menyelidiki reseptor
asetilkolin nikotin. Pada intinya, adalah mungkin untuk menentukan konstanta
kesetimbangan disosiasi inhibitor kompetitif irreversibel dengan pengurangan
produksi dalam tingkat pengikatan suatu radioligand ireversibel (misalnya α-
bungarotoxin). Dalam prakteknya, waktu pengikatan ligan ireversibel dipelajari
dengan ada atau tidaknya inhibitor. Hasil yang diharapkan ditunjukkan pada Gambar
5.6.
GAMBAR 5.6 percobaan Retardasi. Sebuah inhibitor reversibel akan memperlambat
laju asosiasi ligan ireversibel dengan reseptor. Kurva ini telah dibangun sesuai
dengan Persamaan. (5.26) dengan menggunakan nilai numerik yang ditunjukkan
dalam gambar. Ini telah dipilih untuk menggambarkan efek antagonis, seperti
tubokurarine, pada pengikatan α-bungarotoxin pada reseptor nikotin otot rangka.
Ketika ligan ireversibel diterapkan dengan sendirinya, perubahan proporsi situs
diduduki, PLR, dengan waktu akan diberikan oleh:
di mana 1 - PLR (t) adalah proporsi reseptor yang tersisa bebas dan tersedia untuk
mengikat dengan L. Jika PLR = 0 pada t = 0, solusinya adalah:
Persamaan ini adalah aplikasi dari Pers. (1.22) ke ligan ireversibel (yaitu, k-1 = 0), dan
dalam jangka panjang menjalankan semua reseptor akan ditempati sehingga PLR (∞)
adalah kesatuan. Konstanta untuk tingkat equilibrium demikian diberikan oleh k+1
[L]. Untuk kasus di mana pengikatan dipelajari dengan adanya inhibitor, Persamaan.
(5.21) menjadi:
Disubstitusi ke dalam persamaan (5.23):
Solusi untuk PLR = 0 pada t = 0 adalah:
Onset laju konstanta (. Lihat Persamaan (5.22)) dikurangi dengan faktor 1 - [I] / (KI +
[I]). Jika tingkat konstanta untuk pengikatan ligan ireversibel ditentukan dengan
ketiadaan dan adanya inhibitor dan dilambangkan masing-masing k0 dan kI maka:
Dengan demikian, perkiraan konstanta kesetimbangan dapat ditentukan dengan
memberikan konsentrasi tertentu I
5. 3 ASPEK PRAKTIS STUDI PENGIKATAN LIGAND
Mayoritas studi pengikatan memperkirakan jumlah pengikatan oleh pemisahan
terikat dari ligan bebas, baik menggunakan sentrifugasi maupun penyaringan, diikuti
dengan pengukuran kuantitas terikat. Tahap pemisahan, bagaimanapun, dapat
dihindari dalam tes kedekatan kilau (SPA). Tes berlaku untuk ligan yang
mengandung radioisotop (misalnya tritium) yang menghasilkan energi rendah partikel
β yang berjalan pada jarak yang sangat pendek (kurang dari 10 m) dalam cairan.
Dalam satu bentuk SPA, persiapan reseptor amobil pada mikrobeads mengandung
molekul skintillant. Molekul-molekul skintillant mampu mendeteksi radiasi β yang
berasal dari radioligand terikat pada reseptor yang terletak pada permukaan manik-
manik tetapi tidak akan menanggapi radiasi dari molekul bebas radioligand relatif
lebih jauh dalam larutan. Untuk teknik ini agar dapat bekerja, itu harus mungkin
untuk beberapa persiapan reseptor untuk manik-manik dengan cara yang tidak
mengganggu pengikatan ligan. Asalkan hal ini dapat dilakukan, penghitungan
kedekatan kilau menyediakan metode sederhana untuk mendeteksi pengikatan,
selanjutnya akan digunakan untuk mengikuti waktu pengikatan sedangkan campuran
reaksi tetap dalam pencacah sintilasi. Teknik menggunakan fluoresense berlabel ligan
(misalnya, polarisasi fluoresensi dan teknik resonansi fluoresen transfer energi)
sedang dikembangkan dan juga tidak perlu memisahkan ikatan dari ligan bebas.
Teknik ini memiliki keuntungan tambahan untuk menghindari bahaya yang
berhubungan dengan penggunaan dan pembuangan radioisotop.
5. 3. 1 PERSIAPAN RESEPTOR
Kebanyakan reseptor (pengecualian PADA reseptor steroid yang
mempengaruhi transkripsi DNA) terletak pada permukaan sel, dan dimurnikan
membran sel dengan demikian pilihan persiapan. Ketika sebuah jaringan
dihomogenisasi, bagaimanapun, setiap fraksi membran baik terisolasi mungkin berisi
membran dari organel intraseluler selain membran sel dari semua jenis sel dalam
jaringan. Dengan demikian, membran otak akan berisi membran tidak hanya dari
neuron tetapi juga dari glia, serta otot polos dan sel endotel pembuluh darah. Ini
mungkin, bagaimanapun, mungkin untuk mempersiapkan membran dari persiapan sel
murni (misalnya, baris sel atau sel diperoleh bukan dari agregasi jaringan dengan
enzim dan kemudian mengalami pemurnian dengan sentrifugasi diferensial). Semakin
banyak penelitian tentang pengikatan situs dilakukan pada membran dari baris sel
transfer dengan kloning gen reseptor manusia, dan berbagai reseptor kloning tersebut
sekarang tersedia untuk skrining obat secara rutin.
Sebuah fitur pada gangguan sel adalah bahwa hal itu dapat mengekspos
reseptor yang tidak original pada permukaan sel. Beberapa reseptor akan telah
melewati proses penyisipan sementara yang lain mungkin telah terendositosis. Hal ini
akan mengarah pada kepadatan reseptor permukaan sel. Sebaliknya, membran sel
dapat membentuk vesikel yang dapat memiliki baik di luar atau di dalam-orientasi.
Reseptor permukaan sel di dalam vesikel tidak akan mengikat ligan kecuali dapat
menembus vesikel tersebut. Hal ini biasanya diperlukan untuk mencuci persiapan
membran beberapa kali untuk menghilangkan endogen yang mungkin mempengaruhi
pengikatan (misalnya, enzim proteolitik, ligan endogen). Salah satu keuntungan
penting dari membran sel yang sering dipersiapkan dapat disimpan dibekukan selama
berminggu-minggu tanpa perubahan apapun dalam sifat pengikatan.
Penggunaan membran sel dapat dikritik atas dasar bahwa reseptor telah berganti
dari lingkungan alami mereka dan tidak akan lagi tunduk pada mekanisme kontrol
selular, karena Misalnya, fosforilasi domain intraseluler dapat dimodifikasi. Masalah-
masalah ini dapat dihindari dengan menggunakan sel utuh untuk studi pengikatan
situs. Irisan jaringan (misalnya, otak, jantung) yang digunakan, seperti sel diisolasi
dari jaringan yang dipotong oleh kolagenase atau tripsin pencernaan. Baris sel
permanen juga dapat digunakan. Namun, kemungkinan bahwa aplikasi enzim
proteolitik untuk membantu disagregasi jaringan dapat memodifikasi reseptor adalah
beberapa kekhawatiran. Bila menggunakan sel utuh, juga mungkin bahwa beberapa
ligan akan diangkut ke dalam sel, yang mengarah ke pengikatan non spesifik. Selain
itu, beberapa sel dapat mengandung enzim yang memetabolisme radioligand tersebut.
Di sisi lain, karena sel-sel harus dijaga dalam kondisi fisiologis yang cocok, hasil
pengikatan adalah mungkin, lebih mungkin untuk situasi in vivo sesungguhnya. Studi
pemurnian , reseptor larut kurang dan perhatian ketidakpastian bahwa penghilangan
dari lingkungan lipid dari membran sel dapat mengubah pengikatan.
5. 3. 2 RADIOLIGAN
Meskipun metode kuadrat-kurva nonlinear memungkinkan kurva pengikatan
kompleks untuk dianalisis, komponen tunggal kurva akan menghasilkan perkiraan
yang lebih tepat pada parameter pengikatan. Jika, bagaimanapun, adalah tidak
mungkin untuk menghindari beberapa komponen, kurva akan lebih memuaskan jika
dianalisis pada masing-masing komponen disosiasi konstanta kesetimbangan yang
berbeda. Demikian, ada keuntungan yang jelas dalam menggunakan radioligands
selektif yang memiliki afinitas yang lebih besar untuk satu jenis situs pengikatan.
Sebuah afinitas tinggi juga diinginkan, karena memungkinkan pengikatan untuk
dipelajari pada konsentrasi rendah, yang hal lain dianggap sama, akan mengurangi
pengikatan non spesifik. Tingginya rasio spesifik dengan pengikatan non spesifik
akan mengurangi kesalahan dalam parameter estimasi. Sebuah afinitas tinggi,
Namun, juga memiliki konsekuensi bagi tingkat di mana pengikatan mencapai
keseimbangan. Asosiasi laju konstanta , k +1, memiliki batas atas, ditentukan oleh
teori tabrakan, dari sekitar 108 M-1sec-1, dari yang berikut bahwa ligan dengan
afinitas tinggi harus memiliki nilai k-1 sangat rendah. Dari Pers. (5.12) dan (5.15),
terlihat bahwa ini akan mengakibatkan kedua onset lambat (pada konsentrasi rendah
L yang digunakan) dan offset pengikatan lambat. Tingkat lambat offset
menguntungkan dalam pemisahan bagian dari ligan bebas dengan penyaringan,
dimana hal ini penting untuk memastikan bahwa langkah-langkah pencucian yang
dilakukan tidak menyebabkan disosiasi signifikan.
Radioligand juga harus memiliki aktivitas spesifik tinggi sehingga jumlah yang
terikat ligan yang sangat kecil dapat diukur secara akurat. Aktivitas spesifik, hanya
didefinisikan sebagai jumlah radioaktivitas, dinyatakan dalam becquerels (Bq) atau
curie (Ci) per mol ligan, tergantung pada paruh isotop yang digunakan dan jumlah
atom radioaktif dimasukkan ke dalam molekul ligan. Sebuah radioisotop dengan
waktu paruh pendek meluruh cepat sehingga banyak disintegrasi terjadi dalam satuan
waktu, menghasilkan aktivitas spesifik yang tinggi. Isotop yang paling sering
digunakan untuk pelabelan adalah 125I dan 3H, dengan waktu paruh 60 hari dan 12,3
tahun, masing-masing (label dengan 14C, dengan waktu paruh dari 5760 tahun, akan
menghasilkan aktivitas spesifik rendah). Ligan berlabel dengan atom tunggal baik 125I
atau 3H akan memiliki aktivitas maksimum masing-masing 2200 dan 29 Ci per
mmol,. Sebuah dasar berbeda antara label dengan 3H dengan 125I. Dengan 3H,
radioisotop dapat menggantikan atom hidrogen dalam molekul dengan hanya
perubahan signifikan dalam sifat kimia, memang, akan ada kemungkinan untuk
mengganti beberapa H oleh 3H tanpa perubahan signifikan dalam sifat kimia tapi
dengan keuntungan yang berguna dalam kegiatan tertentu. Sebaliknya, beberapa ligan
alami dan hampir semua obat tidak mengandung atom yodium yang dapat diganti
oleh 125I. Sebaliknya, perlu untuk menghasilkan derivat iodinasi yang akan memiliki
sifat kimia yang berbeda dan sangat mungkin afinitas yang berbeda untuk reseptor.
(Untuk alasan ini, biasanya untuk menggabungkan hanya satu atom 125I di masing-
masing molekul ligan.) Oleh karena itu, perlu untuk memeriksa bahwa turunan
diinginkan mempertahankan sifat dari senyawa induk. Dengan radioiodine, adalah
mungkin untuk mencapai 100% pelabelan isotop, karena mungkin untuk
mendapatkan 125I murni dan untuk memisahkan ligan berlabel dari kedua
uninkorporasi 125I-dan senyawa induk noniodin. Hal ini jelas penting untuk
memastikan bahwa label dikaitkan hanya dengan ligan dimaksud. Potensi masalah
termasuk kemungkinan yang mencemari zat mungkin juga telah diberi label dan
radioligand mungkin telah mengalami perubahan kimia selama penyimpanan. Ligan
radioaktif tinggi dapat mengalami kerusakan radiasi, dan adanya kotoran radioaktif
hampir pasti akan mengakibatkan penurunan rasio tertentu pengikatan spesifik dan
pengikatan non spesifik.
Bagi kebanyakan reseptor, baik radioligands hidrofilik dan hidrofobik yang
tersedia. Dalam beberapa kasus, ligan hidrofobik telah ditemukan untuk memberikan
perkiraan yang lebih tinggi Bmax, menunjukkan bahwa mereka memiliki akses ke
reseptor dalam sel yang menolak ligan hidrofilik. Ini dicontohkan oleh semakin besar
nilai Bmax yang diamati (dalam membran neuroblastoma) untuk reseptor muskarinik
ligan 3H-skopolamin (amina tersier) dibandingkan dengan 3H-N-methilskopolamin
(kuartener amonium). Perbedaan-perbedaan dalam akses terhadap reseptor
sebenarnya dapat dimanfaatkan untuk mempelajari internalisasi reseptor.
5. 3. 3 KONDISI INKUBASI
5. 3. 3. 1 INKUBASI MEDIUM
Pengikatan sel-sel utuh mesti dilakukan dalam larutan fisiologis, dan hasil
diperoleh maka sangat mungkin begisrkorelasi dengan studi fungsional. Ini mungkin
dapat untuk menghindari dimasukkannya protein (misalnya, albumin), karena protein
dapat juga mengikat radioligand tersebut sampai batas yang signifikan yang tidak
akan terdeteksi oleh pengukuran radioaktivitas supernatan yang diperoleh dari
sentrifugasi. Pengikatan pada membran, sebaliknya, cukup sering dilakukan dalam
larutan buffer sederhana (misalnya, 20 - atau 50-mM buffer Tris atau HEPES). Hal
ini jelas, bagaimanapun, bahwa afinitas beberapa ligan untuk reseptor meningkat
dalam larutan dengan kekuatan ionik yang rendah. Efek ini telah jelas menunjukkan
untuk reseptor kolinergik muskarinik. Pada prinsipnya, hal itu bisa dihindari dengan
memasukkan cukup NaCl untuk membuat inkubasi medium isotonik dengan kondisi
larutan fisiologis. Ion tertentu telah terbukti memiliki efek pada sistem reseptor
tertentu. Mg2 +, untuk misalnya, sering mempengaruhi pengikatan reseptor pasangan
G-protein, yang sesuai dengan yang efek yang dikenal pada aktivasi G-protein.
Ionisasi kelompok asam lemah atau basa di kedua reseptor dan ligan akan
dipengaruhi oleh pH dan kemungkinan untuk memodifikasi pengikatan. Oleh karena
itu, jika mungkin penelitian pengikatan dapat dilakukan pada pH fisiologis,
5. 3. 3. 2 SUHU
Suhu memiliki efek pada kedua tingkat reaksi dan konstanta kesetimbangan
disosiasi. kenaikan suhu akan meningkatkan tingkat kedua asosiasi dan disosiasi,
seperti yang ditunjukkan pada Tabel 5.1
untuk mengikat 3H-flunitrazepam untuk membran otak tikus. Efek pada
kesetimbangan disosiasi konstan kurang karena perubahan k +1 dan k-1 berada di
arah yang sama. Telahnditemukan untuk beberapa reseptor yang pengaruh suhu pada
afinitas lebih besar untuk agonis daripada antagonis. Tabel 5.2 menggambarkan hasil
untuk pengikatan adrenoreseptor β diperoleh Weiland et al. (1979). Disarankan
bahwa perbedaan dalam pengaruh suhu pada agonis dibandingkan dengan pengikatan
antagonis mencerminkan perubahan struktural dalam reseptor (isomerisasi) yang
terjadi dengan agonis tapi tidak antagonis. Belum diiadakan penyelidikan lebih baru
dari masalah ini, bagaimanapun, menegaskan umum adalah kesimpulannya.
Kejelasan hasil ini, mungkin tampak terbaik untuk mengukur pengikatan hanya
pada suhu fisiologis yang relevan, namun melakukan inkubasi pada suhu rendah
memiliki beberapa keuntungan. Misalnya, kerusakan proteolitik pada reseptor dan
pemecahan ligan, jika kondisi kimia tidak stabil, akan berkurang selama inkubasi
yang lama (meskipun keuntungan ini mungkin diimbangi dengan waktu inkubasi
yang lama).
5. 3. 3. 3 LAMA INKUBASI
Studi Equilibrium jelas memerlukan masa inkubasi yang cukup lama untuk
memungkinkan equilibrium yang ingin dicapai. Sebagaimana dibahas di atas, waktu
yang dibutuhkan akan lebih lama pada suhu yang lebih rendah. Sekarang sangat
tergantung pada afinitas ligan untuk reseptor. Seperti diuraikan sebelumnya, tingkat
konstan untuk awal pengikatan diberikan oleh k-1 + k +1 [L]. Jika k +1 diberi nilai 107
M-1
sec-1
, dapat diperkirakan bahwa untuk mencapai 97% dari kesetimbangan untuk
ligan dengan KL dari 100 pM, pada konsentrasi yang sesuai, akan membutuhkan
sekitar 1 jam pada suhu 37oC dan sebanyak 58 jam pada suhu 0
oC. Pengaruh
persaingan obat adalah untuk memperlambat laju equilibrium. Pertimbangan ini
menunjukkan keinginan untuk melaksanakan percontohan studi kinetik sebelum
pengukuran kesetimbangan rinci dibuat.
5. 3. 3. 4 JUMLAH JARINGAN
Tujuannya harus menggunakan materi yang cukup untuk memberikan rasio
spesifik untuk pengikatan nonspesifik tanpa menyebabkan deplesi signifikan dari
radioligand tersebut. Pengikatan non spesifik terkait dengan pengikatan pada filter
yang cenderung menjadi jumlah yang tetap pada setiap diberikan konsentrasi ligan,
sehingga meningkatkan jumlah reseptor sehingga meningkatkan rasio signal.
Konsentrasi tinggi reseptor mungkin, bagaimanapun, mengikat sebagian besar
radioligand yang ada dan mengurangi konsentrasi bebas. Deplesi tersebut merupakan
pertimbangan penting. Jika konsentrasi ligan bebas dapat akan diukur secara
langsung, ini harus dilakukan, dan konsentrasi yang diperoleh berlaku untuk
persamaan yang disajikan dalam bab ini. Sebuah alternatif, jika [L] tidak dapat
diukur, adalah untuk memperoleh persamaan yang memungkinkan untuk deplesi
yang timbul dari kedua pengikatan spesifik dan nonspesifik. Persamaan tersebut telah
disajikan oleh Hulme dan Birdsall (1992), tetapi beberapa asumsi yang dibuat selalu
mengalami penyederhanaan. Adalah lebih baik untuk mencoba merancang penelitian
sehingga deplesi yang tidak signifikan (katakanlah, <5%) sehingga dapat diabaikan.
5. 3. 4 METODE PEMISAHAN BAGIAN TERIKAT DARI LIGAN BEBAS
Untuk persiapan partikulat reseptor (sel utuh atau membran), biasanya untuk
memisahkan bagian terikat dari ligan bebas oleh salah satu sentrifugasi atau
penyaringan. (Untuk persiapan larutan reseptor, kesetimbangan dialisis,
menggunakan membran semipermeabel, atau filtrasi gel dapat digunakan.)
5. 3. 4. 1 PENYARINGAN
Pada waktu yang tepat, campuran reaksi baik tip atau ditarik oleh penghisap ke
filter dan supernatan segera disaring di bawah vakum. Filter, sering dibuat dari fiber
glass, harus mempertahankan semua reseptor persiapan, sementara pada saat yang
sama memungkinkan pemisahan yang cepat. Hal ini juga diperlukan untuk
memeriksa pengikatan ligan ke filter. Beberapa contoh "spesifik," pengikatan
saturable dari radioligand untuk filter dapat ditemukan dalam literatur. Persiapan
reseptor ditahan oleh filter biasanya dicuci dua sampai tiga kali dengan inkubasi
buffer volume kecil yang tidak mengandung radioligand untuk menghilangkan
radiolabel dangkal. Hal ini penting untuk meminimalkan disosiasi ligan terikat
selama pencucian ini. Hal ini dapat dicapai dengan menggunakan hanya beberapa,
mencuci cepat dan mencucinya dengan penyangga pada suhu rendah. Sistem filtrasi
komersial yang tersedia saat ini memungkinkan banyak sampel yang harus ditangani
secara bersamaan. Umumnya tidak digunakan peralatan filtrasi, bagaimanapun,
memungkinkan supernatan dikumpulkan untuk penentuan konsentrasi ligan bebas.
5. 3. 4. 2 SENTRIFUGASI
Inkubasi sering dilakukan dalam tabung plastik kecil, yang dapat disentrifugasi
langsung ke bentuk sel atau membran pelet dalam hitungan detik. Supernatan
kemudian dapat baik tipped off atau dihapus dengan pengisapan. Radioaktivitas
supernatan dapat diukur untuk menentukan konsentrasi ligan bebas. Setiap
supernatan yang tersisa pada permukaan pelet atau tabung dapat dikurangi dengan
mencucinya sekali lagi menggunakan penyangga dingin. Kebanyakan reseptor akan
berada dalam pelet dan tidak akan terkena larutan pencuci, sehingga disosiasi harus
dibatasi. Hal ini jelas penting bahwa pencucian tidak mengganggu pelet,
menyebabkan hilangnya reseptor. Dalam beberapa eksperimen yang menggunakan
sel utuh, pemisahan telah dicapai dengan melakukan inkubasi selama lapisan minyak
dengan kepadatan yang tepat. Pada waktu yang diinginkan, sel-sel sentrifugasi
melalui lapisan minyak, dengan hampir semua supernatan yang tersisa berada di
lapisan atas. Supernatan dan minyak kemudian dihilangkan oleh penghisap dan tidak
diperlukan langkah pencucian. Jika tabung plastik digunakan, ujung tabung berisi
pelet dapat dipotong, sehingga mengurangi perhitungan lebih lanjut karena
radioligand melekat pada dinding tabung. Akhirnya, radioligand terikat (pada filter
atau pelet) yang dihitung dengan menggunakan metode standar untuk pengukuran
radioaktivitas (biasanya perhitungan skintilasi).
5. 3. 5 PENENTUAN PENGIKATAN NONSPESIFIK
Pengikat non spesifik diperkirakan dengan mengatur campuran inkubasi
tambahan yang, di samping untuk radioligand tersebut, juga mencakup penggantian
agen untuk hampir menghilangkan reseptor pengikatan nonspesifik. Karena sebagian
besar penggantian agen yang digunakan untuk mendefinisikan pengikatan nonspesifik
bertindak kompetitif, perlu untuk menggunakan konsentrasi 100 sampai 1000 kali
lebih besar dari Kd nyauntuk memastikan bahwa konsentrasi yang lebih tinggi
radioligand yang tidak mengatasi hambatan tersebut. Hal ini juga penting untuk
memeriksa bahwa penggantian agen tidak mengurangi pengikat nonspesifik. Hal ini
mungkin lebih dari masalah jika bentuk yang tidak terlabeli dari radioligand sendiri
digunakan, karena itu, preferensi harus diberikan kepada penggantian agen kimia
yang berbeda. Ekstra kepastian bisa diperoleh jika nilai yang sama untuk pengikatan
non spesifik diperkirakan menggunakan lebih dari satu agen pengganti. Ini sering
terjadi dalam percobaan kompetisi dimana beberapa obat bersaing menghasilkan
penghambatan pengikatan maksimal identik, sehingga memberikan perkiraan yang
dapat diandalkan dari residu pengikat nonspesifik.
5. 4 ANALISIS DATA PENGIKATAN
Analisis percobaan pengikatan pada dasarnya memiliki dua langkah:
1. Pemeriksaan awal dan analisis data dengan mencoba untuk menetapkan model
yang cukup menggambarkan pengikatan. Misalnya, beberapa komponen atau
kooperatititas dapat diidentifikasi.
2. Estimasi model parameter (misalnya, Bmax, KL) dengan beberapa indikasi
kesalahan terkait dengan perkiraan.
Itu selalu diinginkan untuk plot data dalam jumlah radioligand terikat sebagai
fungsi salah satu dari konsentrasi radioligand (percobaan saturasi) atau konsentrasi
inhibitor (percobaan kompetisi). Sebuah skala konsentrasi logaritmik biasanya
memberikan gambaran yang lebih jelas dari hubungan, dengan penyimpangan dari
kurva monoton sederhana menjadi lebih jelas. Hal serupa juga terjadi untuk
menggunakan transformasi linear dari kurva pengikatan, baik untuk mengungkapkan
kompleksitas pengikatan dan untuk memberikan perkiraan awal parameter
pengikatan. Berbagai transformasi linear telah digunakan untuk menganalisis
percobaan saturasi, seperti sekarang akan diuraikan.
5. 4. 1 PLOT SCATCHARD
Persamaan (5.3) dapat disusun kembali untuk memberikan:
Plot Scatchard yang terikat bebas (B / [L], sumbu y, dengan terikat (B, sumbu
x) (plot Eadie-Hofstee adalah terikat dengan terikat/bebas). Jika persamaan ini
berlaku (yaitu interaksi pengikat bimolekular sederhana) ), titik data akan jatuh pada
garis lurus, lereng -KL-1
, Dan ditandai pada sumbu x (bila B / [L] = 0) akan
memberikan Bmax. (Lihat Gambar 5.10 untuk plot Scatchard dari data diberikan pada
Soal 5.1.). Kurva plot Scatchard dapat menunjukkan kooperatititas positif atau negatif
atau adanya situs (misalnya, subtipe reseptor) dengan afinitas yang berbeda untuk
ligan. Plot Scatchard, pada awalnya, telah menjadi sarana utama untuk memperoleh
perkiraan KL dan Bmax, tetapi hanya dapat digunakan jika data sangat baik dan
diperoleh garis lurus. Perlu dicatat bahwa regresi linier sederhana tidak harus
diterapkan dengan plot Scatchard, sebagai B dengan kesalahan yang terkait terjadi di
kedua nilai x dan y. Regresi linier plot Scatchard secara sistematis untuk Kd dan Bmax.
Karena nonlinear plot Scatchard bahkan lebih sulit untuk ditangani, sering ada
godaan kuat untuk menyesuaikan garis lurus untuk plot yang jelas tidak lurus.
Metode Nonlinear least-square (lihat di bawah) jauh lebih disukai untuk estimasi
parameter dengan batas kepercayaannya.
5. 4. 2 PLOT Lineweaver-Burk
Plot ganda timbal balik didasarkan pada penataan ulang lain dari Pers. (5.3):
Sebuah plot 1 / B vs 1 / [L] akan memberikan garis lurus menyediakan bahwa
Pers. (5.3) berlaku, ketika 1 B / = 0, maka 1 / [L] = -1/KL, dan ketika 1 / [L] = 0,
maka 1 / B = 1/Bmax. Sebuah plot Lineweaver-Burk ditunjukkan pada Gambar 5.10,
di mana ia dapat dibandingkan dengan plot Scatchard dari data yang sama. Plot
ganda -timbal balik menyebar data sangat kurang dan kalah dengan plot Scatchard.
5. 4. 2 PLOT HILL
Plot ini telah dibahas secara rinci dalam Bab 1 dan sebelumnya dalam bab ini. Namun
penataan lain Pers. (5.3) memberikan:
Plot Hill adalah log (B / (Bmax - B)) vs log [L]. Seperti disebutkan
sebelumnya, kemiringan plot Hill (koefisien Hill, nH) adalah utilitas tertentu. Jika
persamaan dipegang, garis lurus dengan kemiringan = 1 harus diperoleh. Sebuah nilai
yang lebih besar dari 1 dapat menunjukkan kooperatititas positif, dan kemiringan
kurang dari 1 baik kooperatititas negatif atau yang biasa adanya situs dengan afinitas
yang berbeda. Data Soal 5.1 juga disajikan sebagai plot Hill pada Gambar 5.10
5. 4. 4 ANALISIS PERCOBAAN KOMPETISI
Persamaan (5.18), yang menggambarkan pengikatan kompetitif, juga dapat diubah
menjadi bentuk Plot Hill:
Untuk interaksi kompetitif sederhana pada situs kelas tunggal , sebidang log
(BI / (B0 - BI)) vs log [I] akan linear dengan kemiringan -1 dan mencegat pada sumbu
x log (IC50). Perkiraan IC50 dapat digunakan untuk memperoleh nilai KI seperti yang
dibahas sebelumnya. Sebuah plot yang berbeda, setara dengan plot Eadie-Hofstee
untuk percobaan saturasi, juga telah digunakan untuk mengungkapkan karakteristik
pengikatan lebih kompleks dalam percobaan kompetisi. Gambar 5.7 memberikan
contoh analisis dari studi kompetisi. di mana dua situs yang ditunjukkan.
GAMBAR 5.7 Analisis percobaan kompetisi di mana pengikatan radiolabelel
adrenoreseptor-β antagonis (125I-iodopindolol) dihambat oleh antagonis selektif -β1
β2. Keempat panel menunjukkan berbagai cara di mana data dapat dianalisis (lihat
teks). (Data untuk gambar telah diambil dari Gambar. 4, Bab 7, dari Wolfe, BB dan
Molinoff, PB, dalam Buku Pegangan, Farmakologi Eksperimental, Trendelenburg, U.
dan Weiner, N., Eds., Springer-Verlag, Berlin, 1988.)
Sebuah plot B vs log [I] (Gambar 5.7A dan B) awalnya mungkin menyarankan
dua komponen, tetapi harus hati-hati. Plot Hill (Gambar 5.7D) mengungkapkan
kemiringan (oleh regresi linier) dari -0,629 (signifikan berbeda dari -1), yang tidak
konsisten dengan sederhana 1:1 kompetisi di situs pengikatan tunggal tetapi bukan
beberapa situs pengikatan atau kooperatititas negatif. Plot Eadie-Hofstee (Gambar
5.7C) jelas nonlinear. Analisis data kuadrat Nonlinier (lihat bagian berikutnya)
ditunjukkan pada Gambar 5.7A dan B. Pada B, komponen tunggal yang dipasang
menggunakan Persamaan. (5.18), tetapi dengan syarat pangkat nH. Pemasangannya
cukup masuk akal dan menghasilkan sebuah nH dari -0,648, dekat dengan nilai dari
plot Hill. Sebuah nilai cocok lebih dekat (Gambar 5.7a) (diduga) diperoleh dengan
model dua komponen (di mana nH terkendala satu) menurut:
Konversi setiap IC50 ke KI untuk dua situs tergantung pada pengetahuan
tentang afinitas dari radioligand untuk situs. Perhatikan juga bahwa rasio B0(1) ke
B0(2) hanya akan memberikan proporsi relatif dari dua situs dalam jaringan jika situs
memiliki afinitas identik untuk radioligand tersebut.
5. 4. 5 ANALISIS DATA METODE KUADRAT NONLINEAR
Seperti telah dicatat, dengan munculnya mikrokomputer kuat dan perangkat
lunak menggabungkan rutinitas pas, data pengikatan dapat segera dianalisis dengan
cara prosedur kuadrat nonlinier . Ini di luar lingkup dari catatan ini untuk
memberikan keterangan lengkap tentang metode ini. Pada intinya, bagaimanapun,
prosedur pertama membutuhkan pemilihan ekspresi yang diyakini mewakili sistem
yang sedang diselidiki. Tebakan awal yang kemudian dibuat dari parameter yang
tidak diketahui (misalnya, KL, Bmax), dan dengan menggunakan penebakan
pengikatan diharapkan dihitung sesuai dengan konsentrasi ligan pada setiap titik.
Penyimpangan dari titik-titik diamati yang dihitung dan ditambahkan bersama-sama.
Dengan demikian,
dimana Bobs adalah pengikatan yang diukur, Bcalc adalah pengikatan yang
dihitung dengan menggunakan tebakan, dan w adalah faktor bobot. Hal ini
memungkinkan peneliti untuk memberikan bobot lebih atau kurang untuk titik data
tertentu menurut kehandalan mereka. Dimana setiap titik datum memiliki standard
error yang terkait, sangat umum, misalnya, untuk berat terbalik dengan varians.
Program ini kemudian membuat perubahan sistematis dengan nilai-nilai yang
ditebak dan menghitung ulang kuadrat jumlah tersebut, mengulangi proses ini sampai
kuadrat jumlah mencapai minimum (yaitu, perkiraan kuadrat yang diperoleh). Banyak
program juga akan menghasilkan perkiraan standar deviasi dari nilai taksiran. Proses
ini dijelaskan secara lebih rinci dalam buku ini Colquhoun, Kuliah biostatistik, dan
aplikasi untuk studi pengikatan telah dianggap khusus oleh Wells (lihat bagian
Bacaan lebih lanjut). SigmaPlot (Jandel) dan Origin (Microcal) adalah contoh
komersial grafik yang tersedia dan program kurva-fitting. Program yang dirancang
khusus untuk analisis pada eksperimen pengikatan ligan adalah Ligan (Biosoft) dan
Prisma (GraphPad Software).
Bentuk kuadrat yang cocok jelas dapat diperoleh dengan mengadopsi model
yang lebih rumit melibatkan parameter tambahan. Penggunaan model yang lebih
rumit tentu saja, akan lebih mudah dibenarkan jika ada bukti yang mendukung
independen tersedia (misalnya, pengetahuan tentang beberapa pengikatan situs dari
studi fungsional).
5. 5 RELEVANSI HASIL DARI STUDI PENGIKATAN
Studi pengikatan dilakukan secara independen dari setiap respon biologi, dan
itu jelas diinginkan pemeriksaan untuk memastikan bahwa pengikatan terjadi pada
situs yang relevan atau dapat diidentifikasi. Dengan demikian, sedapat mungkin, hasil
pengikatan harus dibandingkan dengan hasil dari studi fungsional. Hal ini dapat
dicapai paling mudah untuk antagonis kompetitif. Dalam kasus ini, Schild plot (lihat
Bab 1) dapat memberikan perkiraan afinitas dari pergeseran kurva konsentrasi-respon
yang seharusnya sesuai dengan Kd yang diperoleh dalam studi pengikatan. Hulme
dan Birdsall (1992) memberikan ilustrasi terbaik dari korelasi tersebut untuk reseptor
muskarinik, dan contoh lebih lanjut diberikan dalam Gambar 5.8, yang
membandingkan studi fungsional dan mengikat kalium channel bloker. Ini jelas akan
lebih sulit untuk membangun hubungan seperti ketika ada subtipe reseptor dalam
jaringan. Dalam keadaan ini, ketersediaan agen yang menunjukkan selektivitas untuk
subtipe akan membantu penafsiran.
5. 6 MASALAH
Masalah-masalah ini disediakan untuk memberi kesempatan bagi pembaca
untuk menganalisis macam data pengikatan. Masalah tidak memerlukan analisis
kuadrat nonlinier, tetapi ini akan dianjurkan untuk mereka yang memiliki akses ke
fasilitas yang tepat.
Gambar 5.8 korelasi antara kemampuan berbagai senyawa untuk menghambat
125l-monoiodapamin mengikat hepatosit untuk hamster (nilai KI, absis) dan
kemampuan mereka untuk menghambat K+ peningkatan permeabilitas diinduksi oleh
angiotensin II dalam sel-sel (nilai IC50, ordinat). Garis lurus yang diharapkan untuk
kesetaraan langsung. Pengukuran sangat berkoreasi, menunjukkan bahwa senyawa
memang menghasilkan efek mereka dengan mengikat ke apamin-sensitif K+ channel.
(data dari Cook, NS dan Haylett, DG, J. Physiol., 358, 373, 1985. Dengan izin)
Masalah 5.1: ukuran kejenuhan
Data pada tabel. 5.3 berasal dari sebiah percobaan pengukuran 125l-
monoidoapamin mengikat GuineaPig Hepatosit. Kondisi itu sedemikian rupa
sehingga penipisan radiologand diabaikan atas seluruh konsentrasi belajar.
TABEL 5.3
Data permasalah 5.1
Jumlah Bound
Radiologand Konsentrasi [L] (fmol. Mg kering jaringan-1)
(pM) jumlah Noninhibitable
20 0.110 0.018
50 0.224 0.046
100 0.351 0.071
150 0.495 0.143
200 0.557 0.180
300 0.708 0.275
500 0.942 0.462
1000 1.530 0.900
1500 1.920 1.310
1. Gambaran tertentu (inhibitabel) mengikat terhadap [L]. Membuat perkiraan
awal terhadap KL dan Bmax dari grafik ini
2. Buatlah plot Scatchard dari data yang diperoleh dari perkiraan yang baru dari
KL dan Bmax
3. Buatlah sebuag gambar bukit kecill ). Apa
yang dapat disimpulkan dari kemiringan gambar ini?
TABEL 5.4
DATA UNTUK PERMASALAHAN 5.2
GAMBAR 5.9 gambar dari data untuk permasalahan 5.2
Permasalahaan 5.2: kinetik
pada mulanya pengikatan apamin radiolabeled untuk hipotesis hamster dipelajari
selama tiga konsentrasi dari ligan selama 200 detik dan memberikan hasil dalam tabel
5.4. Data ini di gambarkan pada gambar 5.9 dan menunjukkan bagaimana tingkat
konstan untuk terjadinya kenaikan ikatan dengan konsentrasi ligan. Untuk setiap
rangkaian ikatan diharapkan diberikan oleh :
Perkiraan k+1 dan k-1 dari data (lihat bagian 5.2.2.2).
Permasalahan 5.3: percobaan kompetisi
Pengikatan tiga konsentrasi125
I berlabel iodohydroxybenzylpindolol(IHYP) dari
sel darah merah kalkun dipelajari tidak ada dan adanya serangkaian konsentrasi
satalol. Tabel 5.5 menunjukkan hasil. Gambaran jumlah total IHYP menuju pada log
[satolol] dan gambaran kurva halus dengan mata melalui setiap set poin. Perkiraan
IC50 untuk masing-masing garis.
TABEL 5.5
DATA UNTUK PERMASALAHAN 5.3
Mengingat bahwa KL pada IHYP adalah 37pM, dihitung KI dari setiap IC50
(lihat persamaan. (5.20)). Mentabulasi pengikatan spesifik untuk setiap set data dan
membangun gambaran bukit (persamaan (5.31)). Apakah hasil sesuai dengan
populasi tunggal dari reseptor? Bandingkan setiap IC50 gambaran ini dengan
perkiraan anda sebelumnya.
5.7 BACAAN LEBIH LANJUT
Penelitian pertama tepatnya pengikatan radioligand
Paton, W. D. M. and Rang, H. P., The uptake of atropine and related drugs by
intestinal smooth muscle of the guinea-pig in relation to acetylcholine
receptors, Proc. Roy. Soc. London Ser. B, 163, 1, 1965.
Metode kedekatan sintilasi
Udenfriend, S., Gerber, L., and Nelson, N., Scintillation proximity assay: a sensitive
and continuous isotopic method for monitoring ligand/receptor and
antigen/antibody interactions, Anal. Biochem., 161, 494,1987.
Pengaruh kekuatan ion pada pengikatan ligan
Birdsall, N. J. M., Burgen, A. S. V., Hulme, E. C., and Wells, J. W., The effects of
ions on the binding of agonists and antagonists to muscarinic receptors, Br. J.
Pharmacol., 67, 371, 1979.
Pengobatan komprehensif aspek teoritis dan praktis dari radioligan
eksperimen
Hulme, E. C. and Birdsall, N. J. M., Strategy and tactics in receptor binding studies,
in Receptor–Ligand Interactions: A Practical Approach, Hulme, E. C., Ed.,
IRL Press, Oxford, 1992, chap. 4.
Penaksiran parameter mencakup nonlinear metode kuadrat
Colquhoun, D., Lectures on Biostatistics, Clarendon Press, Oxford, 1971.
Wells, J. W., Analysis and interpretation of binding at equilibrium, in Receptor–
Ligand Interactions: A Practical Approach, Hulme, E. C., Ed., IRL Press,
Oxford, 1992, chap. 11.
GAMBAR 5.10 Analisis data saturasi yang disediakan untuk Soal 5.1 (lihat teks
yang menyertai).
5.8 SOLUSI UNTUK PERMASALAHAN
Permasalahan 5.1: Saturasi data
Data kasar yang digambarkan pada Gambar 5.10A. Dua poin dari data tertentu
mungkin menunjukkan bahwa Bmax telah dicapai oleh sekitar 1000 pM, dengan nilai
antara nilai-nilai diukur pada 1000 dan 1500 pM, katakanlah 0.62 fmol / mg berat
kering. Perkiraan KL dapat diperoleh dengan membaca dari grafik konsentrasi ligan
yang menghasilkan pengikatan 0,5 Bmax (yaitu, 0,31 fmol / mg berat kering;. lihat
Persamaan (5.3).). Perkiraan ini akan tergantung bagaimana kurva telah ditarik tetapi
mungkin sekitar 120 pM.
Sebuah plot Scatchard dari data yang ditunjukkan pada Gambar 5.10C. Untuk
kenyamanan, garis dipasang adalah regresi B / F pada B (meskipun, seperti
disebutkan sebelumnya, ini adalah statistik tidak kokoh) dan memberikan suatu
perkiraan untuk Bmax (x-intercept) dari 0,654 fmol / mg berat kering. dan perkiraan
untuk KL (-1/slope) dari 132 pM. Sebuah Lineweaver-Burk (double-timbal balik)
gambaran disediakan untuk perbandingan pada Gambar 5.10D. Regresi linear
memberikan perkiraan lain untuk Bmax (1/y-intercept;. Lihat Persamaan (5.29)) dari
0,610 fmol / mg kering berat. Perkiraan KL dari komplotan ini (kemiringan × Bmax)
adalah 114 pM.
Untuk mengkonstruksikan gambaran (Gambar 5.10E), diasumsikan bahwa Bmax
adalah 0,654 fmol / mg berat kering., nilai Scatchard. Kemiringan gambar adalah
1,138 dengan standar deviasi 0,12, sehingga akan tidak masuk akal untuk menduga
nH memang 1 dan begitu konsisten dengan biomolekuler sederhana interaksi. Gambar
5.10B menunjukkan nonlinier kuadrat-fit dari Persamaan. (5.3) dengan data spesifik
mengikat (memberikan semua titik berat yang sama). Perkiraan kuadrat-adalah 0.676
fmol / mg berat kering. untuk Bmax dan 150 pM untuk KL. (Perkiraan kesalahan
standar nilai-nilai ini dicatat pada gambar.) nonlinier kuadrat-cocok dari total data
yang mengikat dengan Persamaan. (5.4) memberikan Bmax = 0,686 fmol / mg berat
kering. dan KL = 151 pM. Data untuk permasalahanl 5.1. Pada kenyataannya
dihasilkan dengan menetapkan poin secara acak tentang kurva dengan Bmax = 0,68
fmol / mg berat kering. dan KL = 150 pM. Baik Scatchard dan double-timbal balik
gambaran , dalam hal ini, meremehkan kedua parameter, gambaran terakhir menjadi
sangat tidak akurat.
GAMBAR 5.11 Analisis data kinetik disediakan untuk Soal 5.2 (lihat yang
menyertai teks).
Permasalahan 5.2 Data kinetik
Sebuah analisis grafis, yang memungkinkan penentuan k +1 dan k-1 dari data
yang diberikan, dijelaskan dalam Bagian 5.2.2.2. Untuk setiap set data, perlu untuk
menentukan kon+. Nilai-nilai ini dapat diperoleh dari gambaran semilog dari ln ((B ∞ -
Bt) / B ∞) vs t. Tapi, nilai apa yang harus diambil untuk B ∞?
Perkiraan dapat dilakukan dengan mata dari data, dan Gambar 5.11c B ∞ selama
30 dan 100 pM telah diambil sebagai yang tertinggi dan tercatat nilai 300 pM
sebagai nilai rata-rata pada 100 dan200 detik.
Dalam merencanakan Gambar 5.11c, poin lebih dari 50 detik telah diabaikan
karena kesalahan dalam (B ∞- Bt) menjadi proporsional sangat besar. Regresi linier
telah dilengkapi dengan tiga baris, memberikan perkiraan kon dari 0,0377 detik-1 (
30
pM), 0,0572 detik-1
(100 pM), dan 0,0765 detik-1
(300 pM).
Nonlinier kuadrat-cocok, menggunakan Persamaan. (5.14), juga terbuat dari
masing-masing set data (menggunakan Origin), dan kurva dipasang ditunjukkan pada
Gambar 5.11a. Nilai-nilai pas untuk B ∞ adalah 0.110 ± 0.005, 0.269
± 0,006, dan 0,494 ± 0,006 fmol.mg kering wt.-1 dan untuk kon 0,0351 ± 0,004,
0,0518 ± 0,003, dan 0,0828 ± 0,003 detik-1.
Nilai-nilai yang terakhir telah diplot
terhadap [L] pada Gambar 5.11B, dan linier regresi memberikan kemiringan (≡ k +1
)
dari 1,72 × 10-4 pM-1 detik-1 (= 1,7 × 108 M-1 detik-1) dan intercept (≡ k-1
)
0,032 detik-1
. (Ketiga kurva juga dipasang secara bersamaan untuk Pers. (5.14)
dan (5.15) menggunakan Program nonlinier kuadrat-(D. Colquhoun, tidak
diterbitkan) dan memberikan nilai untuk k +1
dan k-1
langsung:. k +1
= 1,63 × 10-4
pM-1 detik-1, k-1
= 0,034 detik-1
)
Permasalahan 5.3 Data Kompetisi
Gambaran individual data akan menghasilkan kurva setara dengan yang di
Gambar 5.4, yang tidak spesifik mengikat, tentu saja, meningkat dengan konsentrasi
radioligand. IC50 dapat dibaca dari kurva langsung (dengan mempertimbangkan
mengikat spesifik) atau dapat diperoleh dari gambaran bukit untuk spesifik mengikat
(lihat Persamaan. (5.31)). Bukit gambaran dari data yang disajikan pada Gambar
5.12, poin untuk konsentrasi luar 3 × 10-8
sampai 3 × 10-4
M yang dikeluarkan karena
kesalahan besar yang terkait dengan mereka. Garis terlihat menjadi lurus, dan regresi
linier menunjukkan lereng tidak signifikan berbeda dari -1. Garis dipasang karena itu
telah dibatasi untuk memiliki kemiringan -1. The xintercepts sesuai dengan IC50
sebesar 1,43 M, 2,48 µM, dan 5,74 mM. (Bandingkan ini dengan perkiraan yang
diperoleh dengan interpolasi langsung pada plot dari data kasar.) nonlinear kuadrat-
cocok dari masing-masing set data untuk Persamaan . (5.18) memberikan IC50
memperkirakan 1,20 ± 0,07 µM, 2,51 ± 0,13µM, dan 6.17 ± 0.45 µM. KI dapat
diperoleh dari IC50 menggunakan Persamaan. (5.20). Pengambilan KL 37 pM
memberikan Nilai KI 0,66, 0,68, dan 0,68 µM, masing-masing, yang mana seperti
yang diharapkan sangat mirip. Data untuk masalah ini benar-benar dihasilkan
menggunakan nilai awal untuk KI 0,68 µM.
GAMBAR 5.12 gambaran Bukit hasil percobaan kompetisi digunakan untuk
permasalahan 5.3. Garis pasang telah dibatasi agar mempunyai kemiringan -1. Nilai
IC50 yang diberikan oleh x-penyadapan dan dapat digunakan untuk menentukan KI
untuk mengikat sotalol (lihat teks yang menyertainya). Nilai-nilai IC50, seperti yang
diharapkan dari Persamaan. (5.20), meningkat dengan konsentrasi radioligand.
Bagian IV
Transduksi Sinyal Reseptor
6 Reseptor Terkait dengan Ion
Saluran: Mekanisme
Aktivasi dan Blok
Alasdair J. Gibb
ISI
6.1pendahuluan....................................................................................................184
6.1.1 Respon untuk aktivitas reseptor..............................................................184
6.2 Mekanisme
Agonis.........................................................................................184
6.2.1 Bukti untuk nonidentical Agonis Situs
Bindin…...................................185
6.2.2 Penerapan Mekanisme Dua-Binding-Site…..........................................186
6.2.3 Bukit Koefisien kooperatitit……...........................................................186
6.2.4 Bukit Koefisien untuk homomerik Saluran Receptor............................188
6.2.5 Reseptor Desensitisasi............................................................................188
6.2.6 Penentuan pbuka curve...........................................................................190
6.2.7.Analisis Single-Channel Rekaman.........................................................192
6.2.8 Analisis Semburan Ion-Channel Bukaan...............................................192
6.3Antagonisme Ion-Channel Reseptor...............................................................193
6.3.1Antagonisme kompetitif dan Persamaan Schild
.....................................193
6.3.2 Ion-Channel Blok...................................................................................197
6.3.3Mekanisme untuk Channel Blok ...........................................................197
6.3.4 Kinetika makroskopik: relaksasi (seperti Arus Synaptic) dan Kebisingan
...............198
6.3.5 Saluran Blok di Equilibrium
..................................................................199
6.3.6 Analisis Single-Channel Kanal Blok
.....................................................200
6.3.6.1 waktu pembukaan …….............................................................200
6.3.6.2 waktu penutupan........................................................................200
6.3.6.3 frekuensi penyumbatan..............................................................200
6.3.6.4 Ledakan Panjang........................................................................200
6.3.6.5 Pembukaan Ledakan .................................................................202
6.3.7 Skala waktu kanal
blok………………..................................................202
6.3.8Menggunakan Ketergantungan
ChanneBlocker......................................203
6.3.9 ketergantungan tegangan kanalblok………….......................................203
6.4 Penutup…………..........................................................................................205
6.5 Masalah..........................................................................................................206
6.6 Bacaan lebih lanjut .......................................................................................208
6.7 Solusi untuk masalah ....................................................................................209
6.1 PENDAHULUAN
Banyak pengukuran dalam farmakologi bergantung pada serangkaian peristiwa
setelah aktivasi reseptor menghasilkan respon yang dapat diukur - misalnya,
kontraksi otot polos seekor hamster ileum dalam menanggapi aktivasi reseptor
muskarinik oleh asetilkolin. Ini berarti bahwa hubungan antara reseptor hunian dan
respon cenderung menjadi kompleks, dan mekanismekerja obat dalam sistem
tersebut seringkali sulit untuk ditentukan.
Berbeda dengan ini, respon agonis pada saluran ion ligand-gated dan efek obat
pada saluran ion sering lebih setuju dengan pemeriksaan mekanistik karena respon
(arus ion melalui membuka saluran ion bila diukur dengan tegangan atau tekhnik
patch-clamp) berbanding lurus untuk aktivasi reseptor. Ini adalah keuntungan besar
dan telah memungkinkan teknik elektrofisiologi yang akan digunakan untuk
mempelajari aktivasi ion-channel dan blok obat reseptor ion-channel dengan sangat
rinci.
Bab ini terutama berkaitan dengan informasi yang dapat diperoleh dari
keseimbangan, atau setidaknya steady-state, rekaman aktivitas reseptor ion-channel.
Namun, banyak informasi memiliki juga diperoleh dari studi kinetik saluran ion di
mana tujuannya adalah untuk menentukan nilai untuk konstanta laju mekanisme
reseptor. Secara umum, hanya konstanta kesetimbangan dapat
ditentukan dari studi keseimbangan.
6.1.1 Tanggapan Terhadap Aktivasi Reseptor
Aktivasi ligand-gated ion-channel reseptor menyebabkan pembukaan saluran
ion, yang membentuk pori pusat melalui struktur reseptor. Ion seperti Na + dan K
+.
Dan sering juga Ca2
+(tergantung pada selektivitas ion saluran), mengalir melalui
saluran kationik yang dibentuk oleh nicotinic acetylcholine reseptor (nAChRs),
reseptor glutamat ionotropic, 5HT3 reseptor, atau P2X adenosine trifosfat (ATP)
reseptor. Ini arus ionik umumnya rangsang menyebabkan depolarisasi sel. Ion
klorida, dengan beberapa kontribusi dari HCO3- ion, adalah pembawa muatan utama
melalui γ -aminobutyric acid (GABAA) Dan saluran reseptor glisin, dan arus ini
umumnya tidak selalu, menghambat.
Reseptor ion-channel ligand-gated perantara cepat transmisi sinaptik pada
neuromuscular sambungan seluruh sistem saraf pusat dan perifer. Reseptor ini juga
terletak presynaptically pada terminal saraf di banyak sinapsis di mana mereka
mempengaruhi pelepasan transmitter. Selain itu, di mana saluran reseptor yang
permeabel terhadap Ca2+
, Mereka terlibat dalam mengendalikan Ca2+
intraseluler
konsentrasi dan karenanya menjadi masukan banyak mekanisme transduksi yang
melibatkan Ca2 +
sebagai utusan kedua. Ca2+
Masuk melalui reseptor glutamat dari N-
metil-D aspartat (NMDA) subtipe (Ascher dan Nowak, 1988) sangat penting terutama
dalam proses synaptogenesis dan pengendalian kekuatan koneksi sinaptik dalam otak,
sedangkan kelebihan CA2 +
menyebabkan masuknya melalui saluran reseptor NMDA
diperkirakan menjadi penyebab utama kematian sel saraf selama hipoksia atau
iskemia di otak.
Selama 50 tahun terakhir, perkembangan teknik elektrofisiologi telah
memungkinkan efek agonis dan antagonis pada reseptor ion-channel ligand-gated
untuk dipelajari dengan ketelitian tinggi. Ini terutama berguna dalam pembelajaran
mekanisme kerja obat karena hasil aktivasi reseptor (aktif melalui saluran ion) dapat
diukur secara langsung, dan membuka saluran secara langsung terkait dengan aktivasi
reseptor. Jadi, seharusnya tidak mengejutkan bahwa pertama kali mekanisme fisik
yang masuk akal untuk aktivasi reseptor adalah hasil dari elektrofisiologi studi
aktivasi AChR. Percobaan itu dilakukan oleh Katz dan rekan kerjanya di Biofisika
Departemen di University College, London, lebih dari 40 tahun yang lalu.
6.2 MEKANISME AGONIS
Mekanisme agonis sederhana yang dapat digunakan untuk menggambarkan
aktivasi ionchannel ligand-gated reseptor itu pertama kali diusulkan oleh del Castillo
dan Katz (1957) untuk aktivasi nAChRs
pada sambungan neuromuskuler:
Mekanisme ini membuat titik penting bahwa aktivasi reseptor harus merupakan
langkah yang berbeda (kebanyakan kemungkinan beberapa langkah) selanjutnya
mengikat agonis (lihat juga Bab 1). Namun, mekanisme ini tidak memungkinkan
untuk fakta bahwa bukti fungsional, biokimia, dan struktural yang cukup sekarang
menunjukkan bahwa ada dua situs mengikat ACh pada reseptor nicotinic
acetylcholine otot dan organ listrik (Unwin, 1996), dan mungkin kasus yang lain
empat transmembran. Reseptor subunit (4TM)-domain (lihat Bab 3) seperti glisin dan
reseptor GABA juga membutuhkan mengikat dua molekul agonis untuk aktivasi
efisien reseptor. Saat ini, Mekanisme yang paling umum (misalnya, Colquhoun dan
Sakmann, 1981) digunakan untuk menggambarkan AchR aktivasi adalah sebagai
berikut:
Di sini, asosiasi mikroskopis dan konstanta laju disosiasi untuk setiap langkah
dalam reseptor mekanisme aktivasi yang diberikan, di mana k+1 dan k+2 lihat
mengikat agonis, k-1 dan k-2 lihat agonis disosiasi, dan β dan α adalah konstanta laju
untuk membuka saluran dan penutupan, masing-masing. Faktor 2 sebelum k+1 dan k-
2 terjadi karena mekanisme berasumsi bahwa salah satu dari dua situs pengikatan
agonis bisa ditempati atau dikosongkan terlebih dahulu. Selain itu, perhatikan bahwa
dua situs diasumsikan untuk menjadi setara sebelum mengikat agonis.
6.2.1 Bukti Untuk Nonidentical Agonis Situs Mengikat
Situs agonis mengikat reseptor adalah beberapa jarak dari saluran ion dan di
luar membran. Mereka terbentuk di saku dalam setiap α-Subunit (Unwin, 1996).
Lingkungan dua situs mengikat tidak bisa, pada prinsipnya, identik karena subunit
yang berdekatan nonidentical dan fakta bahwa reseptor adalah pentamer a. Namun,
bukti fungsional menunjukkan nonequivalance dari dua situs mengikat belum
konsisten antara spesies. Bukti terbaik bahwa situs mengikat berbeda berasal dari
studi tentang Torpedo AChR, yang kedua studi mengikat reseptor asli dan studi
patch-clamp reseptor kloning diekspresikan dalam fibroblas menunjukkan bahwa ada
di urutan perbedaan 100 kali lipat dalam afinitas untuk Ach antara dua lokasi (Lingle
et al., 1992). Eksperimen serupa pada garis sel BC3H1 juga menunjukkan
heterogenitas situs agonis mengikat ini embrio AChR otot tikus. Di
Sebaliknya, beberapa eksperimen tidak menemukan bukti untuk perbedaan yang
besar antara Ach mengikat pada dua situs di katak endplate AChRs (Colquhoun dan
Ogden, 1988). Saat ini, masalah ini belum diselesaikan, dan lebih fungsional dan
struktural bekerja terus untuk menjawab pertanyaan ini. Namun, perlu dicatat bahwa
kehadiran pada reseptor dari dua agonis / antagonis situs mengikat, yang mungkin
berbeda, cukup untuk menambah kompleksitas hasil yang diharapkan dari studi
mengikat atau percobaan dosis-rasio seperti metode Schild, sebagai dijelaskan
kemudian dalam bab ini. Hal ini juga dapat dicatat di sini bahwa reseptor homomerik
(seperti neuronal nicotinic α 7 reseptor AMPA reseptor atau homomerik, lihat Bab 3)
akan memiliki setara situs pengikatan agonis sebelum mengikat agonis. Titik menarik
lebih lanjut adalah bahwa jika glutamat reseptor subunit stoikiometri adalah
tetrameric, maka heteromeric non-NMDA reseptor terdiri dari,
misalnya, dua GluR1 dan dua GluR2 subunit akan, pada prinsipnya, memiliki situs
pengikatan nonidentical pada subunit setara jika subunit yang berdekatan satu sama
lain dalam molekul, tetapi mereka akan memiliki situs mengikat setara ketika GluR1
dan GluR2 subunit alternatif dalam posisi sekitar saluran pusat ion. Ini adalah contoh
yang sangat baik tentang bagaimana informasi mengenai struktur reseptor dapat
sangat diperlukan dalam menafsirkan hasil studi fungsional kerja obat.
6.2.2 Penerapan Dua-Mengikat-Situs Mekanisme
Persamaan (6.2) telah terbukti menjadi penjelasan yang baik dari aktivitas
AchR di berbagai eksperimental situasi (ditinjau oleh Edmonds et al., 1995) dan lebih
baru-baru ini telah digunakan sebagai titik awal dalam mekanisme berkembang untuk
menggambarkan aktivasi saluran ion lainnya ligand-gated seperti reseptor glutamat,
5HT3 reseptor, dan reseptor GABA.
Ekspresi yang berkaitan dengan hunian keseimbangan negara apapun dalam
mekanisme ini untuk agonis Konsentrasi dapat diturunkan seperti yang dijelaskan
dalam Bab 1. Jika kita mendefinisikan konstanta kesetimbangan untuk agonis
mengikat sebagai K1= k-1 / k+1 dan K2 = k-2 / k+2 dan konstanta E menggambarkan
efisiensi saluran pembukaan (setara dengan kemanjuran) sebagai E=β/α, Maka hunian
keseimbangan keadaan terbuka (A2R *) akan:
Ini adalah pelajaran untuk menulis persamaan ini dalam bentuk analog dengan
untuk mekanisme situs pengikatan agonis tunggal,
sebagai formulir ini menggambarkan ketergantungan konsentrasi rendah pA2R *
di alun-alun dari konsentrasi agonis, yang steepens kurva dosis-respons.
Ekuilibrium hunian keadaan terbuka saluran ion biasanya disebut sebagai
p terbuka dan merupakan sebagian kecil dari waktu itu satu saluran terbuka atau,
sama, fraksi populasi saluran yang terbuka pada kesetimbangan. Untuk mekanisme
agonis situs dua mengikat, hubungan antara p terbuka dan konsentrasi agonis (kurva
terbuka p) memiliki bentuk sigmoid akrab (ketika konsentrasi agonis diplot pada
skala logaritmik) dari kurva dosis-respons, tetapi lebih curam dibandingkan
mekanisme situs tunggal mengikat.
6.2.3 Hill Koefisien Dan Kooperatititas
Dalam Bab 1 (Bagian 1.2.4.3), persamaan Hill dan koefisien Hill, NH,
dijelaskan. Bukit koefisien lebih besar dari atau kurang dari satu sering ditafsirkan
sebagai menunjukkan kooperatititas positif atau negatif, masing-masing, dalam
hubungan antara reseptor hunian dan respon. Misalnya, kooperatititas positif bisa
muncul akibat amplifikasi dalam mekanisme transduksi dimediasi oleh G-protein dan
perubahan konsentrasi kalsium sel.
Jika reseptor memiliki dua situs mengikat agonis, muncul pertanyaan, apakah
pengikatan agonis pada satu situs bisa mempengaruhi pengikatan agonis di situs lain,
disebut sebagai kooperatititas antara situs pengikatan agonis. Kooperatititas negatif
terjadi ketika mengikat pada satu situs mengurangi afinitas di lokasi kedua, sementara
kooperatititas positif terjadi jika mengikat pada satu situs meningkatkan afinitas di
lokasi kedua. Perhatikan bahwa mungkin ada kooperatititas antara situs pengikatan
agonis meskipun situs kosong memiliki afinitas yang sama untuk agonis. Namun,
juga mungkin bahwa kedua situs agonis mengikat yang berbeda sebelum mengikat
agonis terjadi (rata-rata, satu situs yang kemudian lebih mungkin untuk ditempati
sebelum yang lain), dan dalam hal ini masih mungkin untuk mengikat agonis satu
situs untuk mempengaruhi mengikat di situs lain. Kemiringan kurva p terbuka untuk
Pers. (6.2) lebih kompleks daripada untuk situs pengikatan agonis tunggal;
Persamaan. (6.4) tidak memiliki bentuk yang sama dengan persamaan Bukit-
Langmuir, dan plot Hill adalah tidak
GAMBAR 6.1 tanggapan AchR Makroskopik dan lereng Bukit untuk aktivasi
AChR. (Kiri) saat melalui saluran ion AChR dalam menanggapi meningkatnya
konsentrasi Ach tercatat dari Xenopus oosit yang telah disuntikkan 3 hari sebelumnya
dengan Crna (courtesy of Prof SF Heinemann, Salk Institute) untuk α tersebut, β, γ,
dan δ subunit dari AChR otot tikus. Arus ke dalam melalui saluran AchR ion
ditampilkan sebagai defleksi ke bawah jejak. Artefak kecil pada jejak menunjukkan
waktu ketika solusi yang mengalir ke dalam bak mandi diubah dari kontrol ke
konsentrasi Ach ditunjukkan dan kemudian kembali untuk mengontrol. Arus yang
direkam dengan dua microelectrode tegangan klem. Potensi membran -60 mV dan
rekaman dilakukan pada suhu kamar. (Kanan) Tanggapan (dalam nA) untuk
meningkatkan konsentrasi Ach diplot terhadap konsentrasi Ach (di nM) pada skala
log-log. Kemiringan garis (1,92) adalah pendekatan untuk koefisien Hill (ketika
reseptor hunian kecil) dan menunjukkan bahwa dua agonis molekul harus mengikat
reseptor untuk menghasilkan aktivasi reseptor efisien.
garis lurus (seperti yang disebutkan dalam Bab 1, Bagian 1.2.4.3). Hal ini karena
untuk mekanisme situs pengikatan dua agonis Hill coefficientnH tergantung pada
konsentrasi agonis:
Ketika [A] << K1, maka nH = 2 tapi jatuh ke nH = 1 ketika [A] >> K1. Dalam
sebuah studi aktivasi AChR pada endplate katak, perkiraan terbuat dari EC 50 = 15
M, K1 = K2 = 77 M, dan nH = 1,6 pada respon setengah-maksimal, EC50,
konsentrasi.
Sebuah pendekatan untuk plot Hill sering digunakan dengan data agonis-respon
untuk saluran ion ligand-gated menyarankan batas bawah untuk jumlah situs agonis
mengikat reseptor. Ternyata, bagi banyak (tapi tidak semua) mekanisme, jika [A] <<
KA, maka kemiringan plot log (respon) vs log [A] mendekati jumlah reaksi agonis
mengikat diperlukan untuk aktivasi reseptor .
Gambar 6.1 mengilustrasikan hal ini dengan menggunakan data yang tercatat dari
oosit Xenopus mengekspresikan reseptor AChR otot embrio tikus. Dalam contoh ini,
respon yang diukur adalah arus dijumlahkan.
6.2.4 Hill Koefisien Untuk Saluran Reseptor Homomerik
Beberapa reseptor fungsional telah dijelaskan dalam sistem ekspresi mana
reseptor adalah diungkapkan dari subunit reseptor tunggal. Subunit reseptor yang
membentuk homomerik fungsional saluran termasuk neuronal nicotinic α7 subunit,
subunit reseptor 5HT3, beberapa non-NMDA subunit reseptor, embrio glisin reseptor
α subunit, dan P2X ATP reseptor subunit. Berdasarkan analogi dengan struktur yang
dikenal dari AChRs Torpedo, diasumsikan bahwa AChRs, 5HT3 reseptor, dan
reseptor glisin memiliki struktur pentameric lima subunit yang mengelilingi sebuah
pusat saluran ion pori. Struktur seperti menunjukkan bahwa akan ada lima situs
agonis mengikat pada reseptor homomerik. Apa, kemudian, harus kita harapkan
koefisien Hill bagi reseptor ini? Bukit koefisien untuk reseptor ini umumnya
ditemukan dalam kisaran dari 1 sampai 3. Demikian pengukuran ini dipersulit oleh
reseptor desensitisasi (lihat di bawah). Namun, hasil ini dapat diartikan sebagai
menunjukkan bahwa, dalam situasi dengan lima situs agonis mengikat reseptor,
mungkin hanya ada dua harus diduduki untuk aktivasi reseptor penuh.
6.2.5 Desensitisasi Reseptor
Desensitisasi dapat didefinisikan sebagai kecenderungan respon berkurang,
meskipun kehadiran stimulus intensitas konstan (misalnya, konstan konsentrasi
agonis). Dalam kasus nicotinic ACh reseptor, bukti yang baik menunjukkan bahwa
hasil desensitisasi dari perubahan reseptor konformasi ke keadaan tidak aktif
refraktori (Rang dan Ritter, 1970). Untuk menggambarkan hal ini dalam hal
mekanisme aktivasi AChR, kita bisa menambahkan keadaan peka terhadap skema
yang ditunjukkan pada Persamaan. (6.2) untuk memberikan:
Di sini, k + D dan k-D adalah konstanta laju untuk masuk ke dan keluar dari
A2RD negara peka. Investigasi penerapan berbagai mekanisme seperti skema linier
dalam Pers.(6.6) ke AchR desensitisasi (Katz dan Thesleff, 1957; Rang dan Ritter,
1970) memberikan bukti yang baik bahwa skema linier tidak bisa cukup menjelaskan
AchR desensitisasi. Secara khusus, itu mencatat bahwa onset sering lambat
dibandingkan dengan offset desensitisasi pada konsentrasi agonis memproduksi
sekitar 50% tunak desensitisasi, dan, sementara tingkat onset tergantung pada sifat
agonis, Offset adalah independen dari agonis. Hasil ini tidak diharapkan dari skema
linear seperti Pers. (6.6). Disimpulkan bahwa skema siklik seperti berikut itu
diperlukan:
Di sini, konstanta kesetimbangan untuk setiap reaksi yang diberikan dan hanya
langkah mengikat agonis tunggal ditampilkan untuk kesederhanaan.
GAMBAR 6.2 Aktivasi saluran AchR tunggal dalam patch membran luar-out dan
tanggapan terhadap meningkatnya konsentrasi ACh dari sebuah patch membran yang
berisi beberapa AChRs. Sebuah artefak kecil dekat awal dari setiap jejak
menunjukkan waktu ketika solusi yang mengalir ke dalam ruang rekaman diubah
menjadi solusi mengandung konsentrasi tercantum Ach. Dengan meningkatnya
konsentrasi Ach, dapat dilihat bahwa saluran diaktifkan lebih cepat, dan bahwa
desensitisasi reseptor menjadi semakin lebih cepat seperti bahwa respon puncak
berkurang pada konsentrasi Ach tinggi. Setelah respon terhadap agonis telah
mencapai steady state, mungkin lebih dari 90% dari reseptor di patch yang peka. Hal
ini kemudian memungkinkan untuk melihat kelompok individu bukaan saluran, yang
mencerminkan periode ketika AChRs tunggal sebentar keluar dari negara peka dan
mengalami aktivasi ulang oleh agonis ACh, sebelum memasuki kembali negara peka
lagi. Identifikasi kelompok ini menyediakan sarana langsung mengamati dan
mengukur popen untuk reseptor pada konsentrasi agonis tinggi, seperti digambarkan
pada Gambar 6.3.
Peka keadaan reseptor memiliki afinitas sangat tinggi untuk agonis (KA '<<
KA) dan reseptor lebih mungkin untuk menurunkan rasa mudah terpengaruh ketika
diduduki oleh agonis (KD KD << '). pengamatan ini memiliki konsekuensi penting
untuk studi radioligand mengikat memanfaatkan ligand-gated ion-channel agonis
reseptor. Umumnya, karena desensitisasi cepat relatif terhadap skala waktu mengikat
eksperimen, apa yang diukur akan didominasi oleh konstanta kesetimbangan untuk
mengikat dari agonis ke negara peka reseptor, dan ini mungkin afinitas yang lebih
tinggi dengan beberapa kali besarnya dari afinitas agonis untuk beristirahat, reseptor
nondesensitized. Ini hanyalah kasus lain dari hasil yang dikembangkan dalam Bab 1
menunjukkan bahwa, secara umum, afinitas jelas agonis diperkirakan dengan metode
seperti mengikat radioligand akan menjadi fungsi dari semua kesetimbangan
konstanta dalam mekanisme reseptor.
Desensitisasi mungkin fenomena reseptor cukup umum, meskipun bervariasi
secara luas di cakupan dan tingkat onset dan offset. Skala dan waktu perjalanan AchR
desensitisasi diilustrasikan pada Gambar (6.2), yang menunjukkan respon sepetak
membran sel mengandung beberapa AChRs untuk meningkatnya konsentrasi Ach.
Dua hal yang jelas: pertama, selama setiap aplikasi Ach, yang respon cepat naik ke
puncak dan kemudian berkurang ke tingkat di mana jejak dapat dilihat melangkah
GAMBAR 6.3 Pengukuran reseptor popen selama cluster bukaan saluran AchR
di patch luar-out mengekspresikan AChR otot tikus seperti yang dijelaskan untuk
Gambar 6.1. Atas jejak menunjukkan satu cluster dari AchR bukaan saluran
diaktifkan oleh 10 pM Ach. Semakin rendah jejak menunjukkan jejak output dari
analog rangkaian integrator. Lamanya cluster adalah 275 msec, dan biaya berlalu
adalah 295 fC. rata-rata arus saluran tunggal adalah 2,2 pA, memberikan popen untuk
clusterini0,49. antara tingkat single-channel saat ini. Kedua, dapat dilihat bahwa
dengan meningkatnya konsentrasi Ach respon puncak tidak hanya menjadi lebih
besar, melainkan kenaikan pertama dan kemudian menurun karena tingkat
peningkatan timbulnya desensitisasi.
6.2.6 Penentuan Kurva Popen
Karena terjadinya desensitisasi, bentuk hubungan penuh antara konsentrasi
agonis dan respon tidak dapat ditentukan dari eksperimen seperti itu diilustrasikan
dalam Gambar 6.1A. Di prakteknya, bagian yang paling akurat ditentukan dari kurva
dosis-respons makroskopik sering di batas konsentrasi rendah, di mana efek
desensitisasi pada kurva dosis-respons yang kecil.
Rekaman Single-channel menyediakan cara sekitar masalah desensitisasi
karena periode ketika semua reseptor di patch membran peka yang jelas pada
konsentrasi agonis tinggi sebagai membentang panjang rekaman di mana tidak ada
bukaan saluran terjadi, karena itu, desensitisasi telah digunakan untuk menyediakan
sarana untuk memperoleh kelompok bukaan berturut-turut, semua karena aktivitas
dari AchR tunggal, disebut sebagai cluster. Periode peka hanya dibuang, dan channel
popen diukur selama kelompok kegiatan antara periode peka.
Dalam setiap jejak pada Gambar 6.2, setelah beberapa detik terpapar ACh
menjadi mungkin untuk mengidentifikasi kelompok individu bukaan saluran AChR.
Analisis kelompok ini saluran bukaan, seperti digambarkan pada Gambar 6.3,
memungkinkan hubungan antara konsentrasi ACh dan p terbuka
akan ditentukan.
Gambar 6.3 menunjukkan contoh dari sekelompok bukaan saluran AchR
direkam dari outsideout Patch membran di hadapan 10 pM Ach. The popen selama
cluster, pada prinsipnya, sederhana untuk menghitung, fraksi waktu saluran terbuka
adalah total waktu yang dihabiskan dalam keadaan terbuka
dibagi dengan durasi cluster. Namun, bandwidth terbatas dari setiap sistem
pencatatan berarti bahwa beberapa bukaan singkat akan terlalu singkat untuk diukur.
Oleh karena itu, lebih baik untuk mengukur muatan disahkan selama cluster (karena
muatan tidak hilang dengan penyaringan) dan menggunakan akumulasi muatan
(integral dari arus selama cluster) untuk menghitung popen tersebut:
P terbuka (6.8)
GAMBAR 6.4 popen kurva untuk AChR otot tikus dinyatakan dalam Xenopus
oosit. (a) Sekelompok AchR bukaan saluran aktif dalam menanggapi 200 mM Ach
ditampilkan, cluster popen = 0,87. (b) Hubungan antara klaster popen dan Ach
konsentrasi ditampilkan. Titik data menunjukkan rata-rata ± S.E. (n = 8-82 cluster)
pada setiap konsentrasi Ach. Garis padat menunjukkan kecocokan data dengan
mekanisme reaksi yang diberikan dalam Pers. (6.24), di mana agonis dapat keduanya
mengaktifkan reseptor dan memblokir saluran ion terbuka. Kesetimbangan konstanta
untuk agonis mengikat dua situs mengikat reseptor itu diasumsikan sama (KA) dan
diperkirakan 22 M, rasio pembukaan saluran untuk menutup konstanta laju (β / α)
adalah 7,9, dan kesetimbangan konstan untuk membuka blok saluran (KB) adalah 4,9
mM. (Diadaptasi dari Gibb et al., Proc. Roy. Soc. London Ser.
Menggunakan metode mengintegrasikan muatan berlalu selama setiap cluster
aktivitas saluran, itu mungkin untuk secara akurat menentukan kurva popen pada
konsentrasi agonis tinggi. Namun demikian, perhatikan bahwa metode ini tergantung
pada identifikasi kelompok bukaan saluran dimana setiap segmen dapat ditugaskan
jelas sebagai akibat dari aktivitas saluran reseptor tunggal: pada popen rendah, adalah
mungkin untuk dua saluran menjadi aktif selama cluster tanpa memberikan bukaan
ganda yang jelas tapi, tentu saja, memberikan sekitar dua kali lipat popen berlaku
untuk reseptor tunggal. Oleh karena itu, bagian bawah kurva popen tidak dapat
ditentukan jenis percobaan. Idealnya, kurva popen seluruh harus ditentukan dari
percobaan di mana hanya ada satu reseptor hadir di patch membran direkam. Dalam
prakteknya, ini sangat sulit dicapai karena kepadatan reseptor terlalu tinggi di
sebagian besar membran sel dan tidak mungkin untuk menentukan berapa banyak
reseptor dalam patch.
Gambar 6.4 menunjukkan contoh dari sekelompok bukaan saluran AChR dan
kurva popen diperolehdari patch yang sama. Itu mungkin untuk mengidentifikasi
kelompok dengan jelas ketika popen yang lebih besar darisekitar 0,4. Hasil ini
dipersulit oleh adanya saluran terbuka blok saluran AchR oleh agonis, Ach (lihat
Bagian 6.3.3 dan Persamaan. (6.24)). Hal ini menyebabkan p terbuka untuk secara
bertahap menurun pada konsentrasi agonis tinggi, terutama di atas 1 mM. P terbuka
maksimum untuk patch diilustrasikan pada Gambar 6.4a adalah 0,83 ± 0,01 (n = 45
cluster) dan terjadi pada 200 M Ach (Gambar 6.4b). bagaimana hasil ini harus
ditafsirkan? The p terbuka kurva pada Gambar 6.4b yang dilengkapi dengan
hubungan antara p terbuka dan konsentrasi Ach diprediksi untuk mekanisme situs
pengikatan dua-agonis diperpanjang untuk memungkinkan blok saluran ion terbuka
oleh Ach (Persamaan (6.34)). Pas ini memungkinkan perkiraan harus dibuat untuk
masing-masing konstanta kesetimbangan dalam mekanisme reaksi.
Ada, bagaimanapun, satu kesulitan dengan menafsirkan hasil pas kurva p
terbuka. Itu kesulitan adalah bahwa ketika pendekatan p terbuka maksimum kesatuan,
meningkatkan β / α atau menurunkan KA memiliki efek yang sangat mirip pada
kurva p terbuka, baik perubahan hanya menggeser ke kiri. Dengan demikian, β / α
dan KA tidak dapat diperkirakan secara independen (E = β / α dan KA berkorelasi)
ketika p terbuka maksimum adalah tinggi. Salah satu solusi untuk ini adalah untuk
memperkirakan β / α secara terpisah dan kemudian memperbaiki nilai ini ketika pas p
terbuka yang kurva untuk memperkirakan KA. Untungnya, perkiraan β dan α dapat
diperoleh dari analisis semburan bukaan single-channel direkam pada konsentrasi
agonis rendah seperti yang dijelaskan di bawah ini.
6.2.7 Analisis Rekaman Satu-Channel
Pengembangan teknik rekaman single-channel adalah suatu kemajuan besar
untuk studi fungsi reseptor ion-channel (Neher dan Sakmann, 1976). Untuk pertama
kalinya menjadi mungkin untuk mengajukan pertanyaan rinci tentang mekanisme
aktivasi dan blok ligan-gated ion-channel reseptor. Ini menjadi mungkin untuk
mengukur secara langsung durasi bukaan ion-channel dan penutupan dan
menghindari beberapa asumsi yang paling membatasi yang telah diperlukan ketika
menafsirkan catatan saat makroskopik. Hal yang menarik adalah bahwa, meskipun
rekaman single-channel yang umumnya dibuat pada kesetimbangan, adalah mungkin
untuk memperoleh informasi rinci tentang tingkat saluran membuka dan menutup.
Hal ini karena, dalam arti, setiap molekul tunggal tidak pernah pada kesetimbangan,
tetapi menghabiskan acak kali didistribusikan di negara-negara konformasi yang
berbeda. Panjang rata-rata waktu yang dihabiskan dalam masing-masing negara
adalah sama dengan kebalikan dari jumlah tingkat semua rute yang mungkin untuk
meninggalkan menyatakan bahwa, sehingga pengukuran saluran kali terbuka dan
tertutup kali memberikan informasi tentang konstanta laju untuk transisi dalam
mekanisme reaksi. Penjelasan lengkap penafsiran data single-channel adalah di luar
lingkup bab ini
.
6.2.8 Analisis Semburan Openings Ion-Channel
Persamaan (6.2) memprediksi bahwa bukaan saluran akan terjadi pada
kelompok atau semburan. Semburan bukaan terjadi karena setiap kali reseptor
mencapai keadaan A2R saluran dapat membuka atau molekul agonis dapat
memisahkan dari reseptor. Ketika agonis disosiasi tingkat k-2 mirip dengan saluran
membuka tingkat β, saluran dapat membuka dan menutup beberapa kali sebelum
agonis disosiasi terjadi, menghasilkan ledakan bukaan. Ledakan pembukaan dan
penutupan juga disebut sebagai aktivasi, yang dapat didefinisikan sebagai segala
sesuatu yang terjadi dari pembukaan pertama setelah mengikat agonis sampai akhir
pembukaan terakhir sebelum semua molekul agonis memisahkan dari reseptor (jelas,
kesempatan di mana agonis mengikat dan kemudian memisahkan tanpa membuka
saluran tidak terlihat). Itu diperkirakan bahwa ligand-gated ion-channel aktivasi
reseptor akan menghasilkan semburan saluran bukaan mengingat apa yang diketahui
tentang cepat transmisi sinaptik (ditinjau oleh Edmonds et al.,
1995), dan ide ini telah digunakan untuk menginterpretasikan data dari rekaman
single-channel dari channel AchR bukaan pada katak neuromukular (Colquhoun dan
Sakmann, 1985).
Dari Persamaan. (6.2), waktu buka rata-rata diperkirakan menjadi kebalikan
dari tingkat konstan untuk Saluran penutupan (τopen = 1 / α). Untuk semburan
tercatat pada konsentrasi agonis yang sangat rendah, mean Waktu tertutup dalam
semburan, τg, adalah sama dengan 1 / (β + 2k-2), dan jumlah rata-rata kesenjangan
per meledak, Ng, sama dengan β/2k-2. Dengan menggunakan dua persamaan
simultan, itu kemudian memungkinkan untuk menghitung β dan k-2.
Dari rekaman semburan rekombinan embrio otot bukaan saluran AchR tikus
pada konsentrasi rendah dari Ach (kurang dari 1 M), durasi pembukaan dan
penutupan dan jumlah penutupan per meledak diukur. Rata-rata τopen = 3,0 msec, τg
= 94 κsec, dan Ng = 0.86, memberikan α = 333 detik-1, β = 4919 detik-1, dan k-2 =
2.860 sec-1. Jika kita asumsikan k +2 = 2 × 108 M-1sec-1, kemudian KA = 14 pM.
Dengan demikian, β / α = 15 dan popen maksimum = β / (α + β) = 0,94. Nilai-nilai ini
konsisten dengan yang diperoleh dari pas kurva p terbuka pada Gambar 6.4. Rasio β /
(α + β) menunjukkan bahwa Ach adalah agonis-efficacy tinggi, sedangkan nilai yang
besar untuk β menunjukkan bahwa [Ach] tinggi akan sangat cepat (dalam beberapa
ratus mikrodetik) mengaktifkan saluran, seperti yang diamati selama transmisi
neuromuskular (Edmonds et al., 1995).
6.3 Antagonisme Dari Reseptor Ion-Channel
Penggunaan metode Schild untuk estimasi kesetimbangan disosiasi konstan
kompetitif antagonis dijelaskan secara rinci dalam Bab 1. Keuntungan besar dari
metode Schild terletak pada Fakta bahwa itu adalah metode nol: agonis hunian
dengan atau tanpa kehadiran antagonis diasumsikan harus sama ketika tanggapan
dalam ketiadaan atau adanya antagonis yang sama. Bahkan ketika
hubungan antara hunian dan respon yang kompleks, metode Schild telah ditemukan
untuk bekerja dengan baik.
6.3.1 Antagonisme Kompetitif Dan Persamaan Schild
Menggunakan prosedur yang diuraikan dalam Bab 1, itu sangat mudah untuk
menunjukkan bahwa persamaan Schild juga diperoleh untuk antagonisme kompetitif
reseptor ion-channel dalam kasus agonis tunggal situs pengikatan. Namun, ketika
mempertimbangkan dua situs mengikat agonis, situasinya lebih rumit
karena beberapa pertanyaan baru tentang mekanisme harus dijawab:
• Apakah afinitas antagonis untuk kedua situs mengikat yang sama? Hal ini sangat
mungkin bahwa bahkan jika agonis memiliki afinitas yang sama untuk kedua situs,
antagonis tidak akan.
• Dapatkah dua molekul antagonis menempati reseptor pada saat yang sama?
• Apakah pengikatan antagonis di satu lokasi mempengaruhi afinitas dari situs
lain baikagonis atau antagonis?
Situasi dapat disederhanakan dengan asumsi:
• Agonis afinitas di setiap situs adalah sama.
• Antagonis afinitas di setiap situs adalah sama.
• Hunian satu situs dengan baik agonis atau antagonis tidak mempengaruhi
afinitas
situs kedua baik untuk agonis atau antagonis.
Bahkan dengan asumsi menyederhanakan, mekanisme untuk menggambarkan
tindakan simultan dari kedua agonis dan antagonis pada reseptor dua-mengikat-situs
yang kompleks:
Sebuah ekspresi untuk hunian kesetimbangan pA2R * dapat lagi diperoleh
dengan menggunakan metode diuraikan dalam Bab 1. Sebuah komplikasi yang
potensial adalah bahwa mekanisme ini mengandung sebuah siklus, sehingga produk
dari laju reaksi di kedua arah searah jarum jam dan berlawanan harus sama dalam
Untuk memastikan prinsip reversibilitas mikroskopis dipertahankan. Dalam kasus ini,
mikroskopis reversibilitas dipertahankan. Dengan demikian.
Di hadapan kedua-duanya agonis A dan B musuh, pA2R* bergantung pada
kedua-duanya agonis dan musuh konsentrasi di dalam benar-benar pertunjukan yang
diperrumit; bagaimanapun, hubungan itu adalah sangat utama satu perluasan dari Eq.
(63) dan adalah tiba di sebagai berikut:
1. Ukuran semua wujud dari sel yang peka rangsangan itu harus menjumlahkan
kepada nya:
2. Ketika sistim adalah di keseimbangan, masing-masing reaksi yang individu masuk
Eq. (69) dapat digunakan untuk menulis ungkapan-ungkapan untuk masing-
masing wujud dari sel yang peka rangsangan dalam kaitan dengan?dengan
menggunakan istilah bentuk aktif dari sel yang peka rangsangan, A2R*:
Hubungan antara pA2R* dan kedua-duanya konsentrasi agonis dan musuh kemudian
bisa ditulis sebagai:
Itu telah jelas dari perbandingan dari Eq. (614) dengan Eq. (63), direproduksi di
bawah seperti(ketika Eq. (615) dengan KA = K1 =K2,
bahwa ada sekarang tanpa ungkapan yang sederhana yang berhubungan perbandingan
dosis kepada konsentrasi musuh. Setelah penyamaan pemilikan-pemilikan di dalam
ketidakhadiran dan kehadiran dari blok dan mengalikan konsentrasi agonis di Eq.
(614) oleh perbandingan dosis, r dapat ditemukan dari ungkapan:
Ungkapan ini dapat diatur kembali untuk memberi suatu persamaan quadrat di dalam
r
dan ini dapat diatur kembali untuk memiliki wujud patokan:
dua solusi siapa ditemukan dari penyamaan:
Satu solusi adalah hal negatif dan yang lain adalah (barangkali anehnya!) penyamaan
Schild yang terbiasa:
Lebih secara langsung, mungkin saja dilihat oleh pemeriksaan Eqs. (614) dan (615)
itu:
maka untuk kiri kanan(di mana-mana sisi-sisi dari penyamaan untuk bersifat sama
ini,
dan penyamaan Schild menerapkan. Jadi; Dengan demikian, jika kita berasumsi
bahwa kedua tapak pengikat bersifat mandiri dan serupa, lalu Schild penyamaan
pegang(jaga untuk mekanisme two-binding-site. Jika bagaimanapun, musuh mengikat
dengan yang yang berbeda [gaya gabung/ hubungan dekat] kepada masing-masing
lokasi, lalu perbandingan dosis menjadi suatu fungsi kompleks kedua-duanya agonis
dan musuh konsentrasi-konsentrasi dan tetapan keseimbangan (Colquhoun, 1986). Itu
adalah, oleh karena itu, tidak mengejutkan bahwa a pergeseran paralel dari meletus
kurva dengan meningkatkan konsentrasi musuh adalah yang diramalkan untuk
menjadi tidak mengamati ketika tapak pengikat itu bersifat yang berbeda, sehingga
perbandingan dosis akan bergantung pada tingkatan tanggapan di mana itu
di/terukur. Bagaimanapun, beberapa pengandaian sederhana dapat masih sebagai
dibuat. Jika itu letus adalah kecil ([ Suatu] <<KA), lalu satu pergeseran kira-kira
paralel dari kurva doseŔresponse terjadi dan perbandingan dosis adalah:
Di sini, KB1 dan KB2 adalah tetapan keseimbangan untuk blok di dua lokasi.
Di dalam situasi ini, alur cerita Schild bukanlah linear; itu mempunyai suatu
keserongan dari kurang dari kesatuan pada konsentrasi-konsentrasi musuh di
sekeliling SEMBUR (di mana KB = (KB1KB2)1/2) dan menuju ke kepada kesatuan
pada ketinggian atau pada konsentrasi-konsentrasi musuh yang rendah (Colquhoun,
1986).
Satu contoh dari pemakaian alur cerita Schild di dalam menguji tindakan
tubokurarina musuh di AChRs di sambungan neuromuskulus kodok (Colquhoun et
al., 1979) ditunjukkan di dalam Gambar 65. Figur ini menggambarkan satu
eksperimen di mana jaring dalam batin arus mengukur sebagai jawaban atas yang
yang berbeda konsentrasi-konsentrasi carbachol adalah yang direncanakan pertama
di dalam ketidakhadiran (kendali) dan lalu di hadapan meningkatkan konsentrasi-
konsentrasi tubokurarina. Perekaman-perekaman diserang dua potensi membran yang
berbeda dan Schild merencanakan karena masing-masing potensi membran dibangun.
Hasil-hasil menggambarkan itu, pada Ŕ70 mV, alur cerita Schild adalah linear dan
mempunyai suatu keserongan dekat dengan kesatuan, mengusulkan pertentangan
kompetitif
GAMBAR 65 Use dari metoda Schild untuk penilaian KB dari suatu akting musuh
yang kompetitif pada suatu ion yang ligand-gated menggali sel yang peka
rangsangan. (suatu) Bukukan concentrationresponse membengkok karena
keseimbangan menjaring dalam batin arus (.Aku‡) yang ditimbulkan oleh carbachol
di hadapan meningkatkan konsentrasi-konsentrasi tubokurarina (TC) pada suatu
potensi membran dari .70 mV (atas panel) dan pada suatu potensi membran dari .120
mV (panel lebih rendah). Itu dapat dilihat itu, kecuali konsentrasi yang paling tinggi
TC ( 5 ƒÊM), pada .70 musuh mV ini menghasilkan satu pergeseran kira-kira paralel
dari carbachol doseresponse membengkok sebagai yang diharapkan untuk
pertentangan yang kompetitif. Bagaimanapun, di dalam eksperimen yang sama pada
suatu potensi membran dari .120 mV, pergeseran dari doseresponse membengkok
adalah jauh dari paralel. Ini adalah karena molekul tubokurarina yang bermuatan
positif sedang tertarik ke dalam AChR menggali ketika di dalam dari sel itu dibuat
lebih hal negatif. Garis putus di dalam atas dan menurunkan diskusi beregu yang
tanggapan-tanggapan meramalkan untuk pertentangan murni kompetitif dengan KB =
027 ƒÊM. Perbandingan-perbandingan dosis dihitung pada suatu tanggapan tingkat
.8 nA pada .70 mV dan .24 nA pada .120 mV. (b) Schild alur cerita dari batang kayu (
r . 1)melawan terhadap batang kayu (konsentrasi tubokurarina). Pertunjukan
lingkaran-lingkaran yang diisi perbandingan-perbandingan dosis keseimbangan pada
.70 mV, perbandingan-perbandingan dosis keseimbangan pertunjukan segi tiga yang
diisi pada .120 mV, dan membuka segi tiga menunjukkan tanggapan puncak pada
.120 mV. Karena blok salur terbuka oleh tubokurarina adalah secara relatif melambat
untuk berkembang, ketika tanggapan puncak pertentangan kompetitif sebagian besar
yang di/terukur dilihat dan keserongan Schild adalah dekat dengan kesatuan. Fakta
bahwa kedua-duanya kurva-kurva bersamaan waktu pada konsentrasi-konsentrasi
musuh yang rendah (perbandingan-perbandingan dosis kecil) nyatakan bahwa KB
untuk pengikatan bersaing kepada sel yang peka rangsangan itu tidak terikat pada
potensi membran, seperti(ketika boleh jadi diharapkan jika tapak pengikat agonis di
luar ladang potensi membran itu. ( Yang diadaptasikan dari Colquhoun, D.et al.,
J.Physiol., 293, 247284, 1979.)
6.3.2 BLOK ION-CHANNEL
Mekanisme ganjal saluran ion mempunyai secara luas diuji dan yang ditemukan
untuk bersifat penting di dalam kedua-duanya ilmu farmasi dan ilmu faal. Contoh-
contoh adalah blok dari sodium syaraf dan berhubungan dengan jantung menggali
oleh anestetik lokal, atau blok dari sel yang peka rangsangan NMDA menggali oleh
Mg2+ dan ketamine yang anesthetic. saluran menghalangi mekanisme pertama
digunakan menurut banyaknya untuk menguraikan blok dari K akson ikan cumi-
cumi+ arus oleh tetraethylammonium (TEH) notulen. Barang kepunyaan dari saluran
blockers di potensi-potensi yang synaptic dan arus-arus synaptic diselidiki, terutama
sekali di sambungan neuromuskulus, dan pengembangan dari teknik perekaman
saluran tunggal mengizinkan kemacetan-kemacetan saluran untuk mengamati secara
langsung untuk pertama kali.
6.3.3 SUATU MEKANISME UNTUK BLOK SALURAN
Gagasan di mana narkoba bisa bertindak oleh secara langsung menghalangi alir
notulen melalui ion menggali mungkin dimulai, seperti umumnya hipotesis, sebagai
suatu semacam gagasan abstrak? ringkasan tanpa dasar secara fisik. Adalah mudah ke
[menggambar/ menarik] suatu rencana bahwa termasuk kira-kira menyambungkan
suatu muara, menghalangi alir mempermudah saluran (saluran ion); bagaimanapun,
untuk maju, perlu mengkonversi gambar? penarikan ke dalam suatu mekanisme yang
secara phisik masuk akal (yaitu., tidak melanggar manapun hukum yang diterima
yang dari ilmu fisika) dan sediakan ramalan-ramalan kwantitatif bahwa dapat diuji
secara eksperimen. Idealnya, tujuan itu adalah untuk menaksir tetapan laju asosiasi
dan pemisahan untuk obat/racun ganjal saluran. Ini akan lalu memberi tetapan
keseimbangan pemisahan (MENYEMBUR) untuk obat/racun jilid. Seperti halnya
dalam pemakaian metoda Schild untuk mengukur pertentangan kompetitif, suatu
yang kwantitatif perkiraan dari KB untuk blok saluran mengizinkan [membiarkan
perbandingan dari berbagai narkoba dan suatu yang pharmakologis penggolongan
ion menggali kepada mana mereka mengikat. Dengan kata lain, kita bisa berkata
bahwa ketika satu ion menggali bersikap terbuka, lokasi pengikatan obat diunjukkan.
Jika suatu obat/racun mengikat kepada lokasi itu, arus notulen melalui saluran itu
dihalangi. Kita mungkin lebih lanjut mengira bahwa obat/racun harus melepas blok
sebelum saluran itu dapat menutup secara normal. Suatu mekanisme yang standar
menggunakan untuk menguraikan blok saluran dari ion yang ligand-gated menggali
sel yang peka rangsangan kemudian adalah:
di mana â dan á adalah pembukaan saluran dan kurs penutup, dan k+B dan kŔB
adalah yang mikroskopis tetapan laju asosiasi dan pemisahan untuk menghalangi
saluran oleh obat/racun B. Di sini, [B] adalah yang ditandai di transisi ke dalam
keadaan terblok itu untuk mengingatkan pembaca yang tingkat reaksi ini bergantung
pada [B]. Kenali bahwa ini mekanisme tidak mempertimbangkan kemungkinan
bahwa suatu obat/racun bisa mengikat kepada saluran di dalam yang tertutup
(menduduki atau tak terpakai) penyesuaian. Dengan mekanisme-mekanisme seperti
ini semua, itu sering mungkin untuk menyederhanakan analisa dari tindakan a
saluran menghalangi dengan mengira bahwa jilid agonis adalah banyak lebih cepat
dari pembukaan saluran dan menutup dan lalu mengkombinasikan beberapa negara
yang tertutup bersama-sama sehingga mekanisme mendekati suatu tiga status(negara
sistim:
Kenali bahwa tingkat pembukaan saluran kini ditandai ƒÀŒ.Karena saluran itu
hanya dapat membuka dari status(negara A2R, tingkat pembukaan yang efektif,
ƒÀŒ,diperoleh dengan perkalian tingkat pembukaan yang riil ƒÀoleh pemilikan
keseimbangan dari A2R:
6.3.4 ILMU GERAK YANG MAKROSKOPIK: RELAKSASI-RELAKSASI
(Seperti ARUS-ARUS SYNAPTIC) DAN SUARA GADUH
Berubah di dalam pemilikan dari status(negara salur terbuka dari sel yang peka
rangsangan sebagai suatu fungsi waktu ( pA2R*(t sebagai jawaban atas suatu
gangguan keseimbangan sel yang peka rangsangan dapat digunakan untuk
memperoleh informasi tentang daftar biaya pengiriman barang-barang dari saluran
gating dan interaksi narkoba dengan ion menggali sel yang peka rangsangan. Sistim
itu adalah yang dikatakan kepada kendur ke arah suatu keseimbangan yang baru.
Waktu sepanjang relaksasi itu digunakan untuk mengukur daftar biaya pengiriman
barang-barang dari perilaku rerata dari banyak ion menggali di suatu perekaman,
selagi analisa suara gaduh menggunakan frekuensi dari fluktuasi-fluktuasi moment-
to-moment di dalam pemilikan dari status(negara salur terbuka pada keseimbangan
untuk menyediakan informasi tentang daftar biaya pengiriman barang-barang di
dalam mekanisme sel yang peka rangsangan. Untuk negara kali 1000, suatu relaksasi
(atau menyiarkan spektrum) akan berisi k1 bersifat exponen (atau Lorentzian)
komponen-komponen. Jadi; Dengan demikian, mekanisme di Eq. (625) di atas akan
memiliki dua negara di dalam ketidakhadiran dari blok dengan demikian
mengakibatkan relaksasi-relaksasi (atau menyiarkan spectra) bahwa dapat dicoba
dengan bersifat exponen yang tunggal (atau Lorentzian) berfungsi. Penambahan blok
menciptakan satu status(negara yang tambahan (keadaan terblok), memberi kali 1000
=3. Untuk kali 1000 =3, pemilikan dari tempat terbuka menyatakan sebagai suatu
fungsi waktu akan digambarkan oleh dua bersifat exponen:
Timbal-balik dari tetapan-waktu, Ą1 dan Ą2, adalah tetapan laju ă1 dan
ă2. Timbangan dari yang bersifat exponen (w1 dan obligasi pangkalan) diper;rumit
fungsi-fungsi laju alihan di Eq. (625).
Bagaimanapun, tetapan laju itu adalah eigennilai-eigennilai yang ditemukan
dengan pemecahan sistern persamaan diferensial bahwa menguraikan mekanisme
tersebut. ă 1 dan ă2 adalah kedua solusi-solusi persamaan quadrat:
di mana
dan
Pemberitahuan bahwa ketika ƒÀŒ kecil (yaitu., ketika pemilikan dari A2R adalah
sangat kecil,karena akan jika konsentrasi agonis adalah rendah), lalu
dan
Dengan pengandaian sederhana suatu yang kecil ƒÀŒ,jumlahan dan produk
dari tetapan laju yang di/terukur dalam satu eksperimen dapat digunakan untuk
mengkalkulasi kB dan k+B jika ƒ¿dikenal dari eksperimen-eksperimen di dalam
ketidakhadiran dari blok. Hal ini yang hanyalah dilaksanakan dengan merencanakan
jumlahan atau produk dari yang di/terukur tetapan laju melawan terhadap konsentrasi
blok. Dari Eq. (632) di atas, produk dari tetapan laju harus tidak terikat pada
konsentrasi blok dengan suatu nilai sepadan dengan ƒ¿kB, selagi jumlahan dari
tetapan laju ( Eq. (631)) akan memberi suatu garis lurus dengan keserongan sepadan
dengan k+B dan perpotongan dari ƒ¿ +kB. Jika data yang bersifat percobaan adalah
konsisten dengan ramalan-ramalan ini, lalu data menunjuk yang direncanakan di
dalam ini cara perlu [berada/dusta] di suatu garis lurus, dan ini adalah bukti baik
yang mekanisme tindakan obat/racun untuk menghalangi saluran ion tempat terbuka.
Asumsi yang ƒÀŒsangat kecil sudah digunakan ketika mempelajari barang
kepunyaan dari saluran blockers di arus-arus yang synaptic, seperti(ketika
konsentrasi pemancar (dan karenanya pA2R) mungkin kecil selama tahap kebusukan
dari arus. Selama analisa suara gaduh mengadakan percobaan, suatu konsentrasi
agonis yang rendah digunakan sehingga, lagi; kembali, di bawah kondisi-kondisi ini
ƒÀŒharus kecil.
6.3.5 SALURAN MENGHALANGI PADA KESEIMBANGAN
Hubungan antara meletus (pcontrol) dan konsentrasi agonis untuk dua tapak
pengikat agonis mekanisme disampaikan dalam Eq. (64) dan reproduksi di bawah di
suatu wujud sedikit yang berbeda:
Ketika satu blok salur terbuka ditambahkan, masuk dengan tiba-tiba kehadiran dari
blok (pblocker) memberi di bawah adalah suatu fungsi kedua-duanya agonis (Suatu)
dan blok (B) konsentrasi:
Mengambil rasio pcontrol/pblocker memberi hasil sederhana ini:
Karena arus merekam di suatu eksperimen pengapit volt adalah berbanding
lurus kepada saluran meletus, rasio arus di dalam ketidakhadiran dari blok kepada
arus di hadapan meningkatkan konsentrasi-konsentrasi blok dapat digunakan untuk
mengkalkulasi KB. Rancangan percobaan itu diharapkan untuk memperoleh suatu
tanggapan yang cukup besar kepada agonis sendirian dan lalu mengkalkulasi rasio
reaksi kontrol ini untuk tanggapi kepada konsentrasi yang sama agonis di hadapan
meningkatkan konsentrasi-konsentrasi blok saluran. Perbandingan pcontrol/pblocker
ketika yang direncanakan melawan terhadap [B] akan merupakan suatu garis lurus
bahwa menginterupsi sumbu-y pada 1 dan mempunyai suatu keserongan dari
pcontrol/KB. Jika pcontrol =1, lalu keserongan =1/KB. Jika pcontrol dikenal untuk
konsentrasi agonis tertentu, lalu sungguh-sungguh KB dapat masih sebagai
diperkirakan. Jika kita mengasumsikan pcontrol = 1, lalu KB yang dihitung akan
lebih besar dari KB yang benar: sebagai contoh, oleh suatu faktor dari 2 jika pcontrol
= 05 dan oleh suatu faktor dari 10 jika pcontrol =01.
6.3.6 ANALISA SINGLE-CHANNEL DARI BLOK SALURAN
Di bawah adalah satu garis besar dari sebagian dari informasi bahwa dapat
diperoleh dari data saluran tunggal menggunakan pengukuran-pengukuran sederhana
[secara] wajar seperti rata-rata membuka waktu dan nilai-tengah menutup waktu.
Analisa ini adalah yang digambarkan di dalam Gambar 66 karena blok dari sel yang
peka rangsangan NMDA menggali oleh Mg2+ notulen.
6.3.6.1 Waktu Yang Terbuka
Gali blockers akan menghasilkan suatu pengurangan rata-rata membuka waktu
dari:
di dalam kendali itu untuk:
di hadapan blok, yang yang dihitung dari aturan yang umur purata tentang segala
status(negara memadai;sama dengan yang timbal balik dari jumlahan dari daftar
biaya pengiriman barang-barang untuk meninggalkan bahwa status(negara
(Colquhoun dan Hawkes, 1982). Suatu alur cerita dari 1/Ą melawan terhadap [B]
perlu, oleh karena itu, memberi suatu garis lurus dari keserongan k+B. Ini
digambarkan di dalam Gambar 66C, di mana untuk bidang potensi membran dan
Mg2+ konsentrasi- konsentrasi kebalikan NMDA saluran nilai-tengah membuka
waktu mengikuti hubungan linier ini, memberi k+B nilai-nilai di dalam cakupan 66
•~106 M.1sec.1 pada .40 mV kepada 84•~107 M.1sec.1 pada .80 mV.
6.3.6.2 Waktu Yang Tertutup
Periode-periode tertutup karena kemacetan-kemacetan saluran mempunyai, dari
aturan yang sama, suatu umur purata dari:
Catat bahwa jangka waktu kemacetan-kemacetan saluran diramalkan untuk
menjadi tidak terikat pada konsentrasi blok, seperti yang digambarkan di dalam
Gambar 66D, di mana jangka waktu kemacetan menunjukkan tidak ada
ketergantungan yang jelas bersih di Mg2+ konsentrasi.
6.3.6.3 Frekuensi Kemacetan
Frekuensi dari kemacetan-kemacetan, per detik dari waktu yang terbuka, adalah
k+B[B], sehingga nomor nilai-tengah dari kemacetan-kemacetan pada setiap
pembukaan saluran hanyalah frekuensi kemacetan dikalikan dengan rata-rata
membuka waktu:
6.3.6.4 Bursts dari Openings
Di mana blok saluran mengkonversi tunggal membuka ke dalam yang jelas
nyata meledak (eg., blok anestetik lokal dari nicotinic menggali), nomor rata-rata
tentang membuka per meledak adalah satu lagi dibanding nomor rata-rata dari
kesenjangan; celah; jurang (kemacetan-kemacetan):
GAMBAR 66 analisa Single-channel blok saluran ion. Perekaman-perekaman wakil
arus-arus saluran tunggal melalui sel yang peka rangsangan NMDA menggali
direkam digambarkan pada potensi membran dari .20 mV, .50 mV, dan .80 mV
terkendali merekam (Suatu) dan di hadapan magnesium 40-ƒÊM (B). Ganjal yang
cepat dan lepas blok tentang saluran itu terutama sekali jelas pada voltase-voltase
lebih negatif. Nilai-tengah kebalikan membuka waktu dan kebalikan berarti jangka
waktu penutupan-penutupan saluran yang tambahan disebabkan oleh Mg2+
direncanakan melawan terhadap Mg2+ konsentrasi di dalam (C) dan (D). Hasil-hasil
ini mengkonfirmasikan hubungan yang linier antara Mg2+ konsentrasi dan kebalikan
berarti waktu terbuka dan ketiadaan Mg2+ ketergantungan konsentrasi dari saluran
yang diramalkan oleh salur terbuka yang sederhan mekanisme blok. Garis utuh di
dalam (C) gambarkan regresi linier data merekam pada masing-masing selaput
potensi. Keserongan-keserongan bentuk ini beri perkiraan-perkiraan dari nilai dari
k+B dari 66, 157, 266, 404, dan 840 •~106 M1 sec1 pada . 40-, . 50-, . 60-, .70-, dan
.80-mV potensi membran.
Kenali bahwa jumlah keseluruhan nilai-tengah membuka waktu per meledak akan :
Ini adalah satu hasil yang penting. Salur terbuka yang sederhana menghalangi
mekanisme meramalkan bahwa jumlah keseluruhan membuka waktu per meledak
adalah sama ketika rata-rata membuka waktu di dalam ketidakhadiran dari blok
(Neher, 1983), bahkan meskipun [demikian] membuka kini dipotong-potong oleh
kemacetan-kemacetan saluran. Sebenarnya, karena saluran-saluran bahwa memberi
meledak tentang membuka terkendali merekam, jumlah keseluruhan membuka waktu
per meledak konstan di dalam kehadiran atau ketidakhadiran dari blok.
Hasil ini adalah juga dari arti penting karena itu menunjukkan salur terbuka
sederhana itu blockers tidak kurangi beban?tugas lewat saluran selama masing-
masing pengaktifan sehingga mereka tidak akan mengurangi beban? tugas yang
disuntik pada suatu sinapsis oleh suatu arus yang synaptic. Sebagai gantinya, mereka
memperpanjang waktu di mana beban? Tugas disuntik yang dapat mempunyai barang
kepunyaan sungguh dramatis di transmisi yang synaptic.
6.3.6.5 Meledak Panjangnya
Rata-rata meledak panjangnya ditemukan seperti yang ditunjukkan di bawah:
Jadi; Dengan demikian suatu alur cerita dari rata-rata meledak panjangnya
melawan [B] akan memberi suatu garis lurus dari perpotongan 1/á dan keserongan
1/(áKB).
6.3.7 SKALA WAKTU DARI BLOK SALURAN
Gali blockers sering digolongkan sebagai yang lambat, intermediate/antara, atau
blockers cepat, yang yang didasarkan pada sangat lebar cakupan berharga yang telah
ditemukan untuk tetapan laju pemisahan yang mikroskopis dari gali blockers. Hampir
semua saluran blockers telah ditemukan untuk memiliki asosiasi yang mikroskopis
tetapan laju (k+B) di dalam cakupan di sekitar 107 MŔ1secŔ1. Di dalam kontras,
tingkat pemisahan mikroskopis tetap (kŔB) mencakup (di) atas beberapa
order(pesanan dari besaran dari di sekitar 105 secŔ1 (eg., blok dari nicotinic sel yang
peka rangsangan menggali oleh ACh) kepada 001 secŔ1 untuk MK-801 (dizocilpine)
blok dari NMDA menggali. panjangnya-panjangnya nilai-tengah dari kesenjangan;
celah; jurang kemacetan dapat oleh karena itu mencakup dari 10 ìdetik sampai
dengan 100 detik. Hanyalah ketika kemacetan-kemacetan itu di dalam cakupan
intermediate/antara, menyerupai 1 msec di dalam jangka waktu, bahwa kesenjangan;
celah; jurang adalah dengan mudah mendeteksi di dalam perekaman-perekaman
saluran tunggal. Jika blok itu adalah suatu blok yang lambat dengan kemacetan yang
sangat panjang kesenjangan; celah; jurang, catatan data kelihatan seolah-olah
frekuensi dari pembukaan-pembukaan saluran sudah berkurang. Jika blok adalah
puasa, amplitudo saluran tunggal muncul dikurangi karena ganjal dan melepas blok
juga puasa untuk dipecahkan.
6.3.8 KETERGANTUNGAN PENGGUNAAN DARI SALURAN BLOCKERS
Itu mengikuti dari fakta yang blok diasumsikan untuk mengikat hanya untuk
keadaan teraktif dari saluran bahwa derajat tingkat dari blok akan bukanlah hanya
konsentrasi tergantung tetapi juga menggunakan tergantung; di dalam yang lain kata-
kata, semakin banyak saluran-saluran itu diaktipkan, semakin banyak mereka menjadi
dihalangi Itu mengikuti dari di atas diskusi di timbangan waktu dari saluran
menghalangi bahwa derajat tingkat berguna ketergantungan akan dengan kritis
tergantung pada tetapan laju pemisahan yang mikroskopis. Lambat blockers
tunjukkan ketergantungan penggunaan ekstrim, yang ditambahkan dengan blockers
mempertunjukkan peristiwa penjeratan. Menjerat terjadi ketika saluran itu dapat
menutup dan agonis memisahkan dengan blok masih yang terbelenggu di dalam
saluran. Blok itu kemudian adalah menjerat di dalam saluran sampai lain waktu sel
yang peka rangsangan diaktipkan. Contoh-contoh penting tentang blok penjeratan
termasuk tindakan hexamethonium pada yang autonomic ganglia dan blok dari sel
yang peka rangsangan NMDA menggali oleh MK801 atau ketamine yang anesthetic.
6.3.9 KETERGANTUNGAN VOLTASE DARI BLOK SALURAN
Salah satu [dari] hasil-hasil yang menarik timbul dari awal pengapit volt
mengadakan percobaan dengan ganjal saluran narkoba adalah bahwa/karena potensi
dari blok itu tergantung pada voltase selaput. Di dalam kontras, ini ditemukan untuk
menjadi tidak kasus untuk pertentangan yang kompetitif pada pelat ujung nicotinic
sel yang peka rangsangan (Gambar 65). Hasil ini ditafsirkan sebagai menunjukkan
bahwa tapak pengikat asetilkolina di sel yang peka rangsangan (- dan blok kompetitif
oleh karena itu pada lokasi itu oleh tubokurarina) tidak dipengaruhi oleh potensi
perbedaan ke seberang selaput; sedangkan, jika jilid dimakan karat oleh potensi
membran, lalu tapak pengikat harus pada suatu daerah protein yang menjadi bagian
dari cara ke seberang medan elektrik dari selaput. Jilid suatu obat/racun yang
dibebankan pada suatu lokasi di dalam satu medan elektrik akan dipengaruhi oleh
bahan kimia interaksi-interaksi (seperti ikatan hidrogen, umum kepada semua
interaksi drugŔreceptor) dan oleh medan elektrik dan beban?tugas di obat/racun.
Tetapan laju yang mikroskopis untuk asosiasi dan pemisahan pada suatu lokasi di
dalam satu medan elektrik (- karena blok oleh narkoba yang dibebankan) adalah
fungsi eksponensial voltase selaput:
Di sini, dilihat pada pecahan voltase selaput yang pikiran sehat obat/racun ganjal di
jilid lokasi, dan memulai siaran äditentukan oleh apakah obat/racun ganjal mendekati
tapak pengikat dari di dalam atau di luar selaput. Seperti yang dinyatakan di sini,
penyamaan-penyamaan ini menguraikan tingkat konstan-konstan untuk blok dari di
luar. Valensi dari obat/racun ganjal diberi sebagai z, dan F, R, dan T adalah konstanta
Faraday (9,65 × 104c mol-1), tetapan gas (8.32 JK-1mol-1), dan absolutetemperature
(293 K pada suhu kamar), masing-masing. Tegangan ketergantungan konstanta
kesetimbangan disosiasi diberikan oleh:
Dari hubungan ini dapat dilihat bahwa plot semilog dari LNK (V) vs membran
potensial akan memberikan garis lurus dengan kemiringan δzF / RT dan intercept dari
LNK (0). Kebalikan dari lereng memberikan perubahan tegangan membran yang
diperlukan untuk memberikan perubahan e-kali lipat dalam konstanta kesetimbangan.
Hal ini dapat dilihat bahwa kemiringan maksimum akan diperoleh ketika δ = 1.
Untuk blocker dengan satu biaya, ini akan memberikan kemiringan maksimum 25
mV untuk perubahan e-lipat sedangkan untuk ion divalen, kemiringan maksimum
akan 13 mV untuk perubahan e-lipat. Analisis ini diilustrasikan pada Gambar 6.7
untuk blok saluran reseptor NMDA oleh ion Mg2+.
Gambar 6.7A menunjukkan bahwa sebidang log k+B terhadap potensial
membran memberikan hubungan linier dengan kemiringan yang sesuai dengan δ =
0,76, sementara plot log k-B melawan potensial membran (Gambar 6.7B) juga linear
tetapi bukan sebagai tajam tegangan tergantung dengan δ = 0,21. Bagaimana
seharusnya hasil ini ditafsirkan? Mereka mungkin juga berarti bahwa hambatan
energi untuk Mg2+
mendekati tempat ikatannya dan disosiasi dari situs mengikat
kembali ke solusi ekstraseluler tidak simetris, atau bahwa proporsi Mg2+
ion
meninggalkan situs mengikat mereka dengan menyerap melalui saluran ke dalam
membran sel. Tegangan ketergantungan konstanta kesetimbangan, K+B, menunjukkan
bahwa afinitas Mg2+
untuk saluran tersebut curam tegangan tergantung dengan δ =
0,97, menyiratkan bahwa ion Mg2+
merasakan hampir 100% dari medan listrik
membran di situs mereka mengikat (Ascher dan Nowak, 1998).
Mengingat bahwa saluran blocking obat, menurut definisi, bertindak dalam
jalur perembesan saluran, tidaklah mengherankan untuk menemukan bahwa interaksi
antara obat saluran-blocking dan ion permeant normal dapat mempengaruhi perilaku
blocker saluran. Ini adalah kasus untuk reseptor NMDA, di mana pendudukan situs
mengikat ion permeant memiliki dampak yang signifikan terhadap ketergantungan
tegangan diamati Mg2+
blok. Antonov dan Johnson (1999) telah menunjukkan bahwa
mengambil efek ini mempertimbangkan menempatkan Mg2+
yang situs pengikatan
ion pada posisi yang lebih dangkal (δ = 0,47) dalam medan listrik membran, yang
konsisten dengan posisi yang diprediksikan dua asparagin residu dekat puncak loop
M2 dari subunit reseptor NMDA, yang telah diidentifikasi dari modifikasi struktural
reseptor NMDA sebagai penting bagi Mg2+
blok saluran.
Ketergantungan tegangan curam blok saluran mendasari peran penting yang
Mg2+
blok saluran NMDA memainkan dalam memberikan reseptor NMDA milik
menjadi "detektor kebetulan" dalam sistem saraf. Properti ini mungkin mendasari
perilaku Hebbian sinapsis rangsang di otak dan dapat, pada prinsipnya,
memungkinkan jaringan neuron untuk menyesuaikan perilaku mereka sesuai dengan
pengalaman, maka, pada dasarnya, properti ini memungkinkan sistem saraf untuk
belajar dari pengalaman. Sebuah simulasi efek Mg2+
blok pada kondisi mapan saat ini
melalui saluran reseptor NMDA diilustrasikan pada Gambar 6.7D. Hal ini dapat
dilihat bahwa hubungan linier antara potensial membran dan arus reseptor NMDA
menjadi curam tegangan tergantung dengan meningkatnya Mg2+
konsentrasi-tion.
Pada tingkat fisiologis Mg2+
(1 mM), arus melalui saluran meningkat antara -80 dan -
20 mV mV sebagai Mg2+
yang blok lega dengan depolarisasi. Hal ini penting untuk
menghargai bahwa jenis efek juga akan terjadi pada tingkat yang lebih besar atau
lebih kecil dengan obat yang bertindak untuk memblokir saluran ion dan membuat
memprediksi aksi saluran-blocking obat, terutama pada sistem saraf, sangat rumit.
Gambar 6.8 menunjukkan representasi diagram dari hambatan energi bahwa
obat saluran-blocking mungkin seharusnya untuk mengatasi untuk membuka situs
yang mengikat di dalam saluran. Diagram ini memungkinkan untuk kemungkinan
bahwa obat memblokir benar-benar bisa menembus channel setelah mengikat
daripada kembali setelah disosiasi ke sisi yang sama seperti yang mereka berasal.
Mekanisme umum dapat digunakan untuk menggambarkan saluran blok dari kedua
sisi membran, akses ke Reseptor Terkait dengan Saluran Ion: Mekanisme Aktivasi
dan Blok
GAMBAR 6.7 Analysis dari tegangan-ketergantungan dari blok saluran reseptor
NMDA oleh Mg2+
. (A) Saluran-blocking rate, k+B, Diperkirakan dari kemiringan
garis dipasang ke data pada Gambar 4A, diplot terhadap potensial membran. Garis
padat menunjukkan fit dari Pers. (6.48) ke data dengan δ = 0,76 (mencerminkan e-
lipat peningkatan menghalangi laju untuk setiap 16,6 mV hyperpolarization dari
potensial membran) dan tingkat memblokir 2,66 × 107M
-1 detik
-1 pada -60 mV. (B)
Saluran tingkat blokir, k-B, Diperkirakan sebagai rata-rata nilai disetiap Mg2+
konsentrasi, menunjukkan ketergantungan tegangan dangkal daripada saluran
memblokir tingkat. Itu garis utuh menunjukkan cocok dengan data dari Pers. (6.49)
dengan δ = 0,21 (mencerminkan peningkatan e-kali lipat dalam tingkat memblokir
untuk setiap hyperpolarization mV 61 dari potensial membran) dan menghalangi laju
2,66 × 107M
-1 detik
-1 di -60 MV. (C) Tegangan ketergantungan konstanta
kesetimbangan, KB, untuk blok saluran, dihitung dari rasio k-B / k+B. Garis padat
menunjukkan kecocokan data dengan Pers. (6.50) dengan δ = 0,97 dan
menggambarkan tegangan curam ketergantungan KB yang meningkatkan e-lipat
untuk setiap 13 depolarisasi mV. (D) Simulasi arus-tegangan Hubungan dengan
adanya saluran blok curam tegangan yang tergantung. Saat ini kontrol adalah linier
fungsi dari tegangan membran, namun, dengan adanya konsentrasi rendah (60 M)
atau fisiologis Konsentrasi (1 mM) Mg2+,
Arus melalui saluran rectifies tajam pada
potensial negatif, mencerminkan ketergantungan tegangan curam konstanta
kesetimbangan, KB situs pengikatan tergantung pada ketinggian hambatan energi
yang molekul obat harus menyeberang. Lebih umum, Gambar 6.8 membantu untuk
menggambarkan gagasan bahwa perbedaan antara permeasi dari ion melalui saluran
dan blok saluran mungkin salah satu derajat dan belum tentu sebuah refleksi dari
perbedaan mendasar dalam cara ion permeant atau blocker berinteraksi dengan
protein channel.
6.4 KESIMPULAN
Materi dalam bab ini telah berpusat di sekitar efek obat pada reseptor di ligand-
gated ion channel kelas. Secara khusus, tujuannya adalah untuk menekankan bahwa
pengobatan kuantitatif
GAMBAR 6.8 Tampil merupakan representasi dari model dua-energi-penghalang
yang dapat digunakan untuk menggambarkan energi hambatan obat saluran-blocking
mungkin harus diatasi untuk mencapai tempat ikatannya dalam saluran. Itu hambatan
ditampilkan sebagai simetris dalam kasus ini, meskipun mereka tidak perlu selalu
begitu, dalam hal ini δ Nilai untuk akses ke situs mengikat tidak akan sama besarnya
dengan δvalue untuk mengikat dan kembali ke sisi yang sama dari membran.
Diagram ini memungkinkan untuk kemungkinan bahwa obat memblokir benar-benar
bisa menembus channel setelah mengikat daripada kembali ke sisi yang sama dari
membran itu awalnya berasal. Mekanisme umum dapat digunakan untuk
menggambarkan saluran blok dari kedua sisi membran, akses ke situs mengikat
tergantung pada ketinggian hambatan energi bahwa obat harus menyeberang. Energi
bebas, G, ditampilkan relatif terhadap luar membran. Tingkat transisi k1, K-1, K2, dan
k-2 akan tergantung pada kedua ketinggian penghalang energi dan potensi membran
dan dapat dihitung sebagai dijelaskan dalam Hille (1992). (Diadaptasi dari Hille, B.,
Saluran ionik dari Membran bersemangat, 2nd ed., Sinauer, Sunderland, MD, 1992,
ara. 5, chap. 14.).
Dari beberapa mekanisme sederhana dapat memungkinkan prediksi
eksperimental diuji harus dibuat untuk efek dari obat dan perkiraan afinitas obat
untuk situs / situs di reseptor mengikat. Karena mengukur interaksi obat dengan
reseptor mereka di jantung kemajuan dalam devel-bangan obat selektif dan klasifikasi
reseptor, pendekatan ini kemungkinan akan terus menjadi bagian penting dari
farmakologi. Hal ini khususnya terjadi untuk studi saraf pusat sistem, di mana
membingungkan subtipe reseptor menunggu perkembangan subtipe-selektif obat
sehingga makna fungsional dan terapi reseptor ini keragaman dapat ditentukan.
6.5 MASALAH
Masalah 6.1
Sebuah percobaan di mana AchR ion-channel arus tunggal dicatat pada potensial
membran -60 mV menunjukkan bahwa durasi bukaan saluran individu mengikuti
eksponensial tunggal distribusi. Waktu rata-rata terbuka adalah 5,0 msec. Ketika
percobaan diulang di hadapan dari antagonis, obat B, dalam konsentrasi 10 µM,
ditemukan bahwa waktu buka rata-rata adalah dikurangi menjadi 2,5 msec dan bahwa
bukaan saluran disela oleh periode singkat menutup dengan berarti durasi 1,0 msec
sehingga bukaan dikelompokkan ke semburan. Ketika percobaan itu diulang pada
potensial membran dari -120 mV, waktu buka rata-rata adalah 10 msec dalam
ketiadaan obat B tetapi hanya 2 msec dalam kehadirannya, interupsi dari bukaan
saluran telah menjadi lagi, berlangsung 2 msec rata-rata pada -120 mV. Hasil ini
konsisten dengan obat B menjadi membuka channel blocker.
a. Hitung asosiasi mikroskopis dan konstanta laju disosiasi dan konstanta
kesetimbangan untuk aksi obat B.
b. Apa yang bisa Anda katakan tentang situs kemungkinan kerja obat B yang
diberikan bahwa obat memiliki muatan positif tunggal?
Petunjuk: Kebalikan dari mean negara individu adalah jumlah tingkat (dalam detik-1
)
untuk meninggalkan negara itu.
Masalah 6.2
Dengan reseptor nicotinic endplate telah menemukan bahwa, serta mengaktifkan
reseptor, asetil-choline (Ach) blok saluran ion. Sebuah mekanisme yang mungkin
untuk menggambarkan situasi ini (dengan asumsi Oleh karena itu untuk
kesederhanaan hanya mengikat agonis tunggal diperlukan untuk mengaktifkan
reseptor) mungkin:
a. Menyatakan semua asumsi Anda butuhkan untuk membuat, menurunkan
ekspresi untuk kesetimbangan hunian AR * negara (PAR *) Dalam Pers.
(6.51).
b. Tuliskan ekspresi untuk waktu buka rata-rata (τo) dan durasi rata-rata yang
diblokir negara (τb). (Petunjuk: rata-rata seumur hidup negara manapun
adalah sama dengan kebalikan dari jumlah tarif untuk meninggalkan negara
itu.) Dalam percobaan yang dirancang untuk menguji mekanisme dalam
skema (6.51), dua konsentrasi tinggi Ach (300 dan 800 µM) diuji dalam
single-channel rekaman percobaan, dan τo, τb, Dan saluran terbuka
probabilitas (Pterbuka) Diukur. Hasilnya adalah sebagai berikut:
c. Menggunakan plot 1/τo vs. [Ach], menghitung k-2 dan k+3. Selain itu, hitung k-
3 dari durasi penyumbatan (τb) dan kemudian menghitung konstanta
kesetimbangan (K3) untuk blok dari saluran oleh Ach. Dalam percobaan lain,
nilai 107
M-1
sec-1
, 104 sec
-1, dan 10
4 sec
-1 ditemukan untuk k
1, k
-1, dan k
2.
d. Menggunakan ekspresi yang Anda turunkan dalam (a), menghitung nominal
PAR * Anda harapkan pada 300 dan 800 mM Ach. Bagaimana hal ini
dibandingkan dengan p eksperimen diamati membuka diberikan dalam tabel
di atas? Sarankan alasan mengapa dihitung dan diamati p terbuka mungkin
berbeda.
Masalah 6.3
Sebuah mekanisme sederhana untuk antagonisme kompetitif dari ligand-gated ion-
channel reseptor akan sebagai berikut:
a. Turunkan ekspresi untuk hunian keseimbangan negara AR diberikan
konsentrasi antagonis [B] dan agonis [A] dan konstanta laju mikroskopis
mereka untuk asosiasi dan disosiasi dengan reseptor. Dalam sebuah percobaan
yang dirancang untuk mengukur k-B dan k+B, agonis itu diterapkan pada
konsentrasi 100 µM (konstanta kesetimbangan untuk agonis diketahui 11
µM). Kemudian, langkah perubahan dalam konsentrasi antagonis dibuat dari
nol sampai [B] dan kembali ke nol lagi. Pada penerapan antagonis, respon
diamati menurun (rileks) secara eksponensial menuju tingkat kondisi mapan
blok dengan waktu pada τ konstan. Jika diasumsikan bahwa equilibrium
dengan agonis jauh lebih cepat daripada equilibrium dengan antagonis, maka
relaksasi waktu τ konstan pada dapat ditampilkan untuk skema (6.52) yang
akan dijelaskan oleh persamaan:
dimana Pbebas adalah bagian dari reseptor di negara R sebelum antagonis yang
diterapkan. Antagonis itu diuji pada tiga konsentrasi dan hasilnya adalah
sebagai berikut:
b. Hitung tingkat mikroskopis konstanta k+B dan k-B dan KB konstanta
kesetimbangan. Menggunakan dan persamaan Anda diturunkan pada bagian
(a), menghitung blok persen diharapkan pada kesetimbangan untuk masing-
masing konsentrasi antagonis yang digunakan. Seberapa baik nilai-nilai
dihitung sesuai dengan mereka amati dalam eksperimen? Sarankan
kemungkinan alasan mengapa dihitung keseimbangan blok mungkin tidak
setuju dengan itu teramati dalam eksperimen. Jelaskan apa rekaman saluran
tunggal dari aktivitas reseptor akan terlihat seperti pada kesetimbangan di
hadapan agonis sendirian dan dengan adanya agonis ditambah antagonis.
6.6 BACAAN
Buku teks dengan materi yang relevan:
Hille, B., Ionic Channels of Excitable Membranes, 2nd ed., Sinauer, Sunderland, MD,
1992 (see chap. 7, Endplate channels and kinetics; chap. 15, Channel-block
mechanisms).
Ogden, D. C., Microelectrode Techniques: The Plymouth Workshop Handbook, 2nd
ed., The Company of Biologists, Ltd., Cambridge, U.K., 1994 (excellent
discussion of both methods and principles).
Sakmann, B. and Neher, E., Single Channel Recording, 2nd ed., Plenum Press, New
York, 1995 (many good articles that discuss methods and principles).
kertas asli:
Antonov S. M. and Johnson J. W., Permeant ion regulation of N-methyl-D-aspartate
receptor channel block by Mg(2+). Proc. Natl. Acad. Sci., 96, 14571Ŕ14576,
1999.
Ascher P. and Nowak L., The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate
responses of mouse central neurones in culture, J. Physiol., 399, 247Ŕ266,
1988.
Colquhoun, D., On the principles of postsynaptic action of neuromuscular blocking
agents, in New Neuro-muscular Blocking Agents, Kharkevich, D. A., Ed.,
SpringerŔVerlag, Berlin/New York, 1986.
Colquhoun, D. and Ogden, D. C., Activation of ion channels in the frog end-plate by
high concentrations of acetylcholine, J. Physiol., 395, 131Ŕ159, 1988.
Colquhoun, D. and Sakmann, B., Fluctuations in the microsecond time range of the
current through single acetylcholine receptor ion channels, Nature, 294, 464Ŕ
466, 1981. (The full version of this paper can be found in J. Physiol., 369,
501Ŕ557, 1985.)
Colquhoun, D., Dreyer, F., and Sheridan, R. E., The actions of tubocurarine at the
frog neuromuscular junction, J. Physiol., 293, 247Ŕ284, 1979. del Castillo, J.
and Katz, B., Interaction at endplate receptors between different choline
derivatives, Proc. Roy. Soc. London Ser. B, 146, 369Ŕ381, 1957.
Edmonds, B., Gibb, A. J., and Colquhoun, D., Mechanisms of activation of muscle
nicotinic acetylcholine receptors and the time course of endplate currents,
Annu. Rev. Physiol., 57, 469Ŕ493, 1995.
Katz, B. and Thesleff, S., A study of the Řdesensitizationř produced by acetylcholine
at the motor end-plate, J. Physiol.,138, 63Ŕ80, 1957.
Lingle, C. L., Maconochie, D., and Steinbach, J. H., Activation of skeletal muscle
nicotinic acetylcholine receptors, J. Memb. Biol., 126, 195Ŕ217, 1992
(excellent review of much of the evidence concerning the mechanism of
receptor activation).
MacDonald, J. F. and Nowak, L. M., Mechanisms of blockade of excitatory amino
acid receptor channels, TIPS, 11(4), 167Ŕ172, 1990.
Neher, E., The charge carried by single-channel currents of rat cultured muscle cells
in the presence of local anaesthetics. J. Physiol., 339, 663Ŕ678, 1983.
Rang, H. P. and Ritter, J. M., On the mechanism of desensitization at cholinergic
receptors, Mol. Pharmacol., 6, 357Ŕ382, 1970.
Triggle, D. J., Desensitization, Trends Pharmacol. Sci.,14, 395Ŕ398, 1980.
Unwin, N., Neurotransmitter action: opening of ligand-gated ion channels, Neuron,
10 (Suppl. 1), 31Ŕ41, 1993.
Unwin, N., Projection structure of the nicotinic acetylcholine receptor: distinct
conformations of the alpha subunits, J. Mol. Biol., 257, 586Ŕ596, 1996.
6.7 SOLUSI UNTUK MASALAH
Masalah 6.1
Perhatikan bahwa masalah menyatakan bahwa distribusi kali terbuka adalah
eksponensial tunggal. Ini memberitahu Anda bahwa mekanisme yang berisi keadaan
terbuka tunggal reseptor dapat menggambarkan data. Menggunakan petunjuk di atas,
tingkat penutupan saluran (panggilan α ini) karena itu adalah kebalikan dari waktu
rata-rata terbuka. Dengan demikian, pada -60 mV, α = 1/5 msec, atau 200 detik-1
,
pada -120 mV, α = 1/10 msec, atau 100 detik-1
. Hal ini menunjukkan bahwa saluran
penutupan perubahan konformasi dipengaruhi oleh medan listrik melintasi membran.
Di hadapan obat B, durasi rata-rata penyumbatan (dengan asumsi keadaan
diblokir tunggal) akan menjadi kebalikan dari tingkat untuk meninggalkan negara
diblokir (katakanlah, k-B). Dengan demikian, pada -60 mV, k-B = 1/1.0 msec, atau
1000 detik-1
, pada -120 mV, k-B = 1/2.0 msec, atau 500 detik-1
. Rupanya, laju
disosiasi obat B dari saluran diperlambat ketika potensi membran dibuat lebih negatif.
Untuk obat bermuatan positif, ini merupakan temuan umum dan menunjukkan obat
ini mengikat dalam medan listrik membran. Namun, bisa juga bahwa perubahan
potensial membran telah mengubah protein konformasi reseptor dan dengan demikian
mempengaruhi pengikatan obat pada reseptor.
Untuk menghitung tingkat asosiasi mikroskopis untuk obat B, gunakan
petunjuk di atas untuk menunjukkan bahwa waktu rata-rata terbuka di hadapan obat B
akan sama dengan 1 / (α + [B] k+B). Jadi, kebalikan dari waktu rata-rata terbuka di
hadapan obat B akan sama dengan (α + [B] k+B), jadi (α + [B] k+B) = 400 detik-1
pada
-60 mV dan 500 detik-1
pada -120 mV. adalah 200 detik-1
pada -60 mV dan 100 detik-
1 pada -120 mV, jadi [B] k+B = 200 detik
-1 pada -60 mV dan 400 detik
-1 pada -120
mV. Membagi angka-angka ini dengan [B] memberikan k+B = 2 × 107 M
-1 sec
-1 pada
-60 mV dan 4 × 107
M -1
sec-1
pada -120 mV. Konstanta kesetimbangan, oleh karena
itu, 50 µM di -60 mV dan 12,5 pM pada -120 mV.
Jika ketergantungan tegangan k+B digambarkan oleh Persamaan. (6.48), maka
plot ln (k+B(V)) vs potensial membran (V) akan menjadi garis lurus dengan
kemiringan -δzF/RT. Dalam hal ini, kemiringan plot ini adalah -11,6 V-1
, dan timbal
balik ini menunjukkan peningkatan yang kali lipat k+B untuk setiap hyperpolarization
0.086-V (86 mV) dari potensial membran. Pada suhu kamar (293 K), F / RT = 39,6
V-1, maka untuk obat dengan satu muatan positif, δ = 11.6/39.6 = 0,29, menunjukkan
bahwa saat berada di tempat ikatannya, obat telah melewati 29% dari medan listrik
membran (catatan bahwa ini mungkin tidak sama dengan 29% dari jarak melintasi
membran, sebagai medan listrik membran tidak mungkin jatuh linear seluruh protein
channel).
Perlu diperhatikan bahwa dalam contoh ini kemiringan hubungan antara
potensial membran dan ln (k-B) adalah sama besarnya tetapi berlawanan tanda bahwa
untuk k+B dan δ = 0,58 untuk ketergantungan tegangan KB, seperti yang diharapkan
jika melintasi blocker penghalang energi simetris (Gambar 6.8) ketika keluar dari
saluran seperti ketika memblokir saluran. Sebuah ketergantungan tegangan untuk k-B
dari tanda yang sama seperti untuk k+B akan menyarankan bahwa blokir terjadi oleh
perembesan blocker ke sisi lain dari saluran. Perbedaan antara besaran δ untuk k+B
dan k-B bisa berarti bahwa energi penghalang untuk akses ke dalam dan keluar dari
saluran tidak simetris atau bisa berarti bahwa obat itu sebagian menembus saluran
dan sebagian keluar kembali ke luar membran.
Masalah 6.2
Untuk bagian (a), menganggap bahwa sistem ini pada kesetimbangan dan
bahwa hukum aksi massa memegang. Gunakan prosedur yang dijelaskan dalam Bab
1 untuk menurunkan ekspresi untuk PAR* pada kesetimbangan. Pada keseimbangan,
tingkat maju dan mundur untuk setiap reaksi dalam mekanisme harus sama. Tingkat
maju dan mundur didefinisikan menggunakan hukum aksi massa:
Untuk bagian (c), 1/τo = 5000 sec-1
ketika [Ach] = 300 M dan 1/τo = 10000
detik-1
ketika [Ach] = 800 pM. Dari jawaban untuk bagian (b), kita tahu bahwa 1/τo =
(k-2 + [A] k+3). Ini memiliki bentuk garis lurus dengan kemiringan k+3 dan mencegat
k-2 ketika 1/τo diplot terhadap [A]. Dengan demikian, kemiringan k+3 = (10.000-5.000
detik-1) / (800-300 M) = 107M
-1 detik
-1. Mencegat adalah k-2 = 2000 detik
-1. Tingkat
disosiasi blocker adalah k-3 = 1/40 κ detik = 25.000 detik-1
. Konstan untuk blok kanal
keseimbangan Oleh karena itu, K3 = k-3 / k+3 = 2,5 mM.
Untuk bagian (d), mengganti ke dalam Pers. (6.55) memungkinkan hunian
kesetimbangan AR* menjadi dihitung pada 300 dan 800 mM Ach. Hasilnya 0.503
dan 0.565, masing-masing. Oleh karena itu, pada 300 M, dihitung PAR* dekat dengan
yang teramati dalam eksperimen. Namun, pada 800 M, dihitung PAR* lebih tinggi dari
yang diamati. Alasan untuk hasil ini termasuk kemungkinan bahwa Desen sitization
mempengaruhi p terbuka pada tinggi [A]. Selain itu, mekanisme yang digunakan
untuk menurunkan persamaan. (6.55) mungkin tidak benar (seperti yang akan terjadi
jika keadaan peka harus ditambahkan ke mekanisme).
Masalah 6.3
Untuk bagian (a), derivasi dari sebuah ekspresi untuk PAR di hadapan antagonis,
B, dicapai dengan menggunakan prosedur standar. Hasilnya diberikan dalam Pers.
(6.59):
Untuk bagian (b), sebidang kebalikan dari τ pada dengan [B] akan menjadi
garis lurus dengan kemiringan Pbebas k+B dan sumbu y intercept k-B. Menggunakan
data dalam tabel, lereng ditemukan menjadi 2 × 105 M
-1 detik
-1 dan mencegat 1 detik
-
1. Pbebas adalah 1 - PAR tanpa adanya antagonis. Dengan demikian, Pbebas= KA / ([A] +
KA) = 0,1. Sebagai Pbebas k+B = kemiringan, k+B = kemiringan / Pbebas = 2×106 M
-1 sec
-
1 konstanta kesetimbangan KB = k-B / k+B = 0,5 × 10
-6M. Akhirnya, menghitung PAR
dalam ketiadaan antagonis dan kemudian di hadapan masing-masing [B] dan
kemudian menggunakan hasil ini untuk menghitung persentase blok diproduksi pada
kesetimbangan oleh masing-masing antagonis konsentrasi. Ketika [A] = 100 M, KA =
11 M, Par = 0,9 dengan tidak adanya antagonis, dengan KB = 0,5 M dan [B] = 7,5 M,
dan Par = 0,36. The persen blok sama dengan (0,9-0,36) / 0,9 × 100 = 60%. Ketika
[B] = 20 M, Par = 0,191 dan blok persen adalah 79%. Ketika [B] = 45 M, Par = 0.098
dan blok persen adalah 89%.
Nilai-nilai dihitung untuk persen blok yang dekat dengan yang diamati pada
konsentrasi rendah blocker, tetapi pada konsentrasi yang lebih tinggi blok teramati
lebih dari yang diperkirakan. Kemungkinan alasan untuk ini mungkin terletak pada
pengukuran konstanta waktu onset atau asumsi tentang agonis menyeimbangkan jauh
lebih cepat daripada antagonis, atau mekanisme mungkin salah, mungkin karena
reseptor memiliki lebih dari satu situs mengikat atau pengikatan antagonis
mempromosikan desenssitisasi reseptor.
Dengan asumsi menyederhanakan dari β kecil ', jumlah dan produk dari
konstanta laju yang diukur dalam percobaan dapat digunakan untuk menghitung k-B
dan k + B jika α diketahui dari percobaan tanpa adanya blocker. Hal ini hanya
dilakukan dengan memetakan jumlah atau produk dari konstanta kecepatan diukur
terhadap konsentrasi blocker. Dari Persamaan. (6.32) di atas, produk dari konstanta
laju harus independen dari konsentrasi blocker dengan nilai sama dengan αk-B,
sedangkan jumlah dari konstanta laju (Persamaan (6.31)) akan memberikan garis
lurus dengan kemiringan sama dengan k + B dan intercept dari α + k-B.
Jika data eksperimen konsisten dengan prediksi tersebut, maka titik data diplot
dengan cara ini harus berada pada garis lurus, dan ini adalah bukti kuat bahwa
mekanisme kerja obat ini adalah untuk memblokir saluran ion terbuka. Asumsi bahwa
β 'sangat kecil telah digunakan ketika mempelajari efek dari saluran blocker pada arus
sinaptik, sebagai konsentrasi pemancar (dan karenanya pA2R) mungkin kecil selama
fase pembusukan arus. Selama percobaan analisis kebisingan, konsentrasi agonis
rendah digunakan sehingga, sekali lagi, kondisi ini β 'harus kecil.
6.3.5 SIGNAL BLOK DI EKUILIBRIUM
Hubungan antara Popen (Pkontrol) dan konsentrasi agonis untuk mekanisme situs
pengikatan dua agonis diberikan dalam Pers. (6.4) dan direproduksi di bawah ini
dalam bentuk yang sedikit berbeda:
(6.33)
Ketika blocker saluran terbuka yang ditambahkan, Popen di hadapan blocker
(Pblockers). Berikut ini adalah fungsi dari kedua agonis (A) dan (B) Konsentrasi
blocker:
(6.34)
Mengambil rasio Pcontrol / Pblockers memberikan hasil sederhana ini:
(6.35)
Karena saat ini tercatat dalam percobaan voltage clamp, tegangan berbanding
lurus dengan saluran Popen, rasio lancar tanpa adanya blocker untuk saat ini
meningkatkan konsentrasi blocker dapat digunakan untuk menghitung KB. Desain
eksperimen ini dimaksudkan untuk mendapatkan respon yang cukup besar untuk
agonis sendirian dan kemudian menghitung rasio ini respon kontrol untuk tanggapan
terhadap konsentrasi yang sama agonis dengan adanya peningkatan konsentrasi
channel blocker. Rasio Pcontrol / Pblockers ketika diplot terhadap [B] akan menjadi garis
lurus yang memotong sumbu y pada 1 dan memiliki kemiringan Pcontrol / KB. Jika
Pcontrol = 1, maka lereng = 1/KB. Jika Pcontrol dikenal untuk konsentrasi agonis
tertentu, maka jelas KB masih bisa diperkirakan. Jika kita asumsikan Pcontrol = 1,
maka KB dihitung akan lebih besar daripada KB benar: misalnya, dengan faktor 2
jika Pcontrol = 0,5 dan dengan faktor 10 jika Pcontrol = 0,1.
6.3.6 TUNGGAL-CHANNEL ANALISIS CHANNEL BLOK
Berikut adalah garis besar dari beberapa informasi yang dapat diperoleh dari
data single-channel menggunakan pengukuran yang cukup sederhana seperti waktu
buka rata-rata dan rata-rata waktu menutup. Analisis ini diilustrasikan pada Gambar
6.6 untuk blok saluran reseptor NMDA oleh ion Mg2 +.
6.3.6.1 Waktu Buka
Saluran blocker akan menghasilkan pengurangan waktu buka rata-rata dari:
(6.36)
dalam kontrol ke :
(6.37)
di hadapan blocker, dihitung dari aturan bahwa mean setiap negara adalah sama
dengan kebalikan dari jumlah tarif untuk meninggalkan bahwa negara (Colquhoun
dan Hawkes, 1982). Sebuah plot 1 / τ terhadap [B] harus, karena itu, memberikan
garis lurus dengan kemiringan k + B. Ini diilustrasikan pada Gambar 6.6C, di mana
untuk berbagai potensi membran dan Mg2 + konsentrasi saluran NMDA terbalik
berarti waktu terbuka berikut hubungan linier, memberikan k + nilai B dalam kisaran
6,6 × 106 M-1sec-1 pada -40 mV menjadi 8,4 × 107 M-1sec-1 pada -80 mV.
6.3.6.2 Waktu Tertutup
Periode tertutup karena penyumbatan saluran miliki, dari aturan yang sama,
seumur hidup rata-rata:
(6.38)
Perhatikan bahwa durasi saluran penyumbatan diprediksi akan menjadi
independen dari konsentrasi blocker, seperti digambarkan pada Gambar 6.6D, dimana
durasi penyumbatan tidak menunjukkan ketergantungan jelas pada Mg2 +
konsentrasi.
6.3.6.3 Penyumbatan Frekuensi
Frekuensi penyumbatan, per detik waktu buka, adalah k + B [B], sehingga
jumlah rata-rata penyumbatan pada setiap pembukaan saluran hanya frekuensi
penyumbatan dikalikan dengan waktu buka rata-rata:
(6.39)
6.3.6.4 Semburan Pembukaan
Dimana blocker saluran mengkonversi bukaan tunggal ke semburan jelas
(misalnya, blok anestesi lokal saluran nikotin), rata-rata jumlah bukaan per meledak
adalah salah satu lebih dari jumlah rata-rata kesenjangan (penyumbatan):
GAMBAR 6.6 Single - analisis saluran ion-blok saluran. Rekaman Perwakilan
arus single-channel melalui saluran reseptor NMDA tercatat diilustrasikan pada
potensial membran -20 mV, -50 mV, dan -80 mV dalam rekaman kontrol (A) dan di
hadapan magnesium 40-M (B). Yang cepat dan blokir memblokir saluran terutama
terlihat pada tegangan lebih negatif. Invers berarti waktu terbuka dan durasi rata-rata
kebalikan dari penutupan saluran tambahan yang disebabkan oleh Mg2+
diplot
terhadap Mg2+
konsentrasi (C) dan (D). Hasil ini mengkonfirmasi hubungan linier
antara konsentrasi Mg2+
dan terbalik berarti waktu terbuka dan kurangnya Mg2+
ketergantungan konsentrasi saluran diprediksi oleh sederhana saluran terbuka
menghambat mekanisme. Garis solid dalam (C) menggambarkan regresi linier dari
data yang tercatat pada setiap potensial membran. Lereng garis ini memberikan
perkiraan nilai k + B dari 6,6, 15,7, 26,6, 40,4, dan 84,0 × 106 M-1 detik-1 di -40 -, -
50 -, -60 -, -70 -, dan-80-mV potensial membran.
(6.40)
Perhatikan bahwa total rata-rata terbuka waktu per meledak akan:
(6.41)
(6.42)
(6.43)
Ini adalah hasil yang penting. Mekanisme terbuka-saluran blok sederhana
memprediksi bahwa total waktu per meledak terbuka adalah sama dengan waktu buka
rata-rata dalam ketiadaan blocker (Neher, 1983), meskipun bukaan sekarang
dicincang oleh penyumbatan saluran. Bahkan, untuk saluran yang memberikan
semburan bukaan di rekaman kontrol, total terbuka waktu per burst konstan dalam
ada atau tidaknya blocker.
Hasil ini juga penting karena menunjukkan bahwa blocker saluran terbuka
sederhana tidak mengurangi muatan melewati saluran selama setiap aktivasi sehingga
mereka tidak akan mengurangi biaya disuntikkan pada sinaps oleh arus sinaptik.
Sebaliknya, mereka memperpanjang waktu di mana muatan disuntikkan, yang dapat
memiliki efek yang cukup dramatis pada transmisi sinaptik.
6.3.6.5 Burst Panjang
Panjang rata-rata burst ditemukan seperti berikut:
Jadi plot panjang burst rata vs [B] akan memberikan garis lurus dari intercept 1
/ α dan kemiringan 1 / (αKB).
6.3.7 WAKTU SKALA CHANNEL BLOK
Channel blocker sering diklasifikasikan sebagai lambat, menengah, atau cepat
blocker, berdasarkan rentang yang sangat luas nilai-nilai yang telah ditemukan untuk
tingkat mikroskopis disosiasi konstan yang berbeda channel blocker. Hampir semua
channel blockers telah ditemukan memiliki konstanta laju asosiasi mikroskopis (k +
B) dalam kisaran sekitar 107 M-1sec-1. Sebaliknya, konstanta laju disosiasi
mikroskopis (k-B) rentang selama beberapa kali lipat dari sekitar 105 detik-1
(misalnya, blok saluran reseptor nicotinic oleh Ach) untuk 0,01 detik-1 untuk MK-
801 (dizocilpine) blok NMDA saluran. Rata-rata panjang kesenjangan penyumbatan
sehingga dapat berkisar dari 10 κsec hingga 100 detik. Hanya ketika penyumbatan
berada di kisaran menengah, pada urutan 1 msec dalam durasi, bahwa kesenjangan
mudah terdeteksi dalam rekaman single-channel. Jika blocker adalah blocker lambat
dengan kesenjangan penyumbatan sangat panjang, catatan data yang tampak seolah-
olah frekuensi bukaan saluran mengalami penurunan. Jika blocker cepat, amplitudo
single-channel muncul menurun karena memblokir dan blokir terlalu cepat untuk
diselesaikan.
6.3.8 PENGGUNAAN KETERGANTUNGAN DARI BLOCKERS CHANNEL
Ini mengikuti dari kenyataan bahwa blocker diasumsikan mengikat hanya
kepada negara diaktifkan dari saluran yang tingkat blok akan tidak hanya tergantung
konsentrasi tetapi juga menggunakan bergantung, dalam kata lain, semakin banyak
saluran yang diaktifkan, maka akan semakin tersumbat.
Ini mengikuti dari pembahasan di atas pada skala waktu blok saluran bahwa
tingkat penggunaan ketergantungan akan sangat tergantung pada mikroskopis
disosiasi laju yang konstan. Lambat blocker menunjukkan penggunaan
ketergantungan ekstrim, yang ditambah dengan blocker menampilkan fenomena
perangkap. Trapping terjadi ketika saluran dapat menutup dan agonis memisahkan
dengan blocker masih terikat dalam saluran. Blocker tersebut kemudian terjebak
dalam saluran sampai waktu berikutnya reseptor diaktifkan. Contoh penting dari blok
menjebak termasuk aksi hexamethonium di ganglia otonom dan blok dari reseptor
NMDA oleh saluran mk801 atau ketamin obat bius.
6.3.9 KETERGANTUNGAN TEGANGAN DARI BLOK CHANNEL
Salah satu hasil yang menarik yang timbul dari percobaan tegangan klem dini
dengan obat saluran-blocking adalah bahwa potensi blocker itu tergantung pada
tegangan membran. Sebaliknya, ini ditemukan tidak menjadi kasus untuk
antagonisme kompetitif pada reseptor nicotinic endplate (Gambar 6.5). Hasil ini
diinterpretasikan sebagai indikasi bahwa situs asetilkolin mengikat reseptor (dan
karena itu blok kompetitif di situs tersebut oleh tubocurarine) tidak dipengaruhi oleh
potensi perbedaan melintasi membran, padahal jika mengikat dipengaruhi oleh
potensial membran, maka situs pengikatan harus berada pada daerah dari protein
yang merupakan bagian dari jalan melintasi medan listrik dari membran.
Pengikatan obat dikenakan pada situs dalam medan listrik akan dipengaruhi
oleh bahan kimia interaksi (seperti ikatan hidrogen, umum untuk semua interaksi
obat-reseptor) dan oleh medan listrik dan muatan pada obat.
Konstanta laju mikroskopis untuk asosiasi dan disosiasi pada situs dalam
medan listrik (untuk blok oleh obat dibebankan) adalah fungsi eksponensial dari
tegangan membran:
(6.48)
(6.49)
Di sini, δ mengacu pada sebagian kecil dari tegangan membran bahwa indera
obat memblokir di situs pengikatan, dan tanda di δ ditentukan oleh apakah obat
memblokir mendekati situs pengikatan dari dalam atau di luar membran. Seperti yang
diungkapkan di sini, persamaan ini menggambarkan konstanta laju untuk blok dari
luar. Valensi obat memblokir diberikan sebagai z, dan F, R, dan T adalah konstanta
Faraday (9,65 × 104 C mol-1), tetapan gas (8.32 JK-1 mol-1), dan suhu mutlak (293
K pada suhu kamar), masing-masing. Tegangan ketergantungan konstanta
kesetimbangan disosiasi diberikan oleh:
(6.50)
Dari hubungan ini dapat dilihat bahwa plot semilog dari LNK (V) vs potensial
membran akan memberikan garis lurus dengan kemiringan δzF / RT dan intercept
dari LNK (0). Kebalikan dari lereng memberikan perubahan tegangan membran yang
diperlukan untuk memberikan perubahan e-kali lipat dalam konstanta kesetimbangan.
Hal ini dapat dilihat bahwa kemiringan maksimum akan diperoleh ketika δ = 1.
Untuk blocker dengan satu biaya, ini akan memberikan kemiringan maksimum 25
mV untuk perubahan e-lipat sedangkan untuk ion divalen, kemiringan maksimum
akan 13 mV untuk perubahan e-lipat. Analisis ini diilustrasikan pada Gambar 6.7
untuk blok saluran reseptor NMDA oleh ion Mg2+
.
Gambar 6.7A menunjukkan bahwa sebidang log k + B terhadap potensial
membran memberikan hubungan linier dengan kemiringan yang sesuai dengan δ =
0,76, sementara plot log k-B melawan potensial membran (Gambar 6.7B) juga linear
tetapi bukan sebagai tajam tegangan tergantung dengan δ = 0,21. Bagaimana
seharusnya hasil ini ditafsirkan? Mereka mungkin juga berarti bahwa hambatan
energi untuk Mg2+
mendekati tempat ikatannya dan disosiasi dari situs mengikat
kembali ke solusi ekstraseluler tidak simetris, atau bahwa proporsi ion Mg2+
meninggalkan situs mengikat mereka dengan menyerap melalui saluran ke bagian
dalam membran sel. Tegangan ketergantungan konstanta kesetimbangan, K + B,
menunjukkan bahwa afinitas Mg2+
untuk saluran tersebut curam tegangan tergantung
dengan δ = 0,97, menyiratkan bahwa ion Mg2+
merasakan hampir 100% dari medan
listrik membran di situs mereka mengikat (Ascher dan Nowak, 1998).
Mengingat bahwa saluran blocking obat, menurut definisi, bertindak dalam
jalur perembesan saluran, tidaklah mengherankan untuk menemukan bahwa interaksi
antara obat saluran-blocking dan ion permeant normal dapat mempengaruhi perilaku
blocker saluran. Ini adalah kasus untuk reseptor NMDA, di mana pendudukan situs
mengikat ion permeant memiliki dampak yang signifikan terhadap ketergantungan
tegangan diamati blok Mg2+
. Antonov dan Johnson (1999) telah menunjukkan bahwa
mengambil efek ini mempertimbangkan menempatkan situs pengikatan ion Mg2+
pada posisi yang lebih dangkal (δ = 0,47) dalam medan listrik membran, yang
konsisten dengan posisi yang diprediksikan dua asparagin residu dekat puncak dari
loop M2 dari subunit reseptor NMDA, yang telah diidentifikasi dari modifikasi
struktural reseptor NMDA sebagai penting bagi blok saluran Mg2+
.
Ketergantungan tegangan curam blok saluran mendasari peran penting yang
Mg2+
blok saluran NMDA bermain dalam memberikan reseptor NMDA milik
menjadi "coincidence detectors" dalam sistem saraf. Properti ini mungkin mendasari
perilaku Hebbian sinapsis rangsang di otak dan dapat, pada prinsipnya,
memungkinkan jaringan neuron untuk menyesuaikan perilaku mereka sesuai dengan
pengalaman, maka, pada dasarnya, properti ini memungkinkan sistem saraf untuk
belajar dari pengalaman. Sebuah simulasi pengaruh Mg2+
blok pada kondisi mapan
saat ini melalui saluran reseptor NMDA diilustrasikan pada Gambar 6.7D. Hal ini
dapat dilihat bahwa hubungan linier antara potensial membran
dan arus reseptor NMDA menjadi curam tegangan tergantung dengan meningkatnya
konsentrasi Mg2+
. Pada tingkat fisiologis Mg2+
(1 mM), arus melalui saluran
meningkat antara -80 dan -20 mV mV sebagai Mg2+
yang blok lega dengan
depolarisasi. Hal ini penting untuk menghargai bahwa jenis efek juga akan terjadi
pada tingkat yang lebih besar atau lebih kecil dengan obat yang bertindak untuk
memblokir saluran ion dan membuat memprediksi aksi saluran-blocking obat,
terutama pada sistem saraf, sangat rumit.
Gambar 6.8 menunjukkan representasi diagram dari hambatan energi bahwa
obat saluran-block mungkin seharusnya untuk mengatasi untuk membuka situs yang
mengikat di dalam saluran. Diagram ini memungkinkan untuk kemungkinan bahwa
obat memblokir benar-benar bisa menembus channel setelah mengikat daripada
kembali setelah disosiasi ke sisi yang sama seperti yang mereka berasal. Mekanisme
umum dapat digunakan untuk menggambarkan saluran blok dari kedua sisi membran,
akses ke
GAMBAR 6.7 Analisis tegangan-ketergantungan dari blok saluran reseptor NMDA
oleh Mg2. (A) Saluran-blocking rate, k B, diperkirakan dari kemiringan garis
dipasang ke data pada Gambar 4A, diplot terhadap potensial membran. Garis padat
menunjukkan fit dari Pers. (6.48) ke data dengan δ = 0,76 (mencerminkan
peningkatan e-kali lipat dalam menghalangi laju untuk setiap 16,6 mV
hyperpolarization dari potensial membran) dan menghalangi laju 2,66 × 107 M-1
detik-1 pada -60 mV. (B) Saluran tingkat blokir, k-B, diperkirakan sebagai rata-rata
nilai-nilai pada setiap konsentrasi Mg2, menunjukkan ketergantungan tegangan
dangkal daripada saluran memblokir tingkat. Garis padat menunjukkan cocok dengan
data dari Pers. (6.49) dengan δ = 0,21 (mencerminkan peningkatan e-kali lipat dalam
tingkat memblokir untuk setiap hyperpolarization mV 61 dari potensial membran)
dan menghalangi laju 2,66 × 107 M-1 detik-1 pada -60 mV. (C) Tegangan
ketergantungan konstanta kesetimbangan, KB, untuk blok saluran, dihitung dari rasio
k-B / k B. Garis padat menunjukkan kecocokan data dengan Persamaan (6.50) dengan
δ=0,97 dan menggambarkan tegangan curam ketergantungan KB yang meningkatkan
e-lipat untuk setiap 13 depolarisasi mV. (D) Hubungan simulasi arus-tegangan
dengan adanya saluran blok curam tegangan yang tergantung. Saat ini kontrol adalah
fungsi linier dari tegangan membran, namun, dengan adanya konsentrasi rendah (60
M) atau konsentrasi fisiologis (1 mM) dari Mg2, arus melalui saluran rectifies tajam
pada potensial negatif, mencerminkan curam tegangan ketergantungan konstanta
kesetimbangan, KB. Sisi pengikatan tergantung pada ketinggian hambatan energi
yang molekul obat harus menyeberang. Lebih umum, Gambar 6.8 membantu untuk
menggambarkan gagasan bahwa perbedaan antara perembesan ion melalui saluran
dan blok saluran mungkin salah satu derajat dan belum tentu cerminan dari adanya
perbedaan mendasar dalam cara ion permeant atau blocker berinteraksi dengan
jaringan protein.
6.4 KESIMPULAN
Materi dalam bab ini telah berpusat di sekitar efek obat pada reseptor di ligan
ion kelas channel. Secara khusus, tujuannya adalah untuk menekankan bahwa
pengobatan kuantitatif
GAMBAR 6.8 Tampil merupakan representasi dari model dua-energi-penghalang
yang dapat digunakan untuk menggambarkan hambatan energi obat saluran-blocking
mungkin harus diatasi untuk mencapai tempat ikatannya dalam saluran. Hambatan
ditampilkan sebagai simetris dalam kasus ini, meskipun mereka tidak perlu selalu
begitu, dalam hal nilai δ untuk akses ke situs mengikat tidak akan sama besarnya
dengan nilai δ untuk mengikat dan kembali ke sisi yang sama dari membran. Diagram
ini memungkinkan untuk kemungkinan bahwa obat memblokir benar-benar bisa
menembus channel setelah mengikat daripada kembali ke sisi yang sama dari
membran itu awalnya datang dari. Mekanisme umum dapat digunakan untuk
menggambarkan saluran blok dari kedua sisi membran, akses ke situs mengikat
tergantung pada ketinggian hambatan energi bahwa obat harus menyeberang. Energi
bebas, G, ditampilkan relatif terhadap luar membran. Tingkat transisi k1, k-1, k2, dan
k-2 akan tergantung pada kedua ketinggian penghalang energi dan potensi membran
dan dapat dihitung seperti yang dijelaskan di Hille (1992). (Diadaptasi dari Hille, B.,
Saluran ionik dari Membran bersemangat, 2nd ed., Sinauer, Sunderland, MD, 1992,
ara. 5, bab. 14.)
dari beberapa mekanisme sederhana dapat memungkinkan prediksi eksperimental
diuji harus dibuat untuk efek obat dan perkiraan afinitas obat untuk situs / situs di
reseptor mengikat. Karena mengukur interaksi obat dengan reseptor mereka di
jantung kemajuan dalam pengembangan obat selektif dan klasifikasi reseptor,
pendekatan ini kemungkinan akan terus menjadi bagian penting dari farmakologi. Hal
ini khususnya terjadi untuk studi dari sistem saraf pusat, mana membingungkan
subtipe reseptor menunggu perkembangan subtipe-selektif obat sehingga makna
fungsional dan terapi reseptor ini keragaman dapat ditentukan.
6.5 SOAL
Soal 6.1
Sebuah percobaan di mana AchR ion-channel arus tunggal dicatat pada
potensial membran -60 mV menunjukkan bahwa durasi bukaan saluran individu
mengikuti distribusi eksponensial tunggal. Waktu rata-rata terbuka adalah 5,0 msec.
Ketika percobaan diulang di hadapan antagonis, obat B, dengan konsentrasi 10 M,
ditemukan bahwa waktu buka rata-rata berkurang menjadi 2,5 msec dan bahwa
bukaan saluran disela oleh periode menutup singkat dengan durasi rata-rata 1,0 msec
sehingga bukaan dikelompokkan ke semburan. Ketika percobaan diulang pada
potensial membran dari -120 mV, waktu buka rata-rata adalah 10 msec dalam
ketiadaan obat B tetapi hanya 2 msec dalam kehadirannya, interupsi dari bukaan
saluran telah menjadi lebih lama, berlangsung 2 msec rata-rata pada -120 mV. Hasil
ini konsisten dengan obat B menjadi blocker saluran terbuka.
a. Hitung asosiasi mikroskopis dan konstanta laju disosiasi dan konstanta
kesetimbangan untuk aksi obat B
b. Apa yang bisa Anda katakan tentang situs kemungkinan kerja obat B yang
diberikan bahwa obat memiliki muatan positif tunggal?
Petunjuk: Kebalikan dari mean negara individu adalah jumlah tingkat (dalam
detik-1) untuk meninggalkan negara itu.
Soal 6.2
Dengan reseptor nicotinic endplate telah menemukan bahwa pengaktifan
reseptor, asetilkolin (Ach) blok saluran ion. Sebuah mekanisme yang mungkin untuk
menggambarkan situasi ini (dengan asumsi untuk kesederhanaan hanya mengikat
agonis tunggal diperlukan untuk mengaktifkan reseptor) karena mungkin:
(6.51)
a. Menyatakan semua asumsi Anda butuhkan untuk membuat, menurunkan ekspresi
untuk kesetimbangan hunian AR * negara (PAR *) dalam Pers. (6.51).
b. Tuliskan ekspresi untuk waktu buka rata-rata (τo) dan rata-rata durasi keadaan
diblokir (τb). (Petunjuk: rata-rata seumur hidup negara manapun adalah sama
dengan kebalikan dari jumlah tarif untuk meninggalkan negara itu.) Dalam
percobaan yang dirancang untuk menguji mekanisme dalam skema (6.51), dua
konsentrasi tinggi Ach (300 dan 800 M) diuji dalam eksperimen single-channel
rekaman, dan τo, τb, dan saluran terbuka probabilitas (popen) diukur. Hasilnya
adalah sebagai berikut: NIST mengikat diperlukan untuk mengaktifkan reseptor)
karena mungkin:
c. Menggunakan plot 1/τo vs [Ach], menghitung k-2 dan k +3. Selain itu, hitung k-3
dari durasi penyumbatan (τb) dan kemudian menghitung konstanta kesetimbangan
(K3) untuk blok saluran oleh Ach. Dalam percobaan lain, nilai 107 M-1 detik-1,
104 detik-1, dan 104 detik-1 ditemukan untuk k +1, k-1, dan k +2.
d. Menggunakan ekspresi yang Anda diturunkan dalam (a), menghitung nominal*
Anda harapkan pada 300 dan 800 mM Ach. Bagaimana hal ini dibandingkan
dengan popen eksperimen diamati diberikan dalam tabel di atas? Sarankan alasan
mengapa popen dihitung dan diamati mungkin berbeda.
Soal 6.3
Sebuah mekanisme sederhana untuk antagonisme kompetitif dari ligand-gated
ion-channel reseptor akan menjadi sebagai berikut:
(6.52)
7 G-Protein
David A. Brown
ISI
7.1 Penemuan G-
Protein……………………………………………………………………213
7.2 Struktur G-
protein………………………………………………………………………214
7.3 Siklus G-
protein…………………………………………………...……………………215
7.4 Perturbing Siklus G-Protein ...........................................
................................................217
7.5 Bukti Experimental untuk pasangan G-Protein di Reseptor Aksi
.................................. 218
7.5.1 Ketergantungan
GTP……………………………………………………………..218
7.5.2 Penggunaan GTP Analog dan Racun
................................................................... 219
7.6 Pengukuran Aktivasi G-Protein
..................................................................................... 220
7.7 Tipe dari G-
protein……………………………………………………………………...220
7.8 Pasangan Reseptor-G-
Protein……………………………………………………….….221
7.9 Pasangan G-Protein-
Efektor……………………………………………………………224
7.10Pengaturan dari Sinyal G-Protein
................................................................................. 229
7.10.1 RGS
Protein…………………………………………………………………….229
7.10.2 Efektor sebagai Pengaktivan GTPase-
Protein....................................................230
7.11 Kinetika Sinyal GPCR-Mediated
.................................................................................230
7.12 Bacaan lebih
lanjut……………………………………………………………………236
G-protein trimerik, sinyal-pentransduksi, guanin protein nukleotida-mengikat.
Mereka merupakan langkah pertama dalam transducing aktivasi agonis-induced dari
reseptor pasangan G-protein (lihat Bab 2) ke dalam respon seluler.
7.1 PENEMUAN G-PROTEIN
G-protein yang ditemukan sebagai hasil dari beberapa percobaan oleh Martin
Rodbell tahun 1971 pada stimulasi adenilat siklase oleh glukagon, di mana ia
menemukan bahwa penambahan guanosin trifosfat (GTP) diperlukan untuk
mendorong reaksi. Menggunakan istilah yang berasal dari teori informasi cybernetic,
ia tergambar sebuah protein nukleotida guanin peraturan, kemudian disebut "N
(nukleotida-mengikat)-protein," bertindak sebagai transduser perantara antara
diskriminator (reseptor) dan penguat (efektor, yaitu, adenilat siklase ) (Gambar 7.1).
Dia kemudian menemukan bahwa adenilat siklase diaktifkan kuat dan ireversibel oleh
GTP analog, 5'-guanylylimidophosphate, atau [GPP (NH)-p] '. Karena GPP (NH)-p
tahan terhadap hidrolisis, Rodbell menyarankan bahwa GTP "dihidrolisis di lokasi
aktivasi," yaitu, transduser bertindak sebagai GTPase a. Ini kemudian ditampilkan
langsung oleh Cassell dan Selinger pada tahun 1976. Kehadiran protein GTP-binding
terpisah, berbeda dari enzim adenilat siklase, didirikan oleh Alfred Gilman dan
kolega yang mampu menyusun kembali GPP (NH)-p-menstimulasi aktivitas adenilat
siklase dalam membran dari garis sel limfoma mutan (Cyc -) yang berisi adenilat
siklase tetapi tidak memiliki G-protein dengan menambahkan terpisah dimurnikan
40-kDa faktor GTP-mengikat. Pada tahun 1980, Howlett dan Gilman melaporkan
bahwa aktivasi gigih ini adenilat-merangsang G-protein (Gs) menyebabkan
penurunan dalam molekul
GAMBAR 7.1 Konsepsi Martin Rodbell tentang peran dari transduser G-protein
dalam aktivasi adenylate cyclase oleh glukagon. (Dari Birnbaumer, L., FASEB J., 4,
3178, 1990. Dengan izin.)
massa protein, menyiratkan bahwa G-protein terdiri dari subunit tdk. The trimerik
sifat G-protein kemudian dibentuk oleh Stryer dan rekan. Menggunakan fotoreseptor
G-protein transducin (Gt), mereka menunjukkan bahwa aktivasi Gt oleh GPP (NH)-p
dan cahaya menyebabkan disosiasi kompleks αβγ trimerik ke GPP (NH)-p-terikat αt
dan βγ, dan αt yang bertanggung jawab untuk stimulasi phosphodiesterase. Pada
tahun 1985, α-transducin dikloning oleh empat kelompok yang dipimpin oleh Numa,
Bourne, Khorana, dan Simon, subunit α dari Gs dikloning oleh kelompok Gilman di
1986. Rodbell dan Gilman bersama-sama dianugerahi Hadiah Nobel pada tahun
1994.
7.2 STRUKTUR G-PROTEIN
G-protein yang terdiri dari tiga subunit: sebuah subunit α massa molekul ~ 39-
45 kDa, subunit β (~ 37 kDa), dan γ subunit kecil (~ 8 kDa). Sekitar 20 produk gen
yang berbeda menyandikan berbagai subunit α, 6 subunit β yang berbeda, dan 12
subunit γ yang berbeda (lihat di bawah). Dalam trimerik asli negara mereka, G-
protein yang melekat pada wajah bagian dalam membran sel melalui ekor lipofilik
pada α dan subunit γ (miristoil dan palmitoil pada α, farnesyl atau geranylgeranyl
pada γ tersebut) (Gambar 7.2). The β dan γ subunit diperintahkan agak tegas melalui
interaksi melingkar-coil untuk membentuk βγ-dimer, subunit β dimer ini kemudian
melekat pada subunit α melalui pelengkap situs peptida-mengikat dua protein dan
melalui interaksi ekor lipofilik. Ketika G-protein diaktifkan, interaksi ini subunit α-β
terganggu, dan terdisosiasi trimer ke subunit α monomer dan dimer βγ subunit (lihat
di bawah). Kedua α dan subunit βγ tetap melekat pada membran tetapi bebas untuk
bergerak.
The α subunit memiliki dua domain fungsional penting lainnya selain domain
β-mengikat. Pertama, subunit α berinteraksi dengan reseptor melalui domain yang
mencakup lima asam amino terakhir dari C-terminus (Gambar 7.3). Kedua,
menanggung guanin saku mengikat nukleotida dan
GAMBAR 7.2 Diagram untuk menunjukkan G-protein α, β, dan subunit γ melekat
pada membran luar sel. (Diadaptasi dari Clapham, DE, Nature, 379, 297, 1996.
Dengan izin.)
Gambar 7.3
bertanggung jawab untuk kegiatan GTPase dari G-protein. Di sisi lain, baik α dan
subunit βγ dapat berinteraksi dengan efektor.
7.3 G-PROTEIN SIKLUS
Siklus kejadian setelah aktivasi reseptor diringkas dalam Gambar 7.4. Urutan
ini sebagai berikut:
1. In keadaan dasar, G-protein ada dalam trimerik (αβγ) bentuk, dengan difosfat
guanosin (PDB) terikat pada situs nukleotida-mengikat subunit α. Hal ini
dekat dengan, tapi mungkin tidak untuk precoupled, reseptor. Rata-rata, ada
lebih G-protein daripada reseptor, jadi satu mungkin membayangkan reseptor
tunggal dikelilingi oleh cincin terdekat G-protein, menyediakan sekuensial
beberapa interaksi reseptor-G-protein.
2. Agonis menginduksi (<1 msec) perubahan konformasi cepat dalam reseptor,
sehingga penyelarasan dan membuka dari heliks transmembran, mungkin
melalui rotasi helix 6 dan pemisahan heliks 3, 6, dan 7.
3. Setelah Wajah bagian dari reseptor diaktifkan mengikat C-terminus dari G-
protein α subunit (lihat Gambar 7.3). Loop batin 3 (IC3) antara transmembran
heliks 5 dan 6 dari reseptor memainkan peran penting dalam interaksi ini.
Catatan, bagaimanapun, bahwa meskipun subunit α beruang tempat
pengikatan utama untuk reseptor, lampiran βγ-dimer ke subunit α sangat
penting untuk interaksi ini terjadi.
4. Pengikatan reseptor menginduksi perubahan konformasi yang cepat (switch)
dalam trimer G-protein. Ini ditularkan ke situs pengikatan nukleotida, sekitar
3 nm pergi, dan hasil dalam disosiasi dari PDB terikat.
5. PDB diganti di situs nukleotida-mengikat oleh guanosin trifosfat (GTP), yang
hadir dalam tiga sampai empat kali lipat lebih (50-300 M) dalam sitosol.
6. Binding GTP mempromosikan mengharubirukan karboksil-dan amino-termini
dari G-protein α subunit, dengan dua konsekuensi paralel: GTP-terikat
memisahkan subunit α
GAMBAR 7.4 Diagram siklus G-protein dengan (dalam kasus ini) aktivasi efektor
oleh GTP-bound α subunit. Lihat teks untuk huruf. (Diadaptasi dari Neer dan
Clapham, Nature, 333, 129, 1988. Dengan izin.)
baik dari reseptor dan dari βγ-dimer, melepaskan gratis Gα-GTP dan Gβγ gratis.
itu
konformasi Gβγ tidak berubah pada disosiasi dari subunit
7. Gα-GTP bebas atau bebas Gβγ lain (atau kadang-kadang keduanya) berinteraksi
dengan molekul efektor untuk mengaktifkan atau menghambat itu (lihat di bawah
untuk contoh). Aktivasi ini adalah persisten kecuali terbalik dengan langkah 8.
8. Terminal (γ) fosfat GTP dihidrolisis oleh aktivitas GTPase dari G-protein α
subunit, meninggalkan PDB terikat sebagai gantinya. Ini membalikkan perubahan
konformasi dalam langkah 5 dan memungkinkan subunit α untuk memisahkan dari
efektor dan reassociate dengan subunit βγ. Reassociation juga akan membalikkan
interaksi βγ-efektor karena Gα-PDB efektif bersaing dengan efektor untuk βγ-
mengikat. Meskipun afinitas cukup tinggi (misalnya, KD ~ 50 nM untuk GIRK
[G-protein-diaktifkan hati meluruskan K + channel] aktivasi) dan gigih dalam
ketiadaan bersaing Gα-PDB, mengikat βγ-efektor tidak ireversibel.
Pengaruh stimulasi reseptor demikian untuk mengkatalisis reaksi siklus. Hal ini
menyebabkan amplifikasi yang cukup dari sinyal awal. Misalnya, dalam proses
eksitasi visual, yang photoisomerization dari satu molekul rhodopsin menyebabkan
aktivasi sekitar 500 sampai 1000 transducin (Gt) Molekul, masing-masing yang pada
gilirannya mengkatalisis hidrolisis ratusan monofosfat siklik guanosin (cGMP)
molekul dengan phosphodiesterase. Amplifikasi dalam adenilat siklase kaskade
kurang tapi masih besar, masing-masing ligan yang terikat mengaktifkan β-
adrenoreseptor sekitar 10 sampai 20 molekul Gs, masing-masing yang pada
gilirannya mengkatalisis produksi ratusan siklik adenosin monofosfat (cAMP)
molekul dengan adenilat siklase.
Durasi respon reseptor-dimediasi tergantung, dalam contoh pertama, pada laju
Reaksi GTPase dari subunit α. Dalam larutan, angka ini agak lambat (waktu-
konstanta, 10-60 sec), terlalu lambat untuk memperhitungkan tingkat off banyak
pasangan G-protein reseptor (GPCR)-diinduksi efek. Sebagai contoh, jawaban cahaya
retina dan tanggapan jantung terhadap stimulasi vagal terakhir kurang dari satu detik.
Namun, dalam sel utuh, reaksi GTPase dipercepat 10 - sampai 100 kali lipat oleh
Protein GTPase-mengaktifkan (GAP). Dalam beberapa kasus, efektor sendiri
bertindak sebagai sebuah GAP, misalnya,
GAMBAR 7.5 Beberapa nukleotida guanosin dan turunannya. Singkatan: PDB,
difosfat guanosin, GTP, guanosin trifosfat, GTPγS, guanosin 5'-O-(3-
thiotriphosphate); GPP (NH)-p, 5'-guanylylimidophos-fosfat, AlF4, aluminium
fluoride.
fosfolipase C mempercepat kegiatan GTPase dari Gαq G-protein. Sebuah
keluarga RGS (regulator G-protein signaling) protein yang mempercepat aktivitas
GTPase subunit α dibahas lebih lanjut di bawah ini. Biasanya (tapi dengan
pengecualian cGMP fosfodiesterase), ketiga komponen Sistem - reseptor G-protein,
dan efektor - berada di membran plasma dan tetap di sana selama semua langkah
dalam siklus.
7.4 PERTURBING SIKLUS G-PROTEIN
Siklus G-protein dapat terganggu dalam beberapa cara:
1. Reversal siklus tergantung pada hidrolisis γ-fosfat GTP. Hal ini dicegah jika
nonhydrolyzable, atau perlahan terhidrolisis, analog GTP diganti, misalnya, 5'-
guanylylimidophosphate (GPP (NH)-p) atau guanosin 5'-O-(3-thiotriphosphate)
(GTPγS), atau dengan menambahkan AlF4, yang membentuk ketiga "semu" fosfat
terhadap PDB di Gα-PDB (Gambar 7.5 ). Dengan kondisi tersebut, aktivasi efektor
menjadi hampir ireversibel setelah aktivasi singkat reseptor (lihat Gambar 7.6
untuk contoh). Pengaruh aktivasi reseptor pada dasarnya adalah untuk
mengkatalisasi siklus G-protein, mempercepat itu 100- atau 1000-kali lipat.
Bahkan tanpa adanya aktivasi reseptor oleh ligan, bersepeda basal lambat terjadi.
Hal ini mungkin disebabkan oleh fakta bahwa sebagian kecil dari reseptor ada
dalam "aktif" konformasi, bahkan tanpa adanya ligan, seperti yang diharapkan dari
model dua-negara reseptor (lihat Bab 1). Akibatnya, substitusi GPP (NH)-p atau
GTPγS untuk GTP atau penambahan AlF4 sendiri dapat merangsang respon
efektor dalam ketiadaan ligan reseptor, dan, memang, teknik ini digunakan untuk
tujuan ini dalam percobaan awal pada adenilat siklase, namun onset jauh lebih
lambat daripada yang terlihat untuk co-penambahan ligan.
2. Siklus Aktifitas dapat diperlambat dengan menambahkan kelebihan dari PDB atau,
lebih umum, guanosin 5'-O-(2-thiodiphosphate) (GDPβS), analog lebih stabil.
Tidak seperti GTPγS, GDPβS tidak terikat ireversibel dan sehingga hanya bersaing
dengan GTP, oleh karena itu hanya efektif ketika hadir dalam besar (sepuluh kali
lipat) berlebih.
GAMBAR 7.6 efek ireversibel dari GTPγS-bound G-protein α subunit. Catatan
menunjukkan penghambatan arus kalium dalam M1 asetilkolin reseptor sel
neuroblastoma mengekspresikan hybrid muscarinic oleh asetilkolin. Kalium saat ini
tercatat sebagai luar arus berkelanjutan pada potensial memegang -30 mV (garis
putus-putus) dan dinonaktifkan selama 1 detik setiap 30 detik dengan hyperpolarizing
sel untuk -60 mV. Dalam sel kontrol (jejak atas), sebuah aplikasi singkat 100 M
asetilkolin (Ach) sementara menghambat arus kalium, tapi ini pulih sekitar 6 menit
setelah mengeluarkan asetilkolin dari cairan mandi. Namun, dalam sel lain ditambal
dengan elektroda berisi 500 GTPγS M (jejak yang lebih rendah), efek asetilkolin
bertahan setelah washout, memang, saat ini terus menurun selama satu jam
berikutnya, mungkin mencerminkan omset lambat dari siklus G-protein dalam tidak
adanya aktivasi GPCR. Perhatikan bahwa efek ini asetilkolin mungkin dimediasi oleh
Gαq, melalui jalur kedua utusan diketahui. (Dari Robbins et al., J. Physiol., 469, 153,
1993. Dengan izin.)
3. Kehadiran NAD +, G-protein α subunit dapat ADP-ribosylated oleh dua protein
bakteri. Pertusis (batuk rejan-) toksin (PTX) ADP-ribosylates residu sistein dalam
C-terminus G-protein dari Gi dan kelompok Go (Gambar 7.7, lihat di bawah).
Akibatnya mencegah kopling reseptor-G-protein dan tanggapan blok untuk
aktivasi GPCR. N-etil-maleimide (NEM) alkylates sistein dan memiliki efek yang
sama. Toksin kolera (CTx) ADP-ribosylates arginin di G-protein dari (adenilat
siklase-stimulating) kelas Gs, dekat situs katalitik dari domain GTPase, akibatnya,
itu blok aktivitas GTPase dan menghasilkan Gs / adenilat siklase aktivasi terus-
menerus. Transducin dan gustducin (visual dan rasa-transducing G-protein, lihat di
bawah) ADP-ribosylated oleh kedua racun. Reaksi ini telah sangat membantu
dalam mengisolasi dan memurnikan G-protein yang dapat ADP-ribosylated.
7.5 BUKTI EKSPERIMENTAL UNTUK PASANGAN G-PROTEIN DI
RESEPTOR AKSI
7.5.1 KETERGANTUNGAN GTP
Sebuah efek G-protein-dimediasi memiliki syarat mutlak untuk GTP. Referensi
telah dibuat untuk persyaratan untuk GTP dalam membangun kembali dirangsang
hormon-aktivitas adenilat siklase. Suatu persyaratan yang sama dapat ditunjukkan
ketika efektor adalah saluran ion, seperti atrium inward-rectifier K + channel jantung
yang diaktifkan setelah stimulasi M2 muscarinic reseptor asetilkolin. Dengan
demikian, dalam percobaan diilustrasikan pada Gambar 7.8, saluran direkam dengan
sel-
GAMBAR 7.7 C-terminal residu G-protein subunit α. Sistein ADP-ribosylated oleh
Pertusis toksin (PTX) ditumbuk.
terlampir Patch pipet dari sel atrium utuh tonically diaktifkan bila asetilkolin (atau
adenosine) hadir dalam pipet menempel. Kegiatan ini hilang ketika patch dipotong
(dalam konfigurasi inside-out) tetapi kemudian dikembalikan pada menambahkan
GTP dengan solusi memandikan wajah dalam patch.
Bahkan tanpa adanya suatu efektor, keterkaitan reseptor diaktifkan untuk G-
protein dapat dideteksi dalam uji reseptor-mengikat oleh yang disebut GTP-shift.
Afinitas jelas agonis (tapi tidak antagonis), diukur baik secara langsung atau dengan
perpindahan agonis dengan antagonis, berkurang pada menambahkan GTP (atau
analog stabil, seperti GTPγS, atau bahkan PDB) menjadi solusi (Gambar 7.9) . Hal ini
karena trimerik G-protein, dengan situs pengikatan nukleotida guanin kosong
membentuk kompleks stabil dengan reseptor diaktifkan seperti untuk memperlambat
disosiasi agonis. Agonis kemudian memiliki afinitas tinggi untuk G-protein.
Penambahan istirahat nukleotida kompleks ini membentuk dipisahkan PDB-terikat
trimer atau GTP-bound α subunit, agonis kemudian dapat memisahkan lebih cepat
dari reseptor, menganugerahkan afinitas rendah.
7.5.2 PENGGUNAAN GTP analog DAN RACUN
Analog Stabil GTP dan PDB dapat digunakan untuk mempelajari peran G-
protein, seperti ditunjukkan di atas. Dengan demikian, stabil GTP analog
meningkatkan efek agonis reseptor-mediated-diinduksi dan memperlambat
pembalikan mereka, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 7.6. Pertusis dan kolera
racun juga dapat digunakan untuk menghambat atau mengaktifkan G-protein tertentu,
seperti yang ditunjukkan.
GAMBAR 7.8 Persyaratan GTP dalam aktivasi batin perbaikan saluran kalium di
membran sel guinea pigatrial oleh asetilkolin. Rekaman dimulai ketika pipet
mengandung asetilkolin melekat pada sel atrium utuh (ca). Ini menghasilkan
pembukaan berkelanjutan hingga tiga saluran kalium (dicatat sebagai defleksi saat
batin pada -60 mV karena pipet berisi 145 mM K +). Pada eksisi patch membran
dalam mode inside-out (io) ke dalam larutan mandi (mengandung 140 mM [K +]),
aktivitas berhenti, tapi dibangkitkan dengan menambahkan 100 M GTP untuk solusi,
memandikan wajah bagian membran Patch. (Dari Kurachi et al., Am. J. Physiol., 251,
H681, 1986. Dengan izin.)
GAMBAR 7.9 GTP pergeseran agonis mengikat GPCR a. Grafik menunjukkan
pengikatan carbachol (lingkaran) dan atropin (kotak) untuk tikus homogenat jantung
dalam ketiadaan (simbol terbuka) dan kehadiran (simbol tertutup) dari 1 mM GTP.
Axes: reseptor hunian (P) dan log-molar konsentrasi ligan. (Diadaptasi dari Hulme et
al., Di Reseptor Obat dan efektor mereka, Birdsall, NJM, Ed., Macmillan, New York,
1981, hal. 23. Dengan izin.)
7.6 PENGUKURAN G-PROTEIN AKTIVASI
Cara yang paling langsung mengukur aktivasi oleh reseptor adalah untuk
mengukur tingkat hidrolisis GTP dalam sel rusak atau pembuatan membran setelah
aktivasi reseptor. Sayangnya, hal ini tidak selalu sangat mudah dalam praktek karena
tingkat latar belakang tinggi (mencerminkan aktivitas basal semua G-protein dalam
membran ditambah reaksi enzimatik lainnya), yang justru respon tertentu G-protein
diaktifkan oleh reseptor, dan karena beberapa G-protein seperti Gs memiliki tingkat
GTPase lambat dalam persiapan tersebut. Metode yang terbaik bagi anggota Go /
keluarga Gi yang melimpah, tinggi omset G-protein. Sebuah metode alternatif dan
banyak digunakan adalah untuk mengukur tingkat GTPγS mengikat, yang tidak
tergantung pada aktivitas GTPase, hanya pada tingkat aktivasi G-protein dan PDB
disosiasi. Metode untuk mengukur perubahan fluoresensi selama aktivasi G-protein
juga telah dijelaskan.
7.7 JENIS G-PROTEIN
Secara tradisional, G-protein telah diklasifikasikan dalam hal kopling efektor
dari subunit α. Terlepas dari fakta bahwa (1) ini mendahului informasi mengenai
struktur primer dan sekunder dari kerja kloning, dan (2) subunit βγ juga terlibat dalam
kopling efektor, klasifikasi ini masih cukup berguna.
Pertama G-protein α subunit untuk diidentifikasi adalah Gs. The α subunit Gs
(αs) bertanggung jawab untuk merangsang adenilat siklase (maka, subscript "s") dan
ADP-ribosylated dan diaktifkan oleh CTx. Gs memiliki setidaknya empat varian
molekul. Beberapa bukti bahwa αs juga dapat meningkatkan aktivitas jantung L-type
Ca2+
channel, terlepas dari fosforilasi mereka dengan cAMP-dirangsang protein
kinase A. Golf adalah homolog adenilat-stimulating di epitel penciuman, diaktifkan
oleh keluarga besar reseptor penciuman .
Gi adalah G-protein yang bertanggung jawab untuk menghambat adenilat siklase.
Penghambatan ini dimediasi oleh subunit α. Berbeda Gs, Gi tidak terpengaruh oleh
CTx tapi malah ADP-ribosylated (dan menghambat) oleh PTX. Dari tiga isoform
Gi(Gil-3), αil adalah inhibitor yang paling ampuh dari adenilat. Gi juga mengaktifkan
inward-rectifier (Kir3.1/3.2 dan Kir 3.1/3.4) K+ channel (saluran GIRK), dan aktivasi
ini dimediasi oleh dirilis subunit βγ (lihat di bawah).
7.8 Reseptor G-Protein Coupling
Interaksi antara reseptor dan G-protein bersifat sementara dan cepat reversibel.
Hal ini ditunjukkan, misalnya, oleh kenyataan bahwa molekul rhodopsin tunggal
diaktifkan oleh cahaya dapat mengaktifkan molekul 500 sampai 1000 transducin
selama 1 sampai 3 sec yang seumur hidup. Oleh karena itu, interaksi harus, di titik
akhir, akan diatur oleh hukum normal interaksi kimia dan dinyatakan dalam bentuk
asosiasi dan tetapan laju disosiasi dan afinitas pengikatan. Pertanyaan yang kemudian
muncul, apakah afinitas reseptor yang berbeda untuk berbagai G-protein bervariasi.
Artinya, ada kekhususan dalam kopling reseptor-G-protein, dan, jika demikian, apa
yang menentukan ini?
Idealnya, mungkin akan berpikir bahwa pertanyaan ini terbaik bisa didekati
dengan mengukur aktivasi individu rekombinan trimer G-protein (menggunakan
reaksi GTPase, GTPγS mengikat, atau metode fluoresensi) oleh reseptor rekombinan
individu (baik dalam konsentrasi diketahui) dalam membran lipid buatan , namun, ini
adalah tugas yang menakutkan. Rubinstein dan rekan telah mencapai pendekatan
dengan mengukur aktivitas GTPase beberapa subunit α rekombinan dilarutkan
dengan dimurnikan adrenoreseptor β dan dimurnikan sapi G-protein βγ subunit dalam
vesikula fosfolipid. Menggunakan konsentrasi tunggal (10 M) dari isoprenalin,
dengan berbagai konsentrasi reseptor, mereka menemukan bahwa GDP / GTP
pertukaran dirangsang paling efektif menggunakan αs, sekitar sepertiga secara efektif
menggunakan αi1 atau αi3, sepersepuluh dengan αi2, dan diabaikan dengan αo .
Pendekatan yang lebih sering adalah untuk menilai interaksi reseptor rekombinan
dengan rekombinan atau endogen G-protein dalam baris sel, dengan menggunakan
pengukuran GTPase atau GTPγS mengikat dalam fraksi membran atau beberapa
fungsi efektor hilir sebagai titik akhir. Ini telah menghasilkan informasi yang cukup
tentang apa yang terbaik mungkin disebut "preferensi" dalam hal interaksi reseptor-
Gprotein individu, dan, melalui penggunaan titik-mutasi dan chimera, telah sangat
berguna dalam menggambarkan beberapa fitur struktural reseptor dan G-protein yang
menentukan seperti preferensi. Dari pekerjaan tersebut, jelas bahwa faktor penentu
utama adalah urutan C-terminal subunit α, di satu sisi (lihat Gambar 7.3), dan loop
batin ketiga dan kedua (i3, i2) reseptor, pada sisi lain, meskipun domain lainnya dari
subunit α dan β dari dan subunit γ juga terlibat dalam interaksi keseluruhan.
Seperti "reconstitutional" pendekatan menderita dua masalah, namun. Pertama,
selektivitas kopling reseptor-G-protein dalam lingkungan sel asli mereka tidak hanya
tergantung pada afinitas relatif dari reseptor untuk berbagai G-protein, tetapi juga
pada proporsi relatif dan ketersediaan reseptor dan G-protein. Dengan demikian,
beberapa contoh jelas "pergaulan bebas" dalam reseptor-G-protein kopling diragukan
lagi dapat dikaitkan dengan reseptor berlebih. Kedua, respon G-protein untuk reseptor
dapat dipengaruhi oleh faktor-faktor pendukung: misalnya, kehadiran tertentu RGS
protein (lihat di bawah) yang mungkin sel tertentu. Pertanyaan yang kemudian
muncul adalah bagaimana reseptor-G-protein kopling selektivitas terbaik dapat
disimpulkan dalam sel normal. Beberapa pendekatan telah digunakan. Satu sederhana
adalah untuk menguji apakah respon terhadap mengaktifkan reseptor itu dicegah oleh
PTX, sehingga mendefinisikan responsif G-protein sebagai anggota Gi / Go keluarga.
Jika demikian, maka hal ini dapat ditindaklanjuti dengan mencoba untuk
"menyelamatkan" respon dengan menerapkan atau mengungkapkan individu subunit
α eksogen di mana sistein ADP-ribosylated digantikan oleh beberapa asam amino
lainnya seperti isoleusin. Pendekatan lain adalah untuk mengganggu sambungan ke
individu G-protein α subunit menggunakan antibodi diarahkan terhadap urutan C-
terminal atau menggunakan bersaing urutan pendek-peptida. Ini akan memungkinkan
diskriminasi antara, katakanlah, Gi1 / 2 dan Gi3 atau Go, antara Aceh dan pelayar, atau
antara Gi/o dan Gq/11, tapi bukan antara Gi1 dan Gi2 atau antara Gq dan G11, karena
urutan Cterminal untuk pasangan ini adalah sama (lihat Gambar 7.7). Selektivitas
yang lebih besar dapat diperoleh dengan menghapus subunit individu G-protein
menggunakan gen knockout atau, lebih cepat dan lebih murah (tapi kurang lengkap),
dengan mengurangi ekspresi protein dengan antisense konstruksi.
Dua poin umum muncul dari pekerjaan tersebut. Pertama, pendekatan yang
berbeda tidak selalu memberikan hasil yang sesuai. Misalnya, antisense-deplesi
menunjukkan bahwa aktivasi saluran GIRK oleh aksi noradrenalin pada α2-
adrenoreseptor di neuron simpatik asli dimediasi selektif oleh Gi-protein, dari pada
Go-protein, tetapi aktivasi dapat sama baiknya diselamatkan di PTX-sel diperlakukan
oleh bentuk-bentuk PTX-tahan dari kedua αo dan αi (Gambar 7.10). Sebaliknya,
penghambatan N-type Ca2 saat dalam sel-sel yang sama dengan noradrenalin dapat
diselamatkan setelah PTX pengobatan oleh PTX-tahan αi meskipun antisense deplesi
menunjukkan penghambatan yang biasanya dimediasi oleh protein Go asli, bukan
protein Gi. Dengan demikian, menyelamatkan percobaan, seperti ekspresi lainnya
pendekatan, cenderung menunjukkan apa jalur kopling mungkin dan tidak selalu
menentukan apa yang biasanya jalur beroperasi. Kedua, dan mengikuti dari ini,
tingkat agak mengejutkan kekhususan dalam kopling reseptor-G-protein dalam sel
asli telah muncul dari beberapa studi antisense-deplesi, memperluas tidak hanya
untuk subunit α terkait erat tetapi juga untuk β terkait dan subunit γ . Misalnya,
penghambatan Ca2 arus dalam GH3 sel tumor hipofisis oleh somatostatin tampaknya
istimewa dimediasi oleh kombinasi αo1β1γ3, sedangkan efek yang sangat mirip
asetilkolin, melalui reseptor muscarinic M4, paling efektif obtunded oleh antisense
penipisan αo1β3γ4. Salah satu alasan untuk tinggi spesifisitas in situ tidak dapat
diprediksi dari percobaan pemulihan mungkin bahwa, dalam sel normal, reseptor dan
kognitif G-protein tidak terdistribusi secara acak dalam membran sel tetapi co-
terlokalisasi di "microdomains."
Di sisi lain, beberapa reseptor yang benar-benar "promiscuous" dalam bahwa
mereka dapat mengaktifkan dua atau lebih G-protein dari kelas berbeda, bahkan
dalam lingkungan yang normal mereka seluler. Sebagai contoh, konsentrasi yang
sama thyroid-stimulating hormone (TSH; 0,1-100 U / ml) dapat merangsang
penggabungan 32P-GTP ke αi, αo, α12, α13, αs, dan αq/11 melalui aktivasi reseptor
thyrotropin di membran dari kelenjar tiroid manusia. TRH aktivasi Ca2 + arus dalam
GH3 sel obtunded sama oleh antisense-penipisan αi2, αi3, dan αq/11, tapi bukan dari αo.
Beberapa genotip reseptor nukleotida P2Y individu juga dapat pasangan dengan
afinitas sama dengan PTX-sensitif dan PTxinsensitive G-protein dalam neuron
simpatik. Derajat, atau sebaliknya, seperti "pergaulan" diduga ditentukan oleh
struktur protein reseptor itu sendiri.
Lebih menarik lagi, beberapa bukti menunjukkan bahwa tingkat preferensi
bahwa salah satu reseptor menunjukkan untuk satu atau lain G-protein mungkin
tergantung pada agonis digunakan. Dengan demikian, aktivasi reseptor octopamine
Drosophila diungkapkan dalam bahasa Cina hamster ovarium (CHO) sel
menghambat adenilat siklase dan meningkatkan Ca2+
intraseluler melalui aktivasi dua
G-protein yang berbeda: PTX-sensitif dan tidak sensitif, masing-masing. Tyramine
dan octopamine telah terbukti meningkatkan Ca2+
dengan potensi yang sama, tapi
tyramine adalah jauh lebih kuat dalam menghambat adenilat daripada octopamine.
Hal ini sesuai dengan percobaan sebelumnya yang menunjukkan bahwa mutasi dari
aspartat sangat lestari terlibat dalam agonis amina mengikat hampir semua reseptor
mempengaruhi kopling G-protein dalam agonis tergantung cara. Salah satu
interpretasi dari ini adalah bahwa agonis yang berbeda menghasilkan states aktif yang
berbeda dari reseptor, atau distribusi yang berbeda dari states yang aktif, dengan
afinitas yang berbeda untuk berbagai Gproteins, namun, tidak ada informasi langsung
apakah ada atau tidak reseptor ligan-diduduki dapat membentuk beberapa states yang
aktif. Diaktifkan cahaya rhodopsin melewati beberapa states konformasi sebelum
membentuk aktif-states metarhodopsin-II, tetapi tidak ada states menengah memiliki
lebih dari ~ 1/10, 000 dari afinitas metarhodopsin-II untuk transducin. Dengan tidak
adanya bukti langsung yang bertentangan, tampaknya bijaksana untuk menafsirkan
fenomena seperti variasi agonis-tergantung dalam efisiensi kopling pada asumsi
bahwa reseptor yang diberikan biasanya dapat membentuk hanya satu states yang
aktif.
GAMBAR 7.10 Membandingkan informasi yang dihasilkan oleh antisense deplesi
dan subunit α pemulihan mengenai spesies G-protein yang bertanggung jawab untuk
penghambatan adrenergik inward penyearah arus GIRK pada tikus neuron simpatik.
Catatan menunjukkan hati meluruskan arus GIRK dihasilkan dalam sel sebelumnya
transfected dengan cDNA coding untuk Kir3.1 dan Kir.3.2 saluran kalium oleh jalan
tegangan dari -140 sampai -40 mV, direkam dalam ketiadaan (basal) dan kehadiran
(NE) dari 10 pM noradrenalin (norepinefrin). Perhatikan bahwa dalam (a) co-ekspresi
cDNA antisense ditujukan terhadap GαoA tidak berpengaruh pada aktivasi saat ini
dengan noradrenalin, sedangkan co-ekspresi dari antisense ditujukan terhadap urutan
pengkodean umum Gαi1-3 mengurangi respon terhadap noradrenalin sekitar setengah
(seperti yang ditunjukkan pada grafik batang bawah). Di (b), pendekatan yang
berbeda digunakan, di mana α subunit asli adalah tidak aktif dengan Pertusis toksin
(PTX), sehingga menghambat efek noradrenalin (panel atas), dan upaya yang
dilakukan untuk menyelamatkan respon oleh co-transfecting cDNA coding untuk
subunit α berbeda bermutasi untuk menghapus sistein PTX-responsif (lihat Gambar
7.7). Dalam kasus ini, respon diselamatkan untuk luasan yang sama oleh semua
subunit α diekspresikan. (Diadaptasi dari Fernandez-Fernandez et al., Eur. J.
Neurosci., 2001.
TABEL 7.1
Beberapa Prinsip Preferensi Reseptor G-Protein Coupling
G-Protein Reseptor
Gs β-Adrenoceptor; dopamine D1,5; histamine H2; 5-hydroxytryptamine
5HT4,6,7; glucagon; vasopressin V2; VIP/PACAP (VPAC1Ŕ3); prostanoid DP, IP;
CRF1,2; calcitonin/amylin/CGRP
Gi/Go α2-Adrenoceptor; M2/4 muscarinic acetylcholine; dopamine D2Ŕ4;
5HT1; opioid δ, κ, θ, OFQ; somatostatin sst1Ŕ5; GABAB; mGlu2Ŕ4; cannabinoid
CB1,2
Gq/G11 α1-Adrenoceptor; M1,3,5 muscarinic; histamine H1; 5HT2; mGlu1,5;
nucleotide P2Y; vasopressin V1; tachykinin NK1Ŕ3; bradykinin B1,2; neurotensin
NTS1,2; endothelin ET1,2; TRH; cholecystokinin CCK2; prostanoid FP, TP
Meskipun berbagai pertimbangan dan keberatan mengenai reseptor G-protein
coupling spesifisitas yang diuraikan di atas, dan mengabaikan variasi antara coupling
untuk anggota yang berbeda dari kelas yang sama dari G-protein, Tabel 7.1 dapat
membantu dalam memberikan ringkasan operasional yang luas dari pokok-reseptor
preferensi G-protein-coupling. Informasi yang lebih rinci diberikan di bawah ini di
bagian Bacaan lebih lanjut (lihat Guderman et al., 1996).
7.9 G-Protein-Coupling Efektor
"Efektor" dalam pengertian ini adalah protein target langsung diaktifkan G-
protein subunit (s). Meskipun awalnya ditandai dalam hal aktivasi efektor oleh α
subunit GTP-bound, misalnya, dari adenilat siklase oleh αs, sekarang jelas bahwa
subunit βγ dibebaskan juga bertindak sebagai transduser independen (lihat Tabel 7.2).
Sementara tunjangan harus dibuat dalam sistem utuh untuk efek tidak langsung
melalui Gβγ mengikat, dan inaktivasi, Gα-GTP, interaksi langsung Gβγ dengan
efektor protein telah ditetapkan untuk reseptor kinase β-adrenergik (βARK), adenilat
siklase, fosfolipase C-β1, 2,3, phosducin, GIRK K saluran, dan N-type (α1B) saluran
Ca2+
. Mengikat efektor ini tampaknya terutama melalui situs pada subunit β yang
tumpang tindih dengan situs di mana βγ mengikat subunit α, maka, subunit α bebas
bertindak sebagai pesaing dengan efektor untuk βγ mengikat (lihat di bawah). Situs
mengikat komplementer untuk βγ pada C-terminus protein βARK, pada linker I-II
dari saluran Ca2+
α1B (tumpang tindih tempat engikatan saluran β subunit) dan pada
kedua N-dan C-termini dari saluran GIRK memiliki telah diidentifikasi. Beberapa
efektor adalah target untuk kedua α dan subunit βγ (misalnya, PLCβ1-3, beberapa
isoform adenilat siklase). Dalam kasus ini, dua subunit memiliki efek independen dan
aditif. Aktivasi enzim ini dengan βγ dilepaskan dari α subunit PTX-sensitif dapat
menjelaskan banyak contoh adenilat PTX-sensitif atau tanggapan PLC untuk aktivasi
reseptor.
Pertanyaan yang kemudian muncul adalah bagaimana, dalam sebuah sistem
yang tidak diketahui, seseorang dapat mengidentifikasi subunit (α atau βγ) membawa
pesan. Dua pendekatan utama yang tersedia untuk mengidentifikasi respon βγ-
dimediasi: replikasi (dan oklusi) oleh dinyatakan atau diterapkan subunit βγ dan
antagonisme dengan mengungkapkan atau diterapkan peptida βγ mengikat seperti
peptida C-terminus dari βARK-1 atau α-transducin, yang, pada dasarnya, bersaing
dengan target untuk subunit βγ gratis. Identifikasi positif efek α-dimediasi lebih sulit,
karena antagonis Gα seperti PTX atau antibodi C-terminusjuga mencegah pelepasan
Gβγ gratis, dan efek yang dihasilkan dari antisense penipisan α subunit mungkin
TABLE 7.2
Tipe G-Protein
Subskrip Sentivitas Toxin Efektor
(Gsubskrip) PTx CTx α subnit βγ subunit
S Ŕ + Adenilat siklase ↑ βARK translasi ICa(N)↓
olf Ŕ + Adenilat siklase ↑ ŕ
t + + Fosfodiesterase ↑ Fosfolipase A2 ↑
gust + + Fosfodiesterase ↑ PLC ↑
i + Ŕ Adenilat siklase ↓ GIRK ↑
o + Ŕ ŕ Ca(N, P, Q) ↓
z Ŕ Ŕ ŕ Ca(N)↓, GIRK ↑
q Ŕ Ŕ PLC ↑ PLC ↑
11 Ŕ Ŕ PLC ↑ ŕ
12 Ŕ Ŕ ? ŕ
13 Ŕ Ŕ ? ŕ
14 Ŕ Ŕ PLC ↑ ŕ
15 Ŕ Ŕ PLC ↑ ŕ
16 Ŕ Ŕ PLC ↑ ŕ
Singkatan: βARK1, β-adrenergik reseptor kinase 1, PLC, fosfolipase C, GIRK, G-
protein-diaktifkan dalam hati perbaikan saluran kalium, Ca (N, P, Q), tipe N, P-jenis,
atau kanal kalsium Qtype.
disebabkan kelebihan Gβγ terikat. Replikasi oleh subunit α GTPase-kekurangan
dalam ketiadaan bukti positif bagi keterlibatan subunit βγ dapat berguna.
Sebagai contoh dual efek α-dan βγ-dimediasi, orang mungkin menganggap
penghambatan N-type Ca2 +
arus di neuron simpatik asetilkolin (Angka 7.11 dan 7.12,
lihat juga Hille, 1994). Asetilkolin menghambat arus ini melalui dua reseptor
muscarinic berbeda (M1 dan M4), menggunakan dua jalur G-protein yang berbeda.
GAMBAR 7.11 Pendekatan Eksperimental pada identifikasi subunit G-protein yang
bertanggung jawab untuk menghambat arus kalsium pada rat neuron simpatik
merangsang reseptor asetilkolin muskarinik M4 dengan agonis muskarinik,
oxotremorine-M (Oxo-M). Arus (ditimbulkan oleh 5-msec depolarisasi langkah untuk
0 mV dari -60 mV) tercatat dari sel ganglion dipisahkan ditambal dengan elektroda
terbuka-tip yang mengandung 20 mM Bapta, ini menghilangkan komponen
penghambatan diproduksi dengan merangsang reseptor M1 (lihat Bernheim et al,
1991;. Beech et al, 1992).. Seperti ditunjukkan dalam meninggalkan jejak atas, Oxo-
M diproduksi ~ 60% penghambatan saat ini, yang secara sementara dan sebagian
dibalik oleh 10-msec depolarisasi langkah +90 mV. Preinjection dari antibodi
diarahkan terhadap C-terminus Gαo, tetapi tidak Gαi1 / 2, mengurangi inhibisi (a),
menunjukkan bahwa Gαo adalah menerima α subunit untuk efek ini. Hal ini
dikonfirmasi dan dipersempit ke GαoA isoform dengan mengekspresikan antisense
cDNA konstruksi untuk menguras subunit α individu (b). Ekspresi
dari β1γ2 subunit (oleh transfeksi cDNA) juga menghambat arus dan tersumbat aksi
Oxo-M (c), sedangkan berlebih dari fragmen C-terminal βARK-1 (yang bertindak
sebagai agen βγ-mengikat) mencegah tegangan- penghambatan tergantung oleh Oxo-
M (d), menyiratkan penghambatan yang dimediasi oleh subunit βγ dibebaskan dari
diaktifkan GαoA -abg trimer. Subunit βγ dibebaskan berinteraksi langsung dengan
saluran kalsium dengan cara tegangan-tergantung: depolarisasi menyebabkan
disosiasi subunit, yang kemudian reassociate dengan rata-rata waktu konstan 37 msec
pada repolarisasi (e; lingkaran terbuka); berlebih dari βARK- 1C-ter mengurangi
konsentrasi efektif subunit βγ bebas dan memperpanjang waktu konstan untuk
reassociation menjadi 51 msec. Perhatikan bahwa noradrenalin, bukan Oxo-M,
digunakan untuk menghambat arus dalam (e). (Records (a) sampai (d) yang
diadaptasi dari Delmas et al, Eur J. Neurosci, 10, 1654-1666, 1998;... Record (e)
adalah dari Delmas et al, J. Physiol, 506,.. 319-329, 1998.)
Stimulasi reseptor M4 menghasilkan penghambatan cepat yang ditandai dengan
ketergantungan tegangan. Artinya, pembukaan saluran selama tegangan langkah
depolarizing tertunda (sehingga timbulnya arus diperlambat), dan sementara ini
dibalik oleh kuat depolarizing Prepulse (Gambar 7.11a). Efek seperti ini dicegah oleh
PTX dan dimediasi oleh anggota Gi / Go keluarga yang dapat dipersempit khusus
untuk ke GαA , karena (1) antagonis yang disuntikkan antibodi untuk domain C-
terminal Gαo tetapi tidak untuk C-terminal Gαi1 / 2 (Gambar 7.11a), dan (2) dikurangi
pada mengekspresikan antisense RNA untuk GαoA (Gambar 7.11b). Transduser akhir
adalah βγ-dimer dilepaskan dari αoAβγ-trimer karena (1) efek stimulasi reseptor M4
direplikasi dan tersumbat karena berlebih dari kombinasi βγ umum (β1γ2, Gambar
7.11c), dan (2), aksi agonis dicegah dengan meningkatkan ekspresi yang peptida
domain C-terminal βARK-1, yang mengikat dan disekap subunit βγ bebas (Gambar
7.11d). Kecil, residu penghambatan tegangan-independen mungkin hasil dari efek
tambahan dari monomer αoA-GTP. Pengaruh subunit βγ pada saluran ini dapat
ditafsirkan sebagai berikut. Sebuah molekul βγ bebas mengikat langsung ke protein
saluran pada satu atau lebih situs, termasuk situs di linker I-II yang berisi mengikat
motif (QXXER) yang sesuai dengan motif yang sama di βARK-1 peptida, maka
kompetisi. Ini mengikat mengarah ke keterbelakangan di Ca2 +
membuka saluran pada
langkah tegangan. Depolarisasi yang kuat menyebabkan disosiasi sementara ini
molekul βγ terikat sehingga membalikkan penghambatan. Pada repolarisasi, molekul
βγ dipisahkan rebind dan inhibisi dipulihkan. Rebinding (reinhibition) mengikuti
waktu-tentu eksponensial saja, tingkat-konstan yang tergantung pada konsentrasi
yang tersedia gratis Gβγ [βγ], sesuai dengan persamaan kobs = k1 [βγ] + k2, di mana
k1 dan k2 adalah konstanta laju maju dan mundur untuk pengikatan reversibel dari
satu molekul βγ dengan satu saluran molekul protein (C): C + βγ = Cβγ. Dengan
demikian, laju reinhibition dipercepat dengan meningkatkan konsentrasi agonis atau
dengan menerapkan meningkatnya konsentrasi βγ dan diperlambat dengan
mengurangi jumlah βγ tersedia dengan menggunakan βARK-1 peptida (Gambar
7.11e). Sedangkan hanya satu molekul Gβγ tampaknya mengikat satu sama lain
kanal Ca2 +
molekul, ke dalam rectifier kanal K +, yang diaktifkan oleh Gβγ, terdiri
dari empat subunit yang terpisah, masing-masing dapat mengikat satu molekul Gβγ.
Stimulasi reseptor M1 menghasilkan penghambatan lambat yang tidak sensitif
dan tegangan yang bertahan di hadapan PTX (Gambar 7.12a). Seperti yang
diharapkan dari perlawanan terhadap PTX, ini tidak terpengaruh oleh antisense-
penipisan αoA tetapi, sebaliknya, berkurang antisense-penipisan αq (Gambar 7.12b)
dan hilang dalam neuron dari Gαq ketukan luar mice (Gambar 7.12c). Berbeda
dengan penghambatan tegangan-sensitif diproduksi dengan merangsang reseptor M4,
tidak dimediasi oleh βγ-dimer dilepaskan dari dirangsang trimer αqβγ karena (1) tidak
terpengaruh oleh βARK-1 peptida (Gambar 7.12d), dan (2) penghambatan agonis
berlanjut setelah mengekspresikan gratis β1γ2 subunit (Gambar 7.12e). Sebaliknya,
efek agonis ini direplikasi dan tersumbat dengan meningkatkan ekspresi yang
GTPase-kekurangan bentuk (dan karena itu permanen aktif, GTP-bound) dari Gαq
(Gambar 7.12f). Tindakan ini Gαq-GTP tidak mungkin hasil dari interaksi langsung
dari subunit α dengan + saluran Ca2+
tetapi mungkin melibatkan produksi dan
tindakan utusan lain yang dapat menyebar melalui sitoplasma untuk mempengaruhi
kanal Ca2 +
beberapa cara pergi dari lokasi pembentukan Gαq-GTP, seperti Ca2 +
aktivitas saluran tercatat dalam pipet patch yang melekat pada membran sel dapat
dihambat dengan merangsang reseptor muskarinik pada bagian lain dari membran sel
luar patch (Gambar 7.12g, juga lihat di bawah dan Gambar 7.18).
Apa arti fungsional dari berbagai mode Ca2+
penghambatan saat ini? βγ-
dimediasi inhibisi oleh asetilkolin, atau pemancar lain seperti noradrenalin dan γ-
aminobutyric acid (GABA), dan pengurangan konsekuensi dari masuknya Ca2+
di
terminal saraf mungkin menyediakan komponen penting dari tindakan otoinhibitor
presinaptik pemancar pada rilis mereka sendiri dalam sistem saraf baik perifer dan
sentral, meskipun efek lain di luar langkah Ca2+
masuk juga dapat menyebabkan
pelepasan pemancar berkurang. Di sisi lain, semakin penghambatan α-dimediasi jarak
jauh tampaknya terbatas pada membran somatik. Di sini, efek utamanya adalah untuk
mengurangi jumlah Ca2+
tersedia untuk membuka saluran Ca2+
K-dependent, ini
meningkatkan rangsangan somatik, yang memungkinkan neuron untuk api lebih lama
dan lebih cepat potensi kereta selama eksitasi terus menerus atau frekuensi tinggi.
Satu masalah yang timbul sehubungan dengan tanggapan βγ-dimediasi adalah
bagaimana kekhususan reseptor-efektor kopling dipertahankan. Dengan demikian,
sebagian besar efek βγ-dimediasi, pada saluran ion setidaknya, yang dihambat oleh
PTX, menyiratkan bahwa mereka hasil dari aktivasi Gi atau Go. Ada pengecualian,
misalnya, penghambatan βγ-dimediasi Ca2 +
arus dan aktivasi GIRK arus di neuron
simpatik juga dapat disebabkan oleh peptida intestinal vasoaktif (VIP), bertindak
melalui Gs. Namun, ini adalah pengecualian dan, secara umum, tegangan yang
tergantung Ca2 +
penghambatan saat ini atau aktivasi GIRK dalam sel asli dibatasi
untuk reseptor bahwa pasangan untuk PTX-sensitif G-protein seperti α2-
GAMBAR 7.12 Pendekatan Eksperimental pada identifikasi subunit G-protein yang
bertanggung jawab untuk menghambat arus kalsium pada rat neuron simpatik
merangsang reseptor asetilkolin muskarinik M1 dengan agonis muskarinik,
oxotremorine-M (Oxo-M). Dalam eksperimen ini, penghambatan M4/Go/βγ-mediated
diilustrasikan pada Gambar 7.11 telah diblokir oleh pengobatan sebelumnya dengan
Pertusis toksin, dan arus kalsium dicatat menggunakan varian berlubang-patch
metode patch-clamp (yang memelihara konstituen sitoplasma normal). Dengan
kondisi tersebut, oxotremorine-M menghasilkan penghambatan perlahan berkembang
yang umpan balik dengan depolarisasi kuat (a). Bentuk inhibisi tidak terpengaruh
oleh mengekspresikan antisense untuk GαoA, melainkan secara selektif dikurangi
dengan antisense penipisan Gαq (b). Dalam konfirmasi ini, penghambatan sangat
berkurang dalam sel ganglion dari rat transgenik kekurangan Gαq (Gαq - / -), dan
inhibisi dipulihkan dalam sel-sel dengan bebas mengekspresikan Gαq (c). Tidak
seperti penghambatan M4-dimediasi (Gambar 7.11), bentuk penghambatan tidak
terpengaruh dengan meningkatkan ekspresi yang βARK-1 peptida (d) dan berlanjut
setelah overexpressing bebas β1γ2 subunit (e). Sebaliknya, penghambatan ini
direplikasi dan tersumbat oleh mengekspresikan sebuah α subunit GTPase-
kekurangan dari Gq (f), menunjukkan bahwa itu dimediasi oleh GTP-bound αq
subunit. Ini mungkin tidak berinteraksi secara langsung dengan saluran kalsium
melainkan memicu kaskade enzim yang menghasilkan beberapa pesan substansi yang
berdifusi melalui sitoplasma untuk mempengaruhi saluran, sebagai inhibisi penuh
terlihat ketika saluran clusterof dicatat dengan patch pipet sel-terlampir dan Oxo-M
ditambahkan ke dalam larutan mandi dalam kontak dengan membran sel luar patch
(g). (Records (a), (b), dan (d) sampai (g) yang diadaptasi dari Delmas et al, Eur J.
Neurosci, 10, 1654-1666, 1998;... Record (c) yang diadaptasi dari Haley et al., J.
Neurosci., 20, 3973-3979, 2000.)
Adrenoreseptor atau reseptor muskarinik M2 atau M4. Adrenoseptor bahwa
pasangan melalui Gs atau Gq/11 atau reseptor muskarinik bahwa pasangan melalui
Gq/11 biasanya tidak menimbulkan efek βγ-dimediasi. Sebaliknya, sementara ada
perbedaan dalam afinitas relatif antara kombinasi βγ berbeda, baik saluran GIRK dan
kanal Ca2 +
muncul untuk menanggapi berbagai βγ kombinasi subunit bila langsung
diterapkan atau dinyatakan, termasuk yang biasanya mengasosiasikan dengan PTX-
sensitif α subunit. Oleh karena itu, spesifisitas jelas diberikan oleh subunit α.
Bagaimana ini diterjemahkan spesifisitas respon efektor belum jelas.
GAMBAR 7.13 Peran protein RGS dalam mempercepat offset efek G-protein-
dimediasi. (a) Dalam hati meluruskan GIRK kalium arus diaktifkan dengan
merangsang reseptor muskarinik M2 asetilkolin dengan asetilkolin (Ach), dicatat (1)
dari miosit atrium rat, (2) dari sel CHO cotransfected dengan saluran GIRK jantung
(Kir3.1 + Kir3 .2) ditambah reseptor M2, dan (3) dari sel CHO transfected seperti
dalam (2) tetapi juga dengan RGS protein RGS4. Perhatikan bahwa respon dalam sel
CHO (2) lebih lambat untuk mencapai kondisi mapan dan jauh lebih lambat untuk
menonaktifkan dibandingkan dengan sel atrium, tetapi meniru respon dari sel atrium
setelah transfeksi RGS4 (3). (b) Rata-rata tanggapan foton tunggal dari fotoreseptor
batang retina yang diambil dari normal (+ / +) tikus dan dari heterozigot (+ / -) dan
homozigot (- / -) RGS9 tikus knockout. Lampu flash disampaikan pada waktu = 0
detik. (Record (a) diadaptasi dari Doupnik et al, Proc Acad Sci USA Natl, 94, 10.461-
10.466, 1997;..... Record (b) adalah dari Chen et al, Nature, 403, 557-560,. 2000.
Dengan izin.)
7.10 Pengaturan Sinyal G-Protein
7.10.1 Protein RGS
(Lihat Vries et al., 2000, di bagian Bacaan lebih lanjut.) Protein RGS adalah anggota
besar (20 atau lebih) keluarga protein longgar terkait yang memiliki kesamaan dengan
domain RGS 130-asam amino yang memungkinkan mereka untuk mengikat G-
protein subunit α. Mereka memiliki (untuk berbagai luasan) dua tindakan utama di
sinyal G-protein sebagai konsekuensi dari ini mengikat. Pertama, dan yang paling
penting, mereka bertindak sebagai GAP (protein GTPase-activating), yaitu, mereka
mempercepat hidrolisis GTP oleh G-protein aktif dan karenanya mempercepat
pemulihan efektor dari aktivasi oleh GαGTP atau Gβγ. Mereka tidak mempengaruhi
nilai tukar PDB-GTP dan tidak mengubah tingkat aktivasi G-protein dengan reseptor.
Kedua, mereka juga dapat mengurangi pengikatan GαGTP ke efektor, mungkin
secara fisik menghalangi interaksi. Ini mungkin independen dari kegiatan GAP
mereka, yang juga harus mengurangi respon efektor ke tingkat tertentu aktivasi G-
protein (lihat di bawah), karena dapat dilihat ketika subunit α diaktifkan oleh GTPγS
nonhydrolyzable. Misalnya, protein RGS, RGS4, menghambat respon PLC-β1 ke
GTPγS-diaktifkan Gq.
Gambar 7.13a menunjukkan contoh efek dari protein RGS pada aktivasi saluran
GIRK dengan merangsang reseptor asetilkolin muskarinik M2 dengan asetilkolin. Ini
adalah saluran K+ dalam sel-sel alat pacu jantung yang dibuka oleh asetilkolin
dilepaskan setelah stimulasi vagal dan bertanggung jawab atas hiperpolarisasi dan
memperlambat alat pacu jantung (lihat di bawah). Namun, ketika hanya saluran
GIRK dan reseptor M2 dilarutkan dalam oosit atau sel nonkardiak mamalia, saluran
dalam waktu beberapa detik untuk menutup kembali setelah menghapus asetilkolin,
padahal dalam hati, saat pulih dalam waktu kurang dari satu detik. Seperti
ditunjukkan dalam Gambar 7.13a, tingkat off untuk penonaktifan GIRK berikut
penghapusan asetilkolin dalam sistem dilarutkan adalah dipercepat lebih dari 10 kali
oleh co-mengekspresikan RGS4 dan sekarang sesuai dengan tingkat off untuk saat
atrium asli.
Jumlah besar protein RGS memiliki berbagai tingkat selektivitas untuk subunit
α berbeda dan efek pada sistem efektor yang berbeda (lihat Vries et al., 2000)
bervariasi. Properti ini biasanya dinilai dalam sistem ekspresi dilarutkan. Yang
kurang jelas saat ini adalah peran yang RGS protein individu bermain di sel asli.
Salah satu pendekatan yang menarik untuk pertanyaan ini memanfaatkan fakta bahwa
kopling protein RGS ke subunit α dapat terganggu oleh mutasi titik dalam subunit α
tanpa gangguan lain untuk fungsi Gα. Dengan menggabungkan mutasi tersebut
dengan mutasi lain untuk menghilangkan PTX sensitivitas (lihat Gambar 7.10), telah
ditetapkan bahwa RGS protein endogen yang terlibat dalam penghambatan Ca2 +
arus
di neuron simpatik noradrenalineactivated Go, sebagai penggantian Goα endogen
dengan Goα bermutasi telah terbukti mengurangi kepekaan terhadap noradrenalin
sekitar sepuluh kali lipat dan untuk memperlambat laju onset dan pemulihan inhibisi.
Namun, bahkan ini melibatkan tingkat pemulihan, dengan masalah konsekuen
ditangani sebelumnya. Pendekatan alternatif adalah penghapusan genetik. Dengan
demikian, ada dramatis (lebih besar dari sepuluh kali lipat) perlambatan pemulihan
dari photoresponse batang retina terisolasi pada ketukan luar rat kekurangan dalam
RGS retina-spesifik protein RGS-9 (Gambar 7.13b).
7.10.2 Efektor Protein GTPase-Aktif
Beberapa efektor enzim juga bertindak sebagai GAP, mempercepat hidrolisis
GTP dan karenanya mempromosikan belokan cepat dari enzim G-protein-diaktifkan
sendiri. Sebagai contoh, kegiatan GTPase murni Gαq-GTP sangat lambat (10 sampai
60 detik) bila diukur dalam larutan tetapi meningkat 50 kali lipat pada menambahkan
sasaran efektor yang PLC-β1, untuk yang lebih fisiologis waktu paruh 1 detik.
Demikian juga, penambahan fosfodiesterase mempersingkat paruh GTP-terikat α-
transducin dari 20 detik sampai 5 detik. Ini efek percepatan dari fosfodiesterase
efektor yang sinergis dengan efek visual yang RGS protein RGS9 disebutkan di atas.
Apakah efektor ion-channel juga bertindak sebagai GAP dengan tidak adanya protein
RGS jelas.
7.11 Kinetika Sinyal GPCR-Dimediasi
Efek dimediasi oleh G-protein coupled receptors (GPCRs) sangat jauh lebih
lambat dibandingkan mereka yang dimediasi, misalnya, saluran ion ligand-gated,
terutama karena langkah-langkah lebih banyak yang terlibat antara aktivasi reseptor
dan respon akhir. Misalnya, bahkan secara sederhana, tiga langkah, efek Gprotein-
dimediasi, seperti pembukaan saluran GIRK atrium setelah aktivasi reseptor
muscarinic M2 oleh asetilkolin, yang mengikuti skema:
Ach R → R-Ach Gαβγ → [αGTP] βγ GIRKtertutup → βγ-GIRKterbuka
latency minimum untuk perkembangan GIRK saat ini dan konsekuen membran
hiperpolarisasi, setelah pulsa-aplikasi asetilkolin, adalah sekitar 30 msec (Gambar
7.14). Hal ini kontras dengan <1-msec latency pembukaan nikotinik saluran
menyusul penerapan asetilkolin untuk endplate otot reseptor nikotinik. Dengan
analogi dengan respon rodopsin terhadap kilasan cahaya, ada kemungkinan bahwa
pengikatan awal asetilkolin pada reseptor muskarinik dan perubahan konformasi
selanjutnya mengambil tidak lebih dari satu milidetik atau lebih, waktu ekstra
diperlukan untuk difusi dan docking reseptor diaktifkan untuk G-protein, pertukaran
GTP untuk GDP, dan disosiasi dari G-protein, serta difusi dan docking dari subunit
βγ dibebaskan dengan saluran kalium. Setelah puncaknya, saat kemudian menurun
selama beberapa ratus milidetik, ini ditentukan oleh laju hidrolisis GTP dan disosiasi
akibat dari subunit α dari efektor atau merebut kembali dari subunit βγ dari efektor
oleh PDB yang baru dibentuk terikat α subunit (lihat di atas dan Gambar 7.13).
Pengaruh stimulasi adrenoreseptor jantung bahkan lebih santai karena beberapa
langkah lagi mengikuti aktivasi dari protein Gs oleh β-adrenoreseptor. Misalnya,
untuk meningkatkan kekuatan kontraksi jantung, kita memiliki (1) aktivasi adenilat
siklase oleh GαS-GTP, (2) pembentukan cAMP, (3) aktivasi protein kinase A oleh
cAMP, maka (4) fosforilasi saluran protein kalsium oleh kinase. Akibatnya,
dibutuhkan sekitar 5 sampai 6 detik dari waktu reseptor diaktifkan untuk kenaikan
pertama dalam arus kalsium amplitudo (Gambar 7.15a). Sebagian besar waktu ini
diambil dengan langkah menuju generasi jumlah yang cukup cAMP (adenilat siklase
GAMBAR 7.14 Waktu-kursus aktivasi G-protein-dimediasi GIRK saluran kalium
dalam sel kelinci simpul sinoatrial. (a). Saat Outward ditimbulkan oleh 33-msec, 50-
nA pulsa iontoporetik asetilkolin (antara anak panah). (b). Respon dari sel unclamped
ke pulsa iontoporetik asetilkolin (Ach). (Record (a) disesuaikan dengan izin dari
Trautwein et al., Di Reseptor Obat dan efektor mereka, Birdsall, . NJM, Ed,
Macmillan, New York, 1980, hlm 5-22; record (b) disesuaikan dengan izin dari
Noma, di Elektrofisiologi Sel Jantung Single, Noble, dan D. Powell, T., Eds,
Akademik. press, San Diego, CA, 1987, hlm 223-246.)
merupakan enzim relatif lambat-acting), sebagai latency berkurang menjadi sekitar
150 msec pada penerapan lompatan konsentrasi cAMP oleh lampu kilat fotolisis dari
intraseluler akumulasi photolabile cAMP prekursor (Gambar 7.15b).
Namun, latency saja tidak baik panduannya untuk jumlah langkah dalam
kaskade G-protein-dimediasi, geometri dan packing density juga penting. Dengan
demikian, (hampir) reaksi kaskade sama kompleks yang terlibat dalam respon
fotoreseptor ke lampu kilat (di mana rodopsin mengaktifkan transducin G-protein,
yang pada gilirannya mengaktifkan fosfodiesterase, yang mengurangi konsentrasi
cGMP sehingga menutup kation cGMP-gated saluran) sangat cepat, dengan latency
minimal sekitar 10 msec pada tertinggi intensitas berkedip (Gambar 7.16). Alasan
untuk ini adalah kepadatan sangat tinggi reseptor G-protein, dan fosfodiesterase
dalam cakram batang. Juga, fosfodiesterase memiliki (substrat-difusi-terbatas) tingkat
turnover jauh lebih tinggi dari pada adenilat siklase. Sebagai aturan praktis, rasio
biasa reseptor G-protein untuk efektor kanal ion mungkin sekitar 1:10:0.1, karena
saluran ion yang paling tampaknya memiliki kepadatan sekitar 1 per mikrometer
persegi, ini memberikan sekitar 10 reseptor dan sekitar 100 G-protein per mikrometer
persegi. Sebaliknya, ada sekitar 2500 molekul transducin dan sekitar 167 efektor
(fosfodiesterase) molekul per mikrometer persegi batang membran disk. Sebaliknya,
bahkan aktivasi langsung, atau inhibisi, dari saluran ion mungkin sangat lambat
dengan kepadatan rendah saluran dan G-protein (Gambar 7.17).
Untuk efektor kanal ion, Angka 7.8 dan 7.12 menggambarkan cara lain untuk
memutuskan apakah diaktifkan subunit G-protein berinteraksi langsung dengan
saluran atau tidak langsung melalui reaksi kaskade mengarah ke utusan sitoplasma,
menggunakan teknik patch-clamp ditampilkan, kalium GIRK saluran dicatat dalam
patch sel-terpasang pada Gambar 7.8 diaktifkan oleh asetilkolin di pipet patch yang
tetapi tidak pada menambahkan asetilkolin dengan solusi mandi luar patch,
menyiratkan efek lokal dari reseptor-activated protein-G pada saluran. Sebaliknya,
kalsium saluran dalam Gambar 7.12 ditutup dengan menambahkan agonis reseptor
muskarinik pada membran ekstra-patch melalui solusi mandi, menyiratkan bahwa
GAMBAR 7.15 Waktu-program dari peningkatan amplitudo arus kalsium direkam
dari kodok atrium trabekula berikut (A) aplikasi cepat dari agonis β-adrenoreseptor
isoprenalin (3 M), dan (B) rilis intraseluler cepat cAMP oleh flash-fotolisis cAMP o-
nitrobenzil. Aplikasi / berkedip dibuat pada waktu nol. (Dari Nargeot et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. Amerika Serikat, 80, 2395-2399, 1983. Dengan izin.)
beberapa utusan diffusible diproduksi untuk membawa pesan melalui sitoplasma dari
reseptor-diaktifkan G-protein untuk patch-tertutup saluran. Contoh lain seperti sinyal
jalur jarak jauh yang membawa pesan dari reseptor muskarinik-diaktifkan G-protein
untuk jenis lain dari saluran kalium diilustrasikan pada Gambar 7.18.
GAMBAR 7.16 (A) photocurrents sel batang salamander mengikuti berkedip
memberi antara 10 dan 2000 rhodopsin molekul isomerizations. (B) kenaikan
Dihitung dalam konstanta laju phosphodiesterase hidrolitik. (Dari Lamb, TD dan
Pugh, Jr, EN, Tren Neurosci., 15, 291-299, 1992. Dengan izin.)
GAMBAR 7.17 Dihitung latency (delay) antara aktivasi dari reseptor asetilkolin
muscarinic dan penutupan M-saluran kalium diplot terhadap kepadatan membran G-
protein (dalam satuan logaritmik) untuk berbagai kepadatan saluran kalium.
Diasumsikan (untuk kesederhanaan) bahwa diaktifkan GTP-bound α subunit
berinteraksi langsung dengan saluran kalium. Perhitungan didasarkan pada domba
dan Pugh (1992), dengan berikut koefisien difusi: reseptor, 0,7 m / detik; Gαβγ, 1,2 m
/ detik; Gα, 1,5 m / detik; channel, 0,4 m / detik.
Inset: latency diamati penghambatan saat ini pada 35 ° C dalam sel
neuroblastoma hibrida mengekspresikan muscarinic M1 reseptor asetilkolin setelah
aplikasi tekanan 100-msec ion barium (Ba, yang secara langsung colokan saluran)
dan asetilkolin (Ach). Perbedaan rata-rata latency (Ach - Ba) adalah ~ 272 msec. pada
diperkirakan channel dan G-protein kepadatan 1 dan 25/κm2, langsung-klik interaksi
G-protein-channel akan memprediksi latency ~ 180 msec. (Diadaptasi dari Robbins,
J. dkk, J. Physiol, 469, 153-178, 1993;.. Tambahan bahan yang tidak dipublikasikan
dari J. Robbins.)
GAMBAR 7.18 Contoh interaksi G-protein-efektor terpencil. Catatan
menunjukkan saluran kalium M-jenis Kegiatan direkam dari neuron tikus simpatik
pipet patch yang sel-terpasang diadakan di ~ 0 mV. kegiatan ini adalah ditekan ketika
muscarinic reseptor asetilkolin agonis, muscarine (10 M), diterapkan ke sel membran
luar elektroda menempel. (Solusi mandi berisi 25 mM [K +] untuk mengatur
membran potensial pada EK (~ -30 mV) dan mencegah depolarisasi oleh muscarine.)
Fakta bahwa muscarine tidak dapat menyebar melalui segel ketat antara kaca pipet
dan membran (difusi dan dari G-protein diaktifkan melalui membran ke saluran di
dalam patch elektroda akan sangat lambat) menunjukkan bahwa beberapa diffusible
substansi diproduksi untuk membawa pesan dari reseptor teraktivasi dan G-protein
luar patch ke saluran di patch. Catatan dan bar chart dalam (b) diperoleh dengan
menggunakan pipet patch yang sudah diisi dengan larutan muscarine. Terlepas dari
ini, saluran yang aktif dan masih bisa ditutup dengan menambahkan muscarine ke
membran ekstra-patch. Hal ini menunjukkan bahwa saluran tidak bisa ditutup oleh
interaksi lokal (langsung) dari diaktifkan G-protein dengan saluran (juga, bahwa tidak
cukup reseptor hadir di ditambal membran untuk menghasilkan jumlah yang cukup
utusan untuk menutup saluran). (Diadaptasi dari Selyanko et al., Proc. Roy. Soc.
London Ser. B, 250, 119-125, 1992.)
7.12 BACAAN
Beech et al., Neuron, 8, 97-106, 1992.
Bernheim et al., Neuron, 6, 859-867, 1991.
Birnbaumer, L., Transduksi sinyal reseptor dalam modulasi aktivitas efektor oleh G-
protein: pertama
20 tahun atau lebih, FASEB J., 4, 3068-3078, 1990.
Bourne, HR, Bagaimana reseptor berbicara dengan trimerik G-protein, Curr. Opin.
Cell. Biol., 9, 134-142, 1997.
Clapham, DE, The G-protein nano, Nature, 379, 297-300, 1996.
Clapham, DE dan Neer, E., G-protein βγ subunit, Annu. Rev Pharmacol. Toxicol., 37,
167-203, 1997.
Gudermann, T., Kalkbrenner, F., dan Schultz, G., Keanekaragaman dan selektivitas
interaksi reseptor-G-protein,
Annu. Rev Pharmacol. Toxicol., 36, 429-459, 1996.
Hille, B., Modulasi ion fungsi saluran oleh reseptor G-protein-coupled, Tren
Neurosci., 17, 531-536,
1994.
Ikeda, SR dan Dunlap, K., modulasi Tegangan tergantung dari saluran kalsium tipe
N: peran G-protein
subunit, Adv. Kedua Messenger phosphoprotein Res., 33, 131-151, 1999.
Lamb, TD dan Pugh, Jr, EN, cascades G-protein: keuntungan dan kinetika, Tren
Neurosci, 15, 291-299, 1992..
Rodbell, M., Peran reseptor hormon dan protein GTP-peraturan dalam transduksi
membran, Alam,
284, 17-22, 1974.
Vries, LD, Zheng, B., Fischer, T., Elenko, E., dan Farquhar, M., The pengatur G-
protein signaling keluarga,
Annu. Rev Pharmacol. Toxicol., 40, 235-271, 2000.
Wickman, KD dan Clapham, DE, regulasi G-protein saluran ion, Curr. Opin.
Neurobiol., 5, 278-285,
1995.
CHAPTER 8
TRANSDUKSI SINYAL MELALUI PROTEIN KINASE TIROSIN
8.1 PENDAHULUAN
8.1.1 Posforilasi debagai pengganti fungsi sel
Fosforilasi protein ditemukan pada era "regulasi alosterik." Peraturan
aktivitas enzim dapat dijelaskan oleh konsentrasi substrat, kehadiran kofaktor,
dan konsentrasi produk akhir (efektor alosterik). Salah satu jalur sehingga dianalisis
adalah jalur glikolisis. Langkah pertama dalam jalur ini adalah konversi glikogen
menjadi glukosa- 1-fosfat yang dimediasi oleh enzim yang disebut glikogen
fosforilase . Aktivitas enzim adalah ditemukan diatur melalui interaksi alosterik oleh
adenosin 5 ' -Monophosphate (stimulasi) dan glukosa-6-fosfat (penghambatan).
Glikogen fosforilase dapat diisolasi dalam dua bentuk: sebuah bentuk aktif (ditunjuk
dengan sebuah) Dan bentuk yang kurang aktif (ditunjuk dengan b). Pada tahun 1956,
Krebs dan Fischer menemukan bahwa fosforilasa b bisa menggabungkan satu
molekul fosfat organik di residu serin, sebuah proses yang menyertai peningkatan
aktivitasnya. Melalui penggabungan fosfat, fosforilase b memperoleh karakteristik
fosforilasa sebuah , menjadi kurang sensitif terhadap tindakan hambat glukosa-6-
fosfat dan lebih sensitif terhadap tindakan stimulasi adenosin 5 ' -Monophospate.
Dengan demikian, terlepas dari regulasi alosterik, modifikasi kovalen seperti
fosforilasi juga dapat mempengaruhi aktivitas enzim. Fosforilasi dikatalisis oleh
protein kinase, kinase fosforilasa. Kemudian ditemukan bahwa katalis fosfatase
fosforilasa defosforilasi, yang membawa enzim fosforilase kembali ke dalam b
negara. Pada tahun 1970, itu jelas bahwa hampir semua enzim diatur oleh fosforilasi /
defosforilasi, dan peneliti mulai mempertanyakan mengapa hal itu perlu untuk
memiliki dua sistem yang luas untuk mengendalikan enzim Kegiatan: regulasi
alosterik dan fosforilasi. Selain itu, dalam kasus fosforilasa dan enzim lain, glikogen
sintase, itu jelas bahwa regulasi alosterik dan kovalen mungkin bekerja melalui
perubahan konformasi serupa. Perbedaan mendasar antara kedua mode tindakan
menjadi jelas ketika ditemukan bahwa reseptor hormon, melalui pelepasan
intraseluler second messenger, pada gilirannya mengontrol aktivitas kinase
fosforilase. Sementara alosterik kontrol umumnya mencerminkan kondisi intraseluler,
fosforilasi terjadi sebagai respons terhadap ekstraseluler sinyal. Fosforilasi
memungkinkan organisme untuk mengontrol metabolisme dalam sel-sel individual.
Reaksi phosphorylation dan defosforilasi, seperti yang akan terlihat dalam paragraf
berikut, selalu bagian dari kaskade reaksi. Sistem kaskade memungkinkan untuk
amplifikasi besar serta modulasi baik dari sinyal asli. Sementara bidang serin /
treonin protein kinase meledak, tipe baru protein kinase memasuki arena pada tahun
1978 dengan penemuan bahwa sarkoma Rous virus yang terkandung protein kinase,
bernama v-src, bahwa protein terfosforilasi pada residu tirosin. Itu kemudian
menemukan bahwa reseptor faktor pertumbuhan mengandung protein tirosin kinase,
dan baru bidang penelitian berkembang pesat.
8.1.2 Faktor Tumbuh, Interleukin, Interferon Dan Sitokinin
Yang dapat mendukung pertumbuhan sel dalam kultur diisolasi dan dinamai (1)
sel-sel mereka terisolasi dari, (2) sel-sel mereka dirangsang, atau (3) tindakan prinsip
mereka tampil. Sebagai contoh, Faktor platelet-derived growth (PDGF), faktor
pertumbuhan epidermal (EGF), atau transforming growth factor (TGF). Di bidang
imunologi, faktor dipelajari bahwa pematangan diarahkan dan proliferasi sel darah
putih. Faktor ditemukan diberi nama interleukin atau colony-stimulating faktor.
Dalam virologi, faktor diteliti yang mengganggu dengan infeksi virus: interferon.
Dan, di penelitian kanker, faktor yang diteliti yang dapat mempengaruhi pertumbuhan
tumor padat - misalnya, tumor necrosis factor (TNF). Setiap bidang penelitian
percaya bahwa faktor difungsikan oleh dan besar hanya dalam kategori di mana
mereka terungkap. Ia juga percaya bahwa setiap faktor memiliki set tindakan
tambahan yang berhubungan satu sama lain dalam beberapa cara yang jelas. Dengan
kemajuan, menjadi jelas bahwa faktor pertumbuhan juga bertindak pada sel-sel dari
sistem kekebalan tubuh dan telah benar-benar tindakan yang tidak terkait. Selain itu,
hal itu menunjukkan bahwa konteks di mana sel-sel dipelajari (misalnya, adanya
faktor-faktor lain, kehadiran sel-sel lainnya, terpasang atau dalam suspensi, jenis
substrat) juga menentukan hasil dari respon seluler. Sebuah contoh yang baik adalah
TGF- β , Faktor awalnya menunjukkan untuk meningkatkan transformasi sel, maka
namanya. Kemudian ditemukan bahwa faktor ini adalah yang kuat penghambat
pertumbuhan jalur sel epitel berubah dan bahwa itu adalah faktor chemotactic sangat
ampuh untuk neutrofil. Telah diusulkan bahwa nama umum untuk faktor-faktor ini
harus sitokin , didefinisikan sebagai berikut:
Sitokin adalah suatu larut (glyco) protein, nonimmunoglobulin di alam, dirilis
oleh sel-sel hidup dari tuan rumah, yang bertindak nonenzymatically di picomolar
untuk konsentrasi nanomolar untuk mengatur fungsi sel inang.
Informasi ini tidak secara langsung relevan untuk memahami aksi protein
tirosin kinase, tetapi ini menggambarkan bahwa berbagai bidang penelitian yang
datang bersama-sama dan memperkenalkan wawasan baru ke dalam fungsi sel. Hal
ini juga menggambarkan bahwa fosforilasi tirosin tidak terbatas pada growthinducing
sitokin. Fosforilasi tirosin telah terbukti untuk mengatur sel-sel dan sel-matriks
interaksi melalui reseptor integrin dan tempat adhesi focal. Hal ini juga terlibat dalam
stimulasi dari ledakan pernafasan pada neutrofil. Pekerjaan dari sel-B imunoglobulin
M (IgM) dan afinitas tinggi IgE reseptor serta pendudukan T-sel dan interleukin-2
(IL-2) reseptor hasil dalam fosforilasi tirosin. Akhirnya, fosforilasi tirosin juga
terlibat dalam pemilihan tanggapan pemancar disebabkan oleh kontak neuronal.
Hanya sebagian kecil dari apa yang diketahui tentang peran protein tirosin
kinase dalam fungsi selular akan dibahas dalam bab ini, tetapi tetap harus
mengungkapkan beberapa prinsip yang memungkinkan pembaca untuk lebih
memahami sastra saat ini pada subjek. Bab ini dibagi menjadi dua luas bagian: satu
berhubungan dengan reseptor yang mengandung protein tirosin kinase sebagai bagian
integral dari molekul (protein reseptor tirosin kinase, atau PTKS)dan satu berurusan
dengan reseptor yang mengasosiasikan dengan sitosol protein tirosin kinase
(nonreceptor PTKS). Karena studi dengan genetik organisme diakses seperti
Drosophila dan Caenorhabditis elegans telah membuat kontribusi penting pada
penemuan jalur sinyal-transduksi, kami akan menggambarkan beberapa analogi
antara berbagai spesies dalam lampiran untuk bab ini. Pengetahuan ini juga akan
memfasilitasi pemahaman Anda tentang nomenklatur sinyal transduksi.
8.2 Reseptor Yang Mengandung Tirosein Kinase
8.2.1 Hubungan Reseptor Penyebab Aktivasi
Bagian ini berfokus pada sinyal-transduction jalan diprakarsai oleh mengikat
dari faktor pertumbuhan reseptor untuk mereka. Kita akan membatasi tunduk kepada
beberapa prinsip yang umumnya berlaku untuk -kinase tirosin reseptor yang
mengandung, dengan EGF, faktor penumbuh turunan platelet, dan syaraf faktor
pertumbuhan (NGF) reseptor sebagai contoh. EGF dan faktor penumbuh turunan
platelet benar faktor pertumbuhan, proliferasi dari sel epitel dan fibroblasts,
sedangkan peran utama dari NGF adalah untuk memastikan kelangsungan hidup
neuron dan/atau neurite adalah hasil daripada, tidak proliferasi.
Reseptor tirosin kinase-yang mengandung datang dalam berbagai bentuk,
disatukan oleh kehadiran dari domain membran-mencakup tunggal dan protein tirosin
kinase domain katalitik intraseluler (reseptor PTK). Rantai ekstraseluler bervariasi,
seperti digambarkan pada Gambar 8.1. banyak pertumbuhan reseptor faktor
mengandung domain imunoglobulin, yang berperan dalam pengikatan ligan, karena
itu, mereka adalah bagian dari superfamili imunoglobulin. Sebuah fitur umum adalah
bahwa hasil yang mengikat ligan dalam dimerisasi reseptor. Cross-linking reseptor
oleh faktor pertumbuhan dapat dicapai dalam beberapa cara. PDGF dan NGF adalah
disulfida-linked ligan dimer yang cross-link mereka.
GAMBAR 8.1 Klasifikasi protein tirosin kinase (PTK) yang mengandung reseptor.
Semua reseptor ini memiliki satu-membran-mencakup segmen dan semua dari
mereka memasukkan domain katalitik kinase, di beberapa kasus terganggu oleh
insert. Domain ekstraseluler bervariasi seperti ditunjukkan, tapi banyak mengandung
imunoglobulin motif yang bertindak sebagai situs pengikatan ligan. Beberapa
reseptor ini ada di berbagai isoform. FLT1, Fmsrelated tirosin kinase (reseptor untuk
faktor pertumbuhan endotel vaskular [VEGF]); PDGFR, platelet-derived reseptor
faktor pertumbuhan, EGFR, reseptor faktor pertumbuhan epidermal, INSR, reseptor
insulin, NGFR, pertumbuhan saraf reseptor faktor (juga dikenal sebagai TrkA),
FGFR, reseptor faktor pertumbuhan fibroblast. (Diadaptasi dari Heldin, hal.4.)
GAMBAR 8.2 Aktivasi dan reseptor sinyal pembentukan kompleks. Pada
pendudukan oleh ligan, protein tirosin kinase (PTK) yang mengandung reseptor
membentuk dimer, yang menginduksi perubahan konformasi dari domain sitoplasmik
yang mengungkapkan aktivitas PTK latennya. Ini phosphorylates residu tirosin pada
linked reseptor molekul (interphosphorylation). The terdimerisasi, molekul
terfosforilasi merupakan katalis reseptor aktif. Activated EGF, PDGF, atau reseptor
NGF (EGF-R, PDGF-R, atau NGF-R, masing-masing) asosiasi dengan efektor,
termasuk enzim (misalnya, PLC γ , GAP) atau adaptor protein yang merekrut enzim
(misalnya, Gab-1, P85 PI 3 -kinase, Grb2), untuk membentuk kompleks sinyal
reseptor.
Ketika mereka mengikat reseptor mereka, silang secara otomatis. EGF, yang
ligan monomer, mengubah konformasi reseptor dalam domain ekstraselular, yang
memungkinkan monomer diduduki saling mengenali. Sinyal aktivasi, tentu saja, lebih
rumit dari ini. Untuk aktivasi semua fungsi reseptor, tidak hanya harus molekul
reseptor akan dibawa bersama sebagai dimer, tetapi mereka juga harus berorientasi
dengan benar dalam hubungannya dengan satu sama lain.
Dimerisasi memungkinkan aktivitas kinase dari kedua rantai intraseluler
menghadapi urutan target di sisi lain, molekul reseptor terkait. Hal ini memungkinkan
antarmolekul cross-fosforilasi beberapa residu tirosin (Gambar 8.2). The terfosforilasi
dimer kemudian merupakan reseptor aktif. Ia memiliki sebuah array dari
phosphotyrosines yang memungkinkannya untuk mengikat protein untuk membentuk
reseptor sinyal kompleks . Selain itu, reseptor terdimerisasi dan terfosforilasi
memiliki potensi phosphorylating target.
8.2.2 Src dan Ptb Homologi Domain dan Susunan dari Kompleks Reseptor
Signaling
Setelah pembentukan kompleks sinyal reseptor didirikan, itu penting untuk
membangun bagaimana protein berinteraksi dengan reseptor tirosin terfosforilasi.
Analisis urutan protein yang mengikat telah menunjukkan bahwa banyak, tapi tidak
semua dari mereka, mengandung domain juga hadir dalam sitoplasma protein tirosin
kinase Src, maka nama SH2 domain . Lain mengandung domain yang sebelumnya
diidentifikasi sebagai domain phosphotyrosine-binding (PTB). Bukti untuk peran
SH2 domain dalam transmisi sinyal karena PTKS reseptor berasal dari temuan bahwa
penghapusan SH2 domain dihapuskan interaksi dengan reseptor dan respon seluler.
bukti lebih lanjut berasal dari temuan bahwa hanya γ isoform dari fosfolipase C
(PLC) langsung diaktifkan oleh reseptor ini. Secara signifikan, PLC γ , Tapi tidak β
dan δ isoform, memiliki SH2 domain. Di Kesimpulannya, perakitan sinyal kompleks
tergantung pada perekrutan dengan tirosin-terfosforilasi reseptor protein memiliki
SH2 atau PTB domain. Banyak protein mengandung SH2 domain mengasosiasikan
dengan PTKS reseptor dalam pembentukan sinyal kompleks, dan pilihan ini adalah
diilustrasikan pada Gambar 8.3.
GAMBAR 8.3. Organisasi domain protein yang mengasosiasikan dengan tirosin
kinase terfosforilasi (PTK) - mengandung reseptor. Protein yang mengasosiasikan
dengan reseptor tirosin-terfosforilasi mengandung SH2 atau PTB domain, yang
mengakui membentang amino-asam tertentu di sekitar residu tirosin terfosforilasi.
Berbeda dengan enzim, adapter kurangnya aktivitas katalitik intrinsik tetapi
berfungsi untuk menghubungkan reseptor terfosforilasi dengan protein efektor
lainnya. Beberapa protein yang disajikan dalam gambar ini dibahas dalam bab ini.
asosiasi ini, meskipun tidak jelas apakah atau tidak proses ini selalu diperlukan
untuk mereka aktivasi. Dalam kasus PLC, Fosforilasi tentu diperlukan.
Dari berbagai adapter dan enzim yang berinteraksi dengan EGF, PDGF, atau reseptor
NGF, beberapa muncul untuk mengikat lebih erat daripada yang lain, menunjukkan
kepekaan terhadap residu asam amino dalam disekitar phosphotyrosines (Gambar
8.3). Dengan demikian, reseptor tertentu dapat menularkan sinyal melalui panel SH2-
atau PTB yang mengandung protein. Masih belum jelas, namun, jika dua atau lebih
protein intraseluler dapat mengikat molekul reseptor secara bersamaan.
8.2.3 B Peternakan DARI THE SIGNALING PATHWAY
Sejumlah jalur sinyal transduksi-cabang keluar dari reseptor sinyal kompleks.
Lima cabang seperti dijelaskan dalam teks berikut (lihat Gambar 8.4).
8.2.3.1 The Ras Signaling Pathway
8.2.3.1.1 Ras dan Transformasi your
Infeksi tikus dengan virus murine leukemia dapat memprovokasi pembentukan
sarkoma. Sebuah utama muka adalah penemuan bahwa murine virus sarkoma Harvey
mengkode menerus diaktifkan bentuk H-ras gen, sebuah guanosin trifosfat monomer
(GTP)-binding protein, atau GTPase, di mana valin menggantikan glisin pada posisi
12. Protein GTP-binding bertindak sebagai monostable switch. Mereka adalah "on" di
negara GTP-bound dan "off" di difosfat guanosin (PDB) - keadaan terikat.
Pengikatan GTP terjadi melalui disosiasi GDP (pertukaran reaksi), dan GTP yang
kemudian hilang melalui hidrolisis (reaksi GTPase). Keadaan aktivasi kinetis
GAMBAR 8.4 Percabangan jalur sinyal-transduksi. Setelah aktivasi reseptor PTK,
beberapa jalur sinyal-transduksi dapat diaktifkan, lima di antaranya ditunjukkan di
sini (lihat teks untuk rincian lebih lanjut).
diatur, positif oleh tingkat awal PDB disosiasi dan asosiasi selanjutnya GTP dan
maka negatif oleh tingkat di mana GTP dihidrolisis (Gambar 8.5). Valin-to-glisin
substitusi mencegah hidrolisis GTP, sehingga Ras aktif konstitutif (juga disebut
sebagai mutasi gain-of-fungsi). Ekspresi mutan ini pada fibroblast tikus diam
mengakibatkan diubah morfologi sel, stimulasi sintesis DNA, dan proliferasi sel. Bila
diekspresikan, biasa Hc-Ras juga menginduksi transformasi onkogenik seperti halnya
injeksi dari protein mutan. Sebaliknya, suntikan menetralisir antibodi untuk
menghambat fungsi Ras yang normal membalikkan transformasi sel. Akhirnya,
stimulasi sel diam dengan serum atau dengan faktor pertumbuhan dimurnikan
menyebabkan aktivasi Ras, melalui promosi pertukaran GDP untuk GTP. Ini menjadi
jelas bahwa Ras merupakan komponen penting dalam mengatur jalur sinyal
proliferasi sel, tapi bagaimana Ras akan masuk ke jalur yang dikenal berasal dari
reseptor faktor pertumbuhan masih belum jelas untuk waktu yang cukup.
8.2.3.1.2 Peraturan Ras di Vertebrata
The diaktifkan reseptor faktor pertumbuhan mengikat Grb2, sebuah protein
adaptor, melalui domain SH2 nya, dan tindakan ini merekrut hSos penukar nukleotida
guanin ke membran plasma, sehingga dalam sekitar Ras. Para hSos diaktifkan
sekarang pertukaran GDP untuk GTP dan membawa ke Ras diaktifkan nya negara,
siap untuk sinyal ke dalam sel melalui interaksi dengan molekul efektor nya.
Ras-GTPase mengaktifkan protein P120 GAP berisi dua SH2 domain (Gambar
8.3). Hal ini juga mengikat phosphotyrosines pada reseptor aktif, dan merupakan
komponen dari kompleks sinyal yang merakit pada reseptor PDGF aktif (Gambar
8.2). Tidak jelas apa peran asosiasi dari GAP bermain dalam transduksi sinyal.
Misalnya, sel-sel yang mengekspresikan mutan dari reseptor PDGF yang gagal untuk
mengikat GAP mewujudkan aktivasi normal Ras.
8.2.3.1.3 Dari Ras ke MAP Kinase dan Aktivasi Transkripsi
Peristiwa setelah aktivasi Ras akhirnya menyebabkan aktivasi MAP kinase,
diikuti *oleh aktivasi ekspresi gen respon langsung-awal. Aktivasi MAP kinase
membutuhkan dua langkah menengah, yang keduanya melibatkan fosforilasi
(Gambar 8.5). Yang segera penggerak MAP kinase MAP-kinase-kinase (juga disebut
MAP kinase-kinase ERK, atau MEK), enzim yang paling tidak biasa yang
phosphorylates MAP kinase pada kedua treonin (T) dan tirosin (Y) residu. Ini adalah
dalam target-urutan tujuh residu (LTEYVATRWYRAPE) (Tabel 8.1)
Gambar 8.5 Peraturan ras-MAP kinase oleh reseptor protein kinase tirosin. Adaptor
Grb2 protein, berkaitan dengan pertukaran guanin faktor Sos, menempel pada tirosin-
terfosforilasi reseptor melalui domain SH2 nya. Hal ini membawa kompleks
Grb2/hSos ke sekitar membran, di mana mengkatalisis pertukaran nukleotida guanin
di Ras. The diaktifkan asosiasi Ras dengan serin / treonin protein kinase Raf-1. Its
penempatan di hasil membran aktivasi dan fosforilasi berikutnya dari dual-
kekhususan kinase MEK. Hal ini menyebabkan fosforilasi ganda MAP kinase (tirosin
dan treonin residu) dan memperlihatkan peptida sinyal yang memungkinkan MAP
kinase untuk berinteraksi dengan protein yang membimbing ke dalam nukleus
(translokasi). Di dalam inti, MAP kinase phosphorylates p62 TCF, Yang kemudian
asosiasi dengan p67 SRF untuk membentuk sebuah kompleks transkripsi faktor aktif
yang mengikat DNA pada elemen serum-respon (SRE).
Di sisi N-terminal motif APE dilestarikan, hadir di tengah katalitik kinase.
Fosforilasi di situs tersebut membuat protein kinase katalis kompeten. Sampai saat
ini, MAP kinase tampaknya menjadi substrat unik untuk fosforilasi oleh MEK,
menunjukkan terutama tingkat tinggi spesifisitas.
Bergerak lebih hulu, hilir kinase pertama Ras adalah Raf-1 (juga dikenal
sebagai MAPkinase- kinase-kinase, atau MAPKKK) kinase ini awalnya diidentifikasi
sebagai produk onkogen menyebabkan fibrosarcoma pada tikus. Temuan berikutnya
yang diaktifkan Ras merekrut Raf-1 ke membran dan akibatnya membawa kinase
aktivasi link MAP kinase dengan jalur Ras. Dalam aktivasi Raf-1, adalah rekrutmen
ke membran plasma, tidak ada hubungan yang sebenarnya dengan diaktifkan Ras,
yang diperlukan. Tentu saja, hubungan dengan Ras sangat penting dalam kondisi
normal kondisi, namun bentuk mutan dari Raf-1 memiliki kotak C-terminal-Caax
yang bertindak sebagai situs untuk prenylation (dan karena itu yang berhubungan
secara permanen dengan membran plasma) instigates peristiwa hilir independen dari
Ras. Dengan demikian, peran Ras dalam fisiologis Situasi dapat dianggap sebagai
yang dari membran-terletak merekrut sersan.
8.2.3.1.4 Selain MAP Kinase: Aktivasi Ekspresi Gen
The diaktifkan MAP kinase memperlihatkan peptida sinyal yang
memungkinkan untuk berinteraksi dengan protein yang mempromosikan translokasi
ke dalam nukleus. Di dalam, itu mengkatalisis fosforilasi substrat pada motif Ser-Pro
dan Thr-Pro. Dalam kasus stimulasi oleh EGF dan PDGF, aktivasi
MAP kinase merupakan syarat mutlak untuk proliferasi sel. Dalam kasus NGF,
stimulasi berperan dalam perkembangan neurite dan kelangsungan hidup. Gen-gen
respon awal menjadi aktif dalam satu jam stimulasi reseptor. Aktivasi mereka bersifat
sementara dan dapat terjadi dalam kondisi di yang sintesis protein terhambat.
Aktivasi EGF, PDGF, atau hasil reseptor NGF dalam induksi cepat dari faktor
transkripsi c-Fos, salah satu yang pertama sitokin-diinduksi transkripsi faktor yang
harus ditemukan. * Ini menempati posisi sentral dalam regulasi ekspresi gen. Lain
gen respon awal meliputi c-myc, JunB, Dan c-Juni. Promotor daerah dari c-fos gen
mengandung elemen serum-respon (SRE), domain DNA yang mengikat faktor
transkripsi p67 SRF (Serumresponse Faktor) dan p62 TCF (Faktor terner-kompleks).
** Fosforilasi p62 TCF pada residu ser- 383 dan ser-389 oleh MAP kinase
meningkatkan pembentukan kompleks dari kedua faktor transkripsi dengan DNA
untuk mempromosikan transkripsi c-fos gen (Gambar 8.5). Aktivasi kinase MAP
jalur meningkatkan transkripsi gen respon awal, seperti c-fos, yang pada gilirannya
harus terlibat dalam ekspresi dari sejumlah besar gen mengingat adanya 12 O-
tetradecanoylphorbol- 13-asetat (TPA) elemen (TRE) di wilayah promotor dari
banyak gen responsif.
8.2.3.1.5 lainnya Aktivator Ras dan efektor
Faktor pertukaran nukleotida guanin selain hSos juga telah ditemukan untuk
mengaktifkan Ras, seperti yang telah efektor lainnya (lihat Tabel 8.2). Ini mungkin
berinteraksi dengan urutan yang unik dalam lingkaran efektor. Itu Pertanyaannya
tetap, namun, untuk berapa banyak efektor yang berbeda dapat melampirkan
diaktifkan Ras dan apa yang menentukan tingkat prioritas mereka.
8.2.3.1.6 Sebuah Keluarga Kinase MAP
Setelah itu kloning, tampak jelas bahwa MAP kinase adalah anggota dari
keluarga besar protein yang dapat diklasifikasikan ke dalam tiga kelompok fungsional
utama. Yang pertama menengahi mitogenik dan sinyal diferensiasi, dan dua lainnya
berhubungan dengan respon seluler terhadap stres dan sitokin inflamasi. Anggota
GTPases homolog ke Ras (rho keluarga GTPases), di khususnya Cdc42 dan Rac,
memainkan peran dalam inisiasi kaskade ini. MAP kinase keluarga anggota
beroperasi di tiga jalur (Gambar 8.6):
1. ERK jalur. ERK1 dan ERK2 adalah kinase MAP prototypic dijelaskan dalam
sebelumnya teks. The ERK (kinase ekstraseluler-sinyal-diatur) keluarga memiliki
tujuh anggota, namun, sebagian besar lebih tinggi isoform nomor tidak berfungsi
di mitogenik jalur.
2. SAPK / JNK jalur. Dalam kelas, Juni SAPK (stres-activated protein kinase) Kinase
N-terminal (JNKs) membentuk subfamili (SAPK/JNK1-3).
3. p38/HOG jalur. Tinggi osmolaritas gliserol (HOG) diinduksi oleh stres osmotik
dalam ragi (Saccharomyces cerevisiae), mengakibatkan aktivasi ini 38 kDa protein
kinase. P38 MAP kinase membentuk subfamili lain dari empat anggota.
Masing-masing jalur tersebut melibatkan kaskade kinase sehingga fosforilasi
dan aktivasi dari MAP anggota keluarga kinase. Masing-masing berisi situs ganda
fosforilasi (TEY, TPY, atau TGY) dan residu sentral dalam karakteristik motif kelas,
seperti yang ditunjukkan pada Tabel 8.1. Hal ini terbukti bahwa sel-sel diberkahi
dengan jalur sinyal transduksi-paralel dan bahwa mereka dapat beroperasi individual
atau dalam kombinasi untuk memulai pola tertentu ekspresi gen. Selain itu, crosstalk
antara jalur pasti terjadi. Tak satu pun dari jalur tersebut memiliki fungsi yang unik,
melainkan lebih mungkin bahwa kombinasi jalur yang diaktifkan (atau dibungkam)
bersama-sama dengan
GAMBAR 8.6 jalur Sejalan dengan transkripsi dan keluarga MAP kinase. Kinase
MAP dapat diklasifikasikan menjadi tiga
kelompok, berdasarkan pada identitas residu menengah dalam motif ganda
fosforilasi mereka (TEY, TGY, atau TPY). Klasifikasi ini juga mendefinisikan tiga
jalur sinyal transduksi yang berbeda-diindikasikan sebagai ERK, para JNK / SAPK,
dan jalur p38/HOG, masing-masing memiliki protein kinase unik bertindak hulu
GAMBAR 8.7 Klasifikasi phosphatidylinositol-3 kinase (PI-3 kinase). (Kiri) Enzim
diklasifikasikan menjadi tiga kelompok berdasarkan struktur molekul subunit yang
berisi domain kinase. Kelas I adalah dibagi ke dalam kelompok A dan B. Grup A
terdiri α, β, dan γ, yang berinteraksi dengan subunit regulasi, P85 atau P55. Grup B
memiliki satu anggota, p110γ, diatur oleh G-protein βγ subunit. Hal ini juga
ditemukan terkait dengan protein P101 yang belum diketahui identitasnya. (Kanan)
PI-3 kinase phosphorylate posisi 3OH di cincin inositol dari lipid
phosphatidylinositol. PH domain PKB berinteraksi istimewa dengan PI- ,4,5-P
produk. PTEN adalah fosfatase 3-fosfat inositol dan melawan fosforilasi oleh PI3-
kinase. (Diadaptasi dari Vanhaesebroeck et al., TIBS, 22, 267-272, 1997.)
konteks seluler memutuskan hasil dari respon, termasuk proliferasi, diferensiasi,
invasi jaringan, atau sel mati.
8.2.3.2 PKB Signaling Pathway
Tirosin terfosforilasi faktor pertumbuhan reseptor merekrut p85PI3-kinase,
molekul adaptor yang asosiasi dengan p110PI3-kinase, dan bersama-sama mereka
membentuk lipid kinase disebut phosphatidylinositol-3 kinase (PI3-kinase). Protein
kinase memainkan peran penting dalam sejumlah proses seluler: regulasi
glycogenesis (sebagai respon terhadap insulin), regulasi ukuran sel, migrasi,
kelangsungan hidup, dan proliferasi. Dalam bab ini, kita akan fokus pada perannya
dalam proliferasi seluler (EGF, PDGF) melalui regulasi sintesis protein dan perannya
dalam apoptosis (NGF) melalui inaktivasi BAD dan
caspase-9 dan penghambatan translokasi nuklir faktor transkripsi FKHRL-1.
8.2.3.2.1 PI-3 kinase
PI-3 kinase terdiri keluarga enzim dibagi dalam tiga kelas. Mereka memiliki
berbeda substrat dan berbagai bentuk regulasi. Mereka semua memiliki empat
homolog daerah, kinase domain yang paling kekal (Gambar 8.7). Uniknya, I enzim
kelas mengaktifkan protein kinase B dan karena itu akan dibahas dalam bab ini. Kelas
ini fosfolipid kinase memfosforilasi PI, PI-4-P, dan PI-4,5-P2 (substrat disukai) pada
3 posisi cincin inositol (Gambar 8.7). Enzim ini memiliki dua subunit: regulasi (P55
atau P85) dan catalytic (P110), masing-masing ada di berbagai bentuk. Struktur
multidomain dari subunit regulasi, khususnya P85, menunjukkan bahwa mereka
harus dapat berinteraksi dengan sejumlah sinyal protein. The SH2 domain
memungkinkan mereka untuk mengikat residu phosphotyrosine, dan SH3 domain
memungkinkan interaksi dengan urutan kaya prolin hadir, misalnya, dalam molekul
adaptor SHC, yang Cdc42GAP protein GTPase-mengaktifkan, atau pengatur T-
limfosit reseptor (TCR) sinyal, CBL. Selain itu, P85 subunit mengandung breakpoint
klaster daerah (BCR) homologi domain yang berinteraksi dengan anggota keluarga
Rho dari GTPases, Rac, dan Cdc42, menyediakan namun peluang lebih lanjut untuk
regulasi. Katalitik P110 Subunit memiliki empat isoform, yang semuanya
mengandung domain kinase dan Ras situs interaksi. Selain itu, α, β, dan γ isoform
memiliki situs interaksi untuk P85 subunit. I enzim kelas dapat lebih dibagi dua, IA
enzim kelas berinteraksi melalui SH2 domain mereka dengan phosphotyrosines hadir
di kedua tirosin kinase protein atau docking protein seperti insulin-reseptor substrat
(IRSs, GAB-1) atau linker untuk aktivasi sel T (lats, dalam kasus Sel T).
8.2.3.2.2 Phosphatidyl Inositol Fosfatase
Fosforilasi inositol dapat dinetralkan oleh dua fosfatase lipid: SH2-mengandung
inositol fosfatase (KAPAL) dan fosfatase dan tensin homolog dihapus dari kromosom
10 (PTEN). Dephosphorylates KAPAL pada 5 posisi inositol dan ditemukan sebagai
protein yang asosiasi dengan protein SHC adaptor dalam sel hemopoietic. KAPAL
memainkan peran utama dalam modulasi signaling reseptor permukaan sel-
hemopoietic. Ketiadaan, melalui gangguan ditargetkan pada tikus, dikaitkan dengan
peningkatan jumlah granulosit-makrofag nenek moyang dan dengan berlebihan
infiltrasi jaringan oleh sel-sel. PTEN ditemukan sebagai suppresser tumor karena
menonaktifkan mutasi terdeteksi di glioblastomas, melanoma, dan kanker payudara,
prostat, dan karsinoma endometrium. Urutannya mengungkapkan karakteristik
protein fosfatase dual-kekhususan namun substrat favorit adalah Phosphoinositide.
Ini dephosphorylates pada 3 posisi cincin inositol, menangkal fosforilasi oleh kinase
PI3-(Gambar 8.7). Ekspresi ektopik PTEN-kekurangan Hasil sel tumor dalam
penangkapan siklus sel di fase G1 akhirnya diikuti oleh apoptosis. Itu juga
mengurangi migrasi sel, temuan yang mungkin menjelaskan mengapa hilangnya
produk gen sering terkait dengan tumor metastatik stadium akhir.
8.2.3.2.3 Aktivasi PI-3 Kinase
The EGF dan PDGF reseptor langsung mengikat subunit P85-adaptor PI3-
kinase melalui interaksi residu tirosin terfosforilasi mereka dengan SH2 domain
adaptor. Ini perekrutan kemungkinan besar ditegakkan oleh mengikat simultan
diaktifkan Ras ke P110-katalitik domain kinase lipid. Dalam kasus NGF, situasinya
berbeda. Aktivasi NGF reseptor (TrkA) menyebabkan fosforilasi dari "docking
protein" di sejumlah residu tirosin. Docking ini protein, bernama Grb2 terkait
pengikat 1 (Gab-1) menyerupai salah satu substrat utama dari reseptor insulin, IRS-1,
protein dengan fungsi yang sama. The SH2 domain P85- protein adaptor sekarang
mengikat Gab-1. Pengikatan PI3-kinase pada reseptor diaktifkan atau docking protein
merekrut ke membran dan membawanya ke dalam kontak dengan fosfolipid
(substrat), yang merupakan aktivasi. Yang penting, generasi berikutnya dari PI-3 hasil
,4,5-P3 di aktivasi serin / treonin protein kinase B (PKB).
8.2.3.2.4 Kinase B Protein dan Aktivasi melalui PI-3 ,4,5-P3
Protein kinase B, atau Akt, ditemukan sebagai produk dari onkogen yang akut
mengubah retrovirus AKT8, menyebabkan limfoma sel-T pada tikus. Ini mengkode
hasil fusi dari seluler serin / treonin protein kinase dan virus struktural protein Gag.
Kinase ini mirip dengan kedua protein kinase Cε (PKCε, identitas% 73 ke domain
katalitik) dan protein kinase A (PKA 68%). Ini berbeda dari kinase protein lainnya
yang mengandung homologi pleckstrin (PH) domain, yang memungkinkan untuk
mengikat polyphosphoinositide kelompok kepala (dan juga ke G-protein βγ subunit).
Sampai saat ini, tiga subtipe telah diidentifikasi: α, β, dan γ, yang semuanya
menunjukkan jaringan distribusi yang luas. Itu
GAMBAR 8.8 Mekanisme aktivasi protein kinase B (PKB). PI3-kinase yang
direkrut untuk membran melalui hubungan langsung dengan reseptor PTK atau
melalui asosiasi dengan protein docking Gab-1. Ini mengkatalisis generasi fosfatidil
3,4,5-inositolphosphate, yang berfungsi sebagai sinyal membran-perekrutan untuk
PKB. Terkait dengan membran, pertama-tama terfosforilasi dalam domain katalitik
oleh PDK1 dan kemudian oleh PDK2 dalam motif hidrofobik. The diaktifkan PKB
kemudian melepaskan dari membran.
ditemukan bahwa PI-3 kinase, melalui produksi PI-3 ,4,5-P3 adalah penggerak
PKB. Itu mekanisme aktivasi ini ternyata proses tahapan, dengan fosfolipid yang
bermain dua peran yang berbeda. Salah satunya adalah langsung, merekrut PKB ke
membran melalui pengikatan lipid kepala kelompok ke domain PH di segmen N-
terminal. Interaksi lain adalah tidak langsung, melibatkan perekrutan dua kinase
protein terlarut, PDK1 dan PDK2 (3 phosphoinositide-dependent protein kinase 1 dan
2), juga dikaruniai dengan domain PH. Pengikatan PI-3 ,4,5-P3 sangat penting,
karena memungkinkan PDK1, PDK2, dan PKB untuk datang bersama-sama (Gambar
8.8). PDK1 phosphorylates PKB di perusahaan katalitik lingkaran, tetapi sinyal
aktivasi penuh memerlukan fosforilasi kedua di C-terminal domain. Reaksi ini
tergantung pada PDK2, yang belum diidentifikasi secara benar. Dua kali lipat
fosforilasi PKB menyebabkan detasemen nya dari membran, dan ini memungkinkan
untuk berinteraksi dengan substrat yang lain dalam sel. Produk onkogen virus, v-Akt,
memiliki jangkar lipi (Kelompok miristoil), yang berarti bahwa protein kinase sudah
terletak di membran, yang dapat memfasilitasi aktivasi.
8.2.3.2.5 PKB dan Peraturan Sintesis Protein
The PI3-kinase/PKB jalur mengatur sintesis protein melalui aktivasi eukariotik
terjemahan inisiator faktor-4E (EIF-4E) dan ribosom protein kinase p70 S6-kinase.
EIF-4E adalah faktor inisiasi membatasi sintesis protein di sebagian besar sel, dan
aktivitas yang memainkan seorang pelaku berperan dalam menentukan tarif
terjemahan global. Hal ini diatur oleh fosforilasi (misalnya, melalui MAP kinase)
tetapi juga dengan mengikat protein represor translasi, 4E-BPs. Ini represor tidak
aktif oleh fosforilasi. S6 protein merupakan komponen dari ribosom 40S subunit, dan
fosforilasi yang meningkatkan laju penerjemahan, sehingga meningkatkan protein
sintesis. Komponen S6 difosforilasi oleh kinase S6, yang beberapa isoform memiliki
telah diidentifikasi, salah satunya adalah p70-S6 kinase. Kegiatan mereka diatur oleh
insulin, pertumbuhan faktor, atau glukagon. Kedua 4E-BP1 dan p70-S6 kinase berada
di bawah kendali PKB, tapi ini tidak langsung, melibatkan lagi protein kinase, protein
FKBP-rapamycin terkait (FRAP) / mTOR, homolog manusia dari ragi TOR gen
(Gambar 8.9). Protein kinase adalah awalnya diakui sebagai target rapamycin,
immunosuppressant dan inhibitor protein sintesis. FRAP / mTOR phosphorylates 4E-
BP1, yang menyebabkan pelepasan EIF-4E, yang dapat sekarang berpartisipasi dalam
inisiasi sintesis protein. Hal ini juga phosphorylates p70-S6 kinase, yang memiliki
efek stimulasi pada translasi protein.
8.2.3.2.6 Aktivasi PKB dan Peraturan cyclinD Ekspresi
Substrat lain dari PKB adalah glikogen sintase kinase 3β (GSK3β), yang
menyebabkan fosforilasi inaktivasi nya. Seperti namanya menunjukkan, protein
kinase ini pada awalnya ditemukan sebagai regulatorc
GAMBAR 8.9 Peraturan sintesis protein, siklus sel, dan kelangsungan hidup. (A)
Melalui aktivasi PKB, PI-3 kinase mengontrol inisiasi dan terjemahan dalam sintesis
protein. Activated PKB phosphorylates dan mengaktifkan protein kinase FRAP, yang
phosphorylates 4E-BP1, penghambat faktor inisiasi EIF-4E. The dibebaskan EIF-4E
melekat pada struktur tutup mRNA dan, dengan cara menyetrika keluar jepit rambut,
memfasilitasi asosiasi EIF 2GTP dan 40S subunit ribosom. FRAP juga
phosphorylates dan mengaktifkan p70S6 kinase yang pada gilirannya phosphorylates
S6 protein dari subunit ribosom 40S. Terfosforilasi S6 meningkatkan efisiensi
translasi protein. (B) PKB mengontrol stabilitas cyclinD1 pada dua tingkat. Ini
phosphorylates dan menginaktivasi GSK3β, sehingga mencegah fosforilasi cyclinD1
dan karenanya kehancuran ubiquitin-dimediasi nya. PKB juga phosphorylates dan
mengaktifkan FRAP melalui yang mengatur stabilitas cyclinD1 mRNA dan protein
sendiri oleh jalur belum jelas (tidak ditampilkan). (C) PKB mengontrol kelangsungan
hidup sel melalui penyerapan dari FKHRL dalam sitosol dan inaktivasi buruk dan
caspase-9.
glikogen sintase. GSK3β juga memainkan peran penting dalam penghancuran
dimediasi protein melalui jalur ubiquitination. Ketika cyclinD1 difosforilasi oleh
GSK3β, menjadi ubiquitinated, sebuah proses yang melibatkan penambahan sejumlah
peptida ubiquitin kecil dalam urutan, yang berfungsi sebagai sinyal pengakuan untuk
mesin seluler-protein-kehancuran 26S proteosome. Fosforilasi dan penghambatan
GSK3β oleh PKB, karena itu, mencegah penghancuran cyclinD1 (Gambar 8.9).
Selain itu, aktivasi PKB juga meningkatkan transkripsi gen cyclinD1,
meskipun Sinyal-jalur transduksi menyebabkan efek ini belum terungkap. Kombinasi
daripeningkatan ekspresi dan kehancuran berkurang menyebabkan akumulasi dalam
sel dari cyclinD1 protein. CyclinD1, terkait dengan subunit katalitik, kinase cyclin-
dependent 4 atau 6 (CDK4 atau 6) adalah kekuatan pendorong dari siklus sel selama
fase G1, karena itu adalah salah satu yang paling penting
siklin dalam mengatur proliferasi sel.
8.2.3.2.7 PKB dan kelangsungan hidup Seluler
Seperti disebutkan sebelumnya, NGF tidak dianggap sebagai faktor
pertumbuhan yang benar, sebaliknya, kehadirannya menyebabkan neurite
perkembangan dalam sel PC12, tanda diferensiasi selular. Ia juga memiliki penting
peran dalam kelangsungan hidup neuron. Neuron kekurangan NGF memulai proses
kematian sel terprogram, apoptosis. Kehadiran NGF entah bagaimana harus menjaga
sinyal kelangsungan hidup intraseluler, dan PKB memainkan peran penting dalam
acara ini karena menginduksi sejumlah phosphorylations yang menyelamatkan sel
dari apoptosis. PKB mempromosikan penyelamatan melalui setidaknya dua jalur
(Gambar 8.9). salah satunya adalah melalui fosforilasi langsung dan inaktivasi
komponen mesin apoptosis, termasuk BAD dan caspase-9. BAD, anggota keluarga
Bcl-2 dari regulator apoptosis, mempromosikan dimerisasi dan aktivasi caspases
inisiator (orang-orang yang memulai proses apoptosis). Caspases adalah protease
yang mengandung sistein dalam situs katalitik dan protein membelah pada asparate
residu, maka nama mereka (protease sistein-asparate). Caspase-9 adalah salah satu
inisiator caspase tersebut, dan perannya adalah untuk membelah dan mengaktifkan
disebut caspases efektor lain, mereka yang merusak penting komponen sel (inhibitor
nucleases DNA, enzim perbaikan DNA, dan komponen sitoskeleton). PKB bisa juga
langsung memfosforilasi caspase-9, rendering enzim kurang sensitif terhadap
aktivasi. Jenis lain dari perlindungan yang ditawarkan oleh fosforilasi FKHR-L1,
sebuah faktor transkripsi (anggota Drosophila forkhead / bersayap-helix keluarga
AFX, FKHR, dan FKHR-L1, yang orthologs DAF-16, faktor forkhead yang mengatur
umur panjang dalam Caenorhabditis elegans). Ketika terfosforilasi, FKHRL1 masih
dipertahankan dalam sitosol dan dicegah dari mengaktifkan gen penting untuk
induksi faktor yang mendorong kematian sel seperti ligan Fas. Sekali menyatakan,
ligan Fas akan berikatan dengan reseptor permukaan sel dan menginduksi reseptor
trimerisasi, mengakibatkan aktivasi caspases inisiator. Acara ini pasti akan
mengakibatkan kematian sel.
8.2.3.3 The PLCγ dan Protein Kinase C Sinyal-Transduksi Pathway
8.2.3.3.1 PKC, Keluarga dari Kinase Protein
Di antara kegiatan yang digerakkan oleh aktivasi dari reseptor EGF dan PDGF
adalah generasi dari diasilgliserol (DAG) dan inositol-1 ,4,5-fosfat (IP3) oleh PLCγ.
The DAG tetap dalam membran dan bertindak sebagai stimulus untuk PKC.
Konsekuensinya adalah transformasi phosphotyrosine sinyal melalui aktivasi PLCγ
menjadi sinyal phosphoserine / phosphothreonine. Salah satu substrat pertama PKC
adalah reseptor EGF sendiri. Hal ini menjadi terfosforilasi pada serin a residu sangat
dekat dengan domain transmembran dan memiliki efek menonaktifkan reseptor.
PKCS mamalia terdiri dari 12 anggota keluarga yang berbeda yang dapat dibagi lagi
menjadi tiga subfamilies diklasifikasikan atas dasar kesamaan urutan dan modenya
aktivasi. Itu subfamilies adalah PKCS konvensional (cPKCs), termasuk α, β1, β2, dan
γ, PKCS baru (nPKCs), termasuk δ, ε, ε, dan ζ, dan atipikal PKCS (aPKCs),
termasuk ι, η, δ, dan κ (PKD). Beberapa mereka karakteristik disajikan dalam Tabel
8.3.
Mayoritas anggota ini reseptor untuk ester phorbol, produk tumor-
mempromosikan diperoleh dari minyak puring. Salah satunya, 12-O-
tetradecanoylphorbol-13-asetat (TPA),
adalah ampuhpenggerak PKC. Dengan tujuan untuk memahami mekanisme aksi PKC
yang mendasari promosi tumor dengan ester phorbol, dua strategi eksperimental
independen telah diterapkan. Satu melibatkan mencari elemen kontrol transkripsi
yang menengahi phorbol-ester-induced perubahan dalam ekspresi gen dan kemudian
bekerja mundur untuk mengidentifikasi faktor-faktor transkripsi yang mengikat
unsur-unsur dan akhirnya jalur sinyal-transduksi yang mengatur aktivasi mereka. Itu
Pendekatan kedua adalah untuk overexpress berbagai isoform PKC dan untuk
mempelajari perubahan dalam sel fenotipe. Meskipun upaya besar, peran PKC dalam
promosi tumor masih belum jelas, dan PKC telah gagal untuk memenuhi syarat
sebagai onkogen benar.
8.2.3.3.2 PKC dan Aktivasi TRE dan SRE oleh phorbol Ester
Analisis daerah promotor gen TPA-diinduksi (misalnya, kolagenase,
metallothionein IIA, dan stromelysin) mengungkapkan dilestarikan tujuh pasangan
basa palindromic motif (TGACTCA). Ini Elemen TPA-responsif (TRE) diakui oleh
aktivator protein 1 (AP-1). Pada saat itu, itu dipahami bahwa AP-1 adalah pada akhir
penerimaan jalur kompleks yang mentransmisikan efek phorbol ester promotor tumor
dari membran plasma ke mesin transkripsi, mungkin melibatkan protein kinase C.
AP-1 meliputi sekelompok faktor transkripsi dimer kompleks terdiri dari Juni-Juni,
Jun-Fos, atau Jun-ATF, * dikenal onkogen dihubungkan oleh interaksi protein-
protein Motif dikenal sebagai ritsleting leusin. Varian onkogenik dari faktor-faktor
transkripsi memiliki meningkat paruh dan menunjukkan aktivitas transkripsi
ditingkatkan sebagai konsekuensi dari penghapusan parsial.
Ditemukan bahwa aktivasi PKC menyebabkan defosforilasi c-Juni hanya di
dasar daerah di mana ia mengikat DNA. Fosforilasi segmen ini juga dapat dicapai
(dalam tabung tes) oleh glikogen sintase kinase 3β (GSK-3β), jadi itu mendalilkan
bahwa PKC merangsang mengikat c-Juni DNA melalui penghambatan GSK-3β
(Gambar 8.10). Hal ini akan mengakibatkan defosforilasi yang wilayah dasar.
Konsisten dengan ide ini adalah bahwa aktivasi PKC (α, β1, β2, dan ) menyebabkan
fosforilasi dan dengan demikian penonaktifan GSK-3β. Namun, interaksi molekul
antara GSK-3β dan c-Jun belum terbukti juga tidak jelas yang fosfatase strip residu
fosfat dari c-Juni Bahwa ini tidak bisa seluruh cerita menjadi jelas dari temuan bahwa
fosforilasi pada N-terminus juga penting untuk kedua aktivitas transkripsi dan sel
transformasi dengan c Jun.
Penemuan Juni N-terminal protein kinase (JNK-1) yang phosphorylates c-Juni
melalui interaksi dengan situs docking kinase spesifik menarik lapangan jauh dari
PKC dan TRE dan terfokus perhatian pada unsur serum-respon (SRE) dan keluarga
baru muncul kinase MAP. Selain perannya dalam mengatur ekspresi serum-dimediasi
faktor transkripsi c-fos, yang SRE juga terlibat dalam respon seluler terhadap ester
phorbol. Seperti telah disebutkan, SRE mengikat dua faktor transkripsi: faktor serum-
respon (SRF) dan faktor p62TCF terner-kompleks (Elk-1). Faktor pertumbuhan
mengatur aktivitas transkripsi melalui fosforilasi p62TCF, sebuah modus aktivasi
yang juga berlaku untuk ester phorbol.
8.2.3.3.3 PKC dan Modulasi dari MAP Kinase Signal-Transduksi Persiapan
Sebagai jalur sinyal transduksi-yang berasal dari reseptor faktor pertumbuhan
yang mengaktifkan SRE secara bertahap diselesaikan dan ditemukan untuk
melibatkan Ras dan anggota keluarga kinase MAP, peran PKC tetap jelas. PKCε
ditemukan untuk mengaktifkan Ras-diaktifkan kinase c-Raf, dan dua enzim bekerja
sama dalam transformasi NIH3T3 fibroblas. Dalam fibroblas embrio tikus, aktivasi
Raf-1 juga penting untuk efek transformasi dari PKC. Karena semua faktor
pertumbuhan menginduksi generasi DAG dan karenanya mengaktifkan PKC, maka
bahwa PKC memberlakukan Ras-diprakarsai Pertumbuhan sinyal faktor pada tingkat
Raf-1. Namun, ini tidak selalu menghasilkan peningkatan
GAMBAR 8.10 Protein kinase C (PKC) dan aktivasi elemen TPA-responsif
(TRE) dan serumresponse elemen (SRE). PKC dan faktor pertumbuhan yang pada
awalnya untuk mengaktifkan sinyal yang berbeda-transduksi jalur, mengakibatkan
aktivasi TRE dan SRE, masing-masing. Gagasan ini berakhir ketika disadari bahwa
TPA juga mengaktifkan SRE dan bahwa faktor pertumbuhan dapat mengaktifkan
TRE melalui aktivasi Juni Nterminal kinase (JNK). PKC mungkin memiliki peran
penting dalam modulasi kedua MAP kinase yang berbeda jalur. Efek tertentu pada
GSK3β, mengakibatkan dephosphorylation wilayah dasar c-Juni, mungkin juga
melayani untuk meningkatkan aksi JNK, protein kinase yang phosphorylates daerah
N-terminal dan mempromosikan dimerisasi faktor transkripsi.
proliferasi sel. Temuan lebih baru menggunakan kinase-mati dan konstitutif
diaktifkan mutan memastikan bahwa beberapa isoform PKC dapat mengaktifkan jalur
MAP kinase, dalam beberapa kasus terkemuka untuk aktivasi baik MAP kinase
(ERK) dan JNK. Ganda ini sinyal reintegrates pada tingkat fosforilasi p62TCF
(Gambar 8.10). Aktivasi JNK sama bisa mengakibatkan fosforilasi c-Juni, sehingga
aktivasi AP-1 di situs TRE. Secara kolektif, studi ini menunjukkan PKC yang
bertindak terutama sebagai modulator dari Ras jalur sinyal transduksi-yang berasal
dari reseptor faktor pertumbuhan. Komitmen, baik untuk mempromosikan atau untuk
menekan aktivitas, ditentukan pada tingkat kinase MAP.
8.2.3.4 The Ca2 + / Calmodulin Pathway
Pembelahan fosfatidil inositol-4,5-fosfat (PIP2) oleh hasil PLCγ dalam
pembebasan IP3, yang mengikat reseptor pada retikulum endoplasma, sehingga
membuka saluran Ca2 +. Hasil ketinggian sitosol bebas Ca2 + menyebabkan aktivasi
dari sejumlah serin / treonin protein kinase, semua yang mengandung Ca2 subunit
regulasi + mengikat, kalmodulin (juga hadir dalam sejumlah lainnya enzim, lihat
Gambar 8.11). Ini termasuk spektrum luas Ca2 + / protein kalmodulin-dependen
kinase II (CaMKII), myosin rantai ringan kinase-(MlCK), fosforilasa kinase, dan
perpanjangan Faktor 2 kinase (EF-2 kinase), di samping protein fosfatase kalsineurin,
pemain penting dalam aktivasi limfosit T. Jelas, Ca2 + adalah utusan kedua sangat
serbaguna modulasi sinyal intraseluler banyak, subjek terlalu luas untuk menangani
dalam sebuah bab buku.
GAMBAR 8.11 jalur sinyal transduksi-Beberapa diprakarsai oleh kalmodulin.
Kalmodulin terikat Ca2 + berinteraksi dan mengaktifkan banyak enzim, membuka
berbagai respon seluler mungkin. singkatan: MAP-2, mikrotubulus terkait protein 2,
NO, oksida nitrat, Tau, unit perakitan tubulin.
8.2.3.5 Fosforilasi Langsung Faktor Transkripsi dan Aktivasi STAT
Cara paling sederhana di mana reseptor membran plasma bisa mengubah
ekspresi gen akan oleh fosforilasi langsung faktor transkripsi. Aktivasi transkripsi
oleh interferon adalah contoh. Faktor transkripsi yang dikenal sebagai STAT
(transduser sinyal dan aktivator transkripsi) diakui sebagai target untuk reseptor
interferon, tetapi sekarang jelas bahwa mereka juga memediasi sinyal EGF dan PDGF
reseptor. The STAT p84Stat1a dan p91Stat1b direkrut untuk tirosin terfosforilasi-
reseptor faktor pertumbuhan melalui SH2 domain mereka. Setelah fosforilasi, mereka
menggabungkan, melalui interaksi timbal balik dari SH2 domain mereka, dengan
fosfat tirosin untuk membentuk sebuah kompleks dimer, dan sebagai akibatnya,
mereka translokasi ke nukleus, di mana mereka mempromosikan transkripsi gen
respon awal seperti c-fos (Gambar 8.12). The STAT dimer, terbentuk setelah tirosin
fosforilasi oleh reseptor PDGF, pada awalnya digambarkan sebagai simian-sarkoma-
virusinducible factor (SIF), sebuah kompleks faktor transkripsi diaktifkan oleh
onkogen virus, v-Sis. Ini Kode onkogen virus untuk prekursor PDGF dan
mengaktifkan jalur sinyal transduksi-sama.
8.3 RESEPTOR YANG ASOSIASI DENGAN Protein Tyrosine Kinase
8.3.1 KELUARGA nonreceptor PROTEIN tirosin kinase
Bagian ini berkaitan dengan keluarga penting reseptor yang tidak memiliki
aktivitas katalitik intrinsik tetapi namun menginduksi respon serupa dengan tirosin
kinase reseptor. Pertanyaan bagaimana mereka sinyal itu diselesaikan dengan temuan
bahwa banyak reseptor subunit katalitik merekrut dari dalam sel dalam bentuk satu
atau lebih nonreceptor protein tirosin kinase (nonreceptor PTKS). Ini dapat dibagi
menjadi sembilan keluarga: ABL, Fes / Fer, Syk/Zap70, Jak, Tec, Fak, Ack, Src, dan
CSK. Empat PTKS nonreceptor tambahan (RLK / TXK, SRM, Rak / Frk, dan BRK /
Sik) tidak muncul milik salah satu keluarga didefinisikan (Gambar 8.13). Protein ini
ada dalam sitosol sebagai komponen larut, atau mereka mungkin membran terkait
melalui farnesylation (C15 isoprenoid) atau palmitoylation (C16) dari daerah C-
terminal (Src, Fyn, Lyn, atau Yes) atau melalui kehadiran dari domain PH (anggota
keluarga Btk / Tec). Sejumlah besar gen vertebrata encode untuk nonreceptor PTKS
(minimal 33). Perekrutan nonreceptor PTKS dan akibatnya phosphorylations tirosin
biasanya langkah pertama dalam perakitan sebuah sinyal besar kompleks yang terdiri
dari selusin atau lebih protein yang mengikat dan berinteraksi satu sama lain.
GAMBAR 8.12 fosforilasi Langsung Bahasa Dari Kelas B STAT faktor transkripsi.
Melalui domain SH2 mereka, Yang p84Stat1a Dan p91Stat1b mengasosiasikan
Artikel Baru reseptor Dan menjadi terfosforilasi FUNDS residu tirosin. Mereka
membentuk dimer (disebut faktor Sis-diinduksi, atau SIF) Yang translocates Ke inti,
di mana besarbesaran mengikat Sisinducible sebuah elemen (SIE) Dan mengaktifkan
transkripsi, misalnya, gen c-fos.
GAMBAR 8.13 nonreceptor PTKS. Ini protein kinase membentuk keluarga
besar, dan sebagian besar dari mereka mengandung SH2 dan SH3 domain. Beberapa
awalnya ditemukan sebagai transformasi gen dari genom virus, maka nama
seperti src atau ABL, berasal dari virus sarkoma Rous atau Abelson murine
leukemia virus, masing-masing. (Diadaptasi dari Hunter, T., Biochem. Soc. Trans.,
24 (2), 307-327, 1996.)
Contoh dari kelas reseptor yang merekrut nonreceptor PTKS termasuk yang
memediasi imun dan inflamasi tanggapan:
• Reseptor T-limfosit (TCR) yang terlibat dalam deteksi antigen asing, disajikan
bersama-sama dengan major
histocompatibility complex (MHC). Selanjutnya, mengatur ekspansi klonal sel T.
• Reseptor limfosit B untuk antigen penting di baris pertama pertahanan terhadap
infeksi oleh mikroorganisme.
• The interleukin-2 reseptor (IL-2R) adalah penting dalam bahwa sitokin IL-2,
disekresikan oleh subset sel T-helper, meningkatkan proliferasi aktif sel T dan B
dan meningkatkan aktivitas cytolytic pembunuh (NK) sel alami dan sekresi IgG.
• reseptor imunoglobulin, seperti reseptor afinitas tinggi untuk IgE, yang hadir pada
tiang sel dan basofil ditularkan melalui darah. Reseptor ini memainkan peran
penting dalam hipersensitivitasdan inisiasi respon inflamasi akut.
Untuk sel-sel lain, seperti sel-sel endotel atau epitel:
• Integrin hadir dalam kompleks adhesi focal menyebabkan perekrutan dua jenis
protein kinase tirosin ke membran plasma focal adhesion kinase (FAK) dan Src.
Mereka memainkan peran dalam kelangsungan hidup sel dan proliferasi.
8.3.2 MODE PENGAKTIFAN nonreceptor PROTEIN tirosin kinase
PTKS nonreceptor adalah kelompok besar sinyal protein yang memiliki peran
beragam dalam kontrol proliferasi sel, diferensiasi, dan kematian. Beberapa banyak
diekspresikan, yang lainnya dibatasi untuk jaringan tertentu. Klasifikasi awal mereka
didominasi oleh penemuan pp60src, sejauh bahwa kelompok utama dari kinase yang
hanya dikenal sebagai keluarga Src. Setidaknya ada sepuluh dikenal subfamilies dari
nonreceptor PTKS.
The Src kinase keluarga berbagi struktur yang sama. Sebuah domain yang unik
di N-terminus diikuti oleh domain SH2 dan SH3 domain (prototipe dari domain yang
diekspresikan secara luas). Itu SH3 domain ini kemudian melekat dengan wilayah
menghubungkan ke domain kinase dan akhirnya ekor C-terminal (Lihat Gambar
8.13). Banyak kinase ini berfungsi dengan menjadi terkait dengan makromolekul
sinyal kompleks dirakit di situs membran. Membran asosiasi dapat dipromosikan oleh
domain N-terminal yang unik. Dalam keluarga Src, SRC sendiri (pp60c-src), Fyn,
Lyn, dan Ya adalah N-terminal myristoylated. Ini rantai alifatik 14-karbon
memberikan kesempatan untuk membran lampiran yang dapat diperkuat dengan
palmitoylation di sistein dekatnya. Demikian pula, anggota dari keluarga Btk / Tec
dapat menjadi membran terkait melalui domain PH mereka, yang dapat mengikat
polyphosphoinositide lipid. PTKS nonreceptor lain direkrut ke situs mereka tindakan
melalui asosiasi SH2 domain mereka dengan residu phosphotyrosine pada target
mereka.
Terlepas dari lokasi mereka, kebanyakan kinase Src keluarga umumnya tidak
aktif. Mereka umumnya diselenggarakan di negara ini oleh tirosin terfosforilasi
penting (di pp60c-Src, Y527 di C-terminus) yang terlibat N-terminal SH2 domain.
Selanjutnya, urutan di linker mengambil struktur yang menyerupai wilayah kaya
prolin, sehingga mengikat SH3 domain. Interaksi ini menyebabkan molekul untuk
mengadopsi struktur kompak. Pembengkokan ekor karboksil menyebabkan rotasi
lobus kecil dari domain kinase, yang mendistorsi situs aktif. Aktivasi karena itu
memerlukan penghapusan fosfat C-terminal, dimungkinkan karena urutan asam
amino segera berdekatan dengan phosphotyrosine tidak optimal untuk ketat mengikat
ke domain SH2. SH2 domain mengikat phosphotyrosines yang paling efektif ketika
mereka berada di motif pYEEI. Sebuah setara urutan di Src C-terminus tidak
memiliki isoleusin di Py +3 dan tidak begitu terikat erat. Ini memberikan kesempatan
untuk diakses oleh fosfatase (seperti CD45 dalam limfosit) (Gambar 8.14). Memiliki
kehilangan fosfat karboksil-ekor, loop aktivasi di tepi dari situs katalitik kemudian
dapat menjadi
GAMBAR 8.14 Aktivasi PTKS nonreceptor. Lck diadakan dalam keadaan
kompak diakses melalui fosforilasi residu Y505, yang berinteraksi dengan
intramolekul SH2 domain. Setelah aktivasi CD45 (ligan diketahui), pY505 akan
dihapus dan molekul membuka. Autofosforilasi di Y-394 residu dalam domain
katalitik merupakan aktivasi PTK tersebut. terfosforilasi, sangat meningkatkan
aktivitas katalitik. Aktivasi Src kinase keluarga karena membutuhkan pertama
defosforilasi dan kemudian fosforilasi a.
8.3.3 T CELL RESEPTOR SINYAL
8.3.3.1 Aktivasi Limfosit T dan Interaksi antara TCR dan MHC
Limfosit T memiliki peran sentral dalam imunitas diperantarai sel. Ketika
diaktifkan, mereka berkembang biak dan membedakan menjadi baik sitotoksik (NK)
atau helper (Th) sel T. Sel T sitotoksik membunuh spesifik target, paling sering sel
yang terinfeksi virus, sedangkan sel T helper membantu sel-sel lain dari kekebalan
sistem, seperti limfosit B (untuk menginduksi produksi antibodi) dan makrofag
(untuk meningkatkan pelepasan sitokin inflamasi yang memungkinkan pertahanan
tuan rumah yang efektif). Limfosit T diaktifkan melalui interaksi dengan sel-sel yang
menyajikan antigen dalam konteks utama istocompatibility complex (MHC).
Interaksi sel-sel terjadi dengan cara berikut. Itu Acara selektif adalah pengakuan
antigen ditempatkan di alur MHC oleh sel-T reseptor (TCR). Dalam kasus antigen
intraseluler atau virus, fragmen protein (antigen) yang disajikan oleh MHC kelas I,
dalam kasus antigen infeksi mikroba, mereka disajikan oleh MHC kelas II. Sebelum
limfosit menjadi sepenuhnya diaktifkan, interaksi antara antigenpresenting sel dan
limfosit T harus ditegakkan oleh sejumlah interaksi lainnya, seperti sebagai CD4
(atau CD8) berinteraksi dengan MHC dan B7 dengan CD28 (antara lain). Tanggapan
penuh terdiri induksi ekspresi IL-2 dan reseptor diikuti oleh stimulasi autokrin,
mengakibatkan proliferasi sel, acara juga disebut sebagai ekspansi klonal.
8.3.3.2 Sinyal Transduksi Hilir TCRs
Meskipun tidak memiliki domain katalitik intrinsik, aktivasi limfosit T dimulai
dengan phosphorylations tirosin, aktivasi PLC-γ dengan produksi IP3 dan DAG, dan
elevasi sitosol bebas Ca2 +. Dengan demikian, konsekuensi dari reseptor ligasi tidak
berbeda dari orang-diinduksi oleh reseptor untuk EGF atau PDGF. Sebuah studi awal
mencoba untuk menjelaskan induksi tirosin kinase kegiatan menghasilkan penemuan
protein tirosin kinase nonreceptor Lck (p56lck), T-cellspecific anggota keluarga Src.
Lck dikaitkan dengan ekor sitosol CD4 (di T helper sel) atau CD8 (dalam sel T
sitotoksik) (Gambar 8.14). Seperti disebutkan, domain ekstraseluler inimolekul
mengikat protein MHC, yang tidak hanya memperkuat interaksi agak lemah didirikan
antara TCR dan antigen tetapi juga membawa CD4 (atau CD8) ke disekitar TCR
kompleks, yang mengarah ke Lck target pada?-Rantai. Namun, seperti kinase Src
keluarga lainnya, Lck tidak aktif sampai residu tertentu telah dephosphorylated. Hal
ini dilakukan dengan belum protein lain transmembran, CD45, yang memiliki protein
aktivitas tirosin fosfatase (lihat Gambar 8.14)
Aktivasi Lck hasil dalam fosforilasi δ-rantai TCR. Target tyrosines terbatas
pada immunoreceptor berbasis tirosin aktivasi motif (ITAMs). ITAMs juga hadir
dalam α, δ, dan ε rantai CD3 dan target lain Src kinase keluarga, Fyn (p59fyn) terkait
dengan rantai ε. Fyn juga diaktifkan oleh defosforilasi. Kedua Fyn dan Lck
diperlukan untuk efisien TCR sinyal. Fosforilasi ITAMs menyediakan situs docking
untuk SH2 domain-bantalan molekul, dan hasil langsung adalah perekrutan lagi
nonreceptor protein tirosin kinase, ZAP-70 (δ-rantai protein tirosin kinase terkait dari
70 kDa). Setelah terikat, ini pada gilirannya menjadi terfosforilasi dan dengan
demikian diaktifkan, menyebabkan fosforilasi beberapa substrat. Sebagai dengan
reseptor faktor pertumbuhan, urutan kejadian mengikuti pola di mana
phosphotyrosines mengikat SH2-domain yang mengandung (atau PTB-) protein yang
mungkin mereka sendiri PTKS dan dapat phosphorylate protein lain dalam suksesi.
Pada setiap tahap, ada kesempatan untuk percabangan, melalui berbagai efektor.
Dengan perekrutan berturut-turut, sebuah kompleks sinyal yang luas dirakit bahwa
mencakup beberapa enzim efektor (Gambar 8.15). Yang penting cabang-point yang
ditawarkan oleh
GAMBAR 8.15 ekspansi klonal limfosit T naif melalui sinyal dari TCR. (A) TCR
memiliki heterodimer disulfida-linked rantai α dan β. Ini memiliki daerah
hypervariable yang mendeteksi antigen, disajikan sebagai peptida pendek dalam alur
dari molekul MHC. Heterodimer ini bersama dengan dua? - rantai, membentuk
kompleks dengan empat polipeptida (γε dan γδ) dari molekul CD3. CD4 dan CD8
molekul juga terkait dengan TCR di helper dan sel T sitotoksik, masing-masing.
Molekul-molekul ini berikatan dengan MHC dan membawa Lck, sebuah nonreceptor
PTK, ke daerah sekitar δ-rantai. (B) TCR mengaktifkan Lck, yang phosphorylates dua
δ-rantai di motif Itam. Residu phosphotyrosine membentuk sebuah situs docking
untuk SH2 domain ZAP70, lain PTK sitosol, yang, pada gilirannya, phosphorylates
beberapa (maksimal sembilan) residu tirosin pada protein transmembran adaptor
LAT. Berbagai protein melampirkan LAT, termasuk guanin pertukaran faktor Vav,
para Grb2 adaptor, subunit adaptor PI-3 kinase, dan PLC-γ. Semua ini memainkan
peran penting dalam aktivasi gen IL-2. Ketinggian Ca2 + intraseluler mengaktifkan
kalsineurin, yang dephosphorylates NF-AT (faktor nuklir sel T aktif). Bersama
dengan AP-1 kompleks, NFAT mendorong transkripsi gen IL-2. terpisahkan
membran protein LAT (linker untuk aktivasi sel T), yang menyajikan tidak kurang
dari sembilan residu tirosin substrat. Ketika terfosforilasi, ini merekrut berbagai
molekul sinyal, semua interaksi melalui dengan SH2 domain. Ini termasuk adaptor
protein Grb2, SLP76 (SH2-domain yang mengandung protein leukosit 76 kDa,
sebuah protein adaptor), enzim PLC-γ PI3-kinase (Melalui subunit regulasi P85), dan
guanin nukleotida pertukaran faktor Dbl dan Vav. Kompleks sinyal terbentuk di
sekitar TCR dan jalur bercabang yang berasal dari menyerupai mekanisme yang
digunakan oleh faktor pertumbuhan. Namun, tujuan dari jalur ini tidak semua jelas.
PLC-γ jalur (DAG, IP3, dan ketinggian intraseluler bebas Ca2 +) mengarah ke
aktivasi fosfatase kalsineurin, yang mengaktifkan faktor transkripsi NF-AT (nuklir
faktor sel T aktif). Hal ini penting untuk ekspansi klonal sel T karena penting nya
peran dalam induksi IL-2. NF-AT membutuhkan bantuan dari protein aktivator 1
(AP-1) kompleks dalam rangka mendorong ekspresi IL-2.
8.3.3.3 The IgE Reseptor dan Signal untuk eksositosis
Sel mast jaringan dan sirkulasi basofil adalah dari keturunan hematopoietik.
Terkenal karena peran mereka dalam alergi, mereka memediasi kedua reaksi
hipersensitivitas langsung dan tertunda. Mereka juga membantu untuk
mempertahankan tubuh terhadap infeksi bakteri dan parasit dan mengambil bagian
dalam respon inflamasi. Stimulus imunologi mereka disediakan oleh antigen
polivalen yang mengikat dan lintas-link IgE, yang dengan sendirinya terikat dengan
reseptor imunoglobulin afinitas tinggi, IgE-R (khusus, FcεRI). Awalnya, mekanisme
signaling memiliki kesamaan dengan limfosit dalam hal itu melibatkan rekrutmen
berturut-turut tirosin kinase dan protein SH2-domain yang mengandung (adapter dan
efektor).
The IgE-reseptor agregasi digerakkan serangkaian acara. Konsekuensi langsung
adalah sekresi produk preformed disimpan dalam sekresi butiran yang berlangsung
dalam beberapa menit. Zat dirilis termasuk agen vasoaktif dan mediator inflamasi
(histamin, proteoglikan, protease netral, hidrolisis asam). Kemudian, selama menit ke
jam, sel-sel mensintesis dan mensekresi sitokin (antara lain, IL-2 dan IL-6) dan
arakidonat yang diturunkan inflamasi mediator, seperti leukotrien LTB4.
Pembentukan butiran baru dan pemulihan morfologi sel kemudian berlanjut selama
periode membentang dari jam untuk minggu.
Peristiwa awal yang mengikuti agregasi reseptor melibatkan perekrutan tirosin
Src keluarga kinase, termasuk Lyn dan Syk. Seperti reseptor sel T, IgE-R berlokasi
sama dengan perancah protein LAT dalam rakit lipid (microdomain). Fosforilasi LAT
oleh Syk menyediakan docking situs untuk sejumlah protein SH2 domain yang
mengandung (Gambar 8.16). Dari jumlah tersebut, Vav adalah penting karena
mengatur aktivasi anggota keluarga dari GTPases Rho. Vav adalah diberkahi dengan
berbagai domain yang memungkinkannya untuk mengintegrasikan sinyal masuk dan
keluar yang beragam. Ini termasuk salah satu SH2 domain, dua SH3 domain, sebuah
homologi Dbl (DH) domain, pleckstrin sebuah homologi (PH) domain, wilayah
leusin kaya, dan daerah kaya sistein. DH domain, di khususnya, adalah karakteristik
dari faktor pertukaran nukleotida guanin yang mengkatalisis GTP / PDB pertukaran
GTPases Rho-family. Ini memediasi respon seluler yang beragam, termasuk
reorganisasi dari sitoskeleton dan peraturan Juni N-terminal kinase. Dalam sel mast,
Cdc42 dan Rac memainkan dua peran penting. Aktivasi mereka adalah langkah yang
menentukan kunci sel untuk melakukan menjalani eksositosis. Langkah-langkah
menghubungkan GTPases ini untuk protein yang mengatur fusi membran tetap tidak
diketahui. Kedua, mereka yang terlibat dalam regulasi pelepasan interleukin, respon
yang melibatkan aktivasi JNK.
Jalur kedua aktivasi sel mast dipicu oleh agen-agen seperti racun tawon peptida
mastoparan. Daripada berinteraksi dengan reseptor sel-permukaan, seperti "reseptor-
mimesis" agen dapat memasukkan ke dalam membran menyebabkan aktivasi
langsung heterotrimeric G-protein dari kelas Gi. Di sini, itu adalah subunit β dari G-
protein yang memberikan sinyal untuk eksositosis. Sebagai di jalur dari IgE-R, adalah
mungkin bahwa Vav berpartisipasi dalam integrasi sinyal ini, karena memiliki
domain PH (mengikat subunit β) dan memiliki aktivitas pertukaran nukleotida
guanin.
GAMBAR 8.16 Peran nonreceptor PTK di IgE-mediated eksositosis dalam sel
mast. Mengikat IgE kepada para reseptor FcεRI menghasilkan aktivasi nonreceptor
PTK SYK, yang phosphorylates tiga sasaran: yang reseptor itu sendiri, docking
protein LAT, dan faktor pertukaran Dbl. Faktor tukar mengaktifkan GTPases Cdc42
dan Rac, yang keduanya berperan dalam eksositosis langsung dari vesikel yang
mengandung mediator inflamasi dan dalam rilis jangka panjang sitokin, suatu acara
yang mengharuskan aktivasi JNK.
8.3.3.4 integrin Signaling
8.3.3.4.1 Peran FAK dalam Penyelamatan dari Apoptosis
Kelangsungan hidup sel endotel dan epitel sangat bergantung pada kontak
dengan satu sama lain dan dengan matriks ekstraseluler. Tanpa kontak, mereka mati
melalui proses terkendali sel kematian, apoptosis. Dalam kasus detasemen sel, situasi
memicu kematian sel terprogram telah disebut anoikis, berarti tunawisma.
Mekanisme ini melindungi organisme terhadap Pertumbuhan displastik (berarti salah
terbentuk), mencegah sel-sel menyimpang dari menjajah pantas lokasi. Sel memiliki
dorongan intrinsik untuk merusak diri sendiri, tetapi biasanya dicegah dari melakukan
hal ini oleh sinyal yang berasal dari jalur penyelamatan tertentu. Salah satu sinyal
tersebut (luar-dalam) berikut dari lampiran integrin α5β1 ke matriks ekstraseluler.
Ketika fibroblas tersebar di fibronektin, komponen melimpah dari matriks
ekstraseluler, anggota keluarga integrin molekul adhesi, terutama α5β1 dan αVβ3,
bentuk multimerik cluster yang menempel pada sitoskeleton di tempat adhesi focal.
Ini terdiri dari sejumlah protein, beberapa peran struktural memiliki, lain sinyal.
Bersama-sama mereka membentuk adhesi focal kompleks seperti yang digambarkan
dalam Gambar 8.17. Yang penting struktural komponen vinculin dan bentuk talin
situs pengikatan untuk sitoskeleton aktin dan dengan demikian mengarahkan
pembentukan serat stres dan aktin struktur dalam wilayah kortikal sel. Talin juga
membentuk situs lampiran untuk tirosin kinase FAK (focal adhesion kinase).
Lampiran mengakibatkan aktivasi dan autofosforilasi (Di Tyr-397) memungkinkan
FAK untuk bertindak sebagai situs docking untuk SH2 domain P85-peraturan subunit
PI-3 kinase, yang mengarah ke generasi fosfatidil inositide lipid 3-fosfat.
Hilir dalam jalur penyelamatan, PKB efek sejumlah phosphorylations yang
mencegah apoptosis (Gambar 8.17) (lihat Bagian 8.2.3.2). Adalah menarik untuk
dicatat bahwa kedua faktor pertumbuhan reseptor, seperti TrkA, dan molekul adhesi
menghasilkan sinyal penyelamatan melalui aktivasi protein kinase tirosin, dan
tampaknya sel mengharuskan kedua keterikatan matriks ekstraseluler dan adanya
faktor pertumbuhan tertentu agar tidak mati.
Pentingnya FAK digarisbawahi oleh temuan bahwa sel-sel mengekspresikan
konstitutif aktif membentuk bertahan di suspensi meskipun mereka "tunawisma." Di
sini, protein kinase aktif terlepas dari kegagalan untuk melakukan kontak dengan
matriks ekstraseluler. Menyelamatkan dari apoptosis juga terjadi ketika sel-sel
mengekspresikan bentuk onkogenik konstitutif diaktifkan Ras atau Src dan dengan
demikian mengaktifkan PI3-kinase dan jalur MAP kinase. Tidak seperti FAK, ini
tidak hanya mencegah apoptosis tetapi juga mempromosikan sinyal proliferasi yang
menghasilkan pembentukan tumor.
GAMBAR 8.17 kelangsungan hidup dan proliferasi. Tempat adhesi focal
mempromosikan sinyal kelangsungan hidup sel melalui aktivasi protein kinase B
(PKB). Seperti sel-sel jaringan tersebar pada matriks ekstraseluler, adhesi focal situs
terbentuk. Ini terdiri dari berkerumun β1 integrin terkait dengan talin, vinculin, dan
aktin sitoskeleton. The fokus adhesi kinase (FAK) menempel ke talin,
autophosphorylates pada residu tirosin (Y397), dan menyediakan sinyal aktivasi
untuk PI-3 kinase. Produksi PI-3,4,5-P3, yang bertindak sebagai pengikat situs untuk
domain PH PDK1 dan PKB, berikut. PKB difosforilasi pada dua serin / treonin residu
dan melepaskan dari membran untuk memfosforilasi dan menonaktifkan substrat
yang seharusnya peka sel untuk apoptosis. Ini termasuk BURUK, caspase-9, dan
faktor transkripsi FKHRL-1. The fokus adhesi situs mempromosikan sinyal
proliferasi sel melalui aktivasi Ras. Autofosforilasi FAK (Y397) juga menghasilkan
sebuah situs docking untuk Src, yang phosphorylates FAK pada residu tirosin kedua,
Y925, yang bertindak sebagai situs docking untuk SHC adapter, yang dengan
sendirinya menjadi terfosforilasi dan mengikat Grb2. ini memulai pengaktifan Ras-
MAP kinase, yang diperlukan untuk memulai siklus sel.
8.3.3.4.2 Peran FAK dan Src di Proliferasi Seluler
Pembentukan tempat adhesi focal tidak hanya menyelamatkan sel dari
apoptosis tetapi juga penting persyaratan untuk proliferasi sel-sel jaringan, didorong
oleh faktor pertumbuhan. Jika, misalnya, EGF atau PDGF ditambahkan ke fibroblas
ditangguhkan, aktivasi jalur MAP kinase hanyalah sementara, dan sel-sel gagal untuk
berkembang biak (dan dalam jangka panjang mati melalui apoptosis). Proliferasi
hanya hasil di bawah pengaruh dua rangsangan independen, satu karena faktor
pertumbuhan dan lainnya dari molekul adhesi. Cluster integrin memungkinkan
pengikatan FAK, yang mengalami autofosforilasi (di Tyr-397) dan kemudian
merekrut Src (atau Fyn) kinase menyebabkan fosforilasi lanjut (di Tyr-925) dan
pembentukan PTK kompleks diaktifkan (Gambar 8.17). The terfosforilasi FAK,
residu Tyr-925, sekarang mengikat protein SHC adaptor, yang mengikat GRB-2 dan
mengaktifkan jalur Ras (lihat Bagian 8.2.3.1). Hal ini dapat berfungsi untuk
meningkatkan sinyal dari faktor pertumbuhan reseptor dan hasil aktivasi
berkepanjangan MAP kinase (ERK). Sinyal berkelanjutan memastikan perkembangan
dari Pergi ke G1 dan masuk ke dalam siklus sel.
8.4 LAMPIRAN
8.4.1 Homolog Jalur pada Drosophila, Elegans Caenorhabditis, dan MAMALIA
Bagian ini menjelaskan bagaimana studi genetik dengan Drosophila dan
Caenorhabditis elegans memiliki memberikan kontribusi terhadap penemuan Ras
sinyal jalur transduksi operasi dalam sel mamalia.
8.4.1.1 Pengembangan fotoreseptor di Lalat Buah Drosophila
Melanogaster Para mata majemuk serangga terbentuk dari susunan heksagonal
unit-unit kecil, atau ommatidia (dalam Kasus lalat buah, sekitar 800 "mata kecil").
Masing-masing terdiri dari delapan sel fotoreseptor
Gambar 8.18 Mutasi pada mata ± ada tujuh. Peristiwa yang menyebabkan
perkembangan sel R7 pada mata dari drosofila telah memberikan kunci untuk
memahami perjalanan jalur reseptor PTKs. Gen bertindak sebagai aliran dari tujuh
reseptor yang diungkapkan oleh skrining untuk mutasi yang mempengaruhi
perkembangan sel R7. Mata dibangun dari ommatidia, delapan kelompok sel
fotoresptor masing-masing ditutupi oleh lensa tunggal. Gambar tersebut menjelaskan
anatomi dasar dari unit ommatidial tunggal dalam bagain membujur. Bagian a, b, dan
c ditunjukkan pada bagian melintang di sebelah kanan. Karena dua dari sel, R7 dan
R8 tidak memperpanjang unit ommatidial, bagain melintang b dan c hanya
mengungkapkan tujuh sel, tidak semua delapan sel. (Adapted from Dickson and
Hafen, Curr. Opin. Genet. Dev., 4, 64Ŕ70, 1994.)
(R1 Ŕ R8) dan 12 sel lainnya. Atas dasar morfologi, pola akson, dan sensitivitas
spektral, sel-sel reseptor dapat dibagi menjadi tiga fungsiona : R8 yang pertama kali
muncul diikuti oleh R1 hingga R6 dan kemudian R7. Pigmen fotosensitif berada
dalam microvillus tumpukan membran rhabdomer. Rhabdomer lebih besar dari R1 ke
R6 disusun trapesium sekitar rhabdomer R7 dan R8, rhabdomer R8 terletak dibawah
rhabdomer R7 (gambar 8.18). Perkembangan R7 memberikan produk dari dua gen.
Kerugian mutasi dari fenotip yang dihasilkan adalah salah satu dari gen ini
mengalami identik, R7 gagal memulai pembangunan saraf (fly menjadi Ŗsevenlessŗ).
Mutasi ini mudah dideteksi dalam tes perilaku. Mengingat pilihan antara hijau dan
ultraviolet (UV), normal (WT) fly akan bergerak cepat menuju sumber UV.
Kegagalan untuk membangun sel R7, sel fotoreseptor terakhir yang akan
ditambahkan ke cluster ommatidial, berkolerasi dengan kurangnya respon cepat
photothactic, dan tidak bergerak ke arah lampu hijau.
Sementara produk sev hanya diperlukan dalam prekursor R7, fungsi bos harus
dinyatakan dalam pengembangan R8. Kloning mengubah produk bos menjadi
glikoprotein 100-kDa dan memiliki tujuh bentang transmembran dan domain N-
terminal ekstraseluler diperpanjang. Meskipun akhirnya diekspresikan pada semua sel
fotoresptor, pada saat R7 sedang ditentukan hanya hadir pada R8 tertua. Produk dari
gen sev adalah reseptor tirosin kinase protein. Bukti untuk interaksi langsung antara
produk-produk dari kedua gen berasal dari demonstrasi bahwa sel-sel kultur
mengekspresikan produk bos cenderung membentuk agregat dengan sel
mengekspresikan sev.
Diketahui bahwa pengikatan Boss (ligan) ke Sev (kinase reseptor) mengarah
pada aktivasi protein kinase dan pada akhirnya menentukan nasib R7 sebagai saraf
sel. Karena pengurangan dosis gen dari lalat Ras1 mengganggu sinyal oleh Sev, dan
aktivasi Ras1 menyingkirkan kebutuhan untuk bos dan produk gen sev, maka aktivasi
Ras merupakan konsekuensi awal kegiatan Sev. Layar genetik lalat mengungkapkan
konstitutif Sev diaktifkan menyebabkan identifikasi dari dua komponen menengah
jalur ini: Drk (hilir kinase reseptor) dan Sos (anak sevenless) (untuk urutan peristiwa,
lihat Tabel 8.3). Protein Sos menunjukkan homologi substansial dengan ragi CDC25
produk gen, katalis pertukaran nukleotida guanin untuk RAS. Sementara penurunan
dosis gen Drk dan Sos mengganggu sinyal dari pengaktifan Sev konstitutif, tidak ada
efek pada sinyal dari Ras konstitutif diaktifkan. Di jalur aktivasi, menempatkan
fungsi produk Drk dan Sos ke posisi penengah antara Sev dan Ras. Kode gen Drk
untuk protein kecil yang terdiri dari Src homologi domain, dua SH3 domain mengapit
SH2 domain tunggal. Setelah tidak ada aktivitas katalitik sendiri, Drk bertindak
sebagai daptor. Berikatan dengan reseptor tirosin terfosforilasi dan link ke domain
kaya prolin dari Sos.
Gambar 8. 19. Pengembangan vulva di Caenorhabditis elegans. Karena merupakan
struktur yang relatif sederhana, terbentuk dari hanya beberapa sel, vulva yang cocok
untuk analisis genetik dari diferensiasi sel selama perkembangan embrio ini adalah
produk dari hanya tiga garis keturunan sel, keturunan sel p5.p, p6.p, dan p7.p.
Pembangunan diprakarsai oleh sinyal dari jangkar sel yang terletak bersebelahan
dengan p6.p. Ligan, lin-3 (homolog yang EGF), yang diproduksi oleh sel jangkar,
mengikat reseptor Mari-23 (homolog dengan EGF-R) pada permukaan sel p6. P6.p
sel, pada gilirannya, melepaskan sinyal ke tetangganya, p5.p dan p7.p. hal ini
memulai serangkaian kejadian yang melibatkan jalur MAP kinase yang menentukan
nasib sel-sel sebagai komponen dari jaringan vulva.
8.4.1.2 Pengembangan Sel Vulva di Caenorhabditis elegans
Dalam nematoda C.elegans, jalur aktivasi melibatkan autofosforilasi kinase
reseptor tirosin menyebabkan aktivasi GTPase Mari-60, homolog yang Ras. Hal ini
menentukan perkembangan sel-sel vulva. Protein tersebut pertama kali diidentifikasi
dari analisis genetik mutasi mematikan (membiarkan, atau mematikan mutan),
perubahan morfologi dalam pengembangan vulva (sem, atau seks otot mutan), atau
perubahan dalam sel keturunan (lin, atau keturunan mutan). Hal tersebut merupakan
komponen jalur sinyal transduksi-berdasarkan produk disekresikan dari sel jangkar
(Lin-3, kemungkinan besar setara dengan EGF), kinase reseptor tirosin dari sel p5.p (
Let-23), adaptor memiliki SH2 dan SH3 domain (Sem-5) yang mengaitkan dengan
(Sos-seperti) guanin protein pertukaran nukleotida. Hal tersebut membawa pertukaran
sekitar nukleotida Let-3 (Gambar 8.19).
Dalam cacing dan lalat, protein Ras bertindak sebagai saklar yang menentukan
nasib sel. Dalam C. elegans, aktivasi Ras menentukan pembentukan vulva sebagai
lawan hypodermal (kulit) sel (untuk urutan kejadian, lihat Tabel 8.4). Pada
Drosophila fotoreseptor, aktivasi Ras menentukan perkembangan R7 sebagai saraf
sebagai lawan sel kerucut. Dalam kedua kasus, protein Ras mengoperasikan hilir
reseptor tirosin kinase yang diaktifkan oleh interaksi sel-sel.
8.4.1.3 Drosophila, Caenorhabditis elegans, dan Penemuan Pathway Ras di
Vertebrata
Penjelasan dari jalur Ras dalam vertebrata didasarkan pada identifikasi protein
yang memiliki homologi urutan dengan mereka yang hadir di Drosophila dan C.
elegans. Ekspresi atau injeksi protein ini (dan reagen yang sesuai seperti peptida,
antibodi, dll) digunakan untuk mengembalikan atau memodulasi aktivitas jalur ini
dalam sel yang berasal dari mamalia, lalat, atau cacing dan kerugian fungsi dari
bantalan mutasi. Sebuah Grb2 protein vertebrata (faktor pertumbuhan mengikat
reseptor protein 2), kurang aktivitas katalitik tetapi memiliki SH2 dan SH3 domain,
ditemukan mampu memulihkan fungsi dalam kekurangan mutan Sem-5. Selain itu,
Grb2 ditemukan berasosiasi dengan protein yang diakui oleh antibodi yang diajukan
terhadap protein Drosophila, Sos. Dengan cara ini, urutan kejadian menjadi jelas.
Grb2 merupakan protein adapter, menghubungkan tirosin kinase terfosforilasi
reseptor ke penukar nukleotida guanin dalam vertebrata. Mamalia Sos homolog,
hSos, adalah juga merupakan faktor pertukaran nukleotida guanin yang berinteraksi
dengan Ras. Grb2 terdiri eksklusif dari Src homologi domain, satu SH2 diapit oleh
dua SH3 domain. Karena sifat dari interaksi SH3 dengan urutan prolin kaya, ada
kemungkinan bahwa Grb2 dan Sos tetap berhubungan bahkan di bawah kondisi
nonstimulating. Efek utama aktivasi reseptor adalah untuk memastikan rekrutmen
Grb2/Sos kompleks ke membran plasma (untuk urutan peristiwa, lihat tabel 8.4).
TABEL 8.4
Perbandingan Sinyal-Transduksi Persiapan Hilir dari Protein Tyrosine Kinase
Reseptor Spesies dari Tiga Phyla terpisah
Jalur
Spesies
Drosophila
melanogaster
Caenorhabditis
elegans Mamalia
Pembentukan mata Induksi vulva Perkembangbiakan
Ligan Boss Anchorless Cytokines
RTK Sev Let-23 Receptor
Adaptor SH2 Drk Sem-5 Grb2/ Shc
Pengaturan Ras Sos Gap 1 Gap-1 hSos GAP
Ras Dras Let-60 Ras
Raf-1 Draf Lin-45 Raf-1
MEK D-MEK MEK-2 MEK-1
MAP Kinase ERK-A MPK-1 ERK
Faktor transkripsi Sina Lin-31, Lin-1/ Ets P62TCF
, c-jun
8.4.1.4 Kinase MAP di Organisme Lainnya
Persiapan diatur oleh MAP kinase didistribusikan secara luas dan dapat
ditemukan di semua organisme eukariotik. Dalam Saccharomyces cerevisiae, proses
fisiologis diatur oleh MAP kinase termasuk perkawinan, sporulasi, pemeliharaan
integritas dinding sel, pertumbuhan invasif, pertumbuhan pseudohyphal, dan
osmoregulasi. MAP kinase adalah pengatur respon imun dan perkembangan embrio
pada Drosophila. Hal ini juga telah terlibat sebagai regulator dalam jamur lendir,
tumbuhan, dan jamur.
8.4.2 Onkogen, Keganasan, dan Protein Tirosin Kinase
8.4.2.1. Onkogen Viral
Infeksi oleh virus yang membawa onkogen dapat menyebabkan pertumbuhan
sel ganas. Meskipun pertama kali diakui sebagai agen penyebab pada kanker burung
90 tahun yang lalu, untuk sebagian besar abad kedua puluh ada keraguan bahwa
setiap kanker pada manusia telah dimulai dengan cara ini. Bahkan sekarang, hampir
semua informasi di daerah ini mengacu pada hewan bukan manusia, yang menyajikan
sejumlah masalah. Pertama, sebagaimana sudah jelas dalam dekade pertama abad
terakhir, demonstrasi modus penularan virus tergantung pada induksi penyakit
dengan transfer filtrat jaringan dari hewan ke hewan. Beberapa virus hanya menjadi
onkogenik sebagai konsekuensi dari beberapa bagian dan melalui spesies binatang
yang berbeda. Kedua, sementara banyak kanker pada manusia pasti berhubungan
dengan infeksi virus, jauh dari tertentu dalam kebanyakan kasus apakah virus telah
memulai kondisi atau apakah itu hanya kondusif untuk induksi oleh agen lain, seperti
karsinogen kimia. Secara umum, produk transformasi dari onkogen virus berperilaku
seperti mutan terus-menerus diaktifkan protein seluler endogen memiliki peran kunci
dalam regulasi mitogenesis.
TABEL 8.5
Komponen Tyrosine Kinase Signal Transduksi Cascades Apakah Ditemukan
seperti Selular (atau Viral) Onkogen
Reseptor
Protein
Kinase Tirosin
Non Reseptor
Protein
Tirosin
Kinase
Serin /
Theroin
Protein
Kinase
Adaptor
SH2/SH3
Pertukaran
Nukleotida
Faktor GTP
ase
BeK Abl Akt/PKB Crk Bcr H-Ras
Eck Blk Cot Nck Dbl K-Ras
Elk Fgr Mos - Ost N-Ras
Eph Fsp Pim - Tiam -
ErbB Fyn Raf - Vav -
Flg Hck - - - -
Fms Lck/Lyn - - - -
Kit Src - - - -
Met Yes - - - -
Neu - - - - -
Ret - - - - -
TrkA - - - - -
TrkB - - - - -
TrkC - - - - -
8.4.2.2 Onkogen Nonvirus
Tumor tidak disebabkan oleh infeksi virus (misalnya dengan bahan kimia
karsinogen) juga mengekspresikan terus-menerus diaktifkan produk, seperti
onkogenik Ras. Sebagai contoh peran onkogen dalam transformasi sel, bentuk mutasi
dari Ras ditemukan di 40% dari semua kanker pada manusia dan lebih dari pada 90%
karsinoma pankreas. Secara umum, onkogen ini merupakan mutasi gain dari fungsi
gen seluler normal yang terlibat dalam transduksi sinyal dan transkripsi gen.
Sejumlah protein bermutasi beroperasi di tahap awal kinase jalur sinyal transduksi-
tirosin. Sel dapat berubah sebagai konsekuensi dari hipersekresi faktor pertumbuhan,
ekspresi bentuk varian dari reseptor tirosin kinase atau non reseptor tirosin kinase,
berlebih dari SH2/SH3-containing protein adaptor, berlebih dari serin / treonin
protein kinase, atau ekspresi varian GTPases kecil atau protein aksesori mereka. Pada
ujung hilir dari jalur transduksi sinyal, varian faktor transkripsi juga bertindak sebagai
transformator sel ampuh. Meskipun fosforilasi tirosin kinase menyumbang hanya
sekitar 5% dari total aktivitas fosforilasi selular, memiliki posisi kunci dalam banyak
jalur sinyal-transduksi, dan mungkin untuk alasan ini bahwa kejadian gen tersebut
dalam keganasan begitu tinggi. Beberapa contoh diberikan di Tabel 8.5.
8.5 Singkatan
4E-BP eukaryotic initiation factor 4E-binding protein
AKT acutely transforming retrovirus (AKT8)
AP-1 activator protein 1
ATF adenovirus transcription factor (= CREB)
BCR breakpoint cluster region, a GTPase
CD4 cluster of differentiation 4 (antigen typing on leukocytes)
Cdc cycle-deficient cell
CDK cyclin-dependent kinase
Boss bride-of-sevenless
CaMK calmodulin-dependent kinase
Cbl Cas NS-1 B-cell lymphoma
CREB cAMP-responsive, element-binding protein
Crk CT10 regulator of kinase
DAF-16 dauer phenotype
DAG diacylglycerol
Dbl diffuse B-cell lymphoma
Drk downstream of receptor tyrosine kinase
EF-2 elongation factor 2
EGF epidermal growth factor
EIF-4E eukaryotic initiation factor 4E
ERK extracellular signal regulated kinase
EST expressed sequence tag
FAK focal adhesion complex kinase
FKHRL forkhead related-L (forkhead gene promotes terminal as opposed to
segmental development in the Drosophila)
Fos feline osteosarcoma
FRAP FKBP-rapamycin-associated protein
Gab-1 Grb2-associated binder 1
GAP GTPase-activating protein
GRB growth-factor-receptor bound
GSK-3β glycogen synthase kinase 3β
HOG high-osmolarity glycerol
IL-2 interleukin-2
IRS-1 insulin receptor substrate 1
ITAM immunoreceptor tyrosine-based activation motif
JAK janus kinase
JNK Jun N-terminal kinase
Jun avian sarcoma virus 17 (junana, 17 in Japanese)
LAT linker of activated T cells
Lck lymphocyte kinase from murine lymphoma LSTRA cells
Let lethal mutant
Lin lineage mutant
MAP kinase mitogen-activated protein kinase
MAPKAP MAPK-activated protein kinase
MEK MAP kinaseŔERK kinase
MEKK MEK kinase
MHCII major histocompatibility complex II
MKP MAP kinase phosphatase
MLCK Myosin light-chain kinase
Myc myelocytomatosis virus MC29
NGF nerve growth factor
NK natural killer cell
nrPTK nonreceptor protein tyrosine kinase
PAK P21-activated protein kinase
PDGF Platelet-derived growth factor
PDK1 phosphatidyl inositol-dependent kinase 1
PI-3 kinase phosphatidylinositol-3 kinase
PIP2 phosphatidylinositol-4,5-phosphate
PH pleckstrin homology domain
PLC phospholipase C
PKB protein kinase B
PKC protein kinase C
PTB phosphotyrosine-binding domain
PTEN tensin homolog deleted from chromosome 10
PTK protein tyrosine kinase
PYK2 proline-rich protein tyrosine kinase 2
Rac Ras-like C3 substrate (however, it turns out Rac is not a C3 substrate; some
Rho contamination was present in the Rac protein preparations being studied)
Raf rat fibrosarcoma
Ras rat sarcoma
RBD Ras-binding domain
RGD arginineŔglycineŔaspartic acid
Rho Ras homologs
SAPK Stress-activated protein kinase
Sem sex muscle mutant
Sev sevenless
Shc Src homology collagen-like
SH2 Src homology 2
SHIP SH2-domain-containing inositol phosphatase
SIF v-Sis-inducible factor
Sina seven in absentia
v-Sis simian sarcoma virus gene
SLP76 SH2-domain containing leukocyte protein with a molecular weight of
76 kDa
Sos son of sevenless
Src sarcoma
SRE serum-response element
SRF serum-response factor
STAT Signal transducer and activator of transcription
TAK1 TGF-β1-activated kinase 1
TAM tyrosine-based activation motif
TCF ternary complex factor
TCR T-cell receptor
TRE TPA-responsive element
TrkA tyrosine receptor kinase A
TPA 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate
Vav sixth letter in the Hebrew alphabet
ZAP70 zeta-associated protein 70
8.6 Bacaan
Bos, J. L., ras oncogenes in human cancer: a review, Cancer Res., 49, 4682Ŕ4689,
1989.
Cantrell, D. A., T cell receptor signal transduction pathways, Annu. Rev. Immunol.,
14, 259Ŕ274, 1996.
Collins, T. L., Deckert, M., and Altman, A., Views on Vav, Immunol. Today, 18,
221Ŕ225, 1997.
Cooper, J. A. and Howell, B., The when and how of Src regulation, Cell, 73, 1051Ŕ
1054, 1993.
Corvera, S. and Czech, M. P., Direct targets of phosphoinositide 3-kinase products in
membrane traffic and signal transduction [review], Trends Cell. Biol., 8, 442Ŕ6, 1998.
Downward, J., How BAD phosphorylation is good for survival, Nat. Cell. Biol., 1,
E33ŔE35, 1999.
Deller, M. C. and Jones, E. Y., Cell surface receptors, Curr. Opin. Struc. Biol., 10,
213Ŕ219, 2000.
Giancotti, F. G., Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell
cycle progression, Curr Opin. Cell. Biol., 9, 691Ŕ700, 1997.
Gomperts, B., Kramer, I., and Tathan, P., Signal Transduction, Academic
Press/Elsevier, 2002.
Hunter, T., Tyrosine phosphorylation: past, present and future, Biochem. Soc. Trans.,
24(2), 307Ŕ327, 1996.
Kane, L. P., Lin, J., and Weiss, A., Signal transduction by the TCR for antigen, Curr.
Opin. Immunol., 12, 242Ŕ249, 2000.
Kaplan, D. R. and Miller, F. D., Signal transduction by the neurotrophin receptors,
Curr. Opin. Cell. Biol., 9, 213Ŕ212, 1997.
Karin, M., Liu, Z. G., and Zandi, E., AP-1 function and regulation, Curr. Opin. Cell.
Biol., 9, 240Ŕ246, 1997.
Kornfeld, K., Vulval development in Caenorhabditis elegans, Trends Genet., 13, 55Ŕ
61, 1997.
Metzger, H., The receptor with high affinity for IgE, Immunol. Rev., 125, 37Ŕ48,
1992.
Nishizuka, Y., Protein kinase C and lipid signaling for sustained cellular responses.
FASEB J., 7, 484Ŕ496, 1995.
Raff, M., Cell suicide for beginners, Nature, 96, 119Ŕ122, 1998.
Roovers, K. and Assoian, R. K., Integrating the MAP kinase signal into the G1 phase
cell cycle machinery, Bioessays, 22, 818Ŕ826, 2000.
Treisman, R., Regulation of transcription by MAP kinase cascades, Curr. Opin. Cell.
Biol., 8, 205Ŕ215, 1996.
Wymann, M. P. and Pirola, L., Structure and function of phosphoinositide 3-kinases,
Biochim. Biophys. Acta, 1436, 127Ŕ150, 1998.
Bagian V
Reseptor Sebagai Target Farmasi
9. Reseptor sebagai Target Farmasi
James W. Black
ISI
9.1 Reseptor Hormon
9.2 Agonis parsial: Masalah dalam Mendeteksi Perubahan Khasiat
9.3 Nilai Bioassays
9.4 Apakah Bioassays Berharga dalam Penelitian Farmasi ?
9.5 Perancangan Proses Pengembangan Obat
9.6 Me-tooism
9.7 Short-termism
9.8 Kimia Kombinatorial
9.9 Memilih Target untuk Pengembangan Obat
9.1 RESEPTOR HORMON
Tujuan dari penelitian farmasi adalah untuk menemukan dan mengembangkan
bahan baru yang dapat ditandai dengan selektivitas dan spesifisitasnya. Selektivitas
menggambarkan efek khusus pada negara fisiologis atau patologis yang substansi
dapat menghasilkan. Deskripsi ini, seperti hipnotis, hipoglikemik, hipotensi, dan anti-
inflamasi, mungkin seluruhnya empiris, namun, ini tidak menghambat utilitas
terapinya. Dengan demikian, utilitas klinis obat-obatan seperti morfin dan digitalis
didirikan jauh sebelum kami memiliki penjelasan biokimia untuk tindakan mereka.
Spesifisitas, di sisi lain, mengacu pada hipotesis biokimia yang mengklaim untuk
menjelaskan selektivitas suatu zat. Dengan demikian, aktivasi reseptor enkefalin
diusulkan sebagai mekanisme dimana tindakan morfin, dan penghambatan Na+- /K
+-
tergantung ATPase telah diklaim untuk menentukan aktivitas digitalis. Semua jenis
peristiwa biokimia telah digunakan untuk menentukan tindakan obat. Interaksi
dengan enzim, saluran ion, dan transporter membran telah banyak digunakan untuk
menjelaskan tindakan obat. Namun, reseptor farmakologi mungkin merupakan situs
favorit kerja obat yang digunakan dalam model penjelasan kegiatan selektif mereka.
Reseptor adalah istilah yang banyak digunakan dalam biologi: reseptor
sensorik, telereceptors, mechanoreceptors, baroreseptor, kemoreseptor, reseptor T-sel,
dan seterusnya. Sederhananya, reseptor membutuhkan kata sifat atau awalan untuk
menjadi informatif. Seperti digunakan di sini, reseptor merupakan tempat aksi
hormon, neurotransmiter, modulator dari berbagai jenis, dan autocoids. Hingga kini,
tidak ada nama class yang telah disepakati untuk reseptor terkait dengan agen ini,
namun semua agen ini memenuhi perannya sebagai pembawa pesan antar sel. Karena
ini adalah konsep di balik penemuan Bayliss dan Starling dengan sebutan hormon.
Akan lebih mudah untuk berpikir bahwa sekelompok molekul (misalnya, hormon
reseptor) memiliki ciri-ciri yang sama dengan ciri-ciri umum sebagai kelas enzim.
Dengan demikian, enzim menginduksi perubahan kimia dalam substrat sedangkan
dirinya sendiri tidak berubah secara permanen dalam proses, dengan kata lain, mereka
adalah katalis. Dengan cara yang sama, hormon mengubah sifat kimia dari reseptor
yang berhubungan sedangkan dirinya secara kimiawi tidak berubah dalam proses itu,
dengan kata lain, hormon dan bukan reseptor mereka bekerja layaknya katalis.
Dengan demikian, hormon reseptor dengan baik mengenali dan merespon pembawa
pesan konjugasinya. Untuk memudahkan penulisan, ini adalah pengertian kolektif
dimana reseptor akan disebut dalam bab ini.
Hormon, didefinisikan secara luas sebagai pembawa pesan kimiawi, semua
dapat ditandai dengan selektivitas dan spesifisitas mereka. Selektivitas hormon
menggambarkan peran mereka dalam proses regulasi fisiologis dan patofisiologis.
Kekhasan hormon mengacu pada bukti bahwa mereka menghasilkan efek dengan
berinteraksi dengan reseptor protein yang dapat diidentifikasi. Hormon, kemudian,
memiliki obat-kualitas seperti, seperti alam, farmakope fisiologis. Ini adalah ide yang
membuat sistem hormon-reseptor begitu menarik bagi para peneliti farmasi. Ketika
peneliti baru-obat menggunakan kualitas obat-seperti hormon sebagai titik awal,
mereka sudah jauh untuk tujuan menemukan sebuah protodrug dengan selektivitas
dan spesifisitas yang diinginkan.
Selektivitas hormon selalu melibatkan konsep afinitas, Kemungkinan hormon
dan reseptor berinteraksi satu sama lain, dan khasiat, Kekuatan respon yang
menghasilkan hormon yang berasal dari aktivasi reseptor. Konsep-konsep ini
ditetapkan berdasarkan parameter dalam model termodinamika klasik interaksi
hormon-reseptor. Sebagai parameter ini hormon terdefinisi tidak mudah diakses,
bahkan dalam studi radioligand-binding, industry farmakolog biasanya menetapkan
untuk parameter empiris kurva dosis-respons - yaitu, respon maksimum dan dosis
yang dibutuhkan untuk respon setengah-maksimal. Penelitian farmasi modern
didasarkan pada interaksi hormon-reseptor didasarkan pada pengukuran dan
menafsirkan kurva dosis-respons. Targetnya adalah kemampuan untuk memanipulasi
khasiat hormonal seperti yang tersirat dalam kurva dosis-respons. Sebuah fraksi yang
signifikan dari farmakope kontemporer tentang obat yang menyerupai, meningkatkan,
memperpanjang, atau menghapuskan efektivitas hormon.
9.2 Agonis Parsial : MASALAH DALAM MENDETEKSI PERUBAHAN
EFIKASI
Penulis diperkenalkan dengan masalah efikasi dan ekspresi dalam bioassay
dalam beberapa bulan memulai proyek pertamanya dalam penelitian farmasi saat
menggunakan isoprenalin, sepenuhnya berkhasiat analog dari hormon noradrenalin
dan adrenalin, untuk mendorong laju detak jantung hamster yang terisolasi (persiapan
Langendorff) melalui aktivasi β-adrenoreseptor. Segera setelah mulai proyek, analog
dikloro dari isoprenalin, DCI, digambarkan sebagai antagonis dari isoprenalin pada
otot bronkus. Namun, dalam persiapan jantung, kami menemukan bahwa DCI
berkhasiat sebagai isoprenalin sendiri. Selanjutnya, persiapan Langendorff diganti
dengan laju-kontrol persiapan otot papiler hamster. Pada persiapan baru, DCI tidak
memiliki aktivitas agonis tetapi sekarang antagonis kompetitif dari katekolamin.
Pesatnya perkembangan selanjutnya β-Antagonis adrenoreseptor didasarkan pada
pengamatan ini. Jaringan-ketergantungan kemanjuran DCI itu membingungkan, jadi
kami tidak siap untuk pertemuan kedua dengan fenomena tersebut.
Pertemuan kedua terjadi beberapa tahun kemudian ketika laboratorium kami
beralih kepentingan untuk antagonis histamin. Tidak secara in vitro tes untuk
mempelajari sekresi asam lambung perangsang-histamin yang dikenal pada waktu itu,
jadi kami menggunakan perut lumen-perfusi tikus yang sudah dibius (persiapan
Ghosh dan Schild). Analog Histamin Guanidino (IEG) adalah salah satu senyawa
yang pertama diuji. Untuk tujuan praktis, IEG berperilaku seperti agonis yang
berkhasiat sepenuhnya. Beberapa tahun kemudian mengecewakan, ditemukan bahwa
IEG tidak cukup berkhasiat sebagai histamin. ketika IEG didosiskan selama taraf
kesadaran maka respon sekretori maksimal untuk histamin, tingkat kecil
penghambatan terungkap. Pesatnya perkembangan selanjutnya histamin H 2
antagonis reseptor didasarkan pada pengamatan ini. Hal ini akhirnya menemukan
bahwa, persiapan pada uterus tikus yang terisolasi telah digunakan untuk bioassay
skrining, akan segera menunjukkan bahwa IEG kurang ampuh dibandingkan
histamin.
Baik DCI dan IEG sekarang diklasifikasikan sebagai agonis parsial. Agonis
parsial, menurut definisi, merupakan sebuah gambaran komparatif. Ketika zat B tidak
dapat memproduksi sama besar sebagai respon maksimum zat A dalam jaringan
tertentu, dan ketika mereka bisa memperlihatkan hasil efeknya dengan bekerja dalam
reseptor pada populasi yang sama, maka zat B didefinisikan sebagai agonis parsial.
Meskipun begitu, Ini adalah definisi yang sangat terbatas. Pengamatan pertama
dengan DCI dan IEG sekarang umumnya diakui. Ekspresi agonis parsial merupakan
jaringan yang tergantung dalam cara yang sangat sensitif. DCI yang telah
diklasifikasikan sebagai agonis penuh sebagaimana dinilai oleh perubahan denyut
jantung dan sebagai antagonis kompetitif sederhana sebagaimana dinilai oleh
kontraksi otot papiler. Variasi dalam ungkapan efikasi antara analog berkaitan erat
dengan hormon yang bekerja pada jaringan tertentu dan variasi dalam ekspresi
khasiat oleh analog tertentu yang bekerja pada jaringan yang berbeda keduanya
memiliki implikasi praktis dan teoritis.
Kenakin dan Beek menerbitkan sebuah data yang indah yang mengatur
perbandingan kegiatan isoprenalin (diklasifikasikan sebagai agonis penuh) dengan
prenalterol (diklasifikasikan sebagai agonis parsial) pada enam jaringan yang
berbeda. Di seberang jaringan, potensi isoprenalin bervariasi oleh dua perintah besar:
dalam jaringan di mana potensi isoprenalin sangat tinggi, kemanjuran prenalterol juga
sangat tinggi, hampir sama seperti isoprenalin. Dimana potensi isoprenalin rendah,
prenalterol tidak terdeteksi aktivitas agonis dan, memang, sekarang berperilaku
seperti antagonis kompetitif. Dari sudut pandang penelitian farmasi dampaknya jelas.
Cobalah untuk menemukan beberapa jaringan yang akan mengekspresikan Kegiatan
hormon yang menarik. Potensi relatif dari hormon dapat menunjukkan kemungkinan
bahwa jaringan tertentu akan mengekspos efektivitas agonis parsial. Dalam penelitian
farmasi, itu diperlukan pada tahap awal dari proyek berbasis hormon-reseptor untuk
dapat mendeteksi perubahan kecil dalam kemanjuran analog hormon. Sebuah uji
tanpa terlalu banyak amplifikasi diperlukan. Namun, pada tahap selanjutnya dari
proyek (misalnya, bila senyawa telah ditemukan yang berperilaku seperti antagonis
kompetitif sederhana), sistem amplifikasi-efficacy tinggi diperlukan untuk
mendeteksi tanda-tanda aktivitas agonis residual.
Dari sudut pandang teoritis, efektivitas agonis dalam jaringan tergantung pada
rasio antara konsep kepadatan reseptor yang dipahami dan konsep yang jauh lebih
buram dari "semacam faktor penghubung," kemampuan intrinsik reseptor terikat
untuk menghasilkan intraseluler stimulus. Kemungkinan reseptor yang berasal dari
kelas yang sama mungkin memiliki efisiensi penghubung yang berbeda dalam
jaringan yang tidak dapat diabaikan, namun, perbedaan kepadatan ekspresi reseptor
antara jaringan sekarang dikenal dengan baik dan merupakan cara yang paling
menarik untuk menafsirkan keberhasilan dari kebergantungan jaringan. Daya tarik
konsep tersebut tidak hanya karena kesederhanaan namun juga karena menunjuk ke
sebuah cara di mana teknologi baru mengendalikan ekspresi cloning gen reseptor
dapat dimanfaatkan untuk menghasilkan sistem baru untuk mendeteksi dan mengukur
keberhasilan. Meskipun ini sistem ekspresi reseptor baru merupakan perpanjangan
menarik untuk berbagai bioassay, mereka tidak dalam arti pengganti bioassay
tradisional yang didasarkan pada utuh, jaringan terisolasi in vitro.
9.3 NILAI Bioassay
Inti dari penggunaan bioassay jaringan-yang utuh dalam proyek farmasi yang
terkait dengan hormon adalah bahwa Hormon dapat digunakan untuk menyalakan
sejumlah populasi dari reseptor konjugasi dalam konseptual sederhana interaksi
biomolekuler. Jika peristiwa yang terjadi didominasi oleh pengikatan awal interaksi
ini, seperti yang dijelaskan oleh persamaan Hill, kurva dosis-respon persegi panjang
hiperbolik. Sederhana kurva dosis-respons hiperbolik sudah tentu ditemukan dalam
bioassay in vitro, namun berangkat dari kesederhanaannya lebih sering dijumpai.
Kami terus memahami berbagai aktivitas yang dapat menyebabkan kerumitan dari
kurva dosis-respons. Reseptor sendiri bisa menjadi sumber distorsi. Dinamika
ekspresi reseptor dapat memperkenalkan variasi karena internalisasi atau
desensitisasi. Namun, yang paling umum faktor rumit reseptor-dimediasi terjadi
ketika hormon mengaktifkan lebih dari satu populasi reseptor. Pengungkapan reseptor
heterogenitas selalu menarik dan menantang. Masalah yang dihadapi peneliti farmasi
adalah apa yang harus dilakukan tentang penemuan tersebut. Keadaan sekarang ini
adalah bahwa kita harus selalu berusaha untuk menemukan lebih banyak dan lebih
spesifik ligan Namun, ketika hormon mengaktifkan lebih dari satu set reseptor untuk
menghasilkan hasil akhir yang sama, meskipun dengan berbagai proses transduksi, itu
mungkin bisa dibilang lebih bijaksana untuk mencari ligan yang sangat nonselektif.
Ini mungkin cara terbaik untuk mencapai tujuan dari selektivitas yang diinginkan.
Hormon itu sendiri bisa mengenalkan kompleksitas ke bioassay. Banyak
hormon kini harus dilihat dan dipahami bukan sebagai entitas kimia tetapi sebagai
jalur kimia di mana aktivitas hormonal didistribusikan ke sejumlah spesies kimia.
Semakin banyak kita belajar tentang sifat farmakologis dari jalur anggota tubuh,
semakin kita menyadari bahwa masing-masing memiliki gabungan yang sama dan
sifat yang unik. intinya adalah bahwa kita harus berhati-hati tentang apa yang disebut
"hormon" kita memilih untuk menggerakkan bioassay kami. Sebuah jalur reaksi
kimia hormonal dapat berisi serta sumber tenggelam. Metabolisme dan penyerapan
hormon dapat memperkenalkan distorsi signifikan ke bioassay. Semua faktor-faktor
ini meninggalkan sidik jari mereka pada kurva dosis-respon, dan peneliti farmasi
yang mengembangkan bioassay baru harus belajar untuk membaca tanda-tanda.
Sebuah tantangan yang sangat menarik untuk industri farmasi terjadi ketika sel-
sel yang mensintesis hormon, dengan atau tanpa penyimpanan, yang ditemukan pada
jaringan yang sama dengan konjugat reseptor mereka. Sebagai contoh, sel-sel ini
dapat menjadi neuron, sel mast, atau sel enterochromaffin. Kendali pelepasan zat
yang disintesis atau disimpan salah satunya dapat dicapai dengan kimia atau
rangsangan listrik. Bioassay jaringan-yang utuh dalam mode agonis langsung
menawarkan dua kesempatan yang menarik. Pertama, kendala jaringan arsitektur dan
mengarahkan pelepasan zat pada target sel tertentu dengan cara yang tidak mungkin
dapat dicapai oleh hormon menyebar dalam jaringan secara beraturan dari wadah
organ. Kedua, pelepasan tidak langsung dapat menghasilkan gabungan dari
coreleased zat yang berpotensi dapat berinteraksi satu sama lain. Kedua fenomena ini
jelas diakui sekarang dan menawarkan kesempatan kepada peneliti farmasi. Potensi
interaksi pada tingkat pasca-reseptor yang terjadi antara zat pelepasan-terkendali
khususnya menawarkan peluang penting bagi masa depan penelitian obat.
9.4 Apakah Bioassay Penting dalam Riset Farmasi?
Sejauh ini, kami telah meninjau berbagai cara di mana kompleks kurva dosis-
respons jaringan-secara utuh bioassay dapat menjadi hasil, farmakologi yang
dihasilkan, dari dua atau lebih aktivitas yang berinteraksi. Sekarang, jika semua
bioassay tersebut dapat dicapai untuk mengaburkan dan menyamarkan kegiatan yang
mendasari, mereka harus memberikan cara yang lebih baru, tes analitis sederhana
berdasarkan kimia dan biokimia. Namun, keindahan dari bioassay jaringan-yang utuh
adalah bahwa mereka secara analitis mudah dikerjakan; dengan menggunakan
keluarga dari kurva dosis-respon dan model matematika yang sesuai, kompleksitas
yang utuh dari sistem hormon-reseptor dapat, memang, ditafsirkan. Bioassay
memungkinkan mereka untuk dipelajari sebagai sistem dengan cara yang diabaikan
untuk tes biokimia sederhana.
Apakah bioassay jaringan-secara utuh mampu berdiri sendiri, teknologi awal
untuk menemukan obat baru dalam hormon-reseptor-terarah proyek farmasi?
Jawabannya, berdasarkan pengalaman kita sendiri dan banyak bukti diterbitkan, harus
positif, tetapi tanpa diragukan lagi, bioassay secara in vitro yang lambat, sumber daya
intensif, dan mahal dan memerlukan peneliti terampil. Pertanyaan hari ini adalah
tentang apakah kita dapat menghemat tentang bioassay ini atau bahkan
menghilangkannya sama sekali dengan menggunakan layar bahan kimia yang lebih
produktif. Tes Pengikat-radioligand adalah contoh nyata. mereka telah banyak
digunakan di industri selama bertahun-tahun tetapi kita tidak tahu bagaimana
penggunaannya ini dioptimalkan dalam kaitannya dengan bioassay, bahkan setelah
pengalaman pribadi beberapa tahun pengamatan tes pengikat-radioligand berjalan
bersama bioassay untuk kedua gastrin dan reseptor cholecystokinin. setiap senyawa
yang kami telah buat telah dievaluasi dalam kedua jenis uji. Tidak diragukan lagi,
tidak mengherankan, kita memiliki memperoleh lebih banyak informasi tentang
senyawa baru menggunakan bioassay, namun, dalam retrospeksi, bisa kita dihemat
pada bioassay dengan menggunakan tes mengikat untuk memilih senyawa aktif?
Putusan saat ini adalah bahwa kita akan melewatkan beberapa senyawa yang
menarik. Untuk batas tertentu, ini adalah masalah gaya lebih dari taktik. Pada
umumnya, semua senyawa yang dibuat dalam program kami telah dirancang berusaha
untuk menjawab pertanyaan tentang hubungan struktur-aktivitas. Beberapa ribu dolar
telah dihabiskan dalam membuat masing-masing. Akibatnya, evaluasi biologis sepele
jenis biner, 0 atau 1, adalah tidak pantas. Yang dipermasalahkan adalah pertentangan
antara ahli biologi dan ahli kimia untuk belajar memahami dan saling percaya. Hal ini
tidak terlalu banyak karikatur untuk melihat bahwa ahli kimia percaya bahwa setiap
molekul berjuang begitu keras untuk Sifat memiliki yang menarik kalau hanya ahli
biologi akan mengevaluasi dengan cukup baik, ahli biologi, di sisi lain, adalah yakin
bahwa tes nya akan mengungkapkan sifat molekul yang diinginkan jika kimiawan
hanya akan membuat senyawa yang tepat. Berdasarkan pengalaman kami
menunjukan bahwa dibutuhkan setidaknya dua tahun kolaborasi berkelanjutan
sebelum kimia dan biologi benar-benar belajar saling percaya!
9.5 Perancangan Proses Pengembangan Obat
Seorang ahli kimia obat yang terlibat dalam proyek obat hormon-reseptor-
ditargetkan baru tepat di awal. Untuk terlibat, cukup struktur hormon perlu diketahui
untuk memungkinkan semua kemungkinan bentuk molekul yang akan
divisualisasikan oleh model valensi-kawat fisik, oleh ruang-menduduki model nuklir,
atau, saat ini, dengan berbagai simulasi komputerisasi pada komputer. apapun cara
yang dipilih, ahli kimia ini, pada prinsipnya, dalam pikiran mereka selalu berkisar
tentang molekul saat mereka melaksanakan interogasi imajinatif: apa itu tentang
molekul ini yang menarik bagi saya sebagai seorang ahli kimia? Dimana sumber
kemungkinan interaksi noncovalent serta beban reseptor-ion, kepadatan electron pada
karbonil dan gugus amino, sistem pi-elektron, dan sebagainya? Hari ini, ahli kimia
mungkin memiliki tambahan informasi dari modeler molekuler tentang kemungkinan
konformasi. Apapun input ke imajinasi mereka, ahli kimia obat menyaring keluar
pertanyaan pertama tunggal, pertanyaan yang mereka percaya bahwa mereka dapat
mencoba untuk menjawab dengan membuat analog sederhana atau turunan dari
hormon alami. Tentu saja, pertanyaan itu tidak dapat dijawab dengan presisi bedah.
Setiap perubahan yang tepat dalam molekul menghasilkan banyak perubahan lebih
konsekuensial konformasi, dalam distribusi muatan, di bidang listrik, dan sebagainya,
yang memastikan bahwa pertanyaan kimia kemungkinan akan memiliki buram
jawaban biologi pertama kali sekitar.
Jawaban atas pertanyaan para ahli kimia 'disediakan oleh bioassay. Karena ada
pertanyaan harus dijawab, setiap hasil biologis, termasuk (bahkan terutama) bahwa
molekul baru benar-benar tidak aktif, penuh perhatian. Apapun hasilnya, pertanyaan
baru dinaikkan, sebuah inkuisisi baru Senyawa harus dibuat, tes biologis baru harus
dilakukan. Proses berulang-ulang ini, pada prinsipnya, inti dari semua program
hormon-reseptor dari penelitian farmasi tradisional; Namun, dalam prakteknya,
proses tersebut tidak dapat didorong seperti ini sebagai siklus logis tunggal. Berbicara
secara umum, senyawa memakan waktu lebih lama untuk mensintesis daripada
mengevaluasi pada bioassay. Rata-rata, ahli kimia obat akan menghasilkan 15
senyawa target per tahun, sehingga tim ahli kimia biasanya terlibat, bekerja secara
paralel pada bagian dibagi--keluar dari masalah yang dirasakan. Molekul pemodel,
yang juga merupakan bagian dari lingkaran berulang, juga harus bekerja pada ritme
yang berbeda dari baik ahli kimia sintetik atau analis biologis, namun, prinsip
interogatif yang loop selalu bermain.
Selama hidup kita, kita telah menyaksikan kemajuan terus menerus dan luar
biasa dalam teknologi kimia obat, metode analisis kimia, dan kromatografi, tapi yang
paling spektakuler Perubahan terlihat pada sekitar 40 tahun penelitian farmasi berada
dalam pemodelan molekul. industri farmasi telah membuat investasi besar dalam
teknologi pelarian ini. Saya merasakan, meskipun, sejumlah kekecewaan industri
hasil dari investasi ini dan akan setuju bahwa pemodelan molekul belum dramatis
singkat jumlah iterasi loop untuk pergi dari hormon untuk senyawa berbasis hormon
dengan utilitas klinis yang potensial. Namun, ini sama saja dengan kehilangan
intinya. Tiga fitur pemodelan molekul tidak lagi diragukan. Teknologi ini
memungkinkan kita untuk mengatasi masalah, seperti hormon polipeptida yang ada
dimana-mana, yang pasti logis dan imajinatif mungkin 20 tahun yang lalu. Teknologi
terus maju dengan kecepatan yang menakjubkan, kecepatan yang tidak mungkin
tanpa investasi besar sebelumnya. teknologi ini membuat kontribusi yang lebih besar
dan lebih hebat untuk imajinasi kimia sintetis. Sepanjang sebagai model molekuler
yang masih berkaitan, penulis ini adalah pecandu.
9.6 ME-TOOSIM
Logis, imajinatif, dan berulang pendekatan obat baru berdasarkan sistem
hormon-reseptor Pada sketsa di atas berdiri di kontras dengan pendekatan industry
yang kita alami 40 tahun lalu dan ke arah mana industri ini sekarang bergerak secara
kompulsif dengan kecepatan sibuk. Pada masa lalu, penelitian industri dikritik karena
praktek skrining acak dan untuk generasi dari "me-too" obat. Tentu saja, skrining
biologis tidak acak, jauh dari itu, sebagai penyaringan tes dipilih dengan hati-hati
untuk mencerminkan kebutuhan medis yang diidentifikasi. Farmakologi mencoba
untuk mencerminkan pentingnya memenuhi kebutuhan medis dengan menggunakan
paradigma patologi eksperimental untuk skrining tes. Dengan demikian, tes sering
didasarkan pada eksperimen diinduksi hewan patologi seperti steril respon inflamasi
terhadap benda asing seperti kapas, atau terpentin, atau arthritis diinduksi dengan
presentasi antigen-ajudan, atau borok lambung yang diinduksi oleh histamin atau
aspirin, atau kejang-kejang disebabkan oleh leptazol atau listrik, dan sebagainya.
Senyawa yang disaring tidak dipilih secara acak, baik. Mereka dipilih dengan cara,
sistematis, melalui perusahaan terakumulasi koleksi majemuk, database-nya, atau
dengan membunyikan perubahan sistematis dari substituen dalam memimpin molekul
dilambangkan dengan "metil, etil, propil, butil, sia-sia!" Sterilitas intelektual proses
itu bukan karena keacakan tetapi karena kurangnya koneksi yang diperlukan antara
kimia dan bioassay.
Dalam kurung, muatan kritis mee-tooisms juga, saya yakin, salah tempat.
Untuk batas tertentu, Saya bisa menerima muatan komersial mee-tooism. Harga
premium tidak diragukan lagi telah diminta untuk senyawa dengan perbedaan akut
klinis tidak signifikan, tetapi efek samping mulai dikenal lambat, tergantung waktu.
Oleh karena itu, mau tidak mau, obat yang lebih tua memiliki akumulasi lebih banyak
laporan efek samping pada lembar data dan yang lebih baru obat ikut-ikutan dapat
mengayuh oleh manipulator pemasaran sebagai "sama baiknya tapi lebih aman."
Secara pribadi, saya tidak memiliki pandangan yang sinis tentang mee-tooism, dan
ada dua alasan untuk ini. Obat Ikut-ikutan membangun gambaran pikiran yang
menantang bahwa senyawa memiliki struktur kimia yang sangat berbeda tetapi dapat
memiliki sifat farmakologis kongruen. Konsep kelas seperti obat adalah dasar
farmakologi. Kedua, sedangkan struktur kimia yang berbeda memiliki satu fitur yang
sama, mereka sering digunakan dan penting perbedaan profil farmakokinetik dan
toksikologi mereka.
9.7 SHORT-TERMISM
Sebagaimana ditunjukkan, pengembangan program penelitian-reseptor hormon
berbasis telah mengubah semua itu. Logis, imajinatif, berulang pendekatan yang telah
dicat telah terbukti untuk bekerja secara teratur dan andal. Rekor jelas. Jika Anda
mengikuti saran John Locke "mantapkan pikiran anda dalam satu arah, "Anda akan
berhasil, namun, fakta bahwa jumlah iterasi dan tahun itu sepenuhnya akan waktu tak
terduga. Hal ini menjadi masalah yang signifikan, sebagai industri farmasi telah
membiarkan dirinya ditekan menjadi short-termism sebagai penangkal eksponensial
meningkatnya biaya penelitian dan pengembangan, terutama berkat ekstensi untuk
pengawas obat persyaratan dan biaya pengembangan. Akibatnya, tekanan saat ini
semakin cepat, pada apa yang bernama penyaringan throughput tinggi. Potensi untuk
penyaringan throughput tinggi didasarkan pada kemajuan spektakuler dalam
teknologi biologi dan imunologi molekuler dibuat dalam 10 terakhir tahun atau lebih.
Berbagai seluruh prosedur sekarang tersedia yang meliputi kloning gen reseptor
cotransfected dengan gen reporter dalam baris sel atau, dengan kemurnian kimia yang
lebih besar, seperti tes alat tes kedekatan skintilasi, di mana reseptor kimia murni
terikat untuk manik-manik bahwa rumah yang scintillant, sehingga pemecahan
masalahnya sangat jauh. Semua tes ini baru dapat dijalankan seperti robot, dan semua
tes baru ini memiliki persamaan fitur sebagai berikut. Mereka cerdik. mereka adalah
dasar dari kimia dan bukan tes biologis. Mereka sangat produktif tetapi menunjukkan
informasi minimum yang absolut (ada atau tidaknya, 0 atau 1). Pada dasarnya, ini tes
otomatis. Pertanyaan yang penting tidak diminta, sehingga analisis cerdas
dikompromikan. Namun demikian, melakukan hal-produktif, otomatis, menyediakan
tes yang lebih besar, hasil lebih cepat mengarah ke kimiawi?
Pada saat ini, pertanyaan tersebut belum dijawab, tetapi pertanyaan pelengkap
penting juga masih harus dijawab. Dimana senyawa yang berasal dari uji pakan, yang
dapat mengkonsumsi sekitar 2000 atau lebih bahan kimia per minggu? Sumber yang
terlihat adalah inhouse dengan kumpulan senyawa. Perusahaan obat penelitian
berbasis utama sekarang punya tempat antara 0,5 dan 1 juta senyawa di perpustakaan
majemuk mereka. Jadi program penelitian yang dapat assay sekitar 2000 senyawa per
minggu akan tetap diduduki selama setidaknya beberapa tahun hanya bekerja melalui
perpustakaan sendiri. Masalah dengan perpustakaan di rumah adalah bahwa mereka
tidak ensemble secara acak molekul organik terstruktur. Distribusi sangat kental.
Maksud saya bahwa banyak molekul disintesis akan berada di kelompok yang terkait
erat, yang telah disintesis untuk program sebelumnya, sukses serta berhasil. Kecuali
satu irredeemably optimis, ini mungkin tidak menjadi sebuah kolam molekul yang
ideal untuk menjaring pelanggan baru.
9.8 Kimia Kombinatorial
Kelaparan di jantung ini merupakan semangat baru untuk penyaringan
throughput tinggi harus puas dari beberapa sumber dermawan lainnya senyawa baru
untuk skrining. Menukar dengan kontrak atau membeli dengan mengambil alih
perusahaan atau penggabungan pendekatan yang jelas, tetapi harganya sangat mahal,
menawarkan strategi yang terbatas, dan tidak menghindari masalah lumpiness.
Untungnya, kemajuan dalam kimia luar biasa sebagai kemajuan dalam biologi
molekuler dan genetik. kombinatorial kimia adalah nama dari permainan baru.
Saya tidak punya pengalaman pribadi dengan kimia kombinatorial, namun
teknologi untuk membuat sejumlah besar molekul digabungkan ke prosedur seleksi
kimia yang tepat dimulai dengan percobaan laboratorium untuk mempelajari evolusi
molekuler dalam sistem kimia murni. Spiegelman dan rekan kerjanya memulai
dengan fag bakteri, yang salah satu dari empat gen adalah enzim replikase, untuk
membuat salinan dari dirinya sendiri. Mereka menunjukkan bahwa paparan berulang
in vitro RNA virus, replikase tersebut, dan pasokan dari empat nukleotida
menyebabkan urutan RNA yang sama sekali baru dengan peningkatan 15 kali lipat
dalam Tingkat replikasi, mutasi muncul dari kesalahan dalam replikasi. Selanjutnya,
kombinasi metode untuk menginduksi mutasi pada DNA atau RNA, ditambah
langkah berulang amplifikasi dengan PCR (polymerase chain reaction), telah
menyebabkan kemampuan untuk menghasilkan 10 sampai 13 urutan untai tunggal
DNA. Ini kemudian dapat diputar pada kolom yang terikat protein yang tepat. Sebuah
afinitas tinggi ligan DNA untuk trombin ditemukan dengan cara ini. Ketika ahli kimia
organik mengambil alih dari ahli biologi molekular, mereka mengembangkan teknik
untuk menghasilkan perpustakaan dari 106 sampai 107 urutan peptida. Reaksi dan tes
dilakukan pada manik-manik. Teknologi ini memiliki kemajuan dengan
memperkenalkan pengendalian pembangunan urutan ditambah kemampuan untuk
menandai setiap urutan untuk kemudahan identifikasi.
Sintesis urutan peptida terkendala kini telah diikuti oleh kombinasi nonpeptide
molekul. Ketika kendala besar diperkenalkan, produktivitas numerik jatuh, tapi
mungkin proporsi lead meningkat.
Kombinatorial kimia sekarang menjadi kegiatan yang berkembang pesat,
sebagai suatu teknologi, menarik perhatian ahli kimia yang sangat cerdik. Pada saat
ini, mustahil untuk memprediksi di mana teknologi ini akan membawa kita. Kami
tidak tahu apakah beberapa keterbatasan dasar akan diatasi. Pada saat ini, semua
metode dibatasi untuk reaksi biner yang berlangsung mudah. Hal ini berbeda dengan
masalah yang dihadapi seorang ahli kimia sintetik yang ingin membuat molekul
tertentu. Tidak hanya sejumlah langkah berurutan yang diperlukan, tetapi juga banyak
tahapan tuntutan yang membutuhkan kondisi terjadinya suatu reaksi. Dengan
demikian, sulit untuk melihat bagaimana kombinasi kimia dapat, dalam waktu dekat,
menjadi dasar untuk berulang, pendekatan interogatif terhadap hormon-reseptor-ligan
terkait.
Penyaringan throughput tinggi dari database ditambah masukan dari kimia
kombinatorial dirancang untuk menghasilkan lead. Saat aku memahami prosesnya,
lead kemudian akan dikembangkan menggunakan lebih banyak metode konvensional.
Asumsi tampaknya menemukan petunjuk yaitu tingkat-pembatas langkah dalam
proses penemuan obat. Sekarang, saya tidak yakin bahwa itu adalah benar.
Mengembangkan dan mengoptimalkan mengarah ke klinis diuji entitas kimia baru
(NCES, seperti yang disebut dalam industri) biasanya fasenya jauh lebih lambat.
Namun, produktivitas industri, sebagaimana dilihat pada penemuan obat-obatan yang
benar-benar baru, lebih dibatasi oleh pilihan target daripada mengarah pada
penemuan. Perawatan dalam memilih Target adalah titik keputusan yang paling
penting dalam penelitian farmasi.
9.9 SASARAN PEMILIHAN UNTUK PENGEMBANGAN OBAT
Pendekatan pribadi saya kepada target pemilih adalah untuk mencari jawaban atas
enam pertanyaan:
1. Apakah proyek tersebut dapat menyingkirkan angan-angan atau harapan?
2. Apakah titik awal kimia dapat diidentifikasi?
3. Apakah bioassay relevan sudah tersedia?
4. Apakah mungkin untuk mengkonfirmasi defenisi spesifisitas laboratorium pada
manusia?
5. Adalah kondisi klinis relevan dengan spesifisitas ini?
6. Apakah proyek ini juara?
Kriteria pemikiran adalah yang paling penting dari semua. Semua proyek
penemuan obat dimulai dengan keinginan untuk mencegah penyakit atau mengobati
penyakit. Angan-angan mengacu pada kerenggangan dari hubungan yang dirasakan
antara keinginan dan cara yang diusulkan untuk memenuhi itu.Yang paling umum
misalnya hari ini klaim dibuat lagi dan lagi: setelah kita tahu produk gen, maka kita
akan dapat menemukan obat baru. Sejauh ini, belum ada yang menunjukkan bahwa
ini akan disukai atau bahkan mungkin menjadi hal positif. Untungnya, sebagian besar
proyek pengarahan reseptor hormon relatif bebas dari angan-angan sejauh
menemukan ligan yang bersangkutan, meskipun potensi utilitas ligan mungkin akan
fantastis. Untungnya, sekali lagi, sebuah proyek hormon-reseptor memiliki titik awal
kimia, hormon sendiri. Disini, kami cenderung untuk berasumsi bahwa kita tidak
dapat membuktikan bahwa dalam mencari ligan baru berdasarkan pada hormon kimia
kita memberi kesempatan yang adil untuk mempertahankan evolusioner yang berasal
dari selektivitas hormon. Target reseptor hormon juga skor yang baik pada kriteria
bioassay. Sangat sering bioassay mengungkapkan fitur penting dari selektivitas
hormon. Idealnya, deteksi khasiat menawarkan keuntungan: misalnya, dalam
memiliki beberapa bioassay termasuk tes pemilihan ikatan radioligan. Tes didasarkan
pada spesies yang berbeda dapat sangat berharga. Kriteria penting, untuk saya
percaya adalah mengembangkan ligan yang kegiatannya tidak tergantung spesies,
tetapi tergantung prediktor yang paling dapat diandalkan untuk ekstrapolasi manusia.
Dalam memilih target, penting untuk membayangkan bagaimana untuk
menyelidiki ligan baru yang diusulkan pada manusia. Akankah kita bisa, dalam
prakteknya serta pada prinsipnya, untuk mengkonfirmasi selektivitas ligan
sebagaimana didefinisikan dalam eksperimen laboratorium? Ini akan sangat
menantang dalam kaitannya dengan pusat sistem saraf (SSP) dalam pengarahan
senyawa. Namun, sebagian besar hormon, pemancar, dan modulator ditemukan di
otak juga ditemukan dalam usus, jadi mungkin kekhususan ligan CNS dapat
dievaluasi diakhir. Hal ini juga penting sebelum memilih target untuk membayangkan
gangguan klinis apa yang mungkin dieksplorasi oleh ligan tertentu yang baru. Tidak
ada penghakiman komersial harus terlibat pada saat ini. Satu-satunya uji kelayakan.
Untuk obat baru, yang sebelumnya tidak tersedia spesifisitas, banyak bukti
menunjukkan bahwa penilaian komersial jarang berlaku. Ketika obat dikembangkan
dengan modus tertentu dari tindakan, dokter akan memiliki kesempatan untuk
mengeksplorasi gangguan yang tak terduga.
Pertanyaan terakhir ini biasanya memiliki jawaban yang jelas: kebutuhan untuk
juara. Kebutuhan berasal dari pengalaman umum bahwa program penelitian obat
sering melalui periode kebuntuan panjang. Selama periode ini, semangat dan
keyakinan yang diperlukan untuk mencegah keredupan hati dari berhenti.